CN101140243A

CN101140243A - 一种用于检测副溶血弧菌的方法

Info

Publication number: CN101140243A
Application number: CNA2007100466374A
Authority: CN
Inventors: 潘迎捷; 徐芊; 孙晓红; 赵勇
Original assignee: Shanghai Ocean University
Current assignee: Shanghai Ocean University
Priority date: 2007-09-29
Filing date: 2007-09-29
Publication date: 2008-03-12
Anticipated expiration: 2027-09-29
Also published as: CN101140243B

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体地说是一种用于检测副溶血弧菌的方法，其特征在于：DNA模板的制备为细菌纯培养物离心，弃上清液、加入100μL无菌水后水浴，后冰浴、再离心，取上清液备用，作为模板进行扩增；采用primer primer5.0引物软件针对副溶血弧菌tlh基因M36437设计LAMP引物中4条引物序列；采用副溶血弧菌的环介导等温扩增：配置25uL反应体系、温育、灭活；产物检测：肉眼观察反应体系的浊度。本发明与现有技术相比，检测方法简便、可靠、灵敏度高，耗时短，成本低廉，是简易的常规检测手段，尤其适用基层检验检疫机构及养殖场，对提高食品卫生水平和推动食品国际贸易发展具有重要的意义。

Description

一种用于检测副溶血弧菌的方法

[技术领域]

本发明涉及生物技术领域，具体地说是一种用于检测副溶血弧菌的方法。

[背景技术]

副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus隶属于弧菌科弧菌属，是一种革兰氏阴性菌，菌体一端有单鞭毛，运动活泼，为嗜盐性细菌，它是一类重要的病原菌，广泛分布于海岸线区域、海水沉积物、鱼贝类等水产动物以及海产品中，能感染人类以及鱼类、对虾、甲壳类等多种水产动物，人食用受了该菌污染的食物后会引起腹泻、肠痉挛、恶心、呕吐、发热等典型胃肠炎反应，重症患者还会脱水、休克昏迷，甚至死亡。

副溶血弧菌发病呈世界性分布，尤其在沿海地区发病率较高，是进出口水产品检验的重要项目，在食品检测、食品中毒源调查、传染病源调查等工作中，也经常需要对该菌进行检测。

针对副溶血弧菌的检测方法主要是传统的培养及生化鉴定等方法操作繁琐，费时耗力，检测周期长需要5～7天，并且无法对不可培养状态下的副溶血弧菌进行检测，又影响了检测的准确性，而聚合酶链式反应法，即PCR法，具有特异、敏感等特点，针对目前食品卫生标准中大量的“不得检出”也有着很好的应用前景，但是，该类方法通常需要昂贵、精密的仪器设备，对实验环境和操作者技术要求也比较高；同时，由于PCR相关反应需要经过DNA的热变性、长时间的温度循环等等，耗时较长，从3小时到20小时不等，不利于食品中毒的现场快速诊断和处理，所以就目前情况来看，在实验室研究中应用较多，在食品卫生实际检验工作中由于相对要求较高，推广应用上有一定难度。

环介导等温扩增技术Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP是一种新颖的核酸扩增技术，它依赖于能够识别靶DNA上6个特定区域的4条引物和一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件下高效扩增核酸，具有高特异性、快速灵敏、高效、操作简便等特点，目前尚未见利用不耐热溶血毒素基因tlh通过环介导等温扩增法技术快速检测副溶血弧菌的报道。

[发明内容]

本发明的目的是克服现有技术的不足，利用针对副溶血弧菌tlh基因保守区的六个序列而设计的4条特异性引物，和Bst DNA聚合酶，以及四种核苷酸单体dNTP等成份，并采用环介导等温扩增技术，而提供的一种用于检测副溶血弧菌的方法。

为实现上述目的，设计一种用于检测副溶血弧菌的方法，包括DNA模板的制备、采用引物设计软件设计LAMP引物以及引物的合成、副溶血弧菌的环介导等温扩增、产物检测，其特征在于：

(1)DNA模板的制备：

a.取1.0mL细菌纯培养物，置于1.5mL离心管中，以12000转/分离心5分钟，弃上清液；

b.加入100μL无菌水，涡旋混匀，100℃水浴10分钟，立即冰浴2分钟；

c.12000转/分离心5分钟，取上清液备用，作为模板进行扩增；

(2)采用引物设计软件设计LAMP引物为采用primer primer5.0引物软件针对副溶血弧菌tlh基因M36437设计LAMP引物，设计的LAMP引物序列为：正向内引物FIP：

5’-GCCCATTCCCAATCGGTCG-TTTT-CTATGTTTCGCTGTTGGTATCG-3’；反向内引物BIP：

5’-GTTCTACACCAACACGTCGCA-TTTT-TCGCCAAATCTAATGTTGCTTC-3；正向外引物F3：

5’-CAGCACGCAAGAAAACCA-3’；反向外引物B3：

5’-ATTGTCAGCGGCGAAGAA-3’；

(3)采用副溶血弧菌的环介导等温扩增：

a.配置25uL反应体系，包括：100mM MgSO₄ 1.5uL、10mM dNTP2.5uL、5M betaine 4uL、20uM正向内引物FIP 1.5uL、20uM反向内引物BIP 1.5uL、10uM正向外引物F30.5uL、10uM反向外引物B30.5uL、8000U/mL Bst DNA聚合酶大片段1uL、10×ThermoPol buffer 2.5uL、DNA模板2uL、ddH₂O7.5uL；

b.混匀反应体系，于60℃温育60分钟；

c.80℃灭活10分钟；

(4)产物检测：肉眼观察反应体系的浊度变化或5000rpm离心反应体系10s后，观察反应管底部，若体系混浊或反应管底部出现白色沉淀，则待检细菌为副溶血弧菌，若否，则待检细菌不是副溶血弧菌。

所述的正向内引物FIP包括F1的互补序列F1c、TTTT连接子和F2。

所述的反向内引物BIP包括B1的互补序列B1c、TTTT连接子和B2。

F2的5’端与B2的5’端之间的碱基数为120-180bp；F2(B2)的5’端与F1(B1)的3’端之间的碱基数为40-60bp；F2(B2)与F3(B3)之间的碱基数＜20bp；F2、B2的Tm值为55℃-65℃，且F3(B3)Tm值＜F2(B2)Tm值＜F1(B1)Tm值；各引物GC％值为40-60％；F1c(B1c)的5’端、F2(B2)的3’端和F3(B3)的3’端的6个碱基的dG值＜-4kcal/mol；引物

3’端碱基按碱基互补配对原则配对。

本发明同现有技术相比，检测方法简便，耗时短，成本低廉，四条特异性引物保证了检测不同来源的副溶血弧菌菌株的可靠性，引物的检测灵敏度高，是简易的常规检测手段，尤其适用于基层检验检疫机构及养殖场，对于提高食品卫生水平、保证食品安全和推动食品国际贸易发展具有重要的意义。

[附图说明]

图1为本发明中副溶血弧菌标准菌株LAMP检测结果的电泳图。

图2为本发明中副溶血弧菌标准菌株LAMP检测结果的目测图。

图3是本发明中Mg²⁺浓度对LAMP反应的影响结果的电泳图。

图4是本发明中dNTPs浓度对LAMP反应的影响结果的电泳图。

图5是本发明中betaine浓度对LAMP反应的影响结果的电泳图。

图6是本发明中外引物与内引物的浓度比对LAMP反应的影响结果的电泳图。

图7是本发明中反应温度对LAMP反应的影响结果的电泳图。

图8是本发明中反应时间对LAMP反应的影响结果的电泳图。

图9是本发明中LAMP特异性试验结果的电泳图。

图10是本发明中LAMP检测副溶血弧菌基因组DNA的灵敏度试验结果的电泳图。

图11是本发明中LAMP检测副溶血弧菌纯培养物的灵敏度试验结果的电泳图。

图12是本发明中副溶血弧菌tlh基因M36437序列图。

图13是本发明中LAMP引物及靶DNA示意图。

指定图13为摘要附图。

参见附图1和附图2，1为副溶血弧菌标准菌株电泳结果；2为以水作为模板扩增后电泳结果。

参见附图3，M为100bp marker；1为阴性对照；2为2mM；3为4mM；4为6mM；5为8mM；6为10mM；7为12mM；8为14mM；9为16mM；10为18mM。

参见附图4，M为100bp marker；1为阴性对照；2为0mM；3为0.2mM；4为0.4mM；5为0.6mM；6为0.8mM；7为1.0mM；8为1.2mM；9为1.4mM；10为1.6mM；11为1.8mM。

参见附图5，M为100bp marker；1为阴性对照；2为0M；3为0.2M；4为0.4M；5为0.6M；6为0.8M；7为1.0M；8为1.2M。

参见附图6，M为100bp marker；1为阴性对照；2为1∶1；3为1∶2；4为1∶4；5为1∶6；6为1∶8。

参见附图7，M为100bp marker；1为阴性对照；2为53℃；3为55℃；4为58℃；5为60℃；6为63℃；7为65℃.

参见附图8，M为100bp marker；1为阴性对照；2、4、6分别为以副溶血弧菌1基因组DNA为模板反应30、45、60分钟的电泳结果；3、5、7分别为以副溶血弧菌2基因组DNA为模板反应30、45、60分钟的电泳结果。

参见附图9，M为100bp marker；1为阴性对照；2为副溶血弧菌1；3为副溶血弧菌2；4为副溶血弧菌3；5为坎普氏弧菌；6为河弧菌；7为哈维氏弧菌；8为金黄色葡萄球菌；9为沙门氏菌；10为英诺克李斯特菌；11为威尔氏李斯特菌；12为单增李斯特菌1；13为单增李斯特菌2.

参见附图10，M为100bp marker；1为阳性对照；2为90ng；3为9ng；4为900pg；5为90pg；6为9pg；7为900fg；8为90fg；9为9fg；10为0.9fg；11为阴性对照。

参见附图11，M为100bp marker；1为阳性对照；2为2.39×10⁶cfu/mL；3为2.39×10⁵cfu/mL；4为2.39×10⁴cfu/mL；5为2.39×10³cfu/mL；6为2.39×10²cfu/mL；7为2.39×10¹cfu/mL；8为2.39×10⁰cfu/mL；9为2.39×10^-1cfu/mL；10为阴性对照。

参见附图12，其中划线部分为副溶血弧菌tlh基因M36437中序列中用于引物设计的靶序列。

[具体实施方式]

下面对本发明作进一步的说明，本发明对本专业技术领域的人来说还是比较清楚的。

一、DNA模板的制备：

c.12000转/分离心5分钟，取上清液备用，作为模板进行扩增；

二、引物的设计：

根据GenBank公布的副溶血弧菌tlh基因——Accession number：M36437的保守序列，采用primer primer5.0引物软件设计一套特异性的LAMP引物，引物包括正向外引物F3、反向外引物B3，正向内引物FIP、反向内引物BIP，FIP引物包括F1的互补序列F1c、TTTT连接子和F2，BIP引物包括B1的互补序列B1c、TTTT连接子和B2。四条特异性引物序列如下：正向内引物FIP：

5’-GTTCTACACCAACACGTCGCA-TTTT-TCGCCAAATCTAATGTTGCTTC-3’；正向外引物F3：

5’-CAGCACGCAAGAAAACCA-3’；反向外引物B3：

5’-ATTGTCAGCGGCGAAGAA-3’；

三、采用副溶血弧菌的环介导等温扩增；

扩增前先进行反应体系的建立和优化，体系建立前的优化包括：Mg²⁺浓度的优化：选择Mg²⁺浓度为2mM～18mM进行LAMP反应，最后确定体系中Mg²⁺最佳浓度为8mM，参见附图3。

dNTPs浓度的优化：选择dNTPs浓度为0mM～1.8mM进行LAMP反应，最后选定1.0mM为体系中最佳dNTPs浓度，参见附图4。

betaine浓度的优化：选择betaine浓度范围0M～1.2M进行LAMP反应，最后选定0.8M为体系中最佳betaine浓度，参见附图5。

内外引物浓度比的优化：选择体系中外引物与内引物的浓度比1∶1-1∶8进行LAMP反应，最后确定1∶6为体系中外引物与内引物的最佳浓度比，参见附图6。

利用上述引物进行反应体系的建立，最后确定采用的副溶血弧菌环介导等温扩增反应体系为25μL体系，包括：100mM MgSO₄ 1.5uL、10mM dNTP2.5uL、5M betaine 4uL、20uM正向内引物FIP 1.5uL、20uM反向内引物BIP 1.5uL、10uM正向外引物F30.5uL、10uM反向外引物B3 0.5uL、8000U/mL Bst DNA聚合酶大片段1uL、10×ThermoPol buffer 2.5uL、DNA模板2uL、ddH₂O 7.5uL。

2、然后，反应条件的优化，具体如下：

反应温度的优化：采用优化的反应体系，选择反应温度53℃，55℃，58℃，60℃，63℃，65℃进行LAMP反应，最后确定60℃为最佳反应温度，参见附图7。

反应时间的优化：采用优化的反应体系，选择反应时间30、45、60分钟进行LAMP反应，经过多次实验综合评估，选定最佳反应时间为60min，参见附图8。

利用上述引物和优化的反应体系进行反应条件的优化，确定采用的环介导等温扩增反应条件为：60℃温育60min，80℃灭活10min。

3、最后，进行副溶血弧菌的环介导等温扩增：

利用本发明中的一套特异性LAMP引物，采用上述优化的反应体系和反应条件，对副溶血弧菌标准菌株进行环介导等温扩增，使用2.0％琼脂糖凝胶电泳以及目测法分析扩增结果。

四、产物检测：

上述采用环介导等温扩增后的副溶血弧菌标准菌株，肉眼观察反应管，发现副溶血弧菌标准菌株反应管中反应体系较反应前混浊，而阴性对照管未见混浊，5000rpm离心数秒，可见阳性管底部有少量白色沉淀，而阴性对照管未出现；电泳结果分析，发现副溶血弧菌标准菌株泳道产生阶梯状条带，以水作为模板的阴性对照未有条带出现，表明使用此套特异性引物能够有效地扩增副溶血弧菌tlh基因M36437，参见附图1、2。

五、特异性试验：

利用本发明中的一套特异性LAMP引物，采用优化的反应体系和反应条件，对3株副溶血弧菌、1株坎普氏弧菌、1株河弧菌、1株哈维氏弧菌、1株金黄色葡萄球菌、1株沙门氏菌、1株英诺克李斯特菌、1株威尔氏李斯特菌、2株单增李斯特菌进行环介导等温扩增，使用2.0％琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，发现，仅3株副溶血弧菌出现阶梯状扩增条带，其他9株非副溶血弧菌均未出现阶梯状条带，表明该套引物检测特异性强，参见附图9。

六、灵敏度试验：

采用基因组DNA检测灵敏度：测得基因组DNA检测灵敏度试验中DNA模板的原始浓度为449ng/μL，10倍倍比稀释DNA原液至10^-1～10^-9，各取2μL作为模板，则各反应体系中模板含量分别为90ng、9ng、900pg、90pg、9pg、900fg、90fg、9fg、0.9fg，进行环介导等温扩增，结果体系中含基因组DNA 90fg时仍出现阶梯状条带，因此该套引物副溶血弧菌基因组DNA检测灵敏度可达到90fg，参见附图10。

采用细菌纯培养物检测灵敏度：将过夜培养的副溶血弧菌菌液10倍倍比稀释至10^-1～10^-8，取各稀释度菌液100μL进行平板计数，测得原始菌液浓度为2.39×10⁷cfu/mL；同时，取各稀释度菌液1mL，制备模板DNA，各取2μL进行环介导等温扩增，结果当菌液浓度为2.39×10¹cfu/mL时仍出现阶梯状条带，因此该套引物细菌纯培养物检测灵敏度可达到24cfu/mL，参见附图11。

Claims

1.一种用于检测副溶血弧菌的方法，包括DNA模板的制备、采用引物设计软件设计LAMP引物以及引物的合成、副溶血弧菌的环介导等温扩增、产物检测，其特征在于：

(1)DNA模板的制备：

c.12000转/分离心5分钟，取上清液备用，作为模板进行扩增；

(2)采用引物设计软件设计LAMP引物为采用primer primer5.0引物软件针对副溶血弧菌tlh基因M36437设计LAMP引物，设计的LAMP引物序列为：

正向内引物FIP：

5’-GCCCATTCCCAATCGGTCG-TTTT-CTATGTTTCGCTGTTGGTATCG-3’；

反向内引物BIP：

5’-GTTCTACACCAACACGTCGCA-TTTT-TCGCCAAATCTAATGTTGCTTC-3；

正向外引物F3：

5’-CAGCACGCAAGAAAACCA-3’；

反向外引物B3：

5’-ATTGTCAGCGGCGAAGAA-3’；

(3)采用副溶血弧菌的环介导等温扩增：

a.配置25uL反应体系，包括：100mM的MgSO₄ 1.5uL、10mM的dNTP 2.5uL、5M的betaine 4uL、20uM的正向内引物FIP 1.5uL、20uM的反向内引物BIP 1.5uL、10uM的正向外引物F3 0.5uL、10uM的反向外引物B3 0.5uL、8000U/mL的Bst DNA聚合酶大片段1uL、10×ThermoPol buffer 2.5uL、DNA模板2uL、ddH₂O 7.5uL；

b.混匀反应体系，于60℃温育60分钟；

c.80℃灭活10分钟；

(4)产物检测：肉眼观察反应体系的浊度变化或5000 rpm离心反应体系10s后，观察反应管底部，若体系混浊或反应管底部出现白色沉淀，则待检细菌为副溶血弧菌，若否，则待检细菌不是副溶血弧菌。

2.如权利要求1所述的一种用于检测副溶血弧菌的方法，其特征在于：所述的正向内引物FIP包括F1的互补序列F1c、TTTT连接子和F2。

3.如权利要求1所述的一种用于检测副溶血弧菌的方法，其特征在于：所述的反向内引物BIP包括B1的互补序列B1c、TTTT连接子和B2。

4.如权利要求2或3所述的一种用于检测副溶血弧菌的方法，其特征在于：F2的5’端与B2的5’端之间的碱基数为120-180bp；F2(B2)的5’端与F1(B1)的3’端之间的碱基数为40-60bp；F2(B2)与F3(B3)之间的碱基数＜20 bp；F2、B2的Tm值为55℃-65℃，且F3(B3)Tm值＜F2(B2)Tm值＜F1(B1)Tm值；各引物GC％值为40-60％；F1c(B1c)的5’端、F2(B2)的3’端和F3(B3)的3’端的6个碱基的dG值＜-4kcal/mol；引物3’端碱基按碱基互补配对原则配对。