CN105116143A - 多项呼吸道病原体检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

多项呼吸道病原体检测试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种多项呼吸道病原体检测试剂盒及检测方法，多项呼吸道病原体检测试剂盒包括样品抽提液，样品管，多联检试剂板；每个多联检试剂板包含连接板和至少一个单一试剂板；单一试剂板包括卡板和试剂条；卡板的一端设有连接部，连接部与连接板可拆卸连接；卡板上表面设有加样孔和检测窗口；每个试剂条包括PVC板，层析膜，样品垫，结合垫和吸水材料；每个结合垫上面固定至少一种荧光标记的待测呼吸道病原体相应的抗体，每个层析膜上包含质控线C和至少一条检测线T，T线固定有一种相应待测呼吸道病原体对应的抗体，C线固定有羊抗鼠的IgG的多克隆抗体。本发明的试剂盒操作简单，方便快捷；检测用时短；检测特异性强；灵敏度高。

Description

多项呼吸道病原体检测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明属于医学检测领域，涉及一种多项呼吸道病原体检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
现有的七项呼吸道病原体检测试剂盒（免疫荧光法）是荧光素标记的抗体与细胞上的病毒抗原结合，形成抗体抗原复合物，在荧光显微镜下观察呈现绿色荧光的细胞个数。
主要技术缺陷：（1）样本处理过程复杂，样本需要多次离心、洗涤去除黏液层，制成细胞悬浊液；（2）检测过程复杂，时间比较长需要1-2个小时。（3）需要使用荧光显微镜，仪器昂贵，并且需要技术人员操作。（4）定性检测到样本中的有无病毒，不能确定病毒数量。（5）只能检测感染细胞的病毒，不能检测到样本中游离的病毒；当少数病毒感染细胞时，可能因感染的病毒数量较少，未能观察到绿色荧光细胞，出现假阴性现象。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的多项呼吸道病原体检测试剂盒及其检测方法，以实现检测操作简单；检测用时短，操作简便；检测特异性强；灵敏度高的目的。
为实现上述目的，本发明采取下述技术方案来实现：
多项呼吸道病原体检测试剂盒，包括样品抽提液，样品管和多联检试剂板，
多联检试剂板包括连接板和至少一个单一试剂板；
单一试剂板包括卡板和试剂条，试剂板的外壳为卡板，试剂条位于卡板内部；
卡板的一端设有连接部，连接部与连接板可拆卸连接；
卡板上表面设有加样孔和检测窗口；
每个试剂条包括PVC板，层析膜，样品垫，结合垫和吸水材料；
卡板上的加样孔位于样品垫之上，
每个试剂条的结合垫上固定有至少一种荧光标记的呼吸道病原体的单克隆抗体，层析膜上包含有质控C线，至少一条检测T线，质控线和检测线均位于卡板的检测窗口内，C线固定有羊抗鼠的IgG的多克隆抗体，每条T线均含有一种与结合垫上荧光标记抗体相对应的抗体。
根据不同需要，本发明可以做成不同数目的多联病原体试剂盒。
进一步，试剂盒还包括样品管支架和棉签。
进一步，卡板的连接部为一凹槽，所述凹槽设置在卡板一端的侧表面上；连接板设有与凹槽相对应的凸起。
进一步，所述连接板的凸起长度为凹槽长度的至少一倍。
进一步，样品抽提液为磷酸缓冲液、Tris缓冲液、硼酸缓冲液中的一种。
进一步，所述样品抽提液中含有质量分数1%的表面活性剂TritonX-100。
本发明还提供一种多项呼吸道病原体的检测方法，包括以下步骤：
步骤a，采取待测样本；
步骤b，使用上述的试剂盒，将取出的样品放入样品管中，并加入样品抽提液混合均匀；
步骤c，分别在每个单一试剂板的加样孔中滴加步骤b中混合均匀的待测样品液进行反应；也可根据待测病原体的种类选取相应数目的试剂板；
步骤d，将反应后的试剂板插入荧光免疫分析仪器中进行检测，得到检测结果。
进一步，步骤b中加入的样品抽提液体积与样品体积比为1:1。
进一步，步骤d中仪器的检测波段为激发光波长365nm，发射光波长610nm。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明的试剂盒和检测方法是采用荧光免疫层析技术，其基本原理是免疫层析检测方法和荧光标记技术的结合，产品是采用的是抗原抗体反应方法，即将待测抗原相应的抗体固定于载体T线上，同时将荧光标记好的另一个抗体固定于结合垫上。当样本中含有待检测物质时，待检测物质和固定在结合垫上的荧光标记抗体反应，在层析至固定于T线位置上的抗体处，和该抗体反应形成复合物，在激发光的作用下，在T线位置有荧光条带出现，荧光条带的强弱与待测物质的浓度呈线性关系。
试剂板可以拆卸，即可同时检测多种呼吸道病原体，也可检测单一一种病原体。且拆卸下单一的试剂板检测时，不会对其他的试剂板造成交叉污染。
应用本发明的检测试剂盒和检测方法时，样本无需特殊处理，只需要抽提液稀释样本即可。且通过抽提液处理可以释放出细胞中的病原体。检测用时仅需要15-20min，时间短，操作简便。使用的配套仪器价格低廉，操作方便。
本产品以病原体的抗原和抗体的特异性结合反应，加之荧光物质强化特异性反应效果，大大提高了产品的性能，特异性强，灵敏度高。
在患者感染的初期（2-3天左右），仅有少量的病原体时。本试剂盒较高的特异性和灵敏度，能够准确判断病原体的阳性感染情况，在感染初期即可确定是否感染各种病原体，同时可以定量检测样本中的病原体数量，为治疗提供依据。
附图说明
图1是本发明实施例1中七联检试剂板的立体示意图；
图2是比较例的检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述。
实施例1
一种七项呼吸道病原体检测试剂盒
该试剂盒包括七联检试剂板，样品抽提液，样品管，棉签和样品管架。
其中样品抽提液为磷酸缓冲液，其浓度是10nM，并含有质量分数1%的表面活性剂TritonX-100。
样品管为普通样品管即可，无特殊要求。
棉签用于辅助样本的采集，适用于鼻腔取样。
样品管架用于支撑样品管，便于操作。
七联检试剂板如图1所示，包括试剂板1，试剂板2，试剂板3和连接板4；三个试剂板结构相同，均一端与连接板4相连。
每个单一试剂板包括卡板和试剂条。
其中卡板包括上下两块，两块卡板合在一起形成试剂板的外壳，试剂条位于两块卡板中间的空腔内。
卡板的一端设有连接部31，连接部31与连接板4可拆卸连接。本实施例中，卡板的连接部31为一凹槽，所述凹槽设置在卡板一端的侧表面上。凹槽的开口宽度小于凹槽底部宽度，可以保证卡板与连接板4稳固连接，而不会轻易脱离。
连接板4设有与凹槽相匹配的凸起，凸起长度为单个凹槽长度的三倍。通过凹槽与凸起的配合，实现卡板和连接板4的可拆卸连接。
为了便于握持，连接板4上表面开设多个握持槽41。
卡板的上表面设有加样孔12和检测窗口13。
其中加样孔12对应试纸条的加样位置，检测窗口13对应试纸条的检测位置。
试剂条为免疫层析试纸条，包括PVC板，层析膜，样品垫，结合垫和吸水材料。
吸水材料位于层析膜样品流动方向的末端，确保产品能够顺利快速的通过层析膜。
结合垫为玻璃纤维，每个试剂板的结合垫上面固定有两种或者三种荧光标记的呼吸道病原体单克隆抗体。
层析膜为硝酸纤维素膜，层析膜上包含检测线T和质控线C，检测线T和质控线C均位于卡板的检测窗口内，其中每个试剂板T线位置固定有一种与结合垫上荧光标记的病毒抗体相对应的另一个病毒单克隆抗体，C线位置固定有羊抗鼠的IgG的多克隆抗体。
具体的，本试剂盒可以检测的病毒分别为：人流感病毒A（FluA）,人流感病毒B（FluB），腺病毒（ADV），呼吸道合胞病毒（RSV），人副流感病毒（HPIV1），人副流感病毒（HPIV2），人副流感病毒（HPIV3）。
试剂板1中的试剂条上的结合垫固定有荧光标记的甲型流感（FluA）单克隆抗体和荧光标记乙型流感（FluB）单克隆抗体。层析膜上包含有质控C线，检测T1线和检测T2线，质控线和检测线均位于卡板的检测窗口内。C线固定有羊抗鼠的IgG的多克隆抗体。T1线含有另一个FluA抗体，T2线含有另一个FluB抗体。
试剂板2的试剂条上的结合垫固定有荧光标记的腺病毒（ADV）单克隆抗体和荧光标记合胞病毒（RSV）单克隆抗体。层析膜上包含有质控C线，检测T1线和检测T2线，质控线和检测线均位于卡板的检测窗口内。C线固定有羊抗鼠的IgG的多克隆抗体。T1线含有另一个腺病毒（ADV）抗体，T2线含有另一个合胞病毒（RSV）抗体。
试剂板3的试剂条上的结合垫固定有荧光标记的副流感I（HPIV1）单克隆抗体、荧光标记的副流感II（HPIV2）单克隆抗体、荧光标记的副流感III（HPIV3）单克隆抗体。层析膜上包含有质控C线，检测T1线，检测T2线和检测T3线，质控线和检测线均位于卡板的检测窗口内。C线固定有羊抗鼠的IgG的多克隆抗体。T1线含有另一个HPIV1抗体，T2线含有另一个HPIV2抗体，T3线含有另一个HPIV3抗体。
使用本实施例中的七项呼吸道病原体检测试剂盒检测待测样本，操作过程如下：
1.取咽拭子样本0.5ml，加入样本管中，然后分别加入0.5ml的样本抽提液，反复挤压样本管数次，使咽拭子样本中病原体尽可能多的释放到样本抽提液中，并且充分混匀样本。
2.在七联检试剂板上的加样孔中，分别滴加100ul（3滴）的待测样本液，等待5-15min。
3.将反应后的试剂板，插入荧光免疫分析仪中，开始检测。仪器的检测波段为激发光波长365nm，发射光波长610nm。
本实施例中病原体检测试剂盒（免疫荧光法）的最小检测灵敏度为：
FluA≤3×104TCID50/0.1ml
FluB≤3.15×104TCID50/0.1ml
ADV≤1.0×104VP/ml(VP:病毒粒子数)
RSV≤1.2×104TCID50/ml
HPIV1≤2.50×104TCID50/ml
HPIV2≤2.50×104TCID50/ml
HPIV3≤8.00×104TCID50/ml。
本实施例中产品的特异性大于99%，交叉反应试验确认，本试剂与18种细菌和真菌、21种病毒及衣原体均没有交叉反应。
在患者感染的初期（2-3天左右），仅有少量的病原体时。而本试剂盒较高的特异性和灵敏度，能够准确判断病原体的阳性感染情况，在感染初期即可确定是否感染病原体，为治疗提供依据。
使用本发明的多项呼吸道病原体试剂盒可以同时检测多项呼吸道病原体，也可以将上述试剂板拆开，成为单一病原体试剂板或者两种病原体检测试剂板，同时检测一种或者两种病原体。
比较例：
贝西-七项呼吸道病原体检测试剂盒（免疫荧光法）。
操作步骤如下：
1.将待检测样本（以咽拭子样本为例）在涡旋振荡仪上震10-15秒，使其充分混匀。将混匀的待测样本离心，在室温下，1000转/分钟，离心10min。离心完成后弃上清。然后再加1-2ml的磷酸缓冲液（PBS），震荡混匀后，再次离心10min，弃上清。加入0.5ml的PBS，充分震荡混匀，形成细胞悬浊液。
2.将处理好的待测样本，滴加在载玻片上。每个载玻片上的七个加样孔各滴加一滴（约25ul）待测样本。
3.然后烘干样本，在恒温箱中，37℃条件下，烘干约30min。
4.取出烘干的载玻片，在预冷的100%丙酮中固定细胞20-30s，取出，自然风干。
5.在风干的细胞上，滴加DFA细胞染色试剂。同一片载玻片上的七个孔，对应滴加七种DFA细胞染色剂。试剂用量以完全覆盖细胞为准，一般一滴约20-30ul。
6.然后，将染色的载玻片放置到恒温箱中，37℃，孵育约30min。
7.孵育完成的载玻片，在稀释好的洗液（PBS缓冲液）中漂洗3min以上，至少需漂洗两次。然后用去离子水清洗3min。
7.清洗完成的载玻片上滴加一滴甘油，并加盖盖玻片。
8.在暗室的荧光显微镜下检测。荧光显微镜的激发光波长490nm，发射光波长520nm。
检测结果如图2所示：只能定性观察是否有病毒感染组织细胞。
灵敏性和特异性检测：
灵敏度：平均能检测出的病毒的最低浓度为1.0PFU。
特异度：89.7%-100%，用筛查和鉴定试剂对多种细胞和微生物进行交叉反应测试，对64种病毒、18种细胞、19种细菌均没有交叉反应。
本发明虽然已以较佳实施例公开如上，但其并不是用来限定本发明，任何本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围内，都可以利用上述揭示的试剂盒和技术内容对本发明技术方案做出可能的变动和修改，因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (9)

1.多项呼吸道病原体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括样品抽提液，样品管，多联检试剂板；
每个多联检试剂板包括连接板和至少一个单一试剂板；
单一试剂板包括卡板和试剂条，试剂板的外壳为卡板，试剂条位于卡板内部；
卡板的一端设有连接部，连接部与连接板可拆卸连接；
卡板上表面设有加样孔和检测窗口；
每个试剂条包括PVC板，层析膜，样品垫，结合垫和吸水材料；
卡板上的加样孔位于样品垫之上，
每个试剂条的结合垫上固定有至少一种荧光标记的呼吸道病原体的单克隆抗体，层析膜上包含有质控C线，至少一条检测T线，质控线和检测线均位于卡板的检测窗口内，C线固定有羊抗鼠的IgG的多克隆抗体，每条T线均含有一种与结合垫上荧光标记抗体相对应的抗体。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒还包括样品管支架和棉签。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，卡板的连接部为一凹槽，所述凹槽设置在卡板一端的侧表面上；连接板设有与凹槽相对应的凸起。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述连接板的凸起长度为凹槽长度的至少一倍。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，样品抽提液为磷酸缓冲液Tris缓冲液、硼酸缓冲液中的一种。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述样品抽提液中含有质量分数1%的表面活性剂TritonX-100。
7.一种多项呼吸道病原体的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤a，采取待测样本；
步骤b，使用如权利要求1所述的试剂盒，将取出的样品放入样品管中，并加入样品抽提液混合均匀；
步骤c，分别在每个单一试剂板的加样孔中滴加步骤b中混合均匀的待测样品液进行反应；也可根据待测病原体的种类选取相应数目的试剂板单独检测；
步骤d，将反应后的试剂板插入荧光免疫分析器中进行检测，得到检测结果。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤b中加入的样品抽提液体积与样品体积比为1:1。
9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤d中使用免疫荧光分析仪器的检测波段为激发光波长365nm，发射光波长610nm。
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Inventor after: Chen Gongxiang

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