CN112326960A - 一种区别新冠病毒抗体和流感病毒抗体的速测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种区别新冠病毒抗体和流感病毒抗体的速测试剂盒及其检测方法。包括新冠病毒抗原,流感病毒抗原,阴性对照,新冠病毒抗体阳性对照和流感病毒抗体阳性对照,抗体探测液A和抗体探测液B;所述抗体探测液A是含有预标记的一种动物抗另一种动物IgG或IgM的特异抗体的缓冲液;所述抗体探测液B是含有预标记的一种动物抗人抗兔IgG或IgM的特异抗体的缓冲液。检测样品量大,时间短,灵敏度高。
Description
技术领域
本发明涉及病毒检测领域,尤其涉及一种区别新冠病毒抗体和流感病毒抗体的速测试剂盒及其检测方法。
背景技术
目前新冠病毒感染筛查主要是通过实时荧光RT-PCR技术进行核酸鉴定检测。该方法是根据目标病毒核酸基因中开放读码框和核壳蛋白来设计引物实现靶标检测。其主要原理是,将荧光能量传递技术应用于PCR仪中,在PCR的反应体系中加入荧光基团,利用获取的荧光信号积累来实时监测整个PCR进程,最终通过得到的标准曲线进行定量分析。这种检测方法理论上灵敏度高,但操作规程比较复杂,从采样、基因提取、检测,以及技术人员水平等任何一个环节出问题,都会导致巨大误差,尤其是导致假阴性。事实上,这类检测试剂盒在新冠病毒疫情早期临床诊断实践中,发现其对患者的咽拭子样品的核酸检出率只有 30-50/%,许多病例需要2-3次重复。有病例显示,患者经CT检测有明显病毒性表现,但核酸检测却显示阴性。这种假阴性检查结果不仅导致感染患者失去及早治疗机会,放归社会还会成为病毒传播源,加剧家庭和社区传播。
为了补充核酸检测缺陷的基础上,科技人员又开发了新冠病毒抗体胶体金检测卡,这种检测卡使用非常方便,5-15分钟就得到检测结果。然而,这类检测方法的灵敏度不仅比核酸检测方法差很多,更重要的是,流感病毒抗体与新冠病毒抗原蛋白之间具有显著交叉反应,这问题将可能导致把大量感染了流感病毒抗体的受试者误判为新冠病毒感染者,造成社会恐慌和不必要的医疗资源和经济的投入。
发明内容
本发明的目的在于提供一种区别新冠病毒抗体和流感病毒抗体的速测试剂盒及其速测方法。
为实现上述目的,本发明提供一种区别新冠病毒抗体和流感病毒抗体的速测试剂盒,其特征在于,检测时,同时用新冠病毒抗原和流感病毒抗原检测同一样品中的抗体;所述试剂盒包括:新冠病毒抗原,流感病毒抗原,阴性对照,新冠病毒抗体阳性对照和流感病毒抗体阳性对照。
进一步,还包括:样品稀释液,检测板,抗体探测液,速洗液,显色液和终止液;所述检测板上含有新冠病毒抗原包被的检测孔和流感病毒抗原包被的检测孔,优选的,所述含有新冠病毒抗原包被的检测孔和流感病毒抗原包被的检测孔中,新冠病毒抗原包被用的浓度和流感病毒抗原包被用的浓度基本一致,都在0.01ug-10ug/ml之间;更优选的,浓度在0.1ug-1ug/ml之间;但新冠病毒抗原和流感病毒抗原两者的包被量误差在10%以内。
进一步,所述抗体探测液包括:抗体探测液A和抗体探测液B;所述抗体探测液A是含有预标记的一种动物抗另一种动物IgG或IgM的特异抗体的缓冲液;所述抗体探测液B是含有预标记的一种动物抗人抗兔IgG或IgM的特异抗体的缓冲液。
进一步,所述新冠病毒抗体阳性对照是一种动物源抗新冠病毒抗原的抗体;所述流感病毒抗体阳性对照是一种动物源抗流感病毒抗原的抗体;所述的新冠病毒抗原是灭活新冠病毒或新冠病毒结构蛋白,所述的结构蛋白是单一的新冠病毒蛋白,优选的,是N蛋白、S蛋白,或多个新冠病毒蛋白的组合;所述流感病毒抗原是灭活的流感病毒或流感病毒结构蛋白,所述的结构蛋白是单一的流感病毒蛋白或多个流感病毒抗原蛋白的组合;所述的结构蛋白是基因重组的或从灭活病毒中提取的。
进一步,所述新冠病毒抗体阳性对照为将动物源抗新冠病毒的抗体结构中Fc区人源化的抗体,流感病毒抗体阳性对照为将动物源抗流感病毒的抗体结构中Fc区人源化的抗体;优选的,所述动物源抗新冠病毒的抗体是鼠源或兔源抗新冠病毒的抗体,动物源抗流感病毒的抗体是鼠源或兔源抗流感病毒的抗体。
进一步,所述新冠病毒抗体阳性对照和流感病毒抗体阳性对照的浓度在0.001~100ng/ml之间;优选地,浓度在0.1~10ng/ml之间,溶解在2%BSA-PBS缓冲液中。
进一步,所述抗体探测液A和抗体探测液B中的特异抗体是经过筛选的特殊二级单克隆抗体,该特殊单克隆二级抗体的特征是具备在检测混合液中能和一级抗体结合而不影响该一级抗体与抗原结合的能力;
所述抗体探测液A和抗体探测液B中的抗体分别是HRP预标记的两个单克隆二级特异抗体,其中抗体的浓度在0.001ug-1ug/ml之间;优选地,抗体的浓度在0.1ug-0.5ug/ml之间,溶解在2%BSA-PBS缓冲液中。
本发明还提供一种区别新冠病毒抗体和流感病毒抗体的速测方法,其特征在于,使用了所述的速测试剂盒。
进一步,检测步骤为,
加样:将对照品及稀释后的待测样品,优选的,稀释1-5000倍,更优选的,稀释10-1000 倍;各取等量的两份并分别加到新冠病毒抗原包被的检测孔和流感病毒抗原包被的检测板的检测孔中;所述对照品包括阴性对照、新冠病毒抗体阳性对照和流感病毒抗体阳性对照;
抗体-抗原反应:在每个检测孔中加入等量的抗体探测液,其中,对照品的检测孔加抗体探测液A,待测样品的检测孔加抗体探测液B;如果新冠病毒抗体阳性对照或流感病毒抗体阳性对照中的抗体为Fc区人源化抗体时,全部检测孔都只使用抗体探测液B;然后,混匀,室温静置孵育30-60分钟;
洗板:倒空各检测孔中的液体,加入速洗液晃动数次后倒空,如此重复洗孔1-3次;
显色及读板:在每个检测孔中,加入等量的TMB显色液,室温静置1-10分钟直至添加新冠病毒抗体阳性对照或流感病毒抗体阳性对照的各孔显出蓝色为止;然后用酶标仪在波长 370m处测定吸光率OD370,或者,先向每个孔中加入显色终止液,终止反应后在450nm波长下测吸光率OD450;
结果分析:根据读板结果,以测得对照组的OD值为参照,对每个受试样品进行如下分析,
检测时,将检测板按矩阵划区,新冠病毒抗原包被的设为1列,流感病毒抗原包被的设为2列;A行为阴性对照,B行为新冠抗体阳性对照,C行为流感抗体阳性对照,D-G行为样品,H行为空白;
实验正常判定:两组的阴性对照A1和A2相近,并接近空白对照值;新冠病毒抗原组的阳性对照B1应该远大于阴性对照A1,一般B1应该大于A1值5-10倍以上;流感病毒抗原组的阳性对照C2应该远大于阴性对照A2,一般C2应该大于A2值5-10倍以上;B行的新冠抗体阳性对照在B1孔的OD值应大于其在B2孔的OD值,一般B1应该大于B2值1-10倍以上;而C行的流感抗体阳性对照在C2孔的OD值应大于其在C1孔的OD值,一般C2应该大于C1 值1-10倍以上;在此基础上进一步作如下判定:阴性判定:如果某一受试样品的OD值≤新冠病毒抗原组的阴性对照,则该受试样品为新冠病毒抗抗体阴性;同理,如果某一受试样品的OD值≤流感病毒抗原组的阴性对照,则该受试样品为流感病毒抗抗体阴性;
阳性判定:如果某一受试样品的OD值大于任一组的阴性对照,则按下述进一步分析:如果同一个样品在新冠病毒抗原包被的检测孔中测得的OD值显著大于其同浓度时在流感病毒抗原包被的检测孔中测得的OD值,而前者大于后者1.5倍以上,优选2倍以上,则判定该样品为新冠病毒抗体阳性;
相反,如果同一个样品在流感病毒抗原包被的检测孔中测得的OD值大于其同浓度时在新冠病毒抗原包被的检测孔中测得的OD值,而前者大于后者1.5倍以上,理想的是2倍以上,则判定该样品为流感病毒抗体阳性;
如果同一个样品在新冠病毒抗原包被的检测孔中测得的OD值接近或等于其同浓度时在流感病毒抗原包被的检测孔中测得的OD值时,二者差别的绝对值小于或等于1.5倍,则判定该样品同时为新冠病毒抗体阳性和流感病毒抗体阳性;
实验异常判定:两组的阴性对照A1和A2不相近或比空白对照值大很多,则判为实验异常,数据不可靠;或如果新冠病毒抗体阳性对照在新冠病毒抗原组的B1大于其阴性对照A1 的值不到3倍则说明实验窗口太小,判为实验异常,结果不可靠;或如果流感病毒抗体阳性对照在流感病毒抗原组的C2大于其阴性对照A2的值不到3倍则说明实验窗口太小,判为实验异常,结果不可靠;如果,B行的新冠抗体阳性对照在B1孔的OD值等于或小于其在B2孔的OD值,或C行的流感抗体阳性对照在C2孔的OD值等于或小于其在C1孔的OD值,则说明实验出差错或试剂盒设计不合理,判为实验异常,结果不可靠;需要重新检测。
本发明还提供一种可区别新冠病毒抗体和流感病毒抗体的免疫层析检测试剂盒,其特征在于,含有两个检测卡,每个检测卡由样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素层析膜、吸水垫及PVC胶板组成;两个检测卡的胶体金结合垫上都相同地含有胶体金标记的动物抗人IgG或 /和IgM抗体,和胶体金标记的动物质控抗体;但其中一条检测卡的硝酸纤维素层析膜上固定有一条含新冠病毒抗原的T检测线和一条抗质控抗体的C质控线;而另一条检测卡硝酸纤维素层析膜上固定有一条含流感病毒抗原的T检测线和一条抗质控抗体的C质控线。
本发明还提供一种可区别新冠病毒抗体和流感病毒抗体的免疫层析检测试剂盒,其特征在于,含有两个检测卡,每个检测卡由样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素层析膜、吸水垫及PVC胶板组成;两个检测卡的硝酸纤维素层析膜上都相同地固定有一条或两条动物抗人 IgG或IgM,或IgG和IgM抗体的检测线,和一条动物抗质控抗体的质控线;但其中一个检测卡的胶体金结合垫上含有胶体金标记的新冠病毒抗原和胶体金标记的质控抗体;而另一条检测卡的胶体金结合垫上含有胶体金标记的流感病毒抗原和胶体金标记的质控抗体
为便于更清楚的理解本发明的检测方法,见表1的检测布局表示例。表2为根据表1的检测布局表进行的检测结果分析表例。
本发明的检测方法检测后的结果分析:
实验正常判定:实验正常情况下,1)两组的阴性对照A1和A2应该相近,并接近空白对照值;2)新冠病毒抗原组的阳性对照B1应该远大于阴性对照A1,一般B1应该大于A1值 5-10倍以上;3)流感病毒抗原组的阳性对照C2应该远大于阴性对照A2,一般C2应该大于 A2值5-10倍以上。
实验异常判定:1)两组的阴性对照A1和A2不相近或比空白对照值大很多,则判为实验异常,数据不可靠;2)如果新冠病毒抗体阳性对照在新冠病毒抗原组的B1大于其阴性对照A1的值不到3倍则说明实验窗口太小,判为实验异常,结果不可靠;3)同理,如果流感病毒抗体阳性对照在流感病毒抗原组的C2大于其阴性对照A2的值不到3倍则说明实验窗口太小,判为实验异常,结果不可靠。4)如果,B行的新冠抗体阳性对照在B1孔的OD值等于或小于其在B2孔的OD值,或C行的流感抗体阳性对照在C2孔的OD值等于或小于其在C1 孔的OD值,则说明实验出差错或试剂盒设计不合理,判为实验异常,结果不可靠。
阴性判定:如果某一受试样品的OD值等于或小于新冠病毒抗原组的阴性对照,则该受试样品为新冠病毒抗抗体阴性;同理,如果某一受试样品的OD值等于或小于流感病毒抗原组的阴性对照,则该受试样品为流感病毒抗抗体阴性。
阳性判定:如果某一受试样品的OD值同时大于任一组的阴性对照,则按下述进一步分析:
如果同一个样品在新冠病毒抗原包被的检测孔中测得的OD值显著大于其同浓度时在流感病毒抗原包被的检测孔中测得的OD值,而前者大于后者1.5倍以上,理想的是2倍以上,则判定该样品为新冠病毒抗体阳性;
相反,如果同一个样品在流感病毒抗原包被的检测孔中测得的OD值大于其同浓度时在新冠病毒抗原包被的检测孔中测得的OD值,而前者大于后者1.5倍以上,理想的是2倍以上,则判定该样品为流感病毒抗体阳性;
如果同一个样品在新冠病毒抗原包被的检测孔中测得的OD值接近或等于其同浓度时在流感病毒抗原包被的检测孔中测得的OD值时,二者差别的绝对值小于或等于1.5倍,则判定该样品同时为新冠病毒抗体阳性和流感病毒抗体阳性。
基于新冠病毒和流感病毒的抗原蛋白具有高度相似性,以及新冠病毒抗体检测法所测血液中的抗体都是多克隆抗体的原因,申请人研究了新冠病毒抗体和流感病毒抗原蛋白以及流感病毒抗体与新冠病毒抗原蛋白之间是否具有交叉反应的情况。该研究结果发现新冠病毒抗体和流感病毒抗原蛋白之间以及流感病毒抗体与新冠病毒抗原蛋白之间都具有显著交叉反应。这个研究结果提示,现有的抗体检测方法是使用单一病毒的抗原来捕捉新冠病毒抗体 (IgG、IgM),该检测法在检测受试者血液中抗体时存在把流感病毒抗体误诊为新冠病毒抗体的风险,既如果受试者曾经患过流感或接种过流感疫苗致使血液中含有较高流感病毒抗体滴度时可能会被误诊为新冠病毒抗体,产生假阳性结果。虽然可以考虑使用新冠病毒特异性的抗原片段(如新冠病毒S蛋白的RBD片段)来检测新冠病毒抗体,但由于病毒感染后人体会针对该病毒整体产生大量多克隆抗体,而针对某特异性抗原片段的抗体含量必然很少。因此,如果仅限于检测该抗原片段所对应的少量特异抗体的话,必然会减弱检测灵敏度,尤其在感染初期抗体滴度还比较低的时候,导致更高的假阴性结果。
为了克服这些问题,本发明公开了一种能够区别和检测新冠病毒抗体和流感病毒抗体 (IgG、IgM)的快速检测方法和试剂盒。此外,使用该试剂盒还能在60分钟内完成96个样品(包括对照样品)同时检测,平均每个样品检测时间少于1分钟。而且,该检测方法因采用基于酶联免疫(ELISA)的检测法比常规的胶体金检测法灵敏度高10倍以上,同时因自带阳性和阴性对照样品,使得检测结果的判断更客观,进一步减少假阳性和假阴性。
本发明所述的一种区别新冠病毒抗体和流感病毒抗体的快速检测方法是一种基于酶联免疫(ELISA)的改进型检测法,使得检测步骤更简单(以一次抗体反应取代常规方法中的:封闭,漂洗,试样反应,漂洗和二抗结合多个步骤);检测速度更快速,整个操作过程少于1 小时比常规酶联免疫(ELISA)法所需的3个小时大大缩短。
同时,本发明也包括基于免疫层析的两种改进型胶体金检测试剂盒:
一种可区别新冠病毒抗体和流感病毒抗体的免疫层析检测试剂盒1,如图7所示,其含有两个检测卡,每个检测卡由样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素层析膜、吸水垫及PVC胶板组成;两个检测卡的胶体金结合垫上都相同地含有胶体金标记的动物抗人IgG或/和IgM 抗体和胶体金标记的动物质控抗体;但其中一条检测卡的硝酸纤维素层析膜上固定有一条含新冠病毒抗原的T检测线和一条抗质控抗体的C质控线;而另一条检测卡硝酸纤维素层析膜上固定有一条含流感病毒抗原的T检测线和一条抗质控抗体的C质控线。
一种可区别新冠病毒抗体和流感病毒抗体的免疫层析检测试剂盒2,如图8所示,其含有两个检测卡,每个检测卡由样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素层析膜、吸水垫及PVC胶板组成;两个检测卡的硝酸纤维素层析膜上都相同地固定有一条动物抗人IgG或IgM,或两条动物抗人IgG和IgM,抗体的检测线,和一条动物抗质控抗体的质控线;但其中一个检测卡的胶体金结合垫上含有胶体金标记的新冠病毒抗原和胶体金标记的质控抗体;而另一条检测卡的胶体金结合垫上含有胶体金标记的流感病毒抗原和胶体金标记的质控抗体。
附图说明
图1是96孔检测板即其各检测孔的标记示意图。
图2为梯度稀释的新冠病毒抗体与不同抗原反应结果图。
图3为梯度稀释的流感病毒抗体与不同抗原反应结果图
图4为两组检测孔预包被的抗原及添加样品布局图。
图5为同时检测IgG抗体和IgM抗体的检测板布局图。
图6为可区别新冠病毒抗体和流感病毒抗体的免疫层析检测试剂盒中的检测卡的结构示意图。
图7为实施例8所述可区别新冠病毒抗体和流感病毒抗体的免疫层析检测试剂盒中的检测卡的结构示意图。
图8为实施例9所述可区别新冠病毒抗体和流感病毒抗体的免疫层析检测试剂盒中的检测卡的结构示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例,所述实施例的示例在附图中示出,其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的,旨在用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
图6-8中:
1为样品垫、2为胶体金结合垫、3为硝酸纤维素层析膜、4为吸水垫、5为PVC胶板,6为检测线,7为质控线,
21为胶体金结合垫含有胶体金标记的动物抗人IgG或/和IgM抗体,和胶体金标记的动物质控抗体;61为含有新冠抗原检测线;62为含有流感抗原检测线。
22为胶体金结合垫含有胶体金标记的新冠抗原和胶体金标记的质控抗体,23为胶体金结合垫含有胶体金标记的流感抗原和胶体金标记的质控抗体,63为含有动物抗人IgG或IgM 抗体的检测线。
实施例1:一种可同时测定新冠病毒抗体和流感病毒抗体的96孔检测板的制备
新冠病毒抗原包被液的准备:取适量纯化度在90%以上的重组新冠病毒N蛋白(可从市场购买或按公知的方法自制),用20mM Tris-HCl(pH=9.0),10mM EDTA的缓冲液溶解重组新冠病毒N蛋白并稀释至0.3ug/ml,制备6ml备用;
流感病毒抗原包被液的准备:取适量流感病毒裂解疫苗(从市场购买),用20mMTris-HCl (pH=9.0),10mM EDTA的缓冲液溶解并稀释50倍,制备6ml备用;
包被:取一个具有蛋白高结合率的96孔检测板(从市场购买的酶联免疫检测板)如图1 所示。然后,按下表3分布方式(以左右并列为例),分别在每个检测孔添加100ul上述预备的新冠病毒抗原(简记Flu)包被液或流感病毒抗原(简记Cv19)包被液,然后在室温下静置 4小时,倒空各检测孔中的液体,加入200ul/ml PBS缓冲液,晃动数次后再倒空,如此重复洗孔2次;
封闭:在每个检测孔中加入120ul的2%BSA-PBS缓冲液,然后在室温下静置2小时,再倒空各检测孔中的液体,加入200ul/ml PBS缓冲液,晃动数次后再倒空,如此重复洗孔2次,然后在45℃以下温度烘干,装入铝箔袋并抽真空封口。封口后的检测板可在常温下储存1-3个月或-20℃下储存3年。
实施例2:新冠病毒抗体阳性血清制备
用纯化度在90%以上的2mg重组新冠病毒N蛋白(可从市场购买或按公知的方法自制) 浓度1mg/ml,按1:1质量体积比与免疫佐剂混合、乳化后按公知方法,每两周一次,每次1ml多点皮下注射免疫兔子,经3-5次免疫后制得新冠病毒特异性抗血清。该抗血清经免疫印迹法验证,确认其对新冠病毒抗原具有特异性阳性反应。
实施例3、流感病毒抗体阳性血清制备
用市售的流感病毒裂解疫苗0.5ml按1:1体积比与免疫佐剂混合、乳化后按公知方法,每两周一次,每次1ml多点皮下注射免疫兔子,经3-5次免疫后制得流感病毒特异性抗血清。该抗血清经ELISA法验证,确认其对流感病毒抗原具有特异性阳性反应。
实施例4、一种能区别新冠病毒抗体和流感病毒抗体的速测试剂盒制备
本实施例以96检测孔(由12个8孔检测条组成)为例。试剂盒大小可根据市场需要调整,同时各试剂的数量可依试剂盒大小而变。本实施例的试剂盒所含内容及其数量比如如下表4所示:
表4、试剂盒所含内容及其数量表
各试剂的制备方法详述如下:
1)同时包被有新冠病毒抗原和流感病毒抗原的96孔检测板:按实施例1制得;
2)样品稀释液:是2%BSA-PBS缓冲液(pH7.4)加终浓度10mM EDTA制得;
3)IgG抗体探测液A(用于本试剂盒阴性对照及新冠和流感的抗体阳性对照检测):是 HRP-标记的鼠抗兔IgG(本实施例仅检测IgG抗体为例,若要检测IgM抗体则使用HRP-标记的鼠抗兔IgM)的特异单克隆抗体,按1:500~5000,优选的1:2000的体积比稀释在2%BSA-PBS 缓冲液中制得;
4)IgG抗体探测液B(用于人血样品的检测):是HRP-标记的鼠抗人IgG(本实施例仅检测IgG抗体为例,若要检测IgM抗体则使用HRP-标记的鼠抗人IgM)的特异单克隆抗体,按按1:500~5000,优选的1:2000的体积比稀释在2%BSA-PBS缓冲液中制得;
5)阴性对照液:无病毒感染的阴性兔血清(非特异血清)按1:2000体积比稀释在2%BSA-PBS缓冲液(pH7.4)中制得;
6)新冠病毒抗体阳性对照液:是将实施例2中所制得新冠病毒特异性抗血清按1:2000 体积比稀释在2%BSA-PBS缓冲液(pH7.4)中制得;
7)流感病毒抗体阳性对照液:是将实施例3中所制得流感病毒特异性抗血清按1:2000 体积比稀释在2%BSA-PBS缓冲液(pH7.4)中制得;
8)TMB显色液:0.1mg/ml的TMB和0.1%的H2O2溶解在20mM的柠檬酸缓冲液(pH4.5)中制得;
9)显色终止液是1M的H2SO4或1N的HCl。
实施例5、一种检测新冠病毒抗体和流感病毒抗体与二者相对应抗原交叉反应的实验
本实施例仅以检测IgG为例(IgM的检测方法相似,只是把所用的IgG抗体探测液改成 IgM抗体探测液即可);所用检测试剂盒参考实施例4,但仅取其中4条8孔的检测条为例,检测板从左到右各列包被的抗原依次是:1=灭活流感病毒裂解疫苗(Flu)、2=新冠病毒抗原N 蛋白(Cv19)、3=灭活流感病毒裂解疫苗(Flu)、4=新冠病毒抗原N蛋白(Cv19)。各检测孔布局如表5所示:
表5、各检测孔抗原包被布局表
检测方法:
1)稀释及加样:本实施例的检测的样品为已知的新冠病毒IgG抗体(兔抗新冠病毒N蛋白的多克隆IgG抗体)和流感病毒IgG抗体(兔抗裂解流感病毒的多克隆IgG抗体),首先将这两个抗体用稀释液分别稀释2000倍,然后在1和2的检测条的A行的孔中各加入100ul预稀释的新冠病毒抗体液,在3和4的检测条A行的孔中各加入100ul预稀释的流感病毒抗体液,在1-4检测条的其余各孔加入50ul稀释液,然后用排枪从1-4检测条最上面的检测孔取50ul分别加到对应的B行的检测孔中,混匀后再分别取出50ul加到对应的C行的检测孔中,依此类推,自上而下作梯度稀释,直至第7行(G行),混匀后取出50ul弃去,不再加入到第8行(H行),H行的各孔仅有稀释液无抗体;如此加样结果各孔的总量都是50ul。
2)抗体探测反应:在所有孔中各加入50ul的IgG抗体探测液A,混匀,室温静置孵育40分钟;
3)洗板:倒空各检测孔中的液体,加入速洗液晃动数次后倒空,如此重复洗孔3次;
4)显色及读板:在每个检测孔中,加入100ul的TMB显色液,室温静置约5分钟后再向每个孔中加入100μl 1M的HCl以终止反应,然后在酶标仪上测450nm波长下的吸光率OD450。 5)结果分析:上述实验在酶标仪上读得各孔的OD值如表6所示:
表6、新冠抗体和流感抗体与不同抗原交叉反应所测得OD值表
为了便于分析,将上表的OD值转化成图2和3进行分析。图2为梯度稀释的新冠病毒抗体与不同抗原反应结果图。图3为梯度稀释的流感病毒抗体与不同抗原反应结果图。
从图2结果可以看出,新冠病毒抗体与新冠病毒抗原有强特异反应外,还与流感病毒抗原显著的有交叉反应,后者的交叉反应强度高达前者特异反应的25%。这说明,如果没有对比,这个交叉反应足以干扰判定被测抗体是新冠病毒抗体还是流感病毒抗体。同样,从图3 结果看,流感病毒抗体除了与流感病毒抗原有强特异反应外还与新冠病毒抗原有显著的有交叉反应,后者的交叉反应强度高达前者特异反应的40%,而且当这个含用流感病毒抗体的血清被稀释32000倍时依然能观察到其与新冠病毒抗原的交叉反应。这实验结果提示,如果没有对比,仅用新冠病毒抗原检测受试者血液中抗体时,受试者血液中如果含流感病毒抗体(受试者如果近期感染过流感病毒或接种过流感疫苗都会产生流感抗体)就会与新冠病毒抗原发生交叉反应,这个反应结果就会被误判为新冠病毒抗体阳性。同时该实验结果也证明:不论是新冠病毒抗体还是流感病毒抗体,也不论其浓度高低,它们与其特异性抗原反应的强度总是大于与非特异抗原的交叉反应,因此,如果同时使用新冠病毒抗原和流感病毒抗原检测抗体,再根据被测抗体与两已知抗原反应的强弱对比,就可以判断出被测抗体是新冠病毒抗体还是流感病毒抗体。
实验结果与实际情况完全相符,说明采用本发明的试剂盒进行检测,结果100%准确。同时,采集的血清样本稀释128000倍后,仍然能检测出正确的结果,灵敏度高。
实施例6、一种能区别新冠病毒抗体和流感病毒IgG抗体的检测方法
本实施例仅以检测IgG为例(IgM的检测方法相似只是把所用的IgG抗体探测液改成IgM 抗体探测液即可);所用检测试剂盒参考实施例4,但仅取其中2个8孔的检测条为例,检测板左侧8孔包被的是新冠病毒抗原(N蛋白),右侧8孔包被的是4联灭活流感病毒裂解疫苗;检测时同时使用阴性对照、新冠病毒抗体阳性对照及流感病毒抗体阳性对照作参照,对5个待测样品(包括一空白)进行抗体检测;两组检测孔布局如图4所示。图4为两组检测孔预包被的抗原及添加样品布局图。
检测步骤:
稀释及加样:在每个孔中分别加入40ul稀释液,然后根据图4布局,至上而下分别加入10ul的阴性对照液、新冠病毒抗体阳性对照液、流感病毒抗体阳性对照、试样1、试样2、试样3、试样4及试样5(作空白,只有稀释液),同一行的左右两组加入等量相同的样品;抗体-抗原反应:在上面三行(阴性对照、新冠阳性对照、流感阳性对照)的检测孔中各加入50ul的IgG抗体探测液A,在其余(试样1、试样2、试样3、试样4及试样5)的孔中各加入50ul的IgG抗体探测液B,混匀,室温净置孵育40分钟;
洗板:倒空各检测孔中的液体,加入速洗液晃动数次后倒空,如此重复洗孔3次;
显色及读板:在每个检测孔中,加入100ul的TMB显色液,室温净置约5分钟后再向每个孔中加入100μl 1M的HCl以终止反应,然后在酶标仪上用450nm波长测吸光率(OD450)。结果分析:读板结果各孔的OD值及结果判定如下表7所示。
表7、读板测得各孔的OD值及结果判定表
根据上表读板结果进行分析:
A为阴性对照,在A1和A2测得OD值相近且都非常低,接近空白,所测结果与实际一致为阴性;
B为新冠病毒抗体阳性对照,在流感抗原组中显弱阳性(B1)而在新冠病毒抗原组中显强阳性(B2),说明新冠病毒抗体与流感抗原有一定交叉反应,但其特异性还是有显著差异,B2(新冠抗体对新冠抗原)的OD值比B1(新冠抗体对流感抗原)的OD值大5倍多。
C为流感病毒抗体阳性对照,在流感抗原组中显强阳性(C1)而在新冠病毒抗原组中也显弱阳性(C2),说明流感病毒抗体与新冠抗原也有一定交叉反应,但其特异性还是有显著差异,C1(流感抗体对流感抗原)的OD值比C2(流感抗体对新冠抗原)的OD值大3倍多。
D为试样1,在D1和D2测得OD值相近且都接近阴性对照的OD值,所以判定该试样为新冠和流感抗体双阴性。
E为试样2,在流感抗原组中显弱阳性(E1)而在新冠病毒抗原组中显阳性(E2),与新冠病毒抗体阳性对照表现相似,与流感抗原较弱的交叉反应,但与新冠抗原有较强的特异性反应(E2的OD值比E1的OD值大3倍多),所以判定该试样为新冠病毒抗体阳性。
F为试样3,在流感抗原组中显强阳性(F1)而在新冠病毒抗原组中弱阳性(F2),与流感病毒抗体阳性对照表现相似,与新冠抗原有较弱的交叉反应,但与流感抗原有较强的特异性反应(F1的OD值比F2的OD值大3倍多),所以判定该试样为流感病毒抗体阳性。
G为试样4,在流感抗原组中显弱阳性(G1)在新冠病毒抗原组中也显弱阳性(G2),没有显著特异性,可能同时含有流感和新冠病毒抗体,所以判定该试样为流感病毒新冠病毒抗体双弱阳性。
H为空白试样,在H1和H2测得OD值都非常低,视为背景OD值。
实验结果与现实相符,说明采用本发明的试剂盒进行检测,结果100%准确。
实施例7、一种能区别新冠病毒抗体和流感病毒IgG和IgM抗体的检测方法
本实施例的检测方法完全同实施例6,只要在使用的IgG抗体探测液的基础上增加IgM抗体探测液,并把原来两组检测孔布局改成4组布局即可。如图5所示。图5为同时检测IgG 抗体和IgM抗体的检测板布局图。检测结果见表8。
表8、读板测得各样品IgG和IgM的OD值表
实验结果分析同实施例6。各检测样品及对照的IgG抗体同实施例6,IgM抗体结果分析如下。由于IgM抗体峰值只在感染初期出现,感染后期主要是IgG抗体,因此可以看出各样品中的IgM抗体和IgG抗体的阳性并非一致。
A为阴性对照,测得OD值相近且都非常低,接近空白,所测结果与实际一致为阴性;
B为新冠病毒抗体阳性对照,在流感抗原组中IgM显极弱阳性,而在新冠病毒抗原组中 IgM显弱阳性,其特异性还是有差异。
C为流感病毒抗体阳性对照,在流感抗原组中显IgM显极弱阳性,而在新冠病毒抗原组中阴性。
D为试样1,在流感抗原组中和新冠病毒抗原组中都阴性,所以判定该试样为新冠和流感 IgM抗体双阴性。
E为试样2,在流感抗原组中和新冠病毒抗原组中都阴性,所以判定该试样为新冠和流感 IgM抗体双阴性。
F为试样3,在流感抗原组中显弱阳性,而在新冠病毒抗原组中阴性,所以判定该试样为流感病毒IgM抗体弱阳性。
G为试样4,在流感抗原组中和新冠病毒抗原组中都阴性,所以判定该试样为新冠和流感 IgM抗体双阴性。
H为空白试样,测得OD值都非常低,视为背景OD值。
实验结果与现实相符。
实施例8:一种可区别新冠病毒抗体和流感病毒抗体的免疫层析法
试剂盒:含有两条检测卡(图7),每个检测卡(结构见图6)由样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素层析膜、吸水垫及PVC胶板组成;两个检测卡的胶体金结合垫上都相同地含有胶体金标记的动物抗人IgG或/和IgM抗体,和胶体金标记的动物质控抗体;但其中一条检测卡的硝酸纤维素层析膜上固定有一条含新冠病毒抗原的T检测线和一条抗质控抗体的C质控线;而另一条检测卡硝酸纤维素层析膜上固定有一条含流感病毒抗原的T检测线和一条抗质控抗体的C质控线。
采用该试剂盒,检测了实施例6的样品2,定性检测结果新冠抗体阳性,与实施例6的检测结果一致。
实施例9:一种可区别新冠病毒抗体和流感病毒抗体的免疫层析法
试剂盒:含有两条检测卡(图8),每个检测卡(结构见图6)由样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素层析膜、吸水垫及PVC胶板组成;两个检测卡的硝酸纤维素层析膜上都相同地固定有一条动物抗人IgG或IgM抗体的检测线,和一条动物抗质控抗体的质控线;但其中一个检测卡的胶体金结合垫上含有胶体金标记的新冠病毒抗原和胶体金标记的质控抗体;而另一条检测卡的胶体金结合垫上含有胶体金标记的流感病毒抗原和胶体金标记的质控抗体。
采用该试剂盒,检测了实施例6的样品3,定性检测结果为流感抗体阳性与实施例6的检测结果一致。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (11)
1.一种区别新冠病毒抗体和流感病毒抗体的速测试剂盒,其特征在于,检测时,同时用新冠病毒抗原和流感病毒抗原检测同一样品中的抗体;所述试剂盒包括:新冠病毒抗原,流感病毒抗原,阴性对照,新冠病毒抗体阳性对照和流感病毒抗体阳性对照。
2.如权利要求1所述的速测试剂盒,其特征在于,还包括:样品稀释液,检测板,抗体探测液,速洗液,显色液和终止液;所述检测板上含有新冠病毒抗原包被的检测孔和流感病毒抗原包被的检测孔,优选的,所述含有新冠病毒抗原包被的检测孔和流感病毒抗原包被的检测孔中,新冠病毒抗原包被用的浓度和流感病毒抗原包被用的浓度基本一致,都在0.01ug-10ug/ml之间;更优选的,浓度在0.1ug-1ug/ml之间;但新冠病毒抗原和流感病毒抗原两者的包被量误差在10%以内。
3.如权利要求2所述的速测试剂盒,其特征在于,所述抗体探测液包括:抗体探测液A和抗体探测液B;所述抗体探测液A是含有预标记的一种动物抗另一种动物IgG或IgM的特异抗体的缓冲液;所述抗体探测液B是含有预标记的一种动物抗人抗兔IgG或IgM的特异抗体的缓冲液。
4.如权利要求1所述的速测试剂盒,其特征在于,所述新冠病毒抗体阳性对照是一种动物源抗新冠病毒抗原的抗体;所述流感病毒抗体阳性对照是一种动物源抗流感病毒抗原的抗体;所述的新冠病毒抗原是灭活新冠病毒或新冠病毒结构蛋白,所述的结构蛋白是单一的新冠病毒蛋白,优选的,是N蛋白、S蛋白,或多个新冠病毒蛋白的组合;所述流感病毒抗原是灭活的流感病毒或流感病毒结构蛋白,所述的结构蛋白是单一的流感病毒蛋白或多个流感病毒抗原蛋白的组合;所述的结构蛋白是基因重组的或从灭活病毒中提取的。
5.如权利要求4所述的速测试剂盒,其特征在于,所述新冠病毒抗体阳性对照为将动物源抗新冠病毒的抗体结构中Fc区人源化的抗体,流感病毒抗体阳性对照为将动物源抗流感病毒的抗体结构中Fc区人源化的抗体;优选的,所述动物源抗新冠病毒的抗体是鼠源或兔源抗新冠病毒的抗体,动物源抗流感病毒的抗体是鼠源或兔源抗流感病毒的抗体。
6.如权利要求1所述的速测试剂盒,其特征在于,所述新冠病毒抗体阳性对照和流感病毒抗体阳性对照的浓度在0.001~100ng/ml之间;优选地,浓度在0.1~10ng/ml之间,溶解在2%BSA-PBS缓冲液中。
7.如权利要求3所述的速测试剂盒,其特征在于,所述抗体探测液A和抗体探测液B中的特异抗体是经过筛选的特殊二级单克隆抗体,该特殊单克隆二级抗体的特征是具备在检测混合液中能和一级抗体结合而不影响该一级抗体与抗原结合的能力;
所述抗体探测液A和抗体探测液B中的抗体分别是HRP预标记的两个单克隆二级特异抗体,其中抗体的浓度在0.001ug-1ug/ml之间;优选地,抗体的浓度在0.1ug-0.5ug/ml之间,溶解在2%BSA-PBS缓冲液中。
8.一种区别新冠病毒抗体和流感病毒抗体的速测方法,其特征在于,使用了权利要求1-7任一项所述的速测试剂盒。
9.如权利要求8所述区别新冠病毒抗体和流感病毒抗体的速测方法,其特征在于,检测步骤为,
加样:将对照品及稀释后的待测样品,优选的,稀释1-5000倍,更优选的,稀释10-1000倍;各取等量的两份并分别加到新冠病毒抗原包被的检测孔和流感病毒抗原包被的检测板的检测孔中;所述对照品包括阴性对照、新冠病毒抗体阳性对照和流感病毒抗体阳性对照;
抗体-抗原反应:在每个检测孔中加入等量的抗体探测液,其中,对照品的检测孔加抗体探测液A,待测样品的检测孔加抗体探测液B;如果新冠病毒抗体阳性对照或流感病毒抗体阳性对照中的抗体为Fc区人源化抗体时,全部检测孔都只使用抗体探测液B;然后,混匀,室温静置孵育30-60分钟;
洗板:倒空各检测孔中的液体,加入速洗液晃动数次后倒空,如此重复洗孔1-3次;
显色及读板:在每个检测孔中,加入等量的TMB显色液,室温静置1-10分钟直至添加新冠病毒抗体阳性对照或流感病毒抗体阳性对照的各孔显出蓝色为止;然后用酶标仪在波长370m处测定吸光率OD370,或者,先向每个孔中加入显色终止液,终止反应后在450nm波长下测吸光率OD450;
结果分析:根据读板结果,以测得对照组的OD值为参照,对每个受试样品进行如下分析,
检测时将检测板按矩阵划区,新冠病毒抗原包被的设为1列,流感病毒抗原包被的设为2列;A行为阴性对照,B行为新冠抗体阳性对照,C行为流感抗体阳性对照,D-G行为样品,H行为空白;
实验正常判定:两组的阴性对照A1和A2相近,并接近空白对照值;新冠病毒抗原组的阳性对照B1应该远大于阴性对照A1,一般B1应该大于A1值5-10倍以上;流感病毒抗原组的阳性对照C2应该远大于阴性对照A2,一般C2应该大于A2值5-10倍以上;B行的新冠抗体阳性对照在B1孔的OD值应大于其在B2孔的OD值,一般B1应该大于B2值1-10倍以上;而C行的流感抗体阳性对照在C2孔的OD值应大于其在C1孔的OD值,一般C2应该大于C1值1-10倍以上;在此基础上进一步作如下判定:
阴性判定:如果某一受试样品的OD值≤新冠病毒抗原组的阴性对照,则该受试样品为新冠病毒抗抗体阴性;同理,如果某一受试样品的OD值≤流感病毒抗原组的阴性对照,则该受试样品为流感病毒抗抗体阴性;
阳性判定:如果某一受试样品的OD值大于任一组的阴性对照,则按下述进一步分析:如果同一个样品在新冠病毒抗原包被的检测孔中测得的OD值显著大于其同浓度时在流感病毒抗原包被的检测孔中测得的OD值,而前者大于后者1.5倍以上,优选2倍以上,则判定该样品为新冠病毒抗体阳性;
相反,如果同一个样品在流感病毒抗原包被的检测孔中测得的OD值大于其同浓度时在新冠病毒抗原包被的检测孔中测得的OD值,而前者大于后者1.5倍以上,理想的是2倍以上,则判定该样品为流感病毒抗体阳性;
如果同一个样品在新冠病毒抗原包被的检测孔中测得的OD值接近或等于其同浓度时在流感病毒抗原包被的检测孔中测得的OD值时,二者差别的绝对值小于或等于1.5倍,则判定该样品同时为新冠病毒抗体阳性和流感病毒抗体阳性;
实验异常判定:两组的阴性对照A1和A2不相近或比空白对照值大很多,则判为实验异常,数据不可靠;或如果新冠病毒抗体阳性对照在新冠病毒抗原组的B1大于其阴性对照A1的值不到3倍则说明实验窗口太小,判为实验异常,结果不可靠;或如果流感病毒抗体阳性对照在流感病毒抗原组的C2大于其阴性对照A2的值不到3倍则说明实验窗口太小,判为实验异常,结果不可靠;如果,B行的新冠抗体阳性对照在B1孔的OD值等于或小于其在B2孔的OD值,或C行的流感抗体阳性对照在C2孔的OD值等于或小于其在C1孔的OD值,则说明实验出差错或试剂盒设计不合理,判为实验异常,结果不可靠;需要重新检测。
10.一种可区别新冠病毒抗体和流感病毒抗体的免疫层析检测试剂盒,其特征在于,含有两个检测卡,每个检测卡由样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素层析膜、吸水垫及PVC胶板组成;两个检测卡的胶体金结合垫上都相同地含有胶体金标记的动物抗人IgG或/和IgM抗体,和胶体金标记的动物质控抗体;但其中一条检测卡的硝酸纤维素层析膜上固定有一条含新冠病毒抗原的T检测线和一条抗质控抗体的C质控线;而另一条检测卡硝酸纤维素层析膜上固定有一条含流感病毒抗原的T检测线和一条抗质控抗体的C质控线。
11.一种可区别新冠病毒抗体和流感病毒抗体的免疫层析检测试剂盒,其特征在于,含有两个检测卡,每个检测卡由样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素层析膜、吸水垫及PVC胶板组成;两个检测卡的硝酸纤维素层析膜上都相同地固定有一条或两条动物抗人IgG或IgM,或IgG和IgM抗体的检测线,和一条动物抗质控抗体的质控线;但其中一个检测卡的胶体金结合垫上含有胶体金标记的新冠病毒抗原和胶体金标记的质控抗体;而另一条检测卡的胶体金结合垫上含有胶体金标记的流感病毒抗原和胶体金标记的质控抗体。
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