CN113046472A - 用于检测猪圆环病毒的三重pcr引物及试剂盒 - Google Patents

用于检测猪圆环病毒的三重pcr引物及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于检测猪圆环病毒1型、2型和3型的三重PCR引物试剂盒。利用本发明提供的三重PCR检测试剂盒可在2小时内对三种病原同时进行检测，所使用的材料价格便宜，所使用的仪器在大多数畜牧场均有配备，并且该方法特异性强，敏感性高，非常适用于临床对猪圆环三种病原的诊断、流行病学调查以及实验室对该三种病原的初步筛查。

Description

用于检测猪圆环病毒的三重PCR引物及试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测猪圆环病毒的三重PCR引物、检测方法及试剂盒。
背景技术
对全球养猪业具有重大影响的猪病-猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)的病原体就是猪圆环病毒(PCV)。目前报道了三种基因型，分别为猪圆环病毒1型(PCV1)，猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)。
猪圆环病毒(PCV)的全基因组大小一般为2000bp左右，属圆环病毒科圆环病毒属，病毒粒子形态为对称的二十面体，不具备囊膜结构。PCV1是首个被发现的PCV病毒，当时被认为是猪肾细胞系传代过程中出现的污染物，但通过观察发现其可以在PK-15细胞系中持续传代但是并不引起细胞病变，1982年通过进一步研究，证明其为一种环状单链DNA病毒，并将其命名为猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)。20世纪90年代早期，在加拿大多个猪场发现爆发断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)，通过检测发现PCV2是该病的主要病原。在随后的几年，世界各个国家的养猪场均有检出PCV2，并且发现临床上PCV2常与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)以及猪支原体(Porcine mycoplasmas)等病毒混合感染，给世界各地养猪业造成了巨大的经济损失。2015年，美国科学家在死于急性PNDS的母猪体内首次发现并鉴定出了PCV3。PCV3与其他圆环病毒在结构上非常相似，但衣壳蛋白氨基酸序列具有一定差异，同源性均小于70％。近几年在中国、波兰、韩国、巴西、泰国、德国、丹麦、西班牙和意大利等国均有检出该病毒猪圆环1,2和3型病毒是目前有报道的三种猪圆环病毒，其中猪圆环2和3型常呈现混合感染，并常常与其他病毒混合感染，为临床的诊断和防控带来了极大的难度。
目前病毒分离和血清学检测通常用于鉴定PCV，但是其检测程序复杂且耗时，限制了它们在临床领域中的应用。近年来，已经开发出直接PCR方法和qPCR方法来检测PCV3。
但目前已有的检测方法并不适用于临床上区分猪群中共存的PCV1，PCV2和PCV3病毒。在临床上准确对PCV进行检测和区分，对于有效的PCVAD控制非常重要。因此，目前迫切需要一种用于同时鉴别PCV1，PCV2和PCV3的高度特异性，灵敏，方便和快速的诊断分析方法和专用试剂盒。
发明内容
为解决以上问题，本发明提供用于检测猪圆环病毒1型，2型和3型的三重PCR引物及试剂盒，该试剂盒能够同时鉴定猪圆环病毒1型，2型和3型，且具有很高的检测灵敏性与特异性。
为实现上述目的，本发明从种内一致性和稳定性、种间特异性、拷贝数等方面对猪圆环病毒基因组特异序列基因尽心筛选，通过对常见近似病毒的检测筛选，分别选取猪圆环病毒1、2、3型特异性的基因片段作为检测分子，并考虑到扩增片段的长短，以便进行电泳检测，进而设计特异性引物，同时考虑到多重PCR之间干扰，利用PCR电泳技术对其种间特异性、种内保守性和灵敏度等结果进行检测。经过大量分析和实验工作，最终获得可供检测使用针对特异DNA分子特异引物，其序列如SEQ ID No1～6所示。
据此，本发明第一方面提供一种用于检测猪圆环病毒的三重PCR引物，所述引物为根据猪圆环病毒1型，猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的全基因序列分别设计的引物。
其中，猪圆环病毒1型的检测引物，由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的正向引物和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的反向引物组成；猪圆环病毒2型的检测引物，由由SEQID NO：3所示的核苷酸序列的正向引物和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的反向引物组成；猪圆环病毒3型的检测引物，由由SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的正向引物和SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列的反向引物组成；
上述的用于检测猪圆环病毒1型，2型和3型的三重PCR引物在制备检测猪圆环病毒的制品中的应用。
本发明第二方面提供一种用于检测猪圆环病毒的三重PCR检测试剂盒，包括如权利要求1所述的检测猪圆环病毒1型，2型和3型的三重PCR引物。
上述试剂盒还包括10×Taq Buffer、dNTP、MgCl2、Taq酶、阳性质控品、阴性质控品。
上述试剂盒中阳性质控品为：猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型重组质粒以及猪圆环病毒3型全基因组质粒。
上述阳性质控品中猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型重组质粒的构建方法为：设计猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型的特异性引物，通过克隆后连接pMD-18T载体，即得猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型重组质粒；其中，猪圆环病毒1型特异性引物，由SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的正向引物和SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列的反向引物组成；猪圆环病毒2型特异性引物，由SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列的正向引物和SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列的反向引物组成。
本发明第三方面提供上述试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
1)从待检样品制备基因组总DNA；
2)以制备的基因组DNA为模板，利用如权利要求1所述的三重PCR引物，在同一反应体系中进行PCR扩增，得到扩增产物；
3)扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，获得检测结果。
结果判定：
若待检样品中扩增出目的条带为899bp，空白对照无相应的扩增条带，则所述样品中含有猪圆环病毒1型的核酸，为猪圆环病毒1型检测阳性；
若待检样品中扩增出目的条带为485bp，空白对照无相应的扩增条带，则所述样品中含有猪圆环病毒2型的核酸，为猪圆环病毒2型检测阳性；
若待检样品中扩增出目的条带为263bp，空白对照无相应的扩增条带，则所述样品中含有猪圆环病毒3型的核酸，为猪圆环病毒3型检测阳性；
若待检样品中扩增出目的条带同时包括上述两种或三种，空白对照无相应的扩增条带，则所述样品中含有猪圆环病毒1型、2型和3型中相应的两种或三种；
若待检样品中未扩增出上述目的条带，则为阴性。
上述试剂盒的使用方法中三重PCR反应体系总体积为50μL，包括：10×TaqBuffer，5μL；dNTP，4μL；MgCl2，3μL；ExTaq酶，0.4μL；猪圆环病毒1型的检测引物上下游引物各0.6μL，猪圆环病毒3型的检测引物上下游引物各0.6μL，猪圆环病毒3型的检测引物上下游引物各1.2μL；DNA模板5μL；加入双蒸水至50μL。
上述试剂盒的使用方法中三重PCR的反应程序包括：94℃预变性2min；94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸1min，38个循环；72℃终延伸7min。
上述试剂盒的使用方法检测灵敏度可达1.0x 103拷贝/μL。
本发明第四方面提供一种如本发明第一方面所述的三重PCR引物、如本发明第二方面所述三重PCR检测试剂盒在猪圆环病毒检测中的应用，其中，所述检测不以疾病诊断治疗为目的。
本发明具有如下优点：
1)特异性好，用该三重PCR反应体系，以PVC1、PVC2和PVC3为阳性模板均能扩增出899bp、485bp和263bp的特异性条带，而以其他常见猪病毒为模板时均未扩增出特异性条带；灵敏度高，最低检测量可达1.0×103拷贝/μL；
2)使用该三重PCR检测试剂盒可在2小时内对三种病原同时进行检测，所使用的材料价格便宜，所使用的仪器在大多数畜牧场均有配备，并且该方法特异性强，敏感性高，非常适用于临床对猪圆环三种病原的诊断、流行病学调查以及实验室对该三种病原的初步筛查。
附图说明
图1三重PCR检测结果图，其中，M:DNA Marker；1：PCV1；2：PCV2；3：PCV3；4：PCV1、PCV2及PCV3；5：阴性对照。
图2三重PCR检测试剂盒特异性试验结果，其中，M：DNA Marker；1：PCV1；2：PCV2；3：PCV3；4：PCV1、PCV2和PCV3；SIV：猪流感病毒；PRV：伪狂犬病病毒；PRRSV：猪蓝耳病病毒；PEDV：猪流行性腹泻病毒；TGEV：猪传染性胃肠炎；CSFV：猪瘟病毒。
图3三重PCR检测试剂盒敏感性试验结果，其中，M:DL2000Marker，1-10：1.0×108～1.0×10-1拷贝/μL。
图4猪肝脏组织检测结果，其中，M：DNA Marker；A：猪肝脏组织；水：阴性对照。
图5攻毒细胞液检测结果，其中，M：DNA Marker；A：PCV3攻毒细胞液；水：阴性对照。
图6血清检测结果，其中，M：DNAMarker；A：血清；水：阴性对照。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细的说明。应当指出，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，未特别说明的所用试剂及耗材均为市售商品。
实例1：猪圆环病毒三重PCR方法特异性引物筛选及体系优化
1)根据Genbank上发表的PCV1、PCV2和PCV3的全基因序列分别设计对应的特异性引物(表1)。
表1针对PCV1、PCV2和PCV3的特异性引物
Figure BDA0002341425560000071
实验表明，上述引物特异性强，能分别特异性扩增PCV1、PCV2和PCV3特异性片段，而在其他病毒中都无目的片段扩增；且引物的灵敏度较高，在多重PCR扩增最低检测量可达1.0×103拷贝/μL。以上述引物分别向3′、5′延伸一个碱基和两个碱基或修饰形成的引物对进行实验，实验表明仍能进行特异性扩增，但从经济性和综合效果来看以表3中的引物最佳。
2)设计PCV1，PCV2的特异性引物(表2)，通过克隆后连接pMD-18T载体，分别构建PCV1、PCV2重组质粒以及PCV3全基因组质粒十倍梯度稀释作为质控品。
表2 PCV1和PCV2重组质粒的引物
Figure BDA0002341425560000081
3)猪圆环病毒三重PCR的反应体系及反应程序
反应体系为：10×Taq Buffer，5μL；dNTP(10mM),4μL；MgCl2(25mM)，3μL；ExTaq酶(5U/μL)，0.4μL；PCV1和PCV2的引物(10μM)各0.6μL；PCV3的引物1.2μL；DNA模板5μL，加入双蒸水至50μL。
反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸1min，38个循环；72℃终延伸7min。
反应结束后，取7μL PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶成像系统进行观察并拍照，根据电泳结果确定样本中能否扩增出目的条带。
结果判定：
若待测样品中扩增出目的条带为899bp，空白对照无相应的扩增条带，则所述样品中含有猪圆环1型病毒的核酸，为猪圆环1型检测阳性；
若待测样品中扩增出目的条带为485bp，空白对照无相应的扩增条带，则所述样品中含有猪圆环2型病毒的核酸，为猪圆环2型检测阳性；
若待测样品中扩增出目的条带为263bp，空白对照无相应的扩增条带，则所述样品中含有猪圆环3型病毒的核酸，为猪圆环3型检测阳性；
若待检样品中扩增出目的条带同时包括上述两种或三种，空白对照无相应的扩增条带，则所述样品中含有猪圆环病毒1型、2型和3型中相应的两种或三种；
若待检样品中未扩增出上述目的条带，则为阴性(图1)。
实施例2三重PCR检测试剂盒的特异性和敏感性试验
1)特异性试验
采用建立的三重PCR试剂盒对猪流感病毒(SIV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性肠胃炎病毒(TGEV)、猪瘟病毒(CSFV)进行扩增，并选择灭菌水做阴性对照，检验所建立方法的特异性。
结果如图2所示，猪圆环病毒1型的目的片段大小为899bp；猪圆环病毒2型的目的片段大小为485bp；猪圆环病毒3型的目的片段大小为263bp；而猪圆环病毒1型、2型和3型混合感染目的片段有三条，大小分别为899bp、485bp、263bp；SIV、PRV、PRRSV、PEDV、TGEV、CSFV均未见特异性条带扩增。
2)敏感性试验
按照108～10-1拷贝/μL的浓度进行10倍梯度稀释，并按照上述优化好的反应体系及反应程序进行三重PCR的扩增灵敏度检测试验。
结果如图3所示，最低检测量可达1.0×103拷贝/μL。
实施例3三重PCR检测试剂盒的应用
从猪场收集到疑似患病猪的肝脏组织一份，取小拇指甲盖大小，加入200μL PBS进行研磨，使用DNA提取试剂盒提取组织样品DNA，使用建立的三重PCR检测试剂盒对其进行检测，检测结果显示为PCV2和PCV3阳性，通过基因组测序以及qPCR检测结果的比较确定该样品确实为PCV2和PCV3阳性(图4)。
使用DNA提取试剂盒对实验室攻毒的viro细胞液进行DNA的提取，使用建立的三重PCR检测试剂盒对其进行检测，检测结果显示其为PCV3阳性，通过基因组测序以及qPCR检测结果的比较确定该样品确实为PCV3阳性(图5)。
使用实验室攻毒PCV3病毒的攻毒猪的血清，使用DNA提取试剂盒进行DNA的提取，使用建立的三重PCR检测试剂盒对其进行检测，检测结果显示其为PCV3阳性，通过基因组测序以及qPCR检测结果的比较确定该样品确实为PCV3阳性(图6)。
实施例4试剂盒的组装
该试剂盒的组成包括：
引物(各物种引物对SEQ ID No.1&2、3&4、5&6各一份)；
10×Taq Buffer；dNTP(10mM)；MgCl2(25mM)；ExTaq酶(5U/μL)，也可以做成预混液；
阳性对照DNA模板(猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型重组质粒PCV3全基因组质粒)；
灭菌水。
本试剂盒-20℃储存12个月不影响使用效果。
试剂盒的应用方法：
1.依据需要，按照上述各实施例1反应体系加样扩增；每个反应需设置空白对照和阳性对照，反应体系及扩增条件同受测样品。
2.反应结束后取5μL PCR扩增产物，3.0％的琼脂糖凝胶电泳(技术参数：2V/cm～5V/cm，电泳15min～30min)，用溴化乙锭染色，凝胶成像系统检测结果。猪圆环病毒1型的目的片段大小为899bp；猪圆环病毒2型的目的片段大小为485bp；猪圆环病毒3型的目的片段大小为263bp。根据电泳结果可以直接进行判断。
序 列 表
<110> 北京市农林科学院
<120> 用于检测猪圆环病毒的三重PCR引物及试剂盒
<130> 10.17
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgggggtctt tggtgactgt agccgagca 29
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgatccacca acttggccta tga 23
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgattgttg gcgaggaggg taatg 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tagccatccc accacttgtt tctag 25
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atgaacccgg atccacggag gtctgtag 28
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tgacactcgg tcggggtcca gttgttta 28
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atggaaccga ccagcagaa 19
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tgattcaaca tcggccagtt cc 22
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
atgtcggcag cacctcagca gcaacat 27
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tgaatcccag ggcagccagc cataa 25

Claims (10)

1.一种用于检测猪圆环病毒的三重PCR引物，其特征在于，其中，猪圆环病毒1型的检测引物，由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的正向引物和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的反向引物组成；猪圆环病毒2型的检测引物，由SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的正向引物和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的反向引物组成；猪圆环病毒3型的检测引物，由SEQ IDNO：5所示的核苷酸序列的正向引物和SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列的反向引物组成。
2.权利要求1所述的用于检测猪圆环病毒的三重PCR引物在制备检测猪圆环病毒的制品中的应用。
3.一种用于检测猪圆环病毒的三重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的用于检测猪圆环病毒的三重PCR引物。
4.如权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括10×Taq Buffer、dNTP、MgCl2、Taq酶、阳性质控品、阴性质控品。
5.如权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中阳性质控品为：猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型重组质粒以及猪圆环病毒3型全基因组质粒。
6.如权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品中猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型重组质粒的构建方法为：设计猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型的特异性引物，通过克隆后连接pMD-18T载体，即得猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型重组质粒；其中，猪圆环病毒1型特异性引物，由SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的正向引物和SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列的反向引物组成；猪圆环病毒2型特异性引物，由SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列的正向引物和SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列的反向引物组成。
7.权利要求3所述试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)从待检样品制备基因组总DNA；
2)以制备的基因组DNA为模板，利用如权利要求1所述的三重PCR引物，在同一反应体系中进行PCR扩增，得到扩增产物；
3)扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，获得检测结果。
8.如权利要求7所述试剂盒的使用方法，其特征在于，PCR的反应体系总体积为50μL，包括：10×Taq Buffer，5μL；dNTP，4μL；MgCl2，3μL；ExTaq酶，0.4μL；猪圆环病毒1型的检测引物上下游引物各0.6μL，猪圆环病毒3型的检测引物上下游引物各0.6μL，猪圆环病毒3型的检测引物上下游引物各1.2μL；DNA模板5μL；加入双蒸水至50μL。
9.如权利要求7所述试剂盒的使用方法，其特征在于，PCR的程序包括：94℃预变性2min；94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸1min，38个循环；72℃终延伸7min。
10.一种如权利要求1所述的三重PCR引物、如权利要求3所述三重PCR检测试剂盒在猪圆环病毒检测中的应用，其中，所述检测不以疾病诊断治疗为目的。
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