RU2673546C1 - Способ получения иммуноглобулина против лихорадки эбола из сыворотки крови лошадей, жидкого - Google Patents
Способ получения иммуноглобулина против лихорадки эбола из сыворотки крови лошадей, жидкого Download PDFInfo
- Publication number
- RU2673546C1 RU2673546C1 RU2017128630A RU2017128630A RU2673546C1 RU 2673546 C1 RU2673546 C1 RU 2673546C1 RU 2017128630 A RU2017128630 A RU 2017128630A RU 2017128630 A RU2017128630 A RU 2017128630A RU 2673546 C1 RU2673546 C1 RU 2673546C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- immunoglobulin
- ebola
- concentration
- flow rate
- solution
- Prior art date
Links
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 title claims abstract description 72
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 title claims abstract description 72
- 201000011001 Ebola Hemorrhagic Fever Diseases 0.000 title claims abstract description 37
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 title claims abstract description 23
- 239000007788 liquid Substances 0.000 title claims description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 12
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 title description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 21
- 241001115402 Ebolavirus Species 0.000 claims abstract description 12
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 claims abstract description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 8
- 241000283086 Equidae Species 0.000 claims abstract description 7
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims abstract description 7
- YBPUBXQZBUQACE-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;phosphoric acid Chemical compound NCC(O)=O.OP(O)(O)=O YBPUBXQZBUQACE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 claims abstract description 6
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 claims abstract description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims abstract description 3
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims abstract description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 claims description 12
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 11
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 11
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 11
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 11
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 claims description 3
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 claims description 3
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 claims description 3
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 claims description 2
- 241000393993 Aphia Species 0.000 claims 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 claims 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 27
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 20
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 20
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 15
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 abstract description 14
- 239000000539 dimer Substances 0.000 abstract description 11
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 abstract description 11
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 abstract description 10
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 6
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 6
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 6
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 5
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 4
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 4
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 3
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 3
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 3
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 2
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000036783 anaphylactic response Effects 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 230000002498 deadly effect Effects 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 102000002572 Alpha-Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010068307 Alpha-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 102000006734 Beta-Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010087504 Beta-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 206010011416 Croup infectious Diseases 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010024769 Local reaction Diseases 0.000 description 1
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 1
- 102000005686 Serum Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010045362 Serum Globulins Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 201000010549 croup Diseases 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/42—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum viral
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/18—Ion-exchange chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Virology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к разработке технологий производства защитных иммунобиологических препаратов, и касается получения иммуноглобулина Эбола из сыворотки крови лошадей, иммунизированных вирусом Эбола, методом спиртового осаждения по Кону. Сущность изобретения заключается в том, что способ получения гетерологичного иммуноглобулина против лихорадки Эбола включает дополнительные стадии очистки и концентрирования препарата с использованием методов ионообменной и гельфильтрационной хроматографии, иммуноглобулина против лихорадки Эбола, включающие ионообменную хроматографию на колонке BPG 140/500 GE Health care с QSepharose FF при температуре 20°С и скорости подачи образца 350 мл/мин с последующей градиентной элюцией фракции Ig G от 0 до 100% буферным раствором с рН 8,0, содержащим 0,02 моль/л трис (гидрокси-метил)аминометана и 1 моль/л NaCl при той же скорости в течение 80 минут; гель-фильтрационную хроматографию на колонке BPG 140/950 GE Health care с сорбентом 40 SEC, уравновешенной фосфатно-глициновым буферным раствором с рН 6,9, содержащим 0,02 М фосфата натрия с 2% глицина, при скорости потока 100 мл/мин в изократическом режиме элюирования при той же скорости; концентрирование и стерилизующую фильтрацию раствора иммуноглобулина на автоматической системе фильтрации и концентрирования в тангенциальном потоке «Владисарт» через кассеты с пределом эксклюзии 100 кДа при скорости потока 500 мл/мин, входном давлении не более 2 бар и выходном давлении не более 1 бар. Технический результат заключается в том, что разработанный способ обеспечивает получение иммуноглобулина против лихорадки Эбола из сыворотки крови лошадей с более высоким содержанием мономерной фракции иммуноглобулина (не менее 95%) и меньшим количеством посторонних фракций димеров, полимеров и агрегатов (не более 5%), а также отсутствием остаточного этилового спирта, что снижает анафилактогенность иммуноглобулина и приводит качество препарата в соответствие с требованиями Европейской Фармакопеи к гетерологичным препаратам. 2 табл., 1 пр., 2 ил.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к разработке технологий производства защитных иммунобиологических препаратов, в частности к разработке способа получения специфического средства экстренной профилактики лихорадки Эбола.
Смертельно опасный вирус Эбола - возбудитель одноименной особо опасной лихорадки военные специалисты рассматривают как один из наиболее вероятных биологических поражающих агентов - основы биологического оружия и террора [1-4].
В результате эпидемии лихорадки Эбола в 2014-2015 г.г., унесшей жизни более 11 тысяч человек, было инфицировано более 26 тысяч жителей планеты, а смертельно опасный вирус Эбола, ранее регистрировавшийся только в Африке, проник в Европу и Америку [5]. Эти события в очередной раз подтвердили актуальность разработки средств биологической защиты в отношении возбудителя лихорадки Эбола, в том числе медицинских средств защиты для экстренной профилактики и лечения этой особо опасной инфекции. Одним из путей решения проблемы является разработка и использование гетерологичного иммуноглобулина против лихорадки Эбола [6]. Впервые такой препарат был разработай в Научно-исследовательском институте микробиологии МО РФ [7], зарегистрирован в Государственном Реестре лекарственных средств и разрешен для медицинского применения и промышленного выпуска в РФ (регистрационное удостоверение №96/309/123/8) [8-11].
Иммуноглобулин показал высокую эффективность в экспериментах на животных, были подтверждены его протективные свойства при введении по эпидемическим показаниям людям в качестве средства экстренной профилактики. Однако опыт клинического применения препарата выявил развитие общих реакций у 21% и местных реакций - у 33% пациентов [12], поэтому рекомендации по его применению ограничивались ситуациями, в которых контакт с возбудителем мог быть приравнен к заражению [6, 13, 14]. В настоящее время иммуноглобулин Эбола не входит в список иммунобиологических препаратов, разрешенных для применения в медицинской практике на территории Российской Федерации.
Известен способ получения иммуноглобулина против лихорадки Эбола из сыворотки крови лошадей жидкого (иммуноглобулина Эбола), включающий приготовление антигена из вирулентного штамма вируса Эбола, получение иммунной крови, получение иммунной сыворотки с использованием 30% раствора хлористого кальция, выделение и концентрирование иммуноглобулинов методом осаждения этиловым спиртом на холоду по Кону, стерилизующую фильтрацию, фасовку и упаковку [7, 11]. Данный способ является единственным аналогом (прототипом) предлагаемого изобретения.
Способ обеспечивает получение нетоксичного апирогенного стерильного средства экстренной профилактики лихорадки Эбола со специфической активностью, выражающейся титром вируснейтрализующих антител не ниже 1:4096, содержанием гамма-глобулиновой фракции не ниже 90%, содержанием примесей посторонних белков не более 10% и остаточным количеством этилового спирта не более 4%.
К недостаткам существующего способа следует отнести то, что в получаемом конечном продукте содержится большое количество посторонних белков сыворотки крови (до 10% альбуминов, α - и β- глобулинов) и остаточного количества (до 4%) этилового спирта, повышающих реактогенность препарата [9]. При анализе методом гельфильтрационной ВЭЖХ в препарате выявляют около 88% мономеров, 6% димеров, 3% полимеров и 3% агрегатов, что свидетельствует о низкой чистоте иммуноглобулиновой фракции. В результате препарат обладает анафилактогенностью, характеризующейся индексом анафилаксии по Вейглу 2,5±0,5.
Целью настоящего изобретения является разработка способа получения иммуноглобулина против лихорадки Эбола, обеспечивающего получение конечного продукта с более высокой степенью очистки, что позволит значительно снизить анафилактогенность препарата.
Технический результат предлагаемого изобретения, заключается в том, что разработанный способ обеспечивает получение иммуноглобулина против лихорадки Эбола из сыворотки крови лошадей с более высоким содержанием мономерной фракции иммуноглобулина (не менее 95%) и меньшим количеством посторонних фракций димеров, полимеров и агрегатов (не более 5%), а также отсутствием остаточного этилового спирта, что снижает анафилактогенность иммуноглобулина и приводит качество препарата в соответствие с требованиями Европейской Фармакопеи к гетерологичным препаратам [16].
Указанный технический результат достигается за счет того, что предлагаемый способ содержит дополнительные стадии очистки и концентрирования иммуноглобулина против лихорадки Эбола, включающие ионообменную хроматографию на колонке BPG 140/500 GE Health care с QSe-pharose FF при температуре 20°С и скорости подачи образца 350 мл/мин с последующей градиентной элюцией фракции Ig G от 0 до 100% буферным раствором с рН 8,0, содержащим 0,02 моль/л трис (гидроксиметил)аминометана и 1 моль/л NaCl при той же скорости в течение 80 минут; гель-фильтрационную хроматографию на колонке BPG 140/950 GE Health care с сорбентом 40 SEC, уравновешенной фосфатно-глициновым буферным раствором с рН 6,9, содержащим 0,02 М фосфата натрия с 2% глицина, при скорости потока 100 мл/мин в изократическом режиме элюирования при той же скорости; концентрирование и стерилизующую фильтрацию раствора иммуноглобулина на автоматической системе фильтрации и концентрирования в тангенциальном потоке «Владисарт» через кассеты с пределом эксклюзии 100 кДа при скорости потока 500 мл/мин, входном давлении не более 2 бар и выходном давлении не более 1 бар.
Сущность изобретения заключается в том, что способ получения гетерологичного иммуноглобулина против лихорадки Эбола включает дополнительные стадии очистки и концентрирования препарата с использованием методов ионообменной и гельфильтрационной хроматографии, а также концентрирования раствора иммуноглобулина в тангенциальном потоке через кассеты с пределом эксклюзии 100 кДа. Стадия ионообменной хроматографии позволяет выделить фракции IgG на сорбенте Q Sepharose FF, удалить остатки альбумина, а также фракции эуглобулинов, в которых содержится минимальное количество специфических антител при достаточно большом (до 60 % по массе) содержании белка. На следующем этапе очистки с помощью гельфильтрационной хроматографии отделяют высокомолекулярные фракции димеров и полимеров и низкомолекулярные фрагментарные фракции, которые снижают качество иммуноглобулинов. При элюции иммуноглобулина на хроматографической колонке этиловый спирт уходит в составе раствора.
Новизна изобретения заключается в том, что из технологии получения гетерологичных иммуноглобулинов не известно использование дополнительных операций безаффинной очистки и концентрирования препарата методом ионообменной и гельфильтрационной хроматографии для получения иммуноглобулина против лихорадки Эбола.
Изобретательский уровень предложенного технического решения заключается в том, что из уровня техники явным образом не следует, что использование дополнительных стадий очистки и концентрирования в технологии получения иммуноглобулина против лихорадки Эбола с использованием методов ионообменной и гельфильтрационной хроматографии, а также концентрирования раствора иммуноглобулина в тангенциальном потоке через кассеты с пределом эксклюзии 100 кДа обеспечивает получение более безопасного препарата иммуноглобулина.
Промышленная применимость заключается в возможности использования для реализации заявленного способа получения специфического иммуноглобулина типового биотехнологического оборудования и доступных в микробиологической и фармацевтической промышленности РФ материалов.
Предложенное техническое решение может быть использовано для получения более качественного средства экстренной профилактики особо опасного инфекционного заболевания - лихорадки Эбола для нужд населения и воинских контингентов Российской Федерации.
Пример выполнения
По разработанной технологии приготовлены экспериментально-производственные серии иммуноглобулина лошадиного Эбола очищенного. Приготовление включало следующие стадии.
1. Приготовление антигена
Антиген для иммунизации животных-продуцентов готовили путем инфицирования обезьян вирулентным возбудителем лихорадки Эбола, штамм Заир. Печень погибших животных гомогенизировали, готовили 10 % вируссодержащую суспензию на фосфатно-солевом буфере и центрифугировали ее при 500-700 g в течение 10 минут.Биологическая активность антигена составляла не менее 3,0 lg БОЕ/мл.
Перед иммунизацией антиген контролировали на стерильность и специфическую активность. До момента прохождения контролей разлитый антиген помещали на хранение при температуре от минус 55 до минус 65°С
2. Иммунизация лошадей и получение иммунной сыворотки крови
Иммунизацию животных, получение иммунной крови, приготовление иммунной сыворотки крови и выделение иммуноглобулинов методом осаждения этиловым спиртом проводили согласно технологиям, отработанным для производства иммуноглобулина против лихорадки Эбола из сыворотки крови лошадей жидкого, зарегистрированного в Реестре лекарственных средств России в 1996 году.
Иммунизацию лошадей вирулентным возбудителем лихорадки Эбола проводили после выдерживания их в карантине в течение 45 суток в условиях, предусмотренных для работы с возбудителями I группы патогенности. В целях безопасности (исключения возможности выноса вирулентного возбудителя) животных содержали в зонированных помещениях в течение 7 суток, а затем, после полной дезинфекции кожных покровов и помещения, выводили в «чистую» половину конюшни, где осуществляли все последующие операции по взятию крови.
Грундиммунизацию лошадей проводили путем однократной подкожной инъекции антигена в область шеи. Объем вводимого для грундиммунизации антигена составлял 20 мл. Продолжали иммунизацию не ранее чем через месяц циклами, состоящими из однократной инъекции антигена и последующих кровопусканий. Антиген вводили в область крупа в объеме от 80 до 100 мл внутримышечным способом. В процессе гипериммунизации у животных ежедневно измеряли температуру. При ее повышении выше нормы дальнейших манипуляций с животными не осуществляли до исчезновения данных симптомов.
На 8 сутки после последней иммунизации осуществляли пробное кровопускание для контроля специфической безопасности крови, которую подтверждали по отсутствию негативных колоний через 8-10 суток после внесения пробы цельной сыворотки, полученной путем отстаивания крови, на монослойную культуру GMK-AH-1 (Д), чувствительную к вирусу Эбола, и инкубирования ее при температуре 37°С. Основное кровопускание проводили только после получения результатов контроля на 14-35 сутки после последней иммунизации в несколько приемов. После отстаивания крови в течение 2-3 часов отсасывали плазму светло-желтого цвета.
Иммунную сыворотку получали путем дефибринирования плазмы крови 30% раствором хлористого кальция (1,8 мл раствора на 1 л плазмы) путем энергичного встряхивания в течение 15-30 минут. Дефибринированную плазму оставляли на срок от 18 до 24 часов при комнатной температуре. По истечении указанного срока фибриновые нити и комочки собирались в верхнем, а сыворотка - в нижнем слое жидкости; на дне бутыли оседало небольшое количество
эритроцитов. От 5 лошадей получали 6 партий сыворотки крови объемом около 10 л каждая.
Для фракционирования использовали стерильные свежие сыворотки. Выделение и концентрацию иммуноглобулинов проводили только по окончании контролей специфической активности крови после основного кровопускания.
3. Выделение иммуноглобулина G методом спиртового осаждения на холоду
Выделение и концентрирование иммуноглобулинов из сыворотки крови проводили методом спиртового осаждения при низких температурах по Кону [8]. Схема выделения иммуноглобулинов построена на последовательных изменениях следующих факторов: диэлектрической постоянной раствора, ионной силы, величины рН, концентрации этилового спирта, концентрации белка. Для выделения иммуноглобулинов использовали «Комбинированную установку для фракционирования белков сыворотки крови этанолом на холоду» производства 000 «АРТЛАЙФ ТЕХНО», п. Юрга Кемеровской обл. Собственно фракционирование белков проводили в реакторе с охлаждающим режимом от минус 5° до минус 70 С в асептических условиях путем трех основных и одного дополнительного последовательных осаждений этиловым спиртом.
В результате цикла осаждений получали около 190 г серовато-белого или белого студенистого осадка иммуноглобулинов, который помещали на хранение при температуре минус 20°С на срок не более 1 месяца.
Анализ серий иммуноглобулинов против лихорадки Эбола, полученных по Кону, методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) показал, что содержание общего белка в них находится в диапазоне от 72 до 120 мг/мл, содержание иммуноглобулина G - 82-94%.
4. Очистка методом ионообменной хроматографии и гельфильтрации
Дополнительная очистка включала ряд операций, изложение которых представлено ниже.
Осадки иммуноглобулина после третьего осаждения и дополнительного извлечения иммуноглобулина, каждый в отдельности, растворяли в 0,02 моль/л буферном растворе трис(гидроксиметил)аминометан до конечной концентрации белка 0,9-1,1 мг/мл. Пробы каждого раствора объемом 20 мл отбирали для определения величины рН и фракционного состава методом гельфильтрационной ВЭЖХ. До завершения контроля растворы иммуноглобулина хранили при температуре от 2 до 8°С.
Ионообменную хроматографию раствора иммуноглобулина на колонке BPG 140/500, GE Health Care с сорбентом QSepharose FF проводили при температуре 20°С. Для этого 100 литров раствора белка с помощью насоса подачи образца со скоростью 350 мл/мин подавали на хроматографическую колонку. После нанесения раствора (285 минут) сорбент промывали 6 литрами 0,02 моль/л буферного раствора трис (гидроксиметил)аминометан со скоростью 385 мл/мин (15 минут). Иммуноглобулин элюировали с колонки буферным раствором, содержащим 0,02 моль/л трис(гидроксиметил)аминометан 1 моль/л NaCl, в условиях градиентной элюции от 0 до 100 %. Общий объем градиента составлял около 20 литров. Фракции собирали в бутыли объемом 1 литр. Фракции, содержащие не менее 92 % иммуноглобулина G, объединяли (3,6 литра) и передавали на стадию гельфильтрации.
Для удаления высокомолекулярных примесей полученные после ионообменной хроматографии растворы иммуноглобулинов очищали гельфильтрационной хроматографией. Полуфабрикат иммуноглобулина Эбола подавали на колонку BPG 140/950, GE Health Care с сорбентом 40 SEC, предварительно уравновешенную фосфатно-глициновым буферным раствором, со скоростью потока 100 мл/мин. После нанесения раствора фракции разделяли в изократическом режиме элюирования, подавая 12 литров фосфатно-глицинового буферного раствора при той же скорости потока. Сбор фракций по 400 мл начинали с началом выхода хроматографического пика и продолжали до схода пика. Фракции, содержащие мономер иммуноглобулина, объединяли (3,2 л) и доводили концентрацию белка до нужного значения. Данную операцию повторяли 6 раз ввиду ограничения гельфильтрационной колонки по объему наносимого образца (не более 5 % от объема колонки). Суммарный объем раствора после шести нанесений составил 19,2 л. Количество мономерного иммуноглобулина на стадии - 52,4 г
5. Концентрирование и стерилизующая фильтрация
Концентрирование и стерилизующую фильтрацию раствора иммуноглобулина проводили на автоматической системе фильтрации и концентрирования в тангенциальном потоке «Владисарт», снабженной перистальтическим насосом. Для концентрирования использовали тангенциальные кассеты с пределом эксклюзии 100 кДа, скорости потока 500 мл/мин, входном давлении не более 2 бар и выходном давлении не более 1 бар. Стерилизующую фильтрацию проводили через мембранные кассетные фильтры с размером пор 0,22 мкм.
Таким образом, объем конечного раствора иммуноглобулина после двух хроматографических стадий очистки и стерилизующей фильтрации - 480 мл. Концентрация белка в растворе - 90-110 мг/мл.
Результаты анализа ВЭЖХ иммуноглобулина, очищенного методом хроматографии (фиг. 1) и препарата - прототипа (фиг.2) демонстрируют, что по качественному составу оба продукта не отличаются друг от друга. Однако площади пиков белков - примесей в иммуноглобулине после стадии спиртового осаждения на холоду значительно больше, чем в хроматографически очищенном препарате, что свидетельствует об обоснованности включения в технологию производства иммуноглобулина дополнительной стадии очистки.
Разработанный образец иммуноглобулина против лихорадки Эбола представляет собой мономерную фракцию иммуноглобулина (не менее 95 %) с незначительным содержанием (не более 5 %) димеров, полимеров и агрегатов
После завершения этапов очистки 10 % раствор иммуноглобулина на фосфатно-глициновом буфере подвергали предварительной и стерилизующей фильтрации с помощью установки «Владисарт», состоящей из разборного фильтродержателя АСФ-009 в комплекте с мембранными кассетными фильтрами с размером пор 0,22 мкм и перистальтического насоса.
Стерильный препарат разливали в стеклянные флаконы по 6 мл.
В таблице 1 представлены характеристики полученных серий препарата.
Таблица 1 - Характеристика показателей качества трех серий иммуноглобулина Эбола из сыворотки крови лошадей, жидкого, приготовленного заявляемым методом
| Наименование показателя, ед. измерения |
Требования НТД | Значения показателей | ||
| 02/2015 | 03/2015 | 04/2015 | ||
| Объем серии в дозах | Не менее 100 | 138 | 120 | 170 |
| Описание | Прозрачность или слегка опалесцирующая, бесцветная или светло-желтого цвета жидкость. | Прозрачная бесцветная жидкость | Прозрачная бесцветная жидкость |
Прозрачная бесцветная
жидкость |
| Подлинность | Должен содержать специфические антитела к вирусу Эбола |
Содержит вируснейтрализующие антитела к вирусу Эбола | Содержит вируснейтрализующие антитела к вирусу Эбола | Содержит вируснейтрализующие антитела к вирусу Эбола |
| Прозрачность | Оптическая плотность при длине волны 540 нм не должна быть более 0,05 |
0,003 | 0,004 | 0,005 |
| Цветность | Оптическая плотность препарата при длине волны 400 нм не должна быть более 0,15 | 0,01 | 0,02 | 0,03 |
| pH | От 6,8 до 7,2 | 7,12 | 7,03 | 6,95 |
| Извлекаемый объем | Не менее номинального | Соответствует | Соответствует | Соответствует |
| Белок | От 9 до 11 % | 10,7 | 10,9 | 10,2 |
| Молекулярные параметры | Содержание мономерной фракции иммуноглобулина - не менее 95 %; Содержание димеров, полимеров и агрегатов - не более 5 % |
Мономерная иммуноглобулиновая фракция - 96,9 %;
Димеры, полимеры и агрегаты 3,1 % |
Мономерная иммуноглобулиновая фракция - 97,3 %;
Димеры, полимеры и агрегаты 2,7 % |
Мономерная иммуноглобулиновая фракция - 97,1 %;
Димеры, полимеры и агрегаты - 2,9 % |
| Стерильность | Должен быть стерильным | Стерилен | Стерилен | Стерилен |
| Пирогенность | Должен быть апирогенным | Апирогенен | Апирогенен | Апирогенен |
| Аномальная токсичность | Должен быть нетоксичным | Нетоксичен | Нетоксичен | Нетоксичен |
| Специфическая активность | Титр вируснейтрализующих антител против вируса Эбола (штамм Заир) должен быть не ниже 1:4096 |
1:4096 | 1:8192 | 1:4096 |
Сравнительные характеристики препаратов иммуноглобулина против лихорадки Эбола, полученного предлагаемым способом по сравнению с прототипом представлены в таблице 2.
Таблица 2 - Характеристики иммуноглобулина против лихорадки Эбола из сыворотки крови лошадей, жидкого, полученного предлагаемым способом
| Наименование характеристик их размерность | Численные значения показателей для… | |||
| прототипа | Препарата, полученного заявленным способом | |||
| Содержание мономеров, % | Не менее 88 | Не менее 95 | ||
| Содержание димеров, полимеров и агрегатов % | Не более 12 | Не более 5 | ||
| Содержание этилового спирта, % | Не более 4,0 | отсутствует | ||
| Анафилактогенность, индекс анафилаксии | 2,5±0,5 | 1,5±0,5 | ||
Выводы. Предлагаемый способ позволяет получить экспериментально-производственные серии нетоксичного апирогенного стерильного средства экстренной профилактики лихорадки Эбола, содержащего большее по сравнению с аналогом количество активной мономерной фракции Ig G, меньшее количество димеров, полимеров и агрегатов, не содержащего этиловый спирт. Препарат обладает защитной эффективностью и меньшей анафилактогенностью, что снижает риск развития анафилактических реакций при введении людям.
Библиографические данные
1 Неэндемические и экзотические вирусные инфекции: этиология, диагностика, индикация и профилактика / Под ред. С.В. Борисевича, Е.Н. Храмова, А.Л. Ковтуна. - М.: 2014.
2 Feldmann H., Jones S., Klenk H.D., Schnittler H.J. Ebola virus: From discovery to vaccine / H. Feldmann, S. Jones, H.D. Klenk, H.J. Schnittler // Nat. Rev. Immunol. 2003; 3: 677-685.
3 Baize S., Pannetier D., Oestereich L., Rieger T., Koivogui L. Emergence of Zaire Ebola Virus Disease in Guinea. Preliminary Report : New Engl. J. Med 2014; 1-8.
4 Johnson E., Jaax N., White J., Jarling P. Lethal experimental infections of rhesus monkeys by aerosolized Ebola virus. Int. J.Exp. Pathol. 1995; 76: 227-236.
5 Background document potential Ebola therapies and vaccines / WHO 3 September 2014.
6 Маркин В.А., Михайлов В.В., Краснянский В.П. и др. Разработка принципов экстренной профилактики и лечения лихорадки Эбола. Вопр. вирусол. 1997;1: 31-34.
7 Борисевич И.В., Краснянский В.П., Михайлов В.В. и др. Разработка и изучение свойств иммуноглобулина против лихорадки Эбола. Вопр. вирусол. 1995; 6: 270-273.
8 Государственный Реестр лекарственных средств. М.: Медицина, 1996.
9 Иммуноглобулин против лихорадки Эбола из сыворотки крови лошадей, жидкий: ФСП 42-0102-0242-00, ФС 42-0030-00. Введ. 2000-07-26. М.: Департаментом Государственного контроля качества, эффективности, безопасности лекарственных средств и медицинской техники МЗ РФ, 2000.
10 Инструкция по применению иммуноглобулина против лихорадки Эбола из сыворотки крови лошадей, жидкого. Введ. 2001-03-12. М.: Первым заместителем министра здравоохранения РФ - Главным государственным санитарным врачом РФ, 2001.
11 Пат. 2130318 Российская Федерация, МКИ С.1 Препарат, содержащий иммуноглобулин против лихорадки Эбола, из сыворотки крови лошадей, жидкий (иммуноглобулин Эбола) / В.В.Михайлов, И.В.Борисевич, Г.Д. Тиманькова, В.П. Краснянский, Н.В. Потрываева, Е.В. Лебединская, Н.К. Черникова; заявитель и патентообладатель Вирусологический центр НИИ микробиологии МО: заявка № 96113771, заявл. 05.07.1996; зарегистр. В Гос.реестре изобретений РФ 20.05.1999.
12 Хмелев А.Л., Борисевич С.В., Черникова Н.К. и др. Оценка безопасности профилактического использования иммуноглобулинов против вирусных геморрагических лихорадок из сывороток крови лошадей. Антибиотики и химиотерапия 2012; 6: 103-106.
13 Борисевич И.В., Маркин В.А., Фирсова И.В. и др. Эпидемиология, профилактика, клиника и лечение геморрагических лихорадок. Эпидемиология, профилактика, клиника и лечение геморрагических лихорадок. Вопр. вирусол. 2006; 5: 8-16.
14 Медуницын, Н.В. Вакцинология. М., 2010.
15 Cohn E.J., Strong L., Hugnes W.L. et al. Amer. Chem. Soc. 1946; 68: 3: 459-464.
16 Европейская Фармакопея 7.0. Том 1, 2010: 1273 с.
Claims (1)
- Способ получения иммуноглобулина против лихорадки Эбола, из сыворотки крови лошадей, жидкого, включающий приготовление антигена из вирулентного штамма вируса Эбола, иммунизацию им лошадей, получение иммунной сыворотки с использованием 30% раствора хлористого кальция, выделение и концентрирование иммуноглобулинов методом осаждения этиловым спиртом на холоду, стерилизующую фильтрацию, фасовку и упаковку, отличающийся тем, что дополнительно содержит стадии очистки и концентрирования иммуноглобулинов, включающие: ионообменную хроматографию на колонке BPG 140/500 GE Health care с QSepharose FF при температуре 20°С и скорости подачи образца 350 мл/мин с последующей градиентной элюцией фракции Ig G от 0 до 100% буферным раствором с рН 8,0, содержащим 0,02 моль/л трис (гидроксиметил)аминометана и 1 моль/л NaCl при той же скорости в течение 80 минут; гель-фильтрационную хроматографию на колонке BPG 140/950 GE Health care с сорбентом 40 SEC, уравновешенной фосфатно-глициновым буферным раствором с рН 6,9, содержащим 0,02 М фосфата натрия с 2% глицина, при скорости потока 100 мл/мин в изократическом режиме элюирования при той же скорости; концентрирование и стерилизующую фильтрацию раствора иммуноглобулина на автоматической системе фильтрации и концентрирования в тангенциальном потоке «Владисарт» через кассеты с пределом эксклюзии 100 кДа при скорости потока 500 мл/мин, входном давлении не более 2 бар и выходном давлении не более 1 бар.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017128630A RU2673546C1 (ru) | 2017-08-10 | 2017-08-10 | Способ получения иммуноглобулина против лихорадки эбола из сыворотки крови лошадей, жидкого |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017128630A RU2673546C1 (ru) | 2017-08-10 | 2017-08-10 | Способ получения иммуноглобулина против лихорадки эбола из сыворотки крови лошадей, жидкого |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2673546C1 true RU2673546C1 (ru) | 2018-11-28 |
Family
ID=64603566
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017128630A RU2673546C1 (ru) | 2017-08-10 | 2017-08-10 | Способ получения иммуноглобулина против лихорадки эбола из сыворотки крови лошадей, жидкого |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2673546C1 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2770425C2 (ru) * | 2020-06-15 | 2022-04-18 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "48 Центральный научно-исследовательский институт" Министерства обороны Российской Федерации | Способ получения иммуноглобулина противооспенного из сыворотки крови лошадей |
| RU2815252C1 (ru) * | 2023-05-22 | 2024-03-12 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "48 Центральный научно-исследовательский институт" Министерства обороны Российской Федерации | Способ получения очищенного гетерологического иммуноглобулина против лихорадки Эбола |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2130318C1 (ru) * | 1996-07-05 | 1999-05-20 | Вирусологический центр научно-исследовательского института микробиологии МО РФ | Препарат, содержащий иммуноглобулин против лихорадки эбола, из сыворотки крови лошадей, жидкий (иммуноглобулин эбола) |
| CN105254755A (zh) * | 2014-12-01 | 2016-01-20 | 中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所 | 马抗埃博拉病毒病免疫球蛋白F(ab’)2及其制备方法 |
| WO2016123280A1 (en) * | 2015-01-28 | 2016-08-04 | Integrated Biotherapeutics, Inc. | Equine immunoglobulin compositions and uses for treating filovirus-mediated diseases |
| RU2627631C1 (ru) * | 2016-10-11 | 2017-08-09 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Способ получения гипериммунной сыворотки, содержащей гетерологичные иммуноглобулины против лихорадки Эбола |
-
2017
- 2017-08-10 RU RU2017128630A patent/RU2673546C1/ru active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2130318C1 (ru) * | 1996-07-05 | 1999-05-20 | Вирусологический центр научно-исследовательского института микробиологии МО РФ | Препарат, содержащий иммуноглобулин против лихорадки эбола, из сыворотки крови лошадей, жидкий (иммуноглобулин эбола) |
| CN105254755A (zh) * | 2014-12-01 | 2016-01-20 | 中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所 | 马抗埃博拉病毒病免疫球蛋白F(ab’)2及其制备方法 |
| WO2016123280A1 (en) * | 2015-01-28 | 2016-08-04 | Integrated Biotherapeutics, Inc. | Equine immunoglobulin compositions and uses for treating filovirus-mediated diseases |
| RU2627631C1 (ru) * | 2016-10-11 | 2017-08-09 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Способ получения гипериммунной сыворотки, содержащей гетерологичные иммуноглобулины против лихорадки Эбола |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ЖДАНОВ К.В. и др. Геморрагическая лихорадка Эбола: диагностика, этиотропная и патогенетическая терапия, профилактика. Клиническая медицина, 2015, N. 9, с. 5-11. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2770425C2 (ru) * | 2020-06-15 | 2022-04-18 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "48 Центральный научно-исследовательский институт" Министерства обороны Российской Федерации | Способ получения иммуноглобулина противооспенного из сыворотки крови лошадей |
| RU2815252C1 (ru) * | 2023-05-22 | 2024-03-12 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "48 Центральный научно-исследовательский институт" Министерства обороны Российской Федерации | Способ получения очищенного гетерологического иммуноглобулина против лихорадки Эбола |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US12005111B2 (en) | Zika virus vaccine | |
| TWI517858B (zh) | 經純化之瘧原蟲屬（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）及疫苗組成物 | |
| CN111569058B (zh) | 一种SARS-CoV-2灭活疫苗及其制备方法 | |
| Felsenfeld et al. | Antigenic relationships among several simian varicella-like viruses and varicella-zoster virus | |
| JPH04501429A (ja) | ウイルスで汚染された薬理組成物中のウイルスの不活性化方法 | |
| CA2664799C (en) | Ipv-dpt vaccine | |
| RU2673546C1 (ru) | Способ получения иммуноглобулина против лихорадки эбола из сыворотки крови лошадей, жидкого | |
| Ehrnst et al. | Fluctuations and distribution of measles virus antigens in chronically infected cells | |
| RU2754398C1 (ru) | Способ получения четырехвалентной вакцины для профилактики гриппа | |
| US20020086022A1 (en) | Neutralizing antibody and immunomodulatory enhancing compositions | |
| Steele et al. | Specific inhibitory factors of cellular immunity in children with subacute sclerosing panencephalitis | |
| Schmidt et al. | The complement-fixing antigen of rubella virus. | |
| RU2639135C2 (ru) | СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ СВЯЗАННЫХ С IFN-альфа СОСТОЯНИЙ | |
| RU2815252C1 (ru) | Способ получения очищенного гетерологического иммуноглобулина против лихорадки Эбола | |
| JP4053587B2 (ja) | 不活性化レスピラトリーシンシシャルウイルスワクチン | |
| RU2130318C1 (ru) | Препарат, содержащий иммуноглобулин против лихорадки эбола, из сыворотки крови лошадей, жидкий (иммуноглобулин эбола) | |
| RU2770425C2 (ru) | Способ получения иммуноглобулина противооспенного из сыворотки крови лошадей | |
| RU2257916C1 (ru) | Препарат, содержащий иммуноглобулин против лихорадки марбург из сыворотки крови лошадей жидкий (иммуноглобулин лошадиный марбург) | |
| RU2661028C2 (ru) | Фармацевтическая композиция для пассивной иммунизации против бешенства, фармацевтический набор, способ применения фармацевтического набора | |
| RU2627631C1 (ru) | Способ получения гипериммунной сыворотки, содержащей гетерологичные иммуноглобулины против лихорадки Эбола | |
| RU2810740C1 (ru) | Способ получения инактивированной вакцины против covid-19 и вакцина, полученная способом | |
| RU2809375C1 (ru) | Цельновирионная инактивированная вакцина против инфекции, вызываемой sars-cov-2, и ее применение | |
| RU2144379C1 (ru) | Противовирусный препарат и способ получения иммуноглобулина для профилактики и лечения вирусных заболеваний | |
| SM et al. | Evaluation of anti-rabies hyperimmune serum prepared using different adjuvants | |
| Kolmer | Complement fixation in vaccinia and variola |