CN113063951A - 用于同时检测9项呼吸道感染病原体IgM抗体的组合物、试剂盒及检测方法 - Google Patents

用于同时检测9项呼吸道感染病原体IgM抗体的组合物、试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本申请属于病原体检测技术领域，具体公开用于同时检测9项呼吸道感染病原体IgM抗体的组合物，其包括组分A和组分B。本申请至少具有以下有益效果之一：本申请提供的组合物可用于同时检测9项呼吸道感染病原体IgM抗体，利用磁性荧光编码微球可以实现自动化的磁力吸附洗涤方式，通过一次加样可同时进行九个免疫反应，并得到九个待检测IgM抗体的结果，所需样本量少，温育时间短，整个反应过程在20分钟内即可完成，提高了整个检测分析速度。

Description

用于同时检测9项呼吸道感染病原体IgM抗体的组合物、试剂 盒及检测方法
技术领域
本申请属于病原体检测技术领域，更具体地说，它涉及一种用于同时检测9项呼吸道感染病原体IgM抗体的组合物、试剂盒及检测方法。
背景技术
呼吸道感染是指人体的鼻腔、咽喉、气管、支气管等呼吸系统被病原体感染，病原体包括细菌、病毒、支原体及衣原体等多种微生物。呼吸道感染是感染性疾病中发病率最高的，也是抗生素使用频率最高、数量最大的疾病。呼吸道感染的临床症状和体征都很相似，但由于不同种类病原体所引起的感染，其治疗方法截然不同，疗效和病程也不尽相同。因此，急需要诊断学方法来区别各种病原微生物，并指导抗生素治疗。诱发呼吸道感染的病原体已报到有很多，常见的有嗜肺军团菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、Q热立克次体、腺病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒等。
嗜肺军团菌：广泛分布于天然淡水域或人工水域，是一种兼性细胞内致病菌，有鞭毛、革兰氏阴性短小球杆菌，人最易感染的是嗜肺军团菌血清I型，非典型性肺炎常伴随有全身症状，10％的肺炎是由嗜肺军团菌血清I型起的。
肺炎支原体：介于病毒与细菌之间一种没有细胞壁的病原体，40％以上的非典型肺炎病例是由肺炎支原体引起的，肺炎支原体引起的肺炎在儿童和青少年中最为常见，肺炎支原体可在呼吸道黏膜上皮潜伏，部分患者无明显症状；但大部分患者为显性感染。3岁以下儿童以上呼吸道感染多见，成人以肺炎表现为主。
Q热立克次体：介于最小细菌和病毒之间一类的原核细胞型微生物，由Q热立克次体引起的全身疾病，会造成发热、非典型性肺炎、肝炎或心内膜炎。
肺炎衣原体：肺炎衣原体极易造成呼吸系统感染，特别是支气管炎和肺炎。在老年人中发病率较高，它所引起的肺炎占所有肺炎病例的10％。肺炎衣原体感染所致的肺炎，症状和体征无特异性，多数起病缓慢；轻症可无明显症状。青少年常有声音嘶哑、干咳、有时发热、咽痛等咽炎、喉炎、鼻窦炎、中耳炎和支气管炎等症状，且可持续数周之久，发生肺炎通常为轻型，与肺炎衣原体感染的临床表现极为相似，并可能伴随肺外表现如红斑结节、甲状腺炎、脑炎和格林-巴利综合征。成年人肺炎多较严重，特别是老年人往往必须住院和呼吸支持治疗。
腺病毒：腺病毒是一种重要的呼吸道病原体，是无外壳的双链DNA病毒，能引起上呼吸道疾病，伴随有急骤发热和轻度呼吸道感染。典型婴幼儿腺病毒肺炎早期与一般细菌性肺炎不同之处为：①大多数病例起病时或起病不久即有持续性高热；②自第3～6病日出现嗜睡、萎靡等神经症状，嗜睡有时与烦躁交替出现，面色苍白发灰，肝肿大显著，之后易见心力衰竭、惊厥等合并症。上述症状提示腺病毒肺炎不但涉及呼吸道，其他系统也受影响；③肺部体征出现较迟，一般在第3～5病日后方出现湿性罗音，病变面积逐渐增大，易有叩诊浊音及呼吸音减低，喘憋于发病第二周日渐严重；多见于并症。上述症状提示腺病毒肺炎不但涉及呼吸道，其他系统也受影响，多见于6个月至2岁的婴幼儿腺病毒肺炎最为危重。
呼吸道合胞病毒：是RNA病毒，该病经空气飞沫和密切接触传播，近十年来合胞病毒肺炎及毛细支气管炎占我国婴幼儿病毒性肺炎第一位，呼吸道合胞病毒(RSV)是两岁以下幼儿呼吸道感染的主要病原体，在冬季爆发流行，婴幼儿症状较重，可有高热、鼻炎、咽炎及喉炎，以后表现为细支气管炎及肺炎。少数病儿可并发中耳炎、胸膜炎及心肌炎等。成人和年长儿童感染后，主要表现为上呼吸道感染。
甲型流感：球形RNA病毒，甲型H1N1流感症状与感冒类似，每年都会发生，患者会出现发烧、咳嗽、疲劳、食欲不振等。有报道说，美国2009年疫情中发现病例的主要表现为突然发热、咳嗽、肌肉痛和疲倦，其中一些患者还出现腹泻和呕吐症状；包括发热、咳嗽、喉痛、身体疼痛、头痛、乏力、精神不好、食欲不振等、发冷和疲劳等，有些还会出现腹泻或呕吐、肌肉痛或疲倦、眼睛发红等。
流感病毒：它是流感的病原体，在具有潜在病理学的患者中会产生严重的并发症。由于它易于与其它呼吸道疾病混淆，所以在流行期临床诊断很困难。因此，实验室诊断就显得非常重要。发病开始常有一般的流感症状，如起病急骤，咳嗽、咽痛伴有发热、头痛、肌痛、不适，症状持续进展，出现高热不退气急、发绀、阵咳、咯血痰量常很少，但可带血。继发细菌感染常发生于发病2周内，表现为高热或症状一度减轻后又复加重。痰转为脓性，出现细菌性肺炎的症状、体征。病原多为肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌等。
副流感病毒：副流感病毒1、2和3型在2-4岁儿童中能引起喉气管支气管炎(哮吼)。3型具有流行性，1和2型具有地域性。第1和第3型副流感病毒感染常见于幼儿。局部流行发生于托儿所，儿科病房，小学及其他儿童场所。第3型为地方性流行，传染性强，四季均可发生，多数儿童1岁内可感染。由副流感病毒每年均可发生并交替占主导地位的倾向。第2型引起的疾病更趋于散发。第4型引起轻度呼吸道疾病。在疾病早期有中度咽喉痛和干咳，许多病例声音嘶哑和哮吼症状突出；这种哮吼(急性喉气管支气管炎)是小儿副流感病毒感染最严重和危险的病症。
由于呼吸道感染的临床症状和体征都很相似，但治疗方法、疗效和病程不尽相同，所以有效迅速的确认何种病原微生物的诊断方法，从而针对性的治疗方案，避免抗生素滥用，在临床上有重要意义。
发明内容
目前，临床上主要是通过检测针对特异性病原体的IgM而确认何种病原体，检测特异性病原体IgM的方法主要是间接免疫法，病原体抗原捕获特异性的IgM，然后用偶联示踪物的抗人IgM抗体与所捕获的IgM反应，通过分析示踪物而反映所捕获IgM的浓度。常用的方法如胶体金POCT法，ELISA，以及免疫化学发光，这些方法都是通过单一的免疫反应体系进行，如果检测呼吸道九项病原体，一般都是需要九个独立的免疫反应体系进行检测。因此，研究同时检测多种呼吸道感染病原体称为趋势。例如，一种间接免疫荧光法检测呼吸道感染病原体IgM九项联检试剂盒(国械注进20173406446)，其中，荧光标记物是FITC，一个载玻片上有九个分别固定相应病原体抗原的区域，在每个区域均加入样本，并借助荧光显微镜观察结果。该方法的缺点是手工操作，九次加样，而且靠人工判读。又如，专利CN105866434A公开了《一种免疫层析法检测九项呼吸道感染病原体的IgM的试剂盒》，是经典的胶体金POCT，只是每条板划样三个检测线(即三种病原体抗原)，三联条有开三个视窗壳体，每个视窗有3个抗原的检测线，并联起来一共检测九个项目。侧向免疫层析法的灵敏度低，CV大，并且是三个并联而非一次九项免疫反应。再如，专利CN 110988343A公开了《一种检测九项呼吸道感染病原体IgM抗体的芯片》，在一个芯片上点九个样点，每个样点是包被一种病原体抗原，连续上样九次在点样点进行免疫反应，而实现检测呼吸道感染病原体的IgM。其实质是检测九项病原体，而非同时检测九项病原体，在分别九个点样点进行九次加样和免疫反应，而且免疫反应孵育时间较长，需要80min，出结果的时间较长，不能满足临床需要。
针对临床需求，本申请提供一种同时检测9项呼吸道感染病原体IgM抗体的组合物，该组合物在一个反应池中同时可对呼吸道九种感染病原体的特异性IgM抗体进行免疫学分析检测，只需要实施一次加样，就可以对样本进行九项呼吸道感染病原体的检测分析，实现真正的九项同步检测。
本申请是通过以下方案实现的：
本申请提供了一种用于同时检测9项呼吸道感染病原体IgM抗体的组合物，其包括组分A和组分B，所述组分A含有9种包被不同抗原的磁性荧光编码微球，所述抗原分别为嗜肺军团菌血清1型抗原、肺炎支原体抗原、Q热立克次体抗原、肺炎衣原体抗原、腺病毒抗原、呼吸道合胞病毒抗原、甲型流感病毒抗原、乙型流感病毒抗原和副流感病毒抗原，所述9种磁性荧光编码微球的粒径和/或荧光强度不同；所述组分B含有荧光物质标记的抗人IgM抗体；所述组分B中的荧光物质与组分A的磁性荧光编码微球中的荧光物质不同。
本申请中所述9种磁性荧光编码微球的粒径和/或荧光强度不同，包括9种磁性荧光编码微球的粒径完全不同，荧光强度相同；或者9种磁性荧光编码微球的粒径完全相同，荧光强度完全不同；或者9种磁性荧光编码微球的粒径不同，荧光强度也不同。总之，通过粒径与荧光强度能够完全区分9种磁性荧光编码微球。
本申请中的嗜肺军团菌血清1型抗原、肺炎支原体抗原、Q热立克次体抗原、肺炎衣原体抗原、腺病毒抗原、呼吸道合胞病毒抗原、甲型流感病毒抗原、乙型流感病毒抗原和副流感病毒抗原分别与待测样本中的嗜肺军团菌IgM抗体、肺炎支原体IgM抗体、Q热立克次体IgM抗体、肺炎衣原体IgM抗体、腺病毒IgM抗体、呼吸道合胞病毒IgM抗体、甲型流感病毒IgM抗体、乙型流感病毒IgM抗体、副流感病毒IgM抗体形成第一复合物，之后第一复合物与组分B中的抗人IgM抗体结合形成第二复合物，通过检测第二复合物中的荧光编码微球确定与该荧光编码微球所包被的抗原的类型，进而确定出与该荧光编码微球所包被的抗原相结合的IgM抗体的类型，再通过检测与该IgM抗体结合的抗人IgM抗体的荧光物质的强度，进而测定该IgM抗体的含量。
在本申请的一个具体实施方式中，所述9种磁性荧光编码微球为粒径不同的单荧光的磁性编码微球，或粒径相同的双荧光磁性编码微球。
在本申请的一个具体实施方式中，所述粒径不同的单荧光的磁性编码微球的制备方法包括如下步骤：
(一)磁颗粒微球制备：
1、配置预溶液：将环己烷、正己烷与纳米四氧化三铁甲苯溶液混合均匀备用。
2、分别称取粒径不同的聚苯乙烯介孔微球，分别加入预溶液，超声分散，室温机械搅拌。
(二)磁性编码微球的制备：
1、配置不同浓度的量子点QDS700溶液。
2、将上述不同粒径的磁颗粒微球分别加入到上述不同浓度的量子点溶液中，80℃，机械搅拌12h，迅速冷却至室温，定性滤纸过滤，无水乙醇洗涤，60℃干燥24h，得到不同量子点浓度的不同粒径的磁性编码微球。
(三)功能团包裹
1、将上述不同粒径的磁性编码微球溶于无水乙醇中，超声分散后，加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷，机械搅拌12h；定性滤纸过滤，无水乙醇洗涤，得包裹硅烷层的磁性编码微球。
2、将上述包裹硅烷层的磁性编码微球溶于无水乙醇中，加入丁二酸酐，室温机械搅拌12h，定性滤纸过滤，无水乙醇洗涤，60℃干燥24h，得羧基功能团的磁性编码微球。
在本申请的一个具体实施方式中，所述粒径相同的双荧光的磁性编码微球的制备方法包括如下步骤：
(一)磁颗粒微球制备：
1、配置预溶液：将环己烷、正己烷与纳米四氧化三铁甲苯溶液混合均匀备用。
2、称取同一粒径的聚苯乙烯介孔微球，加入预溶液，超声分散，室温机械搅拌形成磁颗粒微球。
(二)磁性编码微球的制备：
1、分别配置CY-5溶液和量子点QDS700溶液。
2、将CY-5溶液和量子点QDS700溶液以不同的比例进行混合形成含有不同CY-5：QDS700比例的混合液。
3、上述磁颗粒微球分别加入到上述含有不同CY-5：QDS700比例的混合液中，80℃，机械搅拌12h，迅速冷却至室温，定性滤纸过滤，无水乙醇洗涤，60℃干燥24h，得到双荧光磁性编码微球。
(三)功能团包裹
1、将上述双荧光磁性编码微球溶于无水乙醇中，超声分散后，加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷，机械搅拌12h；定性滤纸过滤，无水乙醇洗涤，得包裹硅烷层的磁性编码微球。
2、将上述包裹硅烷层的磁性编码微球溶于无水乙醇中，加入丁二酸酐，室温机械搅拌12h，定性滤纸过滤，无水乙醇洗涤，60℃干燥24h，得羧基功能团的磁性编码微球。
本申请中，对所述磁性荧光编码微球含有磁性物质不做要求，例如可以为四氧化三铁、三氧化二铁或二者的混合等；对所述磁性荧光编码微球含有的荧光物质不做要求，例如可以是荧光染料或者量子点等；对所述抗人IgM抗体又不做具体的要求，可以是鼠抗人IgM抗体或羊抗人IgM抗体等，可以是单抗，也可以是多抗。
本申请中，一种磁性荧光编码微球只能包被一种特异性抗原，九种特异性抗原分别包被于九种不同的磁性编码微球。
本申请中，组分A中，9种包被不同抗原的磁性荧光编码微球可以是等浓度的，也可以根据所包被的抗原分子量的不同，调整磁性荧光编码微球的浓度，但最大浓度差异不超过500倍。
本申请中，组分B中的荧光物质可以为荧光染料或量子点等，但是组分B中的荧光物质与组分A中的荧光物质不同。
本申请另一方面提供一种试剂盒，其包括上述所述的组合物。
在本申请的一个具体实施方式中，所述试剂盒还包括校准品(或定标液)，所述校准品(定标液)包括嗜肺军团菌血清1型IgM抗体、肺炎支原体IgM抗体、Q热立克次体IgM抗体、肺炎衣原体IgM抗体、腺病毒IgM抗体、呼吸道合胞病毒IgM抗体、甲型流感病毒IgM抗体、乙型流感病毒IgM抗体及副流感病毒IgM抗体。
本申请中，所述标准物质可以全是液态，或全是冻干粉，或部分是液态，部分是冻干粉等。
在本申请的一个具体实施方式中，所述试剂盒还包括质控品、洗涤液和定容液中的一种或多种。
在本申请的一个具体实施方式中，清洗磁性荧光编码微球时，每次所述洗涤液的用量为100-2000μL。
在本申请的一个具体实施方式中，定容时，所述定容液的用量为50-2000μL。
在本申请的一个具体实施方式中，所述洗涤液和定容液均为pH值为5.5-9.0的PBS缓冲液，也可以采用pH值为5.5-9.0的Tris缓冲液或其他缓冲液。
本申请另一方面提供一种用于以非诊断目的同时检测9项呼吸道感染病原体IgM抗体的方法，其包括如下步骤：
S1：将权利要求1中的组合物加入到待测样本中，温育；
S2：磁力吸附磁性荧光编码微球；
S3：利用流式细胞仪检测步骤S2中的磁性荧光编码微球。
在本申请的一个具体实施方式中，所述S1中，先将组分A加入到待测样本中，温育10-30min；再将组分B加入到待测样本中，温育10-30min。
在本申请的一个具体实施方式中，所述组分A的制备方法包括如下步骤：
1)磁性荧光编码微球的活化：向磁性荧光编码微球中加入EDC，室温混匀温育，置于磁力架上沉降，弃掉上清，得到活化的编码微球；
2)抗原的包被：将嗜肺军团菌血清1型、肺炎支原体、Q热立克次体、肺炎衣原体、腺病毒，吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒的抗原分别溶解，分别加入到活化后的磁性荧光编码微球中，室温混匀温育，置于磁力架上沉降，弃掉上清，得到包被有抗原的磁性荧光编码微球；
3)向2)中分别加入含有1％BSA的PBS溶液，室温混匀，进行封闭，置于磁力架上沉降，弃掉上清；
4)将3)中的所有的磁性荧光编码微球混合在一起即得组分A。
在本申请的一个具体实施方式中，所述组分B的制备方法包括如下步骤：
A)抗人IgM抗体的活化：利用PBS缓冲液将抗人IgM抗体配制成溶液，按抗人IgM抗体：SMCC的摩尔比为20:1的比例加入SMCC溶液，室温反应，透析除去未反应的SMCC；
B)PE的活化：利用PBS缓冲液将PE配制成溶液，加入DTT，室温反应，透析除去未反应的DTT；
C)将活化后的抗人IgM抗体与活化后的PE混合，在2-8℃反应20小时，然后加入马来酰亚胺终止反应即得组分B。
在本申请的一个具体实施方式中，所述待测样本为血清。
在本申请的一个具体实施方式中，所述待测样本的加入量为5-100μl，优选地，待测样本的加入量为50μl。
本申请提供的组合物至少具有以下有益效果之一：
本申请提供的组合物可用于同时检测嗜肺军团菌血清1型IgM抗体、肺炎支原体IgM抗体、Q热立克次体IgM抗体、肺炎衣原体IgM抗体、腺病毒IgM抗体、呼吸道合胞病毒IgM抗体、甲型流感病毒IgM抗体、乙型流感病毒IgM抗体及副流感病毒IgM抗体9项呼吸道感染病原体IgM抗体，利用磁性荧光编码微球可以实现自动化的磁力吸附洗涤方式，通过一次加样可同时进行九个免疫反应，并得到九个待检测IgM抗体的结果，所需样本用量少，温育时间短，整个反应过程在20分钟内即可完成，提高了整个检测分析速度。
附图说明
图1为本申请实施例中提供的粒径不同的单荧光的磁性编码微球的流式前向散射及侧向散射检测结果图。
图2为本申请实施例中提供的A团中的编码通道PerCP和侧向散射SSC的检测结果图。
图3为本申请实施例中提供的B团中的编码通道PerCP和侧向散射SSC的检测结果图。
图4为本申请实施例中提供的粒径相同的双荧光磁性编码微球的侧向散射SSC和前向散射FSC的检测结果图。
图5为本申请实施例中提供的粒径相同的双荧光磁性编码微球的编码通道APC和APC-Cy7的检测结果图。
图6为本申请实施例A团中通道PerCP(编码)和PE(报告)的分布图。
图7为本申请实施例B团中通道PerCP(编码)和PE(报告)的分布图。
具体实施方式
除非另有定义，本申请中使用的所有技术和科学术语具有与本申请所述技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
下面将结合本申请实施例，对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本申请中主要药物或材料的来源如下表所示。
Figure BDA0002995207090000081
Figure BDA0002995207090000091
实施例1、组合物1
一、粒径不同的单荧光的磁性编码微球的制备(一)磁颗粒微球制备：
1、配制预溶液：取20mL环己烷、20mL正己烷与16mL纳米四氧化三铁甲苯溶液(5mg/mL)混合均匀备用。
2、分别称取粒径为3μ径和5μm的聚苯乙烯介孔微球100mg，分别加入预溶液，超声分散5min(60W)，室温机械搅拌12h(100rpm)。
3、定性滤纸过滤，无水乙醇清洗后，60℃，干燥24h，分装备用。
(二)磁性编码微球的制备：
1、称取量子点QDS700 10μL、20μL、40μL、80μL、160μL分别溶于30mL氯仿/正丁醇(1：1)中，室温机械搅拌12h，配制不同浓度的量子点溶液。
2、称取粒径为3μm的磁颗粒微球50mg分别加入到上述不同浓度的量子点溶液中，80℃，机械搅拌12h，迅速冷却至室温，定性滤纸过滤，无水乙醇洗涤，60℃干燥24h，得到不同量子点浓度的A组磁性编码微球。
3、称取粒径为5μm的磁颗粒微球50mg分别加入到上述量子点溶液浓度分别为10μL、20μL、40μL、80μL的溶液中，80℃，机械搅拌12h，迅速冷却至室温，定性滤纸过滤，无水乙醇洗涤，60℃干燥24h，得到不同量子点浓度的B组磁性编码微球。
将A组磁性编码微球和B组磁性编码微球混合既得不同粒径的单荧光的磁性编码微球。
(三)功能团包裹
1、称取20mg磁性编码微球溶于20ml无水乙醇中，超声分散；加入40μl 3-氨基丙基三乙氧基硅烷，机械搅拌12h；定性滤纸过滤，无水乙醇洗涤，得包裹硅烷层的磁性编码微球；
2、将上述包裹硅烷层的磁性编码微球溶于20mL无水乙醇中，加入0.5g丁二酸酐，室温机械搅拌12h，定性滤纸过滤，无水乙醇洗涤，60℃干燥24h，得羧基功能团的磁性编码微球。
二、组分A的制备
1.磁性编码微球清洗：取1mL(50mg)含有羧基功能团的磁性编码微球分别置于不同的EP管(离心管)中做好标记，磁力架沉降2分钟，弃掉上清，再用10mL 0.02mol/L的pH6.0MES缓冲液重悬磁性编码微球，之后再用磁力架沉降2分钟弃掉上清，再用5mL 0.02mol/L的pH6.0MES缓冲液重悬磁性编码微球，室温暂存备用。
2.磁性编码微球的活化：取清洗后的磁性编码微球，分别加入25mg EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)，室温混匀2小时，置于磁力架上沉降2分钟，弃掉上清，得到活化的磁性编码微球。
3.抗原的包被：将嗜肺军团菌血清1型、肺炎支原体、Q热立克次体、肺炎衣原体、腺病毒，吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒的抗原分别溶解成1mg/mL溶液，分别取2.5mL加入到活化后的磁性编码微球中，室温混匀4小时，置于磁力架上沉降2分钟，弃掉上清，得到包被有抗原的磁性编码微球。
4.分别取10mL含有1％BSA的PBS溶液加入到包被有抗原的磁性编码微球中，室温混匀30分钟，进行封闭。置于磁力架上沉降2分钟，弃掉上清，将所有的磁性编码微球混合在一起，加入含牛血清及BSA的缓冲液将总的磁性编码微球配成4.5mg/mL(每个磁性编码微球的浓度为0.5mg/mL)即得到了包被有嗜肺军团菌血清1型、肺炎支原体、Q热立克次体、肺炎衣原体、腺病毒，吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒九个项目抗原的磁性编码微球的工作液。
如图1所示，通过流式前向散射及侧向散射可以将不同粒径的A、B组磁性编码微球分开，通过编码通道PerCP通道(亦可以选择APC通道)可将B组的微球区分为4个(图2所示)，将A组的微球区分为5个(图3所示)，即根据编码强度及微球的大小确定抗原。本实施例中，A1包被嗜肺军团菌血清1型、A2包被肺炎支原体、A3包被Q热立克次体、A4包被肺炎衣原体、A5包被腺病毒，B1包被吸道合胞病毒、B2包被甲型流感病毒、B3包被乙型流感病毒、B4包被副流感病毒。
三、组分B的制备
a)用0.1mol/L的pH 7.5PBS缓冲液将抗人IgM抗体配制成5mg/ml的浓度，按摩尔比20:1的量加入5mmol/L的SMCC溶液，室温反应2小时，透析除去未反应的SMCC。
b)将0.1mol/L的pH 7.5PBS缓冲液PE，配制成5mg/mL，将DTT固体加入到PE的溶液中，使DTT的终浓度为8mg/mL，室温反应15分钟，未反应的DTT用透析法除去。
c)将活化后的抗人IgM抗体与活化后的PE按照质量比为1:4混合，在2-8℃反应20小时进行连接，然后加入马来酰亚胺终止反应。将连接物抗IgM抗体-PE用含1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液按1/100-1/8000(连接效率不同稀释比不同)稀释即为PE标记抗人IgM抗体的组分B工作液，2-8℃保存待用。
四、定标液(或校准品)制备
用含1％牛血清及5％BSA磷酸盐缓冲液，将嗜肺军团菌血清1型IgM抗体、肺炎支原体IgM抗体、Q热立克次体IgM抗体、肺炎衣原体IgM抗体、腺病毒IgM抗体、呼吸道合胞病毒IgM抗体、甲型流感病毒IgM抗体、乙型流感病毒IgM抗体及副流感病毒IgM抗体混合物稀释为至少六个不同浓度的点，用于制作试剂盒定标曲线。
组分A和组分B构成用于同时检测9项呼吸道感染病原体IgM抗体的组合物1。将组分A和组分B共同包装组盒即为九项呼吸道感人病原体IgM抗体检测用的试剂盒。也可以将定标液及PBS缓冲液中的一种或多种溶液包装放入试剂盒中。
实施例2、组合物2
同实施例1相比，本实施例中抗人IgM抗体与荧光物质的连接不同，其他如磁性编码微球的制备、组分A的制备、组分B的制备以及定标液制备均与实施例1相同。
本实施例中，抗人IgM抗体与FITC(异硫氰酸荧光素)进行连接，制备FITC与抗人IgM抗体的连接物，具体过程如下：
用0.1mol/L的pH 9.0CBS缓冲液(碳酸盐缓冲液)将抗人IgM抗体配制成5mg/ml的浓度，按照摩尔比为15:1的量加入浓度为2mg/mL FITC溶液，混匀室温条件下反应20小时，透析除去未反应的FITC；将FITC标记的抗人IgM抗体按照1/100-1/8000(连接效率不同稀释比不同)稀释成工作液。
实施例3、组合物3
与实施例1相比，本实施例中编码微球的选择与实施例1不同，实施例1中编码微球是通过前向和侧向散射分为两团，每团单荧光编码进行项目区分，本实施例中采用的编码微球为粒径相同的双荧光磁性编码微球，每个编码微球的包被、组分B的制备、定标液的制备均与实施例1相同。
本实施例中粒径相同的双荧光磁性编码微球的制备方法如下：
(一)磁颗粒微球制备：
1、配置预溶液：取20mL环己烷、20mL正己烷与16mL纳米四氧化三铁甲苯溶液(5mg/mL)混合均匀备用。
2、称取100mg聚苯乙烯介孔微球(粒径为5μm)，加入预溶液，超声分散5min(60W)，室温机械搅拌12h(100rpm)。
3、定性滤纸过滤，无水乙醇清洗后，60℃，干燥24小时，分装备用。
(二)磁性编码微球的制备：
1、配制CY-5溶液：以甲醇为溶剂进行配置，溶液浓度为100ug/mL，记为M；
2、配制量子点QDS700溶液：以氯仿/正丁醇(V:V＝1:1)配制成浓度为5mg/ml，记为N；
3、双荧光磁性编码微球的制备：
a组：编码染料/量子点浓度为：10uL M/320uL N，10uL M/640uL N，10uL M/1000uLN。
分别取50mg磁颗粒微球分别加入到上述a组不同浓度的编码染料/量子点溶液中，室温机械搅拌12h，然后80℃，机械搅拌12h后，迅速冷却至室温，定性滤纸过滤，无水乙醇洗涤，60℃干燥，得到a组双荧光磁性编码微球，备用。
b组：编码染料/量子点浓度为：60uL M/160uL N，60uL M/320uL N，60uL M/640uLN。
分别取50mg磁颗粒微球分别加入到上述b组不同浓度的编码染料/量子点溶液中，室温机械搅拌12h，然后80℃，机械搅拌12h后，迅速冷却至室温，定性滤纸过滤，无水乙醇洗涤，60℃干燥，得到b组双荧光磁性编码微球，备用。
c组：编码染料/量子点浓度为：100uL M/80uL N，100uL M/160uL N，100uL M/320uL N。
分别取50mg磁颗粒微球分别加入到上述c组不同浓度的编码染料/量子点溶液中，室温机械搅拌12h，然后80℃，机械搅拌12h后，迅速冷却至室温，定性滤纸过滤，无水乙醇洗涤，60℃干燥，得到c组双荧光磁性编码微球，备用。
将a组、b组和c组中的双荧光磁性编码微球混合即为9种双荧光磁性编码微球。
(三)功能团包裹
1、称取20mg上述9种双荧光磁性编码微球溶于20mL无水乙醇中，超声分散；加入40μL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷，机械搅拌12h；定性滤纸过滤，无水乙醇洗涤，得包裹硅烷层的磁性编码微球；
2、上述包裹硅烷层的磁性编码微球溶于20mL无水乙醇，加入0.5g丁二酸酐，室温机械搅拌12h，定性滤纸过滤，无水乙醇洗涤，60℃干燥24h，得含羧基功能团的磁性编码微球。
二、组分A的制备
1.磁性编码微球选择及抗原的对应：图4为上述含羧基功能团的磁性编码微球的侧向散射SSC和前向散射FSC的检测结果图。由图4可知，9项呼吸道感染病原体IgM抗体为一团。图5为上述9种磁性编码微球的编码通道APC和APC-Cy7的检测结果图。由图5可知，9项呼吸道感染病原体IgM抗体中，不同的IgM抗体的位置不同，因此可以根据图5检测9项呼吸道感染病原体IgM抗体。
图5中，1包被嗜肺军团菌血清1型、2包被肺炎支原体、3包被Q热立克次体、4包被肺炎衣原体、5包被腺病毒，6包被吸道合胞病毒、7包被甲型流感病毒、8包被乙型流感病毒、9包被副流感病毒。
应用实施例4
本应用实施例以实施例1中的组合物1为例进行说明。
收集10例血清样本，利用本申请实施例1中的组合物1、定标液，使用CytoPOC流式细胞仪进行检测。具体检测过程如下：
反应管中加入50μL组分A后，加入待测血清样本或定标液50μL，37℃温育10分钟后，加入组分B 50μL，温育10分钟后，磁力吸附磁性荧光编码微球，并用PBS 200μL洗涤一次，加入100μL PBS定容，利用流式细胞分析仪检测。以比尔赛试剂盒为对照。检测结果如图6、图7和表1所示。
表1流式细胞分析仪检测结果
Figure BDA0002995207090000131
注：“+”表示高于cutoff值(阳性)；“-”表示低于cutoff值(阴性)
如图6、图7和表1所示，本申请实施例1中的组合物1的检测结果与比尔塞有限公司生产的试剂盒的检测结果一致，但在操作上远远优于比尔赛试剂盒。利用本申请实施例1中的组合物进行检测时，仅需一次加样即可得到九个项目的结果，操作简单，反应所需样本量少，时间短(共20min)，效率高。而且本申请中的组合物进行检测时，反应的条件是在液相下进行的，其与化学发光类似，同样具备特异性强，灵敏度高等优势。
综上，本申请提供的组合物可以用于同时检测嗜肺军团菌血清1型IgM抗体、肺炎支原体IgM抗体、Q热立克次体IgM抗体、肺炎衣原体IgM抗体、腺病毒IgM抗体、呼吸道合胞病毒IgM抗体、甲型流感病毒IgM抗体、乙型流感病毒IgM抗体及副流感病毒IgM抗体9项呼吸道感染病原体IgM抗体，检测在20min之内即可完成，极大地缩短了临床检测所需时间，而且操作简单，样本用量少，可以应用于基层检验科、三甲医院及独立医学检验室等。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (10)

1.用于同时检测9项呼吸道感染病原体IgM抗体的组合物，其特征在于，包括组分A和组分B，
所述组分A含有9种包被不同抗原的磁性荧光编码微球，所述抗原分别为嗜肺军团菌血清1型抗原、肺炎支原体抗原、Q热立克次体抗原、肺炎衣原体抗原、腺病毒抗原、呼吸道合胞病毒抗原、甲型流感病毒抗原、乙型流感病毒抗原和副流感病毒抗原，所述9种磁性荧光编码微球的粒径和/或荧光强度不同；
所述组分B含有荧光物质标记的抗人IgM抗体；
所述组分B中的荧光物质与组分A的磁性荧光编码微球中的荧光物质不同。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述9种磁性荧光编码微球为粒径不同的单荧光的磁性编码微球，或粒径相同的双荧光磁性编码微球。
3.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2中所述的组合物。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括校准品，所述校准品包括嗜肺军团菌血清1型IgM抗体、肺炎支原体IgM抗体、Q热立克次体IgM抗体、肺炎衣原体IgM抗体、腺病毒IgM抗体、呼吸道合胞病毒IgM抗体、甲型流感病毒IgM抗体、乙型流感病毒IgM抗体及副流感病毒IgM抗体。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括洗涤液和/或定容液中。
6.一种用于以非诊断目的同时检测9项呼吸道感染病原体IgM抗体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：将权利要求1中的组合物加入到待测样本中，温育；
S2：磁力吸附磁性荧光编码微球；
S3：利用流式细胞仪检测步骤S2中的磁性荧光编码微球。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述S1中，先将组分A加入到待测样本中，温育10-30min；再将组分B加入到待测样本中，温育10-30min。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述组分A的制备方法包括如下步骤：
1）磁性荧光编码微球的活化：向磁性荧光编码微球中加入EDC，室温混匀，置于磁力架上沉降，弃掉上清，得到活化的编码微球；
2）抗原的包被：将嗜肺军团菌血清1型、肺炎支原体、Q热立克次体、肺炎衣原体、腺病毒，吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒的抗原分别溶解，分别加入到活化后的磁性荧光编码微球中，室温混匀，置于磁力架上沉降，弃掉上清，得到包被有抗原的磁性荧光编码微球；
3）向2）中分别加入含有1%BSA的PBS溶液，室温混匀，进行封闭，置于磁力架上沉降，弃掉上清；
4）将3）中的所有的磁性荧光编码微球混合在一起即得组分A。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述组分B的制备方法包括如下步骤：
A）抗人IgM抗体的活化：利用PBS缓冲液将抗人IgM抗体配制成溶液，按抗人IgM抗体：SMCC的摩尔比为20:1的比例加入SMCC溶液，室温反应，透析除去未反应的SMCC；
B）PE的活化：利用PBS缓冲液将PE配制成溶液，加入DTT，室温反应，透析除去未反应的DTT；
C）将活化后的抗人IgM抗体与活化后的PE混合，在2-8℃反应20h，然后加入马来酰亚胺终止反应即得组分B。
10.根据权利要求6-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述待测样本为血清。
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