CN107488724B

CN107488724B - 用于活动性肺结核无创诊断的外周血环状rna标记物及应用

Info

Publication number: CN107488724B
Application number: CN201710861796.3A
Authority: CN
Inventors: 顾万君; 钱中清
Original assignee: Individual
Current assignee: Gu Wanjun; Qian Zhongqing
Priority date: 2017-09-21
Filing date: 2017-09-21
Publication date: 2020-09-11
Anticipated expiration: 2037-09-21
Also published as: CN107488724A

Abstract

本发明公开了用于活动性肺结核无创诊断的外周血环状RNA标记物，并且根据该外周血环状RNA标记物设计引物，所设计的引物可用于制备活动性肺结核的无创诊断试剂盒。本发明可有效区分肺结核患者与健康人群，其检测方便、无创、准确性高、稳定性好，适于推广使用。

Description

用于活动性肺结核无创诊断的外周血环状RNA标记物及应用

技术领域

本发明涉及基因检测领域，具体地说，涉及用于活动性肺结核无创诊断的外周血环状RNA标记物及应用。

背景技术

结核病是严重危害人类健康的疾病之一，结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)是结核病的病原体。虽然自2000年以来，结核病的发病率、流行率和死亡率都有所下降，但据世界卫生组织(WHO)估计，2015年全球人口中仍有约150万的死亡病例和1050万的新发结核病病例，其中得到准确筛查和报道的病例尚不到63％。而中国是全球结核病高负担国家之一，结核病患者数量位列全球第三，大约占全球结核病患者总量的百分之十。

目前，活动性肺结核诊断方法大多采用痰涂片检查法，该方法虽然简单易行，但检出率仅不到50％；并且痰结核杆菌的培养耗时长，容易导致患者错过最佳治疗期；另外，痰涂片检测方法对于医务工作者而言也存在一定的感染风险。作为结核病防治的重点，结核病的早期诊断已经成为一个临床上的重要问题之一。目前，迫切需要在现有细菌检测等常规技术之外开发一种快速低成本的无创诊断方法，能够区分早期活动性肺结核与健康人群。

对外周血中的核酸或蛋白质的检测为临床提供了一种很好的无创检测技术，具有较好的应用前景。近期一些研究表明，血液中的转录组标记物可用于区分活动性肺结核以及健康个体，并用于肺结核发病风险的预测；该方法具有易操作、检测成本低和所检测信号背景噪声小等优势，但外周血中mRNA转录产物的表达可能会受到血液采集过程的影响，使得该方法的稳定性和可重复性有待进一步验证，从而限制了其临床转化进程。此外，还有研究通过定量检测血液中结核分枝杆菌抗原多肽的方法对活动性肺结核进行诊断以及治疗监测，但是由于血液中的循环细菌抗原过于微量，在疾病初期很难检测出来，因此大大影响该检测方法的敏感性和临床应用性。因此，亟待从外周血中寻找一种新的标记物用于肺结核病的早期诊断和疗效跟踪。

发明内容

基于现有技术的不足，本发明提供了一种用于活动性肺结核无创诊断的外周血环状RNA标记物。作为新发现的内源性非编码RNA(noncoding RNA，ncRNA)，环状RNA(circularRNA，circRNA)不具有5'末端帽子和3'末端尾巴，在真核细胞中大量稳定存在。本发明充分利用外周血中circRNA的特性，选择外周血单个核细胞(Peripheralbloodmononuclearcell，PBMC)中的circRNA标记物用于活动性肺结核无创诊断，以保证诊断的稳定性、准确性、和敏感性。

本发明为了实现上述目的所采取的技术方案是：

用于活动性肺结核无创诊断的外周血环状RNA标记物，其特征在于：所述环状RNA标记物包括7个环状RNA：hsa_circ_0000681，hsa_circ_0008797，hsa_circ_0002113，hsa_circ_0002362，hsa_circ_0000414，hsa_circ_0063179和hsa_circ_0002908。

上述用于活动性肺结核无创诊断的外周血环状RNA标记物在制备活动性肺结核诊断试剂盒中的应用。

用于活动性肺结核无创诊断的外周血环状RNA标记物的引物，其特征在于：所述引物如序列表SEQ IDNO.8-SEQ IDNO.21所示。

上述用于活动性肺结核无创诊断的外周血环状RNA标记物的引物在制备活动性肺结核诊断试剂盒中的应用。

一种活动性肺结核诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求3所述的用于活动性肺结核无创诊断的外周血环状RNA标记物的引物。

进一步地，所述试剂盒还包括用于分离人外周血单个核细胞、提取外周血单个核细胞全RNA以及qRT-PCR反应的酶和试剂。

进一步地，所述试剂盒还包括标准品和/或对照品。

有益效果：本发明公开了用于活动性肺结核无创诊断的外周血环状RNA标记物，并且根据该外周血环状RNA标记物设计引物，所设计的引物可用于制备活动性肺结核的无创诊断试剂盒。本发明可有效区分肺结核患者与健康人群，其检测方便、无创、准确性高、稳定性好，适于推广使用。

附图说明

图1所示为实施例1两组配对病例对照的PBMC转录组中编码RNA、非编码线性RNA及circRNA所占比例；

其中，A为健康青年，B为健康老年；C为肺结核青年；D为肺结核老年；

图2所示为实施例1两组配对病例对照的PBMC转录组circRNA表达量的累积分布曲线；

其中，A为青年组；B为老年组；

图3所示为实施例1两组配对病例对照PBMC中circRNA表达水平上调富集的KEGG通路的配对Wilcoxon符号秩和检验结果；

其中每个点代表1条KEGG通路，深色点代表在青年和老年肺结核患者中circRNA表达共同上调的通路；

图4所示为实施例1中5条KEGG通路的circRNA表达配对比较；

其中，深色点为健康对照，浅色点为肺结核患者；

图5所示为实施例1发现群体数据集中7种circRNA表达水平的热图；

其中，每一行代表发现群体数据集中的一个诊断个体，共4行：1-2行为健康对照(蓝色)，3-4行为肺结核患者(红色)；每一列代表诊断标记物中的一个circRNA，共7列；红色代表相对较高的基因表达量；蓝色代表相对较低的基因表达量；

图6所示为实施例2验证群体PBMC中“7-circRNA标记物”表达水平对比；

其中，误差棒代表平均值的标准误差；

图7所示为实施例2验证群体PBMC中“7-circRNA标记物”的主成分分析；

其中，PC1代表第一主成分，PC2代表第二主成分；

图8所示为实施例2验证群体活动性肺结核风险值比较；

图9所示为实施例2区分活动性肺结核患者与健康对照的ROC曲线；

其中，阴影区域表示ROC曲线的置信区间。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详述：

实施例1：活动性肺结核诊断标记物的筛选

为了筛选活动性肺结核诊断标记物，本发明先对一个用于发现活动性肺结核诊断标记物人群的PBMC中circRNA的表达数据进行分析。如表1所示，用来发现诊断标记物的人群包括两名活动性肺结核患者和两名与活动性肺结核患者年龄和性别相匹配的健康对照，其中包括一组青年男性配对病例对照和一组老年女性配对病例对照。

表1

对上述两组配对病例对照的PBMC circRNA表达水平的差异进行分析。如图1所示，分析结果显示，两例肺结核患者PBMC转录组中circRNA转录本的比例均升高。

如图2所示，进一步比对两组配对病例对照PBMC的转录组数据发现，相比较于各自的健康对照，两例活动性肺结核患者PBMC中circRNA的表达量显著升高(Kolmogorov-Smirnov检验：P<10^-10)。

如图3所示，经过差异KEGG通路分析，活动性肺结核患者的PBMC中5个KEGG通路相关的circRNA表达水平显著上调(校正P值＜0.05)。如图4及表2所示，上述5个KEGG通路分别为“细胞因子和细胞因子受体相互作用”，“趋化因子信号通路”，“FcγR介导的吞噬作用”，“神经营养因子信号通路”和“细菌侵袭上皮细胞”。

表2

分别对两组配对病例对照进行配对Wilcoxon符号秩和检验，两组配对病例对照的Z值呈高度正相关(Spearman秩相关检验：ρ＝0.506，P＜10^-10)。可见，PBMC中上述5条通路circRNA表达水平的上调在青年和老年活动性肺结核病例中具有共性。

进一步地，利用edgeR算法对配对样本中上述5个KEGG通路基因的circRNA表达谱进行比较，选取错误发现率(False Discovery Rate，FDR)小于0.05的circRNA作为差异表达circRNA。如图5所示，通过筛选发现，相比较于健康对照，5个KEGG通路中共有7个circRNA在青年和老年活动性肺结核患者中同时出现了表达上调，其中，7个circRNA包括：hsa_circ_0000681，hsa_circ_0008797，hsa_circ_0002113，hsa_circ_0002362，hsa_circ_0000414，hsa_circ_0063179和hsa_circ_0002908。将上述7个circRNA的表达量作为一组活动性肺结核诊断标记物，命名为“7-circRNA标记物”。其中，每个circRNA中用于区分线性RNA的特异序列如表3所示。

表3

实施例2：“7-circRNA标记物”在独立样本集中的验证和应用

为了验证“7-circRNA标记物”在活动性肺结核诊断中的有效性，获取另外一个验证群体的PBMC中上述7个circRNA的表达数据。该群体与用于标记物发现的群体完全独立，包含11个健康对照和10个活动性肺结核患者，且病例与对照间在年龄及性别上没有明显差异(表4)。

表4

从circBase数据库中获取7个circRNA的序列信息，根据circRNA上区分线性RNA的特异序列，设计了用于扩增每一个circRNA的特异性背靠背引物，进一步地，利用qRT-PCR技术测定验证群体中所有个体PBMC中7个circRNA的表达量。其中，hsa_circ_0000681的正向引物和反向引物分别如序列表SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示；hsa_circ_0008797的正向引物和反向引物分别如序列表SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示；hsa_circ_0002113的正向引物和反向引物分别如序列表SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13所示；hsa_circ_0002362的正向引物和反向引物分别如序列表SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15所示；hsa_circ_0000414的正向引物和反向引物分别如序列表SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17所示；hsa_circ_0063179的正向引物和反向引物分别如序列表SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19所示；hsa_circ_0002908的正向引物和反向引物分别如序列表SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21所示。

具体试验步骤如下：

1.临床样本采集和PBMC分离

分别采集10名活动性肺结核患者和11名健康对照的肘静脉血，Ficoll-hypaque密度梯度离心法分离PBMC。将5mL外周血与淋巴细胞分离液和不完全RPMI-1640培养基以1:1:1比例混合，25℃，2000rpm离心20分钟。离心结束后，可见4层分层，第二层白雾状的细胞即是目的PBMC层。小心将PBMC收集至另一离心管，加入5mL不完全RPMI-1640培养基，洗2次(4℃，2000rpm离心5分钟)。

2.PBMC中总RNA提取

分离得到的PBMC立刻加入1mLTrizol裂解，室温静置10分钟，转移至无RNA酶的1.5mL Eppendorf管。加入0.2mL三氯甲烷，剧烈震荡15s后室温静置3-4分钟，4℃，12000rpm离心15分钟。小心吸取上层含RNA的水相于新的无RNA酶1.5mL Eppendorf管，加入预冷的异丙醇500μl，再加1μl糖原(20mg/mL)，-20℃过夜。4℃，12000rpm离心15分钟，弃上清，加75％DEPC乙醇，洗涤3次(4℃，12000rpm离心5分钟)，彻底弃上清。提取到的RNA自然风干后溶解在适量DEPC水中，使用分光光度计通过OD260/280读数测定RNA的纯度和浓度，1％甲醛变性凝胶电泳检测RNA的完整性。RNA完整性评分值大于6的RNA用于进一步实验。

3.qRT-PCR检测PBMC全RNA中“7-circRNA标记物”的表达量

针对优选出来的7个circRNA设计相应的特异性背靠背引物，使用SYBR GreenReal Master Mix(with Rox，Tiangen)进行qRT-PCR(QuantStudio 3Real-Time PCRSystem，Thermo Fisher Scientific)。qRT-PCR反应过程的参数、体系和程序如下：

(1)反应体系

qRT-PCR反应液的配置在冰上进行，具体反应体系如表5所示。

表5

反应体系配置完成后，盖上反应管，轻柔混匀；可短暂离心，确保所有组分均在管底。

(2)反应程序

将反应体系置于荧光定量PCR仪中，开始反应，两步法反应程序如表6所示。

表6

选择β-actin作为内参基因，采用2^-ΔΔCT法分析circRNA表达水平的倍数变化，测定所有21个体PBMC中7个circRNA标记物的表达量。

如图6所示，除hsa_circ_0000414外(t-检验：P＝0.171)，活动性肺结核患者PBMC中其他circRNA表达量均明显上调(t-检验：P<0.05)。

进一步地，对验证群体PBMC中“7-circRNA标记物”的表达量进行主成分分析(Principal ComponentAnalysis,PCA)，如图7所示，“7-circRNA标记物”能较好地区分活动性肺结核患者和健康对照。

4.计算待测个体的活动性肺结核风险值

为了使所筛选的“7-circRNA标记物”能够用于活动性肺结核的诊断，本发明提出一种基于待诊断个体PBMC中“7-circRNA标记物”的表达水平计算个体活动性肺结核风险值的方法。

活动性肺结核风险值的计算如公式1所示：

公式1中，I是最终得到的个体患活动性肺结核的风险值；n是circRNA的个数，这里等于7；e_i代表基因circRNA i在所测个体中的表达量；μ_i和τ_i代表circRNA i在所有检测个体中表达量的均值和标准差。本发明中，个体的活动性肺结核风险值高代表该检测个体具有较高的患活动性肺结核的可能性。

基于上述活动性肺结核风险值计算方法和验证群体PBMC中“7-circRNA标记物”的基因表达量，计算21个个体的活动性肺结核风险值。如图8所示，活动性肺结核患者的风险值明显高于健康对照(t-检验：P＝0.001)。如图9所示，基于活动性肺结核风险值的预测ROC(Receiver Operating Characteristic)曲线下的面积(AUC)为0.946。可见，本发明所筛选出的活动性肺结核诊断标记物和风险值计算方法能够很好地区分活动性肺结核患者和其他健康对照，具有较高的灵敏度和特异性。

实施例3：基于“7-circRNA标记物”的活动性肺结核诊断试剂盒

基于本发明筛选和验证的用于活动性肺结核诊断的“7-circRNA标记物”，进一步开发包含7个circRNA所有特异性背靠背引物的诊断试剂盒，用于获取人PBMC中7个circRNA的表达水平的测定和肺结核诊断。

用于活动性肺结核无创诊断试剂盒的制作和操作流程基于细胞分离、RNA提取、qRT-PCR等技术，具体方法包括：PBMC分离；PBMC RNA提取；“7-circRNA标记物”检测以及风险值计算等。

试剂盒包括7个circRNA特异的背靠背引物；

分离人PBMC的常用试剂包括：不完全RPMI-1640培养基、人淋巴细胞分离液等；

提取PBMC RNA的常用试剂如Trizol，三氯甲烷，异丙醇，糖原，75％DEPC乙醇，0.01％DEPC水等；

qRT-PCR的常用试剂如随机引物、逆转录酶、缓冲液、dNTPs、0.01％DEPC水、RNA酶抑制剂、MgCl₂、Taq酶、SYBR Green/RoxTM参比染料等。

此外，试剂盒还包括标准品和/或对照品。

本试剂盒选择β-actin作为内参基因，其上游引物序列为TGACGTGGACATCCGCAAAG；下游引物序列为：CTGGAAGGTGGACAGCGAGG。

另外，试剂盒还包括包装材料、印刷的或电子的说明书。说明书包含试剂盒使用操作流程及风险值计算方法。

以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅限制于本文所示的实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干修改和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 顾万君

<120> 用于活动性肺结核无创诊断的外周血环状RNA标记物及应用

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 100

<212> RNA

<213> human

<400> 1

gugaugaaug uucccagccu guguggcacg gaccacacgg agcgccgcgg ccgcaucuac 60

auccaggccc acaucgacag ggacguccuc auuguccucg 100

<210> 2

<211> 100

<212> RNA

<213> human

<400> 2

gaagcuugug cacauucauu uuuugaugaa uuacgggacc caaaugucaa acuaccaaau 60

gggcgagaca caccugcacu cuucaacuuc accacucaag 100

<210> 3

<211> 100

<212> RNA

<213> human

<400> 3

ggugcuggca ggagccuguu ucuuccuggu ccugaaauau agaggccuga uuaaauacug 60

guuucacacu ccaccaagca ucccauuaca gauagaagag 100

<210> 4

<211> 100

<212> RNA

<213> human

<400> 4

uacagaugug cgaguaucug cugaagguca acgaaaucaa gauuaaaaag ggaguagauu 60

uacuucagaa ucugaucaaa uacuuucaug cccaaugcaa 100

<210> 5

<211> 100

<212> RNA

<213> human

<400> 5

aaauuuccac aaagacuucc uaauuggaga aggagagauu uuugagguau acagagugga 60

gauucaaaac cuaacauaug cugucaaauu auuuaaacag 100

<210> 6

<211> 100

<212> RNA

<213> human

<400> 6

accagguacu gggccagggu gagggucagg accucccgca ccggcuacaa cgggaucugg 60

agcgagugga gugaggcgcg cuccugggac accgagucgg 100

<210> 7

<211> 100

<212> RNA

<213> human

<400> 7

gcggggcaau gcacuagaaa agaagucuaa cuaugaagua uuagaaaaag auguugguuu 60

aaagcgauuu uuuccuaaga guuuacugga uucugucaag 100

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 8

gatgaatgtt cccagcctgt 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 9

agggcaggag aatgtgacaa 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 10

attacgggac ccaaatgtca 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 11

tcccctggaa atattggttg 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 12

gtttcacact ccaccaagca 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 13

cggcagtgaa gtcacactct 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 14

tctgctgaag gtcaacgaaa 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 15

gcaaactgtc caaagggaag 20

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 16

ggagaaggag agatttttga gg 22

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 17

gtgcccagga ccaaagtaat 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 18

gatctggagc gagtggagtg 20

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 19

tgtgttcgta tcgcattttc a 21

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 20

ggggcaatgc actagaaaag 20

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 21

tccttttggc aaataacgaa t 21

Claims

1.用于活动性肺结核无创诊断的外周血环状RNA标记物，其特征在于：所述环状RNA标记物包括7个环状RNA：hsa_circ_0000681，hsa_circ_0008797，hsa_circ_0002113，hsa_circ_0002362，hsa_circ_0000414，hsa_circ_0063179和hsa_circ_0002908。

2.根据权利要求1所述的用于活动性肺结核无创诊断的外周血环状RNA标记物在制备活动性肺结核诊断试剂盒中的应用。

3.根据权利要求1所述的用于活动性肺结核无创诊断的外周血环状RNA标记物的引物，其特征在于：所述引物为序列表SEQ ID NO.8-SEQ ID NO.21所示的14条序列的组合。

4.根据权利要求3所述的用于活动性肺结核无创诊断的外周血环状RNA标记物的引物在制备活动性肺结核诊断试剂盒中的应用。

5.一种活动性肺结核诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求3所述的用于活动性肺结核无创诊断的外周血环状RNA标记物的引物。

6.根据权利要求5所述的一种活动性肺结核诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括用于分离人外周血单个核细胞、提取外周血单个核细胞全RNA以及qRT-PCR反应的酶和试剂。

7.根据权利要求5或6所述的一种活动性肺结核诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括标准品和/或对照品。