CN107177678A - 一种选择性检测海水中活的副溶血性弧菌的方法 - Google Patents
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Abstract
一种选择性检测海水中活的副溶血性弧菌的方法，属于微生物检测领域，它的步骤包括膜过滤采集总菌、叠氮化钠处理采集到的总菌和环介导等温基因扩增测定；所述活的副溶血性弧菌包括可培养状态和非可培养状态。本发明采用价格低廉、易于获得的叠氮化钠预处理死菌中的DNA和胞外DNA，使它们失去扩增活性，进而通过基因扩增实现选择性检测活的副溶血性弧菌；操作过程中无需特定光源设备和其它贵重仪器，操作简易，成本低。
Description
技术领域
本发明属于微生物检测领域，具体涉及一种选择性检测海水中活的副溶血性弧菌(包括可培养状态和非可培养状态)的方法。
背景技术
副溶血性弧菌为革兰氏阴性菌，具有嗜盐、耐热特征，主要存在于海洋、河口环境及鱼、虾、贝等生物体中，是沿海地区主要食源性病原菌之一。从人类健康安全的角度出发，对水产品污染的可能性进行准确判断异常重要。到目前为止，多种分析检测方法得到了研究与应用，比如传统的培养法、免疫法，以及基于遗传物质信息的分子生物学方法——生物传感器法、聚合酶链式反应(PCR)法、环介导等温基因扩增法等，近年来都得到了迅猛的发展。特别是基于环介导等温基因扩增的各种方法(Yamazaki W,Yuko K,RyokoU,etal.Evaluation of a loop-mediated isothermal amplification assay for rapid andsimpledetection of Vibrio parahaemolyticus in naturally contaminated seafoodsamples.Food Microbiology,2011,28,1238；Zeng J,Wei H,Zhang L,et al.Rapiddetection of Vibrio parahaemolyticus in raw oysters using immunomagneticseparation combined with loop-mediated isothermal amplification.InternationalJournal of Food Microbiology,2014,174,123；Wang Y,Li DX,Wang Y,et al.Rapid andsensitive detection of Vibrio parahaemolyticus and Vibrio vulnificus bymultiple endonuclease restriction real-time loop-mediated isothermalamplification technique.Molecules,2016,21,111；Wang R,Xiao XN,Chen Y,et al.Aloop-mediated,isothermal amplification-basedmethod for visual detection ofVibrio parahaemolyticus within only 1h,from shrimp sampling toresults.Analytical Methods,2017,9,1695)，较之于PCR法具有更高的灵敏度(最低可以检测出1个拷贝的基因)和特异性，而且生化反应对模板溶液中的血浆、细胞残渣等干扰物质耐受能力强(Zhang X,Lowe SB,Gooding JJ.Brief review of monitoring methodsfor loop-mediated isothermalamplification(LAMP).Biosensor&Bioelectronics,2014,61,491)，是近期研究热点之一。然而，大多基于环介导等温基因扩增的检测方法，只能用于诊断被检测样品中是否存在目标微生物标识基因，不能有效确定该基因是否来自于活性(包括可培养状态和非可培养状态)副溶血性弧菌。
近来，已有文献报道采用叠氮溴化丙锭和环介导等温基因扩增法相结合选择性检测活的微生物(Chen S，Wang F，Beaulieu JC，et al.Rapid detection of viablesalmonellae in produce by coupling propidiummonoazide with loop-mediatedisothermal amplification.Applied&Environmental Microbiology,2011,77,4008；AhmadF,StedtfeldRD,Waseem H,et al.Most probable number-loop mediatedisothermal amplification(MPN-LAMP)for quantifying waterborne pathogens in<25min.Journal of Microbiological Methods,2017,132,27)，但过程中需要特定的连续光谱光源照射处理，操作繁琐；而且叠氮溴化丙锭价格昂贵。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种选择性检测海水中活的副溶血性弧菌(包括可培养状态和非可培养状态)的方法，所述方法工作原理为：自然光条件下，叠氮化钠上的叠氮基团生成高反应性的氮宾基，遇到双链DNA时，极易与碳氢化合物部分结合生成稳定牢固的共价氮碳键，从而形成稳定的DNA修饰，使DNA失去扩增性能。此外，由于叠氮化钠完全不能通透细胞膜，它只能选择性的修饰死细胞“暴露”的DNA(包括胞外DNA)。因此，采用叠氮化钠处理可以选择性保留活的副溶血性弧菌(包括可培养状态和非可培养状态)中的DNA，然后通过环介导等温基因扩增，即可选择性检测出活的副溶血性弧菌。
本发明是通过以下步骤来实现：
一种选择性检测海水中活的副溶血性弧菌的方法，步骤包括膜过滤采集总菌、叠氮化钠处理采集到的总菌和环介导等温基因扩增测定；所述活的副溶血性弧菌包括可培养状态和非可培养状态。
进一步，所述的膜过滤采集总菌的步骤，指原位收集待测定海水；采用孔径为0.45μm的水系微孔滤膜过滤采集海水中总菌。
进一步，所述的叠氮化钠处理采集到的总菌的步骤，指首先采用细胞释放溶液将微孔滤膜上的总菌洗脱到容器里，加入叠氮化钠溶液，自然光条件下反应20min，获得总菌悬浮液。
进一步，所述的环介导等温基因扩增测定的步骤，指以叠氮化钠处理过的总菌悬浮液为生化扩增反应模板，然后加入包括引物、酶在内的扩增反应试剂和指示剂，封闭反应管，放入61-65℃下反应；同时做阳性和阴性对照，指示剂颜色变化指示环介导等温基因扩增结果。
进一步，所述的指示剂为GeneFinder核酸染料；
进一步，所述的各步骤，均采用无菌的洁净器具。
本发明还提供具体的一种选择性检测海水中活的副溶血性弧菌的方法，步骤如下：
1)清洗、灭菌所有需要的器具，使用前密封保存；
2)用60mL一次性无菌注射器抽取海水样品50mL，然后装上直径13mm、孔径0.45μm水系微孔滤器，缓慢推出海水；
3)从滤器中取出滤膜放入5mL离心管，加入1mL细胞释放溶液，手动震荡1min，将滤膜上所得总菌洗脱到离心管内溶液中；
4)向上述离心管溶液中加入10μL10mmol/L叠氮化钠，摇匀，自然光下反应20min，获得总菌悬浮液；
5)向0.2mL薄壁PCR管中加入环介导等温基因扩增试剂，制得生化反应混合液；25μL的反应体系包括各1.6μmol/L的引物FIP和BIP，各0.8μmol/L的引物LF和LB，各0.2μmol/L的引物F3和B3，1.4mmol/L的dNTPs，6.0mmol/L的MgSO4和1×缓冲液；其中引物针对副溶血性弧菌的tlh基因，序列分别为(5’-3’)：
F3：AGC TAC TCG AAA GAT GAT CC；
B3：GGT TGT ATG AGA AGC GAT TG；
FIP：ATGTTTTTA AATGAA ACGGAGCTCCGGCAAAAA ACG AAG ATG GT；
BIP：ACG TCG CAA AAC GTT ATC CGG CGA AGA ACG TAA TGT CTG；
LF：ACC AGT AGC CGT CAA TG；
LB：TTA GAT TTG GCG AAC GAG A；
6)取5μL总菌悬浮液加入上述生化反应混合液中，不盖PCR管盖子，轻微振动混匀；随后将反应管放入高于95℃的水中10min，取出后冷却至室温；
7)向PCR管内溶液中加入1μLBst2.0DNA聚合酶，不盖PCR管盖子，轻微振动混匀；
8)向PCR管盖子内部均匀涂上1μL GeneFinder核酸染料，然后盖上盖子，并将PCR管置于64℃水浴中反应60min；
9)取出PCR管，上下颠倒几次或者剧烈震荡，使GeneFinder核酸染料混入环介导等温基因扩增生化反应液；
10)结果判断：自然光条件下，PCR管中反应后混合液如果显示橙色，表明待测海水中不含副溶血性弧菌；显示绿色，表明待测海水中含有活的副溶血性弧菌。
本发明与现有技术对比的有益效果：
(1)本发明采用价格低廉、易于获得的叠氮化钠预处理死菌中的DNA和胞外DNA，使它们失去扩增活性，进而通过基因扩增实现选择性检测活的副溶血性弧菌。
(2)操作过程中无需特定光源设备和其它贵重仪器，操作简易，成本低。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明的内容作进一步的解释，并通过与传统方法对比诠释本发明的优点。但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。
实施例1选择性检测浴场海水中活的副溶血性弧菌
步骤一、清洗、灭菌所有需要的器具，使用前密封保存。
步骤二、用60mL一次性无菌注射器抽取海水样品50mL，然后装上直径13mm的水系微孔滤器(天津津腾，孔径0.45μm)，缓慢推出海水。
步骤三、从滤器中取出滤膜放入5mL离心管，加入1mL细胞释放溶液(深圳市安必胜科技有限公司产品)，手动震荡1min，将滤膜上所得总菌洗脱到离心管内溶液中。
步骤四、向上述离心管溶液中加入10μL叠氮化钠(10mmol/L)，摇匀，自然光下反应20min，获得总菌悬浮液。
步骤五、向0.2mL薄壁PCR管中加入环介导等温基因扩增试剂，制得生化反应混合液。25μL的反应体系包括各1.6μmol/L的引物FIP和BIP，各0.8μmol/L的引物LF和LB，各0.2μmol/L的引物F3和B3，1.4mmol/L的dNTPs，6.0mmol/L的MgSO4和1×缓冲液。其中引物针对副溶血性弧菌的tlh基因，序列分别为(5’-3’)：
F3：AGC TAC TCG AAA GAT GAT CC；
B3：GGT TGT ATG AGA AGC GAT TG；
FIP：ATGTTTTTA AATGAA ACGGAGCTCCGGCAAAAA ACG AAG ATG GT；
BIP：ACG TCG CAA AAC GTT ATC CGG CGA AGA ACG TAA TGT CTG；
LF：ACC AGT AGC CGT CAA TG；
LB：TTA GAT TTG GCG AAC GAG A。
步骤六、取5μL总菌悬浮液加入上述生化反应混合液中，不盖PCR管盖子，轻微振动混匀。随后将反应管放入高于95℃的水中10min。取出后冷却至室温。
步骤七、向PCR管内溶液中加入1μLBst2.0DNA聚合酶(美国NEB公司产品)，不盖PCR管盖子，轻微振动混匀。
步骤八、向PCR管盖子内部均匀涂上1μL GeneFinder核酸染料(厦门百维信公司产品)，然后盖上盖子，并将PCR管置于64℃水浴中反应60min。
步骤九、取出PCR管，上下颠倒几次或者剧烈震荡，使GeneFinder核酸染料混入环介导等温基因扩增生化反应液。
步骤十、结果判断：自然光条件下，PCR管中反应后混合液如果显示橙色，表明待测海水中不含副溶血性弧菌；显示绿色，表明待测海水中含有活的(包括可培养状态和非可培养状态)副溶血性弧菌。
注：实验需同时做阳性对照和阴性对照至少各2个用来确保反应系统正常。
实施例2
现有技术中，与实施例1的区别仅是在步骤四向所述离心管溶液中加入同摩尔量叠氮溴化丙锭(该试剂价格是叠氮化钠的20余倍)，然后放入配备有连续光谱光源或者LED(波长范围465-475nm)光源的专用设备(例如PMA-LiteTMLED Photolysis Device)中照射处理20min。比较可知，本发明具有成本低廉、操作简便和无需特殊专用器材三个明显优势。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国水产科学研究院黄海水产研究所
<120> 一种选择性检测海水中活的副溶血性弧菌的方法
<130> 无
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
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<223> 引物LB
<400> 6
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Claims (7)
1.一种选择性检测海水中活的副溶血性弧菌的方法，其特征在于它的步骤包括膜过滤采集总菌、叠氮化钠处理采集到的总菌和环介导等温基因扩增测定；所述活的副溶血性弧菌包括可培养状态和非可培养状态。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的膜过滤采集总菌的步骤，指原位收集待测定海水；采用孔径为0.45μm的水系微孔滤膜过滤采集海水中总菌。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的叠氮化钠处理采集到的总菌的步骤，指首先采用细胞释放溶液将微孔滤膜上的总菌洗脱到容器里，加入叠氮化钠溶液，自然光条件下反应20min，获得总菌悬浮液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的环介导等温基因扩增测定的步骤，指以叠氮化钠处理过的总菌悬浮液为生化扩增反应模板，然后加入包括引物、酶在内的扩增反应试剂和指示剂，封闭反应管，放入61-65℃下反应；同时做阳性和阴性对照，指示剂颜色变化指示环介导等温基因扩增结果。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的指示剂为GeneFinder核酸染料。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的各步骤，均采用无菌的洁净器具。
7.根据权利要求1所述的一种选择性检测海水中活的副溶血性弧菌的方法，其特征在于它的具体步骤如下：
1)清洗、灭菌所有需要的器具，使用前密封保存；
2)用60mL一次性无菌注射器抽取海水样品50mL，然后装上直径13mm、孔径0.45μm水系微孔滤器，缓慢推出海水；
3)从滤器中取出滤膜放入5mL离心管，加入1mL细胞释放溶液，手动震荡1min，将滤膜上所得总菌洗脱到离心管内溶液中；
4)向上述离心管溶液中加入10μL10mmol/L叠氮化钠，摇匀，自然光下反应20min，获得总菌悬浮液；
5)向0.2mL薄壁PCR管中加入环介导等温基因扩增试剂，制得生化反应混合液；25μL的反应体系包括各1.6μmol/L的引物FIP和BIP，各0.8μmol/L的引物LF和LB，各0.2μmol/L的引物F3和B3，1.4mmol/L的dNTPs，6.0mmol/L的MgSO4和1×缓冲液；其中引物针对副溶血性弧菌的tlh基因，序列分别为(5’-3’)：
F3：AGC TAC TCG AAA GAT GAT CC；
B3：GGT TGT ATG AGA AGC GAT TG；
FIP：ATGTTTTTA AATGAA ACGGAGCTCCGGCAAAAA ACG AAG ATG GT；
BIP：ACG TCG CAA AAC GTT ATC CGG CGA AGA ACG TAA TGT CTG；
LF：ACC AGT AGC CGT CAA TG；
LB：TTA GAT TTG GCG AAC GAG A；
6)取5μL模板溶液加入上述生化反应混合液中，不盖PCR管盖子，轻微振动混匀；随后将反应管放入高于95℃的水中10min，取出后冷却至室温；
7)向PCR管内溶液中加入1μL Bst2.0DNA聚合酶，不盖PCR管盖子，轻微振动混匀；
8)向PCR管盖子内部均匀涂上1μL GeneFinder核酸染料，然后盖上盖子，并将PCR管置于64℃水浴中反应60min；
9)取出PCR管，上下颠倒几次或者剧烈震荡，使GeneFinder核酸染料混入环介导等温基因扩增生化反应液；
10)结果判断：自然光条件下，PCR管中反应后混合液如果显示橙色，表明待测海水中不含副溶血性弧菌；显示绿色，表明待测海水中含有活的副溶血性弧菌。
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