CN103940990A - 一种灵敏度增强型金标免疫层析试纸条及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种灵敏度增强型金标免疫层析试纸条，该试纸条背板上依次粘贴样品加样垫、金标抗体垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中在所述试纸条背板上还含有pH修正缓冲垫、促反应缓冲垫和促释放缓冲垫中的至少一种。本发明的灵敏度增强型金标免疫层析试纸条能有效延长待测品中抗原与试纸条中金标抗体的反应时间，使抗原与抗体的结合更加充分，提高了检测的灵敏度，实现了传统竞争法原理的试纸条无法实现的高灵敏度。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种金标免疫层析试纸条及其制备方法。
背景技术
免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique)是上世纪80年代继荧光素、放射性同位素和酶标技术后发展起来的固相标记免疫测定技术。免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。
免疫胶体金技术具有以下优点：
(1)使用方便快速，便于基层使用和现场使用，所有反应能在15分钟内完成；
(2)成本低，不需要特殊的仪器设备；
(3)应用范围广，可适应多种检测条件；
(4)可以进行多项检测，若阳性样本比较难获得，多项检测可以节省样品，降低成本；
(5)标记物稳定，标记样品在4℃贮存两年以上，无信号衰减现象；
(6)胶体金本身为红色，不需要加入发色试剂，省却了酶标的致癌性底物及终止液的步骤，对人体无毒害。
胶体金作为免疫标记物始于1971年，由Faulk和Taylor将其引入免疫化学。Faulk和Taylor首先将兔抗沙门氏菌抗血清与胶体金颗粒结合，用直接免疫细胞化学技术检测沙门氏菌的表面抗原。此后，他们还把胶体金与抗胶原血清、植物血凝素、卵白蛋白、人免疫球蛋白轻链、牛血清白蛋白结合应用。1974年Romano和他的同事们将胶体金标记在马抗人的IgG上，实现了间接免疫金染色法。层析法检测试剂最早出现于1988年，是Unipath公司利用染料颗粒开发生产的一种非常方便使用的怀孕检测试剂。1989年，Spielberg F等发展了以胶体金为标记物用于检测艾滋病毒抗体的渗滤法检测试剂，此后，免疫胶体金在快速检测试剂中得到了广泛的应用和发展，相伴随的层析法检测试剂在组成结构、生产用的材料等方面也取得了长足的进步。
目前胶体金标记检测技术已广泛应用于医学临床诊断，以及食品药品卫生检验中，如早孕、乙肝、寄生虫、兴奋剂、抗生素的检测。该方法最大的特点是单份测定、简单快速、特异灵敏、成本低廉，不使用任何仪器，检测结果肉眼判读，并可保存检测结果。目前市场上普遍存在的金标试纸条由塑料如PVC背板以及在背板上依次粘贴的样品加样垫、金标抗体垫、硝酸纤维素膜和吸水垫组成。
目前的金标试纸条都存在灵敏度低的不足，因此目前市场上迫切需要一种灵敏度高的金标试纸，以进一步拓宽金标试纸条的应用范围和领域。
发明内容
本发明针对现有的金标试纸条的灵敏度不高的研究现状，提供一种灵敏度增强型金标免疫层析试纸条，试纸条背板上依次粘贴样品加样垫、金标抗体垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中在所述试纸条背板上还可以含有pH修正缓冲垫、促反应缓冲垫和促释放缓冲垫中的至少一种，pH修正缓冲垫在样品加样垫和金标抗体垫之间，促反应缓冲垫和促释放缓冲垫在金标抗体垫和硝酸纤维素膜之间。各种垫之间的粘贴通过背板上的胶；背板可以是本领域技术人员所熟知的用于金标免疫层析试纸条背板的各种材料，诸如可以是塑料例如PVC、PE和PP等等。
pH修正缓冲垫、促反应缓冲垫和促释放缓冲垫能够调整不同样本pH和延缓释放速度、有效延长待测品中抗原与试纸条中金标抗体的反应时间，使抗原与抗体的结合更加充分，进而提高检测的灵敏度；其中pH修正缓冲垫的作用在于修正待测样品自身的pH条件，使层析过程处于抗原与抗体反应最适pH状态下；促反应缓冲垫的作用在于延长抗原与抗体反应时间，促进抗原与抗体充分反应；促释放缓冲垫的作用在于利用较高浓度表面活性剂加速金标抗体抗原复合物的释放。
在一种实施方式中，试纸条背板上依次粘贴样品加样垫、pH修正缓冲垫、金标抗体垫、促反应缓冲垫、促释放缓冲垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。
在一种实施方式中，试纸条背板上依次粘贴的各垫之间的重叠部分的长度为0.5~4mm；优选为1~2mm。相邻垫之间重叠部分长度对于金标免疫层析试纸条的层析液涌动产生影响，重叠部分太长会导致涌动不均匀。
在一种实施方式中，所述pH修正缓冲垫可以由涂抹具有修正偏酸性或者偏碱性样品pH值的缓冲溶液的玻璃纤维膜、聚酯膜、纤维素滤纸、或无纺布构成；和/或所述促反应缓冲垫可以由涂抹具有延长抗原与抗体反应时间、促进抗原与抗体充分反应的溶液的玻璃纤维膜、聚酯膜、纤维素滤纸、或无纺布构成；和/或所述促释放缓冲垫可以由涂抹具有加速金标抗体抗原复合物释放的溶液的玻璃纤维膜、聚酯膜、纤维素滤纸、无纺布构成。pH修正缓冲垫、促反应缓冲垫和促释放缓冲垫都可以匀质传导目标检测物。
用于修正偏酸性或者偏碱性样品pH值的缓冲溶液可以是磷酸缓冲溶液、三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液、硼酸缓冲溶液等等。优选地可以是10~50mM、pH值为7.5~8.5磷酸盐缓冲溶液。
用于促反应缓冲垫的溶液可以是磷酸缓冲溶液、三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液、硼酸缓冲溶液等等；优选地可以是10~50mM、pH值为7.5~8.5三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液。
用于促反应缓冲垫的溶液可以是含有表面活性剂的磷酸缓冲溶液、三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液、硼酸缓冲溶液等等；优选地可以是含有表面活性剂的10~50mM、pH值为7.5~8.5三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液。加入到促反应缓冲垫的缓冲液中的表面活性剂可以是本领域中常用的各种表面活性剂，例如可以是10%吐温20、10%Triton-X100。
在一种实施方式中，本发明灵敏度增强型金标免疫层析试纸条可以用于基于免疫竞争法测定的各种分析物的测定，例如可以用于检测样品中的盐酸克伦特罗、莱克多巴胺或沙丁胺醇。
本发明灵敏度增强型金标免疫层析试纸条在4℃~30℃条件下干燥封装保存。本发明在常规胶体金金标免疫层析试纸条中引入pH修正缓冲垫、促反应缓冲垫和促释放缓冲垫，pH修正缓冲垫为免疫反应提供了合适的pH，促反应缓冲垫和促释放缓冲垫能有效延长待测品中抗原与试纸条中金标抗体的反应时间，使抗原与抗体的结合更加充分，提高了检测的灵敏度，实现了传统竞争法原理的试纸条无法实现的高灵敏度。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明的灵敏度增强型金标免疫层析试纸条的侧面结构示意图，
图2为本发明的灵敏度增强型金标免疫层析试纸条的不同检测结果构示意图，其中A表示阴性，B表示阳性，和C表示无效。
在图1和图2中：“1”表示试纸条背板，“2”表示样品加样垫，“3”表示pH修正缓冲垫，“4”表示金标抗体垫，“5”表示促反应缓冲垫，“6”表示促释放缓冲垫，“7”表示硝酸纤维素膜，“8”表示吸水垫，“9”表示检测线，和“10”表示参照线。
具体实施方式
为了使本领域技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。
实施例1：灵敏度增强型盐酸克伦特罗金标免疫层析试纸条的制备
制备灵敏度增强型盐酸克伦特罗金标免疫层析试纸条的具体步骤如下：
（1）pH修正缓冲垫的制备
配置pH值为8.0的10mM磷酸缓冲溶液，得到调节后的缓冲溶液A；
将缓冲溶液A均匀涂抹到玻璃纤维膜上，得到pH修正缓冲垫。
（2）金标抗体垫的制备
选取粒径为40nm的胶体金溶液，用浓度为0.1M的碳酸钾溶液调节胶体金溶液的pH值至8.0，得到调节后的胶体金溶液B；
将浓度为1mg/mL的鼠抗盐酸克伦特罗单克隆抗体溶液10ul加入到1mL调节后的胶体金溶液B中，室温下混匀反应20min；
在温度4℃条件下，以11000rpm的速度离心15min，去除上清溶液；
将离心得到的沉淀重新分散于10mM磷酸盐缓冲溶液中，得到盐酸克伦特罗金标免疫探针溶液C；
将金标免疫探针溶液C均匀涂抹到玻璃纤维膜上，得到金标抗体垫。
（3）促反应缓冲垫的制备
配置10mM三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液，用浓度为0.1M的盐酸溶液调节pH值至8.0，得到调节后的缓冲溶液D，均匀涂抹到玻璃纤维膜上，得到促反应缓冲垫。
（4）促释放缓冲垫的制备
配置10mM三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液，用浓度为0.1M的盐酸HCl溶液调节pH值至8.0，得到调节后的缓冲溶液D；
将浓度为10%的吐温20溶液30ul加入到1mL缓冲溶液D中，均匀涂抹到玻璃纤维膜上，得到促释放缓冲垫。
（5）具有检测线和参照线的硝酸纤维素膜的制备
分别用浓度为1mg/ml的盐酸克伦特罗-BSA偶联物溶液和浓度为1mg/ml的羊抗鼠抗体溶液在硝酸纤维素膜上划两条平行线。盐酸克伦特罗-BSA偶联物划线作为检测线，羊抗鼠抗体溶液划线为参照线。
（6）灵敏度增强型金标免疫层析试纸条的制备
参见图1，在PVC背板1上分别依次粘贴样品加样垫2，pH修正缓冲垫3，金标抗体垫4，促反应缓冲垫5，促释放缓冲垫6，硝酸纤维素膜7和吸水垫8；相邻粘贴物之间重叠部分的长度为2mm，干燥封装，温度4℃~30℃条件下保存。图1中箭头表示液体毛细作用方向。
参见图1和2，样品加样垫的长度为14mm，pH修正缓冲垫长度为4mm，金标抗体垫的长度为4mm，促反应缓冲垫的长度为4mm，促释放缓冲垫的长度为4mm；硝酸纤维素膜的长度为25mm，吸水垫的长度为19mm；检测线宽度为0.8mm，和参照线宽度为0.8mm。
使用时，将含有盐酸克伦特罗的待检测溶液滴加到灵敏度增强型盐酸克伦特罗金标免疫层析试纸条的样品加样垫上，等待10分钟后取出用肉眼观察检测结果。如果膜上的检测条带和对照条带同时显色表明检测结果有效且检测结果为阴性，如图2中A所示；如果膜上的检测条带不显色，表示待检测溶液中含有目标检测物盐酸克伦特罗，为阳性结果，如图2中B所示；如只有检测条带显色而对照条带不显色，表明检测结果无效，如图2中C所示。
试验结果证明，用本发明的灵敏度增强型盐酸克伦特罗金标免疫层析试纸条检测盐酸克伦特罗的灵敏度为1.0ng/ml，而用传统试纸条灵敏度仅为3.0ng/ml。
实施例2：灵敏度增强型莱克多巴胺金标免疫层析试纸条的制备
制备灵敏度增强型莱克多巴胺金标免疫层析试纸条的具体步骤如下：
（1）pH修正缓冲垫的制备
配置pH值为8.0、10mM磷酸缓冲溶液，得到调节后的缓冲溶液A；
将缓冲溶液A均匀涂抹到玻璃纤维膜上，得到pH修正缓冲垫。
（2）金标抗体垫的制备
选取粒径为30nm的胶体金溶液，用浓度为0.1M的碳酸钾溶液调节胶体金溶液的pH值至8.0，得到调节后的胶体金溶液B；
将浓度为1mg/mL的鼠抗莱克多巴胺单克隆抗体溶液8ul加入到1mL调节后的胶体金溶液B中，室温下混匀反应20min；
在温度4℃条件下，以11000rpm的速度离心15min，去除上清溶液；
将离心得到的沉淀重新分散于10mM磷酸盐缓冲溶液中，得到莱克多巴胺金标免疫探针溶液C；
将金标免疫探针溶液C均匀涂抹到玻璃纤维膜上，得到金标抗体垫。
（3）促反应缓冲垫的制备
配置10mM三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液，用浓度为0.1M的盐酸溶液调节pH值至8.0，得到调节后的缓冲溶液D，均匀涂抹到玻璃纤维膜上，得到促反应缓冲垫。
（4）促释放缓冲垫的制备
配置10mM三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液，用浓度为0.1M的盐酸溶液调节pH值至8.0，得到调节后的缓冲溶液D；
将浓度为10%的吐温20溶液20ul加入到1mL缓冲溶液D中，均匀涂抹到玻璃纤维膜上，得到促释放缓冲垫。
（5）具有检测线和参照线的硝酸纤维素膜的制备
分别用浓度为1mg/ml的莱克多巴胺-BSA偶联物溶液和浓度为1mg/ml的羊抗鼠抗体溶液在硝酸纤维素膜上划两条平行线。莱克多巴胺-BSA偶联物划线作为检测线，羊抗鼠抗体溶液划线为参照线。
（6）灵敏度增强型金标免疫层析试纸条的制备
参见图1，在PVC背板1上分别依次粘贴样品加样垫2，pH修正缓冲垫3，金标抗体垫4，促反应缓冲垫5，促释放缓冲垫6，硝酸纤维素膜7）和吸水垫8；相邻粘贴物之间重叠部分的长度为2mm，干燥封装，温度4℃~30℃条件下保存。检测结果示意图参见图2。
试验结果证明，用本发明的灵敏度增强型莱克多巴胺金标免疫层析试纸条检测莱克多巴胺的灵敏度为1.0ng/ml，而用传统试纸条灵敏度仅为3.0ng/ml。
实施例3：灵敏度增强型沙丁胺醇金标免疫层析试纸条的制备
制备灵敏度增强型沙丁胺醇金标免疫层析试纸条的具体操作步骤如下：
（1）pH修正缓冲垫的制备
配置pH值为8.0、10mM磷酸缓冲溶液，得到调节后的缓冲溶液A；
将缓冲溶液A均匀涂抹到玻璃纤维膜上，得到pH修正缓冲垫。
（2）金标抗体垫的制备
选取粒径为40nm的胶体金溶液，用浓度为0.1M的碳酸钾溶液调节胶体金溶液的pH值至8.2，得到调节后的胶体金溶液B；
将浓度为1mg/mL的鼠抗沙丁胺醇单克隆抗体溶液12ul加入到1mL调节后的胶体金溶液B中，室温下混匀反应20min；
在温度4℃条件下，以11000rpm的速度离心15min，去除上清溶液；
将离心得到的沉淀重新分散于10mM磷酸盐缓冲溶液中，得到沙丁胺醇金标免疫探针溶液C；
将金标免疫探针溶液C均匀涂抹到玻璃纤维膜上，得到金标抗体垫。
（3）促反应缓冲垫的制备
配置10mM三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液，用浓度为0.1M的盐酸溶液调节pH值至8.0，得到调节后的缓冲溶液D，均匀涂抹到玻璃纤维膜上，得到促反应缓冲垫。
（4）促释放缓冲垫的制备
配置10mM三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液，用浓度为0.1M的盐酸溶液调节pH值至8.0，得到调节后的缓冲溶液D；
将浓度为10%的吐温20溶液20ul加入到1mL缓冲溶液D中，均匀涂抹到玻璃纤维膜上，得到促释放缓冲垫。
（5）具有检测线和参照线的硝酸纤维素膜的制备
分别用浓度为1mg/ml的沙丁胺醇-BSA偶联物溶液和浓度为1mg/ml的羊抗鼠抗体溶液在硝酸纤维素膜上划两条平行线。沙丁胺醇-BSA偶联物划线作为检测线，羊抗鼠抗体溶液划线为参照线。
（6）灵敏度增强型金标免疫层析试纸条的制备
参见图1，在PVC背板1上分别依次粘贴样品加样垫2，pH修正缓冲垫3，金标抗体垫4，促反应缓冲垫5，促释放缓冲垫6，硝酸纤维素膜7和吸水纸8；相邻粘贴物之间重叠部分的长度为2mm，干燥封装，温度4℃~30℃条件下保存。检测结果示意图参见图2。
试验结果证明，用本发明的灵敏度增强型沙丁胺醇金标免疫层析试纸条检测沙丁胺醇的灵敏度为3ng/ml，而用传统试纸条灵敏度仅为10ng/ml。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
Claims (9)
1.一种金标免疫层析试纸条，试纸条背板上依次粘贴样品加样垫、金标抗体垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中在所述试纸条背板上还含有pH修正缓冲垫、促反应缓冲垫和促释放缓冲垫中的至少一种，pH修正缓冲垫在样品加样垫和金标抗体垫之间，促反应缓冲垫和促释放缓冲垫在金标抗体垫和硝酸纤维素膜之间。
2.根据权利要求1所述的免疫层析试纸条，其中在所述试纸条背板上依次粘贴样品加样垫、pH修正缓冲垫、金标抗体垫、促反应缓冲垫、促释放缓冲垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。
3.根据权利要求1所述的免疫层析试纸条，其中在所述试纸条背板上依次粘贴的各垫之间的重叠部分的长度为0.5~4mm。
4.根据权利要求3所述的免疫层析试纸条，其中在所述试纸条背板上依次粘贴的各垫之间的重叠部分的长度为1~2mm。
5.根据权利要求1所述的免疫层析试纸条，所述pH修正缓冲垫是由涂抹具有修正偏酸性或者偏碱性样品pH值的缓冲溶液的玻璃纤维膜、聚酯膜、纤维素滤纸、或无纺布构成；和/或所述促反应缓冲垫是由涂抹具有延长抗原与抗体反应时间、促进抗原与抗体充分反应的溶液的玻璃纤维膜、聚酯膜、纤维素滤纸、或无纺布构成；和/或所述促释放缓冲垫是由涂抹具有加速金标抗体抗原复合物释放的溶液的玻璃纤维膜、聚酯膜、纤维素滤纸、无纺布构成。
6.根据权利要求5所述的免疫层析试纸条，其中涂抹pH修正缓冲垫的溶液为10~50mM、pH值为7.5~8.5磷酸盐缓冲溶液；和/或涂抹所述促反应缓冲垫的溶液为10~50mM、pH值为7.5~8.5三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液；和/或涂抹所述促反应缓冲垫的溶液为含有表面活性剂的10~50mM、pH值为7.5~8.5三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液。
7.根据权利要求6所述的免疫层析试纸条，其中加入到涂抹促反应缓冲垫的溶液的表面活性剂为10%吐温20。
8.根据权利要求1-7任一所述的免疫层析试纸条在基于免疫竞争法原理的各种样品检测中的应用。
9.根据权利要求1-7任一所述的免疫层析试纸条用于检测盐酸克伦特罗、莱克多巴胺或沙丁胺醇的应用。
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| C53 | Correction of patent of invention or patent application | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 100015 Beijing Chaoyang District, East Jiuxianqiao Road, building M2, floor 1, No. 5 Applicant after: BEIJING YICHENG BIOELECTRONICS TECHNOLOGY Co.,Ltd. Address before: 100015 Beijing Chaoyang District, East Jiuxianqiao Road, building M2, floor 1, No. 5 Applicant before: BEIJING YICHENG BIOELECTRONICS TECHNOLOGY Co.,Ltd. |
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| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: APPLICANT; FROM: YICHENG BIOLOGICAL ELECTRONIC TECHNOLOGY CO., LTD., BEIJING TO: BEIJING YICHENG BIOELECTRONIC TECHNOLOGY CO., LTD. |
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| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20231219 Address after: 101300, Building 1, No. 5 Dasheng Road, Shunyi District, Beijing, 1st to 3rd floors, Room 101, 2nd floor, 201 Patentee after: Beijing Yixin Biotechnology Co.,Ltd. Address before: 100015 5th floor, building m2, No.1 Jiuxianqiao East Road, Chaoyang District, Beijing Patentee before: BEIJING YICHENG BIOELECTRONICS TECHNOLOGY Co.,Ltd. |
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| TR01 | Transfer of patent right |