CN1277837C - 从酱油、豆奶、番茄酱中分离残留dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从酱油、豆奶、番茄酱中分离残留DNA的方法。方法的步骤为：取适量的酱油、豆奶或番茄酱，离心后弃上清，保留沉淀；取CTAB提取缓冲液溶解沉淀；保温，其间不时轻缓颠倒混匀；加入等体积的苯酚/氯仿，混匀至乳浊状；离心至分相；吸上清用Sephadex-G 50柱离心过柱；加入等体积的异丙醇；离心弃上清，保留沉淀；乙醇洗涤，离心，重复洗涤；室温干燥后，向沉淀中加入Chelex溶液混匀，煮沸离心，其上清可直接用于聚合酶链式反应的模板。应用本发明公开的技术流程所分离的酱油、豆奶、番茄酱残留DNA，适用于转基因农产品的多聚酶链式反应检验及相关领域。该方法简单且有效、成本低，所获得的痕迹量DNA可用于定性和定量PCR扩增，且灵敏度和检出率高。
Description
技术领域
本发明为生物技术领域，尤其涉及一种从酱油、豆奶、番茄酱中分离DNA的方法。
背景技术
自1983年世界上第1株转基因植物诞生以来，以转基因技术为核心的现代生物技术迅猛发展。以转基因生物为直接食品或原料加工生产的食品即为转基因食品。目前大部分转基因食品来源于转基因农作物，其对人类的贡献很大，可以改善食品的品质、抗病虫害、增产及减少农药使用量，从而带来显著的经济效益和社会效益。在回归自然，提倡有机食品的今天，消费者对转基因食品的安全性仍心存疑虑，转基因作物和食品所带来的争论是人们始料不及。争论的焦点：一是转基因食品对人体健康的直接或间接的影响；二是转基因作物对大自然生态平衡的破坏；三是相关的伦理道德问题。由于转基因生物及其产品的潜在风险，其管理受到各国政府的高度重视。转基因食品的标签是目前争议最大的问题。世界卫生组织在20世纪90年代提出了对转基因食品进行安全性评价的要求。2000年1月28日，国际社会在相互妥协的基础上，就生物安全的一些重要问题，尤其是转基因技术及其产品的越境转移等问题达成了共识，在加拿大蒙特利尔通过了《卡特基娜生物安全议定书》。联合国粮农组织和世界卫生组织所属的国际食品规定委员会正在准备制订转基因食品的国际安全标准，世界其他国家和地区也纷纷制订了相关法律或法规。由于各国对彼此间的转基因食品及食品原料贸易有所限制，另外国外一些食品公司已放弃转基因食品原料不用，转而采用非转基因原料。为保护广大消费者的权益，满足其选择权、知情权以及出于国际贸易的需要，转基因食品的检测越来越引起各国政府和有关食品监督机构的重视。但是由于基因重组技术的复杂性和多样性，给转基因食品的检测带来了很大的困难，因此建立国际间标准的快速、准确的检测方法，已成为各国政府和研究者亟待解决的问题。
从转基因技术建立之日起，转基因技术亦随之建立，因为在基因重组的技术中，离不开重组基因的检测和筛选。这些方法的针对性很强，有的仅对某个转基因生物的构建有效，却为转基因检测技术的建立打下了基础。目前主要有两类转基因检测方法：基于特异性DNA片断的PCR(polymerase ChainReaction)检测技术和基于特异性蛋白的ELISA(Enzyme-linked Immunosorbent Assays)检测方法。前者特异性DNA片断包括外源启动于、终止于、报告基因和目的基因。后者特异性蛋白主要是外源目的蛋白和一些报告基因所表达的蛋白。两种方法的出发点不同，各有优缺点。一般来说，PCR法可将食品中残存的DNA增幅到100万倍以上，检出灵敏度高，但操作不当易产生假阳性现象。ELISA法不适用于经高温加工的食品，因为加热会使蛋白变性而无法检测。1996年德国伯恩斯坦大学的Meyer Rolf等论证了PCR检测转基因食品的可能性。到目前为止，全世界已有30多种转基因产品得到相关国家的安全评价，在现有的商品化转基因产品中绝大多数含CaMV 35S启动子和NOS终止子，两种因子常用于转基因植物的构建，这就为人们建立针对这两种成分的转基因阳筛选检测方法提供了便利。最近一些国外实验室已将报告基因GUS、NPEII基因，目的基因CRY、CPT等作为检测目标，力争更准确可靠检出转基因成分。由于PCR技术要求比较严格，高灵敏性以及实验室的遗留污染，在日常的转基因食品检测中常出现假阳性结果。目前在转基因食品检测中主要是以35S CaMV启动子和NOS终止子作为检测目标，来判定食品中是否含有转基因成分。定性筛选PCR本身具有局限性，所采取的PCR法因其高敏感性常伴有假阳性现象，而操作上的误差，加上一些反应抑制因素亦可带来假阴性现象，其最大的不足是无法对转基因成分进行定量分析。为此，研究者们在定性筛选PCR方法的基础上，发展了不同的定量PCR检测方法。目前，国外较为成熟的方法主要有定量竞争PCR(Quantitativecompetitive，QC-PCR)和Real-time PCR法。
现在世界上一些实验室正致力于基因芯片的研究，这是转基因检测技术的一个很有前景的发展方向。基因芯片技术的原理是根据分子生物学中成熟的核酸分子原位杂交技术，即DNA的碱基配对和序列互补原则，特大量探针分子固定于约1cm2大小的芯片上，然后与标记的样品杂交，通过检测杂交信号的强弱判定样品中靶分子的数量。此技术可以对大量DNA或RNA分子进行检测分析，大大提高检测效率和精确性。总之，转基因食品检测技术的发展趋势应是操作简便、费用较低、普适性强。对现有或新出现的转基因食品都能快速方便准确地检测。
总而言之，转基因生物的安全性必须建立在转基因成分检测的结果上。目前世界上常用的转基因检测方法主要有两种：一是检测有无来自其他生物成分即以外源结构基因表达出蛋白质为目的的蛋白质检测方法；另一种是检测非转基因植物所不拥有的启动子、终止子、标记基因的DNA检测方法。由于蛋白质检测方法对含量低及深加工的转基因产品无法检测，故DNA检测方法应用范围相对要广。当今，国内外对采用转基因产品为原料，经深加工或精加工的食品即使采用DNA检测方法，也无法检出转基因成分。例如：酱油、色拉油的制成要经过发酵、加热和分离等工序，导入的外源DNA及其产生的蛋白质已经分解。所以迄今为止还无有效的检测方法来判断是否含转基因成分，这在国际生物界是一个公认的难题。
由于转基因产品越来越多地成为食品的原材料，如大豆、玉米等，因此对进口原材料和食品进行转基因检测成为转基因生物安全性检测的突出问题。若能够从被检样品中提取高质量的适于PCR模板的痕迹量DNA，特别从那些深加工或精加工的食品(酱油、色拉油、豆奶、番茄酱、饼干等)中提取痕迹量的高质量的DNA，仍是转基因安全性检测的棘手问题。鉴于此，本发明建立了一种从酱油、豆奶、番茄酱中分离残留DNA的方法，在常规DNA提取技术的基础上，增加了Sephadex-G 50柱分离及Chelex溶液热处理两个步骤，不仅能有效去除酱油、豆奶、番茄酱中的小分子发酵产物、多糖、防腐剂、固定剂、明矾及色素等物质，而且能够获得高质量的可用于检测的痕迹量DNA，该方法简单且有效、成本低、灵敏度和检出率高，所获得的痕迹量DNA可用于定性和定量PCR扩增。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种从酱油、豆奶、番茄酱中分离残留DNA的方法。
方法的步骤为：
1)取50ml的酱油、豆奶、番茄酱，12,000rpm离心15-20min，弃上清，保留沉淀；
2)取0.5ml溴代十六烷基三甲铵提取缓冲液溶解沉淀，溴代十六烷基三甲铵提取缓冲液为2％溴代十六烷基三甲铵，50mmol/L Tris碱，pH8.0，10mmol/L乙二胺四乙酸，pH8.0，0.8mol/L氯化钠；
3)65℃保温30～90min，其间不时轻缓颠倒混匀；加入0.5ml 1∶1的苯酚/氯仿，混匀至乳浊状，12,000rpm离心10-15min至分相，吸取上清液用Sephadex-G50柱离心过柱；
4)加入等体积的异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇于-70℃或-20℃放置1-2小时，12,000rpm离心10-15min，弃上清，保留沉淀；
5)70％乙醇洗涤沉淀，12,000rpm离心10-15min，重复洗涤沉淀1-2次，室温干燥后，向沉淀中加入200μl 10％的Chelex溶液，充分混匀，100℃煮5-10min；
6)12,000rpm离心后，其上清可直接用于聚合酶链式反应的模板。
本发明的优点是：1)在常规DNA提取技术中，增加Sephadex-G 50柱分离及Chelex溶液热处理两个步骤，如此能有效去除酱油、豆奶、番茄酱中的小分子发酵产物、多糖、防腐剂、固定剂、明矾及色素等物质，并获得高质量的可用于检测的痕迹量DNA；2)能够有效去除PCR反应抑制因子所获得的DNA在聚合酶链式反应(PCR)扩增中其灵敏度和检出率高于常规DNA提取方法。3)该方法简单有效、成本低。
附图说明
图1.lectin基因PCR扩增结果，图中：M为分子量标记，1为大豆阳性对照，2为试剂盒抽提DNA的PCR扩增产物，3为CTAB法抽提DNA的PCR扩增产物，4为Chelex直接煮沸法抽提DNA的PCR扩增产物，5为本发明的方法抽提DNA的PCR扩增产物，6为阴性对照；
图2.35S-CTP基因PCR扩增结果，图中：M为分子量标记，1为大豆阳性对照，2为试剂盒抽提DNA的PCR扩增产物，3为CTAB法抽提DNA的PCR扩增产物，4为Chelex直接煮沸法抽提DNA的PCR扩增产物，5为本发明的方法抽提DNA的PCR扩增产物，6为阴性对照；
图3.Cp4-epsps基因PCR扩增结果，图中：M为分子量标记，1为大豆阳性对照，2为试剂盒抽提DNA的PCR扩增产物，3为CTAB法抽提DNA的PCR扩增产物，4为Chelex直接煮沸法抽提DNA的PCR扩增产物，5为本发明的方法抽提DNA的PCR扩增产物，6为阴性对照；
图4.Nos终止子基因PCR扩增结果，图中：M为分子量标记，1为大豆阳性对照，2为试剂盒抽提DNA的PCR扩增产物，3为CTAB法抽提DNA的PCR扩增产物，4为Chelex直接煮沸法抽提DNA的PCR扩增产物，5为本发明的方法抽提DNA的PCR扩增产物，6为阴性对照；
图5.CaMV35S启动子基因PCR扩增结果，图中：M为分子量标记，1为大豆阳性对照，2为试剂盒抽提DNA的PCR扩增产物，3为CTAB法抽提DNA的PCR扩增产物，4为Chelex直接煮沸法抽提DNA的PCR扩增产物，5为本发明的方法抽提DNA的PCR扩增产物，6为阴性对照。
具体实施方式
实施例1.
本实施例中所用的试剂除氯仿、乙醇、异戊醇、异丙醇为国产试剂外，其余试剂均为promega产品。
(一)CTAB法抽提残留DNA
取50ml酱油、豆奶、番茄酱，经12,000rpm离心10min，弃上清液，保留沉淀用于DNA的抽提；或80℃加热蒸发水分后取干物质用于DNA提取；或冷冻干燥后取干物质用于DNA提取。将粉末状的干物质加入400μl预冷的溴代十六烷基三甲铵(CTAB)提取缓冲液I(50mmol/L Tris-Cl，10mmol/L EDTA，800mmol/LNaCl，pH8.0)中。加入500μl 65℃预热的CTAB提取缓冲液II(2％ CTAB，50mmol/LTris-Cl，10mmol/L EDTA，800mmol/L NaCl，pH8.0)，1μl 2-巯基乙醇，混匀，65℃保温30-90min，其间不时轻缓颠倒混匀。待冷至室温后加入450μl氯仿/异戊醇，轻缓颠倒混匀至溶液呈乳浊状。12000rpm离心2min至分相。将上清液转移至干净的离心管中，加入5μl Rnase A储液，室温下保温30min。依次加入600μl异丙醇及60μl乙酸钠溶液，轻缓颠倒混匀。12,000rpm离心10min，沉淀DNA。弃上清液后，加入800μl 76％乙醇，12,000rpm离心10min，弃上清液后，再加入100μl 70％乙醇洗涤沉淀，12,000rpm离心5min，沉淀DNA，除去残留的乙醇。DNA沉淀溶解于100μl TE缓冲液中，4℃保存备用。
(二)Chelex直接煮沸法
取50ml酱油、豆奶、番茄酱，经12,000rpm离心10min，弃上清液，保留沉淀用于DNA的抽提；或80℃加热蒸发水分后取干物质用于DNA提取；或冷冻干燥后取干物质用于DNA提取。取200μl 10％的Chelex溶液溶解沉淀；振荡数min，使沉淀充分溶解于Chelex溶液中，100℃煮5～10min，12,000rpm离心5min，上清液即可用于PCR。
(三)试剂盒法抽提残留DNA
取50ml酱油、豆奶、番茄酱，经12,000rpm离心10min，弃上清液，保留沉淀用于DNA的抽提；或80℃加热蒸发水分后取干物质用于DNA提取；或冷冻干燥后取干物质用于DNA提取。加入25ml正己烷，充分混合后2小时后，加入2.5ml Buffer A后，再65℃水浴中加热，并不断混合，2小时后以12,000rpm离心10min，使有机相和水相分开，取水相并加入40μl(500ng/μl)鲑鱼精DNA。加入与上清等体积的Buffer B，混匀，常温放置10min后，12,000g离心5min，弃上清，保留沉淀；在沉淀中加入60μl Buffer C，37℃放置2min后用枪头将其充分混合(很重要)后，于37℃溶解沉淀，5min后加入300μl Buffer D，上下颠倒充分混匀10次后，取出离心柱，将离心柱放置在一个2ml的套管上，将溶液加入到离心柱中，放置2min；将离心柱和2ml套管一起用8000g离心30秒后，弃2ml套管中的溶液，在离心柱中加入200μl Wash Buffer I，8000g离心30秒后，弃去溶液；在离心柱中加入200μl Wash Buffer II(第一次使用前请按照试剂瓶上的提示加入乙醇)，8000g离心30秒后，弃去溶液；在离心柱中加入200μl Wash Buffer II，8000g离心30秒后，弃去溶液；12,000g离心30秒，以除去离心柱中痕量残余溶液；将离心柱放置在一个新的1.5ml离心管中，网离心柱底部中央小心加入50μl Elution Buffer，37℃放置2min后，12,000g离心30秒；若需提高得率，可用离心下来的50μl Elution Buffer重新进行洗脱，即37℃放置2min后，12,000g再离心30秒；离心管中的溶液即可作为PCR反应的模板，建议一个PCR反应使用2μl DNA，其余样品保存在-20℃。
(四)《分子克隆》法抽提残留DNA
取50ml酱油、豆奶、番茄酱，经12,000rpm离心10min，弃上清液，保留沉淀用于DNA的抽提；或80℃加热蒸发水分后取干物质用于DNA提取；或冷冻干燥后取干物质用于DNA提取。在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液(100mmol/L Tris·Cl，pH8.0，20mmol/L EDTA，pH8.0，500mmol/L NaCl，1.5％SDS)，60℃水浴预热。将上述干物质在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中，剧烈摇动混匀，60℃水浴保温30-60min(时间长，DNA产量高)，不时摇动。加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液，颠倒混匀(需带手套，防止损伤皮肤)，室温下静置5-10min，使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。室温下5000rpm离心5min。仔细移取上清液至另一50ml离心管，加入1倍体积异丙醇，混匀，室温下放置30min，用5000rpm离心5min，再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀，往往难溶解于TE，可在60℃水浴放置15min以上，以帮助溶解。将DNA溶液3000rpm离心5min，上清液倒入干净的5ml离心管。加入5μl RnaseA(10μg/μl)，37℃10min，除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤)。加入1/10体积的3mol/L NaAc及2×体积的冰乙醇，混匀，-20℃放置20min左右，12,000rpm离心10min，70％乙醇漂洗，将DNA重溶解于1mlTE缓冲液(10mmo/L Tris·Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0))，-20℃贮存。
(五)本发明的方法从酱油、豆奶、番茄酱中提出残留DNA
1)取50ml的酱油、豆奶、番茄酱，12,000rpm离心15min，弃上清，保留沉淀；
2)取0.5ml溴代十六烷基三甲铵提取缓冲液溶解沉淀，溴代十六烷基三甲铵提取缓冲液为2％溴代十六烷基三甲铵，50mmol/L Tris碱，pH8.0，10mmol/L乙二胺四乙酸，pH8.0，0.8mol/L氯化钠；
3)65℃保温30min，其间不时轻缓颠倒混匀；加入0.5ml苯酚/氯仿(1∶1)，轻缓颠倒混匀至乳浊状，12,000rpm离心10min至分相，吸取上清液用Sephadex-G 50柱离心过柱；
4)加入等体积的异丙醇(或2.5倍体积的无水乙醇)于-70℃(或-20℃)放置1小时，12,000rpm离心10min，弃上清，保留沉淀；
5)70％乙醇洗涤沉淀，12,000rpm离心10min，重复洗涤沉淀1-2次，室温干燥后，向沉淀中加入200μl 10％的Chelex溶液，充分混匀，100℃煮5min；
6)12,000rpm离心后，其上清可直接用于聚合酶链式反应的模板。
(六)聚合酶链式反应(PCR)扩增
总反应体系为50μl，10μl上述四种方法所提取的不同来源的模板DNA，5μl 10×PCR反应缓冲液(500mmol/L KCl，100mmol/L Tris·Cl，在25℃下，pH9.0，1.0％ Triton X-100)，4μl 25mmol/L MgCl2，4μl 4种dNTP(每种2.5mmol/L)，0.5μl上游引物(100ng/μl)，0.5μl下游引物(100ng/μl)，1μl Taq DNA聚合酶(5U/μl)，重蒸水25μl，混匀后离心5秒。将混合物在94℃下加热5min后冰冷，迅速离心数秒，使管壁上液滴沉至管底，加入Taq DNA聚合酶(0.5μl约2.5U)，混匀后稍离心。95℃变性5min，用95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，进行35次扩增反应循环，进行PCR。最后一轮循环结束后，于72℃下保温10min，使反应产物扩增充分。
PCR扩增的引物分别为：
1.lectin基因
Lec-F1：5’GCCCTCTACTCCACCCCCATCC3’
Lec-R1：5’GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG3’
2.35S-CTP基因
SC-F1：5’TGATGTGATATCTCCACTGACG3’
SC-R1：5’TGTATCCCTTGAGCCATGTTGT3’
3.Cp4-epsps基因
CE-F1：5’CCTTCATGTTCGGCGGTCTCG3’
CE-R1：5’GCGTCATGATCGGCTCGATG3’
4.Nos终止子基因
Pnos-F1：5’GAATCCTGTTGCCGGTCTTG3’
Pnos-R1：5’TTATCCTAGTTTGCGCGCTA3’
5.CaMV35S启动子基因
35S-F：5’GCTCCTACAAATGCCATCATTGC3’
35S-R：5’GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC3’
(七)琼脂糖凝胶电泳
用0.5×TBE电泳缓冲液(45mm6l/L Tris碱，45mmol/L硼酸，1mmol/L EDTA，pH8.0)，配制1％的琼脂糖凝胶液；加入10mg/ml溴化乙锭(EB)溶液母液，使其终浓度为0.5μg/ml；用制胶板制备相应的凝胶板；取10μl PCR产物与2μl 6×载样缓冲液(0.25％溴酚蓝，40％(w/v)蔗糖水溶液)混匀，用微量移液枪小心加入凝胶板的样品槽中；控制电压保持在60-80V，电流在40mA以上，立即接通电源进行电泳；当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳；在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色并拍照。
实施例2.
(一)CTAB法抽提残留DNA
取50ml酱油、豆奶、番茄酱，经12,000rpm离心10min，弃上清液，保留沉淀用于DNA的抽提；或80℃加热蒸发水分后取干物质用于DNA提取；或冷冻干燥后取干物质用于DNA提取。将粉末状的干物质加入400μl预冷的CTAB提取缓冲液I(50mmol/L Tris-Cl，10mmol/L EDTA，800mmol/L NaCl，pH8.0)中。加入500μl 65℃预热的CTAB提取缓冲液II(2％ CTAB，50mmol/L Tris-Cl，10mmol/L EDTA，800mmol/L NaCl，pH8.0)，1μl 2-巯基乙醇，混匀，65℃保温30-90min，其间不时轻缓颠倒混匀。待冷至室温后加入450μl氯仿/异戊醇，轻缓颠倒混匀至溶液呈乳浊状。12000rpm离心2min至分相。将上清液转移至干净的离心管中，加入5μl Rnase A储液，室温下保温30min。依次加入600μl异丙醇及60μl乙酸钠溶液，轻缓颠倒混匀。12,000rpm离心10min，沉淀DNA。弃上清液后，加入800μl 76％乙醇，12,000rpm离心10min，弃上清液后，再加入100μl 70％乙醇洗涤沉淀，12,000rpm离心5min，沉淀DNA，除去残留的乙醇。DNA沉淀溶解于100μl TE缓冲液中，4℃保存备用。
(二)Chelex直接煮沸法
取50ml酱油、豆奶、番茄酱，经12,000rpm离心10min，弃上清液，保留沉淀用于DNA的抽提；或80℃加热蒸发水分后取干物质用于DNA提取；或冷冻干燥后取干物质用于DNA提取。取200μl 10％的Chelex溶液溶解沉淀；振荡数min，使沉淀充分溶解于Chelex溶液中，100℃煮5～10min，12,000rpm离心5min，上清液即可用于PCR。
(三)试剂盒法抽提残留DNA
取50ml酱油、豆奶、番茄酱，经12,000rpm离心10min，弃上清液，保留沉淀用于DNA的抽提；或80℃加热蒸发水分后取干物质用于DNA提取；或冷冻干燥后取干物质用于DNA提取。加入25ml正己烷，充分混合后2小时后，加入2.5ml Buffer A后，再65℃水浴中加热，并不断混合，2小时后以12,000rpm离心10min，使有机相和水相分开，取水相并加入40μl(500ng/μl)鲑鱼精DNA。加入与上清等体积的Buffer B，混匀，常温放置10min后，12,000g离心5min，弃上清，保留沉淀；在沉淀中加入60μl Buffer C，37℃放置2min后用枪头将其充分混合(很重要)后，于37℃溶解沉淀，5min后加入300μl Buffer D，上下颠倒充分混匀10次后，取出离心柱，将离心柱放置在一个2ml的套管上，将溶液加入到离心柱中，放置2min；将离心柱和2ml套管一起用8000g离心30秒后，弃2ml套管中的溶液，在离心柱中加入200μl Wash Buffer I，8000g离心30秒后，弃去溶液；在离心柱中加入200μl Wash Buffer II(第一次使用前请按照试剂瓶上的提示加入乙醇)，8000g离心30秒后，弃去溶液；在离心柱中加入200μl Wash Buffer II，8000g离心30秒后，弃去溶液；12,000g离心30秒，以除去离心柱中痕量残余溶液；将离心柱放置在一个新的1.5ml离心管中，网离心柱底部中央小心加入50μl Elution Buffer，37℃放置2min后，12,000g离心30秒；若需提高得率，可用离心下来的50μl Elution Buffer重新进行洗脱，即37℃放置2min后，12,000g再离心30秒；离心管中的溶液即可作为PCR反应的模板，建议一个PCR反应使用2μl DNA，其余样品保存在-20℃。
(四)《分子克隆》法抽提残留DNA
取50ml酱油、豆奶、番茄酱，经12,000rpm离心10min，弃上清液，保留沉淀用于DNA的抽提；或80℃加热蒸发水分后取干物质用于DNA提取；或冷冻干燥后取干物质用于DNA提取。在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液(100mmol/L Tris·Cl，pH8.0，20mmol/L EDTA，pH8.0，500mmol/L NaCl，1.5％SDS)，60℃水浴预热。将上述干物质在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中，剧烈摇动混匀，60℃水浴保温30-60min(时间长，DNA产量高)，不时摇动。加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液，颠倒混匀(需带手套，防止损伤皮肤)，室温下静置5-10min，使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。室温下5000rpm离心5min。仔细移取上清液至另一50ml离心管，加入1倍体积异丙醇，混匀，室温下放置30min，用5000rpm离心5min，再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀，往往难溶解于TE，可在60℃水浴放置15min以上，以帮助溶解。将DNA溶液3000rpm离心5min，上清液倒入干净的5ml离心管。加入5μl RnaseA(10μg/μl)，37℃10min，除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤)。加入1/10体积的3mol/L NaAc及2×体积的冰乙醇，混匀，-20℃放置20min左右，12,000rpm离心10min，70％乙醇漂洗，将DNA重溶解于1mlTE缓冲液(10mmo/L Tris·Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0))，-20℃贮存。
(五)本发明的方法提取残留DNA
1)取50ml的酱油、豆奶、番茄酱，12,000rpm离心20min，弃上清，保留沉淀；
2)取0.5ml溴代十六烷基三甲铵提取缓冲液溶解沉淀，溴代十六烷基三甲铵提取缓冲液为2％溴代十六烷基三甲铵，50mmol/L Tris碱，pH8.0，10mmol/L乙二胺四乙酸，pH8.0，0.8mol/L氯化钠；
3)65℃保温90min，其间不时轻缓颠倒混匀；加入0.5ml苯酚/氯仿(1∶1)，轻缓颠倒混匀至乳浊状，12,000rpm离心15min至分相，吸取上清液用Sephadex-G 50柱离心过柱；
4)加入等体积的异丙醇(或2.5倍体积的无水乙醇)于-70℃(或-20℃)放置2小时，12,000rpm离心15min，弃上清，保留沉淀；
5)70％乙醇洗涤沉淀，12,000rpm离心15min，重复洗涤沉淀1-2次，室温干燥后，向沉淀中加入200μl 10％的Chelex溶液，充分混匀，100℃煮10min；
6)12,000rpm离心后，其上清可直接用于聚合酶链式反应的模板。
(六)聚合酶链式反应(PCR)扩增
总反应体系为50μl，10μl上述四种方法所提取的不同来源的模板DNA，5μl 10×PCR反应缓冲液(500mmol/L KCl，100mmol/L Tris·Cl，在25℃下，pH9.0，1.0％ Triton X-100)，4μl 25mmol/L MgCl2，4μl 4种dNTP(每种2.5mmol/L)，0.5μl上游引物(100ng/μl)，0.5μl下游引物(100ng/μl)，1μl Taq DNA聚合酶(5U/μl)，重蒸水25μl，混匀后离心5秒。将混合物在94℃下加热5min后冰冷，迅速离心数秒，使管壁上液滴沉至管底，加入Taq DNA聚合酶(0.5μl约2.5U)，混匀后稍离心。95℃变性5min，用95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，进行35次扩增反应循环，进行PCR。最后一轮循环结束后，于72℃下保温10min，使反应产物扩增充分。
PCR扩增的引物分别为：
1.lectin基因
Lec-F1：5’GCCCTCTACTCCACCCCCATCC3’
Lec-R1：5’GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG3’
2.35S-CTP基因
SC-F1：5’TGATGTGATATCTCCACTGACG3’
SC-R1：5’TGTATCCCTTGAGCCATGTTGT3’
3.Cp4-epsps基因
CE-F1：5’CCTTCATGTTCGGCGGTCTCG3’
CE-R1：5’GCGTCATGATCGGCTCGATG3’
4.Nos终止子基因
Pnos-F1：5’GAATCCTGTTGCCGGTCTTG3’
Pnos-R1：5’TTATCCTAGTTTGCGCGCTA3’
5.CaMV35S启动子基因
35S-F：5’GCTCCTACAAATGCCATCATTGC3’
35S-R：5’GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC3’
(七)琼脂糖凝胶电泳
用0.5×TBE电泳缓冲液(45mmol/L Tris碱，45mmol/L硼酸，1mmol/L EDTA，pH8.0)，配制1％的琼脂糖凝胶液；加入10mg/ml溴化乙锭(EB)溶液母液，使其终浓度为0.5μg/ml；用制胶板制备相应的凝胶板；取10μl PCR产物与2μl 6×载样缓冲液(0.25％溴酚蓝，40％(w/v)蔗糖水溶液)混匀，用微量移液枪小心加入凝胶板的样品槽中；控制电压保持在60-80V，电流在40mA以上，立即接通电源进行电泳；当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳；在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色并拍照。
Claims (2)
1.一种从酱油、豆奶、番茄酱中分离残留DNA的方法。其特征在于，方法的步骤为：
1)取50ml的酱油、豆奶、番茄酱，12,000rpm离心15-20min，弃上清，保留沉淀；
2)取0.5ml溴代十六烷基三甲铵提取缓冲液溶解沉淀，溴代十六烷基三甲铵提取缓冲液为2％溴代十六烷基三甲铵，50mmol/L Tris碱，pH8.0，10mmol/L乙二胺四乙酸，pH8.0，0.8mol/L氯化钠；
3)65℃保温30～90min，其间不时轻缓颠倒混匀；加入0.5ml 1∶1的苯酚/氯仿，混匀至乳浊状，12,000rpm离心10-15min至分相，吸取上清液用Sephadex-G50柱离心过柱；
4)加入等体积的异丙醇于-70℃或2.5倍体积的无水乙醇于-20℃放置1-2小时，12,000rpm离心10-15min，弃上清，保留沉淀；
5)70％乙醇洗涤沉淀，12,000rpm离心10-15min，重复洗涤沉淀1-2次，室温干燥后，向沉淀中加入200μ110％的Chelex溶液，充分混匀，100℃煮5-10min；
6)12,000rpm离心后，其上清可直接用于聚合酶链式反应的模板。
2.根据权利要求1所述的一种从酱油中分离残留DNA的方法。其特征在于，所说Sephadex-G 50柱的制备方法为：取10g Sephadex-G 50加入无菌的蒸馏水中反复洗涤，除去可溶性的葡聚糖，用TE缓冲液平衡凝胶，高压灭菌15min，TE缓冲液为10mmo/L Tris碱，1mmol/L乙二胺四乙酸，pH7.6；将0.45μm的微孔滤膜放入试管柱中，用Sephadex-G 50装柱，1×TEN缓冲液平衡，加入凝胶直至试管柱完全装满，1×TEN缓冲液为10mmol/L Tris碱，1mmol/L乙二胺四乙酸，100mmol/L氯化钠，pH8.0；1600g离心4min后，继续补加凝胶使柱床体积达到0.9ml；将0.1ml 1×TEN缓冲液加入柱中，1600g离心4min，并重复2次，加满1×TEN缓冲液密封4℃保存备用。
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