RU2811763C1 - Способ прогностической оценки развития гепатоцеллюлярной карциномы на основе определения полиморфизма гена человека IFNAR-1 и набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров - Google Patents
Способ прогностической оценки развития гепатоцеллюлярной карциномы на основе определения полиморфизма гена человека IFNAR-1 и набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров Download PDFInfo
- Publication number
- RU2811763C1 RU2811763C1 RU2022131541A RU2022131541A RU2811763C1 RU 2811763 C1 RU2811763 C1 RU 2811763C1 RU 2022131541 A RU2022131541 A RU 2022131541A RU 2022131541 A RU2022131541 A RU 2022131541A RU 2811763 C1 RU2811763 C1 RU 2811763C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- ifnar
- insdqualifier
- insdseq
- insdfeature
- gene
- Prior art date
Links
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 title claims abstract description 43
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 title claims abstract description 42
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 238000011161 development Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 title claims abstract description 9
- 101100018861 Homo sapiens IFNAR1 gene Proteins 0.000 title claims description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 60
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 32
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims abstract description 23
- 238000010606 normalization Methods 0.000 claims abstract description 22
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 20
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 16
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 14
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 13
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims abstract description 12
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 101710205841 Ribonuclease P protein component 3 Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 102100033795 Ribonuclease P protein subunit p30 Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 claims abstract description 4
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 4
- 101000852870 Homo sapiens Interferon alpha/beta receptor 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100036714 Interferon alpha/beta receptor 1 Human genes 0.000 claims description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 3
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 abstract description 15
- 239000008280 blood Substances 0.000 abstract description 15
- 230000035772 mutation Effects 0.000 abstract description 14
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 abstract description 7
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 abstract description 7
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 5
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 abstract description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 40
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 12
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 10
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 9
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 9
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 8
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 8
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 7
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 6
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 5
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 230000034994 death Effects 0.000 description 4
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 3
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 3
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 208000010710 hepatitis C virus infection Diseases 0.000 description 3
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 3
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 3
- UFYQLXOGDWQBGQ-UHFFFAOYSA-N 10-phenylspiro[acridine-9,9'-fluorene]-2',7'-dicarbonitrile Chemical compound C12=CC(C#N)=CC=C2C2=CC=C(C#N)C=C2C1(C1=CC=CC=C11)C2=CC=CC=C2N1C1=CC=CC=C1 UFYQLXOGDWQBGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000000419 Chronic Hepatitis B Diseases 0.000 description 2
- 208000006154 Chronic hepatitis C Diseases 0.000 description 2
- 101000844245 Homo sapiens Non-receptor tyrosine-protein kinase TYK2 Proteins 0.000 description 2
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 108010086140 Interferon alpha-beta Receptor Proteins 0.000 description 2
- 102000007438 Interferon alpha-beta Receptor Human genes 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102100032028 Non-receptor tyrosine-protein kinase TYK2 Human genes 0.000 description 2
- 108700027336 Suppressor of Cytokine Signaling 1 Proteins 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 238000002679 ablation Methods 0.000 description 2
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003041 necroinflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 102100027769 2'-5'-oligoadenylate synthase 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100027962 2-5A-dependent ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000007788 Acute Liver Failure Diseases 0.000 description 1
- 206010000804 Acute hepatic failure Diseases 0.000 description 1
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 208000010334 End Stage Liver Disease Diseases 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 208000034826 Genetic Predisposition to Disease Diseases 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 208000037262 Hepatitis delta Diseases 0.000 description 1
- 241000724709 Hepatitis delta virus Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001008907 Homo sapiens 2'-5'-oligoadenylate synthase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001080057 Homo sapiens 2-5A-dependent ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 101000959820 Homo sapiens Interferon alpha-1/13 Proteins 0.000 description 1
- 101000997835 Homo sapiens Tyrosine-protein kinase JAK1 Proteins 0.000 description 1
- 108010014726 Interferon Type I Proteins 0.000 description 1
- 102000002227 Interferon Type I Human genes 0.000 description 1
- 101710099621 Interferon lambda-3 Proteins 0.000 description 1
- 102000042838 JAK family Human genes 0.000 description 1
- 108091082332 JAK family Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 1
- 102000001776 Matrix metalloproteinase-9 Human genes 0.000 description 1
- 108010015302 Matrix metalloproteinase-9 Proteins 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 101150045565 Socs1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100024779 Suppressor of cytokine signaling 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100033438 Tyrosine-protein kinase JAK1 Human genes 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 231100000836 acute liver failure Toxicity 0.000 description 1
- 230000033289 adaptive immune response Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 208000011444 chronic liver failure Diseases 0.000 description 1
- 231100000749 chronicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 208000013772 cryohydrocytosis Diseases 0.000 description 1
- 230000005860 defense response to virus Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000009274 differential gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 230000001553 hepatotropic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002357 laparoscopic surgery Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 238000012317 liver biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009099 neoadjuvant therapy Methods 0.000 description 1
- 238000012634 optical imaging Methods 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 102220112807 rs280519 Human genes 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000036642 wellbeing Effects 0.000 description 1
Abstract
Группа изобретений относится к биотехнологии и медицине. Диагностику проводят с использованием олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и соответствующего одной из пар праймеров флуоресцентно меченого зонда, комплементарных участкам выявляемых фрагментов, а также с использованием стандартных образцов, представляющих собой последовательную серию разведений кДНК охарактеризованного образца-калибратора. Экстрагируют РНК из цельной крови или сухих пятен крови (сухой капли крови), осуществляют обратную транскрипцию, получая кДНК, после чего используют полученный образец кДНК для одновременной амплификации в одной емкости участков целевого гена IFNAR-1 и двух эталонных нормировочных генов HPRT и RPP30, а также для амплификации в других емкостях фрагментов транскрипта гена IFNAR-1 с последующим секвенированием по Сэнгеру. При определении уровня экспрессии для амплификации регистрируют полученные результаты с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПНР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени». Анализ экспрессии IFNAR-1 проводят с нормализацией на эталонные гены, при этом вводится «нормировочный коэффициент», вычисляемый как среднее геометрическое или среднее арифметическое от значения всех эталонных нормировочных генов. Относительный уровень экспрессии IFNAR-1 определяют с использованием метода ΔΔСТ в сравнении с последовательной серией разведений кДНК охарактеризованного образца-калибратора, в котором представлен ген IFNAR-1 дикого типа, на основании чего делают выводы о нормальном или сниженном уровне экспрессии целевого гена. При определении нуклеотидной последовательности полного транскрипта гена IFNAR-1 осуществляют амплификацию двух перекрывающихся фрагментов транскрипта: протяженностью 5944 нуклеотидов, область 1-5944 нт., и протяженностью 4607 нуклеотидов, область 1551-6157 нт., согласно представленной в международной базе данных GenBank референтной последовательности (NM_0013 84504.1). Затем осуществляют прямое секвенирование по Сэнгеру полученных фрагментов транскрипта гена IFNAR-1 и делают выводы о наличии или отсутствии потенциально патогенетически значимых мутаций. При выявлении сниженной экспрессии IFNAR-1 и/или мутаций нуклеотидной последовательности транскрипта, приводящей к изменениям аминокислотной последовательности продукта гена, делают вывод о наличии у обследуемого предрасположенности к развитию ГЦК. Обеспечивается повышение чувствительности и достоверности диагностики, снижение ложноположительных (низкие уровни экспрессии гена IFNAR-1) результатов, а значит и расширение возможностей метода, расширение арсенала средств, используемых для прогноза развития гепатоцеллюлярной карциномы при вирусном гепатите. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 3 ил., 3 табл., 3 пр.
Description
Группа изобретений относится к биотехнологии и медицине, а именно к инфекционным болезням и медицинской генетике, в частности к проблеме прогностической оценки развития гепатоцеллюлярной карциномы при хронических вирусных гепатитах. Диагностику проводят с использованием ДНК, выделенной из цельной крови или сухих пятен крови (сухой капли крови).
Вирусные гепатиты (ВГ), предпосылкой которых являются вирусы гепатита В (ВГВ), С (ВГС), D (BID), относятся к наиболее значимым причинам заболеваемости и смертности во всем мире. Несмотря на наличие прививок от вируса гепатита В (ВГВ), эффективность которых составляет от 98% до 100%, именно этот патоген стал причиной примерно 820000 смертей в 2019 году. Причем смерти были связаны преимущественно с последствиями цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномой (ГЦК) [Robinson A, Wong R, Gish RG. Chronic Hepatitis В Virus and Hepatitis D Virus: New Developments. Clin Liver Dis. 2023 Feb;27(1):17-25. doi: 10.1016/j.cld.2022.08.001].
Гепатоцеллюлярная карцинома является четвертой по значимости причиной смертности от рака во всем мире и ведущей причиной смерти при циррозе печени. Прогноз при ГЦК неблагоприятный, во всем мире смертность приближается к показателям заболеваемости [Ganesan Р, Kulik LM. Hepatocellular Carcinoma: New Developments. Clin Liver Dis. 2023 Feb;27(1):85-102. doi: 10.1016/j.cld.2022.08.004]. Ранняя диагностика с постоянным наблюдением демонстрировала лучшие результаты, чем диагностика на основе симптомов, с соответствующими объединенными показателями 3-летней выживаемости 50,8% и 21,9%. Однако большинство случаев ГЦК диагностируется на поздних стадиях, что приводит к росту и метастазированию злокачественной опухоли и высокой смертности [Li Q, Chen К, Huang W, Ma H, Zhao X, Zhang J, Zhang Y, Fang C, Nie L. Minimally invasive photothermal ablation assisted by laparoscopy as an effective preoperative neoadjuvant treatment for orthotopic hepatocellular carcinoma. Cancer Lett. 2021 Jan 1;496:169-178. doi: 10.1016/j.canlet.2020.09.024]. Рентгеновская компьютерная томография (KT), магнитно-резонансная томография (МРТ) и ультразвуковое исследование (УЗИ) позволяют визуализировать солидные опухоли глубоко в тканях, однако их чувствительности недостаточно для обнаружения очагов ГЦК размером около миллиметра. Оптическая визуализация ГЦК представляет огромный интерес из-за биобезопасности, превосходной чувствительности и возможности молекулярной визуализации, но она не может обеспечить высокое разрешение в глубоких тканях. Таким образом, ранняя диагностика ГЦК по-прежнему представляет собой клиническую проблему [Qi S, Zhang Y, Liu G, Chen J, Li X, Zhu Q, Yang Y, Wang F, Shi J, Lee CS, Zhu G, Lai P, Wang L, Fang C. Plasmonic-doped melanin-mimic for CXCR4-targeted NIR-II photoacoustic computed tomography-guided photothermal ablation of orthotopic hepatocellular carcinoma. Acta Biomater. 2021 Jul 15;129:245-257. doi: 10.1016/j.actbio.2021.05.034].
Диагностика и наблюдение за ГЦК развиваются с появлением новых биомаркеров и разработкой рекомендаций по персонализированному скринингу, основанных на причине и факторах риска заболевания. К таким факторам относятся как инфицирование гепатотропными патогенами, прежде всего вирусами гепатита В, С, D, так и нарушение обмена веществ и/или особенности метаболизма индивидуума. Неинвазивное прогнозирование долгосрочного риска ГЦК при прогрессирующем фиброзе печени, инфекции вирусными гепатитами и других факторах риска крайне необходимо для скрининга ГЦК [Fujiwara N, Kobayashi М, Fobar AJ, Hoshida A, Marquez С A, Koneru B, Panda G, Taguri M, Qian T, Raman I, Li QZ, Hoshida H, Sezaki H, Kumada H, Tateishi R, Yokoo T, Yopp AC, Chung RT, Fuchs ВС, Baumert TF, Marrero JA, Parikh ND, Zhu S, Singal AG, Hoshida Y. A blood-based prognostic liver secretome signature and long-term hepatocellular carcinoma risk in advanced liver fibrosis. Med (N Y). 2021 Jul 9;2(7):836-850.e10. doi: 10.1016/j.medj.2021.03.017].
К биомаркерам, способным дать прогностические сведения о риске развития ГЦК несомненно следует отнести мутации ряда генов человека. В том числе генов, потенциально влияющих на конверсию острой инфекции ВГ в хроническую, развитие цирроза печени и ГЦК. Особенно важным это становится в связи с тем, что элиминация вируса, особенно на поздних стадиях заболевания, не гарантирует окончательного заживления повреждения печени и не устраняет риск декомпенсации печени или развития ГЦК [Wirth ТС, Manns MP. The impact of the revolution in hepatitis С treatment on hepatocellular carcinoma. Ann Oncol. 2016;27: 1467-1474. doi: 10.1093/annonc/mdw219]. Изменчивость различных генов иммунной системы может объяснить различия в исходе инфекции. Например, известна связь семи однонуклеотидных замен в генах IL-28B (rs12979860), JAK1 (rs11576173 и rs1497056), TYK2 (rs280519), OAS1 (rs2057778), SOCS1 (rs33932899) и RNASEL (rs3738579) с тяжелой степенью некровоспалительной активности печени у пациентов с ХГС [Lopez-Rodriguez R, Hernandez-Bartolome A, Borque MJ, Rodriguez-Munoz Y, Martin-Vilchez S, Garcia-Buey L, Gonzalez-Moreno L, Real-Martinez Y, Munoz de Rueda P, Salmeron J, Vidal-Castineira JR, Lopez-Larrea C, Rodrigo L, Moreno-Otero R, Sanz-Cameno P. Interferon-related genetic markers of necroinflammatory activity in chronic hepatitis C. PLoS One. 2017 Jul 12;12(7):e0180927. doi: 10.1371/journal.pone.0180927].
Интерфероны (IFN)-α/β представляют собой цитокины, участвующие как в врожденном, так и в адаптивном иммунном ответе. Интерферон типа 1 (IFN1) представляет собой первую линию иммунной защиты хозяина, играет значимую роль во врожденном иммунном ответе и является важным цитокином, опосредующим противовирусный ответ хозяина. Индуцированные интерфероном пути передачи сигнала представляют собой точно настроенную сеть взаимодействий, которые запускаются при связывании IFN с его рецептором (IFNR). Поскольку IFN являются противоопухолевыми и противовирусными цитокинами, ожидается, что генетические профили генов, участвующих в этих путях передачи сигнала (например, IFNR), будут влиять на восприимчивость пациентов к раку и, при вовлечении ВГВ, к хроническому вирусному гепатиту В и связанной с ВГВ ГЦК [Karamitros Т, Papatheodoridis G, Paraskevis D, Hatzakis A, Mbisa JL, Georgopoulou U, Klenerman P, Magiorkinis G. Impact of Interferon-α Receptor-1 Promoter Polymorphisms on the Transcriptome of the Hepatitis В Virus-Associated Hepatocellular Carcinoma. Front Immunol. 2018 Apr 16;9:777. doi: 10.3389/fimmu.2018.00777].
Известно, что полиморфные варианты IFNAR-1 в промоторной области гена (-568, -408, -77 и -3) и в кодирующих областях (C/G в интроне 3 и C/G в экзоне 4) связаны с предрасположенностью к хронизации вирусного гепатита и его прогрессированию [Rehman SU, Rauf М, Abbas Z, Hamed MH, Qadri I. Role of Some Predominant Host Immunomodulators' Single Nucleotide Polymorphisms in Severity of Hepatitis В Virus and Hepatitis С Virus Infection. Viral Immunol. 2016 Dec;29(10):536-545. doi: 10.1089/vim.2016.0062]. Известно, что IFNAR-1 является одним из генов, чья экспрессия связана с канцерогенезом печени [Bellodi-Privato М, Kubrusly MS, Stefano JT, Soares 1С, Wakamatsu A, Oliveira AC, Alves VA, Bacchella T, Machado MC, D'Albuquerque LA. Differential gene expression profiles of hepatocellular carcinomas associated or not with viral infection. Braz J Med Biol Res. 2009 Dec;42(12):119-1127. doi: 10.1590/s0100-879x2009005000037; Damdinsuren B, Nagano H, Wada H, Noda T, Natsag J, Marubashi S, Miyamoto A, Takeda Y, Umeshita K, Doki Y, Dono K, Monden M. Interferon alpha receptors are important for antiproliferative effect of interferon-alpha against human hepatocellular carcinoma cells. Hepatol Res. 2007 Jan;37(1):77-83. doi: 10.1111/j.l872-034X.2007.00007.x].
Таким образом, определение мутаций гена IFNAR-1 и уровня его экспрессии у инфицированных ВГВ, ВГС, BTD лиц дает ценную прогностическую информацию в отношении возможного развития гепатоцеллюлярной карциномы, что позволяет выявлять пациентов для углубленного обследования, своевременного назначения адекватной терапии, а также проведения комплекса профилактических мероприятий.
Известен способ определения уровня экспрессии гена IFNAR-1 в цельной крови [Lalle Е, Bordi L, Caglioti С, Garbuglia AR, Castilletti С, Taibi С, Cristofari F, Capobianchi MR. IFN-Alpha receptor-1 upregulation in PBMC from HCV naive patients carrying cc genotype, possible role of IFN-lambda. PLoS One. 2014 Apr 1;9(4):e93434. doi: 10.1371/journal.pone.0093434]. Недостатком метода является необходимость для работы предварительного выделения мононуклеаров из периферической крови, а также использование только одного нормировочного гена, кроме того, не проводится определение мутаций гена IFNAR-1 в рамках этого способа, в то время как есть мутации, не влияющие на уровень экспрессии основного транскрипта IFNAR-1, однако играющие регулирующую роль в экспрессии вторичного, укороченного, специфичного для ГЦК транскрипта, что, в свою очередь, совпадает с нарушениями сигнальных путей, связанных с раком, и модификациями экспрессии FN-1 [Karamitros Т, Papatheodoridis G, Paraskevis D, Hatzakis A, Mbisa JL, Georgopoulou U, Klenerman P, Magiorkinis G. Impact of Interferon-a Receptor-1 Promoter Polymorphisms on the Transcriptome of the Hepatitis В Virus-Associated Hepatocellular Carcinoma. Front Immunol. 2018 Apr 16;9:777. doi: 10.33 89/fimmu.2018.00777].
Известен способ определения потенциально патогенетически значимых мутаций гена IFNAR-1 при оценке повышения риска развития хронического вирусного гепатита В [Zhang G, deWeerd NA, Stifter SA, Liu L, Zhou B, Wang W, Zhou Y, Ying В, Ни X, Matthews AY, Ellis M, Triccas JA, Hertzog PJ, Britton WJ, Chen X, Feng CG. A proline deletion in IFNAR1 impairs IFN-signaling and underlies increased resistance to tuberculosis in humans. Nat Commun. 2018 Jan 8;9(1):85. doi: 10.1038/s41467-017-02611-z]. Недостатком способа является необходимость для работы предварительного выделения мононуклеаров из периферической цельной крови, а также определение ряда мутаций без возможности анализа полиморфизма всех экзонов гена IFNAR-1, кроме того, не осуществляется одновременной оценки уровня экспрессии IFNAR-1, в то время как он может быть связан не только с собственными мутациями, но и с мутациями иных генов, участвующих в общих с IFNAR-1 сигнальных путях [Chen J, Xu W, Chen Y, Xie X, Zhang Y, Ma C, Yang Q, Han Y, Zhu C, Xiong Y, Wu K, Liu F, Liu Y, Wu J. Matrix Metalloproteinase 9 Facilitates Hepatitis В Virus Replication through Binding with Type I Interferon (IFN) Receptor 1 To Repress IFN/JAK/STAT Signaling. J Virol. 2017 Mar 29;91(8):e01824-16. doi: 10.1128/JVI.01824-16], а также с наличием вирусной инфекции [Sedefio-Monge V, Santos-Lopez G, Rocha-Gracia RC, Melendez-Mena D, Ramirez-Mata A, Vallejo-Ruiz V, Reyes-Leyva J. Quantitative analysis of interferon alpha receptor subunit 1 and suppressor of cytokine signaling 1 gene transcription in blood cells of patients with chronic hepatitis C. Virol J. 2010 Sep 18;7:243. doi: 10.1186/1743-422X-7-243].
Наиболее близким по сущности к заявляемому изобретению и выбранным за прототип является метод, предложенный в работе Mohammadarian Akbari с соавторами [Akbari М, Akhavan-Bahabadi М, Shafigh N, Taheriazam A, Hussen ВМ, Sayad A, Fathi М, Taheri М, Ghafouri-Fard S, Fathi M. Expression analysis of IFNAR1 and TYK2 transcripts in COVID-19 patients. Cytokine. 2022 May; 153:155849. doi: 10.1016/j.cyto.2022.155849]. Согласно методу, тотальную РНК выделяют из цельной крови, затем осуществляют обратную транскрипцию, получая кДНК, и проводят амплификацию целевого гена одновременно с эталонным нормировочным геном HPRT, уровень экспрессии оценивают по значениям Ct. Недостатком способа является использование одного нормировочного гена для нормирования данных. Недостатком способа нормирования данных с использованием одного эталонного гена является вариабельность результатов анализа, так как не существует идеального нормировочного гена, постоянного в независимости от ткани и состояния клеток в анализируемом образце. В связи с этим выбор эталонного гена является одним из самых ответственных этапов при проведении анализа. Наиболее оптимальным можно считать подход, при котором анализируется одновременно несколько эталонных генов. Кроме того, недостатком является то, что не проводится определение мутаций гена IFNAR-1, в то время как есть мутации, не влияющие на уровень экспрессии основного транскрипта IFNAR-1, однако играющие регулирующую роль в экспрессии вторичного, укороченного, специфичного для ГЦК транскрипта, как уже было упомянуто выше.
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является расширение арсенала способов, предназначенных для оценки на доклиническом этапе генетической предрасположенности человека к развитию гепатоцеллюлярной карциномы при вирусном гепатите.
Технический результат - повышение чувствительности и достоверности диагностики, снижение ложноположительных (низкие уровни экспрессии гена IFNAR-1) результатов, а значит и расширение возможностей метода, расширение арсенала средств, используемых для прогноза развития гепатоцеллюлярной карциномы при вирусном гепатите.
Авторами предложен способ, согласно которому в образце кДНК, полученном при выделении РНК в присутствии ДНКазы из биологического материала (цельной крови или сухой капли крови) с последующей обратной транскрипцией, определяют уровень экспрессии целевого гена IFNAR-1 и двух эталонных нормировочных генов HPRT и RPP30. Регистрируют полученные результаты посредством гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени. Уровень экспрессии целевого гена IFNAR-1 определяют путем пересчета полученных в ходе работы значений на калибровочных графиках с использованием в качестве калибраторов серии последовательных разведений контрольного образца, представляющего собой ранее охарактеризованный образец кДНК, в котором представлен ген IFNAR-1 дикого типа. Параллельно осуществляют ПНР для получения протяженных продуктов амплификации нуклеотидной последовательности транскрипта целевого гена.
Сущность метода заключается в том, что экстрагируют РНК из цельной крови или сухих пятен крови (сухой капли крови), осуществляют обратную транскрипцию, получая кДНК, после чего используют полученный образец кДНК для одновременной амплификации в одной емкости участков целевого гена IFNAR-1 и двух эталонных нормировочных генов HPRT и RPP30, а также для амплификации в других емкостях фрагментов транскрипта гена IFNAR-1 с последующим секвенированием по Сэнгеру.
Состав амплификационной смеси представляет собой буферный раствор, содержащий Трис-HCl рН 8,8 (при 25°С), KCl, 6-7 мМ MgCl2, дезоксинуклеозидтрифосфаты, глицерол, Tween 20, Phusion-полимераза.
При определении нуклеотидной последовательности полного транскрипта гена IFNAR-1 для амплификации и последующей секвенирующей реакции используют набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров, комплементарных участкам выявляемых фрагментов, при этом в одной емкости для ПНР используют пару праймеров IFNAR-1F1/R1, фланкирующую фрагмент протяженностью 5944 нуклеотидов, область 1-5944 нт., согласно представленной в международной базе данных GenBank референтной последовательности (NM_001384504.1), в другой емкости используют пару праймеров IFNAR-1F2/R2, фланкирующую фрагмент протяженностью 4607 нуклеотидов, область 1551-6157 нт., для секвенирующих реакций используют уже упомянутые праймеры, а также праймеры IFNAR-1F3/R3, IFNAR-1F4/R4, IFNAR-1F5/R5:
ПЦР и детекцию результатов проводят при следующих условиях: после денатурации при 95°С в течение 15 минут устанавливают 45 циклов амплификации в режиме: 95°С - 30 сек, 52°С - 30 сек, 72°С - 6 мин 30 сек; после 15-го и 30-го циклов элонгация при 72°С - 8 мин; затем финальная элонгация при 72°С - 10 мин.
При определении уровня экспрессии для амплификации используют набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и соответствующих флуоресцентно меченых зондов, комплементарных участкам выявляемых фрагментов:
ПЦР и детекцию результатов проводят при следующих условиях:
Первичный анализ результатов проводят с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».
Анализируют кривые накопления флуоресцентного сигнала по четырем каналам:
- по каналу для флуорофора HEX регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента гена IFNAR-1;
- по каналу для флуорофора Су5 регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента гена HPRT;
- по каналу для флуорофора ROX регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента ДНК RPP30.
Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (устанавливается в середине линейного участка прироста флуоресценции положительного контроля в логарифмической шкале), что определяет наличие (или отсутствие) для данной пробы значения порогового цикла Ct в соответствующей графе в таблице результатов. Результат амплификации по каналу считается положительным, если кривая однократно пересекается с пороговой линией в области достоверного прироста флуоресценции, отрицательным в случае отсутствия пересечения кривой с пороговой линией (нет значения Ct), сомнительным во всех других случаях.
Анализ экспрессии IFNAR-1 проводят с нормализацией на эталонные гены, при этом вводится «нормировочный коэффициент», вычисляемый как среднее геометрическое или среднее арифметическое от значения всех эталонных нормировочных генов. Относительный уровень экспрессии IFNAR-1 определяют с использованием метода ΔΔCT [Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 2001 Dec;25(4):402-8. doi: 10.1006/meth.2001.1262] в сравнении с последовательной серией разведений кДНК охарактеризованного образца-калибратора, в котором представлен ген IFNAR-1 дикого типа, на основании чего делают выводы о нормальном или сниженном уровне экспрессии целевого гена.
При выявлении сниженной экспрессии IFNAR-1 и/или мутаций нуклеотидной последовательности транскрипта, приводящей к изменениям аминокислотной последовательности продукта гена, делают вывод о наличии у обследуемого предрасположенности к развитию ГЦК.
Сущность изобретения поясняется чертежами, где на фиг.1 представлены кривые флуоресценции трех последовательных разведений кДНК контрольного образца-калибратора, в котором представлен ген IFNAR-1 дикого типа, отражающие динамику образования продукта реакции в ходе амплификации всех анализируемых генов, включая один целевой ген IFNAR-1 (HEX - зеленый) и два нормировочных HPRT (Су5 - фиолетовый), RPP30 (ROX - оранжевый) при «диком» генотипе; на фиг.2 представлены калибровочные графики, демонстрирующие эффективность ПЦР целевого и нормировочных генов. А также фиг.3 где представлены кривые флуоресценции, отражающие динамику образования продукта реакции в ходе амплификации всех анализируемых генов, включая один целевой ген IFNAR-1 (HEX - зеленый) и два нормировочных HPRT (Су5 - фиолетовый), RPP30 (ROX - оранжевый) при сниженном уровне экспрессии IFNAR-1.
Таким образом, предложенный способ отличается от прототипа использованием двух эталонных нормировочных генов HPRT и RPP30 при оценке уровня экспрессии целевого гена IFNAR-1, оценкой не только экспрессии гена IFNAR-1, но и нуклеотидной последовательности его транскрипта для выявления патогенетически значимых мутаций, набором олигодезоксирибонуклеотидных праймеров.
Ниже приведены примеры конкретного использования предложенного метода, являющиеся одним из возможных способов его реализации.
Пример 1
Исследованы биоптаты печени и образцы цельной крови, полученные от 298 пациентов с хроническим вирусным гепатитом В с различной тяжестью течения и прогрессированием заболевания. Показана ассоциация полиморфизма L168V-C/G в 4 экзоне (rs2257167) с острой печеночной недостаточностью, развившейся на фоне хронической, и ГЦК: χ2=4,287 OR=3,7, df=1,95% ДИ: 1,185 - 1,913%, р<0,0384.
Пример 2
Обследованы 78 больных хроническим вирусным гепатитом В с установленной ГЦК, а также 134 больных без тяжелой патологии печени и 200 условно здоровых лиц. Показано значительное снижение уровня экспрессии IFNAR-1 у пациентов с ГЦК по сравнению с больными ХГВ без осложнений и по сравнению со здоровыми людьми - χ2=8,472, р<0,05. Показан высокий риск развития ГЦК при снижении уровня экспрессии IFNAR-1: OR=3,8 df=1,95% ДИ: 1,610 - 8,970%, р=0,0024.
Пример 3
Обследовали жителей стран Средней Азии, в том числе 119 условно здоровых лиц и 149 больных ХГВ с ГЦК или ОХПН. Показана ассоциация полиморфизма I499T-T/C в 11 экзоне (rs113181057) с ОХПН: χ2=6,44 OR=3,008, df=1,95% ДИ: 1,352 - 6,694%, р=0,0111, а также с ГЦК: χ2=13,492 OR=5,207, df=1,95% ДИ: 2,194 - 12,355%, р<0,0002.
--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="СПОСОБ
ПРОГНОСТИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ РАЗВИТИЯ ГЕПАТОЦЕЛЛЮЛЯРНОЙ КАРЦИНОМЫ НА ОСНОВЕ
ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА ЧЕЛОВЕКА IFNAR-1 И НАБОР
ОЛИГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ.xml" softwareName="WIPO
Sequence" softwareVersion="2.2.0" productionDate="2023-02-20">
<ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>2022131541/20(068845)</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2022-12-01</FilingDate>
</ApplicationIdentification>
<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное бюджетное учреждение
науки «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт
эпидемиологии и микробиологии им. Пастера Федеральной службы по
надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека»
(ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера), ул. Мира, 14
, Санкт-Петербург, 197101, Российская Федерация</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>Saint-Petersburg Pasteur Institute
</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Способ прогностической оценки
развития гепатоцеллюлярной карциномы на основе определения
полиморфизма гена человека IFNAR-1 и набор
олигодезоксирибонуклеотидных праймеров</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>19</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q3">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Forward PCR primer</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cagcacctgatggcctatcac</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q7">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Reverse primer PCR</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q6">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tggagcatgaagaactggatg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q10">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Oligonucleotide fluorescent probe
carrying a HEX fluorophore at the 5' end and a dark quencher
RTQ1 or BHQ1 at the 3' end</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q9">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ggccagcaagcgcatctccag</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q13">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Forward PCR primer</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q12">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cttgctcgagatgtgatgaagg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="5">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>25</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q16">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Reverse primer PCR</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q15">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cagcaggtcagcaaagaatttatag</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="6">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>30</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..30</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q19">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Oligonucleotide fluorescent probe
carrying a Cy5 fluorophore at the 5' end and a dark quencher
RTQ2 or BHQ2 at the 3' end</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q18">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>atcacattgtagccctctgtgtgctcaagg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="7">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>16</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..16</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q22">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Forward PCR primer</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q21">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tttggacctgcgagcg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="8">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q25">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Reverse primer PCR</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q24">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gagcggctgtctccacaagt</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="9">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q28">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Oligonucleotide fluorescent probe
carrying a ROX fluorophore at the 5' end and a dark quencher
RTQ2 or BHQ2 at the 3' end</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q27">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ttctgacctgaaggctctgcgcg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="10">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q31">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Forward PCR primer</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q30">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gctctcgctctgcacacag</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="11">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q34">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Reverse primer PCR</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q33">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tgaagagcctccttggaacg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="12">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>26</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..26</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q37">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Forward PCR primer</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q36">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gagatgcatcaattatgtcttctttc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="13">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>27</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..27</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q40">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Reverse primer PCR</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q39">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tggaagttactggtattttgttattac</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="14">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q43">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Forward PCR primer</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q42">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tctgtgttcctgtccatcactg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="15">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q46">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Reverse primer PCR</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q45">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gccttcaaccttttcttccacc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="16">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q48">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Forward PCR primer</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q47">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ggtggaagaaaaggttgaaggc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="17">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q51">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Reverse primer PCR</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q50">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gagtggaatgcaactgcctttt</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="18">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q54">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Forward PCR primer</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q53">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ttttcagtgaacaagcgctgag</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="19">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q57">
<INSDQualifier_name>note</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Reverse primer PCR</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q56">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gagcctccttggaacgaactaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
Claims (4)
1. Способ прогностической оценки развития гепатоцеллюлярной карциномы на основе определения полиморфизма гена человека IFNAR-1, предусматривающий экстракцию РНК из биологического материала с последующей обратной транскрипцией и проведением полимеразной цепной реакции, при этом в одной из емкостей осуществляют амплификацию фрагмента целевого генов и эталонных нормировочных генов с использованием набора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и соответствующих флуоресцентно меченых зондов, комплементарных участкам выявляемых фрагментов, отличающийся тем, что используют IFNAR-1F-cagcacctgatggcctatcac, IFNAR-1R-tggagcatgaagaactggatg, IFNAR-1zondFffiX-HEX-ggccagcaagcgcatctccag-BHQ1, FIPRTF-cttgctcgagatgtgatgaagg, FIPRTR-cagcaggtcagcaaagaatttatag, HPRT-zondCy5-Cy5-atcacattgtagccctctgtgtgctcaagg-RTQ2/BHQ2, RPP30F-tttggacctgcgagcg, RPP30R-gagcggctgtctccacaagt, RPP30-zondROX-ROX-ttctgacctgaaggctctgcgcg-RTQ2/BHQ2, при этом анализ результатов проводят с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени, анализ целевых генов проводят с нормализацией на эталонные гены, при этом используют нормировочный коэффициент, вычисляемый как среднее геометрическое или среднее арифметическое от значения всех эталонных нормировочных генов, относительный уровень экспрессии IFNAR-1 определяют с использованием метода ААСТ в сравнении с последовательной серией разведений кДНК охарактеризованного образца-калибратора, в котором представлен ген IFNAR-1 дикого типа, на основании чего делают выводы о нормальном или сниженном уровне экспрессии целевого гена, одновременно в двух других емкостях для определения нуклеотидной последовательности транскрипта гена IFNAR-1 осуществляют амплификацию фрагментов 1-5944 нт. и 1551-6157 нт. (NM_001384504.1) с использованием следующих праймеров, комплементарных участкам выявляемых фрагментов: IFNAR-1F1-gctctcgctctgcacacag, IFNAR-1R1-tgaagagcctccttggaacg, IFNAR-1F2-gagatgcatcaattatgtcttctttc, IFNAR-1R2-tggaagttactggtattttgttattac, продукты амплификации затем используют для секвенирующей реакции, применяя вышеуказанные олигонуклеотидные праймеры, а также следующие дополнительные: IFNAR-1F3-tctgtgttcctgtccatcactg, IFNAR-1R3-gccttcaaccttttcttccacc, IFNAR-1F4-ggtggaagaaaaggttgaaggc, IFNAR-1R4-gagtggaatgcaactgcctttt, IFNAR-1F5-ttttcagtgaacaagcgctgag, IFNAR-1R5-gagcctccttggaacgaactaa.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что проводят одновременную амплификацию в одной емкости участков целевого гена IFNAR-1 и двух эталонных нормировочных генов HPRT и RPP30.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что одновременно с оценкой уровня экспрессии целевого гена осуществляют также определение нуклеотидной последовательности его транскрипта.
4. Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров для проведения амплификации целевого гена IFNAR-1 и эталонных нормировочных генов HPRT и RPP30: IFNAR-1F- cagcacctgatggcctatcac, IFNAR-1R-tggagcatgaagaactggatg, IFNAR-1zondHEX-HEX-ggccagcaagcgcatctccag-BHQ1, HPRTF-cttgctcgagatgtgatgaagg, HPRTR-cagcaggtcagcaaagaatttatag, HPRT-zondCy5-Cy5-atcacattgtagccctctgtgtgctcaagg-RTQ2/BHQ2, RPP30F-tttggacctgcgagcg, RPP30R-gagcggctgtctccacaagt, RPP30-zondROX-ROX-ttctgacctgaaggctctgcgcg-RTQ2/BHQ2, IFNAR-1F1-gctctcgctctgcacacag, IFNAR-1R1-tgaagagcctccttggaacg, IFNAR-1F2-gagatgcatcaattatgtcttctttc, IFNAR-1R2-tggaagttactggtattttgttattac, IFNAR-1F3-tctgtgttcctgtccatcactg, IFNAR-1R3-gccttcaaccttttcttccacc, IFNAR-1F4-ggtggaagaaaaggttgaaggc, IFNAR-1R4-gagtggaatgcaactgcctttt, IFNAR-1F5-ttttcagtgaacaagcgctgag, IFNAR-1R5-gagcctccttggaacgaactaa.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2811763C1 true RU2811763C1 (ru) | 2024-01-17 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109504763A (zh) * | 2018-12-17 | 2019-03-22 | 北京三元基因药业股份有限公司 | 用于预测α干扰素治疗乙肝患者疗效的分子标记 |
| RU2754038C2 (ru) * | 2017-03-08 | 2021-08-25 | Президент Энд Фэллоуз Оф Харвард Коллидж | Способы амплификации днк для сохранения статуса метилирования |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2754038C2 (ru) * | 2017-03-08 | 2021-08-25 | Президент Энд Фэллоуз Оф Харвард Коллидж | Способы амплификации днк для сохранения статуса метилирования |
| CN109504763A (zh) * | 2018-12-17 | 2019-03-22 | 北京三元基因药业股份有限公司 | 用于预测α干扰素治疗乙肝患者疗效的分子标记 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6753137B2 (en) | Circulating epstein-barr virus DNA in the serum of patients with gastric carcinoma | |
| Lu et al. | Investigation of serum lncRNA-uc003wbd and lncRNA-AF085935 expression profile in patients with hepatocellular carcinoma and HBV | |
| Iizuka et al. | Elevated levels of circulating cell-free DNA in the blood of patients with hepatitis C virus-associated hepatocellular carcinoma | |
| KR102040364B1 (ko) | 알츠하이머병 관련 ３０개 유전자를 이용한 유전적 진단방법 | |
| JP6203803B2 (ja) | 肝臓病変を評価する方法 | |
| US20040018522A1 (en) | Identification of dysregulated genes in patients with multiple sclerosis | |
| JP6092655B2 (ja) | テスト体液サンプルの分類方法 | |
| Kariyazono et al. | Rapid detection of the 22q11. 2 deletion with quantitative real-time PCR | |
| Fábryová et al. | On the origin and diagnostic use of salivary RNA | |
| RU2287158C1 (ru) | Способ прогнозирования развития гипертонической болезни по генетическим факторам риска | |
| Shi et al. | Gene expression signature for detection of gastric cancer in peripheral blood | |
| Mulla et al. | Association of interferon gamma inducible protein-10, monocyte chemoattractant protein-1, macrophage inflammatory protein-1 alpha, interleukin-6, and rs12252 single nucleotide polymorphism of interferon-induced transmembrane protein-3 gene with the severity of COVID-19 infection | |
| RU2811763C1 (ru) | Способ прогностической оценки развития гепатоцеллюлярной карциномы на основе определения полиморфизма гена человека IFNAR-1 и набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров | |
| US20070117105A1 (en) | Interferon assay | |
| Zekri et al. | Caspase recruitment domains. New potential markers for diagnosis of hepatocellular carcinoma associated with HCV in Egyptian patients | |
| CN107312828B (zh) | 与不同肿瘤生长速度肝癌相关的单核苷酸多态性位点及其应用 | |
| BR112020012280A2 (pt) | composições e métodos para diagnosticar cânceres de pulmão usando perfis de expressão de gene | |
| Zekri et al. | IL28B rs12979860 gene polymorphism in Egyptian patients with chronic liver disease infected with HCV | |
| US10407737B2 (en) | Methods and kits for identifying pre-cancerous colorectal polyps and colorectal cancer | |
| RU2442165C1 (ru) | Способ прогнозирования повышения индивидуального риска развития хронической обструктивной болезни легких, ассоциированной с ишемической болезнью сердца | |
| JP2015130852A (ja) | 関節リウマチ患者におけるメトトレキサートによる副作用の発現リスクの判定を補助する方法 | |
| JP4197623B2 (ja) | インターフェロンの治療効果を予測するための新規多型マーカー、プライマー、プローブおよびインターフェロンの治療効果を予測する方法 | |
| RU2723090C1 (ru) | Способ диагностики предрасположенности к почечно-клеточному раку на основе ПЦР-ПДРФ | |
| Kucińska et al. | The Use of CGH Arrays for Identifying Copy Number Variations in Children with Autism Spectrum Disorder | |
| JP6103866B2 (ja) | 大腸ガン検出方法、診断用キット及びｄｎａチップ |