CN103122368A

CN103122368A - 一种喹喔啉类化合物作为抗结核分枝杆菌抑制剂的应用

Info

Publication number: CN103122368A
Application number: CN2011103738517A
Authority: CN
Inventors: 何正国; 崔涛; 曾菊梅
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2011-11-21
Filing date: 2011-11-21
Publication date: 2013-05-29
Anticipated expiration: 2031-11-21
Also published as: CN103122368B

Abstract

本发明属于药物靶标技术领域，具体涉及一种对结核分枝杆菌具有抑制作用的小分子先导化合物的应用。该小分子化合物是喹喔啉类化合物，其化学名称为N-烯丙基-N-[3-(烯丙基亚胺)-1，4-二氢-2-喹喔啉亚基]胺，该化合物具有分子量小，结构简单，渗透性好等优点，能有效抑制结核分枝杆菌的生长，结核分枝杆菌是结核病的致病菌，所以该小分子化合物有治疗结核病的潜力，有望发展成为一种抗结核新药。因此，本发明的小分子化合物可以作为新的抗结核药物进行开发，为治疗和治愈结核病提供了一种新的途径和手段。本发明还涉及含有该小分子抑制剂的制剂在制备抗结核药物中的应用。

Description

一种喹喔啉类化合物作为抗结核分枝杆菌抑制剂的应用

技术领域

本发明属于抑菌药物的筛选技术领域。具体涉及一种特异抑制结核分枝杆菌生长的小分子化合物即喹喔啉类化合物作为抗结核分枝杆菌抑制剂的应用。

背景技术

结核分枝杆菌是一种严重危害人类健康的病原菌，结核分枝杆菌在感染人体后，会在人体内存在数月或数年。据世界卫生组织统计，全世界每年大约有三百万人死于结核病，并且全球约有三分之一的人口感染处于潜伏状态的结核分枝杆菌(WHO，2009)。目前，结核病化学疗法有一线和二线药物的混合剂构成。实际的结核病治疗需要4-5种药物超过6-9个月时间的复杂而又长期的治疗方案来根除该疾病，导致了严重的毒性和抗药性。事实上，由于具有不寻常的细胞壁，分枝杆菌天然地对大多数常用抗生素具有抗性。此外，遗传学改变也使其获得抗药性。由于结核分枝杆菌菌株对越来越多的用于治疗多重抗药性结核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)的二线药物产生抗性，因此其已成为世界范围公共健康的威胁(Gandhi et al，2010)。对于MDR的结核分枝杆菌来说80％死亡率导致该疾病成为严重的全球性健康问题。近年来出现的药物抗性菌株以及与HIV的共感染问题，使得这一形式更加严峻。结核病不仅是存在于发展中国家的问题。随着全球旅行和移民的增加，结核病成为了一个严重威胁全世界的疾病。因此，寻找新的药物靶标并研发新的抗结核药物和诊断工具已经迫在眉睫(Ginsberg and Spigelman，2007)。特别地，我们需要具有新作用机制的对抗药性菌株具有活性的新药物。

发明内容

本发明的目的在于喹喔啉类化合物作为抗结核分枝杆菌抑制剂的应用，所述的化合物具有抑制结核分枝杆菌生长并最终杀死结核分枝杆菌的特性。

本发明通过以下技术方案实现：

申请人通过筛选得到一种喹喔啉类化合物，该化合物具有如下所述的结构：

该喹喔啉类化合物是一种已知化合物，其中文名称为N-烯丙基-N-[3-(烯丙基亚胺)-1，4-二氢-2-喹喔啉亚基]胺；其英文名称为N-allyl-N-[3-(allylimino)-1，4-dihydro-2-quinoxalinylidene]amine。其ZINC数据库ID为13281923；其分子式为C14H16N4；分子量为240.31。为了叙述方便，在本说明书中简称该化合物为70#化合物或抑制剂70#。该化合物可以从商业途径购买得到，本发明所使用的该化合物是从荷兰Specs公司(http://www.specs.net)购买得到。

本发明测定了该喹喔啉类化合物对结核分枝杆菌的抑制作用，在本发明的实施例中，申请人详细描述了所涉及到的若干参试的分枝杆菌，例如：耻垢分枝杆菌菌株(耻垢分枝杆菌菌株的公众获得来源：中国医学细菌保藏管理中心，菌株编号为：93202。网址：http://www.cmccb.org.cn/，)，牛型分枝杆菌菌株(牛型分枝杆菌菌株的公众获得来源：中国医学细菌保藏管理中心，菌株编号为：93006。网址：http://www.cmccb.org.cn/)，结核分枝杆菌菌株(结核分枝杆菌菌株的公众获得来源：中国医学细菌保藏管理中心，菌株编号为：93004。网址：http://www.cmccb.org.cn/)。本发明中将50μg/ml的候选抑制剂添加到分枝杆菌的培养物中，然后将添加了上述候选抑制剂的分枝杆菌于37℃培养7～8天，通过读取各OD值并与对照进行比较来判断分枝杆菌的生长是否受到了抑制。对照1为抑制剂70#的处理组，对照2是使用抗结核的一线药物即利福平(RFP)处理组。实验过程中的数据是与两个对照组比较来评价利用候选抑制剂得到的抑制效果，寻找具有抑制效果的化合物。采用同样的方法还测定了N-烯丙基N-[3-(烯丙基亚胺)-1，4-二氢-2-喹喔啉亚基]胺对结核分枝杆菌，牛型分枝杆菌及耻垢分枝杆菌的最低抑菌浓度。

本发明的优点如下

1、本发明获得的小分子化合物分子量小，结构相对简单，易溶于多种溶剂。

2、本发明获得的小分子化合物特异性好，能有效杀死结核分枝杆菌，而对同源菌属耻垢分枝杆菌效果不明显。

3、本发明获得的小分子化合物抑制结核分枝杆菌的效果可以接近一线抗结核药物利福平。更详细的技术方案见《具体实施方式》所述。

附图说明

图1.候选抑制剂70#对各分枝杆菌菌株的抑菌结果。

图2.固体斜面上观察各处理样品的存活情况，从左到右依次是不添加抑制剂70#的对照组，添加抑制剂70#的处理组，添加利福平的对照组。

图3.最小抑菌浓度测定实验中结核分枝杆菌菌株在各抑制剂浓度下的生长情况。从左到右喹喔啉类化合物即抑制剂70#的浓度分别为：0.031，0.062，0.125，0.25，0.50，1.00，2.00，4.00，8.00，16.00，32.00μg/ml。

具体实施方式

实施例1菌株的培养和液体抑制剂的配制

供试菌株的准备：

本实施例的参试菌株涉及耻垢分枝杆菌菌株(菌株编号：93202；从中国医学细菌保藏管理中心获得，网址：http://www.cmccb.org.cn/，(下同))，牛型分枝杆菌菌株(菌株编号：93006，从中国医学细菌保藏管理中心获得)，结核分枝杆菌菌株(菌株编号：93004，从中国医学细菌保藏管理中心获得)。

筛选培养基的组分及制备：

液体筛选培养基的组分及其配制方法：在100ml的液体筛选培养基中加入90ml商购的7H9液体培养基(该7H9液体培养基购自美国BD公司，货号：271310)和10ml OADC营养液(5％牛血清白蛋白，0.2％葡萄糖，0.06％油酸甘油酯，230mmol/l NaCl，该商品OADC营养液购自美国BD公司，货号：211886)，该液体培养基是针对分枝杆菌菌株的典型液体培养基。

固体筛选培养基的组分及其配制方法：在100ml的固体筛选培养基中加入90ml商购的7H10固体培养基(购自美国BD公司，货号：262710)和10ml OADC营养液(5％牛血清白蛋白，0.2％葡萄糖，0.06％油酸甘油酯，230mmol/l NaCl，该商品OADC营养液购自美国BD公司，货号：211886)，该固体培养基是针对分枝杆菌菌株的典型固体培养基。

候选抑制剂的准备：

本实施例的抑制剂(N-烯丙基-N-[3-(烯丙基亚胺)-1，4-二氢-2-喹喔啉亚基]胺)以溶液或混悬液使用。采用二甲基亚砜(DMSO)溶解抑制剂粉剂以便于后续实验使用。具体配制方法：先配制成原始浓度为50mg/ml(0.1M)的抑制剂浓缩液贮存备用，在测定抑制剂即N-烯丙基N-[3-(烯丙基亚胺)-1，4-二氢-2-喹喔啉亚基]胺对结核分枝杆菌，牛型分枝杆菌及耻垢分枝杆菌的最低抑菌浓度时，用上述配制好的抑制剂浓缩液进行浓度梯度实验，其浓度梯度分别设计为：0.031，0.062，0.125，0.25，0.50，1.00，2.00，4.00，8.00，16.00，32.00μg/ml。

接种及培养方法：

将上述三种分枝杆菌分别接种于上述制备好的液体筛选培养基中，于37℃培养，其中：耻垢分枝杆菌菌株培养3天，牛型分枝杆菌菌株，结核分枝杆菌菌株均培养21天，至分枝杆菌密度为1×10⁸～2×10⁸或光密度值OD₆₀₀为0.8～1。然后将每一种分枝杆菌菌液进行稀释(终浓度为1～2×10⁴)并分装到96孔板中。整个操作在常用的生物安全柜的无菌操作程序的无菌条件下进行。

实施例2抑制剂的体外抑菌活性试验

按照实施例1的无菌操作程序，将实施例1的结核分枝杆菌菌液(菌株编号为：93004)接种到添加有抑制剂70#的筛选培养基中来确定抑制剂70#的体外抑菌活性。本实施例中将50μg/ml的抑制剂70#添加到结核分枝杆菌的细菌培养物中于37℃培养7～8天，通过读取各OD值并与对照(含对照1和对照2)进行比较来判断结核分枝杆菌生长是否受到抑制。对照1为不添加抑制剂70#，对照2为添加利福平50μg/ml，实验过程中的数据是与两个对照比较来评价抑制剂70#对结核分枝杆菌抑制效果，牛型分枝杆菌菌株(菌株编号为：93006)，耻垢分枝杆菌菌株(菌株编号为：93202)的体外抑菌实验采用上述同样的方法，结果如图1所示。从图1中可以明显看出候选抑制剂喹喔啉类化合物即抑制剂70#能有效抑制结核分枝杆菌和牛型分枝杆菌的生长，而对耻垢分枝杆菌不产生抑制效果。

实施例3确定喹喔啉类化合物的体外抑菌活性

将结核分枝杆菌(菌株编号为：93004)菌液接种到添加有喹喔啉类化合物的液体筛选培养基中来确定喹喔啉类化合物的体外抑菌活性。具体方法是：将50μg/ml的由实施例2筛选得到的抑制剂70#添加到结核分枝杆菌的细菌培养物中(菌液浓度为1～2×10⁷)于37℃培养，经过8天的抑制剂70#处理后，将10μl结核分枝杆菌菌液涂到固体筛选培养基上于37℃培养一个月，观察各样品的生长情况。结果表明：添加有抑制剂70#和利福平的两个样品均没有单菌落生长，而不用抑制剂70#的结核分枝杆菌则生长良好，结果见图2。

实施例4确定候选抑制剂的最低抑制浓度(MIC)

在抗菌试验中，抑制的百分数的评价优选通过测定最低抑制浓度(Minimum InhibitoryConcentration，MIC)来进行。MIC定义为抗菌药物能抑制培养基中细菌生长的最低浓度。按照实施例1的设计方案，将不同浓度的抑制剂70#进行梯度稀释(其浓度梯度分别为：0.031，0.062，0.125，0.25，0.50，1.00，2.00，4.00，8.00，16.00，32.00μg/ml)，添加到培养有结核分枝杆菌的液体筛选培养基中，37℃培养7～8天，通过读取各OD值来判断结核分枝杆菌生长是否受到抑制，结果见图3所示。耻垢分枝杆菌菌株，牛型分枝杆菌菌株的接种与培养条件同结核分枝杆菌，其MIC测定结果如表1所示。

表1.抑制剂70#对各分枝杆菌属的最小抑菌浓度

参考文献：

1.World Health Organization.Global Tuberculosis Control 2009：Epidemiology，Strategy，Financing.Nonserial Publication.WHO，2009.

2.Gandhi NR，Nunn P，Dheda K，Schaaf HS，Zignol M，van Soolingen D，Jensen P，Bayona J.Multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis：a threat to global control oftuberculosis.Lancet.2010 May 22；375(9728)：1830-43.

3.Ginsberg AM，Spigelman M.Challenges in tuberculosis drug research and development.NatMed.2007 Mar；13(3)：290-4.

Claims

1.一种喹喔啉类化合物在筛选抗结核分枝杆菌药物化合物中作为抑制剂的应用，其特征在于，该化合物是N-烯丙基-N-[3-(烯丙基亚胺)-1，4-二氢-2-喹喔啉亚基]胺，其分子式为C14H16N4；分子量为240.31，其结构式如下所示；

其步骤如下：

(1)以耻垢分枝杆菌，牛结核分枝杆菌，结核分枝杆菌为参试菌；

(2)液体筛选培养基的制备：在100ml的液体筛选培养基中加入90ml 7H9液体培养基和10ml OADC营养液；

(3)将步骤(1)所述的三种分枝杆菌分别接种于步骤(2)所述的液体筛选培养基中，于37℃培养，其中：耻垢分枝杆菌培养3天，牛结核分枝杆菌和结核分枝杆菌培养21天，至分枝杆菌密度为1×10⁸～2×10⁸或光密度值OD₆₀₀为0.8～1，然后将每一种分枝杆菌菌液稀释并分装到96孔板中，稀释后的终浓度为1～2×10⁴；

(4)将50μg/ml的N-烯丙基-N-[3-(烯丙基亚胺)-1，4-二氢-2-喹喔啉亚基]胺添加到步骤(3)的培养有分枝杆菌菌液的96孔板中，通过读取OD₆₀₀值并与对照比较，判断分枝杆菌的生长是否受到了抑制；

(5)重复步骤(4)的方法，测定N-烯丙基-N-[3-(烯丙基亚胺)-1，4-二氢-2-喹喔啉亚基]胺对结核分枝杆菌，牛结核分枝杆菌及耻垢分枝杆菌的最低抑菌浓度(MIC)；

其中

步骤(2)所述的OADC营养液组分及配比如下：5％牛血清白蛋白，0.2％葡萄糖，0.06％油酸甘油酯，140mmol/l NaCl；

步骤(5)所述的最低抑菌浓度分别如下所述：

结核分枝杆菌 8μg/ml；

牛结核分枝杆菌 8μg/ml。