CN106636392A - 一种检测肿瘤微环境相关抗原表达的方法 - Google Patents

一种检测肿瘤微环境相关抗原表达的方法 Download PDF

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    • C12Q2600/158—Expression markers

Abstract

本发明公开了一种检测肿瘤微环境相关抗原表达的方法，包括以下步骤：步骤一：从实体瘤组织样品中提取样品RNA；步骤二：检验样品RNA；步骤三：以提取的检验合格的样品RNA为模板，oligo dT为引物进行RNA的反转录得到组织样品cDNA；步骤四：设计qPCR检测引物，通过qPCR扩增各组织样品cDNA，采集荧光信号。本发明的有益效果：发明人选取了多种肿瘤微环境相关抗原，并相应设计了对应的多种抗原引物，通过当前主流的基因表达分析方法，荧光定量PCR法特异性的检测抗原在组织样品的表达情况，通过本方法，得到肿瘤患者的微环境相关的多种抗原表达值，当医生为患者提供具有针对性的治疗方案时，该表达值具很强的参考性。

Description

一种检测肿瘤微环境相关抗原表达的方法
技术领域
本发明属于抗原表达检测技术领域，具体地说，涉及一种检测肿瘤微环境相关抗原表达的方法。
背景技术
近年的研究发现各种肿瘤的微环境，尤其是实体肿瘤，对机体抗肿瘤免疫反应有着极强的抑制作用。这些抑制机制主要有以下几个方面：第一，肿瘤细胞表面表达的PD-L1/PD-L2传递抑制性信号到T淋巴细胞表面的PD-1。由于PD-1是一个抑制性受体，T淋巴细胞对瘤细胞的杀伤功能受到抑制。一年来，美国FDA连续批准了抗PD-1抗体治疗肺癌，肾癌，及抗PD-L1抗体治疗晚期膀胱癌，表明阻断肿瘤微环境对肿瘤免疫反应的抑制是非常有效的治疗手段。第二，肿瘤中侵润的抑制性细胞亚群，调节性T淋巴细胞(Treg)。Treg可以直接抑制抗肿瘤的效应T细胞，而近年的研究发现低剂量的环磷酰胺可以有效的清除体内的Treg，增强抗肿瘤特异免疫反应。第三，肿瘤细胞内表达的一些抑制性酶，包括环氧化酶cyclooxygenases(Cox1/Cox2/PGE2)，和吲哚胺2，3-双加氧酶IDO-1/IDO-2/TDO-1。这些抑制性酶对机体的抗肿瘤反应都有极强的抑制作用。
针对这些抑制性酶，现有的药物如阿司匹林可以很好的抑制环氧化酶1和2的活性，预防肠癌的发生和复发。西乐葆抑制环氧化酶2的活性，在临床中与其他药物合用治疗肿瘤。需要强调的是来自不同患者的肿瘤具有非常不同的肿瘤微环境和不同的免疫抑制机制。因此，要想取得有效的治疗效果，必须对每一个患者的肿瘤微环境中的免疫抑制机制进行分析才能设计具有针对性的治疗方案。
肿瘤的免疫治疗需要采用综合手段，而现有技术中的免疫治疗通常只检测少数几种肿瘤相关的抗原，无法对整个的肿瘤微环境进行全面、透彻的分析，从这样的检测结果出发，也很难找到针对性的治疗方案。
发明内容
针对相关技术中的上述技术问题，本发明提出一种检测肿瘤微环境相关抗原表达的方法，能够针对肿瘤免疫微环境相关的多种抗原，检测结果可以成为治疗肿瘤可靠的参考，可供医生结合自身的治疗经验为患者找到更加个体化的治疗方案来进行免疫干预。
为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种检测肿瘤微环境相关抗原表达的方法，包括以下步骤：
步骤一：从实体瘤组织样品中提取样品RNA；
步骤二：检验样品RNA；
步骤三：以提取的检验合格的样品RNA为模板，oligo dT为引物进行RNA的反转录得到组织样品cDNA；
步骤四：设计qPCR检测引物，通过qPCR扩增各组织样品，采集荧光信号；
其中，设计用于qPCR扩增检测引物序列为以下9组：
GAPDHF：AGGTCGGAGTCAACGGATTTG；
GAPDHR：GTGATGGCATGGACTGTGGT；
COX1F：GGAGTTTGTCAATGCCACCT；
COX1R：GCAACTGCTTCTTCCCTTTG；
COX2F：ATGGAATTACCCAGTTTGTTGAATC；
COX2R：TGGAAGCCTGTGATACTTTCTGTACT；
PDL1F：GTGCATGATCAGCTATGGTGGTG；
PDL1R：CAGTTCATGTTCAGAGGTGACTGGA；
PDL2F：CTGGAATTGCAGCTTCACCAGA；
PDL2R：GTTGCATTCCAGGGTCACATTG；
IDO1F：AAAGGGGACCCGAGCAATG；
IDO1R：CTTCCTGGTGATAGCGGTTCG；
TDOF：GGGAACTACCTGCATTTGGA；
TDOR：GTGCATCCGAGAAACAACCT；
FOXP3F：TGACCAAGGCTTCATCTGTG；
FOXP3R：AGGAACTCTGGGAATGTGCT；
PGE2F：GTACTGGCTTCGTACGCGCG；
PGE2R：TAGCGCTCCAGGGCCATGGC。
进一步地，本发明还提供了一种用于步骤三的组织样品cDNA获得反应体系，共20ul，包括10X RT Buffer，2.0ul；25X dNTP Mix，0.8ul；10X oligo(dT)，2.0ul；逆转录酶，1.0ul；RNA酶抑制剂，1.0ul；样品RNA，1ug；其余部分为无核酸纯水；组织样品cDNA获得反应条件为25℃，10min；37℃，120min；85℃，5min；得到组织样品cDNA后在4℃下保存。
进一步地，本发明还提供了一种用于步骤四的qPCR检测反应体系，共15ul，包括组织样品cDNA，2μl；正向引物，0.5ul；反向引物，0.5ul；2XTransStart@Top Green qPCRSuperMix，7.5μl；双蒸水，4.5ul；qPCR检测反应条件为94℃，30s；94℃，5s；58℃，15s；72℃，10s；共40个循环。
本发明的有益效果：发明人选取了多种肿瘤微环境相关抗原，并相应设计了对应的多种抗原引物，通过当前主流的基因表达分析方法，荧光定量PCR法特异性的检测抗原在组织样品的表达情况，通过本方法，得到肿瘤患者的微环境相关的多种抗原表达值，当医生为患者提供具有针对性的治疗方案时，该表达值具很强的参考性。
附图说明
图1是根据本发明实施例所述的一种检测肿瘤微环境相关抗原表达的方法得出的BT048病人的微环境相关抗原表达值的柱形图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，该具体实施方式应理解为是为了进一步阐明本发明而不用以限制本发明。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。
实施例一：从实体瘤组织样品中提取样品RNA
1.1组织样品的选取和制备：手术切下的肿瘤组织及用作阴性对照的良性肿瘤组织，切除边缘，选取中间完好的组织块在最短的时间内放置于RNAlater中在-80℃下保存，防止RNA降解；其中，RNAlater是一种液态的，无毒的组织保存试剂。它能迅速稳定组织，保护非冷冻细胞RNA于原位。获得组织块后，迅速浸泡在RNAlater中保存，而不会引起RNA的降解，这样可以不必马上处理样品或将样品冷冻在液氮之中以备以后处理，属于本领域常规试剂，可从商业途径获得。
1.2取30mgRNAlater保存样品，加1ml TRIzol，充分研磨，使组织块充分裂解，按200μl/ml TRIzol的比例加入氯仿，充分震荡混匀，4℃，12000rpm离心15min；其中，TRIzol是一种总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA，属于本领域常规试剂，可从商业途径获得。
1.3小心吸取上层水相于另一新的EP管中，加入等体积异丙醇，沉淀RNA，4℃，12000rpm离心10min，收集沉淀的RNA；
1.4用75％乙醇洗涤沉淀得到的RNA，4℃，12000rpm离心10min；
1.5重复1.4步骤；
1.6弃掉乙醇，待乙醇挥发殆尽，适量DEPC水溶解组织样品RNA；其中DEPC水是用DEPC(diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压灭菌的纯水，不含杂质RNA、DNA和蛋白质，通过本领域常规技术手段可得到。
实施例二：检验样品RNA
用超微量分光光度计准确测得组织样品RNA浓度，其中，在本实施例中所用的超微量分光光度计型号为Nanodrop 2000。用生物分析仪对RNA进行质量分析，其中，在本实施例中所使用的生物分析仪型号为安捷伦2100，OD值在1.8～2.0之间且RIN值＞6的RNA样品符合抗原表达谱检测标准，为质量合格的RNA样品，采用其进行下一步实验。
实施例三：以提取的检验合格的样品RNA为模板，oligo dT为引物进行RNA的反转录得到组织样品cDNA
在冰上配置好如表1所示的cDNA获得反应体系，轻柔混匀反应体系，离心机短暂离心，再进行表2所示程序，获得模板cDNA。
表1.cDNA获得反应体系
组分 体积
10X RT Buffer(缓冲液) 2.0ul
25X dNTP Mix 0.8ul
10X oligo(dT) 2.0ul
Reverse Transcriptase(逆转录酶) 1.0ul
RNase Inhibitor(RNA酶抑制剂) 1.0ul
样品RNA 1ug
Nuclease-free H2O(无核酸纯水) 至20ul
表2.cDNA获得反应程序
步骤1 步骤2 步骤3 步骤4
温度 25℃ 37℃ 85℃ 4℃
时间 10min 120min 5min ∞
实施例四：设计qPCR检测引物，通过qPCR扩增各组织样品cDNA，采集荧光信号
4.1选用特异性胶质瘤相关抗原基因，设计对应引物，进行qPCR扩增，用以检测抗原表达水平，采用人内参基因(GAPDH)进行qPCR扩增各组织样品作为对照，以确保RNA的提取质量及获得的cDNA质量。根据本领域常规知识可知，GAPDH是甘油醛-3-磷酸脱氢酶的缩写，这个酶的基因是看家基因，也就是在机体各组织中的表达都趋于稳定和接近，可以作为RT-PCR的内参，也就是衡量模板取样量的一个参照物。申请人利用Primer 5、DNAMAN、DNAStar、NCBI等序列分析软件设计了8种肿瘤微环境相关抗原引物，抗原包括COX1、COX2、PDL1、PDL2、IDO1、TDO、FOXP3、PGE2。
表3 qPCR检测引物
4.2按照SYBR select master Mix试剂盒说明书严格在冰上配置好qPCR体系，体系如表4；轻柔混匀以上反应体系，并利用离心机短暂离心，按照表5程序进行qPCR扩增，采集荧光信号。其中，SYBR select master Mix试剂盒是用于实时荧光定量PCR的试剂盒，可从商业途径获得；TransStart@Top Green qPCR SuperMix是用于实时荧光定量PCR的试剂，可从商业途径获得。
表4.qPCR反应体系
表5.qPCR反应程序
实施例五：数据分析
本申请使用目前主流的RNA提取法-TRIzol法对组织样品的RNA进行提取，用通过对RNA进行质量分析，利用检验合格的RNA样品以当前主流的基因表达分析方法-荧光定量PCR法检测了8个常见的肿微环境瘤抗原相对癌旁正常组织的相当表达水平。
肿瘤抗原表达分析使用2-ΔΔCT法.表达倍数差异＝2-ΔΔCT。ΔΔCT＝[(CT目的基因-CT内参基因)肿瘤样品-(CT目的基因-CT内参基因)癌旁样品].每个样品投入的起始模板量使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)进行均一化。对于没有检测到的肿瘤抗原，以CT为40来计算表达差异。
申请人通过上述具体实施例一至四所描述的具体步骤检测了在一例胶质母细胞瘤(临床编号BT048)肿瘤微环境相关抗原的扩增Ct值及对于正常脑组织(N)的表达值，即Cq值，并用实施例五中所述的数据分析方法对检测结果进行了分析，得出的结果分别用表6及图1进行表示。
其中，表达倍数差异最高的抗原为COXl，为环氧化酶，是肿瘤细胞内表达的一种抑制性酶，对机体的抗肿瘤反应都有极强的抑制作用。现有的药物如阿司匹林可以很好的抑制COX1的活性，预防肠癌的发生和复发。由于来自不同患者的肿瘤具有非常不同的肿瘤微环境和不同的免疫抑制机制。因此，要想取得有效的治疗效果，必须对每一个患者的肿瘤微环境中的免疫抑制机制进行分析才能设计具有针对性的治疗方案。医生可以通过本发明所述的方法，以病人肿瘤微环境相关抗原表达情况的汇总为基础进行分析，从而找出最适合病人的用药方式和治疗方法。
表6.BT048病人肿瘤微环境相关抗原表达情况汇总
序列表
<110>暨南大学
<120>一种检测肿瘤微环境相关抗原表达的方法
<160>18
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<223>GAPDH正向引物
<400>
AGGTC GGAGT CAACG GATTT G 21
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223>GAPDH反向引物
<400>
GTGAT GGCAT GGACT GTGGT 20
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223>COX1正向引物
<400>
GGAGT TTGTC AATGC CACCT 20
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223>COX1反向引物
<400>
GCAAC TGCTT CTTCC CTTTG 20
<210>5
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<223>COX2正向引物
<400>
ATGGA ATTAC CCAGT TTGTT GAATC 25
<210>6
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<223>COX2反向引物
<400>
TGGAA GCCTG TGATA CTTTC TGTAC T 26
<210>7
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<223>PDL1正向引物
<400>
GTGCA TGATC AGCTA TGGTG GTG 23
<210>8
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<223>PDL1反向引物
<400>
CAGTT CATGT TCAGA GGTGA CTGGA 25
<210>9
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<223>PDL2正向引物
<400>
CTGGA ATTGC AGCTT CACCA GA 22
<210>10
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<223>PDL2反向引物
<400>
GTTGC ATTCC AGGGT CACAT TG 22
<210>11
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<223>IDO1正向引物
<400>
AAAGG GGACC CGAGC AATG 19
<210>12
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<223>IDO1反向引物
<400>
CTTCC TGGTG ATAGC GGTTC G 21
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223>TDO正向引物
<400>
GGGAA CTACC TGCAT TTGGA
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223>TDO反向引物
<400>
GTGCA TCCGA GAAAC AACCT 20
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223>FOXP3正向引物
<400>
TGACC AAGGC TTCAT CTGTG 20
<210>16
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223>FOXP3反向引物
<400>
AGGAA CTCTG GGAAT GTGCT
<210>17
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223>PGE2正向引物
<400>
GTACT GGCTT CGTAC GCGCG 20
<210>18
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223>PGE2反向引物
<400>
TAGCG CTCCA GGGCC ATGGC 20

Claims (3)

1.一种检测肿瘤微环境相关抗原表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：从实体瘤组织样品中提取样品RNA；
步骤二：检验样品RNA；
步骤三：以提取的检验合格的样品RNA为模板，oligo dT为引物进行RNA的反转录得到组织样品cDNA；
步骤四：设计qPCR检测引物，通过qPCR扩增各组织样品cDNA，采集荧光信号，所述检测引物包括以下9组：
GAPDHF：AGGTCGGAGTCAACGGATTTG；
GAPDHR: GTGATGGCATGGACTGTGGT;
COX1F:GGAGTTTGTCAATGCCACCT;
COX1R:GCAACTGCTTCTTCCCTTTG;
COX2F:ATGGAATTACCCAGTTTGTTGAATC;
COX2R:TGGAAGCCTGTGATACTTTCTGTACT;
PDL1F:GTGCATGATCAGCTATGGTGGTG；
PDL1R：CAGTTCATGTTCAGAGGTGACTGGA；
PDL2F：CTGGAATTGCAGCTTCACCAGA；
PDL2R：GTTGCATTCCAGGGTCACATTG；
IDO1F：AAAGGGGACCCGAGCAATG；
IDO1R：CTTCCTGGTGATAGCGGTTCG；
TDOF:GGGAACTACCTGCATTTGGA；
TDOR：GTGCATCCGAGAAACAACCT；
FOXP3F:TGACCAAGGCTTCATCTGTG;
FOXP3R:AGGAACTCTGGGAATGTGCT;
PGE2F：GTACTGGCTTCGTACGCGCG;
PGE2R:TAGCGCTCCAGGGCCATGGC。
2.根据权利要求1所述的一种检测肿瘤微环境相关抗原表达的方法，其特征在于，组织样品cDNA获得反应体系20ul，包括：
10X RT Buffer，2.0 ul；
25X dNTP Mix，0.8 ul；
10X oligo(dT)，2.0 ul；
逆转录酶，1.0 ul；
RNA酶抑制剂，1.0 ul；
样品RNA，1ug；
其余部分为无核酸纯水；
其中，组织样品cDNA获得反应条件为25℃，10分钟；37℃，120分钟；85℃，5分钟；得到组织样品cDNA后在4℃下保存。
3.根据权利要求1所述的一种检测肿瘤微环境相关抗原表达的方法，其特征在于，qPCR检测反应体系15ul，包括组织样品cDNA，2μl；正向引物，0.5ul；反向引物，0.5ul；2XTransStart@Top Green qPCR SuperMix，7.5μl；双蒸水，4.5ul；qPCR检测反应条件为94℃，30s；94℃，5s；58℃，15s；72℃，10s；共40个循环。
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