CN104263859A - 一种能够快速区分猪圆环病毒1型(pcv1)和2型(pcv2)的多重pcr诊断方法和专用试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明专利涉及农业技术领域内的诊断技术。通过自行设计特异性引物L1、L2、L3，提取病毒DNA，在此基础上利用PCR方法鉴别检测猪圆环病毒不同血清型，扩增猪圆环病毒II型(PCV2)预计扩增片段大小为404bp，扩增猪圆环病毒I型(PCV1)预计扩增片断大小为198bp。并在此基础上研制成功了专用试剂盒，与现有技术相比该诊断方法和专用试剂盒具有很强的特异性、敏感性，与病毒分离和IFA等方法相比符合率可达90％以上。该引物对猪蓝耳病病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒的扩增结果均为阴性，可广泛用于临床和实验室圆环病毒的检测。

Description

一种能够快速区分猪圆环病毒1型(PCV1)和2型(PCV2)的多重PCR诊断方法和专用试剂盒
技术领域
本发明专利涉及兽医生物技术领域的诊断技术，具体是一种能够快速区分猪圆环病毒1型(PCV1)和2型(PCV2)的多重PCR诊断方法和专用试剂盒。
背景技术
猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)是一种小的、二十面体对称、无囊膜、单股环状DNA病毒。病毒粒子直径为17nm左右，是目前发现的最小DNA的动物病毒之一。圆环病毒有两个基因型：无致病性的PCV1和具有致病性的PCV2。猪圆环病毒2型也是引起断奶仔猪多系统衰弱综合征(PMWS)的主要病原，该病主要表现为体重下降，呼吸困难，黄疸以及间质性肺炎，淋巴结肿大，肝炎和肾炎等症状，给养殖业带来巨大的经济损失，是目前危害世界养猪业的重要疫病之一。猪圆环病毒1型虽然没有致病性，但经常污染猪源的细胞系，而且在实验室的PCV2细胞毒培养纯化中很容易污染PK-15细胞，影响PCV2的增值。本研究的目的是建立一种能够快速区分猪圆环病毒1型和2型的多重PCR诊断方法和专用试剂盒，方便实验室对细胞培养及PCV2细胞毒纯化的随时监控。
发明内容
本发明的目的是针对目前我国PCV2感染普遍存在，给养猪业带来严重经济损失，而PCV2培养过程中经常污染PCV1的现状，提供一种能够方便实验室对细胞培养及PCV2细胞毒纯化进行随时监控的诊断方法和专用试剂盒。
本发明的目的是这样实现的：
自行设计特异性引物，提取细胞等病料DNA，在此基础上利用PCR方法检测猪圆环病毒1型和2型，并在此基础上研制成功了专用试剂盒，与现有技术相比该诊断方法和专用试剂盒具有很强的特异性、敏感性，与病毒分离和IFA等方法相比符合率可达90％以上，可广泛用于猪圆环病毒1型和2型的鉴别检测。
附图说明
图1试剂盒对PCV1和PCV2特异性鉴别扩增结果
M：DL2000(2000，1000，750，500，250，100bp)；1、3泳道：特异性扩增PCV1目的条带；2泳道：特异性扩增PCV2目的条带；4泳道：阴性对照
图2临床样本的PCR检测结果
M：DL2000(2000，1000，750，500，250，100bp)；1、2、3、6、8、9、13：PCV1阳性检测样本；4、5、7、10、11、12：PCV2阳性检测样本；14：PCV1、PCV2阳性检测样本。
具体实施方式
1.1引物设计：根据NCBI上发表的PCV1和PCV2基因序列的差异，设计了三条特异性引物L1、L2、L3，扩增猪圆环病毒II型(PCV2)预计扩增片段大小为404bp，扩增猪圆环病毒I型(PCV1)预计扩增片断大小为198bp。
L1：5′-TATTACCGGCGCACTTCGGCAGCG-3′
L2：5′-TCACTCCGTTGTCCCTGAGATCT-3′
L3：5′-TCTTCCAAACCTTCCTCTCCGCAA-3′
其中L1和L2能够特异性扩增猪圆环病毒II型(PCV2)，预计扩增片段大小为404bp，L1和L3扩增猪圆环病毒I型(PCV1)预计扩增片断大小为198bp，退火温度为55℃，采用30个循环。
1.2病毒DNA的提取
分别取PCV1和PCV2细胞培养裂解液，反复冻融3次后，5000g离心15分钟。
1)取上清500μL于1.5mL离心管中，加入50μg/mL的蛋白酶K 5μL，加入10％的SDS溶液25μL，55℃水浴2～3小时。
2)加入200μL Tris饱和酚，充分混匀，10000g离心15分钟。
3)取上清于一新离心管中，加入Tris饱和酚和氯仿各200μL，充分混匀后，10000g离心15分钟。4)取上清于一新离心管中，加入200μL氯仿，充分混匀，10000g离心15分钟。
5)取上清于一新离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃静置20分钟，10000g离心15分钟，弃上清。
6)加入70％的乙醇冲洗沉淀表面及管壁，弃乙醇，晾干。
7)加入20μL灭菌超纯水溶解沉淀，-20℃保存备用。
1.3聚合酶链式反应(PCR)
以上述DNA为模板，按顺序加入以下试剂，建立50μLPCR反应体系
反应条件为：(1)95℃5min；(2)94℃40S，55℃40S，72℃40S，共30个循环；(3)72℃10min。PCR扩增产物于-20℃保存。
1.4电泳：电压100V电泳40min，取凝胶在含10mg/mL的溴化乙锭(EB)水溶液中染色15min，在DNA凝胶成像系统仪下观察并拍照。
1.5病料的检测
实验1：
分别以PCV1和PCV2病毒样品按照上述步骤1.3中的反应体系和方法进行检测，并设置阴性对照(结果见附图1)，电泳结果表明，PCV1样品中扩增得到约198bp片段(附图1的泳道1和3)，PCV2样品扩增得到约404bp片段(参见泳道2)，阴性对照没有扩增片段(参见泳道4)。
实验2：
使用上述步骤1.3中的反应体系和方法对取自己确定感染病毒类型的患者样本进行检测，样本按照步骤1.2提取DNA后进行监测，结果见图2。泳道1、2、3、6、8、9、13为取自确认仅感染PCV1病毒的患者的样品，泳道4、5、7、10、11、12为取自确认仅感染PCV2病毒的患者的样品，泳道14为取自确认同时感染PCV1和PCV2病毒的患者的样品。结果显示，泳道1、2、3、6、8、9、13均只扩增得到约198bp的片段，泳道4、5、7、10、11、12均只扩增得到约为404bp的片段；而泳道14则同时扩增得到了两者。因此，本申请设计得到的引物L1、L2和L3可以很好的检测样品中感染的猪圆环病毒类型，成功构建了能够快速区分猪圆环病毒1型和2型的多重PCR诊断方法。
实验3：特异性检测
使用上述相同的试验方法和体系对猪圆环病毒、猪蓝耳病病毒、猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒、猪副流感病毒、猪生殖和呼吸综合征病毒、猪细小病毒、猪轮状病毒、猪传染性胃肠炎病毒进行扩增检测，结果表明，只有猪圆环病毒PCV1和PCV2分别扩增得到了约198bp和404bp的片段，其他病毒均无扩增条带产生。实验结果证实，本申请的引物和检测方法具有相当高的特异性。
实验4：符合性和灵敏度实验
对待检样本分别使用本申请和现有技术已知的其他PCR检测方法(“病料中猪圆环病毒(PCV)的分型检测及PCV2型不同毒株的培养”，罗维等，湖南农业大学学报(自然科学版)，第39卷第6期)进行符合性分析实验，结果表明本发明具体实施方式所述方法对PCV的分型鉴定准确，与现有技术其他分型方法结果符合率为100％；对临床待检样品、定量标准品进行10倍梯度稀释，结果表明本发明所述分型方法检测灵敏度高于上述现有技术中PCR检测方法1个log值。

Claims (8)

1.一组用于对圆环病毒进行分型检测的引物组，所述引物组包括特异性引物L1、L2、L3，其中：
L1：5′-TATTACCGGCGCACTTCGGCAGCG-3′
L2：5′-TCACTCCGTTGTCCCTGAGATCT-3′
L3：5′-TCTTCCAAACCTTCCTCTCCGCAA-3′。
2.包含权利要求1所述引物组的圆环病毒分型检测试剂盒。
3.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括核酸提取试剂、PCR扩增试剂、和/或琼脂糖凝胶电泳试剂。
4.一种圆环病毒分型检测方法，其特征在于，使用权利要求1所述的引物组进行PCR检测，退火温度为55℃。
5.如权利要求4所述的分型检测方法，其包括以下步骤：
(1)可选的，核酸提取步骤；
(2)PCR扩增步骤：
(3)可选的，琼脂糖凝胶电泳检测步骤。
6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，还包括对琼脂糖凝胶电泳的结果进行分析的步骤，如扩增片段约为404bp，则样本中的圆环病毒为猪圆环病毒II型(PCV2)；如扩增片断大小约为198bp，则样本中的圆环病毒为猪圆环病毒I型(PCV1)。
7.如权利要求5或6所述的检测方法，其特征在于，还包括对PCR扩增产物进行测序验证的步骤。
8.如权利要求5或6所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)的PCR扩增的条件为：95℃5min；94℃40S，55℃40S，72℃40S，共30个循环；72℃10min。
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