CN101688179A

CN101688179A - 禽类ebx细胞中的重组蛋白生产

Info

Publication number: CN101688179A
Application number: CN200880017131A
Authority: CN
Inventors: M·梅赫泰里
Original assignee: Vivalis SA
Current assignee: Vivalis SA
Priority date: 2007-05-21
Filing date: 2008-05-21
Publication date: 2010-03-31
Also published as: EA017964B1; MY159013A; CA2687493A1; EA200971056A1; AU2008252902A1; JP2010529833A; NZ580820A; EP2152855A1; ZA200908195B; EP1995309A1; KR20100016540A; US20100226912A1; MX2009012747A; BRPI0810322A2; IL202213A0; WO2008142124A1; AU2008252902B2

Abstract

本发明一般涉及重组蛋白生产领域。更特别地，本发明涉及名为Ebx®的禽类胚胎来源的干细胞系在生产蛋白中的用途，并且更特别地，是在生产糖蛋白如抗体中的用途。本发明用于生产具有高细胞介导的细胞毒活性的单克隆IgG1抗体亚型。本发明涉及这样的抗体作为药物在治疗癌症和炎性疾病中的用途。

Description

禽类EBX细胞中的重组蛋白生产

本发明一般涉及重组蛋白生产领域。更特别地，本发明涉及名为

的禽类胚胎来源的干细胞系在生产蛋白中的用途，且更特别地，涉及在生产糖蛋白如抗体中的用途。本发明用于生产具有高的细胞介导的细胞毒活性的单克隆IgG1抗体亚型。本发明涉及这样的抗体作为药物用于治疗癌症和炎性疾病的用途。

糖蛋白介导人类中的包括催化、信号转导、细胞-细胞通讯和分子识别及群聚(association)的许多基本功能。许多糖蛋白已经被开发其治疗目的。蛋白的寡糖成分能影响与治疗性糖蛋白的效果有关的效能，这些效能包括物理稳定性、对蛋白酶攻击的抗性、与免疫系统的相互作用、药代动力学和特定的生物活性。这样的性质可不仅取决于寡糖的存在或缺如，还取决于寡糖的特定结构。例如，某些寡糖结构介导糖蛋白自血流中通过与特定的糖类结合蛋白的相互作用而快速清除，而其他的能与抗体结合并触发非预期的免疫反应(Jenkins et al.，NatureBiotechnol.，14：975-81(1996))。糖蛋白的例子包括促红细胞生成素(EPO)、组织纤溶酶原激活物(TpA)、干扰素β(IFN-b)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)和治疗性单克隆抗体(Mab)。

大多数抗体在重链恒定区的保守性位置含有糖类结构，其中每种同种型具有独特排列的N-连接的糖类结构，其可变地影响蛋白的组装、分泌或功能性活性(Wright&Morrison(1997)Trends Biotech.15：26-32)。某些G免疫球蛋白的生物活性取决于其分子上的聚糖结构的存在和类型，且特别取决于其Fc成分。已经证明了含有聚糖的残基的存在或缺如对抗体与其效应分子(Fc受体和补体)相互作用能力的影响。通过在存在衣霉素的情况下培养抑制人的IgG1的糖基化造成，例如，该抗体与在单核细胞和巨噬细胞中存在的FcγRI受体的亲合力下降50倍(Leatherbarrow et al.(1985)Molec.Immun.，22：407-415)。IgG上的糖类缺失也影响与FcγRIII受体的结合，因为已经公开非糖基化的IgG3不能诱导ADCC型(抗体依赖的细胞的细胞毒作用)经NK细胞的FcγRIII受体的分解(lysis)(Lund et al.(1990)Molec.Immun.27：1145-1153)。然而，除了这些含有聚糖的残基必须存在之外，更加精确的是他们的导致启动效应物功能的能力不同的结构的异质性。

所有人类和鼠类亚类的IgG分子具有与每条重链的CH2结构域相连的N-寡糖(对于人IgG，在残基Asn 297)。IgG上N-连接的寡糖的一般结构是复杂类型，其特征在于有或无二等分GlcNac/L-岩藻糖(Fuc)的甘露糖基-壳二糖核心(Man3-GlcNac2-Asn)和包括存在或缺乏半乳糖(Gal)和唾液酸的其它链变体(见图17)。此外，寡糖可含有0(G0)、1(G1)或2(G2)Gal(见图17)。添加的N-相连的糖的结构可相当大地变化，这取决于加工的程度，且能包括高甘露糖、多分枝以及双触角的复杂寡糖。一般地，存在连在特定糖基化位点的核心寡糖结构的异质化加工，以使甚至是单克隆抗体以多种糖形存在。已经观察到半乳糖基化的概况，其依赖于个体而可变(人血清IgG1)。这些区别可能反映出这些个体的细胞克隆之间半乳糖基转移酶和其他酶类活性的区别(Jefferis et al.(1990)Biochem J.268：529-537)。同样地，已经显示出，细胞系之间抗体糖基化存在较大区别，并且甚至对于在不同培养条件下的给定细胞系也能看到较小的区别，这些不同的细胞培养条件包括培养基的成分、细胞密度、pH、充氧条件(Lifely et al.(1995)Glycobiology 5(8)：813-22；Kumpel et al.(1994)Hum.Antibodies and hybridomas5：143-151)。

已经进行调查寡糖残基对于抗体的生物活性的功能的研究。Boyd等人(1995Mol.Immunol.32：1311-1318)已显示，IgG的唾液酸对ADCC无影响。数个报道已经显示，Gal残基增强ADCC(kumpel et al.(1994)Hum.Antib.Hybrid 5：143-151；Kumpel et al.(1995)Hum.Antib.Hybrid 6：82-88)。二等分GlcNac，其是转变成核心β-甘露糖(Man)残基的β1，4-GlcNac残基，已牵扯到治疗性抗体的生物性残基(Lifely et al.(1995)Glycobiology 5(8)：813-22)。Shield等人(2002，J.Biol.Chem.277：26733-26740)已经揭示了岩藻糖基化的寡糖对于抗体的效应物功能的影响；已显示出Fuc-缺陷的IgG1与FcγRIII结合的50倍增加和增强的ADCC。

目前，用于治疗性应用(即癌症、炎性疾病…)的广大范围的重组蛋白包含糖基化的单克隆抗体。由于治疗和经济原因，有巨大的兴趣获得更高特异性的抗体活性。一种获得大的能力增加而同时保持在细胞系中的简单生产过程和潜在地避免显著的、非预期的副作用的方法是增强Mab的天然的细胞介导的效应物功能。因此，对IgG的寡糖进行工程化可产生最佳化的ADCC，其被认为是一些治疗性抗体的主要功能，尽管抗体具有多种治疗功能(如抗原结合、诱导细胞凋亡和补体依赖的细胞的细胞毒作用(CDC))。像GLYCART BIOTECHNOLOGYAG(Zurich，CH)这样的公司已经表达出N-乙酰基-葡糖胺转移酶III(GnTIII)，其在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系内催化二等分GlcNac残基加至N-连接的寡糖上，并且产生的IgG1抗体显示出更强的ADCC(WO 99/54342；WO 03/011878；WO2005/044859)。通过从抗体的Fc部分移除或代替岩藻糖，KYOWA HAKKO KOGYO(东京，日本)增强了Fc结合并改进了ADCC，并因此增强Mab的效能(US6,946,292)。更近地，Laboratoire Francais du Fractionnement et des Biotechnologies(LFB)(法国)显示，Mab寡糖中的Fuc/Gal比率应等于或低于0.6以获得具有高ADCC的抗体(FR2861080)。

然而，仍旧需要有在适于大规模生产的细胞中生产人单克隆抗体的另外的方法，这些细胞尚未被工程化以表达或沉默适当的糖基转移酶，及这些细胞提供具有增强的细胞介导的效应物功能的一致的人类类型的糖基化。这是本发明的目标。本发明现在证明，在禽类胚胎来源的干细胞系

中表达的单克隆抗体令人吃惊地显示出类似人的糖基化模式。发明人还发现，在

细胞中生产的很大部分的IgG1抗体群具有双触角类型的普遍的N-连接的寡糖结构，其包含高度半乳糖基化的带有末端GlcNac的长链。接近一半的IgG1抗体群含有未岩藻糖基化的双触角类型的N-连接的寡糖结构，其赋予抗体以强的ADCC活性。本发明提供禽类胚胎来源的干细胞

优选鸡或鸭胚胎来源的干细胞

且更优选鸡EB14细胞或鸭的EB24和EB66细胞，使其遗传工程化以表达重组蛋白，且更特别地，抗体、抗体片段或包括抗体片段的ADCC活性增强的融合蛋白。

禽类胚胎来源的干细胞系

是VIVALIS(Nantes，法国)开发出来的细胞系，该公司利用其在禽类生物学和在禽类胚胎干(ES)细胞方面的专业知识的优势承担了开发满足工业化和管理规范的新型稳定的禽类细胞系的任务。通过使用专利方法(见WO 03/076601)，发明人已经产生出一系列良好鉴定和记录的细胞系(即“

细胞”)而不需遗传的、化学的或病毒的永生化的步骤。在优选的具体实施方式中，本发明所述的禽类细胞是鸡或鸭细胞。

细胞已经通过使用一个完整记录的2个步骤的方法且考虑了所有管理要求(例如常规检测鸡群或鸭群的卫生状况，使用无BSE国家的血清，使用链霉蛋白酶而不是胰蛋白酶，方法中包括的所有成分的来源的认证可查…)生产出来。

步骤1：鸡或鸭ES细胞的体外培养和扩增

胚胎干细胞在下列方面具有独特的特点：(i)在体外它们能像未分化细胞那样无限地自我更新，(ii)它们具有无限的再生能力，(iii)它们保持稳定的染色体内容；(iv)它们表达高水平的端粒酶和特异性细胞表面标记。尽管在全世界范围内已经进行了很多努力，ES细胞仅能从非常有限数目的物种(小鼠、人、猴)中成功分离出来。本发明人在过去的岁月里付出了重要的资源来从不同禽类物种中分离和建立ES细胞，且主要自鸡和鸭中分离和建立ES细胞。这样的研究努力导致成功分离和鉴定鸡ES细胞(Pain et al.1999.Cell Tissues Organs 165：212-219)和鸭ES细胞。本发明人然后开发出专利方法，该方法允许在体外有效培养和大规模地扩增鸡和鸭的ES细胞而未诱导分化。

步骤2：

细胞的衍生

然后本发明人建立专利方法来自禽类ES细胞衍生稳定的贴壁或悬浮的连续的细胞系。该方法包括自细胞培养基中逐渐撤掉血清、饲养细胞和生长因子，并使细胞适应悬浮培养。这些胚胎来源的禽类细胞系保持了ES细胞的所期望的特征的大多数(即无限增殖、表达ES特异性标记如端粒酶、核型稳定)，但此外还表现出新的”工业友好型”的特征(在无血清培养基中悬浮生长到高细胞密度)。

基于它们的吸引人的生物特性，本发明人选择一些鸡的

细胞系进行进一步开发，如悬浮鸡细胞系EB14(见WO 03/076601和WO05/007840)或EBv13。可选地，本发明人选择一些鸭

细胞系进行进一步开发，如EB24、EB26、EB66。

本发明所述的

细胞系是“连续的”，因为它们具有能在体外长时间培养的特征。有利地，本发明所述的细胞能增殖至少50代，至少75代，至少100代，至少125代，至少150代，至少175代，至少200代，至少250代。250代并非是时间限制，因为获得的细胞仍存活并仍然能再传代。不希望被束缚于理论，假定本发明所述的细胞能连续地培养，只要细胞表达端粒酶。实际上，据假定，本发明所述的禽类细胞的端粒酶的高水平表达是遗传稳定性(即本发明所述的禽类

细胞是二倍体)和细胞连续生长的原因。

术语“传代”是指细胞移植稀释或不稀释地自一个培养器皿转移至另外一个培养器皿中。据理解，不管细胞自一个器皿转移至另一器皿任何次数，均可能丢失细胞的一定比例，因此可出现细胞的稀释，不管考虑是否周到。该术语与术语“继代培养”同义。传代数是细胞在培养中(悬浮或是贴壁生长的细胞)被继代培养或传至新的器皿中的次数。该术语不与群体倍增或增殖同义，其是细胞群体复制一次所需时间；也就是说，大概是群体的每个细胞复制的时间。例如，鸭或鸡的ES的群体倍增时间(PDT)大约是＞40小时。本发明所述的禽类细胞的PDT大约是短于30小时，通常短于24小时，且优选短于20小时。对于

细胞，通常每3代是一次传代。

术语“二倍体”是指本发明所述的细胞每个染色体有2个拷贝(2n)，通常一个来自母亲一个来自父亲。

本发明所述的禽类

细胞系是连续的并且是二倍体(即使遗传稳定的)的这一事实构成显著和独特的特征，因为这些术语通常是对抗性的。因此，通过化学的、物理的(U.V照射、X射线或g-辐射…)或遗传修饰(病毒转化、癌基因过表达…)而获得的癌细胞和/或永生化细胞因其能够无限复制培养而是连续的细胞，但是它们因其表现出多倍体核型而不是遗传稳定的。另一方面，原代细胞如鸡胚胎成纤维细胞MRC5、WI38，这些是非转化细胞，是不连续的，因为它们具有传少数几代之后有限的生命期，但是它们是遗传稳定(即二倍体)的细胞。

在本发明中，不加区分地使用术语”细胞系”和”细胞”。

如本文所用，术语“禽”、“鸟”、“鸟纲”或“鸟目”具有相同的含义，且不加区分地使用。“鸟”是指分类学纲“《鸟纲》”的生物体的任何种、亚种或种族。在优选的具体实施方式中，“鸟”是指下列分类学目的任何动物：

-“雁形目”(即鸭、鹅、天鹅和同类(ally))。雁形目含有约150个鸟类物种，可分为三个科：叫鸭科(叫鸭)、鹊鹅科(Anseranatidae)(喜鹊)和鸭科，其包括超过140个物种的水鸟，其中它们包括鸭、鹅和天鹅。在该目中的所有物种高度适于在水表面水生生活。全部是有蹼足以有效游泳(尽管有些后来已经成为主要是陆栖的动物)。

-“鸡形目”(即鸡、鹌鹑、火鸡、野鸡和同类)。鸡形目是含有鸡、火鸡、鹌鹑、野鸡的鸟类目。在全世界范围内发现约256个物种。

-“鸽形目”(即鸽子及其同类)。鸟的鸽形目包括分布非常广泛的斑鸠(dove)和鸽子。

根据优选的具体实施方式，本发明所述的禽类选自在其基因组中不包含禽类E型造白细胞组织增生(leucosis)病毒(ALV-E)和内源性禽类病毒(EAV)的前病毒序列的禽类。本领域技术人员能确定ALV-E和EAV序列是否存在于禽类基因组中(Johnson et Heneine，2001，J.Virol 75：3605-3612；Weissmahr et al.，1997，J.Virol71：3005-3012)。优选地，禽类选自雁形目(即鸭、鹅或天鹅)、火鸡、鹌鹑、日本鹌鹑、珠鸡或孔雀(Pea Fowl)。因此，源自这样的禽类的细胞不产生具有复制能力的内源性ALV-E和/或EAV颗粒。在优选的具体实施方式中，本发明所述的禽类选自鸭、鹅、天鹅、火鸡、鹌鹑和日本鹌鹑、珠鸡或孔雀。根据更优选的具体实施方式，禽类是鸭，更优选的是北京鸭或莫斯科鸭(Moscovy duck)。根据更优选的具体实施方式，禽类是北京鸭。因此，本发明提供获得来源于胚胎干细胞(ES)的连续的二倍体鸭细胞系的方法，其中所述的鸭细胞系不产生具有复制能力的内源性逆转录病毒颗粒。本发明所述的鸭

细胞系的例子是EB24、EB26、EB66或它们的亚克隆，如EB24-12。

根据第二优选具体实施方式，本发明所述的禽类选自在其基因组中不包含完整的ALV-E前病毒序列但最终包含EAV前病毒序列的禽类。本领域技术人员能确定在禽类的基因组中是否存在部分或完整的ALV-E和EAV序列(Johnson andHeneine，2001)。通过饲养选择了不含有完整ALV-E前病毒序列(即ev-0品种)并因此不产生感染性ALV-E逆转录颗粒(retroparticle)的几个鸡的品种，例如：

-品系0东方兰辛(East Lansing)USDA家禽原种的家鸡(ELL-0品种)。东方兰辛品系0鸡不含任何与ALV相关的内源性病毒(ev)基因座(Dunwiddie and Faras，1985Proc.Natl.Acad.Sci USA 82：5097-5101)。

-品系22查尔斯河(Charles River)白色来亨鸡(SPAFAS)。

-品系DE和PE11来自国家农业研究所(Institut National de la RechercheAgronomique)(Domaine de Magneraud，Surgères，法国)。

因此，来源于ev-0禽类的细胞不产生具有复制能力的内源性ALV-E颗粒。根据优选的具体实施方式，该禽类是ev-0家鸡(原鸡(Gallus Gallus)亚种家鸡(domsticus))，优选地选自ELL-0、Line 22、DE或PE11。通常，ev-0鸡仍旧含有EAV前病毒序列，但是迄今为止无感染性EAV隔离群被鉴定。因此，本发明提供获得来自ev-0鸡品种的胚胎干细胞(ES)的连续的二倍体鸡细胞系的方法，其中所述ev-0鸡细胞系不产生具有复制能力的内源性逆转录病毒颗粒。根据第三具体实施方式，本发明所述的禽类选自在其基因组中包含完整和/或不完整的ALV-E和EAV前病毒序列但是不能产生具有复制能力的的ALV-E和EAV逆转录颗粒的禽类。本领域技术人员能确定ALV-E和/或EAV感染性和/或非感染性逆转录颗粒是否自禽类细胞产生(Johnson and Heneine，2001；Weissmahr et al.，1996)。优选地，禽类选自无特定病原体(SPF)的鸡，优选选自Valo品种。本发明所述的鸡的

细胞系的例子是EBv13细胞系。

在本发明中，术语“内源性逆转录病毒颗粒”或“内源性反转录病毒颗粒”，这些术语能不加区分地使用，是指由一些禽类细胞的基因组中存在的ALV-E或EAV前病毒序列编码的和/或表达的逆转录病毒颗粒或反转录病毒。在禽类中，已知ALV-E前病毒序列存在于家鸡(除了品系-0鸡)、红林鸡(redjungle fowl)和环颈雉鸡(Ringneck Pheasant)的基因组中。在禽类中，已知EAV前病毒序列存在于包括家鸡、品系-0鸡、红林鸡、绿林鸡、灰林鸡、锡兰林鸡及其同类的)所有原鸡(gallus)属中(见Resnick et al.，1990，J.Virol.，64：4640-4653)。

术语“具有复制能力”是指内源性逆转录病毒颗粒是感染性的，也就是说，这样的逆转录病毒颗粒能感染本发明所述的禽类细胞并能在其中复制。

建立本发明所述的名为

的连续的二倍体禽类细胞系的方法包括下列2个步骤：

a)在含有允许这些细胞的生长的所有因子和存在饲养层并添加了动物血清的完全培养基中分离、培养和扩增胚胎干细胞(ES)，这些胚胎干细胞来自不含完整的内源性前病毒颗粒或其片段的，对产生具有复制能力的内源性逆转录病毒颗粒易感的，更特别地，不包含EAV和/或ALV-E前病毒序列或其片段的禽类；可选地，所述完全培养基可包含添加物，如添加的氨基酸(即谷氨酰胺…)、丙酮酸钠、β-巯基乙醇、非动物起源的蛋白水解物(即酵母提取物(yeastolate)，植物蛋白水解物…)；

b)通过修改培养基进行传代，以完全去除所述的因子、所述的饲养层和所述的血清，和可选的所述的添加物，并进一步获得贴壁或悬浮的禽类细胞系(命名为

)，其不产生具有复制能力的内源性逆转录病毒颗粒，能在基础培养基中在缺乏外源性生长因子、饲养层和动物血清下在长时间内增殖。

以至于逐渐或完全去除生长因子、血清和饲养层的建立

细胞系的方法中的步骤b)的培养基的修饰能同时、顺序或分别进行。培养基的“断奶(weaning)”顺序可选自下列顺序：

-饲养层/血清/生长因子；

-饲养层/生长因子/血清；

-血清/生长因子/饲养层；

-血清/饲养层/生长因子；

-生长因子/血清/饲养层；

-生长因子/饲养层/血清。

在优选具体实施方式中，“断奶”的顺序是生长因子/饲养层/血清。

根据优选具体实施方式，本发明的步骤a)中所述的禽类胚胎干细胞收集自在产卵的禽类胚胎，也就是说当卵产下来时。根据Sellier等人(2006，J.Appl.Poult.Res.，15：219-228)，产卵对应于根据Eyal-Giladi分类的下列发育阶段(EYAL-GILADI’s classification：EYAL-GILADI and KOCHAN，1976，《Fromcleavage to primitive streack formation：a complementary normal table and a new lookat the first stages of the development in the chick》.“General Morphology”Dev.Biol.49：321-337)：

-俄国鸭(Muscovy)：阶段VII

-珠鸡：阶段VII-VIII

-火鸡：阶段VII-VIII

-北京鸭：VIII

-鸡：阶段X

-日本鹌鹑：阶段XI

-鹅：阶段XI。

优选地，步骤a)的鸭胚胎干(ES)细胞通过分离约处于Eyal-Giladi分类的阶段VIII(产卵)的胚胎获得，对于俄国鸭更优选约处于阶段VII的胚胎，对于北京鸭更优选约处于阶段VIII的胚胎。优选地，步骤a)中的鸡胚胎干(ES)细胞，优选来自ev-0鸡品种，通过分离约处于Eyal-Giladi分类的阶段X(产卵)的胚胎而获得。可选地，根据本发明步骤a)的禽类胚胎干细胞收集自产卵前的胚胎。产卵前遇到的主要限制在于卵必须从母鸡体内通过外科手术取出且每个胚胎的ES细胞的数量是较不重要的事实。此外，在禽类胚胎发育的非常早期阶段，ES细胞并未良好地个体化(individualized)，这导致了体外培养ES细胞的困难。本领域技术人员将能定义在产卵前可收集禽类ES细胞的时间范围。可选择地，根据本发明步骤a)的禽类胚胎干细胞可从产卵后至孵化的禽类胚胎收集。然而，禽类胚胎干细胞逐渐进入分化以产生分化的组织；因此，优选收集禽类ES是不长过产卵。本领域技术人员能定义产卵后可收集禽类胚胎干细胞的时间范围。

这些禽类胚胎干细胞的特征是在39℃培养中包含48至72小时的缓慢的倍增时间。

不希望受缚于理论，所限定的在逐渐去除生长因子、饲养层和血清之后的禽类ES细胞的细胞培养条件允许改造和选择那些保留了所期望保留的ES细胞的大多数特征(核型稳定、无限增殖、表达ES标记)但是此外还表现出工业友好的特征，如在无血清培养基中悬浮生长直到达到高细胞密度的细胞。端粒酶是最重要的ES标记之一。由于在细胞传代过程中端粒酶持续和维持(maintain)表达，

细胞是连续的(即永生的)但此外是遗传稳定的(即二倍体)。

本发明提供获得连续的二倍体的来自ES细胞的禽类细胞系(命名为

细胞系或

细胞)的方法，其中所述的禽类细胞系不产生具有复制能力的内源性逆转录病毒颗粒，所述方法包含下列步骤：

a)在包括从Eyal-Giladi分类(EYAL-GILADI’s classification：EYAL-GILADI and KOCHAN，1976，《From cleavage to primitive streackformation：a complementary normal table and a new look at the first stages ofthe development in the chick》.“General Morphology”Dev.Biol.，49：321-337)的大约阶段VI的发育阶段和孵化前的发育阶段分离禽类胚胎，优选从鸭或从鸡，优选ev-0鸡。优选地，所述禽类基因组不含有对于产生具有复制能力的内源性逆转录病毒颗粒易感的内源性前病毒序列；

b)将通过分离步骤a)的胚胎获得的禽类胚胎干(ES)细胞在添加下列物质的基础培养基中悬浮：

-胰岛素生长因子((IGF-1)和睫状神经营养因子(CNTF)；

-动物血清；和

-可选地，选自白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-6受体(IL-6R)、干细胞因子(SCF)或成纤维细胞生长因子(FGF)的生长因子；

c)将在步骤b)获得的悬浮ES细胞接种在饲养细胞层上并将ES细胞进一步培养至少一代；

d)可选地，从1至大约15代的数代的时间跨度内从培养基中去除所有选自IL-6、IL-6R、SCF或FGF的生长因子，并将禽类ES细胞进一步培养至少一代。优选地，从培养基中去除所有选自IL-6、IL-6R、SCF或FGF的生长因子在一代内同时进行。通常地，于大约10至15代内去除IL-6、IL-6R、SCF、FGF；

e)从培养基中去除IGF-1和CNTF，并进一步培养禽类ES细胞至少一代。优选地，从培养基中去除选自IGF-1或CNTF的生长因子在一代内同时进行。通常在大约15至25代内去除IGF-1和CNTF。可选地，通过在数代间(至少2代和大约多达15代)逐渐减少地进行IGF-1和CNTF的去除；

f)逐渐减少培养基中饲养细胞的浓度以至于在数代后将饲养层完全去除并进一步培养细胞；

g)可选地，逐渐减少培养基中添加物的浓度以至于在至少一代后将添加物完全去除；且

h)可选地，逐渐减少培养基中动物血清的浓度以至于在数代后将动物血清完全去除；且，

i)获得贴壁禽类细胞系(命名为

)，其来源于能在基础培养基中在缺乏生长因子、饲养层及可选地无动物血清和添加物的条件下增殖的ES细胞，且其中所述连续的二倍体禽类细胞系优选不产生具有复制能力的内源性逆转录病毒颗粒；

j)可选地，进一步使所述贴壁禽类

细胞系适应于悬浮培养条件；

k)可选地，进一步亚克隆所述禽类

细胞，例如通过有限稀释。

在优选的具体实施方式中，本发明涉及获得连续的二倍体禽类细胞系，命名为

其来源于禽类胚胎干细胞(ES)的方法，其中所述禽类细胞系不产生具有复制能力的内源性逆转录病毒颗粒，且所述方法包含下列步骤：

a)于大约产卵期的发育阶段分离禽类胚胎，其中所述禽类的基因组不含有易于产生具有复制能力的内源性逆转录病毒颗粒的内源性前病毒序列；

b)使通过分离步骤a)中的胚胎而获得的禽类胚胎干(ES)细胞在至少添加了下列物质的基础培养基中悬浮：

-胰岛素生长因子1(IGF-1)和睫状神经营养因子(CNTF)；和

-哺乳动物血清如胎牛血清；

c)将在步骤b)中获得的悬浮ES细胞接种在饲养细胞层上并进一步将ES细胞培养至少一代；

e)从培养基中去除IGF-1和CNTF，并进一步将细胞培养至少一代；

f)逐渐减少培养基中饲养细胞的浓度以至于在数代后完全去除饲养层，并进一步培养该细胞；

g)逐渐减少培养基中所述哺乳动物血清的浓度以至于在数代后完全去除哺乳动物血清，并且；

h)获得贴壁的禽类

细胞系，其来源于能在基础培养基中，在缺乏生长因子、饲养层和哺乳动物血清的条件下增殖的ES细胞，并且其中所述连续的二倍体禽类细胞系不产生具有复制能力的内源性逆转录病毒颗粒；

i)可选地，进一步使贴壁的禽类

细胞系适应于悬浮培养条件，优选通过促进悬浮生长，更优选通过将在步骤h)中获得的贴壁的禽类

细胞系转移至另一种比最初使用的支持物(即如吸附(attachment)性超低的支持物)的吸附性低的支持物上。

当进行使贴壁的禽类

细胞系适应于悬浮培养条件的步骤j)时，

该步骤j)能在逐渐减少培养基中的哺乳动物血清的浓度的步骤g)之前在另一优选具体实施方式中受到影响。

在另一优选的具体实施方式中，为了获得本发明所述的连续的二倍体禽类细胞系而在该方法的步骤b)中所述的基础培养基中进一步添加选自白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素6受体(IL-6R)、干细胞因子(SCF)或成纤维细胞生长因子(FGF)的生长因子，且所述的方法进一步包含下列步骤d)：

d)可选地，从培养基中去除所有选自IL-6、IL-6R、SCF或FGF的生长因子，并进一步将ES细胞培养至少一代。

在更优选具体实施方式中，当进行步骤d)时，从培养基中去除IGF-1和CNTF的步骤e)在从培养基中去除所有选自IL-6、IL-6R、SCF或FGF的生长因子的步骤d)后受影响。

根据本发明，“基础培养基”是指具有经典培养基配方的培养基，其借由其本身至少使细胞存活，并且甚至更好地使细胞生长。基础培养基的例子是BME(基础Eagle培养基)、MEM(最小Eagle培养基)、培养基199、DMEM(Dulbecco’s改良Eagle培养基)、GMEM(Glasgow改良Eagle培养基)、DMEM-HamF12、Ham-F12和Ham-F10、Iscove’s改良Dulbecco’s培养基、MacCoy’s 5A培养基、RPMI1640、GTM3。基础培养基包含无机盐(例如：CaCl₂、KCl、NaCl、NaHCO₃、NaH₂PO₄、MgSO₄…)、氨基酸、维生素(硫胺素、核黄素、叶酸、D-泛酸钙…)和其它成分，如葡萄糖、β-巯基-乙醇、丙酮酸钠。优选的基础培养基是合成培养基。

此外，本发明所述的基础培养基可添加选自下列物质的添加物：

-0.1至5mM L-谷氨酰胺，优选2至3mM L-谷氨酰胺；

-0.05至2mM丙酮酸钠，优选0.1mM至1mM丙酮酸钠；

-0.1至2.5％非必需氨基酸，优选大约1％非必需氨基酸；

-0.05至5mM β-巯基-乙醇，优选大约0.16mM β-巯基-乙醇；

-非动物来源的蛋白水解物。

为了建立本发明所述的鸭

细胞，基础培养基优选添加非动物来源的蛋白水解物。非动物来源的蛋白水解物选自细菌胰蛋白胨、酵母胰蛋白胨、植物水解物，如大豆水解物，或其混合物。在优选的具体实施方式中，非动物来源的蛋白水解物是酵母胰蛋白胨。术语“水解物”包括大豆蛋白胨或酵母提取物的酶解消化产物。水解物能分别从很多大豆蛋白胨或酵母提取物制品中获得，其能进一步被酶解消化(例如木瓜酶)和/或通过自溶、加热分解和/或质壁分离而形成。水解物也能通过商业途径获得，如Yeastolate、Hy-Soy、Hy-Yeast 412和Hi-Yeast 444，从如JRH BioSciences(Lenaxa，KA)、Quest International(Norwich，N.Y.)、OrganoTechnie S.A.(法国)或Deutsche Hefewerke GmbH(德国)的来源获得。酵母提取物的来源还公开在WO 98/15614中。酵母提取物和大豆水解物的来源还公开在WO00/03000中。在本发明的培养基中所使用的水解物优选从粗组分中纯化，因为优选去除在该纯化过程中可能干扰有效培养的杂质，借此改进了水解物的一致性。能通过超滤或葡聚糖凝胶层析方法(例如用Sephadex G25或Sephadex G10或等效材料)、离子交换层析方法、亲和层析、大小排阻层析或“反相”层析进行纯化。优选地，通过使用10kDa截留滤膜的超滤进行纯化。本领域已知这些方法。通过使用这些方法，能选择含有所限定分子量的大豆或酵母水解物的组分。优选地，大豆或酵母水解物的平均分子量优选是在大约220和375道尔顿之间。优选地，细胞培养基中含有酵母水解物。例如从JRH-BIOSCIENCES(Ref 58902)获得的酵母水解物50X(大约200g/l)在细胞培养基中的终浓度是在大约0.1X至2X之间，优选大约0.5X至1X之间。还可将大豆水解物加进细胞培养基中。加入培养基中的例如从JRH-BIOSCIENCES(Ref58903100M)获得的大豆水解物50X的终浓度是在大约0.1X至2X之间，优选大约1X。可选地，可如US 2004/0077086所述，将大豆水解物和酵母水解物的混合物加入细胞培养基中。

根据本发明所述的优选基础培养基是DMEM-HarmF12，其加入2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、1％非必需氨基酸、0.16mM β-巯基-乙醇和可选地，1X酵母水解物。

术语“完全培养基”是指添加了至少一种生长因子和动物血清的补充的或不补充的基础培养基，优选地，基础合成培养基。完全培养基的例子如WO 03/076601、WO 05/007840、EP 787180、US 6,114,168、US 5,340,740、US 6,656,479、US 5,830,510和Pain等人(1996，Development 122：2339-2348)中所述的。可选地，完全培养基可是条件培养基(conditioned medium)，优选BRL条件培养基。以举例的方式，BRL条件培养基根据本领域公知技术，如Smith和Hooper(1987，Dev.Biol.121：1-9)中所述的技术生产。BRL细胞可自ATCC登录号CRL-1442获得。条件培养基可添加如下所述的外源性生长因子和动物血清。

如本文所用，术语”生长因子”是指对于培养中的未分化的禽类ES细胞在基础培养基中的存活和生长必需的生长因子。可能概要性地将生长因子分成2个家族：细胞因子和营养因子。细胞因子主要是其功能是通过gp130蛋白相关受体的细胞因子。因此，白血病抑制因子(LIF)、白细胞介素11、白细胞介素6、白细胞介素6受体、睫状神经营养因子(CNTF)、制瘤素和心脏营养素在特别的链的受体水平上募集和后者与gp130蛋白以单体或有时是以异源双体形式结合上具有相似的作用模式。营养因子主要是干细胞因子(SCF)、胰岛素生长因子1(IGF-1)和成纤维细胞生长因子(FGF)，优选碱性FGF(bFGF)或人FGF(hFGF)。

本发明所述的完全培养基包含基础培养基，优选基础合成培养基，和至少一种其作用是通过gp130蛋白相关受体的细胞因子和/或至少一种营养因子的细胞因子。优选地，本发明所述的完全培养基包含基础培养基和至少一种选自白血病抑制因子(LIF)、制瘤素、心脏营养素、胰岛素生长因子1(IGF-1)、睫状神经营养因子(CNTF)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素6受体(IL-6R)、干细胞因子(SCF)、成纤维细胞生长因子(FGF)或白细胞介素11(IL-11)的细胞因子。根据第一优选具体实施方式，完全培养基是添加动物血清和至少添加IGF-1和CNTF的基础培养基。根据第二优选具体实施方式，完全培养基是添加动物血清和至少添加IGF-1、CNTF、IL-6和IL-6R的基础培养基。根据第三优选具体实施方式，完全培养基是添加动物血清和至少添加IGF-1、CNTF、IL-6、IL-6R、SCF、FGF的基础培养基。根据另一具体实施方式，完全培养基是条件培养基，其包含生长因子(即例如由BRL或STO细胞表达的)和可选地添加至少一种外源性的选自LIF、IGF-1、CNTF、IL-6、IL-6R、SCF、FGF、IL-11的生长因子。基础培养基或条件培养基中生长因子IGF-1、CNTF、IL-6、IL-6R、SCF、FGF、IL-11的浓度是在大约0.01至10ng/ml之间，优选是0.1至5ng/ml，，且更优选是大约1ng/ml。

此外，本发明所述的培养基还可包含抗生素，如举例来说，庆大霉素、青霉素和链霉素，来预防细菌污染。可在ES细胞培养的早期传代时将抗生素加入培养基中。例如，终浓度是10ng/ml的庆大霉素、终浓度是100U/ml的青霉素和终浓度是100μg/ml的链霉素可加入到培养基中。在优选的具体实施方式中，在本发明所述的建立连续的二倍体禽类细胞系的方法的后面步骤中在培养基中不加抗生素。

在本发明所述的建立禽类胚胎干细胞的方法的过程中，将细胞培养在饲养细胞层上。更加优选地，饲养细胞是为了培养禽类ES细胞的目的而培养的动物细胞或细胞系。可选地，饲养细胞能用细胞外基质加结合的生长因子取代。因此饲养基质在下文是指饲养细胞或细胞外基质。如本文所用，饲养基质根据本领域技术人员已知的程序构建。如上所注明的，优选饲养基质是经预处理的。术语”预处理”是指在来源于受精的禽类卵的胚盘的细胞放置下来与饲养基质接触之前将饲养基质在培养基中培养一段时间，例如饲养基质足以起始和建立例如生长因子或其它因子的生产的时间；通常饲养基质是在来源于受精的禽类卵的胚盘的细胞放置下来与饲养基质接触之前一至两天通过培养饲养基质本身而预处理。饲养细胞优选包含小鼠成纤维细胞。优选STO成纤维细胞，但是原代成纤维细胞也是合适的。当本发明也就小鼠细胞饲养基质的用途进行描述时，本发明也考虑使用包含来自其它鼠类物种(例如大鼠)；其它哺乳动物物种(例如有蹄动物、牛、猪物种)；或禽类物种(例如鸡(Gallinacea)、鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、雉)的饲养基质。在另一具体实施方式中，本发明所述的饲养细胞可转染表达载体，以允许例如生长因子如禽类SCF在STO细胞中组成性表达。因此，该”饲养”产生可溶性和/或连接在细胞的质膜上的形式的因子。因此，本发明所述的培养方法可可选地包含建立单层饲养细胞的步骤。用标准技术可使饲养细胞的有丝分裂灭活。例如，饲养细胞可暴露于X或γ射线照射中(例如4000Rad的γ射线照射)或可以丝裂霉素C处理(例如以10μg/ml处理2-3小时)。有丝分裂灭活细胞的方法的细节也见于通常与美国典型培养物保藏电心(ATCC，10801University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209)所传送的细胞共同递送的信息中，(例如STO饲养细胞以ATCC登录号1503可得到)。可可选地将单层培养至大约80％融合，优选至大约90％融合，且更优选大约100％融合。当饲养细胞的结构是单层时是培养的优选结构，任何合适的结构旨在包含在本发明的范围内。因此，例如，饲养细胞的多层、单层、成丛、聚集或其它结合或成组旨在包含在本发明的范围内并且尤其是旨在包含在术语“基质”的含义内。

本发明所述的培养基添加动物血清。所使用的动物血清优选是胚胎动物血清。优选胎牛血清。同样，在本发明就胎牛血清进行描述时，本发明旨在也使用包含来自其它动物物种的血清(例如鸡、马、猪、有蹄动物等)。动物血清在培养基中的终浓度是在大约1至25％之间，优选在5％至20％之间，优选在8％和12％之间。在优选的具体实施方式中，动物血清在培养基中的终浓度是在大约10％。根据优选的具体实施方式，培养基包含大约10％胎牛血清。

本发明还涉及连续的二倍体禽类

细胞系。

细胞是小的、圆的(即直径约10um)、分开的细胞，其倍增时间于37℃或39℃时是大约30小时或更短。禽类

细胞，优选鸭

或鸡

ev-0，表达具有下列特征的胚胎干细胞表型：

-高核-质比例，

-内源性端粒酶活性，

-可选地，它们表达一种或多种另外的ES标记如碱性磷酸酶、SSEA-1、EMA-1、ENS1标记。

-于37℃时的倍增时间比本发明所述的方法中的步骤a)中的禽类ES细胞的倍增时间(在39℃时为48-72小时)短，大约是30小时或更短(优选24小时)。

所述的细胞

优选不产生具有复制能力的内源性逆转录病毒颗粒。本发明所述的禽类

细胞系能在无外源性生长因子、血清和/或灭活的饲养细胞层，可选地，添加各种本领域技术人员所通常使用的添加物的条件下在基础培养基中，尤其是在如SAFC Excell培养基、DMEM、GMEM、DMEM-HamF12或McCoy的培养基中无限增殖。添加物的例子是非必需氨基酸、维生素、丙酮酸钠和抗生素。本发明所述的鸭

细胞具有在不添加谷氨酸的基础培养基中生长的显著特征。

本发明所述的禽类

细胞的核型分析显示

细胞是二倍体且代与代之间遗传稳定。

本发明提供禽类

细胞，优选鸡

或鸭

细胞，这些细胞转染至少一种表达载体，所述表达载体包含至少一种表达盒，所述表达盒包含编码目的重组蛋白或多肽的核酸序列，优选脱氧-核糖核酸(DNA)序列，所述序列可通过操作连接到能影响所述蛋白在细胞中表达的启动子序列上。表达载体进一步包含至少一种表达盒，所述表达盒至少包含编码可选择标记的DNA序列，所述可选择标记可通过操作连接到能影响所述可选择标记在宿主细胞中表达的启动子序列上。

表达载体含有至少一种目的编码序列的转录和翻译必需的元件。能使用为本领域技术人员所熟知和使用的方法来构建含有编码目的蛋白和多肽的序列以及合适的转录和翻译调控元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组技术。这些技术见例如Sambrook等人(1989，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Plainview，N.Y.)和Ausubel等人(1989，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York，N.Y.)所述。

合适的表达载体包含至少一种表达盒，所述表达盒包含编码目的异源蛋白的核酸序列，优选DNA序列，这些序列可通过操作连接到调控元件和调节性序列上。至少，表达盒包含编码目的异源蛋白的核酸序列，优选DNA序列，这些序列可通过操作连接到启动子序列上。如本文所使用，“启动子”是指调节基因表达的核酸序列。如本文所使用，术语”可通过操作连接”是指编码和调控序列的安排，例如在表达载体内，以至于实现编码序列的转录和/或表达。因此，可通过操作连接到编码序列上的调控序列能影响编码序列的表达，并能调节基因表达在哪种组织中、于什么发育时间点表达，或响应于哪些信号等。当DNA聚合酶结合至启动子序列上并将编码序列转录成能被翻译成所编码的蛋白的mRNA时，可通过操作将编码序列连接到或置于细胞的转录调节区域的调控下。调控序列不需与编码序列连续，只要它们具有指导其表达的功能即可。因此，例如，在启动子序列和编码序列之间能出现插入的非翻译或转录序列，且仍可认为这种启动子序列”通过操作连接”到编码序列上。这样的插入序列包括但不限于不被转录或不与聚合酶结合的增强子序列。如本文所使用，术语“表达”是指将核酸序列转录成RNA核酸分子，所述RNA核酸分子至少与一条基因编码序列的两条核酸链之中的一条链中的区域部分互补，和/或从RNA核酸分子翻译成蛋白或多肽。

这样的表达盒进一步包含调控元件，或调节性序列，其是所述表达盒上那些除启动子外的非翻译区(例如增强子、5’和3’非翻译区)，其与宿主细胞蛋白相互作用以进行转录和翻译。如本文所用，术语”调控元件”和”调节性序列”包括启动子、增强子和其它可调控基因表达的元件。可参考标准分子生物学手册如Sambrooket al.eds“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”3rd ed.，Cold Spring Harbor Press(2001)来设计合适的表达载体，这些表达载体可进一步包括复制起始子和选择性基因标记。这些元件其强度和特异性不同。取决于载体系统，能使用任何数目的包括组成性和诱导性启动子的合适的转录和翻译元件。

然而，应认识到，合适的表达载体的选择和其中功能元件的组合取决于多种因素，这些因素包括例如要表达的蛋白的类型。表达载体的代表性例子包括，例如，细菌质粒载体，其包括表达和克隆载体，如但是不限于pBR322，动物病毒载体如但是不限于，修饰的禽类腺病毒、麻疹病毒、流感病毒、脊髓灰质炎病毒、痘病毒(pox virus)、逆转录病毒等和来源于细菌噬菌体核酸的载体，例如，质粒和粘粒、人工染色体，如但是不限于，酵母人工染色体(YAC)和细菌人工染色体(BAC)，和合成的寡核苷酸像化学合成的DNA或RNA。因此，如本文所用，术语“核酸载体”或“载体”是指天然或合成的单链或双链的质粒或病毒核酸分子，或能转染或转化进入细胞并能独立于或在宿主细胞染色体内复制的任何其它核酸分子。能通过用限制性内切酶剪切载体并连接剪切片段到一块而将核酸插入载体内。核酸分子能是RNA或DNA。优选地，核酸分子是DNA。某些载体能在其导入的宿主细胞内自主复制，例如，具有细菌复制起始子的细菌载体和附加型(episomal)哺乳动物载体。其它载体，如非附加型哺乳动物载体，在将其导入宿主细胞中后整合入宿主细胞基因组中，并因此与宿主基因组一同复制。

将用于蛋白表达系统的表达盒设计成含有至少一种编码目的重组蛋白的DNA序列，所述DNA序列可通过操作连接到启动子序列上，并可选地连接到调控元件或调节性序列上。调控元件或调节性序列对于基因表达的正确转录和调节是必要的和需要的。这些序列优选选自转录起始和终止序列、增强子、内含子、复制起始位点、多腺苷酸化序列、肽信号或染色质隔离元件。调节性序列见例如在Goeddel；Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，Calif.(1990)所述。为了优化基因表达，增强子序列可位于启动子区域序列的上游或下游。“增强子”是核酸序列，其具有与该基因是何基因、该序列相对于基因的位置或该序列的方向无关的增强基因的转录的活性。本发明所述的载体可选地包括增强子。增强子的例子是CMV即早期(immediateearly)增强子和SV40早期增强子。

为优化基因表达，可将内含子序列置于编码目的重组蛋白的序列的上游或下游。根据优选的具体实施方式，内含子序列位于启动子序列和编码目的重组蛋白的序列之间。本发明所述的内含子序列优选选自嵌合内含子，所述嵌合内含子包含来自人类β-球蛋白基因的第一内含子的5’-供体位点和分支和来自免疫球蛋白基因的重量可变区的内含子的3’-受体位点。

本发明所述的启动子序列优选选自哺乳动物或禽类起源的基因或选自哺乳动物或禽类病毒的基因。在优选的具体实施方式中，启动子序列来自病毒起源并且选自人类或鼠类巨细胞病毒(CMV)启动子、禽类肉瘤病毒(ASV)xLN启动子，早期和晚期启动子来自猴病毒40(SV40)(Fiers et al.(1973)Nature 273：113)、鲁斯氏肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus，RSV)启动子、单纯疱疹病毒(HSV)胸腺嘧啶脱氧核苷激酶启动子、呼吸道合胞病毒启动子、MDOT启动子、多瘤病毒启动子、腺病毒2启动子、牛乳头瘤病毒启动子、腺病毒主要晚期启动子或这些启动子中每一种启动子的功能性部分。根据另一具体实施方式，启动子序列选自小鼠磷酸甘油酸激酶启动子、鼠白血病病毒(MLV)、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、EiF4α启动子、嵌合EF1α/HTLV启动子、嵌合CAG启动子(由结合人类CMV即早期增强子和修饰的鸡β-肌动蛋白启动子和第一内含子而成的复合启动子)或禽类基因启动子或这些启动子中每一种启动子的功能性部分。在禽类基因启动子中，启动子优选选自鸡启动子，如β-肌动蛋白启动子、输卵管特异性启动子、卵类粘蛋白启动子、卵清蛋白启动子、伴清蛋白启动子、卵粘蛋白启动子、卵转铁蛋白启动子、溶菌酶启动子、ENS1基因启动子或这些启动子中每一种启动子的功能性部分。

根据另一具体实施方式，启动子可选自调节启动子，如可被特定化合物或分子诱导的启动子，例如小鼠乳房肿瘤病毒(MMTV)的糖皮质激素反应元件(GRE)可被糖皮质激素诱导(Chandler et al.(1983)Cell 33：489-499)。而且，如果必要或需要，能用组织特异性启动子或调节性元件(Swift et al.(1984)Cell，38：639-646)。能用在本发明中的其它启动子的非限制性例子包括但不限于Pol III启动子(例如1型、2型和3型Pol III启动子)，如HI启动子、U6启动子、tRNA启动子、RNA酶MPR启动子或这些启动子中每一种启动子的功能性部分。通常，在本发明中根据所使用的启动子选择使用功能性终止子序列。

本发明所述的表达载体可进一步包含至少一种表达盒，所述表达盒包含至少一条编码选择性标记的核酸序列，优选DNA序列，所述序列可通过操作连接至能影响所述选择性标记在细胞内表达的启动子序列上。这样的选择性标记可赋予含有这种载体的

细胞以抗性使可在合适的选择培养基中选择这些细胞。对于本发明所述的方法，稳定表达通常优选瞬时表达，因为其通常达到更多可复制的结果并且更能达到大规模的生产。因此，本发明所述的表达载体是稳定地掺入至

细胞的染色体DNA中。在将外源性基因导入之后，工程化的细胞可得以在丰富培养基中生长1-2天，并且然后将其转换成选择培养基。重组载体中的选择性标记产生对选择的抗性并使在其染色体组稳定整合了载体并长成集落的细胞得以被选择出来，其依次被克隆和扩增形成细胞系。

在优选具体实施方式中，将抗代谢剂抗性用作下述非限制性标记基因的范例的选择基础：DHFR，其赋予氨甲喋呤抗性(Wigler et al.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：357和O′Hare et al.(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78：1527)；GPT，其赋予霉酚酸抗性(Mulligan and Berg(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78：2072)；新霉素(NEO)，其赋予氨基-糖苷G418抗性(Wu and Wu(1991)Biotherapy，3：87-95；Tolstoshev(1993)Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.，32：573-596；Mulligan(1993)Science，260：926-932；Anderson(1993)Ann.Rev.Biochem.，62：191-21)；和潮霉素B，其赋予潮霉素(Santerre et al.(1984)Gene，30：147)和嘌呤霉素(puromycine)抗性。在一个最优选具体实施方式中，抗生素抗性基因用作选择的基础。根据优选具体实施方式，本发明所述的选择性标记是新霉素抗性基因。优选地，编码NEO的核酸序列是TN5的新霉素/卡那霉素抗性基因。根据另一优选具体实施方式，本发明所述的选择性标记是卡那霉素抗性基因。根据另一优选具体实施方式，本发明所述的选择性标记是嘌呤霉素抗性基因。

可选地，这样的选择系统需要，本发明所述的

细胞以前已经遗传修饰以表现出合适的基因型(即TK-、HGPRT-、ART-、DHFR-、GPT-等)。能使用许多选择系统，包括但是不限于单纯疱疹病毒胸腺嘧啶脱氧核苷激酶(HSV TK)，(Wigler et al.(1977)Cell 11：223)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT)(Szybalska&Szybalski(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，48：202)和腺嘌呤磷酸-核糖基转移酶(adenine phosphor-ribosyl transferase)基因(Lowy et al.1980Cell 22：817)基因，这些系统能分别用于tk-，hgprt-，或art-细胞(APRT)。本领域公知的重组DNA技术的方法能常规地应用于选择所需重组细胞克隆，并且这样的方法见例如Ausubel等人(1993)和Kriegle(1990，Gene Transfer and Expression，ALaboratory Manual，Stockton Press，NY；在第12和13章中)所述。

此外，表达的蛋白分子的表达水平能通过载体扩增增加(综述见Bebbington&Hentschel，“The use of vectors based on gene amplification for the expression of clonedgenes in mammalian cells in DNA cloning”，Vol.3，Academic Press，New-York 1987)。当表达蛋白的载体系统中的标记是可扩增的，在宿主细胞培养物中出现的抑制物水平的增加将增加标记基因的拷贝数目。由于扩增区与编码蛋白的基因相关，该蛋白的产生将伴随增加(Crouse et al.(1983)，Mol.Cell.Biol.，3：257)。作为选择性标记的含有编码谷氨酰胺合酶(GS)或二氢叶酸还原酶(DHFR)的核酸的载体能分别在药物甲硫氨酸砜亚胺或氨甲喋呤存在条件下扩增。谷氨酰胺合酶表达系统及其成分详细见PCT公开：WO 87/04462、WO 86/05807、WO 89/01036、WO89/10404和WO 91/06657。此外，根据本发明能使用的谷氨酰胺合酶表达载体可从供应商那里购得，这些供应商包括例如Lonza Biologics，Inc.(Portsmouth，NH)。

含有编码序列并表达生物活性基因产物(即目的蛋白，选择性标记…)的宿主细胞可通过至少4种一般性方法鉴定：(a)DNA-DNA或DNA-RNA杂交；(b)“标记”基因功能的存在或缺如；(c)如通过各个mRNA转录本在细胞中的表达所测定的来评价转录水平；和(d)通过测定免疫检测或通过测定其生物活性检测基因产物。在第一种方法中，能使用包含分别与各个编码序列同源的核酸序列的探针或其部分或衍生物，通过DNA-DNA或DNA-RNA杂交检测插入在表达载体上的目的蛋白的编码序列的存在。在第二种方法中，重组表达载体/宿主系统能在某些标记基因功能存在或缺如的基础上进行鉴定和选择(例如，胸腺嘧啶脱氧核苷激酶活性、抗生素抗性、氨甲喋呤抗性等)。

本发明所述的一种或两种载体可包含至少一个复制起始子，使载体构建体得以在宿主细胞内复制。根据优选具体实施方式，本发明所述的载体包含一个细菌复制起始子，如F1ORI，使表达载体得以在细菌内(例如E.coli))复制和SV40复制起始子，使表达载体得以通过快速瞬时检测检测到。

本发明所述的表达载体可进一步包含染色质隔离元件。本发明所述的染色质隔离元件包括边界元件(BE)、基质结合区(MAR)、基因座调控区(LCR)和通用染色质开放元件(UCOE)。边界元件(“BE”)或隔离元件，在许多例子中限定染色质的边界(Bell&Felsenfeld(1999)Curr Opin Genet Dev 9：191-198)并可在体内发挥限定转录结构域的作用。BE缺乏内在启动子活性/增强子活性，但是仍被认为可保护基因免于受周围染色质中调节性元件的转录影响。增强子阻断检测通常用于鉴定隔离元件。在该检测中，染色质元件置于增强子和启动子之间，并且测定增强子激活的转录。在果蝇、酵母和在哺乳动物细胞中，边界元件显示能保护稳定转染的报告基因免受位置影响(Walters et al.(1999)Mol.Cell.Biol.19：3714-3726)。基质结合区域(”MAR”；也称作骨架结合区域或骨架/基质结合区域(”S/MAR”))是在体外以高亲和力结合隔离的核骨架或核基质的DNA序列(Hartand Laemmli(1998)Curr.OpinGenet Dev 8：519-525)。因为如此，它们可限定独立的染色质结构域的边界，以致于只有那些包含顺式调节性元件的能调控结构域内基因的表达。MAR元件能增强异源性基因在细胞培养细胞系内的表达(Kalos andFournier (1995)Mol.Cell.Biol.15：198-207))。基因座调控区域(”LCR”)是被基因座的起始染色质激活和随后的在其天然位置的基因转录所需要的顺式调节性元件(综述见Grosveld 1999，Curr Opin Genet Dev 9：152-157)。最广泛的鉴定的LCR是那些球蛋白基因座的LCR。近期已经报道通用染色质开放元件(“UCOE”，也称作”通用活性染色质开放元件”)(见WO 00/05393)。根据优选具体实施方式，本发明所述的染色质隔离元件是MAR元件。优选地，MAR元件选自鸡溶菌酶5′MAR元件(如WO 02/074969所述)或人类MAR元件(如WO 2005/040377所述)。

本领域技术人员应理解，选择合适的载体(例如质粒)，正确转录、表达的成分(启动子、调控序列&调节性序列)和分离细胞表达系统中产生的蛋白为本领域技术人员公知并常规确定和操作。

根据一个具体实施方式，以至少一种表达载体转染本发明所述的细胞，其中所述的表达载体至少包含：

-第一表达盒，其包含下列顺序的下列DNA序列：SEQ ID N°1的CMV启动子序列或其片段或变体、内含子序列、编码目的重组蛋白的DNA序列、多腺苷酸化序列；和

-第二表达盒，其包含下列顺序的下列DNA序列：SV40启动子、抗生素抗性基因(优选新霉素抗性基因)、多腺苷酸化序列；

-可选地，至少一个鸡溶菌酶5′MAR元件(如WO 02/074969所述)或人类MAR元件(如WO 2005/040377所述)。

根据第二具体实施方式，以至少一种表达载体转染本发明所述的

细胞，其中所述的表达载体至少包含：

-第一表达盒，其包含下列顺序的下列DNA序列：SEQ ID N°2的EF1α/HTLV启动子序列或其片段或变体、内含子序列、编码目的重组蛋白的DNA序列、多腺苷酸化序列；和

根据一个具体实施方式，以至少一种表达载体转染本发明所述的

细胞，其中所述的表达载体至少包含：

-第一表达盒，其包含下列顺序的下列DNA序列：SEQ ID N°3的RSV启动子序列或其片段或变体、内含子序列、编码目的重组蛋白的DNA序列、多腺苷酸化序列；和

根据优选的具体实施方式，内含子序列是序列SEQ ID N°4或其片段或变体，并且多腺苷酸化序列是序列SEQ-ID N°5或其片段或变体。

当本发明所述的重组目的蛋白是多聚体蛋白，所述的蛋白的不同链是在一个表达载体上编码或在不同的表达载体上编码。在后一种情形下，不同的表达载体同时或相继共转染入

细胞。“共转染”是指以一种以上的表达载体转染细胞的方法。当以能表达抗体的轻链的表达载体和能表达抗体的重链的载体共转染细胞时，载体优选包含独立的选择性标记。当一种表达载体能表达抗体的轻链和抗体的重链时，载体优选含有至少一种选择性标记。

令人吃惊的是，发明人现在发现，抗体在

细胞中的表达水平当转染一种编码抗体的重链和轻链的表达载体时较共转染两种表达载体时较高，这两种表达载体中每一种编码一条抗体链。而且，发明人还发现，当转染一种载体时，当该表达载体以下列顺序组成时，抗体在细胞中的表达水平较高：第一表达盒，其编码抗体的重链和第二表达盒，其编码抗体的轻链，每种表达盒具有相同的启动子。实际上，只要抗体分子中轻链和重链等摩尔比例地连接在一起，那么即可希望细胞平衡表达抗体的轻链和重链。表达载体使得抗体以具有功能的形式获得并以很好的产量分泌。因此，该方法可获得足量的具有功能的抗体用于病理性疾病的免疫治疗。

本发明所述的细胞系能产生所有种类的通常包含等摩尔比例的轻链和重链的抗体。因此，本发明包括人类抗体，其中重链和轻链的氨基酸序列与那些在体内通过人类淋巴细胞或体外通过杂交瘤产生的抗体的序列同源。本发明还包括改变了的抗体如杂交抗体，其中重链和轻链与天然抗体同源但是以一种天然不会出现的方式结合在一起。例如，双特异性抗体有对一种以上的抗原有特异性的抗原结合位点。抗体的恒定区可涉及一种或其它抗原结合区或可来自另一个抗体。改变了的抗体，如嵌合抗体，有来自一种抗体的可变区和来自另一种抗体的恒定区。因此，嵌合抗体可是物种/物种(species/species)嵌合体或类别/类别(class/class)嵌合体。这样的嵌合体抗体可有一种或一种以上的进一步修饰以改进抗原结合能力或改变效应物功能。改变了的抗体的另一种形式是人源化或移植CDR的抗体，其包括复合抗体，其中除CDR外还将部分高度可变区转移至人类抗体的框架上。可改变这种抗体的框架或恒定区中的其他的氨基酸。改变了的抗体的限定还包括Fab片段，其大略等同于重链和轻链的Y分支部分；这些可包括包含部分Fc区的不完整片段或片段。因此，在本发明的范围内包括任何改变了的抗体，其中氨基酸序列不是天然存在的氨基酸。

优选地，目的蛋白是单克隆抗体，优选是人类单克隆抗体或改变了的抗体，并且以至少一种表达载体转染本发明所述的细胞，其中所述的表达载体至少包含以下列顺序：

-第一表达盒，其包含下列顺序的下列DNA序列：启动子序列、内含子序列、编码抗体的轻链或其片段的DNA序列(优选cDNA序列)、多腺苷酸化序列；

-第二表达盒，其包含下列顺序的下列DNA序列：启动子序列、内含子序列、编码抗体的重链或其片段的DNA序列(优选cDNA序列)、多腺苷酸化序列；

-第三表达盒，其包含下列顺序的下列DNA序列：病毒启动子、抗生素抗性基因、多腺苷酸化序列；

然而，本发明的目标还提供转染了至少一种表达载体的

细胞，其中所述的表达载体包含以下列顺序：

-第二表达盒，其包含下列顺序的下列DNA序列：启动子序列、内含子序列、编码抗体的重链或其片段的DNA序列(优选cDNA序列)，、多腺苷酸化序列；

根据另一优选具体实施方式，本发明所述的

细胞转染了至少一种表达载体，其中所述的表达载体包含以下列顺序：

-第一表达盒，其包含下列顺序的下列DNA序列：SEQ ID N°1的CMV启动子或其片段或变体、内含子序列、编码抗体的重链或其片段的cDNA序列、多腺苷酸化序列；

-第二表达盒，其包含下列顺序的下列DNA序列：SEQ ID N°1的CMV启动子或其片段或变体、内含子序列、编码抗体的轻链或其片段的cDNA序列、多腺苷酸化序列；

-第三表达盒，其包含下列顺序的下列DNA序列：SV40启动子、新霉素抗性基因、多腺苷酸化序列；

根据另一优选具体实施方式，本发明所述的

-第一表达盒，其包含下列顺序的下列DNA序列：SEQ ID N°2的嵌合EF1α/HTLV启动子或其片段或变体、内含子序列、编码抗体的重链或其片段的cDNA序列、多腺苷酸化序列；

-第二表达盒，其包含下列顺序的下列DNA序列：SEQ ID N°2的嵌合EF1α/HTLV启动子或其片段或变体、内含子序列、编码抗体的轻链或其片段的cDNA序列、多腺苷酸化序列；

根据另一优选具体实施方式，本发明所述的细胞转染了至少一种表达载体，其中所述的表达载体包含以下列顺序：

-第一表达盒，其包含下列顺序的下列DNA序列：SEQ ID N°3的RSV启动子或其片段或变体、内含子序列、编码抗体的重链或其片段的cDNA序列、多腺苷酸化序列；

-第二表达盒，其包含下列顺序的下列DNA序列：SEQ ID N°3的RSV启动子或其片段或变体、内含子序列、编码抗体的轻链或其片段的cDNA序列、多腺苷酸化序列；

轻链和重链基因可构成基因组DNA，或优选地cDNA，并可用本领域已知的方法进行克隆(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Maniatis etal，Cold Spring Harbor)。

根据另一具体实施方式，本发明所述的

细胞进一步包含表达载体，所述表达载体包含至少一种表达盒，所述表达盒包含编码抗细胞凋亡蛋白的核酸序列，优选DNA序列，所述序列可通过操作连接至能影响所述的抗细胞凋亡蛋白在细胞内表达的启动子序列上。抗细胞凋亡蛋白选自哺乳动物、禽类、两栖动物和鱼类Bcl2家族蛋白。根据优选的具体实施方式，抗细胞凋亡蛋白是命名为NR13的禽类Bcl2家族成员(Lee et al.1999Genes&Dev.13：718-728；Lalle et al.2002，Biochem.J.368：213-221)。编码抗细胞凋亡的NR13蛋白的表达载体的例子至少包含：

-第一表达盒，其包含下列顺序的下列DNA序列：CMV、RSV或嵌合EF1a/HTLV启动子序列、内含子序列、编码抗细胞凋亡的NR13蛋白的cDNA序列、多腺苷酸化序列；和

-第二表达盒，其包含下列顺序的下列DNA序列：SV40启动子、新霉素抗性基因、多腺苷酸化序列；

-可选地，第三表达盒，其包含下列顺序的下列DNA序列：SV40启动子、新霉素抗性基因、多腺苷酸化序列；

根据优选的具体实施方式，NR13序列是SEQ ID N°6或其片段或其变体。本发明进一步提供在禽类

细胞产生至少一种目的生物活性产物的方法，所述的方法包含下列步骤：

a)通过转染至少一种表达载体来生产本发明所述的

细胞；转染用贴壁或悬浮

细胞进行；

b)在合适的条件和细胞培养基中培养所述的转染了的

细胞；和

c)从所述的转染了的

细胞、细胞培养基或既从所述的

细胞也从所述的培养基中收获目的生物产物。

本文所述的表达载体能通过各种方法导入

细胞。特别地，本领域技术人员所熟知的标准转染方法可被进行，如磷酸钙沉淀、DEAE-Dextran介导的转染、电穿孔法、核转染法(AMAXA Gmbh，GE)、脂质体介导的转染(例如用

或

技术)或微注射法。根据优选的具体实施方式，在步骤a)中，

细胞，优选鸡或鸭

细胞以至少一种表达载体在无血清细胞培养基中的贴壁培养物中通过电穿孔法进行转染，更优选的是通过核转染法进行转染，核转染法是由AMAXA Gmbh(DE)开发的优化的电穿孔技术。根据优选的具体实施方式，在步骤a)中，

细胞，优选鸡或鸭

细胞以至少一种表达载体在无血清细胞培养基中的悬浮培养物中通过电穿孔法进行转染，更优选的是通过核转染法进行转染。根据另一优选的具体实施方式，在步骤a)中，

细胞、优选鸡或鸭

细胞以至少一种表达载体在无血清细胞培养基中的贴壁或悬浮培养物中使用像

的化合物等通过脂质体介导的转染法进行转染。

如本文所用，术语“目的蛋白”是指通过肽键连接在一起的氨基酸多聚体。术语“目的蛋白”包括蛋白、蛋白片段、蛋白类似物、多肽、寡肽、肽等。根据本发明，术语“目的生物产物”是指单体的“目的蛋白”或至少2种单体目的蛋白的复合物以构成多聚体蛋白。多聚体目的蛋白的例子是由4个单体目的蛋白(即两条重链和两条轻链)组成的抗体。并非细胞基因组的天然部分的“蛋白”或“生物产物”被称作“异源蛋白”或“异源生物蛋白”。

本发明提供具有禽类糖基化的目的生物产物。更特别地，本发明提供具有鸡糖基化的抗体，更优选的是EB14或EBv13糖基化，或具有鸭糖基化，更优选的是EB24糖基化、EB24-12糖基化、EB26糖基化、EB66糖基化。能根据本领域技术人员所熟知的细胞培养技术培养所述转染了的

细胞。为了理解而不是限制的目的，熟练的从业者应理解，蛋白生产的细胞培养和培养流程能包括三种通常的类型；即连续培养、分批培养和补料分批培养(fed-batchculture)。例如，连续培养时，在培养时期内将新鲜培养基添加物(即补料培养基(feeding medium))提供给细胞，同时每日去除旧培养基并且收获产物，例如每日或连续地。在连续培养时，补料培养基能每日加入或连续加入，即如滴入或注入。对于连续培养，细胞能保持在培养物中，只要是所需的，只要细胞保持存活且环境和培养条件保持不变。在分批培养中，在培养流程结束期间或在结束之前，细胞起始培养在培养基中，并且该培养基既不去除、置换也不添加，即细胞不补充新的培养基。在培养流程结束时收获所需产物。对于补料-分批培养，培养流程时间通过在该流程内向培养基中每日一或多次(或连续)添加新鲜培养基而增加，即在细胞培养期间给细胞“补以”新的培养基(“补料培养基”)。补料-分批培养能包括如上所述的各种补料方法和次数，例如每日，每隔一日，每两日等，每日一次以上或每日不到一次，等等。而且，补料-分批培养能以补料培养基连续补给。然后于培养/生产流程结束时收获所需产物。本发明优选包含补料-分批细胞培养。根据本发明，细胞培养能进行，并且蛋白优选糖蛋白能在大规模和小规模蛋白生产条件下，使用动物或哺乳动物细胞培养常规使用的培养容器和/或培养装置通过细胞生产。本领域技术人员应理解，组织培养皿、T型培养瓶和旋转培养瓶通常用于实验室规模。对于大规模培养而言(例如3L、7L、20L、100L、500L、5000L等)，能使用包括但是不限于流化床生物反应器、空心纤维生物反应器、滚瓶培养或搅拌釜式生物反应器系统的方法。微载体可用于或不用于滚瓶或搅拌釜式生物反应器系统。系统能在分批、连续或补料-分批模式中操作。此外，培养装置或系统可与或不与使用滤器、重力、离心力等的细胞分离器装配在一起。

在本发明的细胞培养过程或方法中，细胞能在各种细胞培养基，即本领域通常已知的基础培养基中维持(maintain)。例如，方法适合用于维持在细胞培养基中的大体积细胞，其能添加营养物等。通常，“细胞培养基”(也称作“培养基”)是本领域的从业者理解的术语，并且知道是指细胞，优选动物或哺乳动物细胞在其中生长的营养液，并且其通常提供至少一种或多种下列成分：能量来源(通常为碳水化合物的形式，如葡萄糖)，所有的必需氨基酸，并且一般是指20种基础氨基酸，以及半胱氨酸；通常需要低浓度的维生素和/或其他有机化合物；脂类或游离脂肪酸，例如，亚油酸；和微量元素，例如无机化合物或天然存在的元素，其通常需要非常低的通常在微摩尔范围内的浓度。

还能往细胞培养基中添加使其含有各种可选成分，如激素和其他生长因子，例如胰岛素、转铁蛋白、表皮生长因子、血清等等；盐，例如钙、镁和磷，和缓冲液，例如HEPES；核苷和碱基，例如腺苷、胸腺嘧啶、次黄嘌呤；和蛋白及组织水解物，例如，水解动物蛋白(蛋白胨或蛋白胨混合物，其能从动物副产品、纯化明胶或植物材料获得)；抗生素，例如庆大霉素；和细胞保护剂，例如聚醚多元醇(聚醚F68)。优选是细胞营养培养基，其是无血清和无动物源性产物或成分。本发明所述的

细胞已经适应了在无血清条件下培养。

能使用商业上可得到的培养基，且包括例如Ham’s F12培养基(Sigma，St.Louis，MO)、Dulbecco’s改良Eagles培养基(DMEM，Sigma)、optipro培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)或Excell培养基(SAFC，Lenexa，KS)。往上述示例性培养基中能加入上述添加性组分或成分，这些组分或成分包括可选的成分，以合适的浓度或量，在必要或需要时加入，并且正如那些具有本领域使用的常规技术的人员所知和操作的那样。此外，适合于本发明所述的方法的细胞培养条件是那些对于细胞的分批、补料-分批或连续培养是通常使用的和已知的方法，注意pH，例如大约6.5至大约7.5；溶解氧(O₂)，例如在大约是空气饱和度的5-90％和二氧化碳(CO₂)，搅动和湿度，除温度以外。

一旦收获，目的生物产物通常是浓缩的。一旦以浓缩形式获得，任何标准技术，如制备型圆盘凝胶电泳、离子交换层析、凝胶过滤、大小分离层析、等电聚焦等等可用于纯化、分离和/或鉴定异源蛋白。本领域技术人员还可容易地设计出异源蛋白纯化的亲和层析的方法，尤其是对于那些例子而言，其中异源蛋白的结合配偶体(partner)是已知的，例如抗体。单克隆抗体的分离是简单的，并且其安全性由于培养液中不含另外的人或动物蛋白而得到增强。不含血清进一步增强系统的可靠性，由于使用合成培养基，正如本文所关注的，增强了重现性。

能优选通过本发明的方法生产的目的蛋白的例子包括但是不限于细胞因子、细胞因子受体、生长因子(即EGF、HER-2、FGF-α、FGF-β、TGF-α、TGF-β、PDGF、IGF-1、IGF-2、NGF)、生长因子受体，包括它们的蛋白片段。其它非限制性范例包括生长激素(例如人生长激素、牛生长激素)；胰岛素(例如胰岛素A链和胰岛素B链)、前胰岛素、促红细胞生成素(EPO)、集落刺激因子(例如G-CSF、GM-CSF、M-CSF)；白细胞介素(例如IL-1至IL-12)；血管内皮细胞生长因子(VEGF)及其受体(VEGF-R)、干扰素(例如IFN-α，β，γ)、肿瘤坏死因子(TNF)及其受体(TNFR-1和TNFR-2)、血小板生成素(TPO)、凝血酶、脑利钠肽(BNP)；凝血因子(例如因子VIII、因子IX、von Willebrand因子等)、抗凝血因子；组织型纤溶酶原激活物(TPA)、尿激酶、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、降钙素、CD蛋白(例如，CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD11a、CD11b、CD18、CD19、CD20、CD25、CD33、CD44、CD45、CD71等等)、CTLA蛋白(例如CTLA4)；T细胞和B细胞受体蛋白、骨形态发生蛋白(BNP，例如BMP-1、BMP-2、BMP-3等)、神经营养因子，例如骨源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子、例如凝乳酶、类风湿因子、RANTES、白蛋白、松弛素、巨噬细胞抑制蛋白(如MIP-1、MIP-2)、病毒蛋白或抗原、表面膜蛋白、离子通道蛋白、酶、调节性蛋白、抗体、免疫调制蛋白(如HLA、MHC、B7家族)、归巢受体、转运蛋白、超氧化物歧化酶(SOD)、G蛋白偶联受体蛋白(GPCR)、神经调节蛋白、阿尔茨海默病相关蛋白和肽(如A-β)和其它本领域已知的蛋白。融合蛋白和多肽，嵌合蛋白质和多肽，以及上述任何蛋白质和多肽的片段或部分，或突变体，变体，或类似物也包括在能通过本发明所述的方法生产的适当的蛋白质、多肽和肽中。

在优选的具体实施方式中，目的蛋白是糖蛋白，并优选病毒蛋白。可能根据本发明所述的方法生产的病毒蛋白的例子包括但不限于来自肠病毒，如鼻病毒，口疮病毒(aphtovirus)，或脊髓灰质炎病毒，疱疹病毒，如单纯疱疹病毒，伪狂犬病病毒或牛疱疹病毒，正粘病毒如流感病毒，副粘病毒，如新城疫病毒，呼吸道合胞病毒，腮腺炎病毒或麻疹病毒，逆转录病毒如人类免疫缺陷病毒或细小病毒组或乳头瘤病毒，轮状病毒或冠状病毒，如病毒或麻疹病毒，逆转录病毒，如传染性人胃肠炎病毒或黄病毒属，如蜱传播的森林脑炎病毒或黄热病病毒，披膜病毒，如风疹病毒或东部-，西部-，或委内瑞拉马脑炎病毒，致肝炎病毒，如肝炎A或肝炎B肝炎病毒，鼠疫病毒，如猪瘟病毒或杆状病毒，如狂犬病毒。

根据另一具体实施方式，目的蛋白质是一种细菌蛋白质。

在另一优选的具体实施方式，目的生物产物是抗体。如本文中所使用，术语“抗体”是指多克隆和单克隆抗体及其片段，及其免疫结合等效物。术语“抗体”是指同质分子实体，或混合物，如由多个不同的分子实体构成的多克隆血清产物，并广泛地包括天然出现的抗体的形式(例如IgD、IgG、IgA、IgM、IgE)和重组抗体如单链抗体、嵌合或人源化抗体和多特异性抗体。术语“抗体”，也指所有上述抗体的片段和衍生物，并可进一步包含其保留了特异结合抗原表位的能力的任何修饰或衍生的变体。抗体衍生物可包含蛋白质或偶联到抗体的化学基团。单克隆抗体能够选择性地结合到目标抗原或表位。抗体可包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)、人源化或嵌合抗体、camelized抗体、单链抗体(scFv)、Fab片段、F(ab’)₂片段、二硫键连接Fv(sdFv)片段、抗个体遗传型(抗-Id)抗体、内抗体、合成抗体和上述任一的表位结合片段。术语“抗体”，也指融合蛋白，其包括与免疫球蛋白Fc区等效的区域。

在本发明的范围内优选的抗体包括包含下列氨基酸序列的下列抗体：抗-HER2抗体，其包括包含huMAb 4D5-8的重链和轻链可变区的抗体(Carter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285-4289(1992)，美国专利No.5,725,856)或曲妥单抗如HERCEPTIN^TM；抗-CD20抗体如嵌合的抗-CD20“C2B8”(见美国专利No.5,736,137

)，2H7抗体的嵌合或人源化的变体(见美国专利No.5,721,108)或托西莫单抗(BEXXAR)；抗IL-8抗体(St John et al.，Chest，103：932(1993)和国际公开号No.WO 95/23865)；抗-VEGF抗体，其包括人源化和/或亲和性熟化的抗-VEGF抗体，如人源化的抗-VEGF抗体huA4.6.1AVASTIN^TM(Kim etal.，GrowthFactor，7：53-64(1992)，国际公开号No.WO 96/30046和WO 98/45331)；抗-PSCA抗体(WO01/40309)；抗CD40抗体，其包括S2C6及其人源化变体(WO00/75348)；抗CD11a(美国专利No.5,622,700，WO 98/23761)；抗EGFR(嵌合的或人源化225抗体，见WO 96/40210)；抗CD3抗体如OKT3(美国专利No.4,515,893)；抗CD25或抗tac抗体如CHI-621(SIMULECT)和(ZENAPAX)(见美国专利No.5,693,762)；抗CD4抗体如cM-7412抗体(Choy et al.Arthritis Rheum 39(1)：52-56(1996))；抗CD52抗体如CAMPATH-1H(Riechmann et al.，Nature 332：323-337(1988)；抗癌胚抗原(CEA)抗体如hMN-14(Sharkey et al.，Cancer Res.55(23Suppl)：5935s-5945s(1995)；抗EpCAM抗体如17-1A(PANOREX)；抗GpIIb/IIIa抗体如阿昔单抗或c7E3Fab(REOPRO)；抗RSV抗体如MEDI-493(SYNAGIS)；抗CMV抗体如PROTOVIR；抗肝炎抗体如抗HepB抗体OSTAVIR；抗人肾细胞癌抗体如ch-G250；抗人17-1A抗体(3622W94)；抗人结肠直肠肿瘤抗体(A33)；抗人黑色素瘤抗体R24，其定向抗GD3神经节苷脂；抗人鳞状上皮细胞癌(SF-25)；和抗人白细胞抗原(HLA)抗体如SmartID10和抗HLA DR抗体Oncolym(Lym-1)。

本发明提供生产抗体的方法，该方法包含培养本发明所述的转染了的

细胞。可在含血清的或优选不含血清和蛋白的培养基中进行

细胞的培养。所得抗体可根据标准程序纯化和配制。Mab的两条链以实质上等摩尔比例表达使获得的具有功能的抗体有可能达到最佳的产量。本发明所述的转染了的

细胞，并且更特异的是鸡

和鸭

细胞，能产生的免疫球蛋白是在分批培养中至少10pg/细胞/日，优选在分批培养中至少15pg/细胞/日，更优选在分批培养中至少25pg/细胞/日，更优选在分批培养中至少35pg/细胞/日。2条链在细胞内组装并然后分泌至培养基中成为有功能的抗体。

细胞产生的糖基化抗体保留了抗原结合能力和效应物功能。令人感兴趣的是，发明人现在已经证明，包括与通过本发明的方法产生的免疫球蛋白的Fc区等价的区域的抗体、抗体片段或融合蛋白增加Fc介导的细胞毒性。例如，禽类

细胞优选鸡EB14细胞生产的IgG1亚型抗体的ADCC活性较杂交瘤和CHO细胞产生的同一抗体增加。这通过提供以禽类糖基化模式，更优选鸡

糖基化模式或鸭

糖基化模式产生的目的抗体而达到。特别地，本发明所述的转染了的禽类

细胞能表达大比例的带有双触角类型常见的N-连接的寡糖结构的抗体或其片段，其包含末端为GlcNac的长链，该长链是高度半乳糖基化和非岩藻糖岩藻糖基化的并且其赋予抗体强的ADCC活性。在

细胞中产生的重组抗体群中，非岩藻糖基化的抗体的比例是抗体的至少20％，更优选至少35％，且更优选至少45％或更高。所以，本发明提供转染了的细胞系(优选鸭EB66细胞系)产生的重组多肽，其中重组多肽的特征是具有的非岩藻糖基化的N-连接的寡糖结构大约是20％，更优选是大约35％，更优选大约45％。更准确地，本发明提供转染了的细胞系(优选鸭EB66细胞系)产生的重组单克隆抗体，其中所述抗体的特征是其具有大约45％或更多的非岩藻糖基化的N-连接的寡糖结构。所述抗体的特征是其具有大约35％或更多的非岩藻糖基化的N-连接的寡糖结构G0，G1和G2。

本发明还涉及

细胞，优选鸭EB66细胞产生的抗体或抗体群，较杂交瘤或野生型CHO细胞系(优选CHO-K1和CHO-DG44)产生的同一抗体其ADCC活性增加。抗体优选选自IgG，且更优选选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。更优选抗体是IgG1或IgG3。

因此，

细胞蛋白生产平台用于增加Fc-介导的细胞的抗非所需的细胞的细胞毒作用，其由免疫球蛋白或其片段介导或由任何带有免疫球蛋白区域的Fc区或等价于免疫球蛋白区域的Fc区的生物分子介导。本发明提供细胞产生的并且具有

糖基化特征的抗体(或免疫球蛋白)群，其中所述抗体群或其片段构成大的抗体比例，其中Fc区带有双触角类型的常见的N-连接的岩藻糖基化的寡糖结构，该结构构成带有末端GlcNac的长链，该长链是半乳糖基化并且是抗体的大比例，其中Fc区带有双触角类型的常见的N-连接的寡糖结构，该结构构成半乳糖基化的带有末端GlcNac的长链。所述抗体群的特征是其非岩藻糖基化的N-连接的寡糖结构大约是45％，并且该结构赋予所述抗体强的ADCC活性。这些抗体中大多数，也就是说，EBx细胞产生的抗体群中的这些抗体的60％以上，优选75％以上，85％以上，并且更优选95％以上在连接到Fc区的双触角类型的N-连接的寡糖结构上不含唾液酸残基。大比例的唾液酸残基是N-乙酰-神经氨酸(NeuAC)；实际上，80％以上，优选90％以上，并且优选95％以上的唾液酸残基是已知在人类是非免疫源性的NeuAc。唾液酸残基的剩余的小比例由N-羟乙酰基神经氨酸(NeuGc)构成。

如本文中所使用，术语Fc介导的细胞的细胞毒性包括抗体依赖性细胞的细胞毒性和由含有人类Fc区的可溶性Fc-融合蛋白介导的细胞的细胞毒性。这是导致“抗体靶向细胞”被“人类免疫效应细胞”裂解的免疫机制。“人类免疫效应细胞”是一群白细胞，在这些白细胞表面显示Fc受体，通过Fc受体，这些白细胞结合到抗体的Fc区或Fc融合蛋白的Fc区，并执行效应物功能。这样的细胞群可包括但不限于外周血单核细胞(PBMC)和/或自然杀伤细胞(NK)细胞。抗体靶向细胞是那些被抗体或Fc-融合蛋白结合的细胞。如本文中所使用，术语增加的Fc-介导的细胞的细胞毒作用被限定为在特定的时间内，在靶细胞周围的培养基中，以特定的抗体浓度或特定的Fc-融合蛋白的浓度，通过上述限定的Fc-介导的细胞的细胞毒作用裂解的抗体靶向细胞的数目增加，和/或在特定时间内通过Fc-介导的细胞的细胞毒作用的机制达到裂解特定数目的”抗体靶向细胞”所需的在靶细胞周围的培养基中的抗体浓度或Fc-融合蛋白的浓度下降。Fc-介导的细胞的细胞毒作用增加与其它类型的宿主细胞(例如杂交瘤)使用本领域技术人员已知的同一标准生产、纯化、配制和贮存方法产生的同一抗体或Fc-融合蛋白介导的细胞的细胞毒作用有关。术语具有增加的抗体依赖的细胞的细胞毒作用(ADCC)的抗体是指，正如在本文所限定的那样，具有通过任何本领域普通技术人员已知的方法测定的增加的ADCC的抗体。一种已被接受的体外ADCC检测如下：

1)该检测使用已知表达抗体的抗原结合区域识别的靶抗原的靶细胞。该检测使用从随机选择的健康供体的血液中分离的人外周血单核细胞(PBMC)作为效应细胞；

2)该检测根据下列流程进行：i)使用标准密度离心方法分离PBMC，并且在RPMI细胞培养基中使其以5x10⁶细胞/ml悬浮；ii)通过标准组织培养方法培养靶细胞，并将其于活力在90％以上的指数生长期收获，用RPMI细胞培养基洗涤，标记上100微居的⁵¹Cr，用细胞培养基洗涤2遍，并使其以10⁵细胞/ml的密度悬浮在细胞培养基中；iii)将上述的100微升最终的靶细胞悬液转移至96孔微量滴定板的每孔中；iv)将抗体在细胞培养基中从4000ng/ml至0.04ng/ml进行连续稀释，并将50微升所得到的抗体溶液加入96孔微量滴定板的靶细胞中，测定包含以上全部浓度范围的各种抗体浓度，重复三次；v)在用作最大释放(MR)对照的含有标记的靶细胞的平板上3个另外的孔中加入50微升2％(V/V)的非离子去污剂的水溶液(Nonidet，Sigma，St.Louis)，而不是加入抗体溶液(上文点iv)；vi)在用作自发释放(SR)对照的含有标记的靶细胞的平板上3个另外的孔中加入50微升RPMI细胞培养基，而不是加入抗体溶液(上文点iv)；vii)然后将96孔微量滴定板以50x g离心1分钟并在4℃孵育1小时；viii)在每孔中加入50微升PBMC悬液(上文点i)以产生效应物：靶细胞的比例是25∶1，并且将平板置于孵箱(5％CO₂大气，37℃)中4小时；ix)收获每孔中的无细胞上清并使用γ计数器定量实验性释放的放射活性(ER)；x)根据公式(ER-MR)/(MR-SR)x 100计算每个抗体浓度的特异性裂解的百分数，该公式中ER是抗体浓度的定量测定的平均放射活性(见上文点ix)，MR是MR对照的定量测定的平均放射活性(见上文点v)，并且SR是SR对照的定量测定的平均放射活性(见上文点ix)；4)“增加的ADCC”限定为在上述测定的抗体浓度范围内观察到的特异性裂解的最大的百分数增加，和/或达到在上述测定的抗体浓度范围内观察到的特异性裂解的最大的百分数的一半所需的抗体浓度的下降。ADCC增加与使用本领域技术人员已知的同一标准生产、纯化、配制和贮存方法的另一种类型的宿主细胞产生的同一抗体介导的通过上述检测测定的ADCC相关。例如，通过本发明所述的方法产生的IgG1亚型抗体的ADCC活性较杂交瘤或CHO细胞产生的同一抗体增加。

本发明还涉及

细胞系，优选涉及鸭EB66细胞系，用于产生重组多肽，优选单克隆抗体，所述产生糖基化的多肽的细胞系的特征为，与使用CHO细胞系产生的同一多肽相比，其具有实质上下降的岩藻糖含量。与CHO细胞系(ECACCRef.Q6911)产生的大约0至20％的抗体相比，EB66细胞系产生的大约55％或以上的抗体不含岩藻糖基化的寡糖结构。与CHO细胞系(G0：大约2.5％；G1大约7％)产生的抗体相比，EB66细胞系产生的抗体含有的非岩藻糖基化形式G0(＞15％)和G1(＞13％)更高。

本发明所述的EBx细胞系可此外选择其抗凝集素抗性。实际上，凝集素能用于选择表达特异类型的寡糖的细胞系(Ripka&Stanley，1986，Somatic Cell Mol Gen12：51-62)。人们能使用岩藻糖特异性凝集素小扁豆凝集素(Lens Culinaris agglutinin(LCA))选择表达甚至是更低水平的岩藻糖的EBx细胞系。例如，可将EB66细胞在无血清培养基中以5000个细胞/孔的细胞密度在各种浓度的LCA凝集素存在条件下接种于在96孔板内。5天后，检查细胞存活，并且能选择岩藻糖转移酶FUT8mRNA的表达水平下降的少见的天然EB66变体，并将这些变体细胞在存在50ug/ml LCA条件下接种于另一个96孔板内。数周后，抗性EBx克隆将出现，然后能将其扩增并鉴定它们产生岩藻糖含量下降的重组多肽的能力。

本发明涉及作为药物的本发明所述的目的生物产品。更特异地，本发明涉及作为药物的本发明所述的抗体。产生IgG的

的更高的细胞毒活性使施用于患者的抗体的量减少并能减少治疗相关的花费。

糖基化和非糖基化生物产品(例如病毒蛋白，抗体…)用于预防和治疗多种人或动物的疾病的药物治疗。疾病的非限制性例子有病毒性感染性疾病、细菌感染性疾病、癌症(如非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤等)、传染病(AIDS、疱疹、乙型肝炎、丙型肝炎…)、自体免疫性疾病(如多发性硬化症、移植物抗宿主病、牛皮癣、幼年发病糖尿病、Sjogrens病、甲状腺疾病、重症肌无力、移植排斥反应、哮喘等)、炎症性疾病(如类风湿关节炎，系统性狼疮…)。

因此，本发明提供

糖基化和非糖基化生物产品(如抗体，病毒蛋白…)在制备用于预防性和治疗性处理上述疾病中任意病种的药物中用途。还提供了治疗患有任意这些疾病的人的方法，该方法包含将预防或治疗有效量的

糖基化和非糖基化生物产品施用于所述个体。

本发明还包括本发明所述的生物产品用于制备旨在预防或治疗人或动物的疾病的药物组合物中的用途。除包括所述生物产品外，这样的药物组合物优选包括可能与其它制剂如抗生素混合的生理上可接受的稀释剂或载体。合适的载体包括但是不限于生理盐水、磷酸缓冲盐水、磷酸缓冲盐葡萄糖和缓冲盐。可选地，如抗体的生物产品可被冻干(冷冻干燥)，当需要时通过加入上述水缓冲溶液重组使用。因此，本发明提供包含本发明所述的生物产品和药学上可接受的载体的药物组合物。

这样的生物产品的剂量因治疗的状况和治疗的受体不同而不同。对于抗体而言，其剂量对于在1至30日间的时期通常每日给药的剂量是例如是对于成人患者而言，是在1至大约100mg范围，优选是1-10mg。给药途径是常规的胃肠道外，包括静脉、肌肉、皮下和腹膜内注射或递送。

下列实施例更加详细解释本发明。给予下列制品和实施例以使本领域技术人员能更清楚地理解和操作本发明。然而，本发明并不限于示例性具体实施方案的范围，其仅是旨在解释本发明的一个方面，并且功能上相同的方法包括在本发明的范围内。实际上，本发明的各种修改除了本文所述的那些之外，对于本领域技术人员而言，根据上述说明书和附图是显而易见的。这些修改旨在包括在所附权利要求的范围内。说明书的剩余部分，参考下列附图的说明。

附图说明

图1：亲代空表达载体：pVVS431(pKNexp)

VIVALIS载体骨架包含一个单抗性盒以使质粒能在E.coli中扩增并在将表达载体转染禽类细胞后克隆选择。nptII基因编码新霉素磷酸转移酶蛋白并赋予有机体抗卡那霉素抗性(原核生物界)和新霉素抗性(真核生物界)。转录被nptII基因的串联上游的原核和真核启动子驱动。编码目的蛋白的cDNA克隆在位于包含易于交换的启动子(即CMV启动子…)、内含子和多聚腺苷酸区(polyA region)的空表达盒上的MCS(多克隆位点)内。

图2A和2B：

人-小鼠嵌合Mab IgG1(κ轻链和重链)由MAT-Biopharma(Evry，法国)惠赠。

图2A：带有驱动IgG1轻链表达的RSV启动子的载体：pVVS452(pRSV-IgG1-L)

图2B：带有驱动IgG1重链表达的RSV启动子的载体：pVVS450(pRSV-IgG1-H)

图3A和3B：在RSV启动子调控下表达IgG1轻链和重链的双载体

图3A：pVVS455(pRSV-LH-IgG 1)

图3B：pVVS460(pRSV-HL-IgG1)

图4：在无血清培养基中培养的鸭

细胞中的IgG1瞬时表达

IgG1在鸭细胞中瞬时表达。转染后24H和48H通过ELISA测定IgG1浓度。抗体浓度在细胞培养上清中达到大约4.5μg/ml。

图5：稳定转染、克隆分离和筛选IgG1生产

行A：以含EF1/HTLV启动子(左)或含RSV启动子(右)的IgG1表达载体转染鸡EB14细胞。从鸡EB14转染中挑选200个抗性克隆，将其接种于Excell63066培养基(SAFC Biosciences)，0.25mg/ml遗传霉素。接种后生长5天后，进行ELISA检测以分析每个挑选出的克隆的IgG1生产。行B：仅将最佳的产生IgG1的克隆在24孔板中进行扩增。行C：仅将有最佳的产生IgG1的克隆在6孔板中进行扩增和传代。行D：最后，仅将有最佳的产生IgG1的克隆在175cm²培养瓶中进行培养。该行D显示了在常规培养一个鸡的EB14克隆(EF1/HTLV启动子)的过程中通过ELISA检测监测到的IgG1的产生能力的例子。

图6：鸡EB14细胞和鸭EB66细胞中产生的IgG1抗体

图6A：在搅拌釜式生物反应器中的鸡EB14细胞产生的IgG1抗体

表达IgG1(EF1/HTLV启动子)的稳定转染的鸡EB14克隆适于在无血清的ExCell培养基(SAFC BioSciences)中悬浮生长。将0.4百万细胞/ml接种在3升的搅拌釜式生物反应器(Applikon)中。然后进行分批培养；使细胞得以生长13天。于第10天时，EB14细胞达到16百万细胞/ml的最大细胞密度。通过ELISA检测监测细胞培养基中的IgG1浓度。于第12天，最大IgG1浓度达到0.25g/l。蛋白的特异性生产能力大约是10-20pg/细胞/24h。

图6B：在搅拌釜式生物反应器中的鸭EB66细胞产生的IgG1抗体

表达IgG1的稳定转染的鸭EB66克隆适于在无血清的ExCell培养基(SAFCBioSciences)中悬浮生长。将0.4百万细胞/ml接种在3升的搅拌釜式生物反应器(Applikon)中。然后进行分批培养；使细胞得以生长13天。于第11天时，EB66细胞达到11百万细胞/ml的最大细胞密度。通过ELISA检测监测细胞培养基中的IgG1浓度。于第11天，最大IgG1浓度达到0.07g/l。

图7A和7B：鸡EBx细胞产生的IgG1抗体的糖基化特征

图7A：毛细管电泳分析

鸡EB14细胞产生的IgG1抗体的糖基化特征与人的丝氨酸(seric)IgG分子之一相似。

图7B：质谱分析

岩藻糖含量低(fucose-less)的IgG1抗体的百分数达到鸡EB14细胞产生的抗体群的48％，而CHO细胞产生的抗体仅2％(数据来自文献)。

图8：鸡EBx细胞产生的IgG1抗体的糖基化的详细特征

通过Maldi-Toff质谱分析对一种稳定转染的鸡EB14细胞克隆产生的IgG1的糖基化特征进行分析。分析了在Asn 297残基上连接于每个IgG1重链的CH2结构域上的N-寡糖的结构。该鸡EB14克隆产生的大多数IgG1抗体具有常见的双触角类型的N-连接寡糖的结构，其包含末端GlcNac的长链，该长链是半乳糖基化的。IgG1抗体群的重要部分(48％)是非岩藻糖基化的。一些抗体群具有二等分GlcNac的双触角类型的N-连接寡糖的结构。

图9：鸡EBx细胞产生的IgG1抗体抑制肿瘤细胞的增殖

开发一种检测方法以测定鸡EB14细胞或杂交瘤产生的IgG1免疫球蛋白的细胞增殖抑制活性。IgG1抗体定向抗人类肿瘤细胞表面表达的CD标记。肿瘤细胞在氚标记的胸腺嘧啶脱氧核苷存在条件下生长并与从正常患者体内纯化的单核细胞或自然杀伤T细胞在IgG1免疫球蛋白存在条件下孵育。该检测测定作为IgG1介导的经自然杀伤细胞的肿瘤细胞裂解的后果的掺入增殖的肿瘤细胞中的氚标记的胸腺嘧啶脱氧核苷的量。培养4天后，低量氚标记的胸腺嘧啶脱氧核苷掺入以NK细胞和鸡EB14细胞产生的IgG1抗体处理的肿瘤细胞中，这提示肿瘤细胞并未增殖。相反，在以NK细胞或单核细胞和以杂交瘤生产的IgG1抗体处理的肿瘤细胞观察到较高水平的H3-胸腺嘧啶脱氧核苷，这提示肿瘤细胞增殖。鸡EB14细胞生产的IgG1显示其较杂交瘤产生的同一抗体具有较好的细胞抗增殖活性。

图10：鸡EB14相对于CHO细胞产生的IgG1抗体的抗肿瘤细胞毒反应

使用来自两名健康供体的自然杀伤细胞进行标准ADCC检测。在无白细胞介素2(IL-2)条件下或IL-2为5或100单位条件下培养NK细胞。以前用放射活性铬培养的肿瘤细胞与IgG1免疫球蛋白和NK细胞孵育。以释放至培养基中的铬的百分数评价ADDC活性。

肿瘤：阴性对照

肿瘤+来自杂交瘤(非嵌合抗体)的抗肿瘤IgG1：阳性对照

肿瘤+CHO产生的抗肿瘤IgG1

肿瘤+鸡EB14细胞产生的抗肿瘤IgG1

鸡EB14细胞产生的IgG1抗体显示较CHO细胞产生的同一IgG1抗体具有较高的ADCC活性。

图11：表达NR13抗细胞凋亡基因的贴壁鸡细胞的生长分析

行A：pVVS437和pVVS438载体的说明。pVVS437仅含有嘌呤霉素(puromycine)抗性基因。PVVS438可表达嘌呤霉素抗性和鸡抗细胞凋亡基因NR13。以pVVS437或pVVS438载体转染贴壁鸡

细胞(EB45)，并对这些细胞进行选择。

行B：将克隆按群进行富集或分离，且使用从这些群或克隆中分离的总RNA进行RT-PCR以检测NR13基因的表达。该行显示克隆B2、B3和C1表达抗细胞凋亡基因NR13。

行C：稳定转染NR13抗细胞凋亡基因的贴壁鸡

细胞(EB45)生长分析。表达NR13蛋白的稳定转染的

细胞贴壁培养在100mm培养皿中。不表达NR13蛋白的细胞在培养中不能存活并且大多数这种细胞在培养6至7天后死亡。仅有小比例和稳定比例的表达NR13蛋白的

在培养中死亡，大多数NR13

细胞在培养较长一段时间后依然保持存活。

图12：鸭EB66细胞和CHO细胞产生的IgG1抗体的糖基化特征

在鸭EB66细胞的一种稳定转染的克隆和在CHO细胞中产生的IgG1的糖基化特征通过MALDI TOF质谱分析进行分析。分析了于Asn 297残基上连接到每个IgG1重链的CH2结构域的N-寡糖的结构。该鸭EB66克隆产生的大多数IgG1抗体具有常见的双触角类型的N-连接的寡糖结构，该结构包含具有末端GlcNac的半乳糖基化的长链。EB66生产的IgG1抗体群的重要部分(大约55％)是非岩藻糖基化的。CHO细胞生产的IgG1抗体群的一小部分(大约20％)是非岩藻糖基化的。

图13：在残基Asn297上连接到鸭EB66细胞或CHO细胞产生的IgG1重链的CH2结构域的N-连接的寡糖的质谱分析

糖苷酶F(PNGase F)消化释放出来的抗体Fc寡糖进行预甲基化(permethyled)并使用MALDI-TOF MS在正离子模式下使用DHB矩阵分析。3个主要糖型被建立在两细胞系产生的IgG。与CHO产生的IgG相比，EB66产生的IgG包括较高百分数的非岩藻糖化形式G0和G1。

图14：EB66和CHO细胞产生的同一IgG1抗体的3种主要的岩藻糖基化和非-岩藻糖基化的糖型G0、G1和G2的百分数表

糖苷酶F消化释放出来的抗体Fc寡糖进行预甲基化并使用MALDI-TOF MS在正离子模式下使用DHB矩阵分析。3个主要糖型G0、G1和G2被建立在两细胞系产生的IgG上。与CHO产生的IgG相比，EB66产生的IgG包括较高百分数的非岩藻糖化形式G0和G1。

图15A-15B：鸡EB14、鸭EB66和CHO细胞产生的IgG1抗体的抗肿瘤细胞毒性反应

图15A：NK细胞的激活(IFNg分泌细胞的分析)

IgG1激活自然杀伤细胞通过用流式细胞仪检测INFg而评价。来自2名健康供体的NK细胞在无白细胞介素2(IL-2)或有5或100单位的IL-2的条件下进行培养。将肿瘤细胞与IgG1免疫球蛋白和NK细胞一同孵育。通过以偶联藻红蛋白(PE)的抗-INFg进行细胞内染色来测定INFg检测。与CHO细胞产生的同一IgG1抗体相比，鸡EB14细胞和鸭EB66细胞产生的IgG1抗体显示出较高的NK激活。

图15B：NK细胞的激活(CD107阳性细胞的分析)

IgG1激活自然杀伤细胞通过用流式细胞仪分析CD107的活动化而评价。来自2名健康供体的NK细胞在无白细胞介素2(IL-2)或有5或100单位的IL-2的条件下进行培养。将肿瘤细胞与IgG1免疫球蛋白和NK细胞一同孵育。与FITC偶联的抗CD107抗体用于检测激活的NK细胞。与CHO细胞产生的同一IgG1抗体相比，鸡EB14细胞和鸭EB66细胞产生的IgG1抗体显示出较高的NK激活。

图16：鸡EB14、鸭EB66和CHO细胞生产的IgG1抗体的抗肿瘤细胞毒性反应

使用来自健康供体的纯化的自然杀伤细胞进行标准ADCC检测。将NK细胞在无白细胞介素2(IL-2)或有100单位的IL-2的条件下进行培养。以前用放射活性铬培养的肿瘤细胞与不同浓度的范围是0.8至50μ/ml的IgG1免疫球蛋白和NK细胞进行孵育。以释放至培养基中的铬的百分数评价ADCC活性。

在非限制性条件下(＜50μg/ml的抗体)，EB66和EB14生产的IgG1与CHO细胞生产的同一抗体相比更能诱导肿瘤细胞杀伤。

图17：连接至每个IgG重链的CH2结构域上的双触角寡糖结构的潜在异质性(对于人IgG而言，在残基Asn297上)

图17A：甘露糖基-壳二糖核(Man3-GlcNac2)以普通黑线表示，并且可存在的(+/-)另外的糖残基连接至Man3-GlcNac2核上，以点线表示。

图17B：复杂类型的连接至每个重链的CH2结构域上的N-连接的双触角寡糖结构的线图(对于人IgG而言，在残基Asn297上)。

实施例

实施例1：来自SPF鸡品种VALO的鸡EBv13细胞系

1.1-原材料

卵

无特异性病原体(SPF)的品种称为Valo。Valo品种是来自德国的Lohmann产生和传送的白色来亨鸡品种。那些进行了分析认证的SPF鸡卵检测其：CAV、禽类腺病毒(第1组，血清型1-12和第3组)、EDS、禽类脑脊髓炎病毒、禽白血病病毒/RSV(包括血清型ALV-J)、禽肾炎病毒、禽呼肠孤病毒、禽痘病毒、传染性支气管炎病毒、传染性滑囊炎病毒(IBDV)、传染性喉气管炎病毒、A型流感病毒、马立克氏病(Marek’s Disease)病毒、支原体(Mg+Ms)、分支杆菌、新城疫病毒、网状内皮组织增殖病毒、鸡白痢沙门氏菌、其他沙门氏菌感染、禽传染性鼻气管炎病毒(ART)、嗜血杆菌属副鸡嗜血杆菌(Hemophilusparagallinarum)。仅用去污剂将Valo鸡卵进行消毒，以避免任何在运输过程中与操作鸡卵相关的污染的风险。

饲养细胞

在建立EBv13方法中的第一步中，从鼠起源的细胞(STO细胞)细胞作为饲养层，以保持鸡干细胞多能性。在将其接种至塑料培养皿之前，将那些饲养细胞经γ照射(45至55格瑞)进行有丝分裂灭活。这种照射剂量是亚致死剂量的，其诱导细胞周期最终停滞，但仍能产生生长因子和细胞外基质，这些生长因子和细胞外基质对于促进未分化细胞的细胞生长是必要的。

STO细胞系来自A.Bernstein，Ontario Cancer Institute，Toronto，加拿大)，来自SIM(Sandos近亲交配小鼠)小鼠胚胎成纤维细胞的连续细胞系并由美国典型培养物保藏中心(ATCC)提供(STO产品号：CRL-1503，批号1198713)。新鲜饲养层一周准备两次，一般在周一和周四。指数期的细胞被消化下来并计数。部分细胞被接种以维持存活培养并且另外部分进行照射。对于照射，我们准备在试管内的10x10⁶细胞/mL的细胞悬液。细胞暴露于45至55格瑞剂量，并且将其接种于塑料培养皿中。接种后，覆盖了灭活的饲养细胞的皿或板最长使用5天。

培养基

DMEM-HamF 12(Cambrex，Cat n°BE04-687)

Optipro培养基(Invitrogen，Cat n°12309)

EX-CELL^TM65195、60947和65319(SAFC，专门培养基)

添加物

谷氨酰胺(Cambrex，Cat n°BE 17-605E)

青霉素/链霉素(Cambrex，Cat n°BE17-602E))

非必需氨基酸(Cambrex，Cat n°BE13-114E)

丙酮酸钠(Cambrex，Cat n°BE13-115)

维生素(Cambrex，Cat n°13-607C)

β巯基乙醇(Sigma，Cat n°M7522)

缓冲液和介体

PBS 1X(Cambrex，Catn°BE17-516F)

多聚甲醛4％(Sigma，Cat n°P6148)

KCl 5，6％(Sigma，Cat n°P9333)

甲醇/乙酸(3/1)：甲醇(Merck，Cat n°K34497209；乙酸Sigma Cat n°A6283)

秋水仙胺，Karyomax(Gibco，Cat n°15212-046)

冷冻防护剂

二甲基亚砜(DMSO)(Sigma，Cat n°D2650)

因子

使用两种不同的因子：

重组人睫状神经营养因子(CNTF)(Peprotech Inc，Cat n°450-13)

重组人胰岛素样因子I(IGF1)(Peprotech Inc，Cat n°100-11)

在E.Coli细菌中生长这两种因子。

胎牛血清

未照射的胎牛血清(FBS)(JRH，Cat n°12103)

在程序中使用的未照射的血清在美国收集和生产。用于收集的动物是USDA检查并是可以进行屠宰的。在禽类干细胞培养过程中加入培养基中。这批不进行照射以避免关键蛋白或成分的结构破坏，这些蛋白或成分经鉴定对于培养中干细胞的维持是必要的。

照射的血清(JRH，Cat n°12107)

在该程序中使用的照射批次的血清也在美国收集。该批照射血清作为补充物加入用于培养STO或FED细胞(饲养细胞)的DMEM培养基中。这些细胞不像干细胞那样需要特定质量的血清以在培养中生长和维持。为了最小化培养基中的血清的高浓度，我们使STO细胞适应于在仅有4％FBS存在的条件下生长。

消化剂：

·链霉蛋白酶(Roche，Cat n°165921)

链霉蛋白酶是Roche Diagnostics(德国)生产的重组蛋白酶，用于消化贴壁的禽类干细胞。

·胰蛋白酶EDTA(Cambrex，cat n°BE17-161E)

胰蛋白酶用于消化STO或FED细胞，并且在后期传代时用于消化适应于无血清培养基的禽类细胞。猪起源的该酶是根据cGMP指示条件通过经验证的灭菌过滤方法无菌生产出来的，并根据当前E.P进行检测。严格根据9/CFR 113.53，将在配制之前经照射的原材料进行猪的细小病毒组的检测。

·非酶细胞消化溶液(Sigma，Cat n°C5914)

该消化试剂易于使用配方，其用于温和地将细胞从培养皿的生长表面上解离下来。该配方不含蛋白并能不使用酶而使细胞脱离。细胞蛋白得以保留以可能进行免疫化学研究，免疫化学研究依赖于识别细胞表面的蛋白。该酶用于在进行像EMA-1(上皮细胞膜抗原1)和SSEA1(阶段特异性胚胎抗原-1)的生物标记的FACS分析之前将细胞解离下来。

1.2-鸡EBv13细胞系的建立方法

将卵打开，在打开过程中将卵黄从卵清中分离出来。直接借助于巴斯德移液管或借助于小的吸收滤纸(Whatmann 3M纸)将胚胎从卵黄中取出，借助于打孔器预先将滤纸剪成多孔的环。孔的直径是大约5mm。将这些小环在烤箱中干热灭菌大约30分钟。将这些小纸环放置在卵黄表面并集中于胚胎上，其因此被纸环环绕。然后将后者用一把小剪刀剪开，并将整个胚胎取出置于培养皿中，培养皿中含有PBS或生理盐水。在培养基中清除因此通过纸环带下来的胚胎上多余的卵黄，并用巴斯德移液管收集(因此不含多余的卵磷脂)。

Valo鸡胚置于含有生理培养基(1X PBS、Tris葡萄糖、培养基等)的试管中。然后机械分离Valo胚胎，并将其接种在39℃的完全培养基中的STO细胞饲养层上。饲养细胞以大约2.7x10⁴细胞/cm²接种在培养瓶中。完全培养基由基础商业培养基DMEM-Ham F12添加10％胎牛血清、IGF1和CNTF(终浓度是1ng/ml)、1％非必需氨基酸、1％商业起源的维生素的混合物、丙酮酸钠(终浓度是1mM)、β-巯基-乙醇(终浓度是0.2mM)、谷氨酰胺(终浓度是2.9mM)、含有青霉素(终浓度是100U/ml)和链霉素(终浓度是100μg/ml)的抗生素的起始混合物而组成。在将细胞传一代后很快地，不再将抗生素混合物加入培养基中。应理解，表述“很快地”意味着一般在首次3至5次传代后。

当将来自Valo鸡胚胎的禽类ES细胞从一个培养瓶传代至另一培养瓶中时，以完全培养基中的大约7x10⁴/cm²至8x10⁴/cm²之间的禽类ES细胞进行培养瓶接种。优选地，以大约7.3x10⁴/cm²(4x10⁶细胞/55cm²或4x10⁶细胞/100mm皿)进行接种。将禽类细胞，优选步骤a)的禽类胚胎细胞在数次传代过程中培养在完全培养基中。于第15代，完全培养基中的生长因子IGF1和CNTF去除。去除从一代至另一代直接一步进行。胚胎干细胞，优选禽类胚胎细胞在不含IGF1和CNTF生长因子的完全培养基中培养数代。

在去除生长因子IGF1和CNTF后，然后通过在数代中逐渐减少饲养细胞的浓度进行饲养细胞的去除。实际上，使用同一浓度的饲养细胞2至4代，然后对另2至4代使用较低浓度的饲养细胞，等。开始时，培养瓶接种以大约2.7x10⁴饲养细胞/cm²，然后大约2.2x10⁴饲养细胞/cm²，然后大约1.8x10⁴饲养细胞/cm²，然后大约1.4x10⁴饲养细胞/cm²，然后大约1.1x10⁴饲养细胞/cm²，然后大约0.9x10⁴饲养细胞/cm²，然后大约0.5x10⁴饲养细胞/cm²。然后将培养瓶以6.5x 10⁴禽类细胞/cm²至7.5x10⁴禽类细胞/cm²和无饲养细胞接种。大约在21代时开始去除饲养细胞，结束在大约65代。在去除饲养细胞期间，将鸡Valo ES细胞接种在培养瓶中，接种密度比步骤a)低，为大约4x10⁴细胞/cm²至5x10⁴细胞/cm²。在假设中，在减少培养瓶中的饲养细胞浓度后，Valo ES细胞形态不好，然后将禽类细胞以同一饲养细胞浓度再培养数代，然后继续去除饲养细胞。

在去除生长因子和饲养细胞后去除血清。一开始去除血清时，培养基由基础商业培养基DMEM-HamF12添加10％胎牛血清、1％非必需氨基酸、1％商业起源的维生素的混合物、丙酮酸钠(终浓度是1mM)、β-巯基-乙醇(终浓度是0.2mM)、谷氨酰胺(终浓度是2.9mM)而组成。在分两个步骤的过程中使鸡Valo细胞适应于在无血清培养基中生长：首先，鸡Valo细胞很快适应于由商业上的无血清培养基(SFM)，优选ExCell 60947(SAFC Biosciences)添加10％胎牛血清和1％非必需氨基酸、1％商业起源的维生素的混合物、丙酮酸钠(终浓度是1mM)、β-巯基-乙醇(终浓度是0.2mM)、谷氨酰胺(终浓度是2.9mM)组成的培养基。一旦进行了这一对新的培养基(DMEM-HamF12至Excell 60947)的快适应，进行第二步，这一步由开始缓慢适应于SFM培养基中动物血清浓度下降构成。血清去除通过逐渐减少血清浓度而进行，开始SFM细胞培养基中的血清浓度是10％血清，然后是7.5％，然后是5％，然后是2.5％，然后是1.25％，然后是0,75％，至最后SFM细胞培养基中的血清浓度是0％。血清去除开始于103代并且结束于135代。

在去除血清的过程的结尾，当SFM培养基中保留的血清浓度是0.75％或0％时，贴壁依赖的EBv13细胞开始适应于悬浮培养。在进行的数次以分离不依赖贴壁的EBv13分离物的尝试中，有62.5％的尝试是成功的并能得到悬浮EBv13细胞的不同分离物。EBv13细胞的一个分离物根据群体倍增时间(大约18小时)、培养瓶培养时最佳细胞浓度(大约4百万细胞/ml)、细胞活力、细胞培养同质性(细胞团块的存在和大小)和操作细胞的便利性来选择。

在血清去除结束时，依赖贴壁的鸡Valo细胞(名为EBv13)能在缺乏生长因子、缺乏饲养细胞的无血清培养基中生长。然后通过逐渐降低培养温度(0.5℃/日)使EBv13细胞适应于在37℃生长。

实施例2：鸭EBx细胞系EB66

2.1-原材料

鸭卵

来自北京鸭品种GL30的鸭卵获自GRIMAUD FRERES SELECTION(LaCorbière，Roussay法国)。亲代鸭接种抗大肠杆菌(大肠杆菌自体疫苗01&02)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida，Landavax)、鸭病毒性肝炎(Hepatovax)、红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae，Ruvax)、禽变异肺病毒(metapneumovirus，Nemovac)、鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌(自体疫苗)、鸭疫里默氏杆菌(里默氏杆菌白体疫苗)、禽变异肺病毒(Nobilis RTV灭活)和红斑丹毒丝菌(Ruvax)的疫苗。接种后，将北京鸭受精鸭卵浸于次氯酸钙(hypochloryde)槽进行消毒，接着以Fermacidal(Thermo)去污染以避免任何与外壳上附着的灰尘相关的污染风险。

饲养细胞

在方法的第一步，鼠起源的细胞(STO细胞)用作饲养层以维持鸭干细胞的多能性。这些饲养细胞通过γ照射(45至55格瑞)灭活有丝分裂，然后将其接种于塑料培养器皿中。这个照射剂量是亚致死量的，该量诱导细胞周期最终停滞但仍使之能产生生长因子和细胞外基质，生长因子和细胞外基质对于促进未分化细胞的细胞生长是必要的。STO细胞系来源于A.Bernstein，Ontario Cancer Institute，Toronto，加拿大，来自SIM(Sandos近亲杂交小鼠)小鼠胚胎成纤维细胞的连续细胞系并由美国典型培养物保藏中心(ATCC)提供(STO产品号是CRL-1503，批号是1198713)。新鲜饲养层一周制备两次。将指数期的细胞消化下来并计数。将部分细胞接种以维持存活培养，并且另一部分接受照射。对于照射，我们在试管中准备细胞悬液(10x10⁶细胞/mL)。使细胞暴露于45至55格瑞的剂量并接种于塑料培养器皿中。接种后，覆盖灭活饲养细胞的培养皿或培养板最长使用5天。

培养基

培养基EX-CELL ^TM65788，65319，63066和66444(SAFC，专门培养基)

培养基GTM-3(Sigma，Cat n°G9916)

DMEM-HamF 12(Cambrex，Cat n°BE04-687)

DMEM(Cambrex，Cat n°BE 12-614F)

添加物

谷氨酰胺(Cambrex，Cat n°BE17-605E)

青霉素/链霉素(Cambrex，Cat n°BE17-602E))

非必需氨基酸(Cambrex，Cat n°BE13-114E)

丙酮酸钠(Cambrex，Cat n°BE13-115)

维生素(Cambrex，Cat n°13-607C)

β-巯基乙醇(Sigma，Cat n°M7522)

酵母提取物(SAFC，Cat n°58902C)

缓冲液和介体

PBS 1X(Cambrex，Cat n°BE17-516F)

冷冻防护剂

二甲基亚砜(DMSO)(Sigma，Cat n°D2650)

因子

使用两种不同的重组因子

重组人睫状神经营养因子(CNTF)(Peprotech Inc，Cat n°450-13)

重组人胰岛素样生长因子I(IGF1)(Peprotech Inc，Cat n°100-11)

这两个因子在E.Coli细菌中产生。

胎牛血清

未照射的胎牛血清(FBS)(JRH，Cat n°12003)

在程序中使用的未照射的血清在澳大利亚收集和生产。用于收集的动物是USDA检查并是可以进行屠宰的。在禽类干细胞培养过程中将其加入培养基中。这批不进行照射以避免关键蛋白或成分的结构破坏，这些蛋白或成分经鉴定对于干细胞在培养中维持是必要的。

照射的血清(JRH，Cat n°12107)

在该程序中照射批次的血清在美国收集。该批照射血清作为补充物加入用于培养STO细胞(饲养细胞)的DMEM养基中。这些细胞不像干细胞那样需要特定质量的血清以在培养中生长和维持。为了最小化培养基中的血清的高浓度，我们使STO细胞适应于在仅有4％FBS存在的条件下生长。

消化剂：

·链霉蛋白酶(Roche，Cat n°165921)

·胰蛋白酶EDTA(Cambrex，cat n°BE17-161E)

胰蛋白酶用于消化STO细胞，并且在后期传代时用于消化适应于无血清培养基的禽类细胞。猪起源的该酶是根据cGMP指示条件通过经验证的灭菌过滤方法无菌生产出来的，并根据当前E.P进行检测。严格根据9/CFR 113.53，将在配制之前照射的原材料进行猪细小病毒组的检测。

·Trypzean(Sigma，cat n°T3449)

以重组牛胰蛋白酶配制Trypzean溶液，重组牛胰蛋白酶在玉米中表达并由Sigma Aldrich利用ProdiGene专有的转基因植物蛋白表达系统进行生产。该产品优化用于无血清和添加血清的贴壁的细胞培养过程中的细胞消化。

·非酶细胞消化溶液(Sigma，Cat n°C5914)

该消化试剂易于使用配方，其用于温和地将细胞从培养皿的生长表面上解离下来。该配方不含蛋白并不使用酶而使细胞脱离。细胞蛋白得以保留以可能进行免疫化学研究，免疫化学研究依赖于识别细胞表面的蛋白。该酶用于在进行像EMA-1(上皮细胞膜抗原1)和SSEA1(阶段特异性胚胎抗原-1)的生物标记的FACS分析之前将细胞解离下来。

2.2-鸭EBx细胞系EB66的建立方法

将大约360只受精鸭卵打开，在打开过程中将卵黄从卵清中分离出来。借助于小的吸收滤纸(Whatmann 3M纸)将胚胎从卵黄中取出，借助于打孔器预先将滤纸剪成多孔的环。孔的直径是大约5mm。将这些小的环在烤箱中干热灭菌大约30分钟。实际上，在收集胚胎的步骤中，将这些小的纸环放置在卵黄表面并集中于胚胎上，胚胎因此被纸环环绕。然后将后者用一把小剪刀剪开，并将整个胚胎取出置于培养皿中，培养皿中含有PBS。在培养基中清除因此通过纸环带下来的胚胎上多余的卵黄，并用巴斯德移液管收集胚胎盘(其因此不含多余的卵磷脂)。

将鸭胚置于含有1X PBS的50ml试管中。然后机械分离鸭胚，PBS洗涤，并将其接种在39℃、7.5％CO₂的完全培养基中的灭活的STO细胞饲养层上。饲养细胞以大约2.7x10⁴细胞/cm²接种在6孔培养板中。完全培养基由无血清培养基DMEM-Ham F12添加10％胎牛血清、IGF1和CNTF(终浓度是1ng/ml)和1％非必需氨基酸、1％商业起源的维生素的混合物、丙酮酸钠(终浓度是0.1mM)，β-巯基-乙醇(终浓度是0.5mM)、谷氨酰胺(终浓度是2.1mM)、青霉素(终浓度是100U/ml)、链霉素(终浓度是100μg/ml)和酵母提取物1X组成。在第4代时很快地，不再将抗生素混合物加入培养基中。

将鸭ES细胞在DMEM-Ham F12培养基中培养至第4代。4代后，基础培养基被修改并且DMEM-Ham F12完全培养基被置换成SFM GTM-3培养基，其中添加10％胎牛血清、IGF1和CNTF(终浓度是1ng/ml)、1％非必需氨基酸、1％商业起源的维生素的混合物、丙酮酸钠(终浓度是0.1mM)、β-巯基-乙醇(终浓度是0.5mM)、谷氨酰胺(终浓度是2.1mM)和酵母提取物1X。将鸭ES细胞在新的培养基中进一步培养14代，然后于第18代时进行生长因子的去除。同时将IGF1和CNTF从培养基中去除，因此从第19代至24代，培养基是GTM-3培养基，其中添加10％FBS、1％非必需氨基酸、1％商业起源的维生素的混合物、丙酮酸钠(终浓度是0.1mM)、β-巯基-乙醇(终浓度是0.5mM)、谷氨酰胺(终浓度是2.1mM)和酵母提取物1X。

当将来自北京鸭胚胎的鸭ES细胞从一个培养皿传代至另一培养皿时，在完全培养基中，以大约7x10⁴/cm²至12x10⁴/cm²之间的鸭ES细胞进行培养皿接种。

然后，在24代后，通过在数代中逐渐减少饲养细胞的浓度进行饲养细胞的去除。开始时培养皿接种以大约2.7x10⁴饲养细胞/cm²接种，然后在25至31代之间以大约1.8x10⁴饲养细胞/cm²接种，然后在32至35代之间以大约1.4x10⁴细胞/cm²接种，然后在36至41代之间以大约1x10⁴细胞/cm²接种，然后在42至44代之间以大约0.7x10⁴饲养细胞/cm²接种，并且最后从45代起培养皿仅以禽类细胞并无饲养细胞接种。在去除饲养细胞的末期，培养皿以9x10⁴禽类细胞/cm²至12.7x 10⁴禽类细胞/cm²接种。大约在25代时开始去除饲养细胞，结束在大约45代。在去除饲养细胞期间，将鸭ES细胞接种在培养皿中，接种浓度比步骤a)高，为大约9x 10⁴细胞/cm²至12.7x 10⁴细胞/cm²。

在无饲养细胞数代后，研究了生长参数(群体倍增时间(PDT)和密度)以确定细胞稳定性和强壮度并开始去除氨基酸、维生素、β巯基乙醇、丙酮酸钠和酵母提取物。如果PDT低于大约40小时，并且细胞密度高于大约26x10⁴细胞/cm²，则认为细胞足够强壮来接受这样的去除。

在开发本鸭

细胞(名为EB66)情况下，于52代时开始去除维生素，丙酮酸钠，非必需氨基酸和β-巯基乙醇。所有这些添加物同时从培养基中去除。因此，在52代至59代之间，培养基是SFM GTM-3，其中添加谷氨酰胺，酵母提取物和FBS。在短期适应于新的培养条件后，开始降低温度。从60代至67代之间逐渐开始该降低。67代后，细胞能在37℃生长。67代后，基础培养基GTM-3被置换以新的SFM基础培养基(名为Excell 65788)。因此，67代后，培养基是Excell 65788，其中添加了10％FBS，2.5mM谷氨酰胺和1X酵母提取物。80代时，4x10⁶细胞转移至超低附着培养皿(Ultra Low Attachment，ULA)中，其维持在恒定的搅拌下以起始不依赖贴壁的细胞生长。为了促进悬浮生长，将基础培养基进行修改，并且血清的百分数从10％降至5％(对于在ULA皿中的接种)。因此，从80代至85代，培养基是SFM GTM-3，其中添加5％FBS、2.5mM谷氨酰胺和1X酵母提取物。85代后缓慢减少EB66细胞悬液中的FBS。通过从SFM细胞培养基中的血清浓度是2.5％血清开始逐渐进行血清去除，然后是1.5％血清浓度，最后达到在SFM细胞培养基中的血清浓度是0％。血清去除开始于86代结束于94代。在血清去除结束时，不依赖贴壁的dEB66细胞能在37℃、缺乏生长因子、缺乏饲养细胞的无血清培养基中生长。

获得能生长在37℃的添加2.5mM谷氨酰胺的SFM GTM-3的EB66鸭细胞后，一些对SFM培养基的进一步适应通过稀释或逐渐适应新SFM配方而进行，如Excell 63066，Excell 66444，Excell CHO ACF。

悬浮鸭EB66细胞的亚克隆也能在存在或不存在酵母提取物的情况下实现。

实施例3：鸭EBx细胞系E B26

3.1-原材料

鸭卵，饲养细胞，添加物，缓冲液和介体，冷冻保护剂，胎牛血清&消化剂(这些项同实施例3)。

使用北京鸭品种GL30的鸭卵。

培养基

培养基EX-CELL 65319，63066和66444(SAFC，专门培养基)

培养基GTM-3(Sigma，Cat n°G9916)

DMEM(Cambrex，Cat n°BE 12-614F)

因子

使用6种不同重组因子：

重组人睫状神经营养因子(CNTF)(Peprotech Inc，Cat n°450-13)

重组人胰岛素样因子I(IGF1)(Peprotech Inc，Cat n°100-11)

重组人白细胞介素6(IL6)(Peprotech Inc，Cat n°200-06)

重组人可溶性白细胞介素6受体(sIL6r)(Peprotech Inc，Cat n°200-06R)

重组人干细胞因子(SCF)(Peprotech Inc，Catn°300-07)

重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(Peprotech Inc，Cat n°100-18B)

所有这些因子，除了IL6r，在E.Coli细菌中产生。可溶性IL6r在转染的HEK293细胞中表达。

3.2-鸭EBx细胞系EB26的建立方法

按照以前EB66所述的方法收集鸭胚。将鸭胚置于含PBS 1X的50mL试管中。然后机械分离鸭胚，以PBS洗涤并接种于39℃、7.5％CO₂的完全培养基中的灭活的STO细胞饲养层上。饲养细胞以大约2.7x10⁴细胞/cm²接种于6孔板中或皿中。完全培养基由无血清培养基GTM-3添加5％胎牛血清，IGF1、CNTF、Il-6、Il-6R、SCF和FGF(终浓度是1ng/ml)，和1％非必需氨基酸，1％商业起源的维生素的混合物，丙酮酸钠(终浓度是0.1mM)，β-巯基-乙醇(终浓度是0.5mM)，谷氨酰胺(终浓度是2.1mM)，青霉素(终浓度是100U/ml)，链霉素(终浓度是100μg/ml)和酵母提取物1X组成。在细胞第一次传代后很快地，不再将抗生素混合物加入培养基中。表述“很快地”应理解为一般是指在首次3至9代后。鸭ES细胞培养在完全培养基中至9代。9代后，将完全培养基中的部分因子去除。因此，10至13代之间，将SCF、IL6、IL6r和bFGF从培养基中去除，并且仅重组IGF1和CNTF维持在1ng/ml浓度。其次在13代至16代之间同时减少IGF1和CNTF的浓度以最后获得能于17代时在无重组因子的条件下生长的细胞。通过逐渐适应于较低的因子浓度去除因子。当来自北京鸭的鸭胚的鸭ES细胞从一个培养皿传代至另一个时，培养皿接种以大约7x10⁴/cm²至12x10⁴/cm²的完全培养基中的鸭ES细胞。优选地，以大约7.3x10⁴/cm²(4x10⁶细胞/55cm²或4x10⁶细胞/100mm皿)接种。去除重组因子后，于23代时降低酵母提取物达到终浓度是0.5X。然后，31代后，通过在数代间逐渐减少饲养细胞浓度进行饲养细胞的去除。最初，培养皿接种的饲养细胞是2.7x10⁴饲养细胞/cm²，然后32代和38代之间是大约1.8x10⁴饲养细胞/cm²，然后在39至44代之间是大约1.4x10⁴细胞/cm²，然后在45至47代之间大约是1x10⁴饲养细胞/cm²，然后在48至50代之间大约是0,7x10⁴饲养细胞/cm²，且最后从51代起培养皿仅接种禽类细胞，没有饲养细胞。在去除饲养细胞结束时，培养皿中接种9x10⁴禽类细胞/cm²至12.7x10⁴禽类细胞/cm²的细胞。饲养细胞的去除开始于32代结束于51代。饲养细胞的去除过程中，将鸭ES细胞以较步骤a)高的浓度接种于培养皿中，其浓度是大约9x10⁴细胞/cm²至12.7x10⁴细胞/cm²。在无饲养细胞数代后，研究生长参数(群体倍增时间(PDT)和密度)以确定细胞稳定性和强壮度并开始细胞的悬浮培养。如果PDT低于大约40小时并且细胞密度高于大于26x10⁴细胞/cm²则认为细胞足够强壮以接受悬浮培养。此外，细胞形态应当是圆的、折光的、非常小的，并且细胞不太能附着于塑料培养皿上。

在开发EB26细胞的情况下，在53代时开始悬浮培养，将7x10⁶个细胞转移至超低附着皿中并维持在大约50至70rpm的恒定搅动条件下。对于后续传代，将细胞以0.4至0.5x10⁶细胞/mL之间的浓度接种在T175培养瓶(Sarsted，ref831812502)中。短期适应于新的培养条件后，细胞PDT从大约160H下降至40小时。关于这一良好进化，于59代时，进行新的一系列去除。因此，去除维生素、丙酮酸钠、β-巯基乙醇和非必需氨基酸。因此，在59代后，培养基中仅添加5％FBS、0.5X酵母提取物和2.5mM谷氨酰胺。已经去除了生长因子、饲养细胞、维生素、非必需氨基酸、丙酮酸钠、β-巯基乙醇的细胞悬浮液开始去除血清。通过从5％血清开始，然后2.5％，然后1.5％逐渐降低SFM细胞培养基中的血清浓度，直至最后达到SFM细胞培养基含0％血清而进行血清的去除。血清去除开始于61代结束于79代。在去除血清结束时，贴壁非依赖的鸭EB26细胞能够在39℃、在无生长因子、无饲养细胞的无血清培养基中生长。然后通过在80代降低细胞培养的温度使EB26细胞适应于在37℃、无0.5X酵母提取物条件下生长。

获得能在37℃、在添加2.5mM谷氨酰胺的SFM GTM-3中生长的EB26细胞后，通过稀释或逐渐适应于新的SFM配方(如Excell 63066、Excell 66444、ExcellCHO ACF)进行一些进一步改进。在存在或缺乏酵母提取物的条件下，也能实现悬浮鸭EB26细胞的亚克隆。

实施例4：鸭EBx细胞系EB24

4.1原材料

使用北京鸭品种GL30的鸭卵。

培养基

培养基EX-CELL^TM65319、63066和66444(SAFC，专门培养基)

培养基GTM-3(Sigma，Cat n°G9916)

DMEM F12(Cambrex，Cat n°BE04-687)

DMEM(Cambrex，Cat n°BE 12-614F)

因子

使用6种不同重组因子：

重组人睫状神经营养因子(CNTF)(Peprotech Inc，Cat n°450-13)

重组人胰岛素样因子I(IGF1)(Peprotech Inc，Cat n°100-11)

重组人白细胞介素6(IL6)(Peprotech Inc，Cat n°200-06)

重组人可溶性白细胞介素6受体(sIL6r)(Peprotech Inc，Cat n°200-06R)

重组人干细胞因子(SCF)(Peprotech Inc，Cat n°300-07)

4.2-鸭

细胞系EB24的建立方法

按照以前在建立EB66细胞系时所述的方法收集鸭胚。将鸭胚置于含PBS 1X的50mL试管中。然后机械分离鸭胚，并接种于39℃，7.5％CO₂的完全培养基中的灭活的STO细胞饲养层上。饲养细胞以大约2.7x10⁴细胞/cm²接种于6孔板中或皿中。完全培养基由无血清培养基DMEM-Ham F12添加10％胎牛血清，IGF1、CNTF、Il-6、Il-6R、SCF和FGF(终浓度是1ng/ml)，和1％非必需氨基酸，1％商业起源的维生素的混合物，丙酮酸钠(终浓度是0.1mM)，β-巯基-乙醇(终浓度是0.5mM)，谷氨酰胺(终浓度是2.1mM)，青霉素(终浓度是100U/ml)，链霉素(终浓度是100μg/ml)和酵母提取物1X组成。在细胞第一次传代后很快地，不再将抗生素混合物加入培养基中。表述“很快地”应理解为一般是指在首次3至9代后。

将鸭ES在DMEM-Ham F12完全培养基中培养直至第7代。7代后，基础培养基被修改并且DMEM-Ham F 12完全培养基被GTM-3完全培养基置换，GTM-3完全培养基中添加10％胎牛血清，IGF1、CNTF、Il-6、Il-6R、SCF和FGF(终浓度是1ng/ml)，1％非必需氨基酸，1％商业起源的维生素的混合物，丙酮酸钠(终浓度是0.1mM)，β-巯基-乙醇(终浓度是0.5mM)，谷氨酰胺(终浓度是2.1mM)，青霉素(终浓度是100U/ml)，链霉素(终浓度是100μg/ml)和酵母提取物1X。因此，在11代，血清浓度下降至5％，并将SCF、IL6、IL6r和bFGF从培养基中去除。所以，从11代开始，培养基由5％FBS，IGF1和CNTF(终浓度是1ng/mL)，1％非必需氨基酸，1％商业起源的维生素的混合物，丙酮酸钠(终浓度是0.1mM)，β-巯基-乙醇(终浓度是0.5mM)，谷氨酰胺(终浓度是2.1mM)，青霉素(终浓度是100U/ml)，链霉素(终浓度是100μg/ml)和酵母提取物1X组成。于22代进行IGF1和CNTF的同时去除。22代后，GTM-3培养基中没有重组因子。将鸭细胞从23代至28代之间在这样的培养基中维持。当将来自北京鸭的胚胎的鸭ES细胞从一个培养皿中传代至另一培养皿中时，以大约7x 10⁴/cm²至12x 10⁴/cm²的鸭ES细胞在完全培养基中进行培养皿接种。优选地，以大约7.3x10⁴/cm²(4x10⁶细胞/55cm²或4x10⁶细胞/100mm培养皿)进行接种。然后，28代后，通过在数代间逐渐减少饲养细胞的浓度进行饲养细胞的去除。开始时培养皿接种以大约2.7x10⁴饲养细胞/cm²，然后在29至33代间以大约1.8x10⁴饲养细胞/cm²接种，然后在34至37代间大约1.4x10⁴饲养细胞/cm²接种，然后在38至42代间大约1x10⁴饲养细胞/cm²接种，然后在43至46代间大约0.7x10⁴饲养细胞/cm²，且，最后从47代开始，培养皿仅以禽类细胞接种并无饲养细胞。在饲养细胞去除结束时，培养皿以9x10⁴禽类细胞/cm²至12.7x10⁴禽类细胞/cm²接种。饲养细胞去除开始于29代结束于47代。在去除饲养细胞的过程中，将鸭ES细胞以比步骤a)高的浓度，大约9x10⁴细胞/cm²至12.7x10⁴细胞/cm²接种在培养皿中。在无饲养细胞的情况下传数代后，研究生长参数(群体倍增时间(PDT)和密度)以确定细胞的稳定性和强壮度，并开始将细胞进行悬浮培养。如果PDT低于大约40小时并且细胞密度高于26x10⁴细胞/cm²，则认为细胞足够强壮以接受悬浮培养。此外，细胞形态应是圆的、折光、非常小的，并且细胞不太能附着于塑料培养皿上。在开发EB24细胞的情况下，于48代开始悬浮培养，8x10⁶个细胞被转移至超低附着皿中并维持在大约50至70rpm恒定搅动条件下。对于后续传代，将细胞以0.4至0.5x10⁶细胞/m²之间的浓度接种在T175培养瓶(Sarsted，ref831812502)中。短期适应于新的培养条件后，细胞PDT从248H下降至128小时，并然后进行下一步去除。因此，在52代，去除维生素，非必需氨基酸，丙酮酸钠和β-巯基乙醇。鉴于PDT达到44小时这一进化，在56代，从57代开始，开始去除血清。因此，从57代开始，GTM-3培养基中仅添加5％FBS，1X酵母提取物和2.5mM谷氨酰胺。已经去除了生长因子、饲养细胞、维生素、非必需氨基酸、丙酮酸钠和β-巯基乙醇的细胞悬浮液开始去除血清。通过从5％血清开始，然后2.5％，然后2％，然后1.5％逐渐降低SFM细胞培养基中的血清浓度，至最后达到SFM细胞培养基含0％血清而进行血清的去除。血清去除开始于57代结束于77代。在血清去除期间，也进行适应于37℃的培养。因此，在65代，将在添加2.5％FBS的培养基中生长的细胞转移至37℃，以避免逐渐的温度变化。在去除血清结束时，贴壁非依赖的鸭EB24细胞能够在37℃、在无生长因子、无饲养细胞的无血清培养基中生长。

获得能在37℃、在添加2.5mM谷氨酰胺的SFM GTM-3中生长的EB24细胞后，通过稀释或逐渐适应于新的SFM配方(如Excell 63066、Excell 66444、ExcellCHO ACF)进行一些进一步改进。进行悬浮鸭EB24细胞的亚克隆，选择鸭EB24-12亚克隆，因其有效复制病毒的良好表现。

实施例5：表达载体和构建体

5.1-亲代空表达载体：pVVS431(pKNexp)

VIVALIS载体骨架包含单个的抗性盒以允许质粒在E.coli中扩增，和在将表达载体转染禽类

细胞后进行克隆选择。nptII基因编码新霉素磷酸转移酶并赋予有机体以卡那霉素抗性(原核生物)和新霉素抗性(真核生物)。转录被克隆进串联上游nptII基因的原核和真核启动子驱动。编码目的蛋白的cDNA克隆进位于带有易于互换启动子(即CMV启动子…)、内含子和polyA区域的空表达盒中的MCS(多克隆位点)中(图1)。

下列是带有RSV启动子序列的表达载体的例子；使用相似的方法构建带有CMV、EF&/HTLV、SV40、β-Actin、mPGK、eiF4α、CAG、ENS-1启动子的表达载体。

5.2-驱动IgG1轻链表达的带有RSV启动子的载体：pVVS452(pRSV-IgG1-L)

人-小鼠嵌合Mab IgG1(κ轻链)由MAT-Biopharma(Evry，法国)惠赠。将pIgG1-L-克隆10(MAT-Biopharma)的平末端NcoI-KpnI DNA片段克隆进入pKNexp MCS区域中的平末端NheI-NotI位点以产生pVVS451(pCMV-IgG1-L)。在pVVS451中，Mab轻链的表达被CMV启动子驱动。RSV启动子(劳斯肉瘤病毒)获自Philippe Moullier(Inserm U649-Laboratoire de Thérapie Génique，CHUHotel-Dieu，Nantes)。RSV启动子从pAAV5RSVLacZ以引物SO29(RSV-Bgl2F：ATAAGATCTGCGATGTACGGGCCAGATA)(SEQ ID N°7)和SO30(RSV-IPpoIR：TATGCTACCTTAAGAGAGTCCAGCTTGGAGGTGCACACC)(SEQ ID N°8)进行PCR扩增而来。将RSV启动子PCR片段和pVVS451用BglII和IPpoI进行消化。将pVVS451CMV无启动子(promoterless)DNA片段进行琼脂糖凝胶纯化，并连接到RSV启动子上以造出pVVS452(图2A).

5.3-驱动IgG1重链表达的带有RSV启动子的载体：pVVS450(pRSV-H90H)

Mabγ同种型获自MAT-Biopharma(Evry，法国)。将pHIgG1-H-克隆28(MAT-Biopharma)的平末端NcoI-HindIII DNA片段克隆进入pKNexp MCS区域的平末端NheI-NotI位点以产生pVVS449(pCMV-HIgG1L)。在pVVS449中，Mab重链的表达被CMV启动子驱动。将RSV启动子的PCR片段和pVVS449用BglII和IPpoI进行消化。将pVVS449CMV无启动子DNA片段进行琼脂糖凝胶纯化并连接到RSV启动子上以造出pVVS450(图2B)。

5.4在RSV启动子调控下既表达H90轻链也表达重链的双载体：pVVS455(pRSV-LH-IgG1)和pVVS460(pRSV-HL-IgG1)

RSV启动子驱动的IgG1轻链的表达盒通过PCR从pVVS452上，使用引物SO29和AS455(AscBamSV40polyAR：ATAGGCGCGCCGGATCCCGATCCTTATCGGATTTTACCAC)(SEQ ID N°9)扩增而来。将带有RSV启动子、H90轻链和SV40晚期polyA的该DNA片段用AscI和BamHI进行消化。受体pVVS450载体经AscI-BglII消化。将线性化载体的5’末端去磷酸化后，将其与纯化的扩增DNA片段连接造出pVVS455(pRSV-LH-IgG1)(图3A)。

同一SO29和AS455引物用于从pVVS450上扩增RSV启动子驱动的IgG1重链表达盒。这一带有RSV启动子、IgG1重链和SV40晚期polyA的DNA片段用AscI和BamHI进行消化。受体pVVS452载体用AscI-BglII进行消化。将线性化载体的5’末端去磷酸化后，将其与纯化的PCR DNA片段连接造出pVVS460(pRSV-HL-IgG1)(图3B)。

5.5-带有嘌呤霉素抗性的NR13表达载体：pVVS438(pNR13-puro)

从S86N45原鸡(Gallus gallus)物种纯化的的总RNA进行RT-PCR实验，以产生编码NR13抗细胞凋亡基因的cDNA。带有NheI和NotI位点的寡核苷酸AS376(Nhe1-NR13F：ACGCTAGCATGCCGGGCTCTCTGAAGGAGGAGAC)(SEQ ID N°10)和AS377(Not1-NR13R：GAGCGGCCGCCTACCGCACCACCAAGAGAAAAGCTAATC)(SEQ ID N°11)分别用于产生NR13cDNA片段。在基于pCiNeo的载体中删除CMV启动子并代以RSV启动子，这样的载体用作NR13cDNA的受体。2种DNA进行NheI和NotI消化后进行连接实验。连接产物用于进行以引物SO29和AS4349进行的PCR扩增以得到NR13RSV驱动的启动子表达盒。这一PCR片段经BglII和SwaI消化。受体pVVS437载体经BglII-SwaI消化。纯化的插入片段和载体都连接起来以造出pVVS438(pNR13-puro)。

实施例6：在无血清培养基中瞬时转染和分离最佳启动子

6.1-瞬时转染鸡EBx细胞

在贴壁的鸡EBx细胞中进行2个报告基因(红色荧光蛋白dsREDnuc和人血凝血因子IX)(每个被8个不同的启动子驱动)的瞬时表达以分离最佳启动子。在该实验中测定的8个不同的启动子是：CMV启动子(即人巨细胞病毒启动子)；SV40启动子(猴病毒40)；人β-肌动蛋白启动子；小鼠PGK启动子(磷酸甘油酸激酶)；RSV-LTR(劳斯肉瘤病毒的LTR)；人类eIF4α启动子(翻译起始因子4α)；EF1α-HTLV复合启动子(连接至HTLV1病毒5′UTR区的人EF1延伸因子)；CAG复合启动子(连接至鸡β-肌动蛋白启动子上的CMV增强子)。

将带有这8个启动子(表1)的表达载体用lipofectamine^TM或fugene^TM试剂或通过电穿孔法瞬时转染鸡贴壁

细胞系。观察到其中报告基因的瞬时表达最高的4种启动子是EF1α-HTLV、RSV、CAG和CMV，并被选择和进一步用于在

细胞中表达嵌合人/小鼠IgG1。

表1：用于在瞬时表达实验中驱动cDNA表达以选择在

细胞中表达水平高的启动子的启动子列表。

GFP：荧光报告蛋白；DsRed2nuc：荧光报告蛋白；hFIX：人凝血因子IX；IgG1-LH或HL：克隆进同一载体并被同一名称的启动子驱动的编码IgG1的轻链和重链。LH：轻链克隆到重链的上游；HL：重链克隆到轻链的上游。pVVSxxx对应于在Vivalis’数据库中的命名的载体。

可以得到在

细胞中最高IgG1的表达的启动子是EF1a-HTLV、RSV和CMV(数据未显示)并被进一步进行在

细胞中表达嵌合人/小鼠IgG1的稳定转染实验。

6.2-瞬时转染鸭EBx细胞

方法

通过核转染法(Amaxa，DE)将表达载体[pEF1/HTLV-IgG1轻链和重链](pvVS490)瞬时转染悬浮鸭EBx细胞，其中悬浮鸭EBx细胞在添加2.5mM谷氨酰胺的无血清培养基(来自SAFC Biosciences的Excell GTM 3培养基)的六孔板中培养。转染后24H和48小时通过ELISA检测进行IgG1的表达监测。用无DNA的细胞作为对照核转染。

结果

鸭EBx细胞瞬时表达高达4.5μg/ml的IgG1抗体(图4)。

实施例7：稳定转染和最佳生产克隆鉴定

7.1-材料&方法：

细胞：

在添加2.5mM谷氨酰胺的无血清培养基(Excell-来自SAFC Biosciences)中培养鸡EB14和鸭EB66细胞。

表达载体：

对于EB 14细胞：pVVS490(pEF1/HTLV)和pVVS455(pRSV)

对于EB66细胞：pVVS490(pEF1/HTLV)

转染：

将表达载体在无血清培养基中通过电穿孔法(Amaxa)转染入EB14和EB66细胞。转染后3天，在细胞培养基中加入选择剂(遗传霉素，对于EB14细胞是0.25mg/ml，对于EB66细胞是0.15mg/mL)。分离、挑选和在较大培养容器(微孔板，培养瓶然后是生物反应器)中培养遗传霉素抗性克隆。

ELISA：

对稳定转染克隆进行ELISA筛选检测以测定上清中的抗体表达水平。该检测使用定量夹心酶免疫检测技术。预先将抗IgG-Fc特异性抗体包被在96孔板中。将标准、样品和交联剂加入孔中，且任何存在的IgG被固定抗体和连接第二酶的IgG-κ特异性单克隆抗体夹在中间。在冲洗以去除任何未结合的物质和/或抗体-酶试剂后，将底物溶液加在孔中，显色与结合的IgG的量成比例。使反应终止且测定显色强度(O.D.490nm)。通过Y轴上每一标准的平均吸光度对X轴上的浓度绘制标准曲线，并且通过图上的点绘制出最佳适应曲线。每一未知样品的浓度通过计算标准对应于曲线上平均吸光度的IgG的浓度而确定。例如，通过标准曲线确定的浓度必须乘以稀释因素。

7.2-结果：

获得许多稳定转染编码嵌合人-小鼠IgG1的重链和轻链cDNA的表达载体的

细胞克隆，并通过ELISA进行选择。最佳生产克隆被选择并将其培养在较大容器中(图5)。一种表达IgG1的稳定转染的EB14和EB66克隆适应于悬浮培养，并进一步在3升搅拌釜式生物反应器中进行培养。在3升生物反应器中非-最佳化(optimized)条件下培养9天后，EB14细胞密度达到16百万细胞/ml，并且细胞培养上清中的IgG1浓度是大约0.25g/l(图6A)。在非-最佳化(optimized)条件下，在3升生物反应器中EB66细胞也能有效地表达IgG1(图6B)。

实施例8：

生产的IgG1单克隆抗体的糖基化模式分析

将附着在EBx生产的IgG1上的聚糖进行毛细管电泳分析，并与附着在人丝氨酸IgG上的聚糖的毛细管电泳分析进行比较。获得的结果证明，EBx糖基化特征与人糖基化特征相似(图7A)。

还用N-连接聚糖的Maldi-Toff质谱分析对CHO(中国仓鼠卵巢)和鸡EB14细胞产生的IgG1的糖基化模式进行了比较。鸡EB14细胞生能产较普通CHO细胞(图7B)或HEK细胞(数据未显示)较少岩藻糖基化的抗体群。

通过Maldi-Toff质谱分析对鸡EB14细胞的一种稳定转染的克隆产生的IgG1的糖基化特征进行了分析。分析了通过残基Asn297连接到每个IgG1重链的的CH2结构域的N-寡糖结构(图8)。该鸡EB14细胞克隆产生的大多数IgG1抗体具有常见的双触角类型的N-连接寡糖结构，所述结构包含半乳糖基化的带有GlcNac末端的长链。IgG1抗体群的一个重要部分(48％)是非岩藻糖基化(图7B和8)。

用N-连接聚糖的MALDI-TOF质谱分析还对CHO(中国仓鼠卵巢)和鸭EB66细胞产生的IgG1的糖基化模式进行了比较。鸭EB66细胞能产生较普通CHO细胞(图12-表2)较少岩藻糖基化的抗体群。通过MALDI-TOF质谱分析对鸭EB66细胞的一种稳定转染的克隆产生的IgG1的糖基化特征进行了分析。分析了通过残基Asn 297连接到每个IgG1重链的CH2结构域的N-寡糖的结构(图13)。该鸭EB66克隆产生的大多数IgG1抗体具有常见的双触角类型的N-连接寡糖结构，所述结构包含半乳糖基化的带有GlcNac末端的长链。EB66产生的IgG1抗体群的一个重要部分(＞50％)是非岩藻糖基化的(图12，13，14)。相反地，CHO产生的同一IgG1抗体显示出具有双触角类型的N-连接寡糖结构，所述结构包含高度岩藻糖基化(＞70％)的带有GlcNac末端的长链(图12，13，14)。

表2：鸭EB66细胞和CHO细胞产生的IgG1中复杂类型N-连接寡糖的百分数。

进行了EB66细胞表达的IgG1上唾液酸残基含量的分析。以乙酸(终浓度2M，80℃，2h)水解后，EB66克隆1D7表达的IgG1上存在的唾液酸被标记上DMB(1，2-二氨基-4，5-二氧甲叉基-苯)。通过HPLC(荧光检测)分析了N-乙酰神经氨酸(NeuAC)和N-乙醇酰基神经氨酸(NeuGc)的相对比例。NeuAc代表了在《EB66》IgG1上95％的唾液酸(见表3)。

表3：EB66细胞(克隆ID7)产生的IgG1上的唾液酸的相对比例

唾液酸	相对百分数(％)
唾液酸	相对百分数(％)	Neu5Ac	6.96
Neu5，7Ac2	5.64	Neu5Ac	6.96
Neu5，7Ac2	5.64	Neu5Gc9Ac	3.84
Neu5，9Ac2	63.53	Neu5Gc9Ac	3.84
Neu5，9Ac2	63.53	Neu5，7(或8)，9Ac3	20.03

实施例9：

细胞相对于杂交瘤产生的IgG1的抑制肿瘤细胞增殖的分析

测定鸡EB14细胞或杂交瘤产生的IgG1免疫球蛋白的抑制细胞增殖的活性的检测被开发出来。IgG1抗体定向抗人肿瘤细胞表面表达的CD标记。

在氚标记的脱氧胸腺嘧啶苷存在条件下培养肿瘤细胞，并在IgG1免疫球蛋白存在条件下，将其与来自正常患者的单核细胞或自然杀伤T细胞孵育。该检测测定作为IgG1介导的经单核细胞或NK细胞裂解肿瘤细胞的后果掺入到肿瘤细胞中的氚标记的脱氧胸腺嘧啶苷的量。培养4天后，以NK或或单核细胞和鸡EB14细胞产生的IgG1抗体处理的肿瘤细胞中有少量氚标记的脱氧胸腺嘧啶掺入。相反地，以NK或单核细胞和杂交瘤产生的IgG1抗体处理的肿瘤细胞中观察到较高水平的氚标记的脱氧胸腺嘧啶掺入。

所以，鸡EB14细胞生产的IgG1显示较杂交瘤产生的同一IgG1抗体具有较好的细胞介导的细胞毒活性(图9)。

实施例10：细胞产生的IgG1MAB的ADCC活性

10.1-方法

使用标准密度离心程序将来自两名健康供体的PBMC进行分离并将其在RPMI细胞培养基中以5x10⁶细胞/ml重悬。

根据标准组织培养方法培养疾病相关靶细胞，从活力大于90％的指数生长期将其收获，以RPMI细胞培养基冲洗，并标记以100微居里的⁵¹Cr，以细胞培养基冲洗2遍，并以细胞培养基以10⁵细胞/ml的密度重悬。将100微升疾病相关靶细胞悬液转移至96孔微孔板的每个孔中。

将抗所述疾病靶细胞的抗原性表面标记的抗体在细胞培养基中从4000ng/ml至0.04ng/ml进行系列稀释，将50微升所得抗体溶液加入96孔微孔板的靶细胞中，检测包括上述整个浓度范围的各个抗体浓度，重复3次。然后将96孔微孔板于50xg离心1分钟并在4℃孵育1小时。

在每孔中加入50微升PBMC悬液以提供效应物：靶细胞的比例是25∶1，并且将培养板置于5％CO₂大气、37℃孵箱中4小时。

收获每孔的无细胞上清，并使用γ计数器对实验性释放的放射活性(ER)进行定量。

10.2-结果

使用从2名不同健康供体的PBMC中纯化的NK细胞进行的2个独立的实验显示，与CHO细胞产生的同一抗体相比，鸡EB14和鸭EB66细胞产生的定向抗疾病相关靶细胞的IgG1抗体的ADCC活性增加(图10，15和16)。

通过铬释放方法测定ADCC活性或通过表达IFNγ或CD107标记的NK细胞百分数来估计ADCC活性(图15)。

实施例11：稳定转染NR13抗细胞凋亡基因的贴壁的鸡细胞的生长分析

构建2种不同的表达载体pVVS437和pVVS438载体。pVVS437仅含有博来霉素抗性基因。PVVS438能表达嘌呤霉素抗性和鸡抗细胞凋亡基因NR13。以pVVS437或pVVS438载体转染鸡贴壁

细胞，选择最佳生产者克隆。将表达NR13蛋白的稳定转染的

细胞在100mm培养皿中进行贴壁培养。不表达NR13蛋白的

细胞不能存活于培养物中，并且大多数这种细胞在培养6至7天后死亡。仅有小的和稳定比例的表达NR13蛋白的

在培养过程中死亡，大多数NR13

细胞在培养较长时期后仍然存活(图11)。

序列表

<110>维涡里斯公司

M·梅赫泰里

<120>禽类中的重组蛋白生产

<130>D25555

<150>US 61/032,786

<151>2008-02-29

<150>EP 07301058.9

<151>2007-05-21

<160>11

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>489

<212>DNA

<213>人类巨细胞病毒

<220>

<223>CMv启动子序列

<400>1

ggcgaccgcc cagcgacccc cgcccgttga cgtcaatagt gacgtatgtt cccatagtaa 60

cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa actgcccact 120

tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa gtccgccccc tattgacgtc aatgacggta 180

aatggcccgc ctagcattat gcccagtaca tgaccttacg ggagtttcct acttggcagt 240

acatctacgt attagtcatc gctattacca tggtgatgcg gttttggcag tacaccaatg 300

ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg 360

ggagtttgtt ttggcaccaa aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaat aaccccgccc 420

cgtgacccaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc tatatagcag agctcgttta 480

gtgaaccgt 489

<210>2

<211>538

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>EF1/HTLV启动子序列

<400>2

agatctgctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 60

tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag gtggcgcggg gtaaactggg 120

aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa 180

gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacagctga 240

agcttcgagg ggctcgcatc tctccttcac gcgcccgccg ccctacctga ggccgccatc 300

cacgccggtt gagtcgcgtt ctgccgcctc ccgcctgtgg tgcctcctga actgcgtccg 360

ccgtctaggt aagtttaaag ctcaggtcga gaccgggcct ttgtccggcg ctcccttgga 420

gcctacctag actcagccgg ctctccacgc tttgcctgac cctgcttgct caactctacg 480

tctttgtttc gttttctgtt ctgcgccgtt acagatccaa gctgtgaccg gcgcctac 538

<210>3

<211>404

<2i2>DNA

<213>劳斯肉瘤病毒

<220>

<223>RSV启动子序列

<400>3

gcgatgtacg ggccagatat acgcgtatct gaggggacta gggtgtgttt aggcgaaaag 60

cggggcttcg gttgtacgcg gttaggagtc ccctcaggat atagtagttt cgcttttgca 120

tagggagggg gaaatgtagt cttatgcaat actcttgtag tcttgcaaca tggtaacgat 180

gagttagcaa catgccttac aaggagagaa aaagcaccgt gcatgccgat tggtggaagt 240

aaggtggtac gatcgtgcct tattaggaag gcaacagacg ggtctgacat ggattggacg 300

aaccactgaa ttccgcattg cagagatatt gtatttaagt gcctagctcg atacaataaa 360

cgccatttga ccattcacca cattggtgtg cacctccaag ctgg 404

<210>4

<211>133

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>嵌合内含子序列

<400>4

gtaagtatca aggttacaag acaggtttaa ggagaccaat agaaactggg cttgtcgaga 60

cagagaagac tcttgcgttt ctgataggca cctattggtc ttactgacat ccactttgcc 120

tttctctcca cag 133

<210>5

<211>222

<212>DNA

<213>猴病毒40(sV40)

<220>

<223>PolyA序列

<400>5

cagacatgat aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac aactagaatg cagtgaaaaa 60

aatgctttat ttgtgaaatt tgtgatgcta ttgctttatt tgtaaccatt ataagctgca 120

ataaacaagt taacaacaac aattgcattc attttatgtt tcaggttcag ggggagatgt 180

gggaggtttt ttaaagcaag taaaacctct acaaatgtgg ta 222

<210>6

<211>548

<212>DNA

<213>原鸡

<220>

<223>NR13鸡序列

<400>6

gctagcatgc cgggctctct gaaggaggag acggcgctgc tgctggagga ctacttccag 60

caccgcgccg gcggcgccgc gctgcctccc agcgccacgg cggccgagct gcggcgggcg 120

gcggccgagc tggagcgccg agagcggccc ttcttccgct cctgcgcgcc gctggcgcgg 180

gccgagccgc gggaggcggc ggcgctgctg cggaaggtgg cggcgcagct ggaggccgaa 240

ggcggcctca actggggccg gctgctggcg ctcgtggtgt tcaccggcac gctggcggcg 300

gcgctggccg agagcggctg cgaggaaggg ccgagccgcc tggccgccgc gctggccgcg 360

tacctggccg aggagcaggg cgagtggctg gaggagcacg gcggatggga cggcttctgt 420

cgcttcttcg gcagacatgg ctcccaacca gctgaccaga acagtacctt aagcaatgcc 480

atcatggcag cggcagggtt tggaatagca ggattagctt ttctcttggt ggtgcggtag 540

gcggccgc 548

<210>7

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>RSV-Bgl2F

<400>7

ataagatctg cgatgtacgg gccagata 28

<210>8

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>RSV-IPpolR

<400>8

tatgctacct taagagagtc cagcttggag gtgcacacc 39

<210>9

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AscBamSV40polyAR

<400>9

ataggcgcgc cggatcccga tccttatcgg attttaccac 40

<210>10

<211>34

<212>DNA

<213>原鸡

<220>

<223>AS376

<400>10

acgctagcat gccgggctct ctgaaggagg agac 34

<210>11

<211>39

<212>DNA

<213>原鸡

<220>

<223>AS377

<400>11

gagcggccgc ctaccgcacc accaagagaa aagctaatc 39

Claims

1、一种转染至少一种表达载体的禽类

细胞，所述表达载体包含至少一种表达盒，所述表达盒包含编码目的重组蛋白的核酸序列，该序列通过操作连接至能影响所述蛋白在所述细胞中表达的启动子序列上。

2、根据权利要求1所述的细胞，其中表达载体进一步包含至少一种表达盒，所述表达盒包含至少一种编码选择性标记的核酸序列，所述核酸序列通过操作连接至能影响所述选择性标记在宿主细胞中表达的启动子序列上。

3、根据权利要求1和2所述的

细胞，其中选择性标记选自谷氨酰胺合酶、黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、嘌呤霉素、潮霉素B、新霉素基因或二氢叶酸还原酶(DHFR)。

4、根据权利要求3所述的

细胞，其中启动子序列选自巨细胞病毒(CMV)启动子、猴病毒40(SV40)早期启动子、单纯疱疹病毒(HSV)胸腺嘧啶脱氧核苷激酶启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、鼠磷酸甘油酸激酶启动子、eIF4α启动子、嵌合EF1α/HTLV启动子、CAG启动子或β-肌动蛋白启动子。

5、根据权利要求1和4所述的

细胞，其中所述表达盒进一步包含一种或多种调控元件或调节性序列，其选自转录起始序列、增强子序列、内含子序列、多腺苷酸化序列、终止序列或染色质隔离元件。

6、根据权利要求5所述的

细胞，其中染色质隔离元件选自边界元件(BE)、基质结合区(MAR)、基因座调控区(LCR)或通用染色质开放元件(UCOE)。

7、根据权利要求1至6所述的

细胞，其中所述表达载体至少包含：

-第一表达盒，其包含下列顺序的下列DNA序列：SEQ ID N°1的CMV启动子序列、内含子序列、编码目的重组蛋白的cDNA序列、多腺苷酸化序列；和

-第二表达盒，其包含下列顺序的下列DNA序列：SV40启动子、新霉素基因、多腺苷酸化序列。

8、根据权利要求1至6所述的

细胞，其中所述表达载体至少包含：

-第一表达盒，其包含下列顺序的下列DNA序列：SEQ ID N°2的嵌合EF1α/HTLV启动子序列、内含子序列、编码目的重组蛋白的cDNA序列、多腺苷酸化序列；和

9、根据权利要求1至6所述的细胞，其中所述表达载体至少包含下列顺序的：

-第一表达盒，其包含下列顺序的下列DNA序列：SEQ ID N°1的CMV启动子、内含子序列、编码抗体的重链或其片段的cDNA序列、多腺苷酸化序列；

-第二表达盒，其包含下列顺序的下列DNA序列：SEQ ID N°1的CMV启动子、内含子序列、编码抗体的轻链或其片段的cDNA序列、多腺苷酸化序列；

-第三表达盒，其包含下列顺序的下列DNA序列：SV40启动子、新霉素基因、多腺苷酸化序列。

10、根据权利要求1至6所述的细胞，其中所述表达载体至少包含下列顺序的：

-第一表达盒，其包含下列顺序的下列DNA序列：SEQ ID N°2的嵌合EF1α/HTLV启动子、内含子序列、编码抗体重链或其片段的cDNA序列、多腺苷酸化序列；

-第二表达盒，其包含下列顺序的下列DNA序列：SEQ ID N°2的嵌合EF1α/HTLV启动子、内含子序列、编码抗体轻链或其片段的cDNA序列、多腺苷酸化序列；

11、根据权利要求1至10所述的

细胞，其中细胞进一步包含表达载体，所述表达载体至少包含表达盒，所述表达盒包含编码抗-细胞凋亡蛋白的DNA序列，所述DNA序列通过操作连接至能影响所述抗细胞凋亡蛋白在细胞中表达的启动子序列上。

12、根据权利要求11所述的

细胞，其中抗细胞凋亡蛋白是鸡NR13蛋白。

13、根据权利要求1至12所述的

细胞，其中表达载体稳定掺入细胞的染色体DNA中。

14、根据权利要求1至13所述的

细胞，其中细胞是选自EB14或EBv13细胞的鸡

细胞和选自EB24、EB24-12、EB26或EB66的鸭EBx细胞。

15、根据权利要求14所述的

细胞，其中所述细胞是适应于无血清培养基的悬浮细胞。

16、根据权利要求14所述的细胞，其中细胞是适应于无血清培养基的贴壁

细胞。

17、一种在禽类

细胞中生产至少一种目的生物产品的方法，所述方法包含下列步骤：

a)通过转染至少一种表达载体制备根据权利1至16所述的

细胞；

b)在合适的条件和在合适的培养基中培养所述

细胞；和

c)从

细胞、合适的培养基或既从所述

细胞也从所述培养基收获目的生物产品。

18、根据权利要求17所述的方法，其中

细胞在无血清培养基中的贴壁培养中通过电穿孔法转染至少一种表达载体。

19、根据权利要求17所述的方法，其中

细胞在无血清培养基中的悬浮培养中通过脂质体介导的转染法转染至少一种表达载体。

20、根据权利要求17至19所述的方法，其中目的生物产品是抗体分子、抗体片段或包括等同于免疫球蛋白Fc区的区域的融合蛋白，其中所述目的生物产品具有增强的Fc-介导的细胞毒性。

21、一种具有鸡或鸭糖基化的目的生物产品。

22、一种在

细胞中生产并具有

糖基化的抗体群，其中所述抗体群或其片段包含Fc区，其包含大部分的带有常见的双触角类型的N-连接岩藻糖基化的-寡糖结构的抗体，所述寡糖结构包含具有高度半乳糖基化的末端GlcNac的长链，且其赋予所述抗体强ADCC活性。

23、根据权利要求22所述的具有IgGl或IgG3亚型的抗体，其在

细胞生产并具有较杂交瘤或CHO细胞中生产的同一抗体增加的ADCC活性。

24、作为药物的根据权利要求21所述的目的生物产品。

25、作为药物的根据权利要求22和23所述的抗体或其片段。

26、根据权利要求24所述的生物产品或根据权利要求25所述的抗体或其片段在制备用于预防或治疗人和动物疾病的药物组合物中的用途。

27、一种药物组合物，其包含根据权利要求24所述的生物产品或根据权利要求25所述的抗体或其片段和药学上可接受的载体。