CN114787371A - 用于人类β肌动蛋白的扩增及检测的多核苷酸 - Google Patents
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Abstract
本文公开了涉及经由核酸扩增测试(NAAT)来检测β肌动蛋白[Homo sapiens(智人)(人类)]，例如扩增并确定测试样品中β‑肌动蛋白的存在的引物和探针。具体地，本公开内容描述了用于经由环介导等温扩增(LAMP)和分子信标杂交的检测的与β肌动蛋白基因结合的引物和探针。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年12月2日提交的美国临时申请第16/700,824号的权益，该美国临时申请的公开内容通过引用以其整体并入本文。
序列表
本申请包含序列表，所述序列表已经以ASCII格式电子地提交并且在此通过引用以其整体并入。创建于2020年12月1日的所述ASCII副本被命名为TSM-047WO_SL.txt，并且大小为42,596字节。
发明领域
本发明涉及分子生物学和核酸化学领域。本发明提供了用于检测哺乳动物特别是人类的β肌动蛋白基因的方法和试剂，并且还涉及医学诊断和预后领域。特别地，本发明涉及用于扩增和检测β肌动蛋白(beta actin)(以下称“β-肌动蛋白(β-actin)”)的多核苷酸和方法。
背景
不管细胞在组织或生物体中的具体作用如何，维持细胞存在所必需的基础细胞功能都需要管家基因。因此，无论组织类型、发育阶段、细胞周期状态或外部信号如何，这样的基因都被预期在正常和病理生理条件下的生物体的所有细胞中表达。由于这些基因代表了维持生命必需的基因的最小的组，它们可以为通过经常使用它们作为对照来进行实验研究和分子测试的研究人员和专业人员提供价值。对照与感兴趣的靶分析物被平行评估以建立对所获得的最终结果的置信因子。当对照的预期存在被确定时，实验或测定的一个或更多个方面被确认是正确地发挥功能的。然而，当不存在对照的预期存在时，所讨论的最终结果不符合性能标准并指示错误。
在一个具体的实例中，用于分子诊断测试的核酸扩增测试(NAAT)需要使用与一个或更多个感兴趣的靶分析物平行进行测试和检测的一个或更多个对照。本文公开的实施方案提供了涉及使用环介导等温扩增检测编码β-肌动蛋白的管家基因的引物和探针。
发明概述
在一些实施方案中，本发明包括一种组合物，所述组合物包含选自由组1至组29组成的组的多核苷酸的组。在一些实施方案中，组合物还包含探针。在一些实施方案，探针包含标记物。在一些实施方案中，探针是经标记的多核苷酸。在优选的实施方式中，标记物是荧光团，所述荧光团优选地共价地附接至多核苷酸的末端。在特别优选的实施方案中，探针或多核苷酸是包含荧光团、猝灭剂和多核苷酸的分子信标。在一种实施方案中，荧光团是FAM并且猝灭剂是BHQ1。在替代的实施方式中，荧光团是ATTO 565或Alexa 594，并且猝灭剂是BHQ1或BHQ2。
在一些实施方式中，组合物包含经标记的多核苷酸，所述经标记的多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:135的核苷酸6-33、SEQ ID NO:136的核苷酸6-30、SEQ ID NO:137的核苷酸7-27、SEQ ID NO:138的核苷酸7-26、SEQ ID NO:139的核苷酸1-26、SEQ ID NO:140的核苷酸7-26、SEQ ID NO:141的核苷酸7-30、SEQ ID NO:142的核苷酸6-30、SEQ ID NO:143的核苷酸8-32、SEQ ID NO:144的核苷酸8-30、SEQ ID NO:145的核苷酸6-31、SEQ ID NO:146的核苷酸8-30、SEQ ID NO:147的8-22、SEQ ID NO:148的核苷酸8-24、SEQ ID NO:149的核苷酸7-27、SEQ ID NO:150的核苷酸8-21、SEQ ID NO:151的核苷酸8-32、SEQ ID NO:152的核苷酸1-24、SEQ ID NO:153的核苷酸4-24、SEQ ID NO:154的核苷酸1-23、SEQ ID NO:155的核苷酸8-26、SEQ ID NO:156的核苷酸7-29、SEQ ID NO:157的核苷酸8-28、SEQ ID NO:158的核苷酸8-29、SEQ ID NO:159的核苷酸7-25、SEQ ID NO:160的核苷酸8-22、SEQ ID NO:161的核苷酸6-22、SEQ ID NO:162的核苷酸3-22、SEQ ID NO:163的核苷酸8-28、SEQ ID NO:164的核苷酸3-28、SEQ ID NO:165的核苷酸5-25、SEQ ID NO:166的核苷酸5-26、SEQ ID NO:167的核苷酸5-20、SEQ ID NO:168的核苷酸4-22、SEQ IDNO:169的核苷酸7-22、SEQ ID NO:170的核苷酸3-22、SEQ ID NO:171的核苷酸7-28、SEQ IDNO:172的核苷酸6-27、SEQ ID NO:173的核苷酸7-29、SEQ ID NO:174的核苷酸5-27、SEQ IDNO:175的核苷酸7-29、SEQ ID NO:176的核苷酸6-28、SEQ ID NO:177的核苷酸4-23、SEQ IDNO:178的核苷酸4-34、SEQ ID NO:179的核苷酸3-27、SEQ ID NO:180的核苷酸2-27、SEQ IDNO:181的核苷酸5-33、SEQ ID NO:182的核苷酸3-30、SEQ ID NO:183的核苷酸9-34和SEQID NO:184的核苷酸8-28。在另外的实施方式中，经标记的多核苷酸可以包含选自由SEQ IDNO:135至SEQ ID NO:184组成的组的序列。在某些实施方式中，经标记的多核苷酸的序列选自由SEQ ID NO:135至SEQ ID NO:184组成的组。
在一些实施方案中，多核苷酸的组选自由组9-组12、组17和组22-组29组成的组，并且组合物包含经标记的多核苷酸，所述经标记的多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:147的核苷酸8-22、SEQ ID NO:148的核苷酸8-24、SEQ ID NO:149的核苷酸7-27、SEQ ID NO:150的核苷酸8-21、SEQ ID NO:155的核苷酸8-26、SEQ ID NO:156的核苷酸7-29、SEQ ID NO:165的核苷酸5-25、SEQ ID NO:166的核苷酸5-26、SEQ ID NO:167的核苷酸5-20、SEQ ID NO:168的核苷酸4-22、SEQ ID NO:169的核苷酸7-22、SEQ ID NO:171的核苷酸7-28、SEQ ID NO:172的核苷酸6-27、SEQ ID NO:173的核苷酸7-29、SEQ ID NO:174的核苷酸5-27、SEQ ID NO:175的核苷酸7-29、SEQ ID NO:176的核苷酸6-28、SEQ ID NO:183的核苷酸9-34和SEQ ID NO:184的核苷酸8-28。在一些实施方式中，经标记的多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:149、SEQ IDNO:150、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:173、SEQ IDNO:174、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:183和SEQ ID NO:184。在一些实施方式中，经标记的多核苷酸的序列是SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:149、SEQ IDNO:150、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:173、SEQ IDNO:174、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:183和SEQ ID NO:184。在优选的实施方式中，经标记的多核苷酸的序列是SEQ ID NO:184，并且多核苷酸的组是组29。
在又另一种实施方案中，多核苷酸的组选自由组9-组11、组17和组23-组29组成的组，并且组合物包含经标记的多核苷酸，所述经标记的多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:152的核苷酸1-24、SEQ ID NO:153的核苷酸4-24和SEQ ID NO:154的核苷酸1-23组成的组的序列。更特别地，经标记的多核苷酸可以包含选自由SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:153和SEQ IDNO:154组成的组的序列。在某些实施方式中，经标记的多核苷酸的序列选自SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:153和SEQ ID NO:154的组。
在一种实施方式中，多核苷酸的组选自由组4、组9-组12、组17和组22-组26组成的组，并且组合物包含经标记的多核苷酸，所述经标记的多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:144的核苷酸8-30、SEQ ID NO:145的核苷酸6-31和SEQ ID NO:146的核苷酸8-30组成的组的序列。在某些实施方式中，经标记的多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145和SEQ ID NO:146组成的组的序列。在一些实施方案中，经标记的多核苷酸的序列选自SEQ IDNO:144、SEQ ID NO:145和SEQ ID NO:146的组。
在另一种实施方式中，多核苷酸的组选自由组5、组12、组17和组22-组25组成的组，并且组合物包含经标记的多核苷酸，所述经标记的多核苷酸包含SEQ ID NO:170的核苷酸3-22。在一些实施方式中，经标记的多核苷酸包含SEQ ID NO:170。在其他实施方案中，经标记的多核苷酸的序列是SEQ ID NO:170。
在一种实施方案中，多核苷酸的组选自由组6-组8、组15和组16组成的组，并且组合物包含经标记的多核苷酸，所述经标记的多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:180的核苷酸2-27和SEQ ID NO:182的核苷酸3-30组成的组的序列。在一些实施方式中，经标记的多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:180和SEQ ID NO:182组成的组的序列。在其他实施方案中，经标记的多核苷酸的序列是SEQ ID NO:180或SEQ ID NO:182。
在又另一种实施方案中，多核苷酸的组选自由组6-组11、组28和组29组成的组，并且组合物包含经标记的多核苷酸，所述经标记的多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:178的核苷酸4-34和SEQ ID NO:181的核苷酸5-33组成的组的序列。在一些实施方案中，经标记的多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:178和SEQ ID NO:181组成的组的序列。在其他实施方案中，经标记的多核苷酸的序列是SEQ ID NO:178或SEQ ID NO:181。
在某些实施方式中，多核苷酸的组选自由组6-组9和组11组成的组，并且组合物包含经标记的多核苷酸，所述经标记的多核苷酸包含SEQ ID NO:179的核苷酸3-27。在其他实施方式中，经标记的多核苷酸包含SEQ ID NO:179。在又另一种实施方式中，经标记的多核苷酸的序列是SEQ ID NO:179。
在一种实施方案中，多核苷酸的组选自由组6-组9、组11和组28组成的组，并且组合物包含经标记的多核苷酸，所述经标记的多核苷酸包含SEQ ID NO:177的核苷酸4-23。在一些实施方案中，经标记的多核苷酸包含SEQ ID NO:177。在其他实施方案中，经标记的多核苷酸的序列是SEQ ID NO:177。
在一种实施方式中，多核苷酸的组选自由组13-组15组成的组，并且组合物包含经标记的多核苷酸，所述经标记的多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:159的核苷酸7-25和SEQID NO:160的核苷酸8-22组成的组的序列。在另一种实施方式中，经标记的多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:159和SEQ ID NO:160组成的组的序列。在其他实施方式中，经标记的多核苷酸的序列是SEQ ID NO:159或SEQ ID NO:160。
在一种实施方案中，多核苷酸的组选自由组13-组16组成的组，并且组合物包含经标记的多核苷酸，所述经标记的多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:157的核苷酸8-28、SEQ IDNO:158的核苷酸8-29、SEQ ID NO:161的核苷酸6-22和SEQ ID NO:162的核苷酸3-22组成的组的序列。在这样的实施方案中，经标记的多核苷酸可以包含选自由SEQ ID NO:157、SEQID NO:158、SEQ ID NO:161和SEQ ID NO:162组成的组的序列。在又另一种实施方案中，经标记的多核苷酸的序列选自由SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:161和SEQ ID NO:162组成的组。
在另一种实施方式中，多核苷酸的组是组3，并且组合物包含经标记的多核苷酸，所述经标记的多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:137的核苷酸7-27、SEQ ID NO:138的核苷酸7-26、SEQ ID NO:139的核苷酸1-26、SEQ ID NO:140的核苷酸7-26、SEQ ID NO:141的核苷酸7-30、SEQ ID NO:142的核苷酸6-30、SEQ ID NO:151的核苷酸8-32和SEQ ID NO:153的核苷酸4-24。在某些实施方式中，经标记的多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:151和SEQ ID NO:153。在另外的实施方式中，经标记的多核苷酸的序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:151和SEQ ID NO:153。
在一些实施方案中，多核苷酸的组选自由组1、组2和组18-组0组成的组，并且组合物包含经标记的多核苷酸，所述经标记的多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:163的核苷酸8-28和SEQ ID NO:164的核苷酸3-28组成的组的序列。在一些实施方式中，经标记的多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:163和SEQ ID NO:164组成的组的序列。在其他实施方案中，经标记的多核苷酸的序列是SEQ ID NO:163或SEQ ID NO:164。
在又另一种实施方式中，多核苷酸的组选自由组1、组2和组18-组21组成的组，并且组合物包含经标记的多核苷酸，所述经标记的多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:135的核苷酸6-33和SEQ ID NO:136的核苷酸6-30组成的组的序列。在一些实施方案中，经标记的多核苷酸包含来自由SEQ ID NO:135和SEQ ID NO:136组成的组的序列。在其他实施方案中，经标记的多核苷酸的序列是SEQ ID NO:135或SEQ ID NO:136。
本发明的另一方面提供了分子信标，所述分子信标包含荧光团、猝灭剂和多核苷酸，其中所述多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:135的核苷酸6-33、SEQID NO:136的核苷酸6-30、SEQ ID NO:137的核苷酸7-27、SEQ ID NO:138的核苷酸7-26、SEQID NO:139的核苷酸1-26、SEQ ID NO:140的核苷酸7-26、SEQ ID NO:141的核苷酸7-30、SEQID NO:142的核苷酸6-30、SEQ ID NO:143的核苷酸8-32、SEQ ID NO:144的核苷酸8-30、SEQID NO:145的核苷酸6-31、SEQ ID NO:146的核苷酸8-30、SEQ ID NO:147的8-22、SEQ IDNO:148的核苷酸8-24、SEQ ID NO:149的核苷酸7-27、SEQ ID NO:150的核苷酸8-21、SEQ IDNO:151的核苷酸8-32、SEQ ID NO:152的核苷酸1-24、SEQ ID NO:153的核苷酸4-24、SEQ IDNO:154的核苷酸1-23、SEQ ID NO:155的核苷酸8-26、SEQ ID NO:156的核苷酸7-29、SEQ IDNO:157的核苷酸8-28、SEQ ID NO:158的核苷酸8-29、SEQ ID NO:159的核苷酸7-25、SEQ IDNO:160的核苷酸8-22、SEQ ID NO:161的核苷酸6-22、SEQ ID NO:162的核苷酸3-22、SEQ IDNO:163的核苷酸8-28、SEQ ID NO:164的核苷酸3-28、SEQ ID NO:165的核苷酸5-25、SEQ IDNO:166的核苷酸5-26、SEQ ID NO:167的核苷酸5-20、SEQ ID NO:168的核苷酸4-22、SEQ IDNO:169的核苷酸7-22、SEQ ID NO:170的核苷酸3-22、SEQ ID NO:171的核苷酸7-28、SEQ IDNO:172的核苷酸6-27、SEQ ID NO:173的核苷酸7-29、SEQ ID NO:174的核苷酸5-27、SEQ IDNO:175的核苷酸7-29、SEQ ID NO:176的核苷酸6-28、SEQ ID NO:177的核苷酸4-23、SEQ IDNO:178的核苷酸4-34、SEQ ID NO:179的核苷酸3-27、SEQ ID NO:180的核苷酸2-27、SEQ IDNO:181的核苷酸5-33、SEQ ID NO:182的核苷酸3-30、SEQ ID NO:183的核苷酸9-34和SEQID NO:184的核苷酸8-28。
本发明的又另一方面提供了检测测试样品中β-肌动蛋白的方法，所述方法包括(a)从测试样品提取核酸，(b)通过使步骤(a)中提取的核酸与包含链置换DNA聚合酶和序列特异性引物组的反应混合物反应来扩增靶序列，其中所述序列特异性引物组选自由组1至组29组成的组，和(c)检测步骤(b)的扩增的产物的存在或不存在；其中所述扩增产物的存在指示测试样品中β-肌动蛋白的存在。在一种实施方案中，步骤(b)中靶序列的扩增在约60℃和约67℃之间进行少于30分钟。优选地，扩增步骤进行少于15分钟。在一些实施方式中，反应混合物还包含逆转录酶。
在某些实施方案中，检测扩增产物的存在或不存在包括使扩增的产物与包含附接至标记物的多核苷酸的探针杂交。在优选的实施方式中，标记物是荧光团，所述荧光团优选地附接至多核苷酸的末端。在特别优选的实施方案中，探针或多核苷酸是包含荧光团、猝灭剂和多核苷酸的分子信标。在一种实施方案中，荧光团是FAM并且猝灭剂是BHQ1。在替代的实施方式中，荧光团是ATTO 565或Alexa 594，并且猝灭剂是BHQ1或BHQ2。
本发明的又另一方面提供了试剂盒，所述试剂盒包含含有选自由组1至组29组成的组的多核苷酸的组的组合物。在一些实施方案中，试剂盒还包含链置换聚合酶，和任选地逆转录酶。在某些实施方案中，试剂盒包含分子信标，所述分子信标包含荧光团、猝灭剂和多核苷酸，其中所述多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:135的核苷酸6-33、SEQ ID NO:136的核苷酸6-30、SEQ ID NO:137的核苷酸7-27、SEQ ID NO:138的核苷酸7-26、SEQ ID NO:139的核苷酸1-26、SEQ ID NO:140的核苷酸7-26、SEQ ID NO:141的核苷酸7-30、SEQ ID NO:142的核苷酸6-30、SEQ ID NO:143的核苷酸8-32、SEQ ID NO:144的核苷酸8-30、SEQ ID NO:145的核苷酸6-31、SEQ ID NO:146的核苷酸8-30、SEQ ID NO:147的8-22、SEQ ID NO:148的核苷酸8-24、SEQ ID NO:149的核苷酸7-27、SEQ ID NO:150的核苷酸8-21、SEQ ID NO:151的核苷酸8-32、SEQ ID NO:152的核苷酸1-24、SEQ ID NO:153的核苷酸4-24、SEQ ID NO:154的核苷酸1-23、SEQ ID NO:155的核苷酸8-26、SEQ ID NO:156的核苷酸7-29、SEQ ID NO:157的核苷酸8-28、SEQ ID NO:158的核苷酸8-29、SEQ ID NO:159的核苷酸7-25、SEQ ID NO:160的核苷酸8-22、SEQ ID NO:161的核苷酸6-22、SEQ ID NO:162的核苷酸3-22、SEQ ID NO:163的核苷酸8-28、SEQ ID NO:164的核苷酸3-28、SEQ IDNO:165的核苷酸5-25、SEQ ID NO:166的核苷酸5-26、SEQ ID NO:167的核苷酸5-20、SEQ IDNO:168的核苷酸4-22、SEQ ID NO:169的核苷酸7-22、SEQ ID NO:170的核苷酸3-22、SEQ IDNO:171的核苷酸7-28、SEQ ID NO:172的核苷酸6-27、SEQ ID NO:173的核苷酸7-29、SEQ IDNO:174的核苷酸5-27、SEQ ID NO:175的核苷酸7-29、SEQ ID NO:176的核苷酸6-28、SEQ IDNO:177的核苷酸4-23、SEQ ID NO:178的核苷酸4-34、SEQ ID NO:179的核苷酸3-27、SEQ IDNO:180的核苷酸2-27、SEQ ID NO:181的核苷酸5-33、SEQ ID NO:182的核苷酸3-30、SEQ IDNO:183的核苷酸9-34和SEQ ID NO:184的核苷酸8-28。分子信标的多核苷酸序列可以包含选自由SEQ ID NO:135至SEQ ID NO:184组成的组的序列。在一些实施方案中，分子信标的多核苷酸序列由选自由SEQ ID NO:135至SEQ ID NO:184组成的组的序列组成。在一种实施方案中，分子信标的多核苷酸序列由SEQ ID NO:184组成，并且多核苷酸的组是组29。
本发明的另一方面提供了检测测试样品中β-肌动蛋白的方法，所述方法包括(a)从测试样品提取核酸，(b)通过使步骤(a)中提取的核酸与包含链置换DNA聚合酶和序列特异性LAMP引物组的反应混合物反应少于10分钟来扩增靶序列，和(c)检测步骤(b)的扩增的产物的存在或不存在；其中所述扩增产物的存在指示测试样品中β-肌动蛋白的存在。在一些实施方式中，扩增步骤包括使步骤(a)中提取的核酸与包含链置换DNA聚合酶和序列特异性引物组的反应混合物反应，其中所述序列特异性引物组选自由组1至组29组成的组。在这样的实施方式中，检测扩增产物的存在或不存在可以包括使扩增的产物与包含选自由SEQID NO:135至SEQ ID NO:184组成的组的多核苷酸序列的分子信标杂交。在这样的实施方式中，检测扩增产物的存在或不存在包括使扩增的产物与包含选自由以下组成的组的多核苷酸序列的分子信标杂交：SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:167、SEQ IDNO:168、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:183和SEQ ID NO:184。
详述
在一些实施方案中，本发明包括含有用于引发(priming)核酸扩增反应的多核苷酸的组的组合物及其使用方法。在一些实施方案中，组合物还包含探针。
如本文使用的，“核酸”包括DNA和RNA二者，包括含有非标准核苷酸的DNA和RNA。“核酸”包含至少一个多核苷酸(“核酸链”)。核酸可以是单链的或双链的。术语“核酸”是指构成例如脱氧核糖核酸(DNA)大分子和核糖核酸(RNA)大分子的核苷酸和核苷。最常见的核酸是脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。还应理解，本发明可用于含有人工核苷酸诸如肽核酸(PNA)、吗啉代(morpholino)核酸、锁核酸(LNA)、乙二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)等的生物序列。优选地，人工核苷酸是锁核酸分子，包括[α]-L-LNA。LNA包括其中核糖环被2’-氧和4’-碳之间的亚甲基桥“锁定(locked)”的核糖核酸类似物，即含有至少一个LNA单体(即一个2’-O,4’-C-亚甲基-β-D-呋喃核糖基核苷酸)的寡核苷酸。LNA碱基形成标准的Watson-Crick碱基对，但锁定构型增加了碱基配对反应的速率和稳定性(Jepsen等人,Oligonucleotides,14,130-146(2004))。
如本文使用的，“多核苷酸”是指含有两个或更多个核苷酸的聚合链，其包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或它们的类似物，诸如含有修饰的主链(例如肽核酸(PNA)或硫代磷酸酯)或修饰的碱基的那些。“多核苷酸”包括引物、寡核苷酸、核酸链等。多核苷酸可以包含标准的或非标准的核苷酸。因此，该术语包括mRNA、tRNA、rRNA、核酶、DNA、cDNA、重组核酸、分支核酸(branched nucleic acids)、质粒、载体、探针、引物等。通常，多核苷酸在链的一个末端(“5’末端”)包含5’磷酸并在另一个末端(“3’末端”)包含3’羟基基团。多核苷酸的最5’侧的核苷酸(the most 5’nucleotide)在本文中可称为多核苷酸的“5’末端核苷酸”。多核苷酸的最3’侧的核苷酸(the most 3’nucleotide)在本文中可称为多核苷酸的“3’末端核苷酸”。当本发明的核酸呈RNA形式时，它可以具有或可以不具有5’帽。
LAMP是依赖于通过Bst DNA聚合酶或其他链置换聚合酶进行自循环链置换DNA合成的核酸扩增方法。扩增的产物为具有靶的若干重复的序列的茎环结构，并具有多个环。该方法的主要优点是不需要DNA模板变性，并因此LAMP反应可以在等温条件下(60℃至67℃的范围)进行。LAMP只需要一种酶和识别靶序列中六个不同杂交位点的四种类型的引物。通过添加两种另外的引物可以加速反应。该方法产生大量的扩增产物，导致更容易检测，诸如通过目测反应混合物的浊度或荧光进行检测。
简而言之，该反应由一对“成环”引物(分别为正向内部引物FIP和反向内部引物BIP)的退火和延伸起始，然后是一对侧翼引物(F3和B3)的退火和延伸。这些引物的延伸导致环形成元件的链置换，这些元件折叠起来形成末端发夹-环结构。一旦这些关键结构出现，扩增过程就会自主维持，并在恒定的温度以连续和指数的方式(而不是像PCR的循环方式)进行，直到反应混合物中的所有核苷酸(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)都已被掺入扩增的DNA中。任选地，可以包括另外的引物对以加速反应。这些引物称为环引物，与内部引物哑铃形产物的结合非内部引物的末端环杂交。
如本文使用的术语“引物”是指这样的寡核苷酸，当将其置于其中诱导合成与核酸链(模板)互补的引物延伸产物的条件下，即在存在核苷酸和用于聚合的剂诸如DNA聚合酶的情况下并在合适的温度和pH时，该寡核苷酸能够用作合成起始点。
LAMP的应用已经进一步扩展到包括通过添加逆转录酶(RT)来检测RNA分子。通过包括RNA检测，LAMP可应用的靶的类型也被扩展，并增加了另外地靶向基于RNA的病毒、重要的调节性非编码RNA (sRNA、miRNA)和已经与特定疾病或生理状态关联的RNA分子的能力。检测RNA的能力还具有增加测定灵敏度的潜力，例如在选择高表达的、稳定的和/或丰富的信使RNA (mRNA)或核糖体RNA(rRNA)靶方面。这种扩增的初步阶段涉及RNA分子向互补DNA(cDNA)的逆转录。cDNA然后用作链置换DNA聚合酶的模板。使用热稳定的RT酶(即NEB RTx)使反应能够在单一温度及在一步的单一混合物反应中完成。
如本文使用的“靶序列”意指使用本文提供的多核苷酸中的一种或更多种进行扩增、检测，或既扩增又检测的淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)的核酸序列或其互补序列。此外，虽然术语靶序列有时指双链核酸序列，但本领域技术人员将认识到靶序列也可以是单链的，例如RNA。可以选择对特定生物体或多或少具有特异性的靶序列。例如，靶序列可以对整个属、对多于一个属、对一个种或亚种、血清组、营养型(auxotype)、血清型、菌株、分离株(isolate)或其他生物体亚群具有特异性。
本文描述的引物/探针组合物和方法的速度、特异性和灵敏度来自几个方面。用于根据本发明的组合物和方法中的示例性引物包括表1中提供的那些。
表1：引物序列
可以经由各种方法来实现对LAMP扩增的产物的检测。在优选的实施方案中，通过向引物混合物中添加荧光标记探针来进行产物检测。本文使用的术语“探针”是指包含与靶序列互补或基本互补的一部分或多于一个部分的单链核酸分子。在某些实施方式中，荧光标记探针是分子信标。
如本文使用的，“分子信标”是指设计用于报告溶液中特定核酸的存在的单链发夹形寡核苷酸探针。分子信标由四个组成部分组成：茎、发夹环、末端标记的荧光团和相对末端标记的猝灭剂(Tyagi等人,(1998)Nature Biotechnology 16:49-53)。当发夹样信标不与靶结合时，荧光团和猝灭剂位置靠近在一起，并且荧光被抑制。在存在互补的靶核苷酸序列时，信标的茎开放以与靶杂交。这将荧光团和猝灭剂分开，允许荧光团发出荧光。可选地，分子信标还包含在末端标记的供体邻近处发射的荧光团。“波长移动分子信标(Wavelength-shifting Molecular Beacons)”包含使荧光团更强地发射的另外的收集荧光团(harvester fluorophore)。目前的分子信标综述包括：Wang等人,2009,Angew ChemInt Ed Engl,48(5):856-870；Cissell等人,2009,Anal Bioanal Chem 393(1):125-35；Li等人,2008,Biochem Biophys Res Comm 373(4):457-61和Cady,2009,Methods Mol Biol554:367-79。
在一种实施方式中，分子信标包含荧光团、猝灭剂和多核苷酸，其中所述多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:135的核苷酸6-33、SEQ ID NO:136的核苷酸6-30、SEQ ID NO:137的核苷酸7-27、SEQ ID NO:138的核苷酸7-26、SEQ ID NO:139的核苷酸1-26、SEQ ID NO:140的核苷酸7-26、SEQ ID NO:141的核苷酸7-30、SEQ ID NO:142的核苷酸6-30、SEQ ID NO:143的核苷酸8-32、SEQ ID NO:144的核苷酸8-30、SEQ ID NO:145的核苷酸6-31、SEQ ID NO:146的核苷酸8-30、SEQ ID NO:147的8-22、SEQ ID NO:148的核苷酸8-24、SEQ ID NO:149的核苷酸7-27、SEQ ID NO:150的核苷酸8-21、SEQ ID NO:151的核苷酸8-32、SEQ ID NO:152的核苷酸1-24、SEQ ID NO:153的核苷酸4-24、SEQ ID NO:154的核苷酸1-23、SEQ ID NO:155的核苷酸8-26、SEQ ID NO:156的核苷酸7-29、SEQ ID NO:157的核苷酸8-28、SEQ ID NO:158的核苷酸8-29、SEQ ID NO:159的核苷酸7-25、SEQ ID NO:160的核苷酸8-22、SEQ ID NO:161的核苷酸6-22、SEQ ID NO:162的核苷酸3-22、SEQ IDNO:163的核苷酸8-28、SEQ ID NO:164的核苷酸3-28、SEQ ID NO:165的核苷酸5-25、SEQ IDNO:166的核苷酸5-26、SEQ ID NO:167的核苷酸5-20、SEQ ID NO:168的核苷酸4-22、SEQ IDNO:169的核苷酸7-22、SEQ ID NO:170的核苷酸3-22、SEQ ID NO:171的核苷酸7-28、SEQ IDNO:172的核苷酸6-27、SEQ ID NO:173的核苷酸7-29、SEQ ID NO:174的核苷酸5-27、SEQ IDNO:175的核苷酸7-29、SEQ ID NO:176的核苷酸6-28、SEQ ID NO:177的核苷酸4-23、SEQ IDNO:178的核苷酸4-34、SEQ ID NO:179的核苷酸3-27、SEQ ID NO:180的核苷酸2-27、SEQ IDNO:181的核苷酸5-33、SEQ ID NO:182的核苷酸3-30、SEQ ID NO:183的核苷酸9-34和SEQID NO:184的核苷酸8-28。在一种实施方案中，多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:135至SEQID NO:184组成的组的序列。在另一种实施方案中，多核苷酸由选自由SEQ ID NO:135至SEQID NO:184组成的组的序列组成。
分子信标优选地用于还包含序列特异性LAMP引物的组的组合物中。在一种实施方式中，分子信标包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:135的核苷酸6-33、SEQ IDNO:136的核苷酸6-30、SEQ ID NO:137的核苷酸7-27、SEQ ID NO:138的核苷酸7-26、SEQ IDNO:139的核苷酸1-26、SEQ ID NO:140的核苷酸7-26、SEQ ID NO:141的核苷酸7-30、SEQ IDNO:142的核苷酸6-30、SEQ ID NO:143的核苷酸8-32、SEQ ID NO:144的核苷酸8-30、SEQ IDNO:145的核苷酸6-31、SEQ ID NO:146的核苷酸8-30、SEQ ID NO:147的8-22、SEQ ID NO:148的核苷酸8-24、SEQ ID NO:149的核苷酸7-27、SEQ ID NO:150的核苷酸8-21、SEQ IDNO:151的核苷酸8-32、SEQ ID NO:152的核苷酸1-24、SEQ ID NO:153的核苷酸4-24、SEQ IDNO:154的核苷酸1-23、SEQ ID NO:155的核苷酸8-26、SEQ ID NO:156的核苷酸7-29、SEQ IDNO:157的核苷酸8-28、SEQ ID NO:158的核苷酸8-29、SEQ ID NO:159的核苷酸7-25、SEQ IDNO:160的核苷酸8-22、SEQ ID NO:161的核苷酸6-22、SEQ ID NO:162的核苷酸3-22、SEQ IDNO:163的核苷酸8-28、SEQ ID NO:164的核苷酸3-28、SEQ ID NO:165的核苷酸5-25、SEQ IDNO:166的核苷酸5-26、SEQ ID NO:167的核苷酸5-20、SEQ ID NO:168的核苷酸4-22、SEQ IDNO:169的核苷酸7-22、SEQ ID NO:170的核苷酸3-22、SEQ ID NO:171的核苷酸7-28、SEQ IDNO:172的核苷酸6-27、SEQ ID NO:173的核苷酸7-29、SEQ ID NO:174的核苷酸5-27、SEQ IDNO:175的核苷酸7-29、SEQ ID NO:176的核苷酸6-28、SEQ ID NO:177的核苷酸4-23、SEQ IDNO:178的核苷酸4-34、SEQ ID NO:179的核苷酸3-27、SEQ ID NO:180的核苷酸2-27、SEQ IDNO:181的核苷酸5-33、SEQ ID NO:182的核苷酸3-30、SEQ ID NO:183的核苷酸9-34和SEQID NO:184的核苷酸8-28。在这样的实施方式中，分子信标可以包含选自由SEQ ID NO:135至SEQ ID NO:184组成的组的序列。更优选地，分子信标的多核苷酸序列由选自由SEQ IDNO:135至SEQ ID NO:184组成的组的序列组成。在特别优选的实施方式中，分子信标的多核苷酸序列是SEQ ID NO:184。
当包含在包含选自由组9-组12、组17和组22-组29组成的组的多核苷酸的组的组合物中时，分子信标优选地包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:147的核苷酸8-22、SEQ ID NO:148的核苷酸8-24、SEQ ID NO:149的核苷酸7-27、SEQ ID NO:150的核苷酸8-21、SEQ ID NO:155的核苷酸8-26、SEQ ID NO:156的核苷酸7-29、SEQ ID NO:165的核苷酸5-25、SEQ ID NO:166的核苷酸5-26、SEQ ID NO:167的核苷酸5-20、SEQ ID NO:168的核苷酸4-22、SEQ ID NO:169的核苷酸7-22、SEQ ID NO:171的核苷酸7-28、SEQ ID NO:172的核苷酸6-27、SEQ ID NO:173的核苷酸7-29、SEQ ID NO:174的核苷酸5-27、SEQ ID NO:175的核苷酸7-29、SEQ ID NO:176的核苷酸6-28、SEQ ID NO:183的核苷酸9-46和SEQ ID NO:184的核苷酸8-40。更特别地，分子信标可以包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:156、SEQID NO:165、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:176、SEQID NO:183和SEQ ID NO:184。在某些实施方式中，分子信标的序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:155、SEQ IDNO:156、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:175、SEQ IDNO:176、SEQ ID NO:183和SEQ ID NO:184。
当包含在包含选自由组9-组11、组17和组23-组29组成的组的多核苷酸的组的组合物中时，分子信标优选地包含选自由SEQ ID NO:152的核苷酸1-24、SEQ ID NO:153的核苷酸4-24和SEQ ID NO:154的核苷酸1-23组成的组的序列。在某些实施方式中，分子信标可以包含选自由SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:153和SEQ ID NO:154组成的组的序列。在一些实施方案中，分子信标的序列选自由SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:153和SEQ ID NO:154组成的组。
当与选自由组4、组9-组12、组17和组22-组26组成的组的多核苷酸的组联合使用时，分子信标优选地包含选自由SEQ ID NO:144的8-30、SEQ ID NO:145的核苷酸6-31和SEQID NO:146的核苷酸8-30组成的组的序列。在一些实施方案中，分子信标可以包含选自由SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145和SEQ ID NO:146组成的组的序列。在其他实施方案中，分子信标的序列选自由SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145和SEQ ID NO:146组成的组。
当包含在包含选自由组5、组12、组17和组22-组25组成的组的多核苷酸的组的组合物中时，分子信标优选地包含SEQ ID NO:170的核苷酸3-22。在一些实施方式中，分子信标包含SEQ ID NO:170。在其他实施方案中，分子信标的序列是SEQ ID NO:170。
当与选自由组6-组8、组15和组16组成的组的多核苷酸的组联合使用时，分子信标优选地包含选自由SEQ ID NO:180的核苷酸2-27和SEQ ID NO:182的核苷酸3-30组成的组的序列。在这样的实施方案中，分子信标可以包含选自由SEQ ID NO:180和SEQ ID NO:182组成的组的序列。在另一种实施方案中，分子信标的序列是SEQ ID NO:180或SEQ ID NO:182。
当包含在包含选自由组6-组11、组28和组29组成的组的多核苷酸的组的组合物中时，分子信标优选地包含选自由SEQ ID NO:178的核苷酸4-34和SEQ ID NO:181的核苷酸5-33组成的组的序列。在一些实施方案中，分子信标可以包含选自由SEQ ID NO:178和SEQ IDNO:181组成的组的序列。在其他实施方案中，分子信标的序列是SEQ ID NO:178或SEQ IDNO:181。
当与选自由组6-组9和组11组成的组的多核苷酸的组联合使用时，分子信标优选地包含SEQ ID NO:179的核苷酸3-27。在一些实施方式中，分子信标包含SEQ ID NO:179。在其他实施方案中，分子信标的序列是SEQ ID NO:179。
当包含在包含选自由组6-组9、组11和组28组成的组的多核苷酸的组的组合物中时，分子信标优选地包含SEQ ID NO:177的核苷酸4-23。在一些实施方案中，分子信标包含SEQ ID NO:177。在其他实施方案中，分子信标的序列是SEQ ID NO:177。
当与选自由组13-组15组成的组的多核苷酸的组联合使用时，分子信标优选地包含选自由SEQ ID NO:159的核苷酸7-25和SEQ ID NO:160的核苷酸8-22组成的组的序列。在这样的实施方案中，分子信标可以包含选自由SEQ ID NO:159和SEQ ID NO:160组成的组的序列。在其他实施方案中，分子信标的序列是SEQ ID NO:159或SEQ ID NO:160。
当包含在包含选自由组13-组16组成的组的多核苷酸的组的组合物中时，分子信标优选地包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:157的核苷酸8-28、SEQ ID NO:158的核苷酸8-29、SEQ ID NO:161的核苷酸6-22和SEQ ID NO:162的核苷酸3-22。更特别地，分子信标可以包含选自由SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:161和SEQ ID NO:162组成的组的序列。在某些实施方式中，分子信标的序列选自由SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:161和SEQ ID NO:162组成的组。
当与由组3组成的多核苷酸的组联合使用时，分子信标优选地包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:137的核苷酸7-27、SEQ ID NO:138的核苷酸7-26、SEQ ID NO:139的核苷酸1-26、SEQ ID NO:140的核苷酸7-26、SEQ ID NO:141的核苷酸7-30、SEQ IDNO:142的核苷酸6-30、SEQ ID NO:151的核苷酸8-32和SEQ ID NO:153的核苷酸4-24。在某些实施方式中，分子信标可以包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:137、SEQ IDNO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:151和SEQ ID NO:153。在一些实施方案中，分子信标的序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQID NO:151和SEQ ID NO:153。
当包含在包含选自由组1、组2和组18-组20组成的组的多核苷酸的组的组合物中时，分子信标优选地包含选自由SEQ ID NO:163的核苷酸8-28和SEQ ID NO:164的核苷酸3-28组成的组的序列。在某些实施方式中，分子信标可以包含选自由SEQ ID NO:163和SEQ IDNO:164组成的组的序列。在一些实施方案中，分子信标的序列是SEQ ID NO:163或SEQ IDNO:164。
当包含在包含选自由组1、组2和组18-组21组成的组的多核苷酸的组的组合物中时，分子信标优选地包含选自由SEQ ID NO:135的核苷酸6-33和SEQ ID NO:136的核苷酸6-30组成的组的序列。在一些实施方式中，分子信标可以包含选自由SEQ ID NO:135和SEQ IDNO:136组成的组的序列。在其他实施方案中，分子信标的序列是SEQ ID NO:135或SEQ IDNO:136。具有上述序列的多核苷酸可以包含一种或更多种非天然核苷或连接，诸如肽核酸(PNA)、吗啉代核酸、锁核酸(LNA)、乙二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)等。在一些实施方案中，分子信标的多核苷酸包含1个至6个锁核酸。在优选的实施方案中，分子信标的多核苷酸包含3个或4个锁核酸。
如本文使用的术语“标记物(label)”意指具有能够检测和任选地定量的特性或特征的分子或部分。标记物可以是可直接检测的，例如(但不限于)放射性同位素、荧光团、化学发光团、酶、胶体颗粒、荧光微粒等；或者标记物可以是可间接检测的，例如特定的结合成员。将理解，可直接检测的标记物可能需要另外的组分，诸如例如底物、触发试剂、猝灭部分、光等，以实现标记物的检测和/或定量。当使用可间接检测标记物时，它们通常与“缀合物”联合使用。缀合物通常是已经附接或偶联至可直接检测标记物的特定结合成员。用于合成缀合物的偶联化学是本领域熟知的，并且可以包括例如不破坏特定结合成员的特定结合特性或标记物的可检测特性的任何化学手段和/或物理手段。如本文使用的，“特异性结合成员”意指结合对的成员，即两个不同的分子，其中一个分子通过例如化学或物理手段与另一个分子特异性结合。除了抗原和抗体特异性结合对以外，其他特异性结合对包括但并非旨在限于抗生物素蛋白和生物素；半抗原和半抗原特异性抗体；互补核苷酸序列；酶辅因子或底物和酶；等等。
分子信标可以仅包含核酸诸如DNA或RNA，或者它也可以包含肽核酸(PNA)缀合物。荧光团可以是任何荧光有机染料或单个量子点。猝灭部分合意地使荧光团的发光猝灭。可以使用使荧光团的发光猝灭的任何合适的猝灭部分。荧光团可以是本领域已知的任何荧光标志物/染料。合适的荧光标志物的实例包括但不限于Fam、Hex、Tet、Joe、Rox、Tamra、Max、Edans、Cy染料诸如Cy5、荧光素、香豆素、曙红、罗丹明、Bodipy、Alexa、Cascade蓝、Yakima黄、荧光黄、得克萨斯红和ATTO染料家族。猝灭剂可以是本领域中已知的任何猝灭剂。猝灭剂的实例包括但不限于Dabcyl、Dark Quencher、Eclipse Dark Quencher、ElleQuencher、Tamra、BHQ和QSY(所有这些都是商标)。技术人员在设计探针时将知道哪些染料/猝灭剂的组合是合适的。在示例性实施方案中，荧光素(FAM)与Blackhole QuencherTM(BHQTM)(Novato,Calif.)一起使用。然后分子信标与扩增的产物的结合可以直接通过目视评估。可选地，荧光水平可以通过光谱法来测量，以改进灵敏度。
许多家商业供应商生产标准和定制的分子信标，包括Abingdon Health(UK；www.abingdonhealth.com)、Attostar(US,MN；www.attostar.com)、Biolegio(NLD；www.biolegio.com)、Biomers.net(DEU；www.biomers.net)、Biosearch Technologies(US,CA；www.biosearchtech.com)、Eurogentec(BEL；www.eurogentec.com)、Gene Link(US,NY；www.genelink.com)、Integrated DNA Technologies(US,IA；www.idtdna.com)、IsogenLife Science(NLD；www.isogen-lifescience.com)、Midland Certified Reagent(US,TX；www.oligos.com)、Eurofins(DEU；www.eurofinsgenomics.eu)、Sigma-Aldrich(US,TX；www.sigmaaldrich.com)、Thermo Scientific(US,MA；www.thermoscientific.com)、TIBMOLBIOL(DEU；www.tib-molbiol.de)、TriLink Bio Technologies(US,CA；www.trilinkbiotech.com)。利用分子信标的各种试剂盒也是商购可得的，诸如来自Stratagene(La Jolla,Calif.)的SentinelTM分子信标等位基因鉴别试剂盒和来自Eurogentec SA(Belgium,eurogentec.com)和Isogen Bioscience BV(The Netherlands,isogen.com)的各种试剂盒。
本发明的寡核苷酸探针和引物任选地基本上使用本领域已知的任何技术制备。在某些实施方案中，例如，本文描述的寡核苷酸探针和引物基本上使用任何核酸合成方法通过化学合成，所述核酸合成方法包括例如根据Beaucage和Caruthers(1981),TetrahedronLetts.22(20):1859-1862(其通过引用并入)描述的固相亚磷酰胺三酯方法，或本领域已知的另一合成技术，例如，使用自动化合成仪，如Needham-VanDevanter等人.(1984)NucleicAcids Res.12:6159-6168(其通过引用并入)中描述的。各种各样的用于自动化寡核苷酸合成的设备是商购可得的。还任选地利用多核苷酸合成方法(multi-nucleotide synthesisapproaches)(例如，三核苷酸合成等)。此外，本文描述的引物核酸任选地包含各种修饰。为了进一步说明，引物还任选地被修饰以改进扩增反应的特异性，如例如在1999年12月14日颁发的美国专利第6,001,611号(其通过引用并入)中描述的。引物和探针也可以被合成为具有如本文中描述的或除此之外本领域已知的各种其他修饰。
此外，基本上任何核酸(以及几乎任何经标记的核酸，无论是标准的或非标准的)都可以从以下各种商业来源中的任何一个定制或标准订购，诸如Integrated DNATechnologies、Midland Certified Reagent Company、Eurofins、BiosearchTechnologies、Sigma Aldrich和许多其他来源。
如本文使用的术语“测试样品”意指取自怀疑含有或潜在含有靶序列的生物体或生物液体的样品。测试样品可以取自任何生物来源，诸如例如组织、血液、唾液、痰、唾液、黏液、汗液、尿液、尿道拭子、宫颈拭子、阴道拭子、泌尿生殖或肛拭子、结膜拭子、眼晶状体液(ocular lens fluid)、脑脊液、乳汁、腹水、滑液、腹膜液、羊水、发酵液、细胞培养物、化学反应混合物等。测试样品可以(1)按从来源获得的原样直接使用或(2)在修改样品的特征的预处理后使用。因此，可以在使用前通过以下对测试样品进行预处理：例如从血液制备血浆或血清、破坏细胞或病毒颗粒、从固体材料制备液体、稀释黏性流体、过滤液体、蒸馏液体、浓缩液体、使干扰组分失活、添加试剂、纯化核酸，等等。
有利的是，本发明能够可靠地快速检测临床样品诸如尿液样品中的β-肌动蛋白。
为了进一步说明，在分析本文描述的靶核酸之前，可以从通常包含不同组分的复杂混合物的样品纯化或分离那些核酸。收集的样品中的细胞通常被裂解以释放细胞内容物，包括靶核酸。例如，怀疑含有性传播感染(STI)包括但不限于沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis,CT)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhea,NG)和阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis,TV)的测试样品，可以通过使细胞与各种酶、化学品接触来裂解，和/或通过本领域已知的降解例如细菌细胞壁的其他方法来裂解。在一些实施方案中，直接在细胞裂解物中分析核酸。在其他实施方案中，核酸在检测之前从细胞裂解物进一步纯化或提取。基本上任何核酸提取方法都可以用于纯化本发明方法中使用的样品中的核酸。可用于纯化核酸的示例性技术包括，例如，亲和色谱、与固定在固体支持物上的探针杂交、液-液提取(例如，苯酚-氯仿提取等)、沉淀(例如，使用乙醇等)、用滤纸提取、用胶束形成试剂(例如，鲸蜡基-三甲基-溴化铵等)提取、与固定的嵌入染料(例如，溴化乙锭、吖啶等)结合、吸附至硅胶或硅藻土、在离液条件下吸附至磁性玻璃颗粒或有机硅烷颗粒，等等。样品处理也在例如美国专利第5,155,018号、第6,383,393号及第5,234,809号中描述，它们各自通过引用并入。
测试样品可以任选地已经根据本领域技术人员已知的任何技术处理和/或纯化，以改进扩增效率和/或定性准确性和/或定量准确性。因此，样品可以排他地或基本上由核酸组成，无论是通过纯化、分离或通过化学合成获得的。对于希望从测试样品分离或纯化核酸诸如DNA，例如从宫颈刮片分离或纯化DNA (例如，QIAamp-DNA Mini-Kit；Qiagen,Hilden,Germany)的技术人员来说，手段是可获得的。
等同方案和范围
本领域技术人员将认识到，或能够使用不超过常规实验确定，根据本文描述的本发明的具体实施方案的许多等同方案。本发明的范围并非旨在限于以上描述，而是如所附权利要求书中所述。
在权利要求书中，诸如“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”的冠词可意指一个或多于一个，除非有相反指示或除此之外从上下文是明显的。如果组成员中的一个、多于一个或全部在给定的产品或方法中存在、被采用或以其他方式相关，则在一个或更多个组成员之间包含“或”的权利要求或描述被视为满足情况(considered satisfied)，除非有相反指示或除此之外从上下文是明显的。本发明包括其中一个组成员在给定产品或方法中确切地存在、被采用或以其他方式相关的实施方案。本发明包括其中组成员中的多于一个或全部在给定产品或方法中存在、被采用或以其他方式相关的实施方案。
还应注意，术语“包含(comprising)”旨在是开放式的，并且允许但不必须包括另外的要素或步骤。因此当本文使用术语“包含”时，术语“由...组成”也被涵盖并公开。
在给定范围的情况下，端点被包括在内。此外，应理解，除非另有指示或除此之外从上下文和本领域普通技术人员的理解是明显的，否则在本发明的不同实施方案中，可以将表示为范围的值假定为在陈述范围内的任何具体值或子范围至该范围下限单位的十分之一，除非上下文另外清楚地指明。
所有引用的来源，例如，本文引用的参考文献、出版物、数据库、数据库条目和技术，通过引用并入本申请中，即使在引用中没有明确陈述。如果引用的来源和本申请的陈述相冲突，应以本申请中的陈述为准。
章节和表的标题并非旨在限制。
实施例
提出以下实施例，以便为本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的完整公开内容和描述，并且以下实施例并非旨在限制本发明人视作其发明的范围，它们也并非旨在代表下文的实验是进行的所有实验或仅有实验。尽管作出了努力以确保关于使用的数字(例如，量、温度等)的精度，但是应当考虑一定实验误差和偏差。除非另有指示，份数为重量份数，分子量为加权平均分子量，温度以摄氏度计，且压力处于大气压或临近大气压。
实施例1：靶选择与引物探针设计
设计基于引物/探针的检测测定以通过向反应中添加逆转录酶(RT-LAMP)来利用等温环介导扩增(LAMP)靶向RNA。包括了具有5’荧光团/3’猝灭剂修饰(6-羧基荧光素和Black Hole Quencher 1)的分子信标探针以提供靶特异性荧光检测。使用包括PremierBiosoft的LAMP Designer、Beacon Designer、内部脚本和人工设计在内的软件程序的组合设计了β-肌动蛋白RT-LAMP引物组(表1和表2)。使用BLAST针对人类基因组和NCBI核苷酸数据库进一步分析设计的引物组和信标的特异性。设计了各种引物组和探针，并对反应速度进行了筛选。
表2中总结了本发明的引物组，其最少包括正向内部引物(FIP)和反向内部引物(BIP)。此外，引物组通常还包括至少两种另外的引物，所述另外的引物选自正向外部引物(F3)、反向外部引物(B3)、正向环引物(LF)和反向环引物(LB)。
表2：LAMP引物组
通常，从人类尿液样品或从用内部体外转录的HsActB RNA加标(spiked)的缓冲液或阴性对照(NTC＝无核酸酶水或Tris缓冲液，无模板对照)提取的3μL至5μL的核酸用作RTLAMP反应的模板。10-25μL的总体积反应在冰上制备为含有包含1x扩增缓冲液的制剂的混合物，该1x扩增缓冲液包含10mM-40mM Tris-HCl、0％-0.5％吐温20、0mM-300mM海藻糖、5mM-70mM KCl、4mM-41mM MgSO4、10mM-20mM(NH4)2SO4、0mM-2mM TCEP，和dCTP、dGTP、dATP和dTTP各1.6mM-2mM，NEB Bst2聚合酶(NEB CN#M0537L)和RTx Warmstart逆转录酶(NEB CN#M0380S)。根据实验设计的需要，引物(2μM内部引物、0.2μM外部引物和0.8μM环引物)被添加至各个反应中或直接添加至主混合物中。分子信标(0.2μM)或200nM Yo-Pro-1、Yo-Pro-3或To-Pro染料也被添加至主混合物中，如下文实施例中指示的。用标准的6种引物制备扩增反应。将主混合物分配到各个样品模板，短暂地涡旋和离心，并将每个反应加载到96孔板或384孔板(Roche CN#4729692001或BioRad CNhsI9605)的各个孔中。反应在范围为60℃-67℃的温度进行，并且荧光在Roche LightCycler 96实时PCR仪或BioRad CFX96实时循环仪上监测。经由嵌入染料或分子信标探针与靶结合(导致分子信标荧光从分子内猝灭释放)来监测靶扩增。
实施例2：LAMP与染料检测
使用标准提取方法提取天然含有内源人类B-肌动蛋白的阴性尿基质(urinematrix)，并使用LAMP引物(如表2中描述的)扩增样品。YoProTM染料或同一染料组家族(Life Technologies；绿色荧光碳菁核酸染色剂)内的相容波长形式用于检测扩增的产物。如实施例1中描述地制备主混合物。结果总结在表3中，其中阳性报警时间(Time toPositive,Tp)使用内部开发的算法计算。
表3：染料检测阳性报警时间
实施例3：分子信标检测
为了提供另外水平的基于直接序列的扩增产物检测(相对于间接染料检测)，设计了靶向引物组的β-肌动蛋白扩增子内的独特核苷酸的分子信标(MB1-MB50)(SEQ ID NO:135-184)并将所述分子信标用于检测从活细菌提取的核酸的扩增(表4)，所述引物组具有有希望的TP和灵敏度的组合。分子信标探针被设计为包含5’荧光团/3’猝灭剂修饰(6-羧基荧光素(FAM)和Black Hole Quencher 1(BHQ1))以提供靶特异性荧光检测。分子信标MB49和MB50(SEQ ID NO:183&184)包括由“[+X]”指示的LNA核苷酸，其中X指示核碱基的身份。
表4：探针序列
根据实施例1和2中描述的方法，利用含有天然存在的内源人类β-肌动蛋白的阴性尿基质的洗脱液作为模板输入，评价10μL-25μL的总体积反应。虽然使用分子信标进行检测导致反应Tp略有增加，但在基于序列直接检测扩增产物的能力并从而区分亲缘上接近的物种方面提供了合理的折衷。
表5：阳性报警时间(探针检测)
虽然为了清楚理解的目的通过说明和实例的方式相当详细地描述了前述发明，但是本领域普通技术人员容易明白，根据本发明的教导，可以对其进行某些改变和修改，而不偏离所附权利要求书的精神或范围。还应理解本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，且并非旨在限制，因为本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
因此，前述仅仅说明了本发明的原理。将理解的是，本领域技术人员将能够设计出各种布置，尽管本文未明确描述或显示，这些布置体现本发明的原理并且被包括在本发明的精神和范围内。此外，本文列举的所有实例和条件性语言主要旨在帮助读者理解本发明的原理和发明人为促进本领域发展而贡献的概念，并且应被解释为不限于这样的具体列举的实例和条件。此外，本文中列举本发明的原理、方面和实施方案以及其具体实例的所有陈述旨在涵盖其结构等同物和功能等同物二者。此外，旨在这样的等同物包括当前已知的等同物和未来开发的等同物二者，即所开发的执行相同的功能而不管结构如何的任何元件。因此，本发明的范围并不旨在被限制为本文示出和描述的示例性实施方案。而是，本发明的范围和精神由所附权利要求书体现。
序列表
<110> 达丽斯生物医学公司
<120> 用于人类β肌动蛋白的扩增及检测的多核苷酸
<130> TSM-047WO
<140>
<141> 2020-12-02
<150> 16/700,824
<151> 2019-12-02
<160> 184
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 74
ccggccttgc acatgccgcc agctcaccat g 31
<210> 75
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 75
cgtgatggtg ggcatggggt gaggatgcct ctc 33
<210> 76
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 76
tgtcgacgac gagcg 15
<210> 77
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 77
gtcagaagga ttcctatgtg g 21
<210> 78
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 78
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<210> 79
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 79
catcacgccc tggtgctcgt cgtcgacaac g 31
<210> 80
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 80
ggtcagaagg attcctatgt ggggtgagga tgcctctc 38
<210> 81
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 81
ccggccttgc acatg 15
<210> 82
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 82
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 83
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<210> 84
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 84
gggcataccc ctcgtagatg gg 22
<210> 85
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 85
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<210> 86
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 86
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 87
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 88
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<210> 89
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 89
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<212> DNA
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<220>
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<400> 90
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 91
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<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 92
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
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<210> 94
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 94
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 95
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 97
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
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<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 101
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 102
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 103
gcagctcgta gctcttctcc agg 23
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 104
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<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 105
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<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 106
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 107
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<210> 108
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 108
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<210> 109
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 109
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<210> 110
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 110
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<210> 111
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 111
ccaaccgcga gaaga 15
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<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 112
gaggcgtaca gggatagcat gacccagatc atgtttga 38
<210> 113
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 113
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<210> 114
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 114
cggagtccat cacgatgc 18
<210> 115
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 115
aaggtctcaa acatgatctg ggtcacgtgc tgctgaccga g 41
<210> 116
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 116
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 117
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 119
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 120
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<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 121
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 122
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 123
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<210> 124
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 124
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<210> 125
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 125
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<210> 126
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 126
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<210> 127
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 127
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<210> 128
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 128
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<210> 129
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 129
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<210> 130
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 130
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<210> 131
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 131
acggcatcgt caccaac 17
<210> 132
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 132
tgctcctcgg gagccacaga catggagaaa atctggcac 39
<210> 133
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 133
tgaaccccaa ggccaaccgt ggggtgttga aggtctca 38
<210> 134
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的引物
<400> 134
gcagctcatt gtagaaggtg tg 22
<210> 135
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的探针
<400> 135
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<210> 136
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的探针
<400> 136
cgcgtggcat ggagtcctgt ggcatccacg cg 32
<210> 137
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的探针
<400> 137
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<210> 138
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的探针
<400> 138
cgaccaggat cggcggctcc atcctgctgg tcg 33
<210> 139
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的探针
<400> 139
ccgtgtggat cggcggctcc atcctgcaca cgg 33
<210> 140
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的探针
<400> 140
ccgatgggat cggcggctcc atcctgccat cgg 33
<210> 141
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的探针
<400> 141
cgcgatcaga tgtggatcag caagcaggag gatcgcg 37
<210> 142
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的探针
<400> 142
cgtacgcaga tgtggatcag caagcaggag gcgtacg 37
<210> 143
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的探针
<400> 143
cggcctaaga tgtggatcag caagcaggag taggccg 37
<210> 144
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的探针
<400> 144
cgcgatctac cactggcatc gtgatggact gatcgcg 37
<210> 145
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的探针
<400> 145
ccgctcgtac cactggcatc gtgatggact cgagcgg 37
<210> 146
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的探针
<400> 146
ccgcggatac cactggcatc gtgatggact tccgcgg 37
<210> 147
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的探针
<400> 147
cgtccagcca gatcatgttt gactggacg 29
<210> 148
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的探针
<400> 148
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<210> 149
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的探针
<400> 149
cgaggtccca gatcatgttt gagacctcg 29
<210> 150
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的探针
<400> 150
cgctgagtca tgtttgagac cctcagcg 28
<210> 151
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的探针
<400> 151
cgcgatcgtc caccttccag cagatgtgga tcgcg 35
<210> 152
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的探针
<400> 152
ccgcgagaag atgacccaga tcatctcgcg g 31
<210> 153
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的探针
<400> 153
cctcgagaag atgacccaga tcatctcgag g 31
<210> 154
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的探针
<400> 154
ccgcgagaag atgacccaga tcactcgcgg 30
<210> 155
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的探针
<400> 155
cgcgatcgac ccagatcatg tttgaggatc gcg 33
<210> 156
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的探针
<400> 156
cgtcggtgac ccagatcatg tttgagaccg acg 33
<210> 157
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的探针
<400> 157
cgcgatcaca tgccggagcc gttgtcgaga tcgcg 35
<210> 158
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的探针
<400> 158
ccgatggaca tgccggagcc gttgtcgacc atcgg 35
<210> 159
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的探针
<400> 159
cgcgatccgc cagctcacca tggatcgcg 29
<210> 160
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的探针
<400> 160
caggtctcgc cagctcacca tgagacctg 29
<210> 161
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的探针
<400> 161
cgcgatcttc ccctccatcg tgatcgcg 28
<210> 162
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的探针
<400> 162
caccgtcttc ccctccatcg tgacggtg 28
<210> 163
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的探针
<400> 163
cgcgatccct gtggcatcca cgaaactaga tcgcg 35
<210> 164
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的探针
<400> 164
ccggagtcct gtggcatcca cgaaactaac tccgg 35
<210> 165
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的探针
<400> 165
ccgcgaagat gacccagatc atgttcgcgg 30
<210> 166
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的探针
<400> 166
ccgcgaagat gacccagatc atgtttcgcg g 31
<210> 167
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的探针
<400> 167
cggcgatgac ccagatcatg atcgccg 27
<210> 168
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的探针
<400> 168
cgcgaagatg acccagatca tgcttcgcg 29
<210> 169
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的探针
<400> 169
caagccgatg acccagatca tgcggcttg 29
<210> 170
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的探针
<400> 170
ccgatggact ccggtgacgg ggccatcgg 29
<210> 171
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的探针
<400> 171
cgtcggtgac ccagatcatg tttgagacac cgacg 35
<210> 172
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的探针
<400> 172
cggcctgacc cagatcatgt ttgagacagg ccg 33
<210> 173
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的探针
<400> 173
cggcggtgac ccagatcatg tttgagaccg ccg 33
<210> 174
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的探针
<400> 174
cggcgatgac ccagatcatg tttgagatcg ccg 33
<210> 175
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的探针
<400> 175
cagcggtgac ccagatcatg tttgagaccg ctg 33
<210> 176
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的探针
<400> 176
cgcggtgacc cagatcatgt ttgagaccca ccgcg 35
<210> 177
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的探针
<400> 177
cggcaccaac tgggacgaca tggggtgccg 30
<210> 178
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的探针
<400> 178
cggcaccaac tgggacgaca tggagaaaat ctggtgccg 39
<210> 179
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的探针
<400> 179
cgaccccatc gagcacggca tcgtcacggg gtcg 34
<210> 180
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的探针
<400> 180
ccatgggtca gaaggattcc tatgtggccc atgg 34
<210> 181
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的探针
<400> 181
cggccgacat ggagaaaatc tggcaccaca cctcggccg 39
<210> 182
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的探针
<400> 182
ccgggtcaga aggattccta tgtgggcgac ccgg 34
<210> 183
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的探针
<220>
<221> modified_base
<222> (13)..(13)
<223> 锁核酸
<220>
<221> modified_base
<222> (17)..(17)
<223> 锁核酸
<220>
<221> modified_base
<222> (20)..(20)
<223> 锁核酸
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(24)
<223> 锁核酸
<400> 183
cacgggtcga cccagatcat gtttgagacc cgtg 34
<210> 184
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的说明：合成的探针
<220>
<221> modified_base
<222> (12)..(12)
<223> 锁核酸
<220>
<221> modified_base
<222> (16)..(16)
<223> 锁核酸
<220>
<221> modified_base
<222> (19)..(19)
<223> 锁核酸
<220>
<221> modified_base
<222> (23)..(23)
<223> 锁核酸
<400> 184
cacgcgtgac ccagatcatg tttgagacgc gtg 33
Claims (92)
1.一种组合物，所述组合物包含选自由组1至组29组成的组的多核苷酸的组。
2.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物还包含探针。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述探针包含标记物。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述探针是经标记的多核苷酸。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述经标记的多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:135的核苷酸6-33、SEQ ID NO:136的核苷酸6-30、SEQ ID NO:137的核苷酸7-27、SEQ ID NO:138的核苷酸7-26、SEQ ID NO:139的核苷酸1-26、SEQ ID NO:140的核苷酸7-26、SEQ ID NO:141的核苷酸7-30、SEQ ID NO:142的核苷酸6-30、SEQ ID NO:143的核苷酸8-32、SEQ ID NO:144的核苷酸8-30、SEQ ID NO:145的核苷酸6-31、SEQ IDNO:146的核苷酸8-30、SEQ ID NO:147的8-22、SEQ ID NO:148的核苷酸8-24、SEQ ID NO:149的核苷酸7-27、SEQ ID NO:150的核苷酸8-21、SEQ ID NO:151的核苷酸8-32、SEQ IDNO:152的核苷酸1-24、SEQ ID NO:153的核苷酸4-24、SEQ ID NO:154的核苷酸1-23、SEQ IDNO:155的核苷酸8-26、SEQ ID NO:156的核苷酸7-29、SEQ ID NO:157的核苷酸8-28、SEQ IDNO:158的核苷酸8-29、SEQ ID NO:159的核苷酸7-25、SEQ ID NO:160的核苷酸8-22、SEQ IDNO:161的核苷酸6-22、SEQ ID NO:162的核苷酸3-22、SEQ ID NO:163的核苷酸8-28、SEQ IDNO:164的核苷酸3-28、SEQ ID NO:165的核苷酸5-25、SEQ ID NO:166的核苷酸5-26、SEQ IDNO:167的核苷酸5-20、SEQ ID NO:168的核苷酸4-22、SEQ ID NO:169的核苷酸7-22、SEQ IDNO:170的核苷酸3-22、SEQ ID NO:171的核苷酸7-28、SEQ ID NO:172的核苷酸6-27、SEQ IDNO:173的核苷酸7-29、SEQ ID NO:174的核苷酸5-27、SEQ ID NO:175的核苷酸7-29、SEQ IDNO:176的核苷酸6-28、SEQ ID NO:177的核苷酸4-23、SEQ ID NO:178的核苷酸4-34、SEQ IDNO:179的核苷酸3-27、SEQ ID NO:180的核苷酸2-27、SEQ ID NO:181的核苷酸5-33、SEQ IDNO:182的核苷酸3-30、SEQ ID NO:183的核苷酸9-34和SEQ ID NO:184的核苷酸8-28。
6.根据权利要求4所述的组合物，其中所述经标记的多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:135至SEQ ID NO:184组成的组的序列。
7.根据权利要求4所述的组合物，其中所述标记物是荧光团。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述荧光团共价地附接至所述多核苷酸的末端。
9.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物还包含经标记的多核苷酸，所述经标记的多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:147的核苷酸8-22、SEQ ID NO:148的核苷酸8-24、SEQ ID NO:149的核苷酸7-27、SEQ ID NO:150的核苷酸8-21、SEQ ID NO:155的核苷酸8-26、SEQ ID NO:156的核苷酸7-29、SEQ ID NO:165的核苷酸5-25、SEQ IDNO:166的核苷酸5-26、SEQ ID NO:167的核苷酸5-20、SEQ ID NO:168的核苷酸4-22、SEQ IDNO:169的核苷酸7-22、SEQ ID NO:171的核苷酸7-28、SEQ ID NO:172的核苷酸6-27、SEQ IDNO:173的核苷酸7-29、SEQ ID NO:174的核苷酸5-27、SEQ ID NO:175的核苷酸7-29、SEQ IDNO:176的核苷酸6-28、SEQ ID NO:183的核苷酸9-34和SEQ ID NO:184的核苷酸8-28，并且其中所述多核苷酸的组选自由组9-组12、组17和组22-组29组成的组。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述经标记的多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:168、SEQID NO:169、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:183和SEQ ID NO:184。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述经标记的多核苷酸的序列是SEQ ID NO:184，并且所述多核苷酸的组是组29。
12.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物还包含经标记的多核苷酸，所述经标记的多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:152的核苷酸1-24、SEQ ID NO:153的核苷酸4-24和SEQID NO:154的核苷酸1-23组成的组的序列，并且其中所述多核苷酸的组选自由组9-组11、组17和组23-组29组成的组。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述经标记的多核苷酸包含选自由SEQ IDNO:152、SEQ ID NO:153和SEQ ID NO:154组成的组的序列。
14.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物还包含经标记的多核苷酸，所述经标记的多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:144的核苷酸8-30、SEQ ID NO:145的核苷酸6-31和SEQID NO:146的核苷酸8-30组成的组的序列，并且其中所述多核苷酸的组选自由组4、组9-组12、组17和组22-组26组成的组。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述经标记的多核苷酸包含选自由SEQ IDNO:144、SEQ ID NO:145和SEQ ID NO:146组成的组的序列。
16.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物还包含经标记的多核苷酸，所述经标记的多核苷酸包含SEQ ID NO:170的核苷酸3-22，并且其中所述多核苷酸的组选自由组5、组12、组17和组22-组25组成的组。
17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述经标记的多核苷酸包含SEQ ID NO:170。
18.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物还包含经标记的多核苷酸，所述经标记的多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:180的核苷酸2-27和SEQ ID NO:182的核苷酸3-30组成的组的序列，并且其中所述多核苷酸的组选自由组6-组8、组15和组16组成的组。
19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述经标记的多核苷酸包含选自由SEQ IDNO:180和SEQ ID NO:182组成的组的序列。
20.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物还包含经标记的多核苷酸，所述经标记的多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:178的核苷酸4-34和SEQ ID NO:181的核苷酸5-33组成的组的序列，并且其中所述多核苷酸的组选自由组6-组11和组28-组29组成的组。
21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述经标记的多核苷酸包含选自由SEQ IDNO:178和SEQ ID NO:181组成的组的序列。
22.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物还包含经标记的多核苷酸，所述经标记的多核苷酸包含SEQ ID NO:179的核苷酸3-27，并且其中所述多核苷酸的组选自由组6-组9和组11组成的组。
23.根据权利要求22所述的组合物，其中所述经标记的多核苷酸包含SEQ ID NO:179。
24.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物还包含经标记的多核苷酸，所述经标记的多核苷酸包含SEQ ID NO:177的核苷酸4-23，并且其中所述多核苷酸的组选自由组6-组9、组11和组28组成的组。
25.根据权利要求24所述的组合物，其中所述经标记的多核苷酸包含SEQ ID NO:177。
26.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物还包含经标记的多核苷酸，所述经标记的多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:159的核苷酸7-25和SEQ ID NO:160的核苷酸8-22组成的组的序列，并且其中所述多核苷酸的组选自由组13-组15组成的组。
27.根据权利要求26所述的组合物，其中所述经标记的多核苷酸包含选自由SEQ IDNO:159和SEQ ID NO:160组成的组的序列。
28.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物还包含经标记的多核苷酸，所述经标记的多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:157的核苷酸8-28、SEQ ID NO:158的核苷酸8-29、SEQ ID NO:161的核苷酸6-22和SEQ ID NO:162的核苷酸3-22，并且其中所述多核苷酸的组选自由组13-组16组成的组。
29.根据权利要求28所述的组合物，其中所述经标记的多核苷酸包含来自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:161和SEQ ID NO:162。
30.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物还包含经标记的多核苷酸，所述经标记的多核苷酸包含选自以下的组的序列：SEQ ID NO:137的核苷酸7-27、SEQ ID NO:138的核苷酸7-26、SEQ ID NO:139的核苷酸1-26、SEQ ID NO:140的核苷酸7-26、SEQ ID NO:141的核苷酸7-30、SEQ ID NO:142的核苷酸6-30、SEQ ID NO:151的核苷酸8-32和SEQ ID NO:153的核苷酸4-24，并且其中所述多核苷酸的组是组3。
31.根据权利要求30所述的组合物，其中所述经标记的多核苷酸选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:151和SEQ ID NO:153。
32.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物还包含经标记的多核苷酸，所述经标记的多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:163的核苷酸8-28和SEQ ID NO:164的核苷酸3-28组成的组的序列，并且其中所述多核苷酸的组选自由组1、组2和组18-组20组成的组。
33.根据权利要求32所述的组合物，其中所述经标记的多核苷酸包含来自由SEQ IDNO:163和SEQ ID NO:164组成的组的序列。
34.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物还包含经标记的多核苷酸，所述经标记的多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:135的核苷酸6-33和SEQ ID NO:136的核苷酸6-30组成的组的序列，并且其中所述多核苷酸的组选自由组1、组2和组18-组21组成的组。
35.根据权利要求34所述的组合物，其中所述经标记的多核苷酸包含来自由SEQ IDNO:135和SEQ ID NO:136组成的组的序列。
36.根据权利要求2所述的组合物，其中所述探针是包含荧光团、猝灭剂和多核苷酸的分子信标。
37.根据权利要求36所述的组合物，其中所述分子信标包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:135的核苷酸6-33、SEQ ID NO:136的核苷酸6-30、SEQ ID NO:137的核苷酸7-27、SEQ ID NO:138的核苷酸7-26、SEQ ID NO:139的核苷酸1-26、SEQ ID NO:140的核苷酸7-26、SEQ ID NO:141的核苷酸7-30、SEQ ID NO:142的核苷酸6-30、SEQ ID NO:143的核苷酸8-32、SEQ ID NO:144的核苷酸8-30、SEQ ID NO:145的核苷酸6-31、SEQ ID NO:146的核苷酸8-30、SEQ ID NO:147的8-22、SEQ ID NO:148的核苷酸8-24、SEQ ID NO:149的核苷酸7-27、SEQ ID NO:150的核苷酸8-21、SEQ ID NO:151的核苷酸8-32、SEQ ID NO:152的核苷酸1-24、SEQ ID NO:153的核苷酸4-24、SEQ ID NO:154的核苷酸1-23、SEQ ID NO:155的核苷酸8-26、SEQ ID NO:156的核苷酸7-29、SEQ ID NO:157的核苷酸8-28、SEQ ID NO:158的核苷酸8-29、SEQ ID NO:159的核苷酸7-25、SEQ ID NO:160的核苷酸8-22、SEQ ID NO:161的核苷酸6-22、SEQ ID NO:162的核苷酸3-22、SEQ ID NO:163的核苷酸8-28、SEQ IDNO:164的核苷酸3-28、SEQ ID NO:165的核苷酸5-25、SEQ ID NO:166的核苷酸5-26、SEQ IDNO:167的核苷酸5-20、SEQ ID NO:168的核苷酸4-22、SEQ ID NO:169的核苷酸7-22、SEQ IDNO:170的核苷酸3-22、SEQ ID NO:171的核苷酸7-28、SEQ ID NO:172的核苷酸6-27、SEQ IDNO:173的核苷酸7-29、SEQ ID NO:174的核苷酸5-27、SEQ ID NO:175的核苷酸7-29、SEQ IDNO:176的核苷酸6-28、SEQ ID NO:177的核苷酸4-23、SEQ ID NO:178的核苷酸4-34、SEQ IDNO:179的核苷酸3-27、SEQ ID NO:180的核苷酸2-27、SEQ ID NO:181的核苷酸5-33、SEQ IDNO:182的核苷酸3-30、SEQ ID NO:183的核苷酸9-34和SEQ ID NO:184的核苷酸8-28。
38.根据权利要求37所述的组合物，其中所述分子信标包含选自由SEQ ID NO:135至SEQ ID NO:184组成的组的序列。
39.根据权利要求38所述的组合物，其中所述多核苷酸序列由SEQ ID NO:184组成。
40.一种分子信标，所述分子信标包含荧光团、猝灭剂和多核苷酸，其中所述多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:135的核苷酸6-33、SEQ ID NO:136的核苷酸6-30、SEQ ID NO:137的核苷酸7-27、SEQ ID NO:138的核苷酸7-26、SEQ ID NO:139的核苷酸1-26、SEQ ID NO:140的核苷酸7-26、SEQ ID NO:141的核苷酸7-30、SEQ ID NO:142的核苷酸6-30、SEQ ID NO:143的核苷酸8-32、SEQ ID NO:144的核苷酸8-30、SEQ ID NO:145的核苷酸6-31、SEQ ID NO:146的核苷酸8-30、SEQ ID NO:147的8-22、SEQ ID NO:148的核苷酸8-24、SEQ ID NO:149的核苷酸7-27、SEQ ID NO:150的核苷酸8-21、SEQ ID NO:151的核苷酸8-32、SEQ ID NO:152的核苷酸1-24、SEQ ID NO:153的核苷酸4-24、SEQ ID NO:154的核苷酸1-23、SEQ ID NO:155的核苷酸8-26、SEQ ID NO:156的核苷酸7-29、SEQ ID NO:157的核苷酸8-28、SEQ ID NO:158的核苷酸8-29、SEQ ID NO:159的核苷酸7-25、SEQ ID NO:160的核苷酸8-22、SEQ ID NO:161的核苷酸6-22、SEQ ID NO:162的核苷酸3-22、SEQ IDNO:163的核苷酸8-28、SEQ ID NO:164的核苷酸3-28、SEQ ID NO:165的核苷酸5-25、SEQ IDNO:166的核苷酸5-26、SEQ ID NO:167的核苷酸5-20、SEQ ID NO:168的核苷酸4-22、SEQ IDNO:169的核苷酸7-22、SEQ ID NO:170的核苷酸3-22、SEQ ID NO:171的核苷酸7-28、SEQ IDNO:172的核苷酸6-27、SEQ ID NO:173的核苷酸7-29、SEQ ID NO:174的核苷酸5-27、SEQ IDNO:175的核苷酸7-29、SEQ ID NO:176的核苷酸6-28、SEQ ID NO:177的核苷酸4-23、SEQ IDNO:178的核苷酸4-34、SEQ ID NO:179的核苷酸3-27、SEQ ID NO:180的核苷酸2-27、SEQ IDNO:181的核苷酸5-33、SEQ ID NO:182的核苷酸3-30、SEQ ID NO:183的核苷酸9-34和SEQID NO:184的核苷酸8-28。
41.根据权利要求40所述的分子信标，其中所述多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:135至SEQ ID NO:184组成的组的序列。
42.根据权利要求41所述的分子信标，其中所述多核苷酸由选自由SEQ ID NO:135至SEQ ID NO:184组成的组的序列组成。
43.根据权利要求40所述的分子信标，其中所述荧光团是FAM并且所述猝灭剂是BHQ1。
44.根据权利要求40所述的分子信标，其中所述荧光团是ATTO 565或Alexa 594并且所述猝灭剂是BHQ1或BHQ2。
45.一种检测测试样品中β-肌动蛋白的方法，所述方法包括：
(a)从所述测试样品提取核酸；
(b)通过使步骤(a)中提取的核酸与包含链置换DNA聚合酶和序列特异性引物组的反应混合物反应来扩增靶序列，其中所述序列特异性引物组选自由组1至组29组成的组；和
(c)检测步骤(b)的扩增的产物的存在或不存在；其中所述扩增产物的存在指示所述测试样品中β-肌动蛋白的存在。
46.根据权利要求45所述的方法，其中步骤(b)中所述靶序列的扩增在约60℃和约67℃之间进行少于30分钟。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述扩增步骤进行少于15分钟。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述扩增步骤进行少于12分钟。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述扩增步骤进行少于9分钟。
50.根据权利要求45所述的方法，其中所述反应混合物还包含逆转录酶。
51.根据权利要求45所述的方法，其中检测所述扩增产物的存在或不存在包括使所述扩增的产物与包含附接至标记物的多核苷酸的探针杂交。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述标记物是荧光团。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述荧光团共价地附接至所述多核苷酸的末端。
54.根据权利要求51所述的方法，其中经标记的多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:135的核苷酸6-33、SEQ ID NO:136的核苷酸6-30、SEQ ID NO:137的核苷酸7-27、SEQ ID NO:138的核苷酸7-26、SEQ ID NO:139的核苷酸1-26、SEQ ID NO:140的核苷酸7-26、SEQ ID NO:141的核苷酸7-30、SEQ ID NO:142的核苷酸6-30、SEQ ID NO:143的核苷酸8-32、SEQ ID NO:144的核苷酸8-30、SEQ ID NO:145的核苷酸6-31、SEQ ID NO:146的核苷酸8-30、SEQ ID NO:147的8-22、SEQ ID NO:148的核苷酸8-24、SEQ ID NO:149的核苷酸7-27、SEQ ID NO:150的核苷酸8-21、SEQ ID NO:151的核苷酸8-32、SEQ ID NO:152的核苷酸1-24、SEQ ID NO:153的核苷酸4-24、SEQ ID NO:154的核苷酸1-23、SEQ ID NO:155的核苷酸8-26、SEQ ID NO:156的核苷酸7-29、SEQ ID NO:157的核苷酸8-28、SEQ ID NO:158的核苷酸8-29、SEQ ID NO:159的核苷酸7-25、SEQ ID NO:160的核苷酸8-22、SEQ IDNO:161的核苷酸6-22、SEQ ID NO:162的核苷酸3-22、SEQ ID NO:163的核苷酸8-28、SEQ IDNO:164的核苷酸3-28、SEQ ID NO:165的核苷酸5-25、SEQ ID NO:166的核苷酸5-26、SEQ IDNO:167的核苷酸5-20、SEQ ID NO:168的核苷酸4-22、SEQ ID NO:169的核苷酸7-22、SEQ IDNO:170的核苷酸3-22、SEQ ID NO:171的核苷酸7-28、SEQ ID NO:172的核苷酸6-27、SEQ IDNO:173的核苷酸7-29、SEQ ID NO:174的核苷酸5-27、SEQ ID NO:175的核苷酸7-29、SEQ IDNO:176的核苷酸6-28、SEQ ID NO:177的核苷酸4-23、SEQ ID NO:178的核苷酸4-34、SEQ IDNO:179的核苷酸3-27、SEQ ID NO:180的核苷酸2-27、SEQ ID NO:181的核苷酸5-33、SEQ IDNO:182的核苷酸3-30、SEQ ID NO:183的核苷酸9-34和SEQ ID NO:184的核苷酸8-28。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述经标记的多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:135至SEQ ID NO:184组成的组的序列。
56.根据权利要求51所述的方法，其中经标记的多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:147的核苷酸8-22、SEQ ID NO:148的核苷酸8-24、SEQ ID NO:149的核苷酸7-27、SEQ ID NO:150的核苷酸8-21、SEQ ID NO:155的核苷酸8-26、SEQ ID NO:156的核苷酸7-29、SEQ ID NO:165的核苷酸5-25、SEQ ID NO:166的核苷酸5-26、SEQ ID NO:167的核苷酸5-20、SEQ ID NO:168的核苷酸4-22、SEQ ID NO:169的核苷酸7-22、SEQ ID NO:171的核苷酸7-28、SEQ ID NO:172的核苷酸6-27、SEQ ID NO:173的核苷酸7-29、SEQ ID NO:174的核苷酸5-27、SEQ ID NO:175的核苷酸7-29、SEQ ID NO:176的核苷酸6-28、SEQ IDNO:183的核苷酸9-34和SEQ ID NO:184的核苷酸8-28，并且其中所述序列特异性引物组选自由组9-组12、组17和组22-组29组成的组。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述经标记的多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:168、SEQID NO:169、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:184。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述经标记的多核苷酸的序列是SEQ ID NO:184并且所述序列特异性引物组是组29。
59.根据权利要求51所述的方法，其中经标记的多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:152的核苷酸1-24、SEQ ID NO:153的核苷酸4-24、SEQ ID NO:154的核苷酸1-23组成的组的序列，并且其中所述序列特异性引物组选自由组9-组11、组17和组23-组29组成的组。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述经标记的多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:153和SEQ ID NO:154组成的组的序列。
61.根据权利要求51所述的方法，其中经标记的多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:144的核苷酸8-30、SEQ ID NO:145的核苷酸6-31和SEQ ID NO:146的核苷酸8-30组成的组的序列，并且其中所述序列特异性引物组选自由组4、组9-组12、组17和组22-组26组成的组。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述经标记的多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145和SEQ ID NO:146组成的组的序列。
63.根据权利要求51所述的方法，其中经标记的多核苷酸包含SEQ ID NO:170的核苷酸3-22，并且其中所述序列特异性引物组选自由组5、组12、组17和组22-组25组成的组。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述经标记的多核苷酸包含SEQ ID NO:170。
65.根据权利要求51所述的方法，其中经标记的多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:180的核苷酸2-27和SEQ ID NO:182的核苷酸3-30组成的组的序列，并且其中所述序列特异性组选自由组6-组8、组15和组16组成的组。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述经标记的多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:180和SEQ ID NO:182组成的组的序列。
67.根据权利要求51所述的方法，其中经标记的多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:178的核苷酸4-34和SEQ ID NO:181的核苷酸5-33组成的组的序列，并且其中所述序列特异性引物组选自由组6-组11和组28-组29组成的组。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述经标记的多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:178和SEQ ID NO:181组成的组的序列。
69.根据权利要求51所述的方法，其中经标记的多核苷酸包含SEQ ID NO:179的核苷酸3-27，并且其中所述序列特异性引物组选自由组6-组9和组11组成的组。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述经标记的多核苷酸包含SEQ ID NO:179。
71.根据权利要求51所述的方法，其中经标记的多核苷酸包含SEQ ID NO:177的核苷酸4-23，并且其中所述序列特异性引物组选自由组6-组9、组11和组28组成的组。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述经标记的多核苷酸包含SEQ ID NO:177。
73.根据权利要求51所述的方法，其中经标记的多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:159的核苷酸7-25和SEQ ID NO:160的核苷酸8-22组成的组的序列，并且其中所述序列特异性引物组选自由组13-组15组成的组。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述经标记的多核苷酸包含来自由SEQ ID NO:159和SEQ ID NO:160组成的组的序列。
75.根据权利要求51所述的方法，其中经标记的多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:157的核苷酸8-28、SEQ ID NO:158的核苷酸8-29、SEQ ID NO:161的核苷酸6-22和SEQ ID NO:162的核苷酸3-22，并且其中所述序列特异性引物组选自由组13-组16组成的组。
76.根据权利要求75所述的方法，其中所述经标记的多核苷酸包含来自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:161和SEQ ID NO:162。
77.根据权利要求51所述的方法，其中经标记的多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:137的核苷酸7-27、SEQ ID NO:138的核苷酸7-26、SEQ ID NO:139的核苷酸1-26、SEQ ID NO:140的核苷酸7-26、SEQ ID NO:141的核苷酸7-30、SEQ ID NO:142的核苷酸6-30、SEQ ID NO:151的核苷酸8-32和SEQ ID NO:153的核苷酸4-24，并且其中所述序列特异性引物组是组3。
78.根据权利要求77所述的方法，其中所述经标记的多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:151和SEQ ID NO:153。
79.根据权利要求51所述的方法，其中经标记的多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:163的核苷酸8-28和SEQ ID NO:164的核苷酸3-28组成的组的序列，并且其中所述序列特异性引物组选自由组1、组2和组18-组20组成的组。
80.根据权利要求79所述的方法，其中所述经标记的多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:163和SEQ ID NO:164组成的组的序列。
81.根据权利要求51所述的方法，其中经标记的多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:135的核苷酸6-33和SEQ ID NO:136的核苷酸6-30组成的组的序列，并且其中所述序列特异性引物组选自由组1-组2和组18-组21组成的组。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述经标记的多核苷酸包含来自由SEQ ID NO:135和SEQ ID NO:136组成的组的序列。
83.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求1所述的组合物。
84.根据权利要求83所述的试剂盒，所述试剂盒还包含链置换聚合酶。
85.根据权利要求84所述的试剂盒，所述试剂盒还包含含有荧光团、猝灭剂和多核苷酸的分子信标，其中所述多核苷酸包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:135的核苷酸6-33、SEQ ID NO:136的核苷酸6-30、SEQ ID NO:137的核苷酸7-27、SEQ ID NO:138的核苷酸7-26、SEQ ID NO:139的核苷酸1-26、SEQ ID NO:140的核苷酸7-26、SEQ ID NO:141的核苷酸7-30、SEQ ID NO:142的核苷酸6-30、SEQ ID NO:143的核苷酸8-32、SEQ ID NO:144的核苷酸8-30、SEQ ID NO:145的核苷酸6-31、SEQ ID NO:146的核苷酸8-30、SEQ ID NO:147的8-22、SEQ ID NO:148的核苷酸8-24、SEQ ID NO:149的核苷酸7-27、SEQ ID NO:150的核苷酸8-21、SEQ ID NO:151的核苷酸8-32、SEQ ID NO:152的核苷酸1-24、SEQ ID NO:153的核苷酸4-24、SEQ ID NO:154的核苷酸1-23、SEQ ID NO:155的核苷酸8-26、SEQ ID NO:156的核苷酸7-29、SEQ ID NO:157的核苷酸8-28、SEQ ID NO:158的核苷酸8-29、SEQ ID NO:159的核苷酸7-25、SEQ ID NO:160的核苷酸8-22、SEQ ID NO:161的核苷酸6-22、SEQ IDNO:162的核苷酸3-22、SEQ ID NO:163的核苷酸8-28、SEQ ID NO:164的核苷酸3-28、SEQ IDNO:165的核苷酸5-25、SEQ ID NO:166的核苷酸5-26、SEQ ID NO:167的核苷酸5-20、SEQ IDNO:168的核苷酸4-22、SEQ ID NO:169的核苷酸7-22、SEQ ID NO:170的核苷酸3-22、SEQ IDNO:171的核苷酸7-28、SEQ ID NO:172的核苷酸6-27、SEQ ID NO:173的核苷酸7-29、SEQ IDNO:174的核苷酸5-27、SEQ ID NO:175的核苷酸7-29、SEQ ID NO:176的核苷酸6-28、SEQ IDNO:177的核苷酸4-23、SEQ ID NO:178的核苷酸4-34、SEQ ID NO:179的核苷酸3-27、SEQ IDNO:180的核苷酸2-27、SEQ ID NO:181的核苷酸5-33、SEQ ID NO:182的核苷酸3-30、SEQ IDNO:183的核苷酸9-34和SEQ ID NO:184的核苷酸8-28。
86.根据权利要求85所述的试剂盒，其中所述多核苷酸包含选自由SEQ ID NO:135至SEQ ID NO:184组成的组的序列。
87.根据权利要求86所述的试剂盒，其中所述多核苷酸由选自由SEQ ID NO:135至SEQID NO:184组成的组的序列组成。
88.根据权利要求87所述的试剂盒，其中所述多核苷酸由SEQ ID NO:184组成并且所述多核苷酸的组是组29。
89.一种检测测试样品中β-肌动蛋白的方法，所述方法包括：
(a)从所述测试样品提取核酸；
(b)通过使步骤(a)中提取的核酸与包含链置换DNA聚合酶和序列特异性LAMP引物组的反应混合物反应少于10分钟来扩增靶序列；和
(c)检测步骤(b)的扩增的产物的存在或不存在；其中所述扩增产物的存在指示所述测试样品中β-肌动蛋白的存在。
90.根据权利要求89的方法，其中所述扩增步骤包括使步骤(a)中提取的核酸与包含链置换DNA聚合酶和序列特异性引物组的反应混合物反应，其中所述序列特异性引物组选自由组1至组29组成的组。
91.根据权利要求90所述的方法，其中检测所述扩增产物的存在或不存在包括使所述扩增的产物与包含选自由SEQ ID NO:135至SEQ ID NO:184组成的组的多核苷酸序列的分子信标杂交。
92.根据权利要求90所述的方法，其中检测所述扩增产物的存在或不存在包括使所述扩增的产物与包含选自由以下组成的组的多核苷酸序列的分子信标杂交：SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:156、SEQ IDNO:165、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:176、SEQ IDNO:183和SEQ ID NO:184。
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