CN103074417A - 一种丙型肝炎治疗用药指导的多重基因检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种丙型肝炎治疗用药指导的多重基因检测方法，包括如下步骤：(1)生产“丙型肝炎治疗用药指导多重基因检测试剂盒”；(2)采集患者血液样品，并提取核酸；(3)以样品核酸为模板进行反转录；(4)以反转录产物为模板进行PCR反应；(5)以毛细电泳的方法分离样品。本发明具有灵敏度高、重复性好、准确性强、灵活性强、成本低的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测方法，尤其是一种高通量、准确定量、灵活性强、成本低的一种丙型肝炎治疗用药指导的多重基因检测方法。
背景技术
丙型肝炎病毒(HCV)感染者中有超过70％发展成慢性丙型肝炎，在10～20中有20％～50％进展成肝硬化，1％～2％发展成肝细胞肝癌，危害严重。丙型肝炎的抗病毒治疗是缓解和抑制肝硬化和肝癌的重要途径。但抗HCV药物昂贵，且对不同病情有不同用药标准，因此需要检测多种信息以辅助用药治疗。指导丙型肝炎的用药治疗的信息主要有血清丙型肝炎病毒RNA水平，丙型肝炎病毒的基因型和人类相关单核苷酸多态性(SNP)。只有联系病毒亚型类别、病毒在体内的复制水平和患者的个体信息综合分析，才能做到真正的对症下药。目前，主流的检测方法缺点是：技术成本昂贵、复杂：每个样品需要一个芯片，成本大于￥1000/样品，不利于大规模推广；探针的合成与固定比较复杂，特别是制作高密度的探针阵列，是主要的限速步骤。不能精确定量，重复性差。灵敏度较低：芯片法需核酸量较大，一般须先做多重PCR扩增，由于引物较多，容易自身产生二聚体，发夹结构，或由于Tm值不同，而导致扩增目的片段效率不同，进而影响检测的灵敏度。对于不同亚型的混合感染较难分辨。由于芯片的种类较多，难以制定一个统一的质量控制标准。
发明内容
本发明的目的是提供一种高通量、准确定量、灵活性强、成本低的一种丙型肝炎治疗用药指导的多重基因检测方法。
本发明采用如下技术方案：
一种基于毛细电泳的丙型肝炎治疗用药指导的多重基因检测方法，包括如下步骤：
(1)生产“丙型肝炎治疗用药指导多重基因检测试剂盒”；(2)采集患者血液样品，并提取核酸；(3)以样品核酸为模板进行反转录；(4)以反转录产物为模板进行PCR反应；(5)以毛细电泳的方法分离样品。
优选地，所述步骤(3)包括按比例在样品板上加入试剂和样品、以及混匀后在一定温度下孵育的子步骤。
优选地，所述步骤(3)中的孵育温度分别为48℃、42℃、95℃、4℃。
优选地，所述步骤(4)包括按比例在样品板上加入试剂和样品、以及混匀后按一定温度进行热循环反应的子步骤。
优选地，所述步骤(4)的子步骤中的热循环温度分别为94℃、60℃、70℃、4℃。
优选地，所述步骤(5)包括制备GeXP遗传分析仪样品、准备分离液、毛细电泳分离样品、结果分析的步骤。
本发明的有益效果为：
1.采用激光诱导荧光-PMT，具有超高灵敏度，重复性好。
2.GeXP采用毛细管电泳对PCR产物进行分离检测，可将精确分离一个碱基数量差异的片段，能有效分辨出特异性产物，避免假阳性。
3.高通量检测：可以在一个反应当中同时检测丙型肝炎病毒的RNA水平和人类的SNP位点并检测，即一个反应获得三种用药治疗指导信息。
4.精确定量：对病原体基因拷贝数的定量检测有着与荧光定量PCR同样的高精确性。
5.灵活性强：可随时根据需求增加或修改所需研究的SNP位点。
6.成本低：每个样品的检测成本少于￥50，包括了丙型肝炎病毒RNA定量检测、人类SNP位点的检测和感染病毒亚型多种信息，利于大规模推广。
具体实施方式
下面根据实施例对本发明作进一步详细说明。
本发明创立了一种同步检测丙型肝炎病毒RNA水平、人类相关SNP位点和感染丙型肝炎病毒亚型的多重基因检测方案。检测步骤(详见第四节：具体实施方式)：采集患者样品(血样)，提取核酸，以之为模板进行反转录和PCR反应，最终用毛细电泳方法分离PCR产物。
1.检测目标主要
1.)定量检测样品丙型肝炎病毒RNA水平。参见【表1】
2.)检测与丙型肝炎治疗用药相关的SNP位点：rs12979860和rs8099917。
3.)检测丙型肝炎病毒亚型：1a、1b、2、2a、3a、3b、6共七种亚型。
2.建立了可靠地样品质量及反应过程的对照。参见【表1】
1)人DNA和人RNA完整性的对照内参：确保在检验过程中对样品质量的判断，避免假阴性。
2)正常反应对照内参：监控PCR反应效率，避免假阴性。
3.多重基因检测的引物设计。参见【表2】
表1多重检测目标
表2多重检测引物序列
具体实施步骤如下：
1.配合贝克曼库尔特公司的试剂盒GeXP Start kit，生产“丙型肝炎治疗用药指导多重基因检测试剂盒”，试剂盒中包括：
l)反转录引物管(RT primer mix)
2)PCR引物管(PCR primer mix)
3)25mM氯化镁(MgCl2)
4)DNA聚合酶(Taq DNA Polymerase)
5)阳性对照(Positive Control)
2.采集患者的血液样品，并提取核酸。
3.以患者核酸为模板进行反转录(RT)：
1)按以下比例在96孔样品板上加入试剂和样品(RT板)：
| RT反应试剂 | 量/孔 |
| Dnase/Rnase Free水 | 8μL |
| RT缓冲液，5X | 4μL |
| RT引物 | 2μL |
| RT酶 | 1μL |
| 样品RNA(5-20ng/ul) | 5μL |
| Total | 20μL |
注：阳性对照：1μL/反应
2)混匀后按以下温度孵育：
| 步骤 | 温度 | 时间 |
| 1 | 48℃ | 1分钟 |
| 2 | 42℃ | 60分钟 |
| 3 | 95℃ | 5分钟 |
| 4 | 4℃ | 持续：直至收取RT产物 |
4.以反转录产物为模板进行PCR反应
1)按以下比例在96孔样品板上加入试剂和样品(PCR板)：
| PCR反应试剂 | 量/孔 |
| PCR缓冲液，10X | 2μL |
| 25mM MgCl2 | 4μL |
| PCR引物 | 2μL |
| CM01 | 2μL |
| DNA聚合酶 | 0.3μL |
| RT产物 | 9.7μL |
| Total | 20μL |
2)混匀后按以下温度进行热循环反应：
| 步骤 | 温度 | 时间 |
| 1 | 94℃ | 1分钟 |
| 2 | 94℃ | 30秒钟 |
| 3 | 60℃ | 30秒钟 |
| 4 | 70℃ | 1分钟 |
| 5 | N/A | 重复2-4步骤34次(共35次) |
| 6 | 70℃ | 1分钟 |
| 7 | 4℃ | 持续：直至收取PCR产物 |
5.GenomeLab GeXP遗传分析仪毛细电泳分离样品
1)制备GeXP样品：
| GeXP样品 | 量/孔 |
| SLS上样液 | 38.5μL |
| DNA大小标准400 | 0.5μL |
| PCR产物 | 1μL |
| Total | 40μL |
| 矿物油 | 1滴 |
注：PCR产物量可为0.1-1μL，或用水按需要预稀释后上样
2)准备分离液：将约220μL分离液加入96孔分离液板上适当数目的孔中。
3)毛细电泳分离样品。
6.结果分析。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化和变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (6)
1.一种丙型肝炎治疗用药指导的多重基因检测方法，包括如下步骤：(1)生产“丙型肝炎治疗用药指导多重基因检测试剂盒”；(2)采集患者血液样品，并提取核酸；(3)以样品核酸为模板进行反转录；(4)以反转录产物为模板进行PCR反应；(5)以毛细电泳的方法分离样品。
2.根据权利要求1所述的检测方法，所述步骤(1)中的试剂盒包括：反转录引物管、PCR引物管、25mM氯化镁、DNA聚合酶、阳性对照。
3.根据权利要求1所述的检测方法，所述步骤(3)包括按比例在样品板上加入试剂和样品、以及混匀后并在48℃、42℃、95℃、4℃的温度下孵育的子步骤。
4.根据权利要求1所述的检测方法，所述步骤(4)包括按比例在样品板上加入试剂和样品、以及混匀后按一定温度进行热循环反应的子步骤。
5.根据权利要求4所述的检测方法，所述步骤(4)的子步骤中的热循环温度分别为94℃、60℃、70℃、4℃。
6.根据权利要求1所述的检测方法，所述步骤(5)包括制备GeXP遗传分析仪样品、准备分离液、毛细电泳分离样品、结果分析的步骤。
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