CN1609233A - 一种预测和检测鼻咽癌过滤性病毒相关癌症的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明特征描述了通过检测或测量患者血清或血浆中存在的EBV DNA和接着测定EBV多态性亚型来诊断、检测、监测和确定患者的鼻咽癌过滤性病毒相关癌症预后的方法。循环EBV DNA的灵敏性可以作为一种有力的筛选工具，同时EBV多态性亚型测定也证实了EBV相关恶性肿瘤的预后和诊断。本发明还特征描述了用于上述测试的包括合适试剂的诊断试剂盒。

Description

一种预测和检测鼻咽癌过滤性病毒相关癌症的方法
发明领域
本发明涉及在患者血液的无细胞体液中可发现鼻咽癌过滤性病毒，以及一旦发现该病毒则可判断该患者可能患有鼻咽癌过滤性病毒相关癌症的发现。还涉及一种检测更可能引起癌症的EBV亚型的方法，该方法将有助于预测和诊断上述癌症。
背景技术
已知多种肿瘤的癌细胞可以释放肿瘤来源的DNA(Anker et al.，Cancer Metastasis Rev.18：65-73(1999))。这样的例子包括胰腺癌引起的致癌基因突变(Anker at al.，Gastroenterology.112：4-1120(1997))，肺癌中的微卫星体的改变(Chen et al.，Nature Medicine.2：3-1035(1996))和肝癌引起的后生变化(Wong et al.，Cancer Res.59：3(1999))。此外，在许多已知的与病毒感染相关的癌症的循环系统中发现了病毒DNA。这样的DNA的例子包括来源于鼻咽癌(Mutirangura et al.，Clin Cancer Res.4：665-9(1998)；Lo et al.，Cancer Res.59：1188-91(1999))和特定淋巴瘤(Lei et al.，Br J Haematol.111：239-46(2000)；Gallagher et al，Int J Cancer.84：442-8(1999)；Drouet et al.，J Med Virol.57：383-9(1999))的鼻咽癌过滤性病毒(EBV)DNA和来源于脑瘤和颈瘤的人类乳头瘤病毒DNA(Capone et al.，Clin Cancer Res.6：4171-5(2000))。
近来，许多兴趣集中于研究癌症患者血浆和血清中肿瘤来源DNA的存在(Chen，X.Q. et al.，Nat.Med.，2：1033-1035(1996)；Nawroz，H.et al.，Nat.Med.，2：1035-1037(1996))。对于病毒相关癌症，可在患者血清和血浆中检测到细胞外肿瘤相关病毒的DNA(Mutirangura，A.et al.，CancerRes.，4：665-669(1998)；Lo，Y.M.D.et al.，Clin.Cancer Res.59：1188-1191(1999)；Capone，R.B.Clin.Cancer Res.，6：4171-4175(2000))。一种与许多类型的恶性肿瘤相关的重要病毒是鼻咽癌过滤性病毒(EBV)(Cohen，J.I.N.Engl.J.Med.，343：481-492(2000))。鼻咽癌过滤性病毒(EBV)为一种感染大多数人群的人类疱疹病毒。EBV经常通过唾液传播，并在B淋巴细胞中产生潜伏感染，且在该细胞中持续宿主的终生。因此，在患有鼻咽癌(NPC)(Mutirangura，A.et al.，Cancer Res.，4：665-669(1998)；Lo，Y.M.D.etal.，Clin.Cancer Res.，59：1188-1191(1999))和某种淋巴恶性肿瘤(Lei，K.I.et al.，Br.J.Haematol.，111：239-246(2000)；Drouet，E.et al.，J.Med.Virol.，57：383-389(1999)；Gallagher，A.et al.，Int.J.Cancer，84：442-448(1999))的患者血浆和血清中已检测到循环的EBV DNA。
据报道，EBV感染还与一定比例的胃癌相关(Shibata，D.et al.，Am.J.Pathol.，140：769-774(1992))。在香港，发现大约10％的胃癌病例与EBV感染有关(Yuen，S.T.et al.，Am.J.Surg.Pathol.，18：1158-1163(1994))。
本发明提供了一种检测患者血清中的EBV DNA的方法。如果通过该方法检测到了EBV DNA而临床上没有发现癌症，则采取另一个步骤来确定具有单一核苷酸多态性的不同EBV亚型。具有良性亚型的患者将不大可能发展成为EBV相关癌症，而那些具有更多癌EBV亚型的患者，则更可能以后发展成为上述癌症。
发明概要
第一方面，本发明特征描述了诊断、检测、监测和确定患者除脑瘤，颈瘤和淋巴恶性肿瘤之外的EBV相关癌症的预后方法。该方法特征描述了对这种患者血清或血浆中存在的鼻咽癌过滤性病毒DNA(EBV DNA)的量的检测或确定。因此，本发明在临床药物学方面，特别是EBV潜伏感染发生超过90％的人群中具有广泛的应用。
本发明所述的方法还适用于诊断、检测、监测和确定包括淋巴瘤在内的任何EBV相关癌症的预后。
本发明所述的方法，通常包括如下步骤：(1)从患者中抽取血液样品，(2)从血液样品中提取DNA，(3)测量血液样品中存在的循环EBV DNA的量，和(4)将血液样品中存在的循环EBV DNA的量与对照相比较。
优选地，所述血液样品为无细胞液体样品。所谓的无细胞是指该样品既可以是通过从残留液中凝集和分离而使细胞得到抽提的血清，还可以是通过抑制凝集和离心而得到的液体部分(血浆)。测量液体部分的EBVDNA，当在无细胞样品的液体中发现EBV时，则意味着感染被活化且感染的细胞释放EBV。
第二方面，本发明特征描述了用于检测将EBV分为恶性和良性亚型的已知多态性的基因型测试。
第三方面，本发明特征描述了用于检测患者血清或血浆中的EBVDNA和EBV亚型的含有合适试剂的诊断试剂盒。本发明所述的试剂盒还可以包括一种或多种用于从患者中抽取血液样品的装置，一种从血液样品中分离EBV DNA的设备，和一种定量测定血液样品中存在的EBVDNA的量的设备。该试剂盒用于诊断、检测、监测和确定包括淋巴瘤在内的EBV相关癌症的预后。
附图说明
图1：Zp(inε)，即鼻咽癌过滤性病毒BZLF1基因的启动子图表。如Gutierrez等所述的，不同多态性分别表示为Zp-V3(in*)和Zp-V4(in#)，Zp-P和Zp-V3(恶性肿瘤亚型)和Zp-V4(良性肿瘤亚型)。
发明的详细描述
本发明特征描述了预测、诊断、检测、监测和确定患者EBV相关癌症的预后方法。该方法特征描述了对这种患者血清中存在的EBV DNA的量的检测或确定，如果呈阳性，则有另一种方法确定这些患者的EBV亚型的癌发生潜能。由于EBV潜伏感染普遍和广泛地发生，因此本发明所述的方法在临床药物学方面有广泛的应用性。在一些人群中，超过90％的人具有这种EBV潜伏感染。
临床上，与在鼻咽癌中的应用类似，循环EBV DNA用于诊断和监测具有EBER-阳性肿瘤的胃癌患者(Lo，Y.M.D.et al，Clin.Cancer Res.，59：1188-1191(1999)；Lo，Y.M.D.et al.，Cancer Res.，59：5452-5455(1999))and certain lymphomas(Lei，K.I.et al.，Br.J.Haematol.，111：239-246(2000)；Drouet，E.et al.，J.Med.Virol.，57：383-389(1999)；Gallagher，A.etal.，Int.J.Cancer，84：442-448(1999))。最近，循环EBV DNA对鼻咽癌预后的重要意义的例子(Lo，Y.M.D.et al.，Cancer Res.，60：6878-6881)表明测量EBV DNA对胃癌也具有预后意义。
本发明所述的方法还适用于检测、监测和确定除了那些也与EBV相关的脑瘤、颈瘤和淋巴恶性肿瘤以外的EBV相关癌症的预后。以前已经表明这些肿瘤中的一些与EBV感染有关(Bonnet et al.，J Natl Cancer Inst.91：1376-81(1999))，如某些肝癌(Sugawara et al.，Virology.256：196-202(1999))。
任何常规的DNA扩增或信号扩增方法都可以用于检测EBV DNA。在大多数情况下，可以采用本领域公知的任何几种核酸扩增方法来扩增靶序列。具体地，核酸扩增是含有互补于待扩增序列的序列的核酸扩增子(拷贝)的酶合成。本领域常用的核酸扩增程序的例子包括聚合酶链反应(PCR)、链置换扩增(SDA)、连接酶链反应(LCR)和转录相关扩增(TAA)。当样品中含有的靶序列的量非常低时，核酸扩增尤为有效。由于在检测开始时只需要较少的靶序列，通过扩增靶序列和检测扩增子的合成，检测的灵敏度可以得到极大提高，从而更好地确保了来源于组织或目标病毒的样品中的核苷酸检测。
核酸扩增的方法详细的记载于文献中。例如，PCR扩增由Mullis等描述于美国专利No.4683195，4683202和4800159和Methods inEnzymology，155：335-350(1987)中。SDA的例子可以在Walker，PCRMethods and Applications，3：25-30(1993)，Walker等，Nucleic Acids Res.，20：1691-1996(1992)和Proc.Natl.Acad.Sci.，89：392-396(1991)中找到。美国专利No.5427930和5686272中记载了LCR。不同的TAA形式在出版物中有记载，如Burg等的美国专利No.5437990，Kacian等的美国专利No.5399491和5554516以及Gingeras等的国际申请PCT/US87/01966、国际公开WO 88/01302、国际申请PCT/US88/02108和国际公开WO88/10315。
实时定量PCR是监测EBV DNA的优选方法，其是基于对荧光PCR反应过程的连续光学监测(Heide et al.Genome Res.6：986-694，1996和Loet al.Am J.Hum.Genet.62：768-775，1998)。在该系统中，除了常规PCR中所用的两个扩增引物外，还包括一种双重标记的荧光杂交探针(Livak，etal.PCR Methods Appl.，4357-362，1995)。用一种荧光染料作为报告基团(FAM)，其发射光谱被另一种荧光染料(TAMRA)淬灭。在PCR的延伸阶段，Taq DNA聚合酶(9)的5’到3’的外切酶活性将报告基团从探针上切除，从而将其从淬灭基团中释放，于是增强了518nm处的荧光发射强度。
本发明所述的方法通常包括如下步骤：(1)从患者中抽取血液样品，(2)从血液样品中提取DNA，(3)测量血液样品中存在的循环EBV DNA的量，和(4)将血液样品中存在的循环EBV DNA的量与对照相比较。优选地，将血液样品离心，取液体部分，检测液体部分的EBV DNA。
本领域的普通技术人员应当理解，可以采用本领域公知的各种方法从血样中提取DNA。一种优选的方法是用QIAamp Blood试剂盒。同时，循环EBV DNA的量也可以采用众多已知的或新的方法中的一种来测定。特别优选的是包含实时PCR扩增系统的方案。可以很容易地设计出标准步骤以将检测的EBV DNA水平与对照相比较，从而统计地评估所获值的意义。
EBV DNA拷贝的数目可以根据时间推移和相关疾病的发展或衰退来测定。因此，本发明提供了一种能很好地检测EBV相关癌症预后的非介入性方法。
另一方面，由于EBV裂解性再活化的频繁发生和慢性EBV携带者的转化，所以可以在相当百分比的非癌症患者人群中观察到EBV DNA水平。在本专利要求的优先权中引用的我们的研究中，有3.6％的正常人群在任意一时间点血清或血浆中的EBV DNA呈阳性。但幸运的是，大多数病例，尤其是那些EBV DNA拷贝少于500拷贝/ml的病例都实质上为良性源。经过一两周之后，这些良性病例中的EBV DNA水平将降为零，这标志着裂解性再活化或慢性再感染终止。然而，这种EBV的再活化和其导致的抗EBV衣壳抗原的IgA抗体水平和抗EBV DNA酶的中和抗体水平的升高成为台湾人群鼻咽癌的预测指标(Chien YC，Serologic markers ofEBV infection and nasopharyngeal carcinoma in Taiwanese men，N EnglandJ Med，Vol 345 no26 Dec 27，2001)。总的来说，这种低水平的EBV DNA感染很常见且患者很显然急于知道其致癌潜能。实质上，我们的血清或血浆EBV DNA测试不仅对检测或监测癌症，如鼻咽癌十分灵敏和有用，对发现如此大的人群比例实际携带了EBV和EBV非常频繁地再活化也起到了部分的作用。本发明将这种极高的灵敏度转化为一种有用的工具，从而可以一次或全部地检测这些频繁EBV再活化者的致癌潜能。
第二方面，本发明特征描述了能检测具有不同致癌潜能的不同EBV亚型的基因型方法。一种已公开的方法和基因型显示，EBV裂解性调控基因的BZLF1启动子区域的调节序列的多态性在良性细胞和恶性细胞中具有不同的分布。检测到三种多态Zp序列。在恶性肿瘤的样品中，全部的52个样品显示出的多态性不是Zp-P序列(EBV B95.8病毒株一致)就是Zp-V3序列。对于良性肿瘤样品，全部的52个样品均显示出Zp-V4多态性(Gutierrez，Discrete alterations in the BZLF1 promoter in tumor and nontumor associated EBV，J of the National Cancer Institute，Vol 94，no 23December 4 2002)。
第三方面包括用于检测患者血清或血浆EBV DNA和多态性亚型的含有合适试剂的诊断试剂盒。本发明所述的试剂盒还包括一种或多种用于从患者中抽取血液样品的装置，一种从血液样品中分离EBV DNA的设备和一种定量测定血液样品中出现的EBV DNA的量的设备。该试剂盒用于诊断、检测、监测和确定EBV相关癌症的预后。
如同每一单独的文献或专利申请被特定、单独地引为参考一样，本说明书所引用的全部文献和专利申请在此也都引作参考。
虽然为了清楚理解的目的，上述发明通过例证和实施例作了进一步详细描述，但是本领域的普通技术人员应当很容易理解，在本发明的教导下，在不偏离所附权利要求的主旨和范围的情况下可以对本发明作特定的改进和修饰。
                             实施例
下述的实施例仅仅作为例证，对本发明不产生任何限制。本领域普通技术人员很容易识别那些可以被改变或修饰而产生实质上相似结果的各种非关键参数。
实施例1
材料和方法
检测血浆样品中的EBV DNA征募患有已知EBV相关癌症，如鼻咽癌的患者。还征募健康个体作为EBV良性携带者的对照和检测血清或血浆中EBV DNA的对照以及根据多态性判断EBV亚型的对照。
采用如下步骤从血浆样品中提取DNA。从每一对象中收集外周血(5ml)置于EDTA试管中以分离血浆。1600×g离心血液样品，从含有EDTA的试管中小心地移出血浆，转移到平底聚丙烯试管中。样品保存于-20℃用于下一步处理。采用QIAamp Blood试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)，按照制造商(2)推荐的血液和体液提取方案从血浆样品中提取DNA。用血浆样品(130-800μl/柱)提取DNA。记录提取的量用于计算目标DNA的浓度。提取柱采用的最终洗脱体积为50μl。
采用实时定量PCR系统扩增EBV基因组的BamHI-W片段区域来测量循环EBV DNA的浓度(Lo，Y.M.D.et al.，Cancer Res.，59：1188-1191(1999))。实时定量PCR的原理和反应设置步骤见以前文献所述(Lo，Y.M.D.et al.，Cancer Res.，59：1188-1191(1999))。用ABI Prism 7700序列检测仪来收集数据，并用由Applied Biosystems开发的序列检测系统软件(版本1.6.3)来分析数据。结果表现为每毫升血清中EBV基因组的拷贝数。
所有的血清DNA样品也都针对β-球蛋白基因进行实时PCR分析(Lo，Y.M.D.et al.，Cancer Res.，59：1188-1191(1999))，如果全部测试的样品都显示阳性信号，那么就显示出了提取的DNA的量。在每一次分析中均包括多个阴性水空白对照。
更具体地，采用两个实时定量PCR系统以检测EBV DNA：(a)一个用于扩增BamHI-W区域；(b)另一个用于扩增EBNA-I区域(Baer，et al.Nature，310：207-211，1984)。BamHI-W扩增系统包括扩增引物(SEQ IDNO：1)W-44F(5’-CCCAACACTCCACCACACC-3’)和(SEQ ID NO：2)W-119R(5’-TCTTAGGAGCTGTCCGAGGG-3’)以及双标记的荧光探针(SEQ ID NO：3)W-67T(5’-FAM)CACACACTACACACACCCACCCGTCTC(TAMRA)-3’]。EBNA-1系统包括扩增引物(SEQ ID NO：4)EBNA-1162F(5’-TCATCATCATCCGGGTCTCC-3’)和(SEQ ID NO：5)EBNA-1229R(5’-CCTACAGGGT-GGAAAAATGGC-3’)，以及双标记的荧光探针(SEQID NO：6)EBNA-1186T[5’-(FAM)CGCAGGCCCCCTCCAGGTA-GAA(TAMRA)-3’]。上述荧光探针含有3’-封闭磷酸基团以防止其在PCR过程中延伸。采用Primer Express软件(Perkin-Elmer Corp.，Foster City，CA)来设计引物/探针组合。从GenBank序列数据库中获得EBV基因组序列资料(登录号V01555)。如前文Lo，et al.Am J.Hum Genet 62：768-775，1998所述，针对β-球蛋白基因的实时定量PCR也包括引物和探针，且用作血浆DNA扩增的对照。
荧光PCR反应采用TaqMan PCR核心试剂盒(Perkin-Elmer Corp.)提供的组分(除荧光探针和扩增引物外)在50μl反应体积中完成。采用Perkin-Elmer Applied Biosystems自我合成荧光探针。PCR探针由LifeTechnologies，Inc.(Gaithersburg，MD)合成。每一反应体系含有：5μl的10×缓冲液A；扩增引物各300nM；25nM(EBV探针)或100nM(β-球蛋白探针)的相应荧光探针；4MM MgCl2；dATP、dCTP、dGTP各200μm；400μM的dUTP；1.25单位的AmpliTaq Gold；和0.5单位的AmpErase脲嘧啶N-糖基化酶。
DNA扩增反应在适合于Perkin-Elmer Applied Biosystems 7700序列检测仪的96孔板上进行。每一样品进行两次相同分析。每一次分析中均包括多个阴性水空白对照。
采用从EBV阳性细胞系Namalwa(American Type Culture CollectionCRL-1432；See Klein et al.，Int J.Cancer，10：44-57，1972)中提取的DNA作为标准对照，对每一次分析均作平行重复的标准曲线。Namalwa为一含有两个整合病毒基因组/细胞的两倍体细胞系。6.6pg DNA/两倍体细胞的转换系数用于计算拷贝数(Saiki et al.，Science，239：487-491，1988)。用EBV基因组的拷贝数/ml血浆表示循环的无细胞EBV DNA的浓度。
在EBV BamHI-W和EBNA-IPCR系统中采用相同的热反应模式。热反应开始时，在50℃下温育2分钟使脲嘧啶N-糖基化酶活化，接着95℃，10分钟起始变性，随后进行95℃，15秒和56℃，1分钟的40个循环。
用7700序列检测仪收集的扩增数据，将这些数据存储于Macintosh计算机中(Apple Computer，Cupertino，CA)，并采用Perkin-Elmer AppliedBiosystems开发的序列检测系统软件对其进行分析。每一重复的平均数量用作下一步的浓度计算。采用下述等式来计算EBV DNA的血浆浓度或β-球蛋白基因(表达为拷贝/毫升)：
C = Q × V DNA V PCR × 1 V ext
其中，C代表血浆中的靶目标浓度(拷贝/ml)，Q代表通过PCR中的序列检测仪确定的靶目标的数量(拷贝)，VDNA代表提取后获得的DNA总体积(典型的为50μl/Qiagen提取物)，VPCR代表用于PCR的DNA溶液的总体积(典型的为5μl)，同时Vest代表提取的血浆/血清的体积(典型的为0.13-0.80ml)。
如同在先公开的文献(Hui，P.K.et al.，Hum.Pathol..25：947-952(1994))所述，利用与荧光素结合的EBER寡核苷酸探针(Novocastra，U.K.)在石蜡包埋的组织切片上进行原位杂交来检测EBB在肿瘤细胞中的存在。
EBV亚型检测如上文所述，可以从无细胞血浆中分离患者样品的DNA。这些DNA样品还可以通过经蛋白酶K消化后，采用标准的酚/氯仿提取技术从淋巴细胞外周血中分离。此外，该DNA样品还可以从EBV肿瘤或再活化位点的疑似部位分离。
我们利用Taq聚合酶的5’核酸酶活性和TaqMan Allelic鉴别试验来检测在PCR反应中或之后产生的荧光报告基团信号。为了确定EBV的基因型，采用了一对TaqMan探针和一对PCR引物。试验中采用了多态位点不同的两个TaqMan探针，其中一个探针与野生型等位基因互补，另一个与变异等位基因互补。一5’报告基团染料和一3’淬灭基团染料与野生型或变异的等位基因探针共价连接。当探针完整时，由于报告基团和淬灭基团的染料位置接近，因而使荧光熄灭。在PCR变性步骤中，TaqMan探针与目标多肽位点杂交。在PCR延伸阶段，Taq聚合酶的5’核酸酶活性将报告基团染料切下，从而导致了报告基团染料的特征荧光增加。通过测定PCR反应后两个不同报告基团染料的信号强度来确定特定的基因型。TaqMan基因型测试设备和试剂由Applied Biosystems提供。
基于200-nt Zp BZLF1启动子区域检测的EBV亚型多态性列于下表(如图1所示)：
(1)Zp-P(原型)与EBV病毒株B95-8一致。
(2)Zp-V3在3个位点发生变化：
(a)位点-141的A变为G；
(b)位点-106的A变为G；
(c)位点-100的T变为G。
(3)Zp-V4：含有Zp-V3的全部序列，且加上第4个取代，
即位点-196的T变为C。
鼻咽癌(NPC)患者样品中V3(恶性)与P(良性)状况比较的临床结果
BZLF1实时PCR反应混合物
Vp-P＝FAM
Vp-V3＝VIC
试剂 体积(30μl)
10x缓冲液A25mM Mg2+dNTPBZLF1(正向引物)BZLF1(反向引物)BZLF1-探针PBZLF1-探针V3UNGTaq goldH2O 3.004.502.501.001.000.400.400.300.1511.85
总计： 25.00
25μl主要混合物+5μl DNA样品
BZLF1实时PCR条件
50℃                           2分钟
95℃                           5分钟
Figure A20041007097600141
                                            ×45循环
60℃                           1分钟
患者编号 EBV DNA(拷贝/ml血浆) NPC ？NPC EB肿瘤(V3或P) 附加临床信息
375 101-1000 X P
405 195 X P
709 34 X P NPC(新病例)
837 1174 X P
931 1279 X P
1024 605 X P
256 2273312 X V3 转移性NPC
262 127971 X V3
331 ＜100 X V3 NPC复发
348 22250 X V3
350 1050 X V3
377 33925 X V3
399 101-1000 X V3 同时呈宫颈LN阳性
404 304 X V3
408 295 X V3
427 106 X V3 具有已知继发性骨和肺的NPC后RT
447 3000 X V3
735 59 X V3 转移性NPC
785 13631 X V3 转移性NPC
790 43 X V3
858 778 X V3
960 944 X V3
991 4650 X V3
1003 101-1000 X V3
1025 5131 X V3
TH589 25 X V3
患者编号。 EBV DNA(拷贝/ml血浆) 正常 EB肿瘤结果 (V3或P)
622 0 X 待定
623 0 X 待定
624 0 X 待定
625 0 X 待定
626 0 X 待定
627 0 X 待定
628 0 X 待定
629 0 X 待定
634 0 X 待定
635 0 X 待定
980 0 X 待定
981 0 X 待定
982 0 X 待定
1033 0 X 待定
1034 0 X 待定
1035 0 X 待定
TH39 0 X 待定
TH355 0 X 待定
TH516 0 X 待定
TH663 0 X 待定
TH836 0 X 待定
TH1142 0 X 待定
TH1164 0 X 待定
结论
上述临床研究表明，26名患有NPC和可能患有NPC(无病理学证实)的患者中，有20名患者携带有更恶性的V3亚型(对中国人群，V3为主要的恶性亚型)，占NPC总人数的77％。如果将可能患有NPC的病例从研究中剔除，V3亚型所占的百分比仍保持相同，即77％(22名患者中的17名)。对于血液中无EBV DNA循环的正常个体来说，没有检测到V3或P。该初步研究表明，EBV DNA的V3亚型的联合或单一血液测试可以作为一个有力工具来评估血液呈EBV DNA滴度阳性的患者的可能癌变。
可选择地，可以采用其他能够分辨出单个碱基的方法来检测EBV亚型，这些方法包括，但不限于单链构象多态性，TaqMan Allelic鉴别试验、PCR限制性片段长度多态性分析、寡核苷酸链接基因型分析、微型测序、荧光共振能量转移检测、侵入试验、等位基因特异连接、PCR产物的大量光谱分析，连接酶链反应。下文的方案阐述了单链构象多态性分析的应用。来源于全部肿瘤和非肿瘤样品的500纳克的基因组DNA直接用作聚合酶链反应(PCR)的模板。PCR用于扩增BZLF1启动子(EBV基因组上103420-103182位的核苷酸，Genbank登录号No.NC_001345)-221至+12位(包括转录起始位点)的核苷酸片段。此扩增所采用的引物为5’-agcatgccatgcatatttc-3’和5’-ttggcaaggtgcaatgttt-3’。PCR条件为95℃，5分钟，30个循环的95℃，30秒，60℃，30秒，和72℃，1分钟，随后在72℃延长10分钟。PCR反应缓冲液中含有[32P]dCTP。PCR产物通过在含有10％甘油的6％非变性丙稀酰胺凝胶上(19∶1，丙稀酰胺∶甲叉双丙稀酰胺(bis))，6W功率下电泳18小时，放射自显影显色后分离得到。方式自显影照片曝光2-16小时。通过PCR产物迁移图案的差异，显现出单链构象多态性(SSCPs)。来自于EBV病毒株B95.8的扩增产物作为参考对照。上述方案表明，与临床研究中所阐述的V3和P一样从血样中同样可以发现和检测出其他致癌亚型。
中国人群中的NPC患者的EBV样品表明：Zp-V3亚型可以用于诊断癌症患者，与携带有Zp-P亚型的患者相比，携带有Zp-V3亚型的患者更可能患癌症。
结果
我们过去发表的文章的结果表明，当EBV DNA拷贝浓度超过500拷贝/ml时，鼻咽癌检测具有96％的灵敏度和93％的特异性。在健康对照中，有3.6％显示出EBV DNA滴度阳性，但其中的大部分在500拷贝/ml以下。本发明可进一步预测在3.6％的健康人群中，究竟有多少实质上携带有与EBV相关癌症发展最大可能相关的EBV亚型。对患者更仔细的检查和详细的跟踪使EBV相关癌症的早期诊断成为可能，因而可以预期达到治愈癌症的目的。
讨论
临床上，与在NPC(Lo，Y.M.D.et al.，Cancer Res.，59：1188-1191(1999)；Lo，Y.M.D.et al.，Cancer Res.，59：5452-5455(1999))和在某些淋巴瘤(Lei，K.I.et al.，Br.J. Haematol.，111：239-246(2000)；Drouet，E，et al.，J.Med.Virol.57：383-389(1999)；Gallagher，A.et al.，Int.J.Cancer，84：442-448(1999))中的应用相类似，循环EBV DNA可用于诊断和监测具有EBER阳性肿瘤的胃癌患者的比例。近来，已经证实了循环EBV DNA在鼻咽癌预后中的价值。其它的资料(Lo，Y.M.D.et al.，Cancer Res.，60：6878-6881)表明EBV DNA检测对胃癌也具有预后价值。
然而，经诊断有大量的患者具有低EBV DNA水平和慢性的或频繁的EBV再活化，而并没有可见的癌症迹象或症状。由于EBV具有已知的致癌潜能以及实际上癌症在这些患者中更流行，因此对这类患者的处理和跟踪还远不令人满意。
Gutierrez(JNCI，94 no23 Dec 4th 2002)公开了一种检测多态性或其他遗传型异常的方法。她的出版物中揭示了可将EBV裂解基因BZLF1的启动子区域分为3个亚型，其多态性可通过PCR单链构象多态性检测。所有的癌症样品均属于Zp-P和Zp-V3两个亚型。然而，在中国人群中，相对于Zp-P来说，Zp-V3为主要的恶性肿瘤亚型，而没有发现Zp-V4亚型。
本发明所述的非常灵敏的方法可用于检测一组个体中的无细胞血浆EBV DNA，其中的个体仅具有明显的良性疾病，例如上呼吸道和胃炎中的裂解性再活化的。他们通常具有低于500拷贝/m1的EBV DNA，同时详细的检查显示不存在已知的恶性肿瘤。在确定的EBV多态性和亚型的检测中结合本发明的第二部分将有助于进一步明确对该组个体的处理。具有恶性肿瘤亚型的一组个体须进行常规的跟踪和频繁的EBV DNA水平测试。另一组具有良性肿瘤亚型的个体则可缓解其焦虑，同时在需要的基础上进行跟踪。
资料还表明，循环EBV DNA还可用于许多其他的与EBV相关的癌症类型。这类癌症的例子包括乳腺癌(Bonnet，M.et al.，J. Natl.Cancer Inst.，91：1376-1381(1999))和肝细胞癌Sugawara，Y.et al.，Virology，256：196-202(1999))。由于许多肿瘤类型与EBV的关系仍处于争论之中，因此这种肿瘤患者的血清中的EBV DNA可能性检测和致癌亚型检测将有助于解决上述争论。
                     序列表
<110>杨华显 卢煜明
<120>一种预测和检测鼻咽癌过滤性病毒相关癌症的方法
<140>US 10/455,041
<141>2003-08-08
<160>6
<170>Patent Version3.1
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>BamHI-W系统扩增引物W-44F
<400>1
cccaacactc caccacacc                                                19
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>BamHI-W系统扩增引物W-119R
<400>2
tcttaggagc tgtccgaggg                                                20
<210>3
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>BamHI-W系统双标记荧光探针W-67T
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)…(1)
<223>n＝FAM-标记c
<220>
<221>misc_feature
<222>(27)…(27)
<223>n＝TAFAM-标记c
<400>3
nacacactac acacacccac ccgtctn                                    27
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>EBNA-1系统扩增引物EBNA-1162F
<400>4
tcatcatcat ccgggtctcc                                                20
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>EBNA-1系统扩增引物EBNA-1229R
<400>5
cctacagggt ggaaaaatgg c                                              21
<210>6
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>EBNA-1系统双标记荧光探针EBNA-1186T
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)…(1)
<223>n＝FAM-标记c
<220>
<221>misc_feature
<222>(22)…(22)
<223>n＝TAFAM-标记c
<400>6
ngcaggcccc ctccaggtag an                                               22
SEQ ID Listing
(SEQ ID NO：1)W-44F(5′-CCCAACACTCCACCACACC-3′)
(SEQ ID NO：2)W-119R(5′-TCTTAGGAGCTGTCCGAGGG-3＇)
(SEQ ID NO：3)W-67T
[5′-FAM)CACACACTACACACACCCAC-CCGTCTC(TAMRA)-3′]
(SEQ ID NO：4)EBNA-1162F(5′-TCATCATCATCCGGGTCTCC-3′)
(SEQ ID NO：5)EBNA-1229R(5′-CCTACAGGGT-GGAAAAATGGC-3′)
(SEQ ID NO：6)EBNA-1186T
[5′-(FAM)CGCAGGCCCCCTCCAGGTA-GAA(TAMRA)-3′]

Claims (11)

1、一种确定血液中存在鼻咽癌过滤性病毒(EBV)DNA的患者患病可能性的方法，该方法包括：
检测血浆或血清中的EBV多态性，根据该多态性鉴别EBV亚型。
2、根据权利要求1所述的方法，该方法在检测EBV多态性之前还包括检测血浆或血清中EBV DNA的量的步骤。
3、根据权利要求1或2所述的方法，其中所述的检测EBV多态性的方法包括：TaqMan Allelic鉴别试验、单链构象多态性分析、PCR限制性片段长度多态性分析、寡核苷酸链接基因型分析、微型测序、荧光共振能量转移检测、侵入试验和等位基因特异连接。
4、根据权利要求3的方法，其中所述的检测EBV多态性的方法是单链构象多态性分析。
5、根据权利要求2的方法，其中检测血浆或血清中EBV DNA的量的方法包括：聚合酶链反应(PCR)、链置换扩增(SDA)、连接酶链反应(LCR)和转录相关扩增(TAA)。
6、根据权利要求5所述的方法，其中检测血浆或血清中EBV DNA的量的方法是实时定量PCR。
7、一种诊断、检测、监测和确定患者鼻咽癌过滤性病毒相关癌症的预后的方法，该方法包括检测患者血清或血浆中存在的EBV DNA和EBV亚型的步骤。
8、根据权利要求所述7的方法，该方法包括如下步骤：
(1)从患者血液样品中分离液体部分；
(2)从液体部分中提取DNA；
(3)测量存在于液体部分的循环EBV DNA的量；和
(4)检测液体部分中的EBV多态性，根据该多态性鉴别EBV亚型。
9、根据权利要求8所述的方法，该方法还包括如下步骤：
(5)将液体部分存在的循环EBV DNA的量与对照相比较，
(6)在经鉴别后，将EBV亚型与那些通常被定义为恶性或良性的亚型相比较。
10、一种检测血液中EBV DNA增加的患者患病可能性增加而预后和诊断鼻咽癌过滤性病毒相关癌症的试剂盒，所述试剂盒包括：
(a)核酸，用于检测患病患者血液中鼻咽癌过滤性病毒；
(b)说明书，记载使用该核酸来确定鼻咽癌过滤性病毒的存在与否的方法，和如果证实具有EBV亚型则患者患鼻咽癌过滤性病毒相关癌症可能性增加的解释；和
(c)TaqMan探针和PCR引物，其中两个TaqMan中的一个互补于良性肿瘤的等位基因，另一个互补于恶性肿瘤的等位基因。
11、根据权利要求10所述的诊断试剂盒，其包括从血液样品或从其他样品中分离EBV DNA的装置。
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