CN107338305A - 一种用于pd‑1表达水平检测的试剂盒 - Google Patents

一种用于pd‑1表达水平检测的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于PD‑1表达检测的试剂盒，试剂盒包括特异性反转录引物、Q‑PCR特异性引物和探针。能检测肿瘤细胞内PD‑1表达水平的高低，此方法相对IHC，具有操作简单，灵敏度高、特异性好,只需2个小时就能完成检测的优点，可满足临床快速检测、指导用药的需求。

Description

一种用于PD-1表达水平检测的试剂盒
技术领域
本发明涉及一种生物技术领域，尤其涉及一种用于PD-1表达水平检测的试剂盒。
背景技术
PD-1(programmed death 1)程序性死亡受体1，最初在凋亡的小鼠T细胞杂交瘤中发现，属于CD28超家族成员，是一种由定位于染色体2q37.3的PD-1基因编码的Ⅰ型跨膜糖蛋白。PD-1主要表达于活化的T细胞、B细胞及活化抗原提呈细胞（包括单核细胞及树突状细胞）。PD-1配体主要有PD-L1和PD-L2，两者在相关研究中都可以发现在一些肿瘤细胞中有高表达。
研究表明，PD-1的表达与许多肿瘤的发生、发展及预后有关。肿瘤细胞可通过PD-1/PD-L1信号途径逃过免疫系统的监测和杀伤，参与肿瘤的免疫逃逸机制。当T细胞表面的受体PD-1与其配体PD-L1相互作用时，细胞内的ITSM发生磷酸化，招募SHP2磷酸酶类分子，从而激活RAS和PI3K/AKT信号通路，使下游的T细胞的活化被抑制，包括抑制细胞因子的产生和T细胞增殖并诱导T细胞凋亡等，转导负性信号，从而发挥负性调节作用。
PD-1在许多肿瘤组织中的表达发生明显上调。Zhang等研究证实，PD-1过表达与NSCLC密切相关。从21NSCLC患者中证实在肿瘤组织中CD8+T细胞PD-1的表达要远远高于外周血单核淋巴细胞（PBMC）中CD8+T细胞PD-1的表达。同时发现对于同一个患者，在其肿瘤组织中CD8+T细胞PD-1的表达也要远远高于PBMC中CD8+T细胞的表达。
肿瘤免疫治疗是通过调动机体的免疫系统，增强抗肿瘤免疫力，从而抑制和杀伤肿瘤细胞。肿瘤免疫治疗是当前肿瘤治疗领域中最具前景的研究方向之一。以PD-1及PD-L1为靶点的免疫抑制剂，可以阻断PD-1与PD-L1的结合，阻断负向调控信号，使T细胞恢复活性，增强T细胞免疫应答，对抗肿瘤的生长、转移有重要的临床意义。目前已上市的PD-1拮抗剂包括Opdivo，Keytruda和Tecentriq。FDA已批准上述三个PD-1抑制剂用于多种癌症的治疗，包括转移性非小细胞肺癌、黑色素瘤、头颈鳞癌、尿路上皮癌等。
发明内容
本发明的目的：提供一种用于PD-1表达检测的试剂盒，能检测肿瘤细胞内PD-1表达水平的高低，此方法相对IHC，具有操作简单，灵敏度高、特异性好,只需2个小时就能完成检测的优点，可满足临床快速检测、指导用药的需求。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是：
一种用于PD-1表达检测的试剂盒，包括特异性反转录引物、Q-PCR特异性引物和探针；
所述特异性反转录引物包括如下核苷酸序列：
PD-1反转录1：5’AGACTAGCAGCACCAGGCTG3’
GAPDH反转录2：5’ATACGACCAAATCCGTTGACT3’
所述Q-PCR特异性引物包括如下核苷酸序列：
PD-1F：GAGCTCAGGGTGACAGAGAGAAG3’
PD-1R：5’CAACCACCAGGGTTTGGAAC3’
GAPDHF:5’CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC3’
GAPDHR:5’ATGGTGTCTGAGCGATGTGG3’
所述探针包括如下核苷酸序列：
PD-1taqman:5’-FAM-CAGAAGTGCCCACAGC-MGB-3’
GAPDHTaqman:5’CGTCGCCAGCCGA3’
一种用于PD-1表达检测的试剂盒，通过所述试剂盒提取RNA样本，逆转录体系中将RNA逆转录成cDNA，并在PCR扩增体系中进行PCR扩增反应。
所述逆转录体系包括如下组份：
5×RT buffer 4µL
引物终浓度 200nM
dNTP 1mM
super RT 200U
RNA 6µL
补DEPC水至 20µL。
所述PCR扩增体系包括如下组份：
10XPCR Buffer 稀释为1X
dNTP 0.2mM
模板 2uL
各引物 200-400 nM
各探针 100-400 nM
热启动Taq酶 1U
MgCL2 2-5mM
总体积 20uL。
所述PCR扩增反应的条件如下：
一种用于PD-1表达检测的检测试剂盒的检测方法，所述检测方法至少包括如下步骤：
步骤1：针对PD-1表达设计合成引物和检测探针。
步骤2：样本处理与RNA的提取。
步骤3：RNA逆转录成cDNA
步骤4：建立PCR扩增反应体系。
步骤5：分析图像后调节Baseline的Start值、End值和阈值线，判定结果。
上述的用于PD-1表达检测的检测试剂盒的检测方法，其中，所述的RNA样本包括新鲜肿瘤组织或新鲜病理组织或石蜡包埋组织或新鲜血液。
上述的用于PD-1表达检测的检测试剂盒的检测方法，其中，取样的所述的RNA样本为1克。
本发明采用了PD-1特异探针和引物，可以检测肿瘤组织中RNA中PD-1的表达；创新性的利用RT-PCR的方法，提高了其灵敏度，大于传统的IHC方法；可以在外泌体和血小板RNA中检测PD-L1的表达；操作简单，检测廉价，可以大规模推广；检测速度快，检测过程大约需要2小时就可完成。
具体实施方式
以下进一步说明本发明的实施例。
一种用于PD-1表达检测的引物、探针，包括PD-1和GAPDH反转录引物，PD-1检测引物与探针，所述的PD-1和GAPDH引物与探针具体为：
所述反转录引物包括如下核苷酸序列：
PD-1反转录引物（PD-1）：5’AGACTAGCAGCACCAGGCTG3’
GAPDH反转录引物（GAPDH-2）：5’ATACGACCAAATCCGTTGACT3’
所述Q-PCR特异性引物包括如下核苷酸序列：
PD-1反转录引物（PD-1F）：GAGCTCAGGGTGACAGAGAGAAG3’
PD-1反转录引物（PD-1R）：5’CAACCACCAGGGTTTGGAAC3’
GAPDH检测引物（GAPDHF）:5’CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC3’
GAPDH检测引物（GAPDHR）:5’ATGGTGTCTGAGCGATGTGG3’
所述探针包括如下核苷酸序列：
PD-1taqman:5’-FAM-CAGAAGTGCCCACAGC-MGB-3’
GAPDHTaqman:5’CGTCGCCAGCCGA3’
一种用于PD-1表达检测的检测试剂盒的检测方法，该方法至少包括如下步骤：
步骤1：根据COSMIC数据公布的人类PD-1和GAPDH基因的基因序列，针对PD-1和GAPDH基因来设计引物和探针。通过PD-1和GAPDH特异性引物和探针体系优化，实现高灵敏和特异检测。
针对选定的PD-1和GAPDH序列，应用Premier 6.0引物设计软件设计多对特异引物和探针。
步骤2：提取检测样本的RNA，所述的检测样本包括新鲜病理组织、石蜡包埋组织和胸腔液。
步骤3：配制实时荧光PCR扩增反应体系。
步骤4：根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果：荧光信号的收集定为FAM，数据的采集定在60℃。
步骤5：实验结束后进行分析和判定。
在所述的步骤2中，还包括如下分步骤：
步骤2.1：取约1×1 cm2的各肺癌样本切片（共约4-5片切片）置于离心管（自备）中，加入1ml二甲苯，盖紧管盖，涡旋震荡10秒。
步骤2.2：12，000 rpm（～13，400×g）离心2分钟，小心吸弃上清，注意不要吸弃沉。
步骤2.3：加入1ml无水乙醇，涡旋震荡混匀；12，000 rpm离心2分钟，弃上清，注意不要吸弃沉淀。
步骤2.4：打开管盖，室温或最高至37°C孵育10分钟，直至无乙醇残留。
步骤2.5：加入150μl Buffer PKD，重悬沉淀；加入10 μl Proteinase K，涡旋震荡混匀。
步骤2.6：56℃孵育15分钟，直至样品完全溶解；80℃孵育15分钟；短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
步骤2.7：加入320μl Buffer RBC，涡旋震荡彻底混匀。
步骤2.8：将步骤2.7中所得到的溶液全部加入到已装入收集管（Collection Tube2 ml）的过滤柱（DNA Remover Column）中；10，000 rpm离心1分钟，收集滤液。
步骤2.9：在步骤2.8得到的滤液中，加入720μl无水乙醇，涡旋震荡彻底混匀。
步骤2.10：将步骤2.9中所得的溶液全部加入到已装入收集管（Collection Tube2 ml）的吸附柱（Spin Column RS）中；10，000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
步骤2.11：向吸附柱中加入500μl Buffer RW2，10，000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
步骤2.12：12，000 rpm离心2分钟，倒掉收集管中废液；将吸附柱置于室温数分钟以彻底晾干。
步骤2.13：将吸附柱置于一个新的无RNase离心管（Collection Tube 1.5 ml）中，向吸附柱的中间部位悬空加入20-50 μl RNase-Free Water，室温放置2-5分钟，10，000rpm离心1分钟，收集RNA溶液，准备后续实验。
在所述的步骤2.13中，所述的逆转录PCR反应体系如下：
5×Transcription Buffer 5uL
dNTP(10mM) 1.25uL
引物终浓度 200nM
Ribonuclease Inhibitor (40 U/μl) 0.7uL
MLV-Transcriptase 1uL
RNA 15uL
DEPC H2O 补足至25uL
在所述的步骤3中，所述的PCR扩增反应体系如下：
PCR扩增反应体系如下：
10XPCR Buffer 稀释为1X
dNTP 0.2mM
模板 2uL
各引物 200-400 nM
热启动Taq酶 1U
MgCL2 2-5mM
总体积 20uL。
所述的PCR反应的条件如下：
荧光信号的收集定为FAM，数据的采集定在60℃。
步骤4：分析图像后调节Baseline的Start值、End值和阈值线，判定结果。
反应结束后，仪器自动保存结果，分析图像后调节Baseline的Start值、End值（可自行调节，Start值可以在3-10之间，End值位于15-20之间，调整阴性质控品的扩增曲线使其平直或低于阈值线）和阈值线（Threshold值，可手动调整至baseline之上）。
Ct值及△Ct值的确定：用户根据实际情况确定各反应管扩展曲线升起的拐点处，得到其Ct值。△Ct=PD-1孔FAM荧光Ct值与参照孔Ct值的差值。检测孔Ct值是指样本检测孔对应的Ct值；参照孔Ct值是指样本GAPDH对应的Ct值。
结果判读如下：样本PD-1有S型曲线且△ct值>15时，PD-1弱表达；10≤△ct≤15时，PD-1中表达；△ct值≤10时，PD-1强表达。
所述的RNA样本包括新鲜肿瘤组织或新鲜病理组织或石蜡包埋组织或新鲜血浆。
取样的所述的PD-1样本为1克左右。
在所述的步骤5中，还包括如下分步骤：
步骤5.1：运行无模板对照（NTC）时，FAM信号无曲线升起，说明实验无污染存在，可以继续分析实验情况。
步骤5.2：运行阳性质控品分析，所有阳性质控的Ct值≤30.0，说明实验体系正常，可以继续分析实验结果；其Ct值也可能会由于不同仪器的不同阈值设置而发生波动。
步骤5.3：运行MIX5（ref）的Ct值计算，在FAM通道，如果Ct值≤42.0，可以继续分析；如果Ct值>42.0，则说明样本RNA降解严重，不适合实验需要。
步骤5.4：有效扩增曲线的定义及要求：典型扩增曲线具有三种典型时期，早期背景扩增期、中期指数扩增期（升高）和晚起的平台期，曲线整体形状呈S型。有效扩增曲线至少需要早期背景扩增期和中期指数扩增，曲线呈正常S型扩增趋势，方可计算曲线Ct值；其余曲线视为无效曲线，不予计算。
步骤5.5：在FAM通道中运行Ct的计算，根据每个位点的Ct值及有无扩增曲线，判定对应位点情况，具体结果判定结果为：
结果判读如下：样本PD-1有S型曲线且△ct值>15时，PD-1弱表达；10≤△ct≤15时，PD-1中表达；△ct值≤10时，PD-1强表达。
所述的mRNA反转录cDNA的操作方法，包括如下步骤：
步骤1：取逆转录反应混合液13µL，super RT逆转录酶1µl，加入无菌离心管中，混匀。
步骤2：加入待测样品RNA 6µL，RNA总量在0.1～5µg范围内至20µl。
步骤3：42°保温1个小时，85°C孵育5分钟；反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。
步骤4：逆转录产物可直接用于后续PCR反应和荧光定量PCR反应。
实施例1：
利用本发明体系检测质粒，实验用质粒模板（含PD-1基因），利用上述荧光PCR检测PD-1基因表达的方法如下：
（1）质粒处理与提取
质粒的提取采用TIANGEN（HighPure Plasmid kid，DP116）的质粒提取试剂盒进行提取，具体提取操作步骤按试剂盒说明操作。所提DNA溶于Tris-HCl (10mM,pH 8.0), 经紫外分光光度计检测提取质量，确定其浓度，然后用Tris-HCl (10mM,pH 8.0)溶液调整DNA浓度到20ng/ul作为稀释母液。
根据公式C拷贝浓度=（C质量浓度X6.02X1023）/MWDNA稀释野生型质粒为106个拷贝数/微升。
(2)建立PCR扩增反应体系：
将上述所得cDNA模板，用作实时荧光PCR扩增的模板，按照如下扩增体系进行PCR扩增
10XPCR Buffer 稀释为1X
dNTP 0.2mM
模板 2uL
各引物 200-400 nM
各探针 100-400 nM
热启动Taq酶 1U
MgCL2 2-5mM
总体积 20uL。
实时PCR反应条件如下：
荧光信号的收集定为FAM，数据的采集定在60℃。
实验结束以后，按以下步骤进行分析、判定：
1、运行无模板对照（NTC）时，FAM信号无曲线升起，说明实验无污染存在，可以继续分析实验情况。
2、运行阳性质控品分析，所有阳性质控的Ct值≤30.0，说明实验体系正常，可以继续分析实验结果；其Ct值也可能会由于不同仪器的不同阈值设置而发生波动。
3、运行GAPDH的Ct值计算，在FAM通道，如果Ct值≤42.0，可以继续分析；如果Ct值>42.0,则说明样本RNA降解严重，不适合实验需要。
4、有效扩增曲线的定义及要求：典型扩增曲线具有三种典型时期，早期背景扩增期、中期指数扩增期（升高）和晚起的平台期，曲线整体形状呈S型。有效扩增曲线至少需要早期背景扩增期和中期指数扩增，曲线呈正常S型扩增趋势，方可计算曲线Ct值；其余曲线视为无效曲线，不予计算。
5、在FAM通道中运行Ct的计算，根据每个位点的Ct值及有无扩增曲线，判定对应位点情况，具体结果判定如下：样本PD-1有S型曲线且△ct值>15时，PD-1弱表达；10≤△ct≤15时，PD-1中表达；△ct值≤10时，PD-1强表达。
灵敏度分析：取PD-1基因质粒经定量后浓度为1000个拷贝的样品DNA，进行10倍稀释，然后分别对3个浓度进行检测，每次反应加入5µL DNA.结果表明本发明的荧光PCR方法的灵敏度高，10拷贝DNA基因即可检出。
重复性试验：每个反应分别加入质粒DNA 1000拷贝、100拷贝，重复10次进行荧光PCR扩增，10次Ct值相差不到0.5个循环。
检测结果表明，本发明的检测体系可以准确检测质粒PD-1基因表达，检测的灵敏度可达到5-10拷贝。
实施例2：
运用本发明检测临床样本，取送我公司待检测的临床肺癌石蜡包埋组织样本120例，男性60例，女性60例，平均年龄为58岁，中位年龄52岁。利用本发明特异引物和探针荧光PCR体系检测120例临床样本的PD-1的基因表达如下：
(1)样本处理与RNA的提取
a．取约1×1 cm2的各肺癌样本切片（共约4-5片切片）置于离心管（自备）中，加入1 ml二甲苯，盖紧管盖，涡旋震荡10秒。
b．12，000 rpm（～13,400×g）离心2分钟，小心吸弃上清，注意不要吸弃沉。
c．加入1ml无水乙醇，涡旋震荡混匀。12，000 rpm离心2分钟，弃上清，注意不要吸弃沉淀。
d．打开管盖，室温或最高至37°C孵育10分钟，直至无乙醇残留。
e．加入150μl Buffer PKD，重悬沉淀；加入10μl Proteinase K，涡旋震荡混匀。
f．56℃孵育15分钟，直至样品完全溶解。80℃孵育15分钟。短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
g．加入320μl Buffer RBC，涡旋震荡彻底混匀。
h.将步骤g中所得到的溶液全部加入到已装入收集管（Collection Tube 2 ml）的过滤柱（DNA Remover Column）中。10，000 rpm离心1分钟，收集滤液。
i.在步骤h得到的滤液中，加入720μl无水乙醇，涡旋震荡彻底混匀。
j.将步骤i中所得的溶液全部加入到已装入收集管（Collection Tube 2 ml）的吸附柱（Spin Column RS）中。10，000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
k.向吸附柱中加入500μl Buffer RW2，10，000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
l.12，000 rpm离心2分钟，倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分钟以彻底晾干。
m.将吸附柱置于一个新的无RNase离心管（Collection Tube 1.5 ml）中，向吸附柱的中间部位悬空加入20-50 μl RNase-Free Water，室温放置2-5分钟，10，000 rpm离心1分钟，收集RNA溶液，准备后续实验。
(2)建立PCR扩增反应体系
将所提上述RNA溶于0.1%DEPC水中，经紫外分光光度计检测提取质量，确定其浓度OD260/OD280为1.9-2.1，并读其含量。取0.1～5µg的RNA A作为其c DNA合成的模板，采用康为世纪的RNA逆转录试剂盒合成cDNA，cDNA合成体系如下：
5×RT buffer 4µL
引物终浓度 200nM
dNTP 1mM
super RT 200U
RNA 6µL
补DEPC水至 20µL。
应用上述反转录体系按如下步骤进行逆转录。
(a)取逆转录反应混合液13µL, super RT逆转录酶1µL,加入无菌离心管中，混匀。
(b)加入待测样品RNA 6µL,RNA总量在 0.1～5µg范围内至20µL.
（c）42°C保温1个小时
(d)85°C保温5分钟后冰上冷却，得到cDNA 模板
将上述所得cDNA模板，用作实时荧光PCR扩增的模板，按照如下扩增体系进行PCR扩增：
10XPCR Buffer 稀释为1X
dNTP 0.2mM
模板 2uL
各引物 200-400 nM
各探针 100-400 nM
热启动Taq酶 1U
MgCL2 2-5mM
总体积 20uL。
实时PCR反应条件如下：
荧光信号的收集定为FAM，数据的采集定在60℃。
实验结束以后，按以下步骤进行分析、判定：
1、运行无模板对照（NTC）时，FAM信号无曲线升起，说明实验无污染存在，可以继续分析实验情况。
2、运行阳性质控品分析，所有阳性质控的Ct值≤30.0，说明实验体系正常，可以继续分析实验结果；其Ct值也可能会由于不同仪器的不同阈值设置而发生波动。
3、运行GAPDH的Ct值计算，在FAM通道，如果Ct值≤42.0，可以继续分析；如果Ct值>42.0,则说明样本RNA降解严重，不适合实验需要。
4、有效扩增曲线的定义及要求：典型扩增曲线具有三种典型时期，早期背景扩增期、中期指数扩增期（升高）和晚起的平台期，曲线整体形状呈S型。有效扩增曲线至少需要早期背景扩增期和中期指数扩增，曲线呈正常S型扩增趋势，方可计算曲线Ct值；其余曲线视为无效曲线，不予计算。
5、在FAM通道中运行Ct的计算，根据每个位点的Ct值及有无扩增曲线，判定对应位点情况，具体结果判定结果为：
结果判读如下：样本PD-L1有S型曲线且△ct值>15时，PD-1弱表达；10≤△ct≤15时，PD-1中表达；△ct值≤10时，PD-1强表达。
检测结果表明所检测120例肺癌样本中有12例PD-1高表达，高表达率为10%，同时对上述所有样本进行免疫组化检测对比，免疫组化检测结果表明>50%癌细胞表达的比例为11例患者，表明此方法检测与免疫组化有非常的一致性。
附表1：临床样本检测结果比较：
综上所述，本发明采用了PD-1特异性探针和引物，可以检测肿瘤组织中PD-1的mRNA表达水平；创新性的利用RT-PCR的方法，跟管家基因GAPDH比较，通过 2-△△CT算法，得到PD-L1的相对表达水平，提高了其灵敏度，大于传统的IHC方法；可以在血液中检测PD-1的表达；操作简单，检测廉价，可以大规模推广；检测速度快，检测过程大约需要2小时就可完成。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构变换，或直接或间接运用附属在其他相关产品的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (6)

1.一种用于PD-1表达检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括特异性反转录引物、Q-PCR特异性引物和探针；
所述特异性反转录引物包括如下核苷酸序列：
PD-1反转录1：5’AGACTAGCAGCACCAGGCTG3’
GAPDH反转录2：5’ATACGACCAAATCCGTTGACT3’
所述Q-PCR特异性引物包括如下核苷酸序列：
PD-1F：GAGCTCAGGGTGACAGAGAGAAG3’
PD-1R：5’CAACCACCAGGGTTTGGAAC3’
GAPDHF:5’CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC3’
GAPDHR:5’ATGGTGTCTGAGCGATGTGG3’
所述探针包括如下核苷酸序列：
PD-1taqman:5’-FAM-CAGAAGTGCCCACAGC-MGB-3’
GAPDHTaqman:5’CGTCGCCAGCCGA3’。
2.根据权利要求1所述的一种用于PD-1表达检测的试剂盒，其特征在于，通过所述试剂盒提取RNA样本，逆转录体系中将RNA逆转录成cDNA，并在PCR扩增体系中进行PCR扩增反应。
所述逆转录体系包括如下组份：
5×RT buffer 4µL
引物终浓度 200nM
dNTP 1mM
super RT 200U
RNA 6µL
补DEPC水至 20µL。
3.根据权利要求2所述的一种用于PD-1表达检测的试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增体系包括如下组份：
10XPCR Buffer 稀释为1X
dNTP 0.2mM
模板 2uL
各引物 200-400 nM
各探针 100-400 nM
热启动Taq酶 1U
MgCL2 2-5mM
总体积 20uL。
4.一种用于PD-1表达检测的检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述检测方法至少包括如下步骤：
步骤1：针对PD-1表达设计合成引物和检测探针;
步骤2：样本处理与RNA的提取;
步骤3：RNA逆转录成cDNA;
步骤4：建立PCR扩增反应体系;
步骤5：分析图像后调节Baseline的Start值、End值和阈值线，判定结果。
5.根据权利要求4所述的一种用于PD-1表达检测的检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述的RNA样本包括新鲜肿瘤组织或新鲜病理组织或石蜡包埋组织或新鲜血液。
6.根据权利要求4所述的一种用于PD-1表达检测的检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述的RNA样本为1克。
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