CN114480692B

CN114480692B - 产毒型艰难梭菌快速核酸检测专用引物组、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN114480692B
Application number: CN202210231702.5A
Authority: CN
Inventors: 金大智; 陈毓; 宋小军
Original assignee: Hangzhou Medical College
Current assignee: Hangzhou Medical College
Priority date: 2022-03-10
Filing date: 2022-03-10
Publication date: 2024-03-12
Anticipated expiration: 2042-03-10
Also published as: CN114480692A

Abstract

本发明属于细菌检测技术领域，具体涉及一种产毒型艰难梭菌快速核酸检测专用引物组、试剂盒及方法；引物组包括如SEQ ID No.1～SEQ ID No.10的10条特异性引物，该方法采用等温核酸扩增技术MCDA(多重交叉置换扩增技术)实现，具有低成本、高稳定性、高特异性和高灵敏度的特点，可快速特异性检测产毒型艰难梭菌，灵敏度可达5拷贝/反应。

Description

产毒型艰难梭菌快速核酸检测专用引物组、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体而言，涉及一种鉴定产毒型艰难梭菌的方法，尤其涉及一种产毒型艰难梭菌快速核酸检测专用引物组、试剂盒及方法。

背景技术

艰难梭菌是目前公认的院内感染和抗生素相关性腹泻的重要病原体之一。艰难梭菌感染可引起伪膜性肠炎、中毒型巨结肠、肠穿孔、弥漫性血管内凝血、肾衰竭和脓毒症等严重的并发症。据美国疾控中心的统计数据，每年大约有50万人感染艰难梭菌，其中约2.0万死于该菌感染。美国疾控中心已将艰难梭菌列为耐药性细菌威胁等级最高的“紧急”级别。因此，艰难梭菌感染已成为全世界高度关注的严重院内感染问题之一。传统的生物学鉴定方法主要是进行细菌培养、GDH抗原反应等，耗时较长，因此有必要建立一种快速鉴定艰难梭菌的试剂方法，对临床艰难梭菌感染的确证及用药具有重要的指导意义。目前鉴别艰难梭菌的分子生物方法有ELISA、免疫胶体金以及荧光PCR法等，以上各种方法虽然可能在临床上提供较好的价值，但因操作繁琐、灵敏度低、耗时较长、还需要其他方法辅助进行鉴定、或需要配备昂贵的仪器设备及试剂等不同的原因未能在临床上大规模推广使用。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种产毒型艰难梭菌快速核酸检测专用引物组、试剂盒及方法；该方法采用等温核酸扩增技术MCDA(多重交叉置换扩增技术)实现，具有低成本、高稳定性、高特异性和高灵敏度的特点，灵敏度可达5拷贝/反应。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

本发明根据艰难梭菌tcdB毒力基因的特异性设计10条特异性引物，构成用于快速鉴定产毒性艰难梭菌的特异性引物组，包括：

tcdB_F1：CTGAAGGATTACCTATAATTGC(SEQ ID No.1)

tcdB_F2：ATCTCGAAGTACAAGTTCATTG(SEQ ID No.2)

tcdB_D1：TTTCACTTAGCTCTTTGATTGC(SEQ ID No.3)

tcdB_D2：GGATTTAGTATACTTTTAGTTCC(SEQ ID No.4)

tcdB_C1：TTTCTTGTCTTAATAATGGGTCACTCG(SEQ ID No.5)

tcdB_C2：AATCATTACTTCATCTTTGGGGATAGC(SEQ ID No.6)

tcdB_R1：CTGCCATTATACCTATCTTAGC(SEQ ID No.7)

tcdB_R2：AATTTAACAACAGCTACAACTGC(SEQ ID No.8)

tcdB_CP1：TTTCTTGTCTTAATAATGGGTCACTCGATAGATGGTGTAAGTTTAGGTGC(SEQ IDNo.9)

tcdB_CP2：AATCATTACTTCATCTTTGGGGATAGCGTATACCTGCTGAAATTCCTGC(SEQ IDNo.10)

一种产毒型艰难梭菌快速核酸检测的试剂盒，包括前述的10条引物；上述试剂盒还可包括Warm Start LAMP 2X预混液，50X LAMP荧光染料；利用该试剂盒可以基于MCDA扩增技术对产毒型艰难梭菌进行快速核酸检测，扩增程序可为：63℃30分钟，95℃5分钟，每分钟记性一次荧光检测。根据PCR仪判读各扩增反应的Ct值进行鉴别。

具体包括如下步骤：

(1)模板DNA的提取：提取待检样品的DNA，所述待检样品是疑是艰难梭菌感染的病人粪便标本或分离的艰难梭菌；

(2)MCDA扩增反应：在200μL PCR管配制反应体系：引物混合液1.2μL，Warm StartLAMP 2X预混液5μL，LAMP荧光染料(50X)0.5μL,模板DNA1μL，用灭菌去离子水补齐到10μl盖上管盖。

Warm Start LAMP 2X预混液包含Bst 2.0Warm Start DNA聚合酶、Warm StartRTx反转录酶和LAMP缓冲液。

所述引物混合液含有上述的10条特异性引物，其中，tcdB_CP1、tcdB_CP2浓度为2.4pmol/μL；tcdB_D1、tcdB_D2、tcdB_R1、tcdB_R2浓度为1.2pmol/μL；tcdB_C1、tcdB_C2浓度为0.8pmol/μL；tcdB_F1、tcdB_F2浓度为0.4pmol/μL；

扩增程序为：63℃30分钟，95℃，5分钟，每1分钟检测一次SYBR GREEN荧光。

(3)结果判断：根据实时荧光定量PCR仪所显示的各反应的Ct值

阴性结果判定：如果样本扩增曲线均不呈S型、Ct值为UNDET，则结果为阴性。

阳性结果判定：如果样本对应通道扩增曲线呈S型，则结果为阳性。

上述技术方案中采用MCDA扩增结合SYBR荧光检测进行结果判读。此外还可在扩增结束后通过核酸电泳、胶体金显色等方法对扩增结果进行判读。

本发明的有益效果是：

现有检测艰难梭菌以荧光PCR法最优，但其成本较高，目前常见的荧光PCR法需要合成探针，单条售价在1000元以上，本方案使用的均为普通引物，售价为100元以内；荧光PCR法需要使用专门的荧光PCR仪，售价10万元以上，本方法采用恒温扩增技术，可使用金属浴、水浴控温设备，或开发专门的单温控扩增设备，造价几千元，二者灵敏度无显著差异(荧光PCR灵敏度为1拷贝/反应，本方法为5拷贝/反应)，均能满足临床对艰难梭菌的检测需求。

附图说明

图1是实验室灵敏度检测结果

图2是本方法检测阳性和阴性结果曲线

具体实施方式

下面结合附图对本发明技术方案做进一步的详细描述。

本发明提供10条用于对产毒型艰难梭菌进行快速鉴定甄别的特异性引物，含有该引物组的试剂盒及一种用多重交叉置换扩增技术(MCDA)技术快速鉴定产毒型艰难梭菌的方法。该方法方便快捷，对样本进行简单核酸提取，试剂加样等简单操作即可上机，30分钟即可完成检测；价格低廉，使用的试剂耗材为常规合成引物以及等温扩增酶，较荧光PCR法以及免疫法造价低廉。而且，本发明方法基于等温扩增技术进行，对仪器设备的要求较低，适于推广应用。

实施例

荧光定量PCR仪购自ABI公司，纯水仪购自Millipore；LAMP扩增酶购自NEB公司；超纯水由纯水仪制备并高压后使用，引物合成自生工生物。0.2mL PCR八连管及管盖购自Axygen公司。

根据艰难梭菌tcdB毒力基因的特异性设计10条特异性引物，利用MCDA扩增技术，扩增程序为：63℃30分钟，95℃5分钟，每分钟记性一次荧光检测。根据PCR仪判读各扩增反应的Ct值进行鉴别。

用于快速鉴定产毒性艰难梭菌的特异性引物，包括：

tcdB_F1：CTGAAGGATTACCTATAATTGC(SEQ ID No.1)

tcdB_F2：ATCTCGAAGTACAAGTTCATTG(SEQ ID No.2)

tcdB_D1：TTTCACTTAGCTCTTTGATTGC(SEQ ID No.3)

tcdB_D2：GGATTTAGTATACTTTTAGTTCC(SEQ ID No.4)

tcdB_C1：TTTCTTGTCTTAATAATGGGTCACTCG(SEQ ID No.5)

tcdB_C2：AATCATTACTTCATCTTTGGGGATAGC(SEQ ID No.6)

tcdB_R1：CTGCCATTATACCTATCTTAGC(SEQ ID No.7)

tcdB_R2：AATTTAACAACAGCTACAACTGC(SEQ ID No.8)

tcdB_CP1：TTTCTTGTCTTAATAATGGGTCACTCGATAGATGGTGTAAGTTTAGGTGC(SEQ IDNo.9)

tcdB_CP2：AATCATTACTTCATCTTTGGGGATAGCGTATACCTGCTGAAATTCCTGC(SEQ IDNo.10)

具体包括如下步骤：

(1)模板DNA的提取：提取待检样品的DNA，所述待检样品是疑是艰难梭菌感染的病人粪便标本或疑是艰难梭菌的菌株；

(3)结果判断：根据实时荧光定量PCR仪所显示的各反应的Ct值

将艰难梭菌标准株BAA-1870(购自ATCC)培养，提取细菌基因组，通过分光光度计检测其浓度,稀释至5ng/μL。分别稀释至浓度为10⁶copies/μL、10⁵copies/μL、10⁴copies/μL、1000copies/μL、100copies/μL、10copies/μL、5copies/μL、2.5copies/μL、1.25copies/μL。

通过本方法进行实验，结果见图1。根据本方法的结果判定，阳性结果为10⁶copies/μL、10⁵copies/μL、10⁴copies/μL、1000copies/μL、100copies/μL、10copies/μL、5copies/μL；阴性结果为2.5copies/μL、1.25copies/μL。所以本方法的实验室灵敏度为5copies/反应。

分别挑选B型链球菌(Streptococcus agalactiae)、变异链球菌(streptococcusmutans)、艰难梭菌提取DNA。使用本方法进行检测，结果见图2，艰难梭菌阳性，其他菌株阴性。

序列表

<110> 杭州医学院

<120> 产毒型艰难梭菌快速核酸检测专用引物组、试剂盒及方法

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctgaaggatt acctataatt gc 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atctcgaagt acaagttcat tg 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tttcacttag ctctttgatt gc 22

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggatttagta tacttttagt tcc 23

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tttcttgtct taataatggg tcactcg 27

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aatcattact tcatctttgg ggatagc 27

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctgccattat acctatctta gc 22

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aatttaacaa cagctacaac tgc 23

<210> 9

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tttcttgtct taataatggg tcactcgata gatggtgtaa gtttaggtgc 50

<210> 10

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aatcattact tcatctttgg ggatagcgta tacctgctga aattcctgc 49

Claims

1. 一种产毒型艰难梭菌核酸检测引物组，其特征在于，包括

tcdB_F1：CTGAAGGATTACCTATAATTGC

tcdB_F2：ATCTCGAAGTACAAGTTCATTG

tcdB_D1：TTTCACTTAGCTCTTTGATTGC

tcdB_D2：GGATTTAGTATACTTTTAGTTCC

tcdB_C1：TTTCTTGTCTTAATAATGGGTCACTCG

tcdB_C2：AATCATTACTTCATCTTTGGGGATAGC

tcdB_R1：CTGCCATTATACCTATCTTAGC

tcdB_R2：AATTTAACAACAGCTACAACTGC

tcdB_CP1：TTCTTGTCTTAATAATGGGTCACTCGATAGATGGTGTAAGTTTAGGTGC

tcdB_CP2：AATCATTACTTCATCTTTGGGGATAGCGTATACCTGCTGAAATTCCTGC 。

2.一种产毒型艰难梭菌核酸检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组。

3. 根据权利要求2所述的产毒型艰难梭菌核酸检测的试剂盒，其特征在于，试剂盒中还含有Warm Start LAMP 2X 预混液及50X LAMP 荧光染料, Warm Start LAMP 2X 预混液包含Bst 2.0 Warm Start DNA 聚合酶、Warm Start RTx 反转录酶和LAMP 缓冲液。

4.一种非诊断目的的产毒型艰难梭菌核酸检测方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

模板DNA的提取：提取待检样品的DNA；

配制反应体系：如权利要求1所述的引物组的混合液1.2µL，Warm Start LAMP 2X 预混液 5µL，LAMP 荧光染料（50X）0.5µL,模板DNA 1µL，用灭菌去离子水补齐到10µl；

进行MCDA扩增反应并检测。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述待检样品是艰难梭菌感染的病人粪便标本或是含艰难梭菌菌株的样品。

6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述引物混合液中，tcdB_CP1、tcdB_CP2浓度分别为2.4pmol/µL；tcdB_D1、tcdB_D2、tcdB_R1、tcdB_R2浓度分别为1.2pmol/µL；tcdB_C1、tcdB_C2浓度分别为0.8pmol/µL；tcdB_F1、tcdB_F2浓度分别为0.4pmol/µL。

7. 根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述MCDA扩增的程序为：63℃ 30分钟，95℃，5分钟。

8. 根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，采用MCDA扩增结合SYBR荧光检测进行结果判读，每1分钟检测一次SYBR GREEN荧光；

阴性结果判定：如果样本扩增曲线均不呈S型、Ct值为UNDET，则结果为阴性；

9.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，在扩增结束后采用核酸电泳或胶体金显色方法对扩增结果进行判读。