EA017964B1 - Способ продуцирования антител или гибридных белков в клетках птиц и применение полученных антител и белков - Google Patents

Способ продуцирования антител или гибридных белков в клетках птиц и применение полученных антител и белков Download PDF

Info

Publication number
EA017964B1
EA017964B1 EA200971056A EA200971056A EA017964B1 EA 017964 B1 EA017964 B1 EA 017964B1 EA 200971056 A EA200971056 A EA 200971056A EA 200971056 A EA200971056 A EA 200971056A EA 017964 B1 EA017964 B1 EA 017964B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
cells
cell
promoter
antibody
serum
Prior art date
Application number
EA200971056A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200971056A1 (ru
Inventor
Мажид Метали
Original Assignee
Вивалис
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Вивалис filed Critical Вивалис
Publication of EA200971056A1 publication Critical patent/EA200971056A1/ru
Publication of EA017964B1 publication Critical patent/EA017964B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A61P5/16—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4 for decreasing, blocking or antagonising the activity of the thyroid hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/23—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from birds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Obesity (AREA)

Abstract

Изобретение в целом относится к области продуцирования рекомбинантных белков. Более конкретно, изобретение относится к применению линий эмбриональных стволовых клеток птиц, названных EBx®, для продуцирования белков и, более конкретно, гликопротеинов, таких как антитела. Изобретение полезно для продуцирования подтипа моноклонального антитела IgG1, обладающего высокой клеточно-опосредованной цитотоксической активностью. Изобретение относится к применению таких антител в качестве лекарства для лечения раков и воспалительных заболеваний.

Description

(57) Изобретение в целом относится к области продуцирования рекомбинантных белков. Более конкретно, изобретение относится к применению линий эмбриональных стволовых клеток птиц, названных ЕВх®, для продуцирования белков и, более конкретно, гликопротеинов, таких как антитела. Изобретение полезно для продуцирования подтипа моноклонального антитела 1дС1, обладающего высокой клеточно-опосредованной цитотоксической активностью. Изобретение относится к применению таких антител в качестве лекарства для лечения раков и воспалительных заболеваний.
Изобретение в целом относится к области продуцирования рекомбинантных белков. Более конкретно, изобретение относится к применению линий эмбриональных стволовых клеток птиц, названных ЕВх®, для продуцирования белков и, более конкретно, гликопротеинов, таких как антитела. Изобретение полезно для продуцирования подтипа моноклонального антитела 1д61, обладающего высокой клеточноопосредованной цитотоксической активностью. Изобретение относится к применению таких антител в качестве лекарства для лечения раков и воспалительных заболеваний.
Гликопротеины опосредуют многие незаменимые функции у людей, включая катализ, передачу сигнала, межклеточное сообщение и молекулярное распознавание и связывание. Многие гликопротеины применены в терапевтических целях. Олигосахаридный компонент белка может влиять на свойства, релевантные для эффективности терапевтического гликопротеина, включая физическую стабильность, устойчивость к протеазной атаке, взаимодействия с иммунной системой, фармакокинетику и специфическую биологическую активность. Такие свойства могут зависеть не только от присутствия или отсутствия, но также от специфичных структур олигосахаридов. Например, некоторые олигосахаридные структуры опосредуют быстрый клиренс гликопротеина из кровотока посредством взаимодействий со специфичными белками, связывающими углеводы, тогда как другие могут связываться антителами и запускать нежелательные иммунные реакции (1епк1И8 с! а1., №1Шгс Вю1сс1шоГ 14:975-81 (1996)). Примеры гликопротеинов включают эритропоэтин (ЕРО), активатор тканевого плазминогена (ТрА), интерферон бета (ΙΓΝ-β), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (6М-С8Г), человеческий хорионический гонадотропин (11СС) и терапевтические моноклональные антитела (Май).
Большинство антител содержит углеводные структуры при консервативных положениях в константных областях тяжелой цепи, где каждый изотип обладает отдельным расположением Ν-сшитых углеводных структур, которые по-разному влияют на сборку, секрецию или функциональную активность белка (\Угщ1и & Моткой (1997). Тгспйк Вю1сс11. 15:26-32). Биологическая активность некоторых 6 иммуноглобулинов зависит от присутствия и от типа гликановой структуры на молекуле и, в частности, на ее Гс-компоненте. Продемонстрировано влияние присутствия или отсутствия гликансодержащих остатков на способность антитела к взаимодействию с эффекторными молекулами (Гс-рецепторами и комплементом). Ингибирование гликозилирования человеческого Ιβ61 путем культивирования в присутствии туникамицина вызывает, например, 50-кратное снижение сродства этого антитела к рецептору ГсуКЙ, присутствующему на моноцитах и макрофагах (ГсаШсгЬатготе с! а1. (1985), Мо1сс. 1ттип., 22:407-415). На связывание с рецептором ГсуКШ также влияет потеря углеводов на ΙβΟ. поскольку описано, что негликозилированный 1дС3 не способен к индукции лизиса типа АЗКЦ (антителозависимой клеточной цитотоксичности) посредством рецептора ГсуШП клеток ΝΚ (Бипй с! а1. (1990), Мо1сс. 1ттип. 27:11451153). Однако, кроме необходимого присутствия этих гликансодержащих остатков, точнее, необходима гетерогенность их структуры, которая может приводить в результате к различиям в способности к инициации эффекторных функций.
Молекулы 1д6 всех человеческих и мышиных подклассов имеют Ν-олигосахарид, присоединенный к СН2 домену каждой тяжелой цепи (при остатке Акп 297 для человеческих Ιβ6). Общая структура Ν-сшитого олигосахарида на Ιβ6 является структурой комплексного типа, характеризующейся маннозил-хитобиозной сердцевиной (Мап3-С1с№1с2-Акп) с делением или без деления пополам 61с№с/Ь-фукозой (Гис), и другими вариантами цепи, включающими присутствие или отсутствие галактозы (6а1) и сиаловой кислоты (см. фиг. 17). Кроме того, олигосахариды могут содержать ноль (60), один (61) или два (62) 6а1 (см. фиг. 17). Структура присоединенного Ν-сшитого углевода может значительно варьировать в зависимости от степени процессинга и может включать комплексные олигосахариды с высоким содержанием маннозы, как многократно разветвленные, так и двухантенные. Типично существует гетерогенный процессинг сердцевинных олигосахаридных структур, присоединенных при конкретном сайте гликозилирования, так что даже моноклональные антитела существуют в виде множественных гликоформ. Наблюдали профили галактозилирования, которые являются вариабельными в зависимости от индивидуума (человеческие сывороточные 1д61). Эти различия, вероятно, отражают различия в активности галактозилтрансфераз и других ферментов между клеточными клонами этих индивидуумов (1сГГсг1к с! а1. (1990), ВюсНст 1. 268:529-537). Подобным образом, показано, что основные различия в гликозилировании антител встречаются между клеточными линиями, и даже минорные различия наблюдают для данной клеточной линии, выращенной в различных условиях культивирования, включая состав культуральной среды, плотность клеток, рН, обогащение кислородом (ЫГс1у с! а1. (1995), 61усоЬ1о1оду. 5 (8):813-22; Китрс1 с! а1. (1994), Нит. АийЬоШск апй НуЬпйотак. 5:143-151).
Проведены исследования, чтобы изучить функцию олигосахаридного остатка при биологических активностях антитела. Воуй с! а1. (1995), Мо1. 1ттипо1. 32:1311-1318) показали, что сиаловая кислота 1д6 не обладает эффектом на АЗКЦ. В нескольких сообщениях показано, что остатки 6а1 усиливают АЗКЦ (Китрс1 с! а1. (1994), Нит. АпйЬ. НуЬпй. 5:143-151; Китрс1 с! а1. (1995), Нит. АпйЬ. НуЬпй. 6:82-88). Делящий пополам 61с№с, который представляет собой остаток бета-1,4-61с№с, перенесенный на сердцевинный остаток бета-маннозы (Мап), включенный в биологический остаток терапевтических антител (ЫГс1у с! а1. (1995), 61усоЬю1о§у. 5 (8):813-22). 8йс1й с! а1. (2002), 1. Вю1. С1ст. 277:26733-26740), вы
- 1 017964 явил эффект фукозилированного олигосахарида на эффекторные функции антитела; Рис-недостаточный 1дС1 показал увеличенное в 50 раз связывание с РсуКШ и усиленную АЗКЦ.
В настоящее время широкий ряд рекомбинантных белков для терапевтических применений (т.е. рака, воспалительных заболеваний и т.п.) состоит из гликозилированных моноклональных антител. По терапевтическим и экономическим причинам существует большой интерес в получении высокоспецифичной активности антител. Одним из путей к получению большого прироста эффективностей при сохранении простого способа продуцирования в клеточной линии и потенциального избегания значительных нежелательных побочных эффектов является усиление естественных, клеточно-опосредованных эффекторных функций МаЬ. Следовательно, конструирование олигосахаридов 1дС может привести в результате к оптимизированной АЗКЦ, которую рассматривают как основную функцию некоторых терапевтических антител, хотя антитела обладают множественными терапевтическими функциями (например, связывание антигена, индукция апоптоза и комплементзависимая клеточная цитотоксичность (КЗКЦ)). Фирма, подобная СЬУСАКТ ВЮТЕСНЫОЬОСУ АО (Ζιιποίι. СН), экспрессировала Ν-ацетилглюкозаминилтрансферазу III (ОиТШ), которая катализирует добавление делящего пополам остатка С1с№1с к Ν-сшитому олигосахариду, в линии клеток яичника китайского хомячка (СНО) и показала более высокую АЗКЦ продуцируемого антитела 1дС1 (\УО 99/54342; \УО 03/011878; \УО 2005/044859). В результате удаления или вытеснения фукозы из участка Рс-антитело КУОХУА НАККО КООУО (Токио, Япония) обладает усиленным связыванием Рс и улучшенной АЗКЦ, и, следовательно, эффективностью МаЬ (И8 6946292). Более недавно в ЬаЬотаМге Бгапсаб би Ргасйоииетеи! с1 бек Вю1ес1то1ощек (ЬРВ) (Франция) показали, что отношение Рис/Оа1 в олигосахариде МаЬ должно быть равно или ниже чем 0,6, чтобы получить антитела с высокой АЗКЦ (БК 2861080).
Однако все еще остается необходимость в обладании альтернативными способами продуцирования человеческих моноклональных антител в клетке, пригодными для широкомасштабного продуцирования, которые не были схематически разработаны, для экспрессии или для ингибирования соответствующей гликозилтрансферазы, а также такими, которые обеспечивают постоянное гликозилирование человеческого типа с усиленными клеточно-опосредованными эффекторными функциями. Это составляет цель настоящего изобретения.
В настоящее время авторы изобретения продемонстрировали, что неожиданно моноклональное антитело, экспрессируемое в линии эмбриональных стволовых клеток птиц ЕВх®, проявляет паттерн гликозилирования, подобный человеческому. Авторами изобретения также сделано открытие, что большая доля популяции антител 1дС1, продуцируемых в клетках ЕВх®, имеет общую структуру Ν-сшитого олигосахарида двухантенного типа, которая содержит длинные цепи с концевым С1с№1с, которые являются в высокой степени галактозилированным. Примерно половина популяции антител 1дС1 содержит структуру Ν-сшитого олигосахарида двухантенного типа, которая не является фукозилированной и которая придает сильную активность АЗКЦ антителам. В настоящем изобретении предложены эмбриональные стволовые клетки птиц ЕВх®, предпочтительно эмбриональные стволовые клетки кур или уток ЕВх®, и более предпочтительно клетки ЕВ14 кур или клетки ЕВ24 и ЕВ66 уток, сконструированные генноинженерным способом для экспрессии белков рекомбинантным путем, и более конкретно антител, фрагментов антител или гибридных белков, которые включают фрагменты антител с повышенной активностью АЗКЦ.
Линии эмбриональных стволовых клеток птиц ЕВх® представляют собой клеточные линии, разработанные фирмой ВИВАЛИС (У1УАБ18) (Нант, Франция), которая воспользовалась преимуществом ее практического опыта и профессиональных знаний в биологии птиц и в эмбриональных стволовых клетках (ЭС) птиц, чтобы предпринять разработку новых стабильных линий клеток птиц, которые удовлетворяют промышленным и законодательным спецификациям. Используя собственный способ (см. ХУО 03/076601), автор изобретения создал серию хорошо охарактеризованных и документированных клеточных линий (т.е. клетки ЕВх®) без стадий генетической, химической или вирусной иммортализации. В предпочтительном воплощении клетки птиц по настоящему изобретению представляют собой клетки кур или уток. Клетки ЕВх® получены, используя полностью документированный 2-стадийный способ, и учитывая все законодательные требования (например, регулярный мониторинг санитарного состояния стад кур и уток, использование сыворотки из стран, свободных от губчатой энцефалопатии крупного рогатого скота, использование проназы вместо трипсина, доступность сертификатов происхождения для всех компонентов, включенных в процесс).
Стадия 1. Культивирование и размножение ίη νίίτο ЭС клеток кур или уток.
Эмбриональные стволовые клетки уникальны в том, что они (ί) могут самостоятельно обновляться ίη νίίτο бесконечно долго в виде недифференцированных клеток; (ίί) обладают неограниченной регенеративной способностью; (ш) сохраняют стабильный хромосомный состав; (ίν) экспрессируют высокие уровни теломеразы и специфичных маркеров клеточной поверхности. Несмотря на множество усилий во всем мире, ЭС клетки успешно выделены только из очень ограниченного числа видов (мыши, человека, обезьян). Автор изобретения направил значительные ресурсы, накопленные за последние годы, на выделение и получение стабильной линии ЭС клеток из различных видов птиц, в основном из кур и уток. Эти
- 2 017964 исследовательские усилия привели к успешному выделению и характеристике куриных ЭС клеток [Раш с1 а1. 1999. Се11 Т188ие8 Огдапз. 165: 212-219] и утиных ЭС клеток. Затем автор изобретения разработал собственные методики, которые дали возможность эффективного культивирования ίη νίΐτο и широкомасштабного размножения куриных и утиных ЭС клеток без индукции дифференциации.
Стадия 2. Извлечение клеток ЕВх®.
Затем автор изобретения предложил собственный способ извлечения стабильных, прикрепленных или суспензионных, непрерывных клеточных линий из ЭС клеток птиц. Этот способ включает прогрессивное исключение сыворотки, фидерных клеток и ростовых факторов из клеточной культуральной среды и адаптацию клеток к суспензионной культуре. Эти линии клеток птиц эмбрионального происхождения сохраняли большинство желаемых признаков ЭС клеток (т.е. неопределенно долгую пролиферацию, экспрессию ЭС-специфичных маркеров, таких как теломераза, стабильность кариотипа), но в дополнение проявляли новые промышленно благоприятные характеристики (рост в суспензии в средах, свободных от сыворотки, вплоть до высоких плотностей клеток).
На основе их привлекательных биологических свойств авторы изобретения выбрали несколько линий куриных клеток ЕВх® для дальнейшей разработки, таких как суспензионные линии куриных клеток ЕВ14 (см. \УО 03/076601 и \УО 05/007840) или ΕΒν13. Альтернативно авторы изобретения отобрали несколько линий утиных клеток ЕВх® для дальнейшей разработки, таких как ЕВ24, ЕВ26, ЕВ66.
Клеточные линии ЕВх® по изобретению являются непрерывными, поскольку они обладают характеристиками культивирования ίη νίΐτο в течение продолжительного периода времени. Преимущественно клетки по изобретению способны к пролиферации по меньшей мере 50 поколений, по меньшей мере 75 поколений, по меньшей мере 100 поколений, по меньшей мере 125 поколений, по меньшей мере 150 поколений, по меньшей мере 175 поколений, по меньшей мере 200 поколений, по меньшей мере 250 поколений. 250 поколений не составляет предел времени, поскольку полученные клетки все еще живы, и их все еще можно пересевать для дополнительных пассажей. Без связи с теорией постулировано, что клетки по изобретению можно культивировать непрерывно настолько долго, насколько теломераза экспрессируется клетками. Действительно, принимают, что высокий уровень экспрессии теломеразы клетками птиц по изобретению ответственен за генетическую стабильность (т.е. птичьи клетки ЕВх® по изобретению являются диплоидными) и непрерывный клеточный рост.
Под пассажем подразумевают перенос или пересев клеток, с разведением или без разведения, из одного культурального сосуда в другой. Понятно, что в любое время клетки могут быть перенесены из одного сосуда в другой, некоторая часть клеток может быть потеряна, и, следовательно, может иметь место разведение клеток: либо преднамеренное, либо непреднамеренное. Этот термин является синонимом термину субкультура. Число пассажей равно числу моментов, когда клетки в культуре, которые растут либо в суспензии, либо при прикреплении, субкультивируют или переносят в новый сосуд. Этот термин не является синонимом удвоения популяции или поколения, который представляет собой время, необходимое клеточной популяции для воспроизведения один раз; т.е. грубо говоря, время воспроизведения для каждой клетки в популяции. Например, утиные или куриные ЭС имеют время удвоения популяции (ВУП) примерно >40 ч. Клетки птиц ЕВх® по изобретению имеют ВУП примерно менее чем 30 ч, обычно менее чем 24 ч и предпочтительно менее чем 20 ч. Для клеток ЕВх® обычно проводят один пассаж через каждые 3 поколения.
Под диплоидом подразумевают, что клетки по изобретению имеют две копии (2η) каждой хромосомы, обычно одну от материнской и одну от отцовской клетки.
Тот факт, что линии клеток птиц ЕВх® по изобретению являются непрерывными и диплоидными (т.е. генетически стабильными), составляет примечательный и уникальный признак, поскольку эти термины обычно являются антагонистами. Так, раковые клетки и/или иммортализованные клетки, полученные путем химической, физической (УФ-облучение, рентгеновское или гамма-облучение и т.п.) или генетической модификации (вирусная трансформация, гиперэкспрессия онкогенов и т.п.), представляют собой непрерывные клетки, поскольку они способны неопределенно долго реплицироваться в культуре, но они не являются генетически стабильными, поскольку они проявляют полиплоидные кариотипы. С другой стороны, первичные клетки, такие как эмбриональные фибробласты цыпленка, МКС5, \У138, которые представляют собой нетрансформированные клетки, не являются непрерывными, поскольку они имеют конечную продолжительность жизни после нескольких поколений, но они являются генетически стабильными (т.е. диплоидными) клетками.
В настоящем изобретении термины клеточная линия и клетки следует использовать без отличия.
Термин птичий, птица, ауез или ага, как используют здесь, подразумевают одинаковое значение, и их следует использовать без отличия. Птицы относятся к любому виду, подвиду или расе организма таксономического класса ага. В предпочтительном воплощении птицы относятся к любому животному таксономического отряда.
- 3 017964
Пластинчатоклювые (т.е. утка, гусь, лебедь и родственные виды).
Отряд пластинчатоклювых содержит примерно 150 видов птиц в трех семействах: ЛпЫшМае (шпорцевые гуси), Лпкегапайбае (полулапчатый гусь) и Апаббае, которое включает более 140 видов водоплавающих птиц, среди них уток, гусей и лебедей. Все виды в этом отряде в высокой степени адаптированы к существованию в водоемах на поверхности воды. Все они являются лапчатоногими для эффективного плавания (хотя некоторые впоследствии стали в основном наземными).
Куриные (т.е. куры, перепела, индюк, фазан и родственные виды). Куриные представляют собой отряд птиц, содержащий кур, индюков, перепелов и фазанов. Примерно 256 видов находится по всему миру.
Голубеобразные (т.е. голубь и родственные виды). Отряд птиц Голубеобразные включает очень широко распространенных горлиц и голубей.
В соответствии с предпочтительным воплощением птица по изобретению выбрана среди птиц, которые не содержат провирусных последовательностей вируса лейкоза птиц типа Е (АЬУ-Е) и эндогенного птичьего вируса (ЕАУ) в их геноме. Специалист в данной области техники способен определить, присутствуют ли последовательности ЛЬУ-Е и ЕЛУ в геноме птицы (1ойп8оп е! Непете, 2001, 1. У1го1. 75:3605-3612; ХУеГСтаБг е! а1., 1997, 1. У1го1. 71:3005-3012). Предпочтительно птица выбрана из группы, включающей пластинчатоклювых (т.е. утку, гуся, лебедя), индюков, перепелов, японских перепелов, цесарок, павлинов. Следовательно, клетки, выделенные из такой птицы, не продуцируют репликационнокомпетентные ЛЬУ-Е и/или ЕАУ частицы. В предпочтительном воплощении птица по настоящему изобретению выбрана среди группы, включающей уток, гусей, лебедей, индюков, перепелов и японских перепелов, цесарок и павлинов. В соответствии с более предпочтительным воплощением птица представляет собой утку, более предпочтительно пекинскую или мускусную утку. В соответствии с более предпочтительным воплощением птица представляет собой пекинскую утку. Следовательно, в настоящем изобретении предложен способ получения непрерывных диплоидных линий клеток уток, выделенных из эмбриональных стволовых клеток (ЭС), где указанные линии клеток уток не продуцируют репликационно-компетентные эндогенные ретровирусные частицы. Примерами линий клеток уток ЕВх® по изобретению являются ЕВ24, ЕВ26, ЕВ66 или их субклоны, такие как ЕВ24-12.
Согласно второму предпочтительному воплощению птица по изобретению выбрана среди птиц, которые не содержат в их геноме полноразмерных провирусных последовательностей АЬУ-Е, но в конечном счете содержат провирусные последовательности ЕАУ. Специалист в данной области техники способен определить, частичные или полноразмерные последовательности АЬУ-Е и ЕАУ присутствуют в геноме птицы (1о11п5оп апб Непете, 2001). Путем скрещивания отобрано несколько линий кур, которые не содержат полноразмерных провирусных последовательностей АЬУ-Е (т.е. линия еу-0) и, следовательно, не продуцируют инфекционных ретрочастиц АЬУ-Е, таких как:
линия 0 домашних кур из стада птицы Ист Лансинга Министерства сельского хозяйства США (линия ЕЬЬ-0). Куры линии-0 Ист Лансинга не содержат никаких эндогенных вирусных локусов (еу), относящихся к АЬУ (Оип\\'|бб1е аиб Еагак, 1985, Ргос. Ыаб. Асаб. 8сг И8А. 82:5097-5101);
линия 22 кур белый леггорн Чарльз-Ривер (8РАГА8);
линии ЭЕ и РЕ11 из Национального института агрономических исследований (Поташе бе Мадпегаиб, Сюржер, Франция).
Таким образом, клетки, выделенные из птиц еу-0, не продуцируют репликационно-компетентных эндогенных частиц АЬУ-Е. Согласно предпочтительному воплощению птица представляет собой домашнюю курицу еу-0 (Са11н5 Са11н5 подвид ботекбсик), предпочтительно выбранную среди ЕЬЬ-0, линии 22, ПЕ и РЕ11. Обычно куры еу-0 все же содержат провирусную последовательность ЕАУ, но в такой степени, что инфекционные изоляты ЕАУ не идентифицированы. Следовательно, в настоящем изобретении предложен способ получения непрерывных диплоидных линий клеток кур, выбранных из эмбриональных стволовых клеток (ЭС) линий кур еу-0, где указанные линии клеток кур еу-0 не продуцируют репликационно-компетентные эндогенные ретровирусные частицы.
Согласно третьему воплощению птица по изобретению выбрана среди птиц, которые содержат полноразмерные и/или неполные провирусные последовательности АЬУ-Е и ЕАУ в их геноме, но которые не способны продуцировать репликационно-компетентные ретрочастицы АЬУ-Е и ЕАУ. Специалист в данной области техники способен определить, инфекционные и/или неинфекционные ретрочастицы АЬУ-Е и/или ЕАУ продуцируются клетками птиц (1о11п5оп апб Непете. 2001; ХУеГСтаБг е! а1., 1996). Предпочтительно птица выбрана из группы, содержащей кур, свободных от особых патогенов (8РЕ), предпочтительно из линии Уа1о. Примером линии клеток кур ЕВх® по изобретению является линия клеток ЕВу13.
В настоящем изобретении под термином эндогенная ретровирусная частица или эндогенная ретрочастица, термины, которые можно использовать без отличия, понимают ретровирусную частицу или ретровирус, кодируемый и/или экспрессируемый провирусными последовательностями АЬУ-Е или ЕАУ, присутствующими в некоторых геномах клеток птиц. Известно, что у птиц провирусные последовательности АЬУ-Е присутствуют в геноме домашней курицы (за исключением кур линии-0), банкивской
- 4 017964 джунглевой курицы и обыкновенного фазана. Известно, что у птиц провирусные последовательности ЕЛУ присутствуют у всех родов да11ик, которые включают домашнюю курицу, курицу линии-0, банкивскую джунглевую курицу, зеленую джунглевую курицу, серую джунглевую курицу, цейлонскую джунглевую курицу и родственные виды (см. Кекшск е! а1., 1990, 1. νίτοί., 64:4640-4653).
Под репликационно-компетентным подразумевают, что эндогенные ретровирусные частицы являются инфекционными, т.е. что такие ретровирусные частицы способны инфицировать клетки птиц по изобретению и реплицироваться в них.
Способ основания непрерывных диплоидных линий клеток птиц, названных ЕВх®, по изобретению включает две стадии:
(а) выделение, культивирование и размножение эмбриональных стволовых (ЭС) клеток из птиц, которые не содержат полноразмерных эндогенных провирусных последовательностей или их фрагмента, склонного к продуцированию репликационно-компетентных эндогенных ретровирусных частиц, более конкретно провирусных последовательностей ΕΑν и/или ΑΕν-Ε или их фрагмента, в полной культуральной среде, содержащей все факторы, дающие возможность их роста, и в присутствии фидерного слоя, а также с добавлением животной сыворотки; возможно, указанная полная культуральная среда может содержать добавки, такие как дополнительные аминокислоты (т.е. глутамин и т.п.), пируват натрия, бета-меркаптоэтанол, белковый гидролизат не животного происхождения (т.е. дрожжевой экстракт, растительные гидролизаты и т.п.);
(б) пассаж путем модификации культуральной среды, чтобы получить полное исключение указанных факторов, указанного фидерного слоя, указанной сыворотки и, возможно, указанных добавок, и дальнейшее получение прикрепленных или суспензионных линий клеток птиц, названных ЕВх®, которые не продуцируют репликационно-компетентные эндогенные ретровирусные частицы, способных к пролиферации в течение длительного периода времени, в базовой среде в отсутствие экзогенных факторов роста, фидерного слоя и животной сыворотки.
Модификация культуральной среды стадии б) способа основания клеточных линий ЕВх®, чтобы получить прогрессивное или полное исключение факторов роста, сыворотки и фидерного слоя, может быть произведена одновременно, последовательно или отдельно. Последовательность отнятия культуральной среды может быть выбрана среди:
фидерный слой/сыворотка/факторы роста; фидерный слой/факторы роста/сыворотка; сыворотка/факторы роста/фидерный слой; сыворотка/фидерный слой/факторы роста; факторы роста/сыворотка/фидерный слой; факторы роста/фидерный слой/сыворотка.
В предпочтительном воплощении последовательность отнятия составляет: факторы роста/фидерный слой/сыворотка.
В соответствии с предпочтительным воплощением эмбриональные стволовые клетки птиц согласно стадии а) изобретения собирают из птичьих эмбрионов в момент откладки яиц, т.е. когда яйцо отложено. Согласно 8еШет е! а1. (2006, 1. Арр1. Рои1!. Век., 15:219-228) откладка яиц соответствует приведенным ниже стадиям развития согласно классификации Еуа1-6баб1 (ЕУАЬ-СШАОГк скьМПсайоп: ЕУАЕ-С1ЕАИ1 апб КОСНАЫ, 1976, Етош с1еауаде !о рпшйтуе к1теаск Гогтабоп: а сотр1етеп!агу погта1 1аЫе апб а пе\у 1оок а! !йе йтк! 51адек оГ !йе беуе1оршеп! ш !йе сЫск. Сепета1 Могр1ю1оду Иеу. Вю1. 49:321-337):
мускусная утка: стадия VII, цесарка: стадия νΐΐ-νΐΐΐ, индюк: стадия νΐΐ-νΐΐΐ, пекинская утка: стадия νΐΐΐ, курица: стадия X, японский перепел: стадия Χΐ, гусь: стадия Χΐ.
Предпочтительно утиные эмбриональные стволовые (ЭС) клетки стадии а) получают путем диссоциации эмбриона(ов) примерно на стадии νΐΐΐ (откладка яиц) классификации Еуа1-Сйаб1, более предпочтительно примерно на стадии νΐΐ для мускусной утки и примерно на стадии νΐΐΐ для пекинской утки. Предпочтительно куриные эмбриональные стволовые (ЭС) клетки, предпочтительно от линии кур еу-0 стадии а) получают путем диссоциации эмбриона(ов) примерно на стадии X (откладка яиц) классификации Еуа1-Сйаб1. Альтернативно птичьи эмбриональные стволовые клетки в соответствии со стадией а) по изобретению собирают из эмбриона перед откладкой яйца. Основные ограничения, встречающиеся перед откладкой яйца, составляет тот факт, что яйцо приходится извлекать из кур хирургическим путем и что количество ЭС клеток на эмбрион менее важно. Кроме того, на очень ранних стадиях развития птичьего эмбриона ЭС клетки не очень хорошо индивидуализированы, что затрудняет культивирование ίπ уйто ЭС клеток. Специалист в данной области техники способен определить временную рамку перед откладкой
- 5 017964 яйца, которая дает возможность собирать птичьи ЭС клетки. Альтернативно птичьи эмбриональные стволовые клетки в соответствии со стадией а) по изобретению можно собирать из эмбриона птицы после откладки яйца вплоть до вылупления. Однако птичьи эмбриональные стволовые клетки прогрессивно вступят в дифференциацию с образованием дифференцированных тканей; однако предпочтительно собирать птичьи ЭС недолго после откладки яйца. Специалист в данной области техники способен определить временную рамку после откладки яйца, которая дает возможность собирать птичьи эмбриональные стволовые клетки.
Эти птичьи эмбриональные стволовые клетки характеризуются медленным временем удвоения, составляющим между 48 и 72 ч при культивировании при 39°С.
Не связываясь с теорией, определенные условия клеточной культуры птичьих ЭС клеток с последующим прогрессивным отнятием ростовых факторов, фидерного слоя и сыворотки дает возможность адаптировать и отобрать клетки, которые сохраняют большую часть желаемых признаков ЭС клеток (стабильность кариотипа, неопределенно долгую пролиферацию, экспрессию маркеров ЭС), но в дополнение проявляют промышленно благоприятные характеристики, такие как рост в суспензии вплоть до высоких плотностей клеток в среде, свободной от сыворотки. Теломераза составляет один из важнейших маркеров ЭС. Вследствие пролонгированной и поддерживаемой экспрессии теломеразы на протяжении пассажей клеток клетки ЕВх® являются непрерывными (т.е. бессмертными), но, кроме того, являются генетически стабильными (т.е. диплоидными).
В настоящем изобретении предложен способ получения непрерывных диплоидных клеточных линий птиц, выделенных из ЭС клеток (названных клеточными линиями ЕВх® или клетками ЕВх®), где указанные птичьи клеточные линии не продуцируют репликационно-компетентные эндогенные ретровирусные частицы, где указанный способ включает приведенные ниже стадии:
а) выделение эмбриона(ов) птицы, предпочтительно из утки или из курицы, предпочтительно курицы еу-0. на стадии развития, включающей стадии от примерно стадии VI классификации Еуа1-О11аб1 (ЕУЛЬ-СШЛОГх с1а881Дса1юи: ЕУАЕ-С1ЕАО1 аиб КОСНАЫ, 1976, Етош с1еауаде 1о рптШуе Цгеаск Гогтабоп: а сотр1етеи1ату погта1 1аЫе апб а пе\у 1оок а! 1йе ίίτδΐ йадез оГ 1йе беуе1ортеп1 ίη Не с1пск. Оеиега1 Могрйо1о§у Эеу. Вю1., 49:321-337) и до вылупления, предпочтительно около откладки яйца. Предпочтительно геном указанной птицы не содержит эндогенных провирусных последовательностей, склонных к продуцированию репликационно-компетентных эндогенных ретровирусных частиц;
б) суспендирование птичьих эмбриональных стволовых (ЭС) клеток, полученных путем диссоциации эмбриона(ов) стадии а) в базовой культуральной среде с добавлением:
инсулиноподобного фактора роста 1 (ИФР-1) и цилиарного нейротрофического фактора (ЦНТФ); животной сыворотки и возможно, факторов роста, выбранных из группы, содержащей интерлейкин 6 (1Ь-6), рецептор интерлейкина 6 (1Ь-6В), фактор стволовых клеток (ФСК) и фактор роста фибробластов (ФРФ);
в) высев суспензии ЭС клеток, полученных на стадии б), на слой фидерных клеток и дальнейшее культивирование ЭС клеток в течение по меньшей мере одного пассажа;
г) возможно, исключение всех факторов роста, выбранных из группы, содержащей 1Ь-6, 1Ь-6В, ФСК, ФРФ, из культуральной среды в течение ряда из нескольких пассажей от 1 до примерно 15 пассажей, и дальнейшее культивирование птичьих ЭС клеток в течение по меньшей мере одного пассажа. Предпочтительно исключение всех факторов роста, выбранных из группы, содержащей 1Ь-6, 1Ь-6В, ФСК, ФРФ, из культуральной среды осуществляют одновременно в течение одного пассажа. Обычно исключение 1Ь-6, 1Ь-6В, ФСК, ФРФ проводят примерно при пассаже от 10 до 15;
д) исключение ИФР-1 и ЦНТФ из культуральной среды и дальнейшее культивирование птичьих ЭС клеток в течение по меньшей мере одного пассажа. Предпочтительно исключение факторов роста, выбранных из группы, содержащей ИФР-1 и ЦНТФ, из культуральной среды осуществляют одновременно в течение одного пассажа. Обычно исключение ИФР-1 и ЦНТФ проводят примерно при пассаже от № 15 до № 25. Альтернативно исключение ИФР-1 и ЦНТФ проводят путем прогрессивного снижения в течение нескольких пассажей (по меньшей мере 2 пассажей и примерно вплоть до 15 пассажей);
е) прогрессивное снижение концентрации фидерных клеток в культуральной среде, чтобы получить полное исключение фидерного слоя после нескольких пассажей, и дальнейшее культивирование клеток;
ж) возможно, прогрессивное снижение концентрации добавок в культуральной среде, чтобы получить полное исключение добавок после по меньшей мере одного пассажа; и
з) возможно, прогрессивное снижение концентрации животной сыворотки в культуральной среде, чтобы получить полное исключение животной сыворотки после нескольких пассажей; и
и) получение прикрепленных линий клеток птиц, названных ЕВх®, выделенных из ЭС клеток, способных к пролиферации в базовой среде в отсутствие факторов роста, фидерного слоя, возможно, без животной сыворотки и добавок, и где указанные непрерывные диплоидные линии клеток птиц предпочтительно не продуцируют репликационно-компетентных эндогенных ретровирусных частиц;
к) возможно, дополнительная адаптация указанных прикрепленных линий клеток птиц ЕВх® к условиям суспензионной культуры;
- 6 017964
л) возможно, дополнительное субклонирование указанных клеток птиц ЕВх®, например, путем ограничительного разведения.
В предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к способу получения непрерывных диплоидных линий клеток птиц, названных ЕВх®, выделенных из птичьих эмбриональных стволовых клеток (ЭС), где указанные линии клеток птиц не продуцируют репликационно-компетентных эндогенных ретровирусных частиц, и указанный способ включает стадии:
а) выделение эмбриона(ов) птицы на стадии развития около откладки яйца, где геном указанной птицы не содержит эндогенных провирусных последовательностей, склонных к продуцированию репликационно-компетентных эндогенных ретровирусных частиц;
б) суспендирование птичьих эмбриональных стволовых (ЭС) клеток, полученных путем диссоциации эмбриона(ов) стадии а), в базовой культуральной среде с добавлением по меньшей мере:
инсулиноподобного фактора роста 1 (ИФР-1) и цилиарного нейротрофического фактора (ЦНТФ) и сыворотки млекопитающих, такой как фетальная бычья сыворотка;
в) высев суспензии ЭС клеток, полученных на стадии б), на слой фидерных клеток и дальнейшее культивирование ЭС клеток в течение по меньшей мере одного пассажа;
д) исключение ИФР-1 и ЦНТФ из культуральной среды и дальнейшее культивирование клеток в течение по меньшей мере одного пассажа;
е) прогрессивное снижение концентрации фидерных клеток в культуральной среде, чтобы получить полное исключение фидерного слоя после нескольких пассажей, и дальнейшее культивирование клеток;
з) прогрессивное снижение концентрации указанной сыворотки млекопитающих в культуральной среде, чтобы получить полное исключение сыворотки млекопитающих после нескольких пассажей; и
и) получение прикрепленных линий клеток птиц ЕВх®, выделенных из ЭС клеток, способных к пролиферации в базовой среде в отсутствие факторов роста, фидерного слоя и сыворотки млекопитающих, и где указанные непрерывные диплоидные линии клеток птиц предпочтительно не продуцируют репликационно-компетентные эндогенные ретровирусные частицы;
к) возможно, дополнительная адаптация прикрепленных линий клеток птиц ЕВх® к условиям суспензионной культуры, предпочтительно путем стимуляции роста в виде суспензии, более предпочтительно путем переноса прикрепленных линий клеток птиц ЕВх®, полученных на стадии з), на другую подложку, обладающую низкими характеристиками прикрепления, чем исходная подложка (т.е. такую, как подложка для прикрепления ЦЦга Ьо\\·).
Стадию к) адаптации прикрепленных линий клеток птиц ЕВх® к условиям суспензионной культуры, когда ее проводят, можно осуществлять в другом предпочтительном воплощении перед стадией ж) прогрессивного снижения концентрации сыворотки млекопитающих в культуральной среде.
В другом предпочтительном воплощении в базовую культуральную среду на стадии б) способа получения непрерывных диплоидных линий клеток птиц согласно настоящему изобретению дополнительно добавляют фактор роста, выбранный из группы, содержащей интерлейкин 6 (1Ь-6), рецептор интерлейкина 6 (1Ь-6В), фактор стволовых клеток (ФСК) и фактор роста фибробластов (ФРФ), и указанный способ дополнительно включает стадию г):
г) возможное исключение всех факторов роста, выбранных из группы, содержащей 1Ь-6, 1Ь-6К ФСК, ФРФ, из культуральной среды и дальнейшее культивирование ЭС клеток в течение по меньшей мере одного пассажа.
В более предпочтительном воплощении, когда проводят стадию г), стадию д) исключения ИФР-1 и ЦНТФ из культуральной среды осуществляют после стадии г) исключения всех факторов роста, выбранных из группы, содержащей 1Ь-6, 1Ь-6К, ФСК, ФРФ, из культуральной среды.
Согласно изобретению базовая культуральная среда означает культуральную среду с классическим составом среды, который сам по себе дает возможность, по меньшей мере, выживания клеток, и, даже лучше, роста клеток. Примерами базовой среды являются ВМЕ (базовая среда Игла), МЕМ (минимальная среда Игла), среда 199, ЭМЕМ (модифицированная Дульбекко среда Игла), 6МЕМ (модифицированная Глазго среда Игла), ПМЕМ-НатГ12, Нат-Е12 и Нат-Е10, среда дульбекко, модифицированная по способу Исков, среда Мак-Коя 5А, РРМ1 1640, 6ТМ3. Базовая среда содержит неорганические соли (например, СаС12, КС1, №1С1. ЫаНСО3, ЫаН2РО4, Мд§04 и т.п.), аминокислоты, витамины (тиамин, рибофлавин, фолиевую кислоту, Ό-Са пантотенат и т.п.) и другие компоненты, такие как глюкоза, бетамеркаптоэтанол, пируват натрия. Предпочтительно базовая среда представляет собой синтетическую среду.
Кроме того, базовая среда по изобретению может быть дополнена добавками, выбранными из приведенной ниже группы:
0,1-5 мМ Ь-глутамина, предпочтительно между 2 и 3 мМ Ь-глутамина;
0,05-2 мМ пирувата натрия, предпочтительно между 0,1 и 1 мМ пирувата натрия;
0,1-2,5% заменимых аминокислот, предпочтительно около 1% заменимых аминокислот;
0,05-5 мМ бета-меркаптоэтанола, предпочтительно около 0,16 мМ бета-меркаптоэтанола; белкового гидролизата не животного происхождения.
- 7 017964
Для основания утиных клеток ЕВх® по изобретению базовую среду предпочтительно дополняют белковым гидролизатом не животного происхождения. Белковый гидролизат не животного происхождения выбран из группы, состоящей из бактериального триптона, дрожжевого триптона, растительных гидролизатов, таких как соевые гидролизаты, или их смесей. В предпочтительном воплощении белковые гидролизаты не животного происхождения представляют собой дрожжевой гидролизат. Термин гидролизат включает продукт ферментативного переваривания соевого пептона или дрожжевого экстракта. Гидролизат может быть получен из множества препаратов соевого пептона или дрожжевого экстракта, соответственно, которые могут быть дополнительно ферментативно переварены (например, папаином) и/или образованы путем автолиза, термолиза и/или плазмолиза. Гидролизаты могут быть также получены коммерческим путем, такие как Уеа81о1а1е, Ну-8оу, Ну-Уеак! 412 и Н1-Уеа81 444, из таких источников, как 1ВН Вю8с1епсе5 (Ьеиаха, КА), Оие51 1п1етпа1юпа1 (Νοηνίοΐι. Ν.Υ.), ОтдапоТесйше 8.А. (Етаиее) или Иеи^сЬе НеГе\тегке СтЬН (Сеттапу). Источники дрожжевых экстрактов также раскрыты в АО 98/15614. Источники дрожжевых экстрактов и соевых гидролизатов также раскрыты в АО 00/03000. Гидролизаты, используемые в средах по изобретению, предпочтительно очищены из сырой фракции, поскольку примеси, которые могут препятствовать эффективному культивированию, предпочтительно элиминируют во время этой очистки, улучшая посредством этого консистенцию гидролизата. Очистку можно проводить путем ультрафильтрации или хроматографии на сефадексе (например, на 8ерйабех С25 или 8ерйабех С10 или эквивалентных материалах), ионообменной хроматографии, аффинной хроматографии, вытеснительной хроматографии или хроматографии с обращенной фазой. Предпочтительно очистку проводят путем ультрафильтрации, используя буфер с порогом отсечения 10 кДа. Эти методики известны в данной области техники. Используя эти способы, можно отобрать фракции, которые содержат соевый или дрожжевой гидролизат определенной молекулярной массы. Предпочтительно средние молекулярные массы соевого и дрожжевого гидролизатов предпочтительно составляют между примерно 220 и 375 Да. Предпочтительно дрожжевой гидролизат присутствует в среде для культивирования клеток. Дрожжевой гидролизат 50Х (примерно 200 г/л), полученный, например, от ΙΚΠ-ΒΙΟδΟΙΕΝΟΕδ (ВеГ 58902), присутствует в среде для культивирования клеток при конечной концентрации, составляющей между примерно 0,1Х и 2Х, предпочтительно от примерно 0,5Х до примерно 1Х в культуральной среде. Соевый гидролизат можно также добавлять в среду для культивирования клеток. Соевый гидролизат 50Х, полученный, например, от ^ВН-ΒIΟδСIΕNСΕδ (ВеГ 58903100М), добавляют при конечной концентрации, составляющей между примерно 0,1Х и 2Х, предпочтительно примерно 1Х, в культуральную среду. Альтернативно смесь соевого гидролизата и дрожжевого гидролизата можно добавлять в среду для культивирования клеток, как описано в И8 2004/0077086.
Согласно предпочтительному воплощению базовая среда по изобретению представляет собой ПМЕМ-НатЕ12, которая дополнена 2 мМ Ь-глутамином, 1 мМ пируватом натрия, 1% заменимыми аминокислотами, 0,16 мМ бета-меркаптоэтанолом и возможно 1Х дрожжевым гидролизатом.
Под полной культуральной средой подразумевают базовую культуральную среду, дополненную или нет, предпочтительно базовую синтетическую среду с добавлением по меньшей мере одного фактора роста и животной сыворотки, пример полной культуральной среды описан в АО 03/076601, АО 05/007840, ЕР 787180, И8 6114168, И8 5340740, И8 6656479, И8 5830510 и в Раш е! а1. (1996, Эеуе1ортеп1 122: 2339-2348). Альтернативно полная культуральная среда может представлять собой кондиционированную среду, предпочтительно ВВЕ кондиционированную среду. Например, ВВЬ кондиционированную среду готовят в соответствии с методиками, признанными в данной области техники, такими как описаны διηίΐΐι апб Ноорег (1987, Эеу. Вю1. 121:1-9). Клетки ВВЬ доступны из АТСС, номер по каталогу СВЬ-1442. В кондиционированную среду могут быть добавлены экзогенные факторы роста и животная сыворотка, как описано ниже.
Термин факторы роста, как используют здесь, означает фактор роста, необходимый для выживания и роста недифференцированных птичьих ЭС клеток в культуре в базовой культуральной среде. Можно схематически разделить два семейства факторов роста: цитокины и трофические факторы. Цитокины представляют собой, главным образом, цитокины, действие которых опосредовано рецептором, который связан с белком др130. Так, фактор, ингибирующий лейкоз (Ь1Е), интерлейкин 11, интерлейкин 6, рецептор интерлейкина 6, цилиарный нейротрофический фактор (ЦНТФ), онкостатин и кардиотрофин имеют сходный способ действия с рекрутментом на уровне рецептора специфичной цепи и объединение последней с белком др130 в мономерной или иногда в гетеродимерной форме. Трофическими факторами являются, в основном, фактор стволовых клеток (ФСК), инсулиноподобный фактор роста 1 (ИФР-1) и фактор роста фибробластов (ФРФ), предпочтительно основной ФРФ (оФРФ) или человеческий ФРФ (чФРФ).
Полная культуральная среда согласно изобретению содержит базовую культуральную среду, предпочтительно базовую синтетическую среду, и по меньшей мере один цитокин, действие которого опосредовано рецептором, который связан с белком др130, и/или по меньшей мере один трофический фактор. Предпочтительно полная культуральная среда согласно изобретению содержит базовую культуральную среду и по меньшей мере один фактор роста, выбранный из группы, состоящей из фактора, ингибирующего лейкоз (Ь1Е), онкостатина, кардиотрофина, инсулиноподобного фактора роста 1 (ИФР-1), цили
- 8 017964 арного нейротрофического фактора (ЦНТФ), интерлейкина 6 (1Ь-6), рецептора интерлейкина 6 (Ш-6Н). фактора стволовых клеток (ФСК), фактора роста фибробластов (ФРФ), интерлейкина 11 (Ш-11). Согласно первому предпочтительному воплощению полная культуральная среда представляет собой базовую среду с добавлением животной сыворотки и по меньшей мере ИФР-1 и ЦНТФ. Согласно второму предпочтительному воплощению полная культуральная среда представляет собой базовую среду с добавлением животной сыворотки и по меньшей мере ИФР-1, ЦНТФ, 1Ь-6 и Ш--6Ш Согласно третьему предпочтительному воплощению полная культуральная среда представляет собой базовую среду с добавлением животной сыворотки и, по меньшей мере, ИФР-1, ЦНТФ, 1Ь-6, 1Б-6К ФСК, ФРФ. Согласно другому воплощению полная культуральная среда представляет собой кондиционированную культуральную среду, содержащую факторы роста (т.е., например, экспрессируемые клетками ВКК или 8ΤΘ) и, возможно, с добавлением по меньшей мере одного экзогенного фактора роста, выбранного из группы, содержащей ЫБ, ИФР-1, ЦНТФ, 1Ь-6, 1Ь-6К, ФСК, ФРФ, 1Б-11. Концентрация факторов роста ИФР-1, ЦНТФ, 1Ь-6, 1Б-6К ФСК, ФРФ, Ш-11 в базовой среде или в кондиционированной культуральной среде составляет между примерно 0,01 и 10 нг/мл, предпочтительно от 0,1 до 5 нг/мл и более предпочтительно примерно 1 нг/мл.
Культуральная среда по изобретению может также содержать в дополнение антибиотики, такие как, например, гентамицин, пенициллин и стрептомицин, для предотвращения бактериального заражения. Антибиотики можно добавлять в культуральную среду при ранних пассажах культуры ЭС клеток. Например, в культуральную среду можно добавлять гентамицин при конечной концентрации 10 нг/мл, пенициллин при конечной концентрации 100 ед./мл и стрептомицин при конечной концентрации 100 мкг/мл. В предпочтительном воплощении антибиотики не добавляют в культуральную среду во время поздних стадий способа основания непрерывных диплоидных линий клеток птиц по изобретению.
Во время процесса основания птичьих эмбриональных стволовых клеток по изобретению эти клетки культивируют на слое фидерных клеток. Более предпочтительно фидерные клетки представляют собой животные клетки или клеточные линии, культивируемые с целью культивирования птичьих ЭС клеток. Альтернативно фидерные клетки можно заменить внеклеточным матриксом со связанными факторами роста. Фидерный матрикс здесь далее относят либо к фидерным клеткам, либо к внеклеточному матриксу. Фидерный матрикс, как используют здесь, конструируют в соответствии с методиками, известными в данной области техники. Как отмечено выше, предпочтительно, чтобы фидерный матрикс был предварительно кондиционирован. Под термином предварительно кондиционирован подразумевают, что фидерный матрикс культивируют в присутствии среды в течение периода времени перед депонированием клеток, имеющих происхождение из диска бластодермы оплодотворенных птичьих яиц, в контакте с фидерным матриксом, например, периода времени, достаточного для инициации и установления продуцирования фидерным матриксом, например, факторов роста или других факторов; обычно фидерный матрикс предварительно кондиционируют путем культивирования самого фидерного матрикса в течение одних-двух суток перед депонированием клеток, имеющих происхождение из диска бластодермы оплодотворенных птичьих яиц, в контакте с фидерным матриксом. Фидерные клетки предпочтительно включают фибробласты мыши. Предпочтительны фибробласты 8ΤΘ, но первичные фибробласты также пригодны. Также, хотя настоящее изобретение описано в отношении использования фидерных матриксов из мышиных клеток, рассматривают, что можно также использовать фидерные матриксы, содержащие клетки от других видов грызунов (например, крыс); других видов млекопитающих (например, видов копытных животных, крупного рогатого скота, свиней); или видов птиц (например, СаШиасеа, куры, индюка, утки, гуся, перепела, фазана). В другом воплощении фидерные клетки по изобретению могут быть трансфицированы экспрессионным вектором(ами), дающим возможность, например, конститутивной экспрессии факторов роста, таких как птичий ФСК, в клетках 8ΤΘ. Таким образом, этот фидер продуцирует фактор в форме, которая является растворимой и/или прикрепленной к плазматической мембране клеток. Таким образом, способ культивирования по настоящему изобретению может, возможно, включать основание монослоя фидерных клеток. Фидерные клетки подвергают митотической инактивации, используя стандартные методики. Например, фидерные клетки можно подвергнуть воздействию рентгеновского или гамма-излучения (например, 4000 рад гамма-излучения) либо можно обработать митомицином С (например, 10 мкг/мл в течение 2-3 ч). Методики митотической инактивации клеток также подробно описаны в информации, обычно посылаемой вместе с клетками из Американской коллекции типовых культур (АТСС), 10801 Ишуегкйу Вои1еуагб, Мапаккак, Уа. 20110-2209 (например, фидерные клетки 8ΤΘ доступны под номером по каталогу АТСС 1503). Монослои можно, возможно, культивировать до 80% конфлюэнтности, предпочтительно до примерно 90% конфлюэнтности и более предпочтительно до примерно 100% конфлюэнтности. Хотя конфигурация фидерных клеток в виде монослоя является предпочтительной конфигурацией для культуры, любую подходящую конфигурацию рассматривают как находящуюся в пределах объема настоящего изобретения. Так, например, слои, монослои, кластеры, агрегаты или другие ассоциации или группировки фидерных клеток рассматривают как входящие в объем настоящего изобретения и, в частности, рассматривают как входящие в значение термина матрикс.
- 9 017964
В культуральную среду по изобретению добавляют животную сыворотку. Предпочтительно используемой животной сывороткой является фетальная животная сыворотка. Предпочтительна фетальная бычья сыворотка. Хотя настоящее изобретение описано в отношении использования фетальной бычьей сыворотки, однако рассматривают, что можно также использовать животную сыворотку, включающую сыворотку от других видов животных (например, кур, лошадей, свиней, копытных и т.д.). Конечная концентрация животной сыворотки в культуральной среде составляет между примерно 1 и 25%, предпочтительно между 5 и 20%, более предпочтительно между 8 и 12%. В предпочтительном воплощении конечная концентрация животной сыворотки в культуральной среде составляет примерно 10%. Согласно предпочтительному воплощению культуральная среда содержит примерно 10% фетальной сыворотки теленка.
Настоящее изобретение также относится к непрерывным диплоидным линиям клеток птиц ЕВх®. Клетки ЕВх® представляют собой маленькие округлые (т.е. диаметром примерно 10 мкм) индивидуализированные клетки с временем удвоения примерно 30 ч или менее при 37 или 39°С. Птичьи клетки ЕВх®, предпочтительно утиные ЕВх® или куриные ЕВх® еу-0, экспрессируют фенотип эмбриональных стволовых клеток с приведенными ниже характеристиками:
высокое ядерно-цитоплазматическое отношение, эндогенная теломеразная активность, возможно, они могут экспрессировать один или более чем один дополнительный ЭС маркер, такой как маркеры щелочная фосфатаза, 88ЕА-1, ЕМА-1, ЕЫ81, время удвоения короче, чем время удвоения птичьих ЭС клеток стадии а) способа по изобретению (от 48 ч до 72 ч при 39°С), примерно 30 ч или менее (предпочтительно 24 ч) при 37°С.
Указанные клетки ЕВх® предпочтительно не продуцируют репликационно-компетентные эндогенные ретровирусные частицы. Линии клеток птиц ЕВх® по изобретению способны к неопределенно долгой пролиферации в базовой среде, в частности, такой как среда 8АЕС Ехсе11, ЭМЕМ. СМЕМ, ЭМЕМНашЕ12 или МсСоу, свободной от экзогенных факторов роста, сыворотки и/или инактивированного фидерного слоя, возможно, дополненной различными добавками, обычно используемыми специалистами в данной области техники. Примерами добавок являются заменимые аминокислоты, витамины, пируват натрия и антибиотики. Утиные клетки ЕВх® по изобретению обладают примечательным признаком роста в базовой культуральной среде, которая не дополнена глутамином.
Кариотипирование птичьих клеток ЕВх® по изобретению показало, что клетки ЕВх® являются диплоидными и генетически стабильными на протяжении поколений.
В настоящем изобретении предложены птичьи клетки ЕВх®, предпочтительно куриные клетки ЕВх® или утиные клетки ЕВх®, трансфицированные по меньшей мере одним экспрессионным вектором, включающим по меньшей мере одну экспрессионную кассету, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты, предпочтительно дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), кодирующую интересующий рекомбинантный белок или полипептид, оперативно сцепленную с промоторной последовательностью, способной осуществлять экспрессию указанного белка в клетке. Экспрессионный вектор дополнительно включает по меньшей мере одну экспрессионную кассету, содержащую, по меньшей мере, последовательность ДНК, кодирующую селективный маркер, оперативно сцепленную с промоторной последовательностью, способной осуществлять экспрессию указанного селективного маркера в клеткехозяине.
Экспрессионные векторы содержат необходимые элементы для транскрипции и трансляции по меньшей мере одной интересующей кодирующей последовательности. Способы, которые хорошо известны и практикуются специалистами в данной области техники, можно использовать для конструирования экспрессионных векторов, содержащих последовательности, кодирующие интересующие белки и полипептиды, а также соответствующие транскрипционные и трансляционные регуляторные элементы. Эти способы включают методики рекомбинантных ДНК ίη νίίτο, методики синтеза и генетическую рекомбинацию ίη νίνο. Такие методики описаны, например, в 8ашЬгоок е1 а1. (1989, Мо1еси1аг С1ошпд, А ЬаЬогакгу Мапиа1, Со1б 8рппд НагЬог Рге§8, Р1а1пу1е^, Ν.Υ.) и в Аи8иЬе1 е1 а1. (1989, Сиггей Ргоксок ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Ло1т \УПеу & 8оп§, Νον Υο^к, Ν.Υ.).
Пригодные экспрессионные векторы включают по меньшей мере одну экспрессионную кассету, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, предпочтительно последовательность ДНК, кодирующую интересующий гетерологичный белок (белки), которая оперативно сцеплена с регуляторным элементом и регуляторными последовательностями. По меньшей мере, экспрессионная кассета содержит последовательность нуклеиновой кислоты, предпочтительно последовательность ДНК, кодирующую интересующий гетерологичный белок (белки), которая оперативно сцеплена с промоторной последовательностью. Промотор, как используют здесь, относится к нуклеиново-кислотной последовательности, которая регулирует экспрессию гена. Термин оперативно сцеплен, как используют здесь, относится к такой конфигурации кодирующих и регуляторных последовательностей, например, внутри экспрессионного вектора, чтобы достичь транскрипции и/или экспрессии кодирующей последовательности. Так, регуляторные последовательности, оперативно сцепленные с кодирующей последовательно
- 10 017964 стью, способны осуществлять экспрессию кодирующей последовательности и регулировать, в каких тканях, в какие временные точки в развитии или в ответ на какие сигналы и т.п., экспрессируется ген. Кодирующая последовательность оперативно сцеплена с транскрипционными регуляторными областями или находится под их контролем в клетке, когда ДНК полимераза должна связываться с кодирующей последовательностью и транскрибировать эту кодирующую последовательность в мРНК, которая может транслироваться в кодируемый белок. Регуляторные последовательности не обязательно должны находиться по соседству с кодирующей последовательностью, если они функционируют, чтобы направлять ее экспрессию. Так, например, промежуточные нетранслируемые или нетранскрибируемые последовательности могут присутствовать между промоторной последовательностью и кодирующей последовательностью, и промоторную последовательность можно все же считать оперативно сцепленной с кодирующей последовательностью. Такие промежуточные последовательности включают, но не ограничены ими, энхансерные последовательности, которые не транскрибируются или не связываются полимеразой. Термин экспрессируемый или экспрессия, как используют здесь, относится к транскрипции нуклеотидной последовательности в молекулу нуклеиновой кислоты РНК, по меньшей мере, частично комплементарную области одной из двух нитей нуклеиновой кислоты кодирующей последовательности гена и/или к трансляции молекулы нуклеиновой кислоты РНК в белок или полипептид.
Такая экспрессионная кассета дополнительно содержит регуляторные элементы или регуляторные последовательности, которые представляют собой те нетранслируемые области кассеты, кроме промоторов (например, 5'- и 3'-нетранслируемые области), которые взаимодействуют с клеточными белками хозяина для осуществления транскрипции и трансляции. Как используют здесь, термин регуляторный элемент и регуляторные последовательности включают промоторы, энхансеры и другие элементы, которые могут регулировать экспрессию гена. Стандартные учебники по молекулярной биологии, такие как 8атЬтоок с1 а1. Ебк. Мо1еси1аг С1оп1ид: А ЬаЬогаЮгу Мапиа1 3'1 сТ. СоИ 8рттд НагЬот Ргекк (2001), можно использовать для консультации по конструированию пригодных экспрессионных векторов, которые могут дополнительно включать точку начала репликации (ТНР) и селективные маркерные гены. Такие элементы могут варьировать по своей силе и специфичности. В зависимости от векторной системы можно использовать любое число пригодных транскрипционных и трансляционных элементов, включая конститутивные и индуцибельные промоторы.
Должно быть понятно, однако, что выбор пригодного экспрессионного вектора и комбинация функциональных элементов в нем зависят от множественных факторов, включая, например, тип белка, который нужно экспрессировать. Репрезентативные примеры экспрессионных векторов включают, например, бактериальные плазмидные векторы, включая экспрессионные и клонирующие векторы, такие как, но не ограниченные ими, рВК.322, вирусные векторы животных, такие как, но не ограниченные ими, модифицированный птичий аденовирус, вирус кори, вирус гриппа, полиовирус, поксвирус, ретровирус и т.п., и векторы, образованные из нуклеиновой кислоты бактериофага, например плазмиды и космиды, искусственные хромосомы, такие как, но не ограниченные ими, дрожжевые искусственные хромосомы (УАС) и бактериальные искусственные хромосомы (ВАС), и синтетические олигонуклеотиды, подобные химически синтезированным ДНК или РНК. Соответственно, термин нуклеиново-кислотный вектор или вектор, как используют здесь, относится к природной или синтетической однонитевой или двунитевой плазмидной или вирусной молекуле нуклеиновой кислоты или к любой другой молекуле нуклеиновой кислоты, которую можно трансфицировать или трансформировать в клетки и реплицировать независимо от генома или внутри генома клетки-хозяина. Нуклеиновая кислота может быть встроена в вектор путем разрезания вектора ферментами рестрикции и лигирования участков вместе. Молекула нуклеиновой кислоты может представлять собой РНК или ДНК. Предпочтительно молекула нуклеиновой кислоты представляет собой ДНК. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клеткехозяине, в которую их вводят, например бактериальные векторы, имеющие бактериальную точку начала репликации, и эписомные векторы млекопитающих. Другие векторы, такие как не эписомные векторы млекопитающих, интегрируют в геном клетки-хозяина при введении в клетку-хозяина, и, следовательно, реплицируется параллельно с геномом хозяина.
Экспрессионная кассета для применения в системе экспрессии белка сконструирована таким образом, что содержит по меньшей мере одну последовательность ДНК, кодирующую интересующий рекомбинантный белок, оперативно сцепленную с промоторной последовательностью, и, возможно, регуляторный элемент(ы) или регуляторную последовательность(и). Регуляторный элемент или регуляторные последовательности необходимы или требуются для правильной транскрипции и регуляции экспрессии гена. Эти последовательности предпочтительно выбраны из группы, состоящей из последовательностей транскрипционной инициации и терминации, энхансера, интрона, сайтов точки начала репликации, последовательностей полиаденилирования, пептидного сигнала и элементов изоляторов хроматина. Регуляторные последовательности описаны, например, в Соеббе1; Сепе Ехртеккюп Тес6по1оду: МеГйобк ίη Еп/уто1оду 185, Асабешю Ргекк, 8ап П1едо, СайГ. (1990). Энхансерные последовательности могут быть локализованы выше или ниже по ходу трансляции последовательностей промоторной области для оптимизации экспрессии гена. Энхансер представляет собой нуклеотидную последовательность, которая действует с потенцированием транскрипции генов независимо от идентичности гена, положения после
- 11 017964 довательности по отношению к гену или ориентации последовательности. Векторы по настоящему изобретению возможно включают энхансеры. Примерами энхансеров являются немедленно-ранний энхансер СМУ и ранний энхансер 8У40.
Интронная последовательность может быть локализована выше или ниже по ходу трансляции последовательности, кодирующей интересующий рекомбинантный белок, для оптимизации экспрессии гена. Согласно предпочтительному воплощению интронная последовательность локализована между промоторной последовательностью и последовательностью, кодирующей интересующий рекомбинантный белок. Интронная последовательность по изобретению предпочтительно выбрана из группы, состоящей из химерного интрона, состоящего из 5'-донорного сайта из первого интрона человеческого гена бета-глобина и ветви и 3'-акцепторного сайта из интрона гена вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина.
Промоторные последовательности по изобретению предпочтительно выбраны из генов происхождения из млекопитающих или птиц или из вирусных генов млекопитающих или птиц. В предпочтительном воплощении промоторная последовательность имеет вирусное происхождение и выбрана из группы, состоящей из промотора человеческого или мышиного цитомегаловируса (СМУ), промотора вируса саркомы птиц (Α8ν)χΒΝ, раннего и позднего промоторов из вируса обезьян 40 (8У40) (Είετκ εΐ а1. (1973), ΝηΙιίΓΟ. 273:113), промотора вируса саркомы Рауса (Я8У). промотора тимидинкиназы вируса простого герпеса (Н8У), промотора респираторно-синцитиального вируса, промотора МООТ, промотора вируса полиомы, промотора аденовируса 2, промотора вируса бычьей папилломы, основного позднего промотора аденовируса и функциональных участков каждого из этих промоторов. Согласно другому воплощению промоторная последовательность выбрана из группы, состоящей из мышиного промотора фосфоглицераткиназы, вируса лейкемии мышей (МЬУ), вируса опухоли молочной железы мышей (ММТУ), промотора Е1Р4-альфа, химерного промотора ЕР1альфа/НТЬУ, химерного промотора САС (составного промотора, который объединяет немедленно-ранний энхансер человеческого СМУ и модифицированный промотор и первый интрон куриного бета-актина) и промоторов птичьих генов и функциональных участков каждого из этих промоторов. Среди промоторов птичьих генов промотор предпочтительно выбран среди куриных промоторов, таких как промотор бета-актина, промотор, специфичный для яйцевода, промотор овомукоида, промотор овальбумина, промотор кональбумина, промотор овомуцина, промотор овотрансферина, промотор лизоцима, промотор гена ΕΝ81 и функциональные участки каждого из этих промоторов.
Согласно другому воплощению промоторы могут быть выбраны среди регулируемых промоторов, таких промоторов, которые придают индуцибельность конкретными соединениями или молекулами, например, глюкокортикоид-отвечающий элемент (ОКЕ) вируса опухоли молочной железы мышей (ММТУ) индуцируется глюкокортикоидами (СНапсПсг εΐ а1. (1983), Сей, 33: 489-499). Также можно использовать тканеспецифические промоторы или регуляторные элементы (8\\ίΓΐ εΐ а1. (1984), Сей, 38: 639-646), если необходимо или желательно. Неограничивающие примеры других промоторов, которые могут быть полезны в настоящем изобретении, включают без ограничения промоторы ΡοΙΙΙΙ (например, промоторы ΡοΙΙΙΙ типа 1, типа 2 и типа 3), такие как промоторы ΗΙ, промоторы иб, промоторы тРНК, промоторы РНКазы МРВ и функциональные участки каждого из этих промоторов. Типично функциональные терминаторные последовательности выбраны для использования в настоящем изобретении в соответствии с используемым промотором.
Экспрессионный вектор по изобретению может дополнительно включать по меньшей мере одну экспрессионную кассету, содержащую, по меньшей мере, последовательность нуклеиновой кислоты, предпочтительно последовательность ДНК, кодирующую селективный маркер, оперативно сцепленную с промоторной последовательностью, способной осуществлять экспрессию указанного селективного маркера в клетке. Такой селективный маркер может придавать устойчивость клетке ЕВх®, несущей вектор, чтобы дать возможность ее селекции в соответствующей селективной среде. Для способов по данному изобретению стабильная экспрессия, как правило, предпочтительна по сравнению с транзитной экспрессией, поскольку при ней достигают более воспроизводимых результатов, и она также более приспособлена к широкомасштабному производству. Соответственно, экспрессионные векторы по изобретению стабильно включаются в хромосомную ДНК клетки ЕВх®. После введения чужеродной ДНК сконструированным клеткам может быть дана возможность расти в течение 1-2 суток в обогащенной среде, а затем их переводят на селективную среду. Селективный маркер в рекомбинантном векторе придает устойчивость к селекции и дает возможность селекции клеток, которые имеют стабильно интегрированный вектор в их хромосомах, и выращивают их до образования очагов, которые, в свою очередь, можно клонировать и размножать до клеточных линий.
В предпочтительном воплощении используют устойчивость к антиметаболитам как основу селекции для приведенных ниже не ограничивающих примеров маркерных генов: ϋΗΕΒ, который придает устойчивость к метотрексату (\Ущ1сг εΐ а1. (1980), Ртос. Май. Асас1. δει. И8А, 77:357 и О'Нате εΐ а1. (1981), Ртос. Νηΐΐ. Асай. δει. И8А, 78:1527); ОРТ, который придает устойчивость к микофеноловой кислоте (Ми1Ндаи аий Вегд (1981), Ртос. N<111. Асас1. δει. И8А, 78:2072); неомицин (ΝΕΟ), который придает устойчи
-12017964 вость к аминогликозиду 6418 (\Уи апб \Уи (1991), ВюГйетару, 3:87-95; Τοίδίοδίιον (1993), Апп. Ксу. Рйаттасо1. Τοχίοοί., 32:573-596; МиШдап (1993), 8с1епсе, 260: 926-932; Апбегкоп (1993) Апп. Кеу. Вюсйет., 62:191-21); и гигромицин В, который придает устойчивость к гигромицину (8апГетге е1 а1. (1984), 6епе, 30:147) и пуромицин. В наиболее предпочтительном воплощении гены устойчивости к антибиотикам используют как основу селекции. Согласно предпочтительному воплощению селективный маркер по изобретению представляет собой ген устойчивости к неомицину. Предпочтительно нуклеиновокислотная последовательность, кодирующая ΝΕΟ, представляет собой ген устойчивости к неомицину/канамицину ΤΝ5. Согласно другому предпочтительному воплощению селективный маркер по изобретению представляет собой ген устойчивости к канамицину. Согласно другому предпочтительному воплощению селективный маркер по изобретению представляет собой ген устойчивости к пуромицину.
Альтернативно такие селекционные системы требуют, чтобы клетки ЕВх® по изобретению были предварительно генетически модифицированы, чтобы проявлять соответствующий генотип (т.е. ΤΚ-, Н6РКГ-, ΛΡΤ-. ΌΗΕΚ-, 6ΡΤ- и т.д.). Можно использовать ряд селекционных систем, включая, но не ограничиваясь ими, гены тимидинкиназы вируса простого герпеса (Н8У ΤΚ) (^1д1ет е1 а1. (1977), Се11. 11: 223), гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы (Η6ΡΒΤ) (8хуЬа18ка & 8хуЬа1<к1 (1992), Ргос. №И. Асаб. 8ск И8А, 48: 202) и аденинфосфорибозилтрансферазы (Ьо^у е1 а1. 1980, Се11. 22: 817), которые можно использовать в клетках 1к-, НдрП- или атГ- (АРИЛ) соответственно. Способы, общеизвестные в данной области техники, технологии рекомбинантных ДНК можно рутинно применять для селекции желаемых рекомбинантных клеточных клонов, и такие способы описаны, например, в Аи8иЬе1 е1 а1. (1993) и Кпед1е (1990, 6епе ^атаГет апб Ехртеккюп А ЬаЬотаГоту Мапиа1, 81оск1оп Ргекк, ΝΥ; ΐπ СйарГетк 12 апб 13).
Кроме того, уровни экспрессии экспрессируемой белковой молекулы можно повысить за счет амплификации вектора (обзор см. в ВеЬЬтдГоп & НепГ8сйе1, Пю икс о! уесГотк Ьакеб оп депе атрййсаГюп Гог Гйе ехртеккюп о! с1опеб депек т таттайап се11к т ^NΛ с1ошпд, Уо1. 3, Асабетк Ргекк, №\\-Уогк 1987). Когда маркер в векторной системе, экспрессирующей белок, является амплифицируемым, повышение уровня ингибитора, присутствующего в культуре клеток-хозяев, должно повысить число копий маркерного гена. Поскольку амплифицируемая область связана с геном, кодирующим белок, продуцирование белка одновременно повысится (Сгоике еГ а1. (1983), Мо1. Се11. Вю1., 3: 257). Векторы, которые несут нуклеиновую кислоту, кодирующую глутаминсинтазу (68) или дигидрофолатредуктазу (ΌΗΕΚ) в качестве селективных маркеров, можно амплифицировать в присутствии лекарств метионина сульфоксимина или метотрексата соответственно. Глутаминсинтазная экспрессионная система и ее компоненты подробно описаны в публикациях РСТ: \УО 87/04462; \УО 86/05807; \УО 89/01036; \УО 89/10404 и \УО 91/06657. Кроме того, глутаминсинтазные экспрессионные векторы, которые можно использовать в соответствии с настоящим изобретением, имеются в продаже от поставщиков, включая, например, йоп/а Вю1од1е8, 1пс. (РойктоиГй, ΝΗ).
Клетки-хозяева, которые содержат кодирующую последовательность и которые экспрессируют биологически активные генные продукты (т.е. интересующий белок, селективный маркер и т.п.), можно идентифицировать с помощью по меньшей мере четырех общих подходов; (а) ДНК-ДНК или ДНК-РНК гибридизации; (б) присутствия или отсутствия функций маркерного гена; (в) оценки уровня транскрипции, который измеряют по экспрессии соответствующих мРНК транскриптов в клетке ЕВх®, и (г) обнаружения генного продукта, который измеряют с помощью иммунологического анализа или по его биологической активности. При первом подходе присутствие кодирующей последовательности интересующего белка, встроенной в экспрессионный вектор, можно обнаружить с помощью ДНК-ДНК или ДНК-РНК гибридизации, используя зонды, содержащие нуклеотидные последовательности, которые гомологичны соответствующим кодирующим последовательностям, соответственно, либо их участкам или производным. При втором подходе система рекомбинантный экспрессионный вектор/хозяин может быть идентифицирована и отобрана на основании присутствия или отсутствия определенных функций маркерного гена (например, активности тимидинкиназы, устойчивости к антибиотикам, устойчивости к метотрексату и т.д.).
Один или оба из векторов по изобретению могут содержать по меньшей мере одну точку начала репликации, чтобы дать возможность репликации векторных конструкций внутри клеток-хозяев. Согласно предпочтительному воплощению векторы по изобретению содержат одну бактериальную точку начала репликации, такую как Е1 ОК1, чтобы дать возможность репликации экспрессионного вектора в бактериях (например, в Е.сой) и точку начала репликации 8У40, чтобы дать возможность проверки экспрессионного вектора путем быстрого транзитного анализа.
Экспрессионный вектор по изобретению может дополнительно содержать хроматиновые изолирующие элементы. Хроматиновые изолирующие элементы по изобретению включают элементы границы (ВЕ), участки прикрепления к матриксу (МАК), участки локусного контроля (ЬСК) и универсальные элементы, открывающие хроматин (ИСОЕ). Элементы границы (ВЕ) или изолирующие элементы во многих случаях определяют границы в хроматине (Ве11 & Ее18епГе1б (1999), Сигг. Орт. 6епеГ. Эсу. 9:191198) и могут играть роль в определении транскрипционного домена 1п у1уо. У ВЕ отсутствует собствен
- 13 017964 ная промоторная/энхансерная активность, но считают, что, вероятнее, они защищают гены от транскрипционного влияния регуляторных элементов в окружающем хроматине. Анализ блокирования энхансера обычно используют для идентификации изолирующих элементов. В данном анализе хроматиновый элемент помещают между энхансером и промотором и измеряют транскрипцию, активируемую энхансером. Показано, что элементы границы способны защищать стабильно трансфицированные репортерные гены против эффектов положения у дрозофилы, дрожжей и в клетках млекопитающих (\Уа11ег8 е1 а1. (1999), Мо1. Се11. Вю1. 19:3714-3726). Участки прикрепления к матриксу (МАК; также известные как участки прикрепления к каркасу или участки прикрепления к каркасу/матриксу (8/МАК)) представляют собой последовательности ДНК, которые связывают изолированные ядерные каркасы или ядерные матриксы ίη νίΐτο с высоким сродством (Най аиб Ьаешшй (1998), Сигг. Ορίη. Сенек Эеу. 8:519-525). Как таковые, они могут определять границы независимых хроматиновых доменов, так что только охваченные ими цисрегуляторные элементы регулируют экспрессию генов внутри домена. Элементы МАК могут усиливать экспрессию гетерологичных генов в культивируемых клеточных линиях (Ка1оз апб Еоигшег (1995), Мо1. Се11. Вю1. 15:198-207)). Участки локусного контроля (ЬСК) представляют собой цис-регуляторные элементы, требуемые для исходной активации хроматина локуса и последующей транскрипции гена в их нативных локализациях (обзор в 6го5те1б, 1999, Сигг. Ορίη. Сеηеΐ. Эеу. 9:152-157). Наиболее широко охарактеризованные ЬСК представляют собой ЬСК глобинового локуса. Универсальные элементы, открывающие хроматин (ИСОЕ, также известные как универсально действующие элементы, открывающие хроматин), недавно описаны (см. \УО 00/05393). Согласно предпочтительному воплощению хроматиновый изолирующий элемент по изобретению представляет собой элемент МАК. Предпочтительно элемент МАК выбран среди 5'-МАК элементов куриного лизоцима, как описано в \УО 02/074969, или человеческие элементы МАК, как описано в \УО 2005/040377.
Как должно быть понятно специалистам в данной области техники, выбор подходящего вектора, например, плазмиды, компонентов для правильной транскрипции, экспрессии (промотора, контролирующих последовательностей и регуляторных последовательностей) и выделение белков, продуцируемых в клеточных экспрессионных системах, известны и рутинно определены и практикуются специалистами в данной области техники.
Согласно одному воплощению клетки ЕВх® по изобретению трансфицируют по меньшей мере одним экспрессионным вектором, где указанный экспрессионный вектор содержит по меньшей мере:
первую экспрессионную кассету, содержащую приведенные ниже последовательности ДНК в следующем порядке: промоторная последовательность СМУ 8ЕС ГО № 1 или ее фрагмент или вариант, интронная последовательность, последовательность ДНК, кодирующая интересующий рекомбинантный белок, последовательность полиаденилирования; и вторую экспрессионную кассету, содержащую приведенные ниже последовательности ДНК в следующем порядке: промотор 8У40, ген устойчивости к антибиотику (предпочтительно ген устойчивости к неомицину), последовательность полиаденилирования;
возможно, по меньшей мере один 5'-МАК элемент куриного лизоцима, как описано в \УО 02/074969, или человеческие МАК элементы, как описано в \УО 2005/040377.
Согласно второму воплощению клетки ЕВх® по изобретению трансфицируют по меньшей мере одним экспрессионным вектором, где указанный экспрессионный вектор содержит по меньшей мере:
первую экспрессионную кассету, содержащую приведенные ниже последовательности ДНК в следующем порядке: химерная промоторная последовательность ЕЕ1альфа/НТЬУ 8ЕС ГО № 2 или ее фрагмент или вариант, интронная последовательность, последовательность ДНК, кодирующая интересующий рекомбинантный белок, последовательность полиаденилирования; и вторую экспрессионную кассету, содержащую приведенные ниже последовательности ДНК в следующем порядке: промотор 8У40, ген устойчивости к антибиотику (предпочтительно ген устойчивости к неомицину), последовательность полиаденилирования;
возможно, по меньшей мере один 5'-МАК элемент куриного лизоцима, как описано в \УО 02/074969, или человеческие МАК элементы, как описано в \УО 2005/040377.
Согласно одному воплощению клетки ЕВх® по изобретению трансфицируют по меньшей мере одним экспрессионным вектором, где указанный экспрессионный вектор содержит по меньшей мере:
первую экспрессионную кассету, содержащую приведенные ниже последовательности ДНК в следующем порядке: промоторная последовательность К8У 8ЕС ГО № 3 или ее фрагмент или вариант, интронная последовательность, последовательность ДНК, кодирующая интересующий рекомбинантный белок, последовательность полиаденилирования; и вторую экспрессионную кассету, содержащую приведенные ниже последовательности ДНК в следующем порядке: промотор 8У40, ген устойчивости к антибиотику (предпочтительно ген устойчивости к неомицину), последовательность полиаденилирования;
возможно, по меньшей мере один 5'-МАК элемент куриного лизоцима, как описано в \УО 02/074969, или человеческие МАК элементы, как описано в \УО 2005/040377.
- 14 017964
Согласно предпочтительному воплощению интронная последовательность представляет собой последовательность 8ЕО ГО № 4 или ее фрагмент или вариант, а последовательность полиаденилирования представляет собой последовательность 8ЕО ГО № 5 или ее фрагмент или вариант.
Когда интересующий рекомбинантный белок по изобретению представляет собой мультимерный белок, различные цепи указанного белка кодируются либо одним экспрессионным вектором, либо в различных экспрессионных векторах. В последнем случае различные экспрессионные векторы котрансфицируют либо одновременно, либо последовательно в клетку ЕВх®. Котрансфекция означает способ трансфекции клетки ЕВх® более чем одним экспрессионным вектором. Когда клетка котрансфицирована экспрессионным вектором, способным к экспрессии легкой цепи антитела, и вектором, способным к экспрессии тяжелой цепи антитела, вектор предпочтительно содержит независимо селективные маркеры. Когда единый экспрессионный вектор способен к экспрессии легкой цепи антитела и тяжелой цепи антитела, этот вектор предпочтительно содержит по меньшей мере один селективный маркер.
Теперь авторы изобретения неожиданно обнаружили, что уровень экспрессии антитела в клетках ЕВх® выше при трансфекции одним экспрессионным вектором, кодирующим тяжелую цепь и легкие цепи антитела, по сравнению с котрансфекцией двумя экспрессионными векторами, каждый из которых кодирует одну цепь антитела. Кроме того, авторы изобретения также обнаружили, что при трансфекции одним вектором уровень экспрессии антитела в клетках ЕВх® выше, когда в экспрессионном векторе содержатся в приведенном ниже порядке: первая кассета, кодирующая тяжелую цепь антитела, и вторая кассета, кодирующая легкую цепь антитела, где каждая кассета имеет один и тот же промотор. Действительно, сбалансированная экспрессия легкой и тяжелой цепей антитела из клеток ЕВх® желательна с учетом того, что легкая и тяжелая цепи связаны вместе в молекуле антитела в эквимолярных соотношениях. Экспрессионный вектор дает возможность получения антитела в функциональной форме и его секреции с хорошими выходами. Таким образом, этот способ обеспечивает получение достаточных количеств функционального антитела для применения при иммунотерапии патологических расстройств.
Клеточная линия по настоящему изобретению способна к продуцированию всех видов антител, которые обычно содержат эквимолярные соотношения легкой и тяжелой цепей. Изобретение, таким образом, включает человеческие антитела, где аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей гомологичны последовательностям антител, продуцируемых человеческими лимфоцитами ίη νίνο или гибридомами ίη νίίτο. В изобретение также включены измененные антитела, такие как гибридные антитела, в которых тяжелая и легкая цепи гомологичны природному антителу, но объединены таким путем, который не встречается в природе. Например, биспецифическое антитело имеет рецепторы антигена, специфичные более чем к одному антигену. Константная область антитела может относиться к одному или другому участку связывания антигена или может принадлежать другому антителу. Измененные антитела, такие как химерные антитела, имеют вариабельные области от одного антитела и константные области от другого. Таким образом, химерные антитела могут представлять собой межвидовые химеры или межклассовые химеры. Такие химерные антитела могут иметь одну или более чем одну дополнительную модификацию для улучшения способности к связыванию антигена или для изменения эффекторной функции. Другой формой измененного антитела является гуманизированное антитело или антитело с привитым СЭВ, включая составное антитело, где участки гипервариабельных областей в дополнение к СЭВ перенесены на человеческую каркасную область. Дополнительные аминокислоты в каркасной или константной областях таких антител могут быть изменены. В определение измененного антитела включены ЕаЬ фрагменты, которые приблизительно эквивалентны участкам Υ ветви тяжелой и легкой цепей; они могут включать неполные фрагменты или фрагменты, включающие участок области Ес. Таким образом, в пределы объема изобретения включено любое измененное антитело, в котором аминокислотная последовательность не представляет собой ту, которая существует в природе.
Предпочтительно интересующий белок представляет собой моноклональное антитело, предпочтительно человеческое моноклональное антитело или измененное антитело, и клетку ЕВх® по изобретению трансфицируют по меньшей мере одним экспрессионным вектором, где указанный экспрессионный вектор включает, по меньшей мере, в приведенном ниже порядке:
первую экспрессионную кассету, содержащую приведенные ниже последовательности ДНК в следующем порядке: промоторная последовательность, интронная последовательность, последовательность ДНК (предпочтительно последовательность кДНК), кодирующая тяжелую цепь антитела или ее фрагмент, последовательность полиаденилирования;
вторую экспрессионную кассету, содержащую приведенные ниже последовательности ДНК в следующем порядке: промоторная последовательность, интронная последовательность, последовательность ДНК (предпочтительно последовательность кДНК), кодирующая легкую цепь антитела или ее фрагмент, последовательность полиаденилирования;
третью экспрессионную кассету, содержащую приведенные ниже последовательности ДНК в следующем порядке: вирусный промотор, ген устойчивости к антибиотику, последовательность полиаденилирования;
- 15 017964 возможно, по меньшей мере один элемент 5'-МАВ куриного лизоцима, как описано в \УО 02/074969, или человеческие элементы МАВ, как описано в \УО 2005/040377.
Однако объектом настоящего изобретения также является разработка клетки ЕВх®, трансфицированной по меньшей мере одним экспрессионным вектором, где указанный экспрессионный вектор включает, по меньшей мере, в приведенном ниже порядке:
первую экспрессионную кассету, содержащую приведенные ниже последовательности ДНК в следующем порядке: промоторная последовательность, интронная последовательность, последовательность ДНК (предпочтительно последовательность кДНК), кодирующая легкую цепь антитела или ее фрагмент, последовательность полиаденилирования;
вторую экспрессионную кассету, содержащую приведенные ниже последовательности ДНК в следующем порядке: промоторная последовательность, интронная последовательность, последовательность ДНК (предпочтительно последовательность кДНК), кодирующая тяжелую цепь антитела или ее фрагмент, последовательность полиаденилирования;
третью экспрессионную кассету, содержащую приведенные ниже последовательности ДНК в следующем порядке: вирусный промотор, ген устойчивости к антибиотику, последовательность полиаденилирования;
возможно, по меньшей мере один элемент 5'-МАВ куриного лизоцима, как описано в \УО 02/074969, или человеческие элементы МАВ, как описано в \УО 2005/040377.
Согласно другому предпочтительному воплощению клетку ЕВх® по изобретению трансфицируют по меньшей мере одним экспрессионным вектором, где указанный экспрессионный вектор включает, по меньшей мере, в приведенном ниже порядке:
первую экспрессионную кассету, содержащую приведенные ниже последовательности ДНК в следующем порядке: промотор СМV 8ЕО ГО № 1 или его фрагмент или вариант, интронная последовательность, последовательность кДНК, кодирующая тяжелую цепь антитела или ее фрагмент, последовательность полиаденилирования;
вторую экспрессионную кассету, содержащую приведенные ниже последовательности ДНК в следующем порядке: промотор СМV 8ЕО ГО № 1 или его фрагмент или вариант, интронная последовательность, последовательность кДНК, кодирующая легкую цепь антитела или ее фрагмент, последовательность полиаденилирования;
третью экспрессионную кассету, содержащую приведенные ниже последовательности ДНК в следующем порядке: промотор 8ν40, ген устойчивости к неомицину, последовательность полиаденилирования;
возможно, по меньшей мере один элемент 5'-МАВ куриного лизоцима, как описано в \УО 02/074969, или человеческие элементы МАВ, как описано в \УО 2005/040377.
Согласно другому предпочтительному воплощению клетку ЕВх® по изобретению трансфицируют по меньшей мере одним экспрессионным вектором, где указанный экспрессионный вектор включает, по меньшей мере, в приведенном ниже порядке:
первую экспрессионную кассету, содержащую приведенные ниже последовательности ДНК в следующем порядке: химерный промотор ΕΕ1альфа/НΤ^V 8ЕО ГО № 2 или его фрагмент или вариант, интронная последовательность, последовательность кДНК, кодирующая тяжелую цепь антитела или ее фрагмент, последовательность полиаденилирования;
вторую экспрессионную кассету, содержащую приведенные ниже последовательности ДНК в следующем порядке: химерный промотор ΕΕ1альфа/НΤ^V 8ЕО ГО № 2 или его фрагмент или вариант, интронная последовательность, последовательность кДНК, кодирующая легкую цепь антитела или ее фрагмент, последовательность полиаденилирования;
третью экспрессионную кассету, содержащую приведенные ниже последовательности ДНК в следующем порядке: промотор 8ν40, ген устойчивости к неомицину, последовательность полиаденилирования;
возможно, по меньшей мере один элемент 5'-МАВ куриного лизоцима, как описано в \УО 02/074969, или человеческие элементы МАВ, как описано в \УО 2005/040377.
Согласно другому предпочтительному воплощению клетку ЕВх® по изобретению трансфицируют по меньшей мере одним экспрессионным вектором, где указанный экспрессионный вектор включает, по меньшей мере, в приведенном ниже порядке:
первую экспрессионную кассету, содержащую приведенные ниже последовательности ДНК в следующем порядке: промотор В8V 8ЕО ГО № 3 или его фрагмент или вариант, интронная последовательность, последовательность кДНК, кодирующая тяжелую цепь антитела или ее фрагмент, последовательность полиаденилирования;
вторую экспрессионную кассету, содержащую приведенные ниже последовательности ДНК в следующем порядке: промотор В8V 8ЕО ГО № 3 или его фрагмент или вариант, интронная последовательность, последовательность кДНК, кодирующая легкую цепь антитела или ее фрагмент, последовательность полиаденилирования;
- 16 017964 третью экспрессионную кассету, содержащую приведенные ниже последовательности ДНК в следующем порядке: промотор 8У40, ген устойчивости к неомицину, последовательность полиаденилирования;
возможно, по меньшей мере один элемент 5'-МАК куриного лизоцима, как описано в \УО 02/074969, или человеческие элементы МАК, как описано в \УО 2005/040377.
Гены легкой и тяжелой цепи могут составлять геномную ДНК или предпочтительно кДНК, и их клонируют, используя методики, известные в данной области техники (Мо1еси1аг С1ошпд: А БаЬога1огу Мапиа1, 8есопб ЕЩНоп, Машайк еί а1., Со1б 8рппд НагЬог).
Согласно другому воплощению клетка ЕВх® по изобретению дополнительно содержит экспрессионный вектор, включающий, по меньшей мере, экспрессионную кассету, содержащую нуклеиновокислотную последовательность, предпочтительно последовательность ДНК, кодирующую антиапоптический белок, оперативно сцепленный с промоторной последовательностью, способной осуществлять экспрессию указанного антиапоптического белка в клетке.
Антиапоптический белок выбран из группы, включающей белки семейства Вс12 млекопитающих, птиц, амфибий и рыб. Согласно предпочтительному воплощению антиапоптический белок представляет собой член семейства птичьих Вс12, названный ΝΚ13 (Ьее еί а1., 1999, Сепек & Эеу. 13:718-728; Ьа11е еί а1., 2002, ВюсНет. I. 368:213-221). Пример экспрессионного вектора, кодирующего антиапоптический белок ΝΚ13, включает по меньшей мере:
первую экспрессионную кассету, содержащую приведенные ниже последовательности ДНК в следующем порядке: промоторная последовательность СМУ, К8У или химерного ЕР1альфа/НТЬУ, интронная последовательность, последовательность кДНК, кодирующая антиапоптический белок ΝΚ13, последовательность полиаденилирования и вторую первую экспрессионную кассету, содержащую приведенные ниже последовательности ДНК в следующем порядке: промотор 8У40, ген устойчивости к пуромицину, последовательность полиаденилирования;
возможно, третью экспрессионную кассету, содержащую приведенные ниже последовательности ДНК в следующем порядке: промотор 8У40, ген устойчивости к неомицину, последовательность полиаденилирования;
возможно, по меньшей мере один элемент 5'-МАК куриного лизоцима, как описано в \УО 02/074969, или человеческие элементы МАК, как описано в \УО 2005/040377.
Согласно предпочтительному воплощению последовательность ΝΚ13 представляет собой 8ЕО ΙΌ № 6 или ее фрагмент или вариант.
Далее в настоящем изобретении предложен способ продуцирования по меньшей мере одного интересующего биологического продукта в птичьей клетке ЕВх®, где указанный способ включает стадии:
а) получение клетки ЕВх® согласно изобретению путем трансфекции по меньшей мере одним экспрессионным вектором; трансфекцию можно проводить либо на прикрепленных, либо на суспензионных клетках ЕВх®;
б) культивирование указанной трансфицированной клетки ЕВх® в пригодных условиях и в клеточной культуральной среде и
в) сбор интересующего биологического продукта из указанной трансфицированной клетки ЕВх®, из клеточной культуральной среды и/или из указанной клетки ЕВх®, и из указанной среды.
Экспрессионные векторы, описанные здесь, можно вводить в клетки ЕВх® с помощью ряда способов. В частности, можно проводить стандартные методики трансфекции, хорошо известные специалистам в данной области техники, такие как кальций-фосфатная преципитация, трансфекция, опосредованная ДЭАЭ-декстраном, электропорация, нуклеофекция (АМАХА СтЬН, СЕ), трансфекция, опосредованная липосомами (с использованием, например, технологии Липофектина® или Липофектамина®) или микроинъекция. Согласно предпочтительному воплощению на стадии а) клетки ЕВх®, предпочтительно куриные или утиные клетки ЕВх®, трансфицируют с помощью электропорации, более предпочтительно с помощью нуклеофекции, которая представляет собой оптимизированную технологию электропорации, разработанную АМАХА СтЬН (ЦЕ), по меньшей мере одним экспрессионным вектором в прикрепленной культуре в клеточной культуральной среде, свободной от сыворотки. Согласно предпочтительному воплощению на стадии а) клетки ЕВх®, предпочтительно куриные или утиные клетки ЕВх®, трансфицируют с помощью электропорации, более предпочтительно с помощью нуклеофекции, по меньшей мере одним экспрессионным вектором в суспензионной культуре в клеточной культуральной среде, свободной от сыворотки. Согласно другому предпочтительному воплощению на стадии а) клетки ЕВх®, предпочтительно куриные или утиные клетки ЕВх®, трансфицируют путем трансфекции, опосредованной липосомами, используя соединение, подобное липофектамину®, и т.п., по меньшей мере одним экспрессионным вектором в прикрепленной или в суспензионной культуре в клеточной культуральной среде, свободной от сыворотки.
Как используют здесь, термин интересующий белок относится к полимеру из аминокислот, связанных посредством пептидных связей. Термин интересующий белок включает белки, фрагменты бел
- 17 017964 ков, аналоги белков, полипептиды, олигопептиды, пептиды и т.п. Согласно изобретению под термином интересующий биологический продукт подразумевают либо мономерный интересующий белок, либо композицию по меньшей мере из двух интересующих мономерных белков, составляющих мультимерный белок. Примерами мультимерного интересующего белка являются антитела, которые состоят из 4 интересующих мономерных белков (т.е. двух тяжелых и двух легких цепей). Белок или биологический продукт, который не составляет естественную часть клеточного генома ЕВх®, называют гетерологичный белок или гетерологичный биологический продукт.
В изобретении предложен интересующий биологический продукт, имеющий гликозилирование птичьих ЕВх®. Более конкретно в изобретении предложено антитело, имеющее гликозилирование куриных ЕВх®, более предпочтительно гликозилирование ЕВ14 или ЕВу13, либо имеющее гликозилирование утиных ЕВх®, более предпочтительно гликозилирование ЕВ24, гликозилирование ЕВ24-12, гликозилирование ЕВ26, гликозилирование ЕВ66.
Культивирование указанных трансфицированных клеток ЕВх® можно проводить в соответствии с методиками клеточных культур, хорошо известных специалистам в данной области техники. В целях понимания, но без ограничения, практикующим специалистам должно быть понятно, что клеточные культуры и серии культивирования для продуцирования белка могут включать три общих типа, а именно непрерывную культуру, периодическую культуру и периодическую культуру с подпиткой. При непрерывной культуре, например, добавление свежей культуральной среды (т.е. питательной среды) обеспечивают клеткам в течение периода культивирования, тогда как старую культуральную среду удаляют ежесуточно и продукт собирают, например, ежесуточно или непрерывно. При непрерывной культуре питательную среду можно добавлять ежесуточно, а можно добавлять непрерывно, т.е. в виде капель или инфузии. Для непрерывного культивирования клетки могут оставаться в культуре настолько долго, насколько желательно, пока клетки остаются живыми и поддерживаются условия окружающей среды и культивирования. При периодической культуре клетки первоначально культивируют в среде, и эту среду не удаляют, не заменяют, не добавляют, т.е. клетки не подпитывают новой средой ни во время, ни в конце серии культивирования. Желаемый продукт собирают в конце серии культивирования. Для периодических культур с подпиткой время серии культивирования увеличивают путем пополнения культуральной среды один или более чем один раз в сутки (или непрерывно) свежей средой во время серии, т.е. клетки подпитывают новой средой (питательной средой) в течение периода культивирования. Периодические культуры с подпиткой могут включать различные режимы и периоды подпитки, как описано выше, например, ежесуточно, через каждые сутки, через каждые двое суток и т.д., более чем один раз в сутки или менее чем один раз в сутки и т.д. Кроме того, периодические культуры с подпиткой можно подпитывать непрерывно питательной средой. Затем описанный продукт собирают в конце серии культивирования/продуцирования. Настоящее изобретение предпочтительно включает периодические клеточные культуры с подпиткой. Согласно настоящему изобретению можно проводить клеточную культуру, и белки, предпочтительно гликопротеины, могут продуцироваться клетками в условиях для крупномасштабного или маломасштабного продуцирования белков, используя культуральные сосуды и/или аппараты для культур, которые общепринято применяют для культур клеток животных или млекопитающих. Как понятно специалистам в данной области техники, чашки для тканевых культур, Т-образные флаконы и роллерные флаконы типично используют в лабораторном масштабе. Для культивирования в большем масштабе (например, 3, 7, 20, 100, 500, 5000 л и т.д.) можно использовать методики, включающие, но не ограниченные ими, биореактор с псевдоожиженным слоем, биореактор с полыми волокнами, культуру в роллерном флаконе или системы биореакторов с механическим перемешиванием. Микроносители можно использовать или не использовать с роллерными флаконами или с системами биореакторов с механическим перемешиванием. Эти системы могут работать в периодическом, непрерывном режиме или в периодическом режиме с подпиткой. Кроме того, аппарат или систему культивирования можно оборудовать или не оборудовать клеточным сепаратором, используя фильтры, гравитацию, центрифужную силу и т.п.
В способах культивирования клеток или способах по данному изобретению клетки можно поддерживать в ряде клеточных культуральных сред, т.е. базовых культуральных сред, как общеизвестно в данной области техники. Например, эти способы применимы для использования с большими объемами клеток, поддерживаемых в клеточной культуральной среде, в которую могут быть добавлены нутриенты и тому подобное. Типично клеточная культуральная среда (также называемая культуральная среда) представляет собой термин, который понятен практикующим специалистам в данной области техники и известен как относящийся к питательному раствору, в котором выращивают клетки, предпочтительно животные клетки или клетки млекопитающих, и который обычно обеспечивает по меньшей мере один или более чем один компонент из приведенного ниже: источник энергии (обычно в форме углевода, такого как глюкоза); все незаменимые аминокислоты, и обычно двадцать основных аминокислот плюс цистеин; витамины и/или другие органические соединения, типично требующиеся при низких концентрациях; липиды или свободные жирные кислоты, например линолевая кислота; и микроэлементы, например неорганические соединения или встречающиеся в природе элементы, которые типично требуют
- 18 017964 ся при очень низких концентрациях, обычно в микромолярном диапазоне.
Клеточная культуральная среда может быть также дополнена таким образом, что содержит ряд возможных компонентов, таких как гормоны и другие факторы роста, например инсулин, трансферрин, эпидермальный фактор роста, сыворотка и тому подобное; соли, например, кальция, магния и фосфата, и буферы, например ГЭПЭС; нуклеозиды и основания, например аденозин, тимидин, гипоксантин; а также белковые и тканевые гидролизаты, например гидролизованный животный белок (пептон или пептоновые смеси, которые могут быть получены из животных субпродуктов, очищенный желатин или растительный материал); антибиотики, например гентамицин; и защитные агенты для клеток, например полиол Р1итошс (Р1итошс Р68). Предпочтительна клеточная питательная среда, которая свободна от сыворотки и свободна от продуктов или ингредиентов животного происхождения. Клетки ЕВх® по изобретению адаптированы для культивирования в условиях, свободных от сыворотки.
Можно использовать имеющиеся в продаже среды, и они включают, например, среду Нат'х Р12 (81дта, 8ΐ. Ьошк, МО), модифицированную Дульбекко среду Игла (ЭМЕМ. 81дта), среду Орйрго (Ιηνίйодеи, СагНЬаб, СА) или среду Ехсе11 (8АЕС, Ьеиеха, К8). К вышеуказанным примерным средам могут быть добавлены вышеописанные дополнительные компоненты или ингредиенты, включая возможные компоненты, в соответствующих концентрациях или количествах, по необходимости или желанию, и, как должно быть известно и использовано на практике специалистами в данной области техники, используя рутинные навыки. Кроме того, условия клеточной культуры, пригодные для способов по настоящему изобретению, представляют собой те, которые типично применяются и известны для периодического, периодического с подпиткой или непрерывного культивирования клеток, где внимание уделяют рН, например, от примерно 6,5 до примерно 7,5; растворенному кислороду (О2), например, между примерно 5-90% насыщения воздухом и диоксидом углерода (СО2), встряхиванию и увлажнению, в дополнение к температуре.
После сбора интересующий биологический продукт обычно концентрируют. После его получения в концентрированной форме можно использовать любую стандартную методику, такую как препаративный диск-электрофорез в геле, ионообменная хроматография, гель-фильтрация, разделительная хроматография по размеру, изоэлектрическое фокусирование и тому подобное, для очистки, выделения и/или идентификации гетерологичного белка. Специалисты в данной области техники могут также легко сконструировать средства для аффинной хроматографии очистки гетерологичного белка, особенно для тех случаев, в которых известен партнер связывания гетерологичного белка, например, антитела. Выделение моноклональных антител упрощено, а безопасность повышена благодаря отсутствию дополнительных человеческих или животных белков в культуре. Отсутствие сыворотки дополнительно повышает надежность системы, поскольку использование синтетических сред, как рассмотрено здесь, усиливает воспроизводимость.
Примеры интересующих белков, которые можно успешно продуцировать способом по данному изобретению, включают без ограничения цитокины, рецепторы цитокинов, факторы роста (например, ЕСЕ, НЕИ-2, ЕСЕ-альфа, ЕСЕ-бета, ТСЕ-альфа, ТСЕ-бета, ΡΌ6Ρ, ЮР-1, ЮР-2, Ν6Ρ), рецепторы факторов роста, включая фрагмент их белка. Другие неограничивающие примеры включают гормоны роста (например, человеческий гормон роста, бычий гормон роста); инсулин (например, А-цепь инсулина и В-цепь инсулина), проинсулин, эритропоэтин (ЕРО), колониестимулирующие факторы (например, С-С8Е, СМ-С8Е, М-С8Е); интерлейкины (например, ГЬ-1 - 1Ь-12); сосудистый эндотелиальный фактор роста (VЕСР) и его рецептор (УЕСЕ-И), интерфероны (например, ИФН-альфа, бета и гамма), фактор некроза опухоли (ЮТ) и его рецепторы (ΤΝΡ'Β-1 и ТЖ-2), тромбопоэтин (ТРО), тромбин, натрийуретический пептид головного мозга (ΈΝΡ); факторы свертывания крови (например, фактор VIII, фактор IX, фактор Виллебранда и тому подобное), антисвертывающие факторы; тканевой активатор плазминогена (ТРА), урокиназу, фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), лютеинизирующий гормон (ЛГ), кальцитонин, белки СО (например, СЭ2, СО3, СЭ4, СЭ5, СЭ7, СЭ8, СП11а, СП11Ь, СП18, СП19, (Ό20, СП25, ΕΌ33, СЭ44, СЭ45, СЭ71 и т.д.), белки СТЬА (например, СТЬА4); Т-клеточные и В-клеточные рецепторные белки, костные морфогенетические белки (ВМР, например, ВМР-1, ВМР-2, ВМР-3 и т.д.), нейротрофические факторы, например, нейротрофический фактор костного происхождения (ВОИЕ), нейротрофины, например реннин, ревматоидный фактор, КА.№ТЕ8, альбумин, релаксин, макрофагальный ингибиторный белок (например, МГР-1, МГР-2), вирусные белки или антигены, поверхностные мембранные белки, белки ионных каналов, ферменты, регуляторные белки, антитела, иммуномодуляторные белки (например, НЬА, МНС, семейство В7), хоминг-рецепторы, транспортные белки, супероксиддисмутазу (8ОЭ), рецепторные белки, связанные с С-белком (СРСИ), нейромодуляторные белки, белки и пептиды, связанные с болезнью Альцгеймера (например, А-бета) и другие, как известно в данной области техники. Гибридные белки и полипептиды, химерные белки и полипептиды, а также фрагменты или участки, или мутанты, варианты или аналоги любого из вышеупомянутых белков и полипептидов также включены среди пригодных белков, полипептидов и пептидов, которые можно продуцировать способами по настоящему изобретению.
- 19 017964
В предпочтительном воплощении интересующий белок представляет собой гликопротеин, и предпочтительно вирусный белок. Примеры вирусных белков (субъединиц), которые можно продуцировать в способах согласно изобретению, включают без ограничения белки от энтеровируса, такого как риновирус, афтовирус или вирус полиомиелита, вируса герпеса, такого как вирус простого герпеса, вируса псевдобешенства или вируса бычьего герпеса, ортомиксовируса, такого как вирус гриппа, парамиксовируса, такого как вирус псевдочумы птиц, респираторно-синцитиального вируса, вируса эпидемического паротита или вируса кори, ретровируса, такого как вирус иммунодефицита человека, или парвовируса или паповавируса, ротавируса или коронавируса, такого как вирус трансмиссивного гастроэнтерита, или флавивируса, такого как вирус клещевого энцефалита или вирус желтой лихорадки, тогавируса, такого как вирус коревой краснухи или вирус восточного, западного или венесуэльского энцефаломиелита лошадей, вируса, вызывающего гепатит, такого как вирус гепатита А или гепатита В, пестивируса, такого как вирус холеры свиней, или рабдовируса, такого как вирус гидрофобии. Согласно другому воплощению интересующий белок представляет собой бактериальный белок.
В другом предпочтительном воплощении интересующий биологический продукт представляет собой антитело. Термин антитело, как используют здесь, относится к поликлональным и моноклональным антителам и их фрагментам, а также их эквивалентам иммунологического связывания. Термин антитело относится к гомогенной молекулярной единице или к смеси, такой как продукт поликлональной сыворотки, полученной из множества различных молекулярных единиц, и широко охватывает природные формы антител (например, 1дО, 1дС, 1дА, 1дМ, 1дЕ) и рекомбинантные антитела, такие как одноцепочечные антитела, химерные и гуманизированные антитела и полиспецифичные антитела. Термин антитело также относится к фрагментам и производным всего вышеуказанного, и может дополнительно включать его любые модифицированные или производные варианты, которые сохраняют способность к специфичному связыванию эпитопа. Производные антитела могут включать белок или химическую группировку, конъюгированные с антителом. Моноклональное антитело способно селективно связывать антиген-мишень или эпитоп. Антитела могут включать, но не ограничены ими, поликлональные антитела, моноклональные антитела (тАЬ), гуманизированные или химерные антитела, камелизованные антитела, одноцепочечные антитела (бсЕу), ЕаЬ фрагменты, Е(аЬ')2 фрагменты, фрагменты Εν (кбЕу), связанные дисульфидным мостиком, антиидиотипические (апй-Гб) антитела, интратела, синтетические антитела и фрагменты, связывающие эпитоп, любого из вышеуказанного. Термин антитело также относится к гибридному белку, который включает область, эквивалентную области Ес-иммуноглобулина.
Предпочтительные антитела в пределах объема настоящего изобретения включают те, которые содержат аминокислотные последовательности приведенных ниже антител: антитела анти-НЕК2, включающие антитела, содержащие вариабельные области тяжелой и легкой цепи 1шМАЬ 4Ό5-8 (Сайег е! а1., Ргос. Ыа!1. Асаб. 8сг И8А, 89:4285-4289 (1992), патент США № 5725856) или трастузумаб, такой как Герцептин™; антитела анти-СО20, такие как химерное антитело анти-СО20 С2В8, как в патенте США № 5736137 (Ритуксан®), химерный или гуманизированный вариант антитела 2Н7, как в патенте США № 5721108, или тозитумомаб (Бексксар); анти-1Ь-8 (Б! ЛоНп е! а1., Сйек!, 103:932 (1993), и Международная публикация № \¥О 95/23865); антитела анти-УЕСЕ, включающие гуманизированные антитела и/или антитела созревшей аффинности анти-УЕСЕ, такие как гуманизированное антитело анти-УЕСЕ 1шА4.6.1 Авастин™ (К1т е! а1., Сго\\111 Еас!огк, 7:53-64 (1992), Международная публикация № \¥О 96/30046 и \УО 98/45331); антитела анти-РБСА (АУО 01/40309); антитела анти-СО40, включая Б2С6 и его гуманизированные варианты (АУО 00/75348); анти-СШ 1а (патент США № 5622700, \УО 98/23761); анти-ЕСЕК (химерное или гуманизированное антитело 225, как в \УО 96/40210); антитела анти-СО3, такие как ОКТ3 (патент США № 4515893); антитела анти-СО25 или анти-!ас, такие как СН1-621 (Симулект) и (Зенапакс) (см. патент США № 5693762); антитела анти-СО4, такие как антитело сМ-7412 (С1оу е! а1. Аг1Нг111ь К1еит 39(1):52-56 (1996)); антитела анти-СО52, такие как Кампат-1Н (К^есйтани е! а1., Ма!иге 332:323337 (1988); антитела против раково-эмбрионального антигена (РЭА), такие как 1ΜΝ-14 (Бйагкеу е! а1., Сапсег Кек. 55 (23 Бирр1):5935к-5945к (1995); антитела анти-ЕрСАМ, такие как 17-1А (Панорекс); антитела анти-Ср11Ь/111а, такие как абциксимаб или с7Е3 ЕаЬ (Реопро); антитела анти-КБУ, такие как МЕЭ1-493 (Синагис); антитела анти-СМУ, такие как Протовир; антитела против гепатита, такие как антитело антиНерВ Оставир; антитело против почечно-клеточного рака человека, такие как с1-С250; антитело античеловеческий 17-1А (3622\У94); антитело против рака прямой и ободочной кишки человека (А33); антитело против меланомы человека К24, направленное против ганглиозида СЭ3; антитело против чешуйчатоклеточной карциномы человека (БЕ-25); и антитела против человеческого лейкоцитарного антигена (НЬА), такие как БтаШО10 и антитело анти-НЬА ΌΚ Онколим (Ьут-1).
В настоящем изобретении предложен способ продуцирования антитела, при котором культивируют трансфицированную клетку ЕВх® по настоящему изобретению. Культуру клеток ЕВх® можно проводить в средах, содержащих сыворотку, или предпочтительно в средах, свободных от сыворотки и белка. Полученное в результате антитело можно очистить и изготовить его препарат в соответствии со стандартными методиками. Экспрессия обеих цепей МаЬ по существу в эквимолярных соотношениях обеспечивает оптимальные выходы функционального антитела, которое нужно получить. Трансфицирован
- 20 017964 ные клетки ЕВх® по изобретению, и более конкретно куриные клетки ЕВх® и утиные клетки ЕВх®, способны продуцировать по меньшей мере 10 пг/клетка/сутки иммуноглобулина в периодической культуре, предпочтительно по меньшей мере 15 пг/клетка/сутки иммуноглобулина в периодической культуре, более предпочтительно по меньшей мере 25 пг/клетка/сутки иммуноглобулина в периодической культуре, даже более предпочтительно по меньшей мере 35 пг/клетка/сутки иммуноглобулина в периодической культуре. Две цепи собираются внутри клетки, а затем секретируются в культуральную среду в виде функционального антитела. Антитело, гликозилированное клетками ЕВх®, сохраняет антигенсвязывающую способность и эффекторную функциональность. Интересно, что теперь авторы изобретения продемонстрировали, что антитело, фрагмент антитела или гибридные белки, которые включают область, эквивалентную области Гс-иммуноглобулина, продуцируемые способом по изобретению, обладают повышенной Гс-опосредованной клеточной токсичностью. Например, антитело подтипа 1д61, продуцируемое в птичьих клетках ЕВх®, предпочтительно в куриных клетках ЕВ14, обладает повышенной активностью АЗКЦ по сравнению с тем же антителом, продуцируемым в клетках гибридомы и СНО. Это достигнуто в результате обеспечения интересующих антител паттерном гликозилирования птичьих ЕВх®, более предпочтительно паттерном гликозилирования куриных ЕВх® или паттерном гликозилирования утиных ЕВх®. В частности, трансфицированные птичьи клетки ЕВх® по изобретению дают возможность экспрессии большой доли антител или их фрагмента, несущих общую Ν-сшитую олигосахаридную структуру двухантенного типа, которая содержит длинные цепи с концевым 61с№с, который в высокой степени галактозилирован и не фукозилирован и который придает сильную активность АЗКЦ антителам. Среди популяции рекомбинантных антител, продуцируемых в клетках ЕВх®, доля нефукозилированных антител составляет по меньшей мере 20%, более предпочтительно по меньшей мере 35% и более предпочтительно по меньшей мере 45% антител или выше. Таким образом, в изобретении предложен рекомбинантный полипептид, продуцируемый трансфицированной клеточной линией ЕВх, предпочтительно линией утиных клеток ЕВ66, где рекомбинантный полипептид характеризуется как имеющий примерно 20%, более предпочтительно примерно 35% и даже более предпочтительно примерно 45% нефукозилированных Ν-сшитых олигосахаридных структур. Точнее, в изобретении предложено рекомбинантное моноклональное антитело, продуцируемое трансфицированной клеточной линией ЕВх, предпочтительно линией утиных клеток ЕВ66, где указанное антитело характеризуется как имеющее примерно 45% или более нефукозилированных Ν-сшитых олигосахаридных структур. Указанное антитело характеризуется как имеющее примерно 35% или более нефукозилированных Ν-сшитых олигосахаридных структур 60, 61 и 62.
Изобретение также относится к антителу или популяции антител, продуцируемым в клетке ЕВх®, предпочтительно в утиной клетке ЕВ66, и обладающим повышенной активностью АЗКЦ по сравнению с тем же антителом, продуцируемым в гибридомной клеточной линии или клеточной линии СНО дикого типа, предпочтительно СНО-К1 и СНО-0644. Антитело предпочтительно выбрано среди 1д6 и более предпочтительно среди 1д61, 1д62, 1д63 и 1д64. Более предпочтительно антитело представляет собой 1д61 или 1д63.
Платформа продуцирования белков клетками ЕВх®, следовательно, полезна для повышения Гс-опосредованной клеточной цитотоксичности против нежелательных клеток, опосредованной иммуноглобулином или его фрагментом или любой биологической молекулой, несущей Гс-область иммуноглобулина или область, эквивалентную Гс-области иммуноглобулина. В изобретении предложена популяция антител (или иммуноглобулина), продуцируемая в клетках ЕВх® и имеющая профиль гликозилирования ЕВх®, где указанная популяция антител или их фрагментов содержит большую долю антител, где Гс-область несет общую Ν-сшитую фукозилированную олигосахаридную структуру двухантенного типа, которая содержит длинные цепи с концевым 61с№с, который является галактозилированным, и большую долю антител, где Гс-область несет общую Ν-сшитую нефукозилированную олигосахаридную структуру двухантенного типа, которая содержит длинные цепи с концевым 61с№с, который являются галактозилированным. Указанная популяция антител характеризуется тем, что имеет примерно 45% нефукозилированных Ν-сшитых олигосахаридных структур, которые придают сильную активность АЗКЦ указанным антителам. Большинство этих антител, т.е. более чем 60%, предпочтительно более чем 75%, более чем 85% и даже более чем 95% этих антител из популяции антител, продуцируемой в клетках ЕВх, не содержит остатков сиаловой кислоты на Ν-сшитой олигосахаридной структуре двухантенного типа, которая сшита с Гс-областью. Большую долю остатков сиаловой кислоты составляет Νацетилнейраминовая кислота (№иАС); действительно, более чем 80%, предпочтительно более чем 90% и предпочтительно более чем 95% остатков сиаловой кислоты составляет №иАс, которая, как известно, является не иммуногенной у человека. Остальную небольшую долю остатков сиаловой кислоты составляет Ν-гликолилнейраминовая кислота (№и6с).
Как используют здесь, термин Гс-опосредованная клеточная цитотоксичность включает антителозависимую клеточную цитотоксичность и клеточную цитотоксичность, опосредованную Гс-гибридным белком, содержащим человеческую Гс-область. Она представляет собой иммунный механизм, приводящий к лизису клеток-мишеней антитела человеческими иммунными эффекторными клетками. Чело
- 21 017964 веческие иммунные эффекторные клетки представляют собой популяцию лейкоцитов, которые проявляют Ес-рецепторы на их поверхности, посредством которых они связываются с Ес-областью антител или Ес-гибридных белков и осуществляют эффекторные функции. Такая популяция может включать, но не ограничена ими, мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и/или естественные киллерные (ΝΚ) клетки. Клетки-мишени антител представляют собой клетки, связываемые антителами или Ес-гибридными белками. Как используют здесь, термин повышенная Ес-опосредованная клеточная цитотоксичность определяют либо как увеличение числа клеток-мишеней антител, которые претерпевают лизис в данное время, при данной концентрации антитела или Ес-гибридного белка, в среде, окружающей клетки-мишени, по механизму Ес-опосредованной клеточной цитотоксичности, определенной выше, и/или как снижение концентрации антитела или Ес-гибридного белка в среде, окружающей клеткимишени, необходимой для достижения лизиса данного числа клеток-мишеней антител, в данное время, по механизму Ес-опосредованной клеточной цитотоксичности. Повышение Ес-опосредованной клеточной цитотоксичности является относительным к клеточной цитотоксичности, опосредованной тем же антителом или Ес-гибридным белком, продуцируемыми другим типом клеток-хозяев, таким как, например, гибридомы, с использованием таких же стандартных способов продуцирования, очистки, изготовления препарата и хранения, которые известны специалистам в данной области техники. Под антителом, обладающим повышенной антителозависимой клеточной цитотоксичностью (АЗКЦ), подразумевают антитело, как этот термин определен здесь, обладающее повышенной АЗКЦ, которую определяют любым пригодным способом, известным обычным специалистам в данной области техники. Один из принятых анализов АЗКЦ ίη νίΐΐΌ состоит в следующем.
1) В анализе используют клетки-мишени, которые известны как экспрессирующие антиген-мишень, распознаваемый участком антитела, связывающим антиген. В анализе используют мононуклеарные клетки периферической крови человека (РВМС), выделенные из крови случайно выбранного здорового донора, в качестве эффекторных клеток.
2) Анализ проводят в соответствии с приведенным ниже протоколом:
ί) РВМС выделяют, используя стандартные методики центрифугирования в градиенте плотности, и суспендируют при 5х 106 клеток/мл в клеточной культуральной среде КРМ1;
ίί) клетки-мишени выращивают стандартными способами культивирования тканей, собирают, начиная с экспоненциальной фазы роста, при выживаемости выше чем 90%, промывают в клеточной культуральной среде КРМ1, метят 100 мкКи 51Сг, дважды промывают клеточной культуральной средой и ресуспендируют в клеточной культуральной среде при плотности 105 клеток/мл;
ϊϊΐ) 100 мкл вышеописанной конечной суспензии клеток-мишеней переносят в каждую лунку 96луночного микротитрационного планшета;
ίν) антитело серийно разводят от 4000 до 0,04 нг/мл в клеточной культуральной среде, и 50 мкл полученных в результате растворов антитела добавляют к клеткам-мишеням в 96-луночном микротитрационном планшете, тестируя в трех повторах различные концентрации антитела, охватывающие весь приведенный выше диапазон концентраций;
ν) для контролей максимального высвобождения (МВ) в 3 дополнительные лунки в планшете, содержащие меченые клетки-мишени, добавляют 50 мкл 2% (об./об.) водного раствора неионного детергента (№шбе1, 81дта, 8ΐ. Ьошк) вместо раствора антитела (см. ίν) выше);
νί) для контролей спонтанного высвобождения (СВ) в 3 дополнительные лунки в планшете, содержащие меченые клетки-мишени, добавляют 50 мкл клеточной культуральной среды КРМ1 вместо раствора антитела (пункт ίν));
νίί) затем 96-луночный микротитрационный планшет центрифугируют при 50хд в течение 1 мин и инкубируют в течение 1 ч при 4°С;
νίίί) 50 мкл суспензии РВМС (см. ί) выше) добавляют в каждую лунку для получения отношения эффектор:клетка-мишень 25:1 и планшеты помещают в инкубатор в атмосферу 5% СО2 при 37°С на 4 ч;
1х) собирают свободную от клеток надосадочную жидкость из каждой лунки и количественно определяют экспериментально высвобожденную радиоактивность (ЭР), используя гамма-счетчик;
х) процент специфичного лизиса вычисляют для каждой концентрации антитела согласно формуле (ЭР-МВ)/(МВ-СВ)х100, где ЭР представляет собой среднюю подсчитанную радиоактивность (см. 1х)) для данной концентрации антитела, МВ представляет собой среднюю подсчитанную радиоактивность (см. 1х)) для контролей МВ (см. ν)) и СВ представляет собой среднюю подсчитанную радиоактивность (см. 1х)) для контролей СВ (см. νί)).
3) Повышенную АЗКЦ определяют либо как увеличение максимального процента специфичного лизиса, наблюдаемого в диапазоне концентраций антитела, тестируемом выше, и/или снижение концентрации антитела, необходимой для достижения половины максимального процента специфичного лизиса, наблюдаемого в диапазоне концентраций антитела, тестируемом выше.
Повышение АЗКЦ является относительным к АЗКЦ, измеренной вышеописанным анализом, опосредованной тем же антителом, продуцируемым другим типом клеток-хозяев, используя те же стандартные способы продуцирования, очистки, изготовления препарата и хранения, которые известны специа
- 22 017964 листам в данной области техники. Например, антитело подтипа 1дС1, продуцируемое способом по изобретению, имеет повышенную активность АЗКЦ по сравнению с тем же антителом, продуцируемым в клетках гибридомы или СНО.
Изобретение также относится к клеточной линии ЕВх®, предпочтительно к линии утиных клеток ЕВ66, полезной для продуцирования рекомбинантных полипептидов, предпочтительно моноклонального антитела, где указанная клеточная линия продуцирует гликозилированные полипептиды, характеризующиеся тем, что они обладают, по существу, сниженным содержанием фукозы по сравнению с тем же полипептидом, продуцируемым с использованием клеточной линии СНО. Примерно 55% или более антитела, продуцируемого клеточной линией ЕВ66, не содержит фукозилированных олигосахаридных структур по сравнению примерно с 0-20% антитела, продуцируемого в клеточной линии СНО (ЕСАСС ЕеГ. 06911). Антитела, продуцируемые в клеточной линии ЕВ66, содержат более высокое количество нефукозилированных форм С0 (>15%) и С1 (>13%) по сравнению с антителами, продуцируемыми в клеточной линии СНО (С0: примерно 2,5%; С1 примерно 7%).
Клеточные линии ЕВх по изобретению могут быть, кроме того, выбраны по их устойчивости к лектину. Действительно, лектины можно использовать для селекции клеточных линий, экспрессирующих специфичный тип олигосахарида (Шрка & 81аи1еу, 1986, 8отаЕс. Се11 Мо1. Сеп. 12:51-62). Можно использовать фукозоспецифичный лектин агглютинин Ьепк сиПпапк (ЬСЛ) для отбора клеточных линий ЕВх, экспрессирующих даже более низкие уровни фукозы. Например, клетки ЕВ66 можно высевать в 96луночные планшеты в среде, свободной от сыворотки, при плотности клеток 5000 клеток/лунка в присутствии различных концентраций лектинов ЬСЛ. После 5 суток проверяют выживаемость клеток, и редкие естественные варианты ЕВ66, экспрессирующие сниженные уровни мРНК фукозилтрансферазы ΕυΤ8, можно отбирать и высевать в другой 96-луночный планшет в присутствии 50 мкг/мл ЬСЛ. После нескольких недель должны появиться устойчивые клоны ЕВх, которые можно размножать и характеризовать на их способность к продуцированию рекомбинантных полипептидов со сниженным содержанием фукозы.
Настоящее изобретение относится к интересующему биологическому продукту согласно изобретению в качестве лекарства. Более конкретно, изобретение относится к антителу согласно изобретению в качестве лекарства. Более высокая цитотоксическая активность 1дС, продуцируемого ЕВх®, даст возможность уменьшить количество антитела, вводимого пациентам, и уменьшить затраты, связанные с лечением.
Гликозилированные и негликозилированные продукты ЕВх® (например, вирусные белки, антитела и т.п.) полезны в консервативной терапии для предупреждения и лечения различных расстройств человека и животных. Неограничивающим примером этих расстройств являются вирусные инфекционные заболевания, бактериальные инфекционные заболевания, раки (например, не-ходжкинская лимфома, множественная миелома, меланома и т.д.), инфекционные заболевания (СПИД, герпес, гепатит В, гепатит С и т.п.), аутоиммунные расстройства (например, рассеянный склероз, болезнь трансплантат против хозяина, псориаз, ювенильный диабет, болезнь Шегрена, заболевание щитовидной железы, тяжелая миастения, отторжение трансплантата, астма и т.д.), воспалительные расстройства (например, ревматоидный артрит, системная красная волчанка и т.п.).
В изобретении, таким образом, предложено применение гликозилированных и негликозилированных биологических продуктов ЕВх® (например, антител, вирусных белков и т.п.) при изготовлении лекарственного средства для профилактического и терапевтического лечения любого из вышеупомянутых расстройств. Также предложен способ лечения человека, страдающего любым таким расстройством, при котором указанному индивидууму вводят профилактически или терапевтически эффективное количество гликозилированных и негликозилированных биологических продуктов ЕВх®.
Изобретение также охватывает применение биологического продукта согласно изобретению для изготовления фармацевтической композиции для предупреждения или лечения заболеваний человека и животных. Такие фармацевтические композиции предпочтительно включают, в дополнение к биологическому продукту, физиологически приемлемый разбавитель или носитель, возможно в смеси с другими агентами, такими как, например, антибиотик. Пригодные носители включают, но не ограничены ими, физиологический солевой раствор, фосфатно-солевой буферный раствор, фосфатно-солевой буферный раствор с глюкозой и буферный солевой раствор. Альтернативно биологический продукт, такой как антитело, может быть лиофилизирован (высушен вымораживанием) и восстановлен для применения при необходимости путем добавления водного буферного раствора, как описано выше. Таким образом, в изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая биологический продукт по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.
Дозировки таких биологических продуктов варьируют в зависимости от состояния, подлежащего лечению, и от реципиента лечения. Для антитела дозировки, например, находятся в диапазоне от 1 до примерно 100 мг для взрослого пациента, предпочтительно 1-10 мг, обычно вводимые ежесуточно в течение периода между 1 и 30 сутками. Пути введения обычно являются парентеральными, включая внутривенную, внутримышечную, подкожную и внутрибрюшинную инъекцию или доставку.
- 23 017964
Приведенные ниже примеры более подробно объясняют изобретение. Приведенные ниже примеры получения и примеры даны, чтобы обеспечить специалиста в данной области техники более четким пониманием и практикой настоящего изобретения. Настоящее изобретение, однако, не ограничено в объеме воплощениями, примеры которых приведены, которые предназначены только в качестве иллюстраций отдельных аспектов изобретения, и способы, которые являются функционально эквивалентными, находятся в пределах объема изобретения. Действительно, различные модификации изобретения в дополнение к описанным здесь станут очевидными специалистам в данной области техники на основании приведенного выше описания и сопроводительных графических материалов. Такие модификации предназначены для включения в объем прилагаемой формулы изобретения. Для остального описания сделана ссылка на приведенные ниже подписи к графическим материалам.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Исходный экспрессионный вектор без вставок: рУУ8431 (ρΚΝεχρ).
Каркас вектора У1УАЬ18 включает одну кассету устойчивости, чтобы дать возможность амплификации плазмиды в Е.сой и селекции клонов после трансфекции экспрессионных векторов в клетках птиц. Ген ирШ кодирует белок неомицинфосфотрансферазу и придает организму устойчивость к канамицину в прокариотах и к неомицину в эукариотах. Транскрипция направляется как прокариотическими, так и эукариотическими промоторами, клонированными в тандеме слева от гена ирШ. кДНК, кодирующие интересующие белки, клонируют в пределах МСК (множественного сайта клонирования), локализованного в пустой экспрессионной кассете, несущей легко заменяемый промотор (т.е. промотор СМУ...), интрон и участок полиА.
Фиг. 2А и 2Б. Химерное МаЬ 1дС1 человека-мыши (каппа-легкая и тяжелая цепи) было любезно предоставлено МАТ-Вюрйатша (Еуту, Етаисе).
Фиг. 2А. Вектор, несущий промотор К.8У, направляющий экспрессию легкой цепи 1дС1: рУУ8452 (рВ8У-1§С1-Ь).
Фиг. 2Б. Вектор, несущий промотор К.8У, направляющий экспрессию тяжелой цепи 1дС1: рУУ8450 (рВ8У-1§С1-Н).
Фиг. ЗА и 3Б. Двойные векторы, экспрессирующие как легкую, так и тяжелую цепи 1дС1 под контролем промотора К.8У.
Фиг. ЗА. рУУ8455 (рВ8У-ЬН-1§С1).
Фиг. ЗБ. рУУ8460 (рВ8У-НЬ-1§С1).
Фиг. 4. Транзитная экспрессия 1дС1 в утиных клетках ЕВх® в среде, свободной от сыворотки.
1дС1 был транзитно экспрессирован в утиных клетках ЕВх®. Концентрацию 1дС1 определяли с помощью ЕЬ18А через 24 и 48 ч после трансфекции. Концентрация антитела достигала примерно 4,5 мкг/мл в надосадочной жидкости клеточной культуры.
Фиг. 5. Стабильная трансфекция, выделение клонов и скрининг на продуцирование 1дС1.
Панель А: Куриные клетки ЕВ14 трансфицировали экспрессионным вектором 1дС1 либо с промотором ЕЕ1/НТЬУ (слева), либо с промотором К.8У (справа). 200 устойчивых колоний из трансфектантов куриных клеток ЕВ14 собирали и пересевали в среду Ехсе11 63066 (8АРС Вюкаеисек), 0,25 мг/мл генетицина. Через 5 суток роста после посева проводили анализ ЕЬ18А для анализа продуцирования 1дС1 от каждой собранной колонии.
Панель Б: Только лучшие продуценты амплифицировали в 24-луночных планшетах.
Панель В: Только лучшие продуценты амплифицировали и проводили пассажи в 6-луночных планшетах.
Панель Г: Наконец, только лучшие продуценты выращивали до 175 см2 флакона. Данная панель Г показывает пример продуктивности 1дС1. наблюдаемой с помощью анализа ЕЬ18А, во время рутинного культивирования одного клона куриных клеток ЕВ14 (промотор ЕЕ1/НТЕУ).
Фиг. 6. Антитело 1дС1, продуцируемое в куриных клетках ЕВ14 и в утиных клетках ЕВ66.
Фиг. 6А. Антитело 1дС1, продуцируемое в куриных клетках ЕВ14, в биореакторе с механическим перемешиванием.
Стабильно трансфицированный клон куриных клеток ЕВ14, экспрессирующий 1дС1 (промотор ЕЕ1/НТЕУ), адаптировали к росту в суспензии в свободной от сыворотки среде ЕхСе11 (8АРС Вю8аепсе5). В 3-литровый биореактор с механическим перемешиванием (Аррйкои) засевали 0,4 млн клеток/мл. Затем проводили периодическую культуру; клеткам давали возможность расти в течение 13 суток. Клетки ЕВ14 достигали максимальной плотности клеток 16 млн клеток/мл на сутки 10. Мониторинг концентрации 1дС1 в клеточной культуральной среде проводили с помощью анализа ЕЬ18А. На сутки 12 максимальная концентрация 1дС1 достигала 0,25 г/л. Продуктивность специфичного белка составляет около 10-20 пг/клетка/24 ч.
Фиг. 6Б. Антитело 1дС1, продуцируемое в утиных клетках ЕВ66 в биореакторе с механическим перемешиванием.
Стабильно трансфицированный клон утиных клеток ЕВ66, экспрессирующий 1дС1, адаптировали к росту в суспензии в свободной от сыворотки среде ЕхСе11 (8АРС ВюЗаеисек). В 3-литровый биореактор
- 24 017964 с механическим перемешиванием (Аррйкоп) засевали 0,4 млн клеток/мл. Затем проводили периодическую культуру; клеткам давали возможность расти в течение 13 суток. Клетки ЕВ66 достигали максимальной плотности клеток 11 млн клеток/мл на сутки 11. Мониторинг концентрации 1дС1 в клеточной культуральной среде проводили с помощью анализа ЕБ18А. На сутки 11 максимальная концентрация 1дС1 достигала 0,07 г/л.
Фиг. 7А и 7Б. Профиль гликозилирования антитела 1дС1, продуцируемого в куриных клетках ЕВх.
Фиг. 7А. Анализ с помощью капиллярного электрофореза.
Профиль гликозилирования 1дС1, продуцируемого в куриных клетках ЕВ14, подобен профилю человеческих сывороточных молекул 1дС.
Фиг. 7Б. Анализ с помощью масс-спектроскопии.
Процент бесфукозного антитела 1дС1 достигал 48% популяции антитела, продуцируемой в куриных клетках ЕВ14, против только 2% антитела, продуцируемого в клетках СНО (данные из литературы).
Фиг. 8. Подробный профиль гликозилирования антитела 1дС1, продуцируемого в куриных клетках ЕЬх.
Профиль гликозилирования 1дС1, продуцируемого в одном стабильно трансфицированном клоне куриных клеток ЕВ14, анализировали с помощью анализа времяпролетного спектра ионизации лазерной десорбцией из матрицы (Ма1б1-ТоГГ). Анализировали структуру Ν-олигосахарида, присоединенного к домену СН2 каждой тяжелой цепи 1дС1 при остатке Акп 297. Большинство антител 1дС1, продуцируемых в этом курином клоне ЕВ14, имело общую Ν-сшитую олигосахаридную структуру двухантенного типа, которая содержит длинные цепи с концевым С1с№1с, который является галактозилированным. Важная часть (48%) популяции антител 1дС1 не является фукозилированной. Некоторая популяция имеет Ν-сшитую олигосахаридную структуру двухантенного типа с делящим пополам С1с№1с.
Фиг. 9. Ингибирование пролиферации опухолевых клеток антителом 1дС1, продуцируемым в куриных клетках ЕЬх.
Был разработан анализ для измерения активности ингибирования клеточной пролиферации иммуноглобулина 1дС1, продуцируемого либо в куриных клетках ЕВ14, либо в гибридоме. Антитело 1дС1 направлено против маркера СИ, экспрессируемого на поверхности человеческих опухолевых клеток. Опухолевые клетки выращивали в присутствии тритированного тимидина и инкубировали с моноцитами или естественными киллерными Т клетками, очищенными от нормального пациента, в присутствии иммуноглобулина 1дС1. Этот анализ измеряет количество тритированного тимидина, включенного в пролиферирующие опухолевые клетки как следствие опосредованного 1дС1 лизиса опухолевых клеток естественными киллерными клетками. После 4 суток в культуре низкое количество тритированного тимидина было включено в опухолевые клетки, обработанные ΝΚ клетками и антителом 1дС1, продуцируемым в куриных клетках ЕВ14, что указывает на то, что опухолевые клетки не пролиферируют. Напротив, высокий уровень Н3-тимидина наблюдали в опухолевых клетках, обработанных клетками ΝΚ или моноцитами и антителом 1дС1, продуцируемым в гибридоме, что указывает на то, что опухолевые клетки пролиферируют. 1дС1, продуцируемый в куриных клетках ЕВ14, проявляет лучшую клеточную антипролиферативную активность, чем то же антитело, продуцируемое в гибридоме.
Фиг. 10. Противоопухолевый цитотоксический ответ антитела 1дС1, продуцируемого в куриных клетках ЕВ14, по сравнению с клетками СНО.
Стандартный анализ АЗКЦ проводили, используя естественные киллерные клетки от двух здоровых доноров. Клетки ΝΚ культивировали либо без интерлейкина 2 (1Ь-2), либо с 5 или 100 единицами 1Ь-2. Опухолевые клетки, предварительно культивированные с радиоактивным хромом, инкубировали с иммуноглобулином 1дС1 и клетками ΝΚ. Активность АЗКЦ оценивали как % высвобождения хрома в среду.
Опухоль: Отрицательный контроль.
Опухоль + противоопухолевый 1дС1 из гибридомы (не химеризованный): Положительный контроль.
Опухоль + противоопухолевый 1дС1, продуцируемый в СНО.
Опухоль + противоопухолевый 1дС1, продуцируемый в куриных клетках ЕВ14.
Антитело 1дС1, продуцируемое в куриных клетках ЕВ14, проявляет более высокую активность АЗКЦ по сравнению с тем же антителом 1дС1, продуцируемым в клетках СНО.
Фиг. 11. Анализ роста прикрепленных куриных клеток ЕВх®, экспрессирующих антиапоптический ген ΝΚ13.
Панель А: Описание векторов рУУ8437 и рУУ8438. рУУ8437 несет только ген устойчивости к пуромицину. Р^8438 дает возможность экспрессии устойчивости к пуромицину и куриного антиапоптического гена ΝΚ13. Прикрепленные куриные клетки ЕВх® (ЕВ45) трансфицированы векторами рУУ8437 или рУУ8438 и проведена селекция на эти клетки.
Панель Б: Клоны объединили в популяцию или выделили и провели ОТ-ПЦР, используя суммарную РНК, выделенную из этих популяций или клонов, для обнаружения экспрессии гена ΝΚ13. Данная панель показывает, что клоны В2, В3 и С1 экспрессируют антиапоптический ген ΝΚ.13.
- 25 017964
Панель В: Анализ роста прикрепленных куриных клеток ЕВх® (ЕВ45), стабильно трансфицированных антиапоптическим геном ΝΚ13. Стабильно трансфицированные клетки ЕВх®, которые экспрессируют белок NВ13, культивировали при прикреплении в 100 мм чашках. Клетки ЕВх®, которые не экспрессируют белок ΝΚ13, не выживают в культуре, и большинство их погибает после 6-7 суток в культуре. Только небольшая и стабильная доля ЕВх®, экспрессирующих белок NВ13, погибает в культуре, а большинство клеток ΝΚ13 ЕВх® остается живым в течение более длительного периода времени в культуре.
Фиг. 12. Профили гликозилирования антитела 1дС1, продуцируемого в утиных клетках ЕВ66 и в клетках СНО.
Профиль гликозилирования 1дС1, продуцируемого в одном стабильно трансфицированном клоне утиных клеток ЕВ66 и в клетках СНО, анализировали с помощью масс-спектрометрического анализа МАЬО1 ТОЕ. Анализировали структуру Ν-олигосахарида, присоединенного к домену СН2 каждой тяжелой цепи 1дС1 при остатке Акп 297. Большинство антител 1дС1, продуцируемых в данном утином клоне ЕВ66, имеет общую Ν-сшитую олигосахаридную структуру двухантенного типа, которая содержит длинные цепи с концевым С1с№1с, который является галактозилированным. Важная часть (примерно 55%) продуцируемой ЕВ66 популяции антител 1дС1 является нефукозилированной. Небольшая доля продуцируемой СНО популяции антител 1дС1 не является фукозилированной (примерно 20%).
Фиг. 13. Масс-спектрометрический анализ Ν-сшитых олигосахаридов, присоединенных к домену СН2 тяжелой цепи 1дС1 при остатке Акп 297, продуцируемого в утиных клетках ЕВ66 или в клетках СНО.
Олигосахариды антитела Ес, высвобожденные путем расщепления РNС-азой Е, были перметилированы и проанализированы с использованием МС МАЬО1-ТОЕ в режиме положительного иона, используя матрицу ЭНВ. Были обнаружены 3 основные гликоформы на 1дС, продуцируемом обеими клеточными линиями, где продуцируемый ЕВ66 1дС содержит более высокий процент нефукозилированных форм С0 и С1 по сравнению с СНО-продуцируемым 1дС.
Фиг. 14. Таблица процентного содержания трех основных фукозилированных и нефукозилированных гликоформ С0, С1 и С2 одного и того же антитела 1дС1, продуцируемого в клетках ЕВ66 и СНО
Олигосахариды антитела Ес, высвобожденные путем расщепления РNС-азой Е, были перметилированы и проанализированы с использованием МС МАЬО1-ТОЕ в режиме положительного иона, используя матрицу ЭНВ. Были обнаружены 3 основные гликоформы на 1дС, продуцируемом обеими клеточными линиями. Продуцируемый ЕВ66 1дС содержит более высокий процент нефукозилированных форм С0 и С1 по сравнению с СНО-продуцируемым 1дС.
Фиг. 15А, 15Б. Противоопухолевый цитотоксический ответ антитела 1дС1, продуцируемого в куриных клетках ЕВ14, утиных клетках ЕВ66 и клетках СНО.
Фиг. 15А. Активация клеток ΝΚ (Анализ клеток, секретирующих ИФН-γ).
Активацию естественных киллерных клеток 1дС1 оценивали путем обнаружения ИФН-γ с помощью проточной цитометрии. Клетки ΝΚ от двух здоровых доноров культивировали без интерлейкина 2 (1Ь-2) или с 5 или 100 единицами 1Ь-2. Опухолевые клетки инкубировали с иммуноглобулином 1дС1 и клетками ΝΚ. Обнаружение ИФН-γ измеряли путем внутриклеточного окрашивания анти-ИФН-γ, конъюгированного с фикоэритрином (ФЭ). Антитело 1дС1, продуцируемое в куриных клетках ЕВ14 и утиных клетках ЕВ66, проявляет более высокую активацию ΝΚ по сравнению с тем же антителом 1дС1, продуцируемым в клетках СНО.
Фиг. 15Б. Активация клеток ΝΚ (Анализ СЭ107-положительных клеток).
Активацию естественных киллерных клеток 1дС1 оценивали путем анализа мобилизации СЭ107 с помощью проточной цитометрии. Клетки ΝΚ от двух здоровых доноров культивировали без интерлейкина 2 (1Ь-2) или с 5 или 100 единицами 1Ь-2. Опухолевые клетки инкубировали с иммуноглобулином 1дС1 и клетками ΝΚ. Антитела анти-СО107, конъюгированные с ФИТЦ, использовали для обнаружения активированных клеток ΝΚ. Антитело 1дС1, продуцируемое в куриных клетках ЕВ14 и утиных клетках ЕВ66, проявляет более высокую активацию ΝΚ по сравнению с тем же антителом 1дС1, продуцируемым в клетках СНО.
Фиг. 16. Противоопухолевый цитотоксический ответ антитела 1дС1, продуцируемого в куриных клетках ЕВ14, утиных клетках ЕВ66 и клетках СНО.
Стандартный анализ АЗКЦ проводили, используя очищенные естественные киллерные клетки от здорового донора. Клетки ΝΚ культивировали либо без интерлейкина 2 (1Ь-2), либо с 100 единицами 1Ь2. Опухолевые клетки, предварительно культивированные с радиоактивным хромом, инкубировали с иммуноглобулином 1дС1 при различных концентрациях в диапазоне от 0,8 до 5 мкг/мл и клетками ΝΚ. Активность АЗКЦ оценивали как % высвобождения хрома в среду.
При не ограничивающих условиях (< 50 мкг/мл антитела) продуцируемый ЕВ66 и ЕВ14 1дС1 более эффективен по индукции киллинга опухолевых клеток, чем то же антитело, продуцируемое в клетках СНО.
- 26 017964
Фиг. 17. Потенциальная гетерогенность двухантенных олигосахаридных структур, присоединенных к домену СН2 каждой тяжелой цепи 1дО (при остатках Ави 297 для человеческих 1дО).
Фиг. 17А. Маннозил-хитобиозная сердцевина (Мап3-С1с№1с2) показана сплошной темной линией, а дополнительные сахарные остатки, которые могут присутствовать (+/-), связаны с сердцевиной Мап3С1сЫас2 пунктирной линией.
Фиг. 17Б. Диаграмма Ν-сшитых двухантенных олигосахаридных структур комплексного типа, присоединенных к домену СН2 каждой тяжелой цепи при остатках Авп 297 для человеческих 1дО.
Примеры
Пример 1. Линия куриных клеток ΕΒν13 от линии кур 8РБ УАБО.
1.1. Сырье.
Яйца.
Свободную от особых патогенов (8РБ) линию назвали Уа1о. Линия Уа1о представляет собой линию белых леггорнов, полученную и доставленную Бойтапп из Германии. Яйца этих кур 8РБ, снабженные сертификатом анализа, тестируют на САУ, птичьи аденовирусы (группа 1, серотипы 1-12 и группа 3), ΕΌ8, вирус энцефаломиелита птиц, вирус лейкоза птиц/В8У (включая серотип АЕУ-Ц, вирус нефрита птиц, птичьи реовирусы, вирус оспы кур, вирус инфекционного бронхита, вирус инфекционного бурсита (1ВЭУ). вирус инфекционного ларинготрахеита, вирус гриппа типа А, вирус болезни Марека, микоплазмоз (Мд + Мв), МусоЬас1егшт аν^ит, вирус псевдочумы птиц, вирус ретикулоэндотелиоза, 8а1топе11а ри11огит, другие инфекции 8а1топе11а, вирус ринотрахеита птиц (АВТ), НеторШив рагадаШпагит. Яйца кур Уа1о подвергали только дезинфекции дезинфицирующим средством во избежание какого-либо риска заражения, связанного с манипуляцией с яйцами во время перевозки.
Фидерные клетки.
На первой стадии способа основания ΕΒν13 клетки мышиного происхождения (клетки 8ТО) использовали в качестве фидерного слоя для поддержания плюрипотентности куриных стволовых клеток. Эти фидерные клетки подвергают митотической инактивации гамма-облучением (45-55 Грей) перед высевом на пластик. Эта доза облучения представляет собой сублетальную дозу, которая индуцирует полную остановку клеточного цикла, но все же дает возможность продуцирования факторов роста и внеклеточного матрикса, необходимых для стимуляции клеточного роста недифференцированных клеток.
Клеточная линия 8ТО была выделена А. ВетвЮт, Институт рака Онтарио, Торонто, Канада, из непрерывной линии мышиных эмбриональных фибробластов 81М (инбредные мыши Сандоз), и она была получена из Американской коллекции типовых культур (АТСС) (номер продукта 8ТО: СВЬ-1503, номер партии 1198713). Свежие фидерные слои готовили дважды в неделю, как правило, в понедельник и в среду. Экспоненциальные клетки диссоциировали и считали. Часть клеток высевали для поддержания жизнеспособных культур, а другую часть облучали. Для облучения авторы изобретения готовили клеточную суспензию 10х106 клеток/мл в пробирках. Клетки подвергали воздействию дозы 45-55 Грей и высевали на пластик. После высева чашки или планшеты, покрытые инактивированными фидерными клетками, использовали в течение максимум 5 суток.
Среда.
ИМЕМ- НатР12 (СатЬгех, № по каталогу ВЕ04-687).
Среда Орбрго (Iην^ι^одеη. № по каталогу 12309).
ЕХ-СЕЕЬ™ 65195, 60947 и 65319 (8АРС, среда, изготовленная на заказ).
Добавки.
Глутамин (СатЬгех, № по каталогу ВЕ17-605Е).
Пенициллин/стрептомицин (СатЬгех, № по каталогу ВЕ17-602Е).
Заменимые аминокислоты (СатЬгех, № по каталогу ВЕ13-114Е).
Пируват натрия (СатЬгех, № по каталогу ВЕ13-115).
Витамины (СатЬгех, № по каталогу 13-607С).
Бета-меркаптоэтанол (81дта, № по каталогу М7522).
Буфер и фиксаторы.
ФСБ 1Х (СатЬгех, № по каталогу ΒΕ17-516Ρ).
Параформальдегид 4% (81дта, № по каталогу Р6148).
КС1 5,6% (81дта, № по каталогу Р9333).
Метанол/уксусная кислота (3/1): Метанол (Мегск, № по каталогу К34497209; уксусная кислота, 81дта № по каталогу А6283).
Колцемид, Кагуотах (01Ьсо, № по каталогу 15212-046).
Криозащитный агент.
Диметилсульфоксид (ДМСО) (81дта, № по каталогу Ό2650).
- 27 017964
Факторы.
Использовали два различных рекомбинантных фактора:
рекомбинантный человеческий цилиарный нейротрофический фактор (ЦНТФ) (Рерто!еск 1пс, № по каталогу 450-13);
рекомбинантный человеческий инсулиноподобный фактор роста I (ИФР1) (РергоЮск 1пс, № по каталогу 100-11).
Эти факторы продуцировали в бактериях Е.сок.
Фетальная бычья сыворотка.
Необлученная фетальная бычья сыворотка (ФБС) (ΙΡΗ. № по каталогу 12103).
Необлученную сыворотку, используемую в программе, собирали и изготавливали в США. Животные, использованные для сбора, были обследованы министерством сельского хозяйства США и приемлемы для убоя. Эту сыворотку добавляли в среду во время культуры птичьих стволовых клеток. Данную партию не подвергали облучению во избежание разрушения критических белков или компонентов, идентифицированных как незаменимые для поддержания стволовых клеток в культуре.
Облученная сыворотка (1ВН, № по каталогу 12107).
Облученную партию, используемую в данной программе, также собирали в США. Эту облученную партию добавляли в качестве добавки в среду ЭМЕМ, используемую для культуры клеток 8ТО или ЕЕЭ (фидерных клеток). Эти клетки не требуют, как стволовые клетки, специального качества сыворотки для роста и поддержания в культуре. Для минимизации высокой концентрации сыворотки в среде авторы изобретения адаптировали клетки 8ТО к росту в присутствии только 4% ФБС.
Диссоциирующие агенты.
Проназа (Воске, № по каталогу 165 921).
Проназа представляет собой рекомбинантную протеазу, изготавливаемую Воске ΌίαβηοδίΒδ, Германия, используемую для диссоциации прикрепленных птичьих стволовых клеток.
Трипсин ЭДТА (СатЬгех, № по каталогу ВЕ17-161Е).
Трипсин используют для диссоциации клеток 8ТО или ЕЕЭ и при поздних пассажах для диссоциации птичьих клеток, адаптированных к среде, свободной от сыворотки. Данный фермент свиного происхождения изготавливают асептически в соответствии со справочными условиями текущих правил организации производства и контроля качества лекарственных средств утвержденным способом стерильного фильтрования и тестируют в соответствии с современной Европейской Фармакопеей. Сырье, облученное перед изготовлением препарата, тестируют на свиной парвовирус в строгом соответствии с 9/Свод Федеральных правил 113.53.
Неферментативный раствор для диссоциации клеток (§1дта, № по каталогу С5914).
Данный агент диссоциации представляет собой готовый к употреблению препарат, используемый для мягкого открепления клеток от поверхности выращивания культурального сосуда. Его состав не содержит белок и дает возможность извлечения клеток без использования ферментов. Клеточные белки сохраняются, создавая возможность для иммунологических исследований, которые зависят от распознавания белков клеточной поверхности. Данный фермент использовали для открепления клеток перед анализом ЕАС8 (клеточным сортером с возбуждением флуоресценции) биологических маркеров, подобных ЕМА-1 (эпителиальный мембранный антиген 1) и 88ЕА1 (стадиеспецифический эмбриональный антиген-1).
1.2. Способ основания клеточной линии ЕВν13.
Яйца вскрывают, желток отделяют от белка во время вскрытия. Эмбрионы выделяют из желтка либо непосредственно с помощью пастеровской пипетки, либо с помощью мало абсорбирующей фильтровальной бумаги (бумаги АкаОпапп 3М), предварительно нарезав ее в форме перфорированного кольца с помощью пуансона. Диаметр перфорации составлял примерно 5 мм. Эти малые кольца стерилизовали, используя сухое тепло, в течение примерно 30 мин в печи. Это малое бумажное кольцо откладывают на поверхности желтка и центрируют на эмбрионе, который, таким образом, окружен бумажным кольцом. Затем последний вырезают с помощью маленьких ножниц и полностью извлекают и помещают в чашку Петри, заполненную ФСБ или физиологическим солевым раствором. Эмбрион, таким образом, вынесенный с помощью кольца, очищают от избытка желтка в среде, и эмбриональный диск, следовательно, свободный от избытка вителлина, собирают пастеровской пипеткой.
Куриные эмбрионы Уа1о помещали в пробирку, содержащую физиологическую среду (1Х ФСБ, Трис, глюкоза, среда и т.п.). Затем эмбрионы Уа1о механически диссоциировали и инокулировали на слое фидерных клеток 8ТО в полной культуральной среде при 39°С. Фидерные клетки высевали в флакон примерно при 2,7х104 клеток/см2 Полная культуральная среда состоит из базовой коммерческой среды ЭМЕМ-На1пЕ12 с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки, с ИФР1 и ЦНТФ при конечной концентрации 1 нг/мл, и с 1% заменимыми аминокислотами, с 1% смесью витаминов из коммерческого источника, с пируватом натрия при конечной концентрации 1 мМ, с бета-меркаптоэтанолом при конечной концентрации 0,2 мМ, глутамином при конечной концентрации 2,9 мМ, с исходной смесью антибиотиков, содержащей пенициллин при конечной концентрации 100 ед./мл и стрептомицин при ко
- 28 017964 нечной концентрации 100 мкг/мл. Вскоре после первых пассажей клеток смесь антибиотиков больше не добавляли в среду. Выражение вскоре понимают как означающее после первых 3-5 пассажей в целом.
Когда птичьи ЭС клетки из куриных эмбрионов νη^ переносят из одного культурального флакона в другой, засев культуральных флаконов проводят примерно между 7х104/см2 и 8х104/см2 птичьих ЭС клеток в полной культуральной среде. Предпочтительно засев осуществляют примерно 7,3х104/см2 (4х106 клеток/55 см2 или 4х106 клеток/чашка 100 мм). Птичьи клетки, предпочтительно птичьи эмбриональные клетки стадии а), культивируют в течение нескольких пассажей в полной среде. При пассаже 15 полную среду истощают по факторам роста ИФР1 и ЦНТФ. Истощение проводят непосредственно в одну стадию, от одного пассажа до другого. Эмбриональные стволовые клетки, предпочтительно птичьи эмбриональные клетки, культивируют в течение нескольких пассажей в полной среде без факторов роста ИФР1 и ЦНТФ.
Затем проводят истощение фидерных клеток после истощения факторов роста ИФР1 и ЦНТФ путем прогрессивного снижения концентрации фидерных клеток в течение нескольких пассажей. Практически одну и ту же концентрацию фидерных клеток использовали для 2-4 пассажей, затем более низкую концентрацию фидерных клеток использовали для дополнительных 2-4 пассажей и т.д. Флакон первоначально засевали примерно 2,7х104 фидерных клеток/см2, затем примерно 2,2х104 фидерных клеток/см2, затем примерно 1,8х104 фидерных клеток/см2, затем примерно 1,4х104 фидерных клеток/см2, затем примерно 1,1х104 фидерных клеток/см2, затем примерно 0,9х104 фидерных клеток/см2, затем примерно 0,5х10 фидерных клеток/см . Затем флакон засевали от 6,5х10 птичьих клеток/см до 7,5х10 птичьих клеток/см2 и без фидерных клеток. Истощение фидерных клеток начинали примерно при пассаже 21 и заканчивали примерно при пассаже 65. Во время истощения фидерных клеток куриные ЭС клетки νπ^ высевали в культуральный флакон при более низкой концентрации, чем на стадии а), примерно от 4х104 клеток/см2 до 5х104 клеток/см2. При предположении, что клетки ЭС Vа1ο находятся не в очень хорошей форме после снижения концентрации фидерных клеток во флаконе, тогда птичьи клетки культивируют в течение дополнительных пассажей с той же концентрацией фидерных клеток, после чего продолжают истощение фидерных клеток.
Истощение сыворотки проводили после истощения факторов роста и фидерных клеток. В начале истощения сыворотки культуральная среда состояла из базовой коммерческой среды ПМЕМ-НашР12 с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки и с 1% заменимыми аминокислотами, с 1% смесью витаминов из коммерческого источника, с пируватом натрия при конечной концентрации 1 мМ, с бетамеркаптоэтанолом при конечной концентрации 0,2 мМ, глутамином при конечной концентрации 2,9 мМ. Куриные клетки νπ^ адаптировали к росту в среде, свободной от сыворотки, в двухстадийном процессе: во-первых, куриные клетки Vа1ο быстро адаптировали к культуральной среде, состоящей из коммерческой среды, свободной от сыворотки (8РМ), предпочтительно ЕхСе11 60947 (8АРС Вюкаепсек) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки и с 1% заменимыми аминокислотами, с 1% смесью витаминов из коммерческого источника, с пируватом натрия при конечной концентрации 1 мМ, с бетамеркаптоэтанолом при конечной концентрации 0,2 мМ, глутамином при конечной концентрации 2,9 мМ. Как только была проведена эта быстрая адаптация к новой среде (ПМЕМ-НашР12 на Ехсе11 60947), проводят вторую стадию, состоящую в том, что начинают медленной адаптации к снижению концентрации животной сыворотки в среде 8РМ. Истощение сыворотки проводили путем прогрессивного снижения, начиная с 10% сыворотки, затем 7,5, затем 5, затем 2,5, затем 1,25, затем 0,75% концентрации сыворотки в клеточной культуральной среде 8РМ с конечным достижением 0% сыворотки в клеточной культуральной среде 8РМ. Истощение сыворотки начинали при пассаже 103 и заканчивали при пассаже 135.
В конце процесса истощения сыворотки, когда остаточная концентрация сыворотки в среде 8РМ составляла либо 0,75%, либо 0%, начинали адаптацию зависимых от культуральной подложки клеток ЕВу13 к суспензионной культуре. Среди нескольких попыток, предпринятых для выделения изолятов ЕВу13, независимых от культуральной подложки, 62,5% попыток были успешными и дали возможность получить различные изоляты суспензионных клеток ЕВу13. Один изолят клеток ЕВу13 был отобран в соответствии со временем удвоения популяции (примерно 18 ч), оптимальной концентрации клеток во флаконной культуре (примерно 4 млн клеток/мл), жизнеспособности клеток, гомогенности клеточной культуры (присутствия и размера агглютинированных клеток) и легкости манипуляции с клетками.
В конце истощения сыворотки куриные клетки Vа1ο, зависимые от культуральной подложки, названные ЕВу13, были способны расти в отсутствие факторов роста, в отсутствие фидерных клеток, в среде, свободной от сыворотки. Затем клетки ЕВу13 адаптировали к росту при 37°С путем прогрессивного снижения температуры клеточной культуры на 0,5°С сутки.
- 29 017964
Пример 2. Линия утиных клеток ЕВх ЕВ66.
2.1. Сырье.
Утиные яйца.
Утиные яйца от пекинских линий СЬ30 были получены от фирмы СК1МАиИ ЕКЕКЕ8 ЗЕЬЕСТЮЫ (Ьа СогЫеге, Коиззау Епшсе). Утки-родители были вакцинированы против ЕзсйепсЫа сой (аутогенная вакцина Сой 01 & 02), Раз1еиге11а шиНоаба (Баратах), утиного вирусного гепатитп (НераЮуах), Егу81ре1о111пх гйизюраШае (Киуах), метапневмовируса птиц (Nетονас), За^огеИа 1урЫтигшт & Ейепбй (аутогенная вакцина), К!етеге11а ηηΙί|^5ΐίίθΓ (аутогенная вакцина К!етеге11а), метапневмовируса птиц (неактивный ЫоЬШз КТУ) и Егу81ре1о111пх гйизюраШае (Киуах). После получения оплодотворенные яйца пекинской утки подвергали дезинфекции в гипохлоридной бане с последующим обеззараживанием Еегшас1ба1 (Тйегто) во избежание какого-либо риска заражения, связанного с загрязнениями, прилипшими к скорлупе.
Фидерные клетки.
На первой стадии способа клетки мышиного происхождения (клетки 8ТО) использовали в качестве фидерного слоя для поддержания плюрипотентности утиных стволовых клеток. Эти фидерные клетки подвергают митотической инактивации гамма-облучением (45-55 Грей) перед высевом на пластик. Эта доза облучения представляет собой сублетальную дозу, которая индуцирует полную остановку клеточного цикла, но все же дает возможность продуцирования факторов роста и внеклеточного матрикса, необходимых для стимуляции клеточного роста недифференцированных клеток. Клеточная линия 8ТО была выделена А. ВепШет, Институт рака Онтарио, Торонто, Канада, из непрерывной линии мышиных эмбриональных фибробластов 81М (инбредные мыши Сандоз), и она была получена из Американской коллекции типовых культур (АТСС) (номер продукта 8ТО: СКЬ-1503, номер партии 1198713). Свежие фидерные слои готовили дважды в неделю. Экспоненциальные клетки диссоциировали и считали. Часть клеток высевали для поддержания жизнеспособных культур, а другую часть облучали. Для облучения авторы изобретения готовили клеточную суспензию 10х106 клеток/мл в пробирках. Клетки подвергали воздействию дозы 45-55 Грей и высевали на пластик. После высева чашки или планшеты, покрытые инактивированными фидерными клетками, использовали в течение максимум 5 суток.
Среда.
Среда ЕХ-СЕЬЬ™ 65788, 65319, 63066 и 66444 (8АГС, среда, изготовленная на заказ).
Среда СТМ-3 (81дта, № по каталогу С9916).
ЭМЕМ-НашП2 (СатЬгех, № по каталогу ВЕ04-687).
ИМЕМ (СатЬгех, № по каталогу ВЕ 12-614Р).
Добавки.
Глутамин (СатЬгех, № по каталогу ВЕ17-605Е).
Пенициллин/стрептомицин (СатЬгех, № по каталогу ВЕ17-602Е)).
Заменимые аминокислоты (СатЬгех, № по каталогу ВЕ13-114Е).
Пируват натрия (СатЬгех, № по каталогу ВЕ13-115).
Витамины (СатЬгех, № по каталогу 13-607С).
Бета-меркаптоэтанол (81дта, № по каталогу М7522).
Дрожжевой экстракт (8АГС, № по каталогу 58902С).
Буфер и фиксаторы.
ФСБ 1Х (СатЬгех, № по каталогу ВЕ17-516Г).
Криозащитный агент.
Диметилсульфоксид (ДМСО) (81дта, № по каталогу Ό2650).
Факторы.
Использовали два различных рекомбинантных фактора.
Рекомбинантный человеческий цилиарный нейротрофический фактор (ЦНТФ) (Рерго1есй 1пс, № по каталогу 450-13).
Рекомбинантный человеческий инсулиноподобный фактор роста I (ИФР1) (Рерго1есй 1пс, № по каталогу 100-11).
Эти факторы продуцировали в бактериях Е.сой.
Фетальная бычья сыворотка.
Необлученная фетальная бычья сыворотка (ФБС) (ДКН, № по каталогу 12003).
Необлученную сыворотку, используемую в программе, собирали и изготавливали в Австралии. Животные, использованные для сбора, были обследованы Министерством сельского хозяйства США и приемлемы для убоя. Эту сыворотку добавляли в среду во время культуры птичьих стволовых клеток. Данную партию не подвергали облучению во избежание разрушения критических белков или компонентов, идентифицированных как незаменимые для поддержания стволовых клеток в культуре.
Облученная сыворотка (ДКН, № по каталогу 12107).
Облученную партию, используемую в данной программе, собирали в США. Эту облученную партию добавляли в качестве добавки в среду ИМЕМ, используемую для культуры клеток 8ТО (фидерных
- 30 017964 клеток). Эти клетки не требуют, как стволовые клетки, специального качества сыворотки для роста и поддержания в культуре. Для минимизации высокой концентрации сыворотки в среде авторы изобретения адаптировали клетки 8ТО к росту в присутствии только 4% ФБС.
Диссоциирующие агенты.
Проназа (Коске, № по каталогу 165 921).
Проназа представляет собой рекомбинантную протеазу, изготавливаемую Коске П1адпо811С8, Германия, используемую для диссоциации прикрепленных птичьих стволовых клеток.
Трипсин ЭДТА (Саткгех, № по каталогу ВЕ17-161Е).
Трипсин используют для диссоциации клеток 8ТО или ЕЕЭ и при поздних пассажах для диссоциации птичьих клеток, адаптированных к среде, свободной от сыворотки. Данный фермент свиного происхождения изготавливают асептически в соответствии со справочными условиями текущих правил организации производства и контроля качества лекарственных средств утвержденным способом стерильного фильтрования и тестируют в соответствии с современной Европейской Фармакопеей. Сырье, облученное перед изготовлением препарата, тестируют на свиной парвовирус в строгом соответствии с 9/Свод Федеральных Правил 113.53.
Ттур2еап (81дта, № по каталогу Т3449).
Раствор Тгур2еап готовят с рекомбинантным бычьим трипсином, экспрессируемым в кукурузе, и он изготавливается фирмой 81дта Л1бпск с использованием собственной системы экспрессии белка в трансгенных растениях фирмы РгобЮепе. Этот продукт оптимизирован для диссоциации клеток в прикрепленных клеточных культурах, как свободных от сыворотки, так и с добавлением сыворотки.
Неферментативный раствор для диссоциации клеток (81дта, № по каталогу С5914).
Данный агент диссоциации представляет собой готовый к употреблению препарат, используемый для мягкого открепления клеток от поверхности выращивания культурального сосуда. Его состав не содержит белок и дает возможность извлечения клеток без использования ферментов. Клеточные белки сохраняются, создавая возможность для иммунологических исследований, которые зависят от распознавания белков клеточной поверхности. Данный фермент использовали для открепления клеток перед анализом ЕЛС8 (клеточным сортером с возбуждением флуоресценции) биологических маркеров, подобных ЕМА-1 (эпителиальный мембранный антиген 1) и 88ЕЛ1 (стадиеспецифический эмбриональный антиген-1).
2.2. Способ основания линии утиных клеток ЕВх ЕВ66.
Примерно 360 оплодотворенных утиных яиц вскрывали, желток отделяли от белка во время вскрытия. Эмбрионы выделяли из желтка с помощью мало абсорбирующей фильтровальной бумаги (бумаги ХУкаПпапп 3М), предварительно нарезав ее в форме перфорированного кольца с помощью пуансона. Диаметр перфорации составляет примерно 5 мм. Эти малые кольца стерилизовали, используя сухое тепло, в течение примерно 30 мин в печи. На практике на стадии сбора эмбрионов малое бумажное кольцо откладывают на поверхности желтка и центрируют на эмбрионе, который, таким образом, окружен бумажным кольцом. Затем последний вырезают с помощью маленьких ножниц и полностью извлекают и помещают в чашку Петри, заполненную ФСБ. Эмбрион, таким образом, вынесенный с помощью кольца, очищали от избытка желтка в среде, и эмбриональный диск, следовательно, свободный от избытка вителлина, собирали пастеровской пипеткой.
Утиные эмбрионы помещали в 50-мл пробирки, содержащие ФСБ 1Х. Затем утиные эмбрионы механически диссоциировали, промывали ФСБ и высевали на слой инактивированных фидерных клеток 8ТО в полной культуральной среде при 39°С, 7,5% СО2. Фидерные клетки высевали в 6-луночные планшеты или чашки примерно при 2,7х104 клеток/см2 Полная культуральная среда состоит из свободной от сыворотки среды ОМЕМ-НатЕ12 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, с ИФР1, ЦНТФ при конечной концентрации 1 нг/мл, с 1% заменимыми аминокислотами, с 1% смесью витаминов из коммерческого источника, с пируватом натрия при конечной концентрации 0,1 мМ, с бета-меркаптоэтанолом при конечной концентрации 0,5 мМ, глутамином при конечной концентрации 2,1 мМ, с пенициллином при конечной концентрации 100 ед./мл, стрептомицином при конечной концентрации 100 мкг/мл и дрожжевым экстрактом 1Х. Вскоре при пассаже 4 смесь антибиотиков больше не добавляли в среду.
Утиные ЭС клетки культивировали в среде ОМЕМ-НатЕ12 вплоть до пассажа 4. После пассажа 4 базовую среду модифицируют, и полную среду ОМЕМ-НатЕ12 заменяют средой 8ЕМ 6ТМ-3 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, с ИФР1, ЦНТФ при конечной концентрации 1 нг/мл, с 1% заменимыми аминокислотами, с 1% смесью витаминов из коммерческого источника, с пируватом натрия при конечной концентрации 0,1 мМ, с бета-меркаптоэтанолом при конечной концентрации 0,5 мМ, глутамином при конечной концентрации 2,1 мМ и дрожжевым экстрактом 1Х. Утиные ЭС клетки далее культивировали в течение 14 пассажей в этой новой культуральной среде, затем истощение факторов роста проводили при пассаже 18. ИФР1 и ЦНТФ одновременно удаляли из среды, таким образом, от пассажа 19 до пассажа 24 культуральная среда представляла собой среду 6ТМ-3 с добавлением 10% ФБС, с 1% заменимыми аминокислотами, с 1% смесью витаминов из коммерческого источника, с пируватом натрия при конечной концентрации 0,1 мМ, с бета-меркаптоэтанолом при конечной концентрации
- 31 017964
0,5 мМ, глутамином при конечной концентрации 2,1 мМ и дрожжевым экстрактом 1Х.
Когда утиные ЭС клетки из эмбрионов пекинской утки пересевают с одной культуральной чашки на другую, засев культуральной чашки проводят примерно между 7х 104/см2 и 12х 104/см2 утиных ЭС клеток в полной культуральной среде.
Затем, после пассажа 24 проводили истощение фидерных клеток путем прогрессивного снижения концентрации фидерных клеток в течение нескольких пассажей. Чашки исходно засевали примерно 2,7х104 фидерных клеток/см2, затем примерно 1,8х104 фидерных клеток/см2 между пассажем 25 и 31, затем примерно 1,4 х104 клеток/см2 между пассажем 32 и 35, затем примерно 1х104 фидерных клеток/см2 между пассажем 36 и 41, затем примерно 0,7х104 фидерных клеток/см2 между пассажем 42 и 44, и, наконец, от пассажа 45 чашки засевали только птичьими клетками и без фидерных клеток. В конце истощения фидерных клеток чашки засевают от 9х104 птичьих клеток/см2 до 12,7х104 птичьих клеток/см2. Истощение фидерных клеток начинали при пассаже 25 и заканчивали при пассаже 45. Во время истощения фидерных клеток утиные ЭС клетки высевают в культуральные чашки при более высокой концентрации, чем на стадии а), между примерно 9х 104 клеток/см2 и 12,7х 104 клеток/см2.
После нескольких пассажей без фидерных клеток параметры роста (время удвоения популяции (ВУП) и плотность) исследовали для подтверждения стабильности и выносливости клеток и для начала истощения аминокислот, витаминов, бета-меркаптоэтанола, пирувата натрия и дрожжевого экстракта. Клетки считают достаточно выносливыми, чтобы подвергать их такому истощению, если ВУП составляет ниже чем примерно 40 ч, а плотность клеток выше чем примерно 26х 104 клеток/см2.
В случае разработки настоящих утиных клеток ЕВх®, названных ЕВ66, истощение витаминов, пирувата натрия, заменимых аминокислот и бета-меркаптоэтанола начинали при пассаже 52. Все эти добавки одновременно удаляли из среды. Таким образом, между пассажем 52 и пассажем 59 культуральная среда представляет собой ЗБМ СТМ-3 с добавлением глутамина, дрожжевого экстракта и ФБС. После короткого периода адаптации к новым условиям культуры начинали снижение температуры. Это снижение проводили прогрессивно между пассажем 60 и пассажем 67. После пассажа 67 клетки были способны расти при 37°С. После пассажа 67 базовую среду СТМ-3 заменяли новой базовой средой 8РМ, называемой Ехсе11 65788. Таким образом, после пассажа 67 культуральная среда представляла собой Ехсе11 65788 с добавлением 10% ФБС, 2,5 мМ глутамина и 1Х дрожжевого экстракта. При пассаже 80 4х106 клеток переносили в чашку ЦЦга Ьоте ЛиасНтегИ (ИЬА), поддерживаемую при постоянном встряхивании для инициации роста клеток, независимых от культуральной подложки. Для стимуляции роста в виде суспензии базовую среду модифицировали и процент сыворотки снижали с 10 до 5% для засева в чашку иЬА. Таким образом, от пассажа 80 до пассажа 85 культуральная среда представляла собой 8РМ СТМ-3 с добавлением 5% ФБС, 2,5 мМ глутамина и 1Х дрожжевого экстракта. Медленное снижение ФБС начинали на клеточной суспензии ЕВ66 после пассажа 85. Истощение сыворотки проводили путем прогрессивного снижения, начиная с концентрации 2,5% сыворотки, затем 1,5% сыворотки в клеточной культуральной среде 8РМ до конечного достижения 0% сыворотки в клеточной культуральной среде 8РМ. Истощение сыворотки начинали при пассаже 86 и заканчивали при пассаже 94. В конце истощения сыворотки клетки 6ЕВ66, независимые от культуральной подложки, были способны к росту при 37°С в отсутствие факторов роста, в отсутствие фидерных клеток, в среде, свободной от сыворотки.
После получения утиных клеток ЕВ66, которые способны к росту при 37°С в 8РМ СТМ-3 с добавлением 2,5 мМ глутамина, некоторую дополнительную адаптацию к среде 8РМ проводили путем разведения или прогрессивной адаптации, например, в новых препаратах 8РМ, таких как Ехсе11 63066, Ехсе11 66444, Ехсе11 СНО АСР.
Субклонирование суспензионных утиных клеток ЕВ66 можно также осуществлять в присутствии или в отсутствие дрожжевого экстракта.
Пример 3. Линия утиных клеток ЕВх ЕВ26.
3.1. Сырье.
Утиные яйца, фидерные клетки, добавки, буферы и фиксаторы, криозащитные агенты, фетальная телячья сыворотка и диссоциирующие агенты (те же пункты, как в примере 3).
Использовали утиные яйца от линий пекинских уток СЬ30.
Среда.
Среда ЕХ-СЕЬЬ 65319, 63066 и 66444 (ЗАГС, среда, изготовленная на заказ).
Среда СТМ-3 (81дта, № по каталогу С9916).
ЭМЕМ (СатЬгех, № по каталогу ВЕ 12-614Р).
Факторы.
Использовали шесть различных рекомбинантных факторов:
рекомбинантный человеческий цилиарный нейротрофический фактор (ЦНТФ) (Рерго1есН 1пс, № по каталогу 450-13);
рекомбинантный человеческий инсулиноподобный фактор роста I (ИФР1) (Рерго1ес11 1пс, № по каталогу 100-11);
рекомбинантный человеческий интерлейкин 6 (ГБ-6) (Рерго1есН Шс, № по каталогу 200-06);
- 32 017964 рекомбинантный человеческий растворимый рецептор интерлейкина 6 (к1Ь-6г) (Рерго1есН 1пс, № по каталогу 200-06 К);
рекомбинантный человеческий фактор стволовых клеток (ЕСЕ) (Рерго1есН 1пс, № по каталогу 30007);
рекомбинантный человеческий основной фактор роста фибробластов (ЬЕСЕ) (Рерго1есН 1пс, № по каталогу 100-18В).
Все эти факторы, за исключением 1Ь-6г, продуцируют в бактериях Е.со11. Растворимый 1Ь-6г экспрессируют в трансфицированных клетках НЕК293.
3.2. Способ основания линии утиных клеток ЕВх ЕВ26.
Утиные эмбрионы собирали, как описано выше для ЕВ66. Утиные эмбрионы помещали в 50-мл пробирки, содержащие ФСБ 1Х. Затем утиные эмбрионы механически диссоциировали, промывали в ФСБ и высевали на слой инактивированных фидерных клеток ЕЛО в полной культуральной среде при 36°С, 7,5% СО2. Фидерные клетки высевали в 6-луночные планшеты или чашки примерно при 2,7х104 клеток/см2. Полная культуральная среда состоит из свободной от сыворотки среды СΤМ-3 с добавлением 5% фетальной бычьей сыворотки, с ИФР1, ЦНТФ, 1Ь-6, 1Ь-6Р, ЕСЕ и ЕСЕ при конечной концентрации 1 нг/мл, с 1% заменимыми аминокислотами, с 1% смесью витаминов из коммерческого источника, с пируватом натрия при конечной концентрации 0,1 мМ, с бета-меркаптоэтанолом при конечной концентрации 0,5 мМ, глутамином при конечной концентрации 2,1 мМ, с пенициллином при конечной концентрации 100 ед./мл, стрептомицином при конечной концентрации 100 мкг/мл и дрожжевым экстрактом 1Х. Вскоре после первых пассажей клеток смесь антибиотиков больше не добавляли в среду. Выражение вскоре понимают как означающее после первых 3-9 пассажей в целом. Утиные ЭС клетки культивировали в полной среде вплоть до пассажа 9. После пассажа 9 полную среду частично истощали по факторам. Таким образом, между пассажем 10 и 13 ЕСЕ, 1Ь-6, 1Ь-6Р и ЬЕСЕ удаляли из среды, и только рекомбинантные ИФР1 и ЦНТФ поддерживали при концентрации 1 нг/мл. Одновременное снижение концентрации ИФР1 и ЦНТФ, во вторую очередь, проводили между пассажем 13 и 16, чтобы, наконец, получить клетки, способные к росту без рекомбинантных факторов, при пассаже 17. Истощение факторов проводили путем прогрессивной адаптации к более низким концентрациям факторов. Когда утиные ЭС клетки из эмбрионов пекинских уток пересевали с одной культуральной чашки на другую, засев культуральной чашки проводили примерно между 7х104/см2 и 12х104/см2 утиных ЭС клеток в полной культуральной среде. Предпочтительно засев проводят примерно 7,3х104/см2 (4х106 клеток/55 см2 или 4х106 клеток/100 мм чашка). После истощения рекомбинантных факторов проводили снижение дрожжевого экстракта при пассаже 23 с достижением конечной концентрации при 0,5Х. Затем, после пассажа 31 проводили истощение фидерных клеток путем прогрессивного снижения концентрации фидерных клеток в течение нескольких пассажей. Чашки исходно засевали примерно 2,7х104 фидерных клеток/см2, затем примерно 1,8х104 фидерных клеток/см2 между пассажем 32 и 38, затем примерно 1,4х104 клеток/см2 между пассажем 39 и 44, затем примерно 1х 104 фидерных клеток/см2 между пассажем 45 и 47, затем примерно 0,7х104 фидерных клеток/см2 между пассажем 48 и 50, и, наконец, от пассажа 51 чашки засевали только птичьими клетками и без фидерных клеток. В конце истощения фидерных клеток чашки засевают от 9х104 птичьих клеток/см2 до 12,7х104 птичьих клеток/см2. Истощение фидерных клеток начинали при пассаже 32 и заканчивали при пассаже 51. Во время истощения фидерных клеток утиные ЭС клетки высевают в культуральные чашки при более высокой концентрации, чем на стадии а), от примерно 9х104 клеток/см2 до 12,7х104 клеток/см2. После нескольких пассажей без фидерных клеток параметры роста (время удвоения популяции (ВУП) и плотность) исследовали для подтверждения стабильности и выносливости клеток и для инициации клеточного роста в виде суспензии. Клетки считают достаточно выносливыми, чтобы подвергать их культивированию в суспензии, если ВУП составляет ниже чем примерно 40 ч, а плотность клеток выше чем примерно 26х 104 клеток/см2. Кроме того, морфология клеток должна быть: округлые, преломляющие, очень маленькие, и клетки не должны быть слишком прикреплены к пластмассовой чашке.
В случае разработки клеток ЕВ26 культуру в суспензии инициировали при пассаже 53. 7х106 клетки переносили в чашку ийга Ьоте Лйасйшеп! и поддерживали при постоянном встряхивании примерно при 50-70 об/мин. Для следующих пассажей клетки высевали во флаконы Т175 (8агк!еб1, геГ 831812502) при концентрации, составляющей между 0,4 и 0,5х106 клеток/мл. После короткого периода адаптации к новым условиям культуры ВУП клеток снижалось от примерно 160 до 40 ч. С учетом хорошей динамики, при пассаже 59 проводили новую серию истощения. Таким образом, витамины, пируват натрия, бетамеркаптоэтанол и заменимые аминокислоты удаляли. Таким образом, после пассажа 59 в культуральную среду добавляли только 5% ФБС, 0,5 X дрожжевой экстракт и 2,5 мМ глутамин. Истощение сыворотки проводили на клеточных суспензиях, уже истощенных по факторам роста, фидерным клеткам, витаминам, заменимым аминокислотам, пирувату натрия и бета-меркаптоэтанолу. Истощение сыворотки проводили путем прогрессивного снижения, начиная с концентрации 5% сыворотки, затем 2,5%, затем 1,5% сыворотки в клеточной культуральной среде 8ЕМ до конечного достижения 0% сыворотки в клеточной культуральной среде 8ЕМ. Истощение сыворотки начинали при пассаже 61 и заканчивали при пассаже
- 33 017964
79. В конце истощения сыворотки независимые от культуральной подложки утиные клетки ЕВ26 были способны к росту при 39°С в отсутствие факторов роста, в отсутствие фидерных клеток, в среде, свободной от сыворотки. Затем клетки ЕВ26 адаптировали к росту в отсутствие 0,5 X дрожжевого экстракта при 37°С путем снижения температуры клеточной культуры при пассаже 80.
После получения клеток ЕВ26, которые способны к росту при 37°С в 8ГМ 6ТМ-3 с добавлением
2,5 мМ глутамина, некоторую дополнительную адаптацию проводили путем разведения или прогрессивной адаптации на новых препаратах 8ГМ, таких как Ехсс11 63066, Ехсс11 66444, Ехсс11 СНО АСГ. Субклонирование суспензионных утиных клеток ЕВ26 можно также осуществлять в присутствии или в отсутствие дрожжевого экстракта.
Пример 4. Линия утиных клеток ЕВх ЕВ24.
4.1. Сырье.
Утиные яйца, фидерные клетки, добавки, буферы и фиксаторы, криозащитные агенты, фетальная телячья сыворотка и диссоциирующие агенты (те же пункты, что и в примере 3).
Использовали утиные яйца от линий пекинских уток 6Ь30.
Среда.
Среда ЕХ-СЕЬЬ™ 65319, 63066 и 66444 (8АЕС, среда, изготовленная на заказ).
Среда 6ТМ-3 (81дта, № по каталогу 69916).
ЭМЕМ Г12 (СатЬгсх, № по каталогу ВЕ04-687).
ЭМЕМ (СатЬгсх, № по каталогу ВЕ 12-614Г).
Факторы.
Использовали шесть различных рекомбинантных факторов:
рекомбинантный человеческий цилиарный нейротрофический фактор (ЦНТФ) (Рсрго!ссй 1пс, № по каталогу 450-13);
рекомбинантный человеческий инсулиноподобный фактор роста I (ИФР1) (Рсрго!ссй 1пс, № по каталогу 100-11);
рекомбинантный человеческий интерлейкин 6 (1Ь-6) (Рсрго!ссй 1пс, № по каталогу 200-06);
рекомбинантный человеческий растворимый рецептор интерлейкина 6 (к1Ь-6г) (Рсрго!ссй 1пс, № по каталогу 200-06 К);
рекомбинантный человеческий фактор стволовых клеток (8СГ) (Рсрго!ссй 1пс, № по каталогу 30007);
рекомбинантный человеческий основной фактор роста фибробластов (ЬГ6Г) (Рсрго!ссй 1пс, № по катало.гу 100-18В)
Все эти факторы, за исключением 1Ь-6т, продуцируют в бактериях Е.сой. Растворимый 1Ь-6т экспрессируют в трансфицированных клетках НЕК293.
4.2. Способ основания линии утиных клеток ЕВх® ЕВ24.
Утиные эмбрионы собирали, как описано выше для ЕВ66. Утиные эмбрионы помещали в 50 мл пробирки, содержащие ФСБ 1Х. Затем утиные эмбрионы механически диссоциировали, промывали в ФСБ и высевали на слой инактивированных фидерных клеток 8ТО в полной культуральной среде при 39°С, 7,5% СО2. Фидерные клетки высевали в 6-луночные планшеты или чашки примерно при 2,7х104 клеток/см2. Полная культуральная среда состоит из свободной от сыворотки среды ЭМЕМ-НатЕ12 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, с ИФР1, ЦНТФ, 1Ь-6, 1Ь-6т, 8СГ и Г6Г при конечной концентрации 1 нг/мл, с 1% заменимыми аминокислотами, с 1% смесью витаминов из коммерческого источника, с пируватом натрия при конечной концентрации 0,1 мМ, с бета-меркаптоэтанолом при конечной концентрации 0,5 мМ, глутамином при конечной концентрации 2,1 мМ, с пенициллином при конечной концентрации 100 ед./мл, стрептомицином при конечной концентрации 100 мкг/мл и 1Х дрожжевым экстрактом. Вскоре после первых пассажей клеток смесь антибиотиков больше не добавляли в среду. Выражение вскоре понимают как означающее после первых 3-9 пассажей в целом.
Утиные ЭС клетки культивируют в полной среде ПМЕМ-НатЕ12 вплоть до пассажа 7. После пассажа 7 базовую среду модифицируют и полную среду ОМЕМ-НатР12 заменяют полной средой 6ТМ-3 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, с ИФР1, ЦНТФ, 1Ь-6, 1Ь-6т, 8СГ и Г6Г при конечной концентрации 1 нг/мл, с 1% заменимыми аминокислотами, с 1% смесью витаминов из коммерческого источника, с пируватом натрия при конечной концентрации 0,1 мМ, с бета-меркаптоэтанолом при конечной концентрации 0,5 мМ, глутамином при конечной концентрации 2,1 мМ, с пенициллином при конечной концентрации 100 ед./мл, стрептомицином при конечной концентрации 100 мкг/мл и 1Х дрожжевым экстрактом. Таким образом, при пассаже 11 концентрацию сыворотки снижают до 5%, и 8СГ, 1Ь-6, 1Ь-6т и ЬГ6Г удаляют из среды. Так, от пассажа 11 среда состоит из 5% ФБС, с ИФР1 и ЦНТФ при конечной концентрации 1 нг/мл, с 1% заменимыми аминокислотами, с 1% смесью витаминов из коммерческого источника, с пируватом натрия при конечной концентрации 0,1 мМ, с бета-меркаптоэтанолом при конечной концентрации 0,5 мМ, глутамином при конечной концентрации 2,1 мМ, с пенициллином при конечной концентрации 100 ед./мл, стрептомицином при конечной концентрации 100 мкг/мл и 1Х дрожжевым экстрактом. Одновременное исключение ИФР1 и ЦНТФ проводят при пассаже 22. Рекомбинант
- 34 017964 ные факторы не присутствуют в культуральной среде СТМ-3 после пассажа 22. Утиные клетки поддерживали в такой среде между пассажем 23 и пассажем 28. Когда утиные ЭС клетки из эмбрионов пекинской утки пересевают с одной культуральной чашки на другую, засев культуральной чашки проводят примерно между 7х104/см2 и 12х104/см2 утиных ЭС клеток в полной культуральной среде. Предпочтительно засев проводят примерно 7,3х104/см2 (4х106 клеток/55 см2 или 4х106 клеток/100 мм чашка). Затем, после пассажа 28, проводят истощение фидерных клеток путем прогрессивного снижения концентрации фидерных клеток в течение нескольких пассажей. Чашки исходно засевали примерно 2,7х104 фидерных клеток/см2, затем примерно 1,8х104 фидерных клеток/см2 между пассажем 29 и 33, затем примерно 1,4х104 клеток/см2 между пассажем 34 и 37, затем примерно 1х 104 фидерных клеток/см2 между пассажем 38 и 42, затем примерно 0,7х104 фидерных клеток/см2 между пассажем 43 и 46, и, наконец, от пассажа 47 чашки засевали только птичьими клетками и без фидерных клеток. В конце истощения фидерных клеток чашки засевают от 9х104 птичьих клеток/см2 до 12,7х104 птичьих клеток/см2. Истощение фидерных клеток начинали при пассаже 29 и заканчивали при пассаже 47. Во время истощения фидерных клеток утиные ЭС клетки высевают в культуральные чашки при более высокой концентрации, чем на стадии а), от примерно 9х104 клеток/см2 до 12,7х104 клеток/см2. После нескольких пассажей без фидерных клеток параметры роста (время удвоения популяции (ВУП) и плотность) исследовали для подтверждения стабильности и выносливости клеток и для инициации клеточного роста в виде суспензии. Клетки считают достаточно выносливыми, чтобы подвергать их культивированию в суспензии, если ВУП составляет ниже чем примерно 40 ч, а плотность клеток выше чем примерно 26х 104 клеток/см2. Кроме того, морфология клеток должна быть: округлые, преломляющие, очень маленькие, и клетки не должны быть слишком прикреплены к пластмассовой чашке. В случае разработки клеток ЕВ24 культуру в суспензии инициируют при пассаже 48. 8х 106 клеток переносили в чашку И11га Бо\у АйасНтегИ и поддерживали при постоянном встряхивании примерно при 50-70 об/мин. Для следующих пассажей клетки высевали во флаконы Т175 (8агйеб1, ге£ 831812502) при концентрации, составляющей между 0,4 и 0,5х106 клеток/мл. После короткого периода адаптации к новым условиям культуры ВУП клеток снижалось от примерно 248 до 128 ч, а затем проводили следующую стадию истощения. Таким образом, при пассаже 52 витамины, заменимые аминокислоты, пируват натрия и бета-меркаптоэтанол удаляют. С учетом хорошей динамики ВУП, достигающего 44 ч при пассаже 56, с пассажа 57 инициировали истощение сыворотки. Таким образом, от пассажа 57 в культуральную среду СТМ-3 добавляли только 5% ФБС, 1Х дрожжевой экстракт и
2,5 мМ глутамин. Истощение сыворотки проводят на клеточных суспензиях, уже истощенных по факторам роста, фидерным клеткам, витаминам, заменимым аминокислотам, пирувату натрия и бетамеркаптоэтанолу. Истощение сыворотки проводили путем прогрессивного снижения, начиная с концентрации 5% сыворотки, затем 2,5%, затем 2%, затем 1,5% сыворотки в клеточной культуральной среде 8ЕМ до конечного достижения 0% сыворотки в клеточной культуральной среде 8ЕМ. Истощение сыворотки начинали при пассаже 57 и заканчивали при пассаже 77. Во время этого истощения сыворотки также проводили адаптацию к росту при 37°С. Таким образом, при пассаже 65 клетки, растущие в культуральной среде с добавлением 2,5% ФБС, переносили на 37°С, избегая прогрессивного температурного сдвига. В конце истощения сыворотки независимые от культуральной подложки утиные клетки ЕВ24 были способны к росту при 37°С в отсутствие факторов роста, в отсутствие фидерных клеток, в среде, свободной от сыворотки.
После получения утиных клеток ЕВ24, способных к росту при 37°С в 8ЕМ СТМ-3 с добавлением
2,5 мМ глутамина проводили некоторую адаптацию путем разведения или прогрессивной адаптации к новым препаратам 8ЕМ, таким как Ехсе11 63066, Ехсе11 66444, Ехсе11 СНО АСЕ. Проводили субклонирование суспензионных утиных клеток ЕВ24, утиный субклон ЕВ24-12 был отобран в связи с его хорошими качествами по эффективной репликации вирусов.
Пример 5. Экспрессионные векторы и конструкции.
5.1. Исходный экспрессионный вектор без вставки: рУУ8431 (рК№хр).
Каркас вектора У!УАЬ18 включает одну кассету устойчивости, чтобы дать возможность амплификации плазмиды в Е.сой и селекции клонов после трансфекции экспрессионными векторами в птичьих клетках ЕВх®. Ген ηρίΙΙ кодирует белок неомицинфосфотрансферазу и придает организму устойчивость к канамицину у прокариот и к неомицину у эукариот. Транскрипция направляется обоими, прокариотическим и эукариотическим, промоторами, клонированными в тандеме слева от гена ηρΐΙΙ. кДНК, клонирующие интересующие белки, клонируют внутри МСК (множественного сайта клонирования), локализованного в пустой экспрессионной кассете, несущей легко заменяемый промотор (т.е. промотор СМУ и т.п.), интрон и участок поли-А (фиг. 1).
Далее приведен пример экспрессионных векторов, несущих промоторную последовательность К.8У; подобные методики использовали для конструирования экспрессионных векторов с промоторами СМУ, ЕЕ&/НТБУ, 8У40, бета-актина, тРСК, е1Е4альфа, САС, Е№-1.
- 35 017964
5.2. Вектор, несущий промотор Κ,δν, направляющий экспрессию легкой цепи !дС1: рVV8452 (рК^ЛдСНЬ).
Химерное МаЬ ЦС1 (легкая цепь каппа) человек-мышь было любезно предоставлено МАТ-Вюрйатта (Эври, Франция). Фрагмент ДНК ЖоЕКрп! с тупыми концами из р^СНЬ-клонЮ (МАТ-Вюрйатта) был клонирован внутри сайтов ШеРЛоЙ с тупыми концами участка МСК рКЫехр с получением рУ\8451 (рСМV-[дС1-^). В рVV8451 экспрессия легкой цепи МаЬ направляется промотором СМУ Промотор Βδν (вируса саркомы Рауса) был получен от РйШрре МоиШег (Иъегш И649 - ЬаЬога!о1ге бе Тйегар1е Ссп1цие, СНИ Но1е1-О1еи, Нант). Промотор Κ,δν был амплифицирован с помощью ПЦР из рЛАУЩЖЕас/ с праймерами 8О29 (НЖ-Вд12Е: АТААСАТСТСССАТСТАССССССАСАТА) (ЛЕО II) № 7) и 8О30 (К^-ШроШ: ТАТССТАССТТААСАСАСТССАССТТССАССТССАСАСС) (8ЕО Ю № 8). ПЦР фрагмент промотора Κ,δν и рУ\8451 переваривали ВдШ и ШроЕ Фрагмент ДНК рУ\8451 без промотора СМ\ очищали из агарозного геля и лигировали с промотором Κ,δν с целью создания рУ\8452 (фиг. 2А).
5.3. Вектор, несущий промотор Βδν, направляющий экспрессию тяжелой цепи ЦСЕ рУ\8450 (рИ8\-Н90Н).
МаЬ изотипа гамма1 было получено от МАТ-Вюрйагша (Эври, Франция). Фрагмент ДНК №оЕ Н1ибШ с тупыми концами из рШдС1-Н-клон28 (МАТ-Вюрйагта) был клонирован внутри сайтов ШеЕ №Й с тупыми концами участка МСК рКЫехр с получением р\\Л449 (рСМ\-ШдС1Е). В р\\Л449 экспрессия тяжелой цепи МаЬ направляется промотором СМ\. Фрагмент ПЦР промотора ИЛ\ и р\\Л449 переваривали ВдШ и ШроЕ Фрагмент ДНК р\\Л449 без промотора СМ\ очищали из агарозного геля и лигировали с промотором Κ,δν с целью создания рУ\8450 (фиг. 2Б).
5.4. Двойные векторы, экспрессирующие и легкую, и тяжелую цепи Н90 под контролем промотора Βδν: РШ455 (рК^-ЬНЛдСЦ и р\\А460 (рК^-НЬЛдСЦ.
Экспрессионная кассета легкой цепи ^С1, направляемая промотором Κ,δν, была амплифицирована с помощью ПЦР из рУ\8452, используя праймеры 8О29 и А8455 (А5сВат8\40ро1уАИ: АТАССССССССССАТССССАТССТТАТСССАТТТТАССАС) (ЛА) II) № 9). Этот фрагмент ДНК, несущий промотор Βδν, легкую цепь Н90 и поздний полиА 8ν40, переваривали А§Л и ВатНЕ Реципиентный вектор р\\Л450 был переварен АксЕВдШ. 5' концы линеаризованного вектора были дефосфорилированы перед лигированием с очищенным амплифицированным фрагментом ДНК с получением р\\Л455 (рЕЖ-ВН-ЦСВ) (фиг. 3А).
Те же праймеры 8О29 и А8455 использовали для амплификации из экспрессионной кассеты тяжелой цепи ЦС1 р\\Л450, направляемой промотором ИЛ\. Этот фрагмент ДНК, несущий промотор ИЛ\, тяжелую цепь ЦС1 и поздний полиА 8ν40, переваривали А§Л и ВатНЕ Реципиентный вектор рУ\8452 переваривали АзсНВдШ. 5' концы линеаризованного вектора были дефосфорилированы перед лигированием с очищенным амплифицированным фрагментом ДНК с получением рУ\8460 (рИ8\-НЕ-[дС1) (фиг. 3Б).
5.5. Вектор, экспрессирующий ΝΚ13, несущий устойчивость к пуромицину: р\\8438 (рЛИ13риго).
Эксперимент по ОТ-ПЦР проводили на суммарной РНК, очищенной из 886Ν45 вида Са11и8 да11и§, с получением кДНК, кодирующей антиапоптический ген ΝΚ13. Олигонуклеотиды А8376 (Nйе1-NΚ13Р: АСССТАССАТСССССССТСТСТСААССАССАСАС) (ЛА) II) № 10) и А8377 (\о11-\В1.ЛИ САСССССССССТАССССАС САССААСАСААААССТААТС) (ЛА) II) № 11), несущие сайты NйеI и соответственно использовали для получения кДНК ΝΚ13. Вектор на основе рСлЛео, внутри которого промотор СМ\ был делетирован и заменен промотором Κ,δν, использовали в качестве реципиента кДНК ΝΚ13. После переваривания обеих ДНК NйеI и ΝαΗ проводили эксперимент по лигированию. Продукты лигирования использовали для проведения ПЦР амплификации с праймерами 8О29 и А84349 с получением экспрессионной кассеты ΝΚ13, направляемой промотором Κ,δν. Этот ПЦР фрагмент переваривали ВдШ и ЛтаЕ Реципиентный вектор рУ\8437 переваривали ВдШ-ЗтаЕ. Очищенные вставку и вектор лигировали вместе с образованием рУ\8438 (рЖ13-риго).
Пример 6. Транзитная трансфекция в среде, свободной от сыворотки, и выделение лучших промоторов.
6.1. Транзитная трансфекция в куриных клетках ЕВх.
Транзитную экспрессию в прикрепленных куриных клетках ЕВх двух репортерных генов (красного флуоресцентного белка б^ИЕЭпис и человеческого фактора свертывания крови IX), каждый из которых направлялся 8 различными промоторами, проводили для выделения лучшего промотора.
различных промоторов, тестируемых в данном эксперименте, представляли собой промотор СМ\ (НР промотор человеческого цитомегаловируса); промотор 8ν40 (обезьяньего вируса 40); промотор человеческого бета-актина; мышиный промотор РСК (фосфоглицераткиназы); И8\-БТИ (ЬТИ вируса саркомы Рауса); человеческий промотор е1Е4альфа (фактора инициации трансляции 4 альфа); ЕЕ1альфаНТЬ\ составной промотор (человеческого фактора элонгации ЕЕ1, сшитый с участком 5'иТИ вируса НТЬ\1); составной промотор САС (энхансер СМ\, сшитый с промотором куриного бета-актина).
- 36 017964
Экспрессионные векторы, несущие эти 8 промоторов (табл. 1), были транзитно трансфицированы в линию прикрепленных клеток кур ЕВх®, используя реагенты липофектамин™ или фуген™, или путем электропорации. 4 промотора, для которых наблюдали самую высокую экспрессию репортерных генов, представляли собой: ΕР1альфа-ΗГ^У, К8У, СА6 и СМУ, и они были отобраны и далее использованы для экспрессии химерного человеческого/мышиного 1д61 в клетках ЕВх®.
Таблица 1
Перечень промоторов, направляющих экспрессию кДНК в экспериментах по транзитной экспрессии с целью отбора промоторов с высокими уровнями экспрессии в клетках ЕВх®
Промотор кДНК Название вектора
ЗУ40 (ранний промотор обезьяньего вируса) ОзКес12пис ΚΡΙΧ рУУ3405 РУУ5415
Бета-актин (человек) 0зКес12пис ИР1Х рУУ8418 рУУ8421
тРСК (мышиная фосфоглицераткиназа) ОзРес12пис ΚΕΙΧ рУУ8407 РУУ8420
СМУ (Человеческий немедленно-ранний промотор из человеческого цитомегаловируса (вируса герпеса 5)) СЕР 0зКед2пис ΚΕΙΧ 1дС1-ЬН 1дС1-НЬ РУУ8525 рУУ8410 р\Л/8413 рУУ8488 рУУ8489
ετκ-κβν (1_ТК из вируса саркомы Рауса) ОзКед2пис ΗΕΙΧ 1дС1-ЬН 1дС1-Ш рУУ8408 рУУ8417 р\Л/8455 рУУ8460
е1Е4альфа (человеческий фактор инициации трансляции 4а) О5Кед2пис ΚΕΙΧ 1дС14.Н 1дС1-Ш рУУ8406 РУУ8416 рУУ8510 рУУ8511
ЕЕ1/НТЬУ (составной промотор: человеческий фактор элонгации 1+ НТЬУ 5ΌΤΚ) ОзКед2пис ЬЕ!Х 1дС1-Ш 1дС1-Н1 рУУ8404 рУУ8414 рУУ8490 рУУ8491
САС (составной промотор: энхансер СМУ + промотор куриного бета-актина) 0зКес12пис ИЕ1Х 1дС14_Н 1дС1-НЬ рУУ8424 рУУ8423 р\Л/8492 рУУ8493
6РР: флуоресцентный репортерный белок;
[)к1<ес121тс: флуоресцентный репортерный белок;
НИХ: человеческий фактор свертывания крови IX;
1д61-ЬН или НЬ: легкая и тяжелая цепи, кодирующие 1д61, клонированные в одном и том же векторе и направляемые одним и тем же указанным промотором;
1,11: легкая цепь клонирована слева от тяжелой цепи;
III,: тяжелая цепь клонирована слева от легкой цепи; рУУ8ххх соответствует названиям векторов, которые зарегистрированы в базе данных У1уаЙ8.
Промоторы, которые дают возможность получить самую высокую экспрессию д61 в клетках ЕВх®, представляли собой ЕР 1 альфа-Н^У, К8У и СМУ (данные не представлены) и были далее использованы для проведения экспериментов по стабильной трансфекции для экспрессии химерного человеческого/мышиного 1д61 в клетках ЕВх®.
6.2. Транзитная трансфекция в утиных клетках ЕВх.
Методы.
Экспрессионные векторы ^ЕРХ/Н^У - 1д61 легкая и тяжелая цепь] (рУУ8490) были транзитно трансфицированы путем нуклеофекции (Атаха, ЭЕ) в суспензионных утиных клетках ЕВх в среде, свободной от сыворотки (среда Ехсе11 6ГМ 3 от 8АРС Вюксхепсез), с добавлением 2,5 мМ глутамина в 6-луночном планшете. Мониторинг экспрессии 1д61 проводили с помощью анализа ЕЫ8А через 24 и 48 ч после трансфекции. Контрольную нуклеофекцию проводили без ДНК.
Результаты.
Утиные клетки ЕВх транзитно экспрессировали вплоть до примерно 4,5 мкг/мл антитела 1д61 (фиг. 4).
- 37 017964
Пример 7. Стабильная трансфекция и идентификация лучших клонов-продуцентов.
7.1. Материалы и методы.
Клетки.
Куриные клетки ЕВ14 и утиные клетки ЕВ66 в среде, свободной от сыворотки (Ехсе11 - от 8АРС В1окс1епсек), с добавлением 2,5 мМ глутамина.
Экспрессионные векторы.
рУУ8490 (рЕЕШТЬУ) и рУУ8455 (рК8У) для клеток ЕВ14. рУУ8490 (рЕЕ1/НТЬУ) для клеток ЕВ66.
Трансфекция.
Экспрессионные векторы трансфицировали в среде, свободной от сыворотки, в клетки ЕВ14 и ЕВ66 путем электропорации (Атаха). Через трое суток после трансфекции селективный агент (0,25 мг/мл генетицина для клеток ЕВ14 и 0,15 мг/мл для клеток ЕВ66) добавляют в клеточную культуральную среду.
Выделяли клоны, устойчивые к генетицину, собирали и культивировали в сосудах большего объема (микротитрационные планшеты, флаконы, затем биореакторы).
ЕЫ8А.
Скрининговый анализ ЕЬ18А проводили на стабильно трансфицированных клонах для обнаружения уровня экспрессии антитела в надосадочной жидкости. В данном анализе используют количественную методику иммуноферментного сэндвич-анализа. Анти-1дС-Ес специфичное антитело предварительно наносят на 96-луночный планшет. Стандарты, образцы и конъюгаты добавляют в лунки, и любой присутствующий 1дС находится между слоями иммобилизованного антитела и второго сшитого с ферментом моноклонального антитела, специфичного к 1дС-каппа. После отмывки для удаления каких-либо несвязанных веществ и/или реагента антитело-фермент в лунки добавляют раствор субстрата, и окрашивание проявляется пропорционально количеству связанного 1дС. Реакцию останавливают и измеряют интенсивность окрашивания (ΟΌ 490 нм). Стандартную кривую строят путем нанесения на график среднего поглощения для каждого стандарта на оси у против концентрации на оси х и строят наилучшую эмпирическую кривую через точки графика. Концентрацию каждого неизвестного образца определяют путем вычисления концентрации 1дС, соответствующей среднему поглощению на основании стандартной кривой. Для образцов концентрация, определенная на основании стандартной кривой, должна быть умножена на фактор разведения.
7.2. Результаты.
Многие клоны клеток ЕВх®, стабильно трансфицированные экспрессионным вектором, кодирующим кДНК тяжелой и легкой цепей химерного 1дС1 человек-мышь, были получены и отобраны с помощью ЕЫ8А. Лучшие клоны-продуценты отбирали и культивировали в сосудах большего объема (фиг. 5).
По одному стабильно трансфицированному клону из ЕВ14 и из ЕВ66, экспрессирующему 1дС1, адаптировали к культуре в суспензии и культивировали далее в 3-литровом биореакторе с механическим перемешиванием. После 9 суток в неоптимизированной культуре в 3 л биореакторе плотность клеток ЕВ14 достигала 16 млн клеток/мл, и концентрация 1дС1 в надосадочной жидкости клеточной культуры составляла примерно 0,25 г/л (фиг. 6А). При неоптимизированных условиях 1дС1 также эффективно экспрессировался в клетках ЕВ66 в 3 л биореакторе (фиг. 6Б).
Пример 8. Анализ Паттерна гликозилирования моноклонального антитела 1дС1, продуцируемого ЕВх®.
Проводили капиллярный электрофоретический анализ гликанов, присоединенных на 1дС1, продуцируемом ЕВх, по сравнению с капиллярным электрофоретическим анализом гликанов, присоединенных на человеческих сывороточных 1дС. Полученные результаты демонстрируют, что профиль гликозилирования ЕВх был подобен человеческому профилю гликозилирования (фиг. 7А).
Сравнение паттерна гликозилирования 1дС1, продуцируемого в СНО (клетки яичника китайского хомячка) и в куриных клетках ЕВ14 также проводили, используя масс-спектрометрический анализ Ма1б1ТоГГ Ν-сшитых гликанов. Куриные клетки ЕВ14 обеспечивают продуцирование популяции антител, которые являются в меньшей степени фукозилированными, чем в обычных клетках СНО (фиг. 7Б) или клетках НЕК (данные не представлены).
Профиль гликозилирования 1дС1, продуцируемого в одном стабильно трансфицированном клоне куриных клеток ЕВ14, анализировали с помощью масс-спектрометрического анализа Ма1б1-ТоГГ. Анализировали структуру Ν-олигосахарида, присоединенного к домену СН2 каждой тяжелой цепи 1дС1 при остатке Акп 297 (фиг. 8). Большинство антител 1дС1, продуцируемых в этом курином клоне ЕВ14, имеет общую Ν-сшитую олигосахаридную структуру двухантенного типа, которая содержит длинные цепи с концевым С1с№с, который является галактозилированным. Важная часть (48%) популяции антител 1дС1 является нефукозилированной (фиг. 7Б и 8).
Сравнение паттерна гликозилирования 1дС1, продуцируемого в СНО (клетках яичника китайского хомячка) и в утиных клетках ЕВ66, также проводили, используя масс-спектрометрический анализ Ма1б1ТоГГ Ν-сшитых гликанов. Утиные клетки ЕВ66 обеспечивают продуцирование популяции антител, которые являются в меньшей степени фукозилированными, чем в обычных клетках СНО (фиг. 12, табл. 2).
- 38 017964
Профиль гликозилирования 1дС1, продуцируемого в одном стабильно трансфицированном клоне утиных клеток ЕВ66, анализировали с помощью масс-спектрометрического анализа Ма1б1-ТоГГ. Анализировали структуру Ν-олигосахарида, присоединенного к домену СН2 каждой тяжелой цепи 1дС1 при остатке Акп 297 (фиг. 13). Большинство антител 1дС1, продуцируемых в этом утином клоне ЕВ66, имеет общую Ν-сшитую олигосахаридную структуру двухантенного типа, которая содержит длинные цепи с концевым СЛсЖс, который является галактозилированным. Важная часть (>50%) продуцируемой ЕВ66 популяции антител 1дС1 является нефукозилированной (фиг. 12-14). Напротив, то же антитело 1дС1, продуцируемое в клетках СНО, проявляет Ν-сшитую олигосахаридную структуру двухантенного типа, которая содержит длинные цепи с концевым СЛсЖс, который является в высокой степени фукозилированным (>70%) (фиг. 12-14).
Таблица 2
Процент Ν-сшитого олигосахарида комплексного типа в 1дС1, продуцируемом клеткой ЕВ66 и клеткой СНО
Пиния клеток Тип комплекса
60, 61,62 Другие структуры без фукозы 60Г, 61Р, 62Р Другие структуры с фукозой Всего
ЕВ66 36,6 9,7 37,4 7,6 91,3
СНО 15,3 6,2 69,4 5,6 96,5
Проводили анализ содержания остатков сиаловой кислоты, присутствующих в 1дС1, экспрессируемом в клетках ЕВ66. После гидролиза уксусной кислотой (2 М конечная концентрация, 80°С, 2 ч) сиаловые кислоты, присутствующие на 1дС1, экспрессируемом в клоне ЕВ66 1Ώ7, метили 1)МВ (1,2-диамино4,5-метилендиоксибензолом). Относительную долю Ν-ацетилнейраминовой кислоты (ЖиАС) и Ν-гликолилнейраминовой кислоты (ЖиСс) определяли по ВЭЖХ (флуоресцентное обнаружение). ЖиАс составляет 95% сиаловой кислоты, присутствующей на ЕВ66 1дС1 (см. табл. 3).
Таблица 3
Относительная доля сиаловой кислоты, присутствующей на 1дС1 продуцируемом клетками ЕВ66 (клон ΙΏ7)
Сиаловая кислота Относительный процент (%)
Ыеи5Ас 6,96
Иеи5,7Ас2 5,64
Νβυ5Οο9Αο 3,84
Ыеи5,9Ас2 63,53
Νβιι5,7(θΓ 8),9Ас3 20,03
Пример 9. Анализ ингибирования пролиферации опухолевых клеток 1дС1, продуцируемого в клетках ЕВх®, по сравнению с гибридомой.
Был разработан анализ для измерения активности иммуноглобулина 1дС1, продуцируемого либо в куриных клетках ЕВ14, либо в гибридоме, по ингибированию клеточной пролиферации. Антитело 1дС1 направлено против маркера СО, экспрессируемого на поверхности человеческих опухолевых клеток.
Опухолевые клетки выращивали в присутствии тритированного тимидина и инкубировали с моноцитами или естественными киллерными Т-клетками, очищенными от нормального пациента, в присутствии иммуноглобулина 1дС1. Этот анализ измеряет количество тритированного тимидина, включенного в опухолевые клетки, как следствия опосредованного 1дС1 лизиса опухолевых клеток моноцитами или ΝΚ клетками. После 4 суток в культуре низкое количество тритированного тимидина было включено в опухолевые клетки, обработанные ΝΚ клетками или моноцитами и антителом 1дС1, продуцируемым в куриных клетках ЕВ14. Напротив, более высокий уровень Н3-тимидина наблюдали в опухолевых клетках, обработанных ΝΚ клетками или моноцитами и антителом 1дС1, продуцируемым в гибридоме.
Следовательно, 1дС1, продуцируемый в куриных клетках ЕВ14, проявляет лучшую клеточноопосредованную цитотоксическую активность, чем то же антитело, продуцируемое в гибридоме (фиг. 9).
- 39 017964
Пример 10. Активность АЗКЦ 1дС1 МаЬ, продуцируемого в клетках ΕΒx®.
10.1. Методы.
РВМС от двух здоровых доноров выделяли, используя стандартные методики центрифугирования в градиенте плотности, и суспендировали при 5х 106 клеток/мл в клеточной культуральной среде ВРМ1.
Клетки-мишени, связанные с заболеванием, выращивали стандартными способами культивирования тканей, собирали из экспоненциальной фазы роста при жизнеспособности выше 90%, промывали в клеточной культуральной среде ВРМ1, метили 100 мкКи 51Сг, дважды промывали клеточной культуральной средой и ресуспендировали в клеточной культуральной среде при плотности 105 клеток/мл. 100 мкл суспензии клеток-мишеней, связанных с заболеванием, переносили в каждую лунку 96-луночного микротитрационного планшета.
Антитело, направленное на антигенный поверхностный маркер указанных клеток-мишеней, связанных с заболеванием, серийно разводили от 4000 до 0,04 нг/мл в клеточной культуральной среде, и 50 мкл полученных в результате растворов антитела добавляли к клеткам-мишеням в 96-луночном микротитрационном планшете, тестируя в трех повторах различные концентрации антитела, охватывающие весь вышеуказанный диапазон концентраций. Затем 96-луночный микротитрационный планшет центрифугировали при 50хд в течение 1 мин и инкубировали в течение 1 ч при 4°С.
мкл суспензии РВМС добавляли в каждую лунку с получением отношения эффекторы:клеткимишени 25:1 и планшеты помещали в инкубатор в атмосфере 5% СО2 при 37°С на 4 ч.
Надосадочную жидкость, свободную от клеток, из каждой лунки собирают и количественно определяют экспериментально высвобожденную радиоактивность (ЭР), используя гамма-счетчик.
10.2. Результаты.
Два независимых эксперимента, проведенных с ΝΚ клетками, очищенными из РВМС двух отдельных здоровых доноров, показали, что антитело 1дС1, направленное против клеток-мишеней, связанных с заболеванием, и продуцируемое в куриных клетках ЕВ14 и в утиных клетках ЕВ66, обладает повышенной активностью АЗКЦ по сравнению с тем же антителом, продуцируемым в клетках СНО (фиг. 10, 15 и 16).
Активность АЗКЦ либо измеряли способом высвобожденного хрома, либо оценивали по процентному содержанию ΝΚ клеток, экспрессирующих маркеры ИФН гамма и СЭ107 (фиг. 15).
Пример 11. Анализ роста прикрепленных куриных клеток ΕΒx®, стабильно трансфицированных антиапоптическим геном ΝΒ13.
Были сконструированы два отдельных экспрессионных вектора рУУ8437 и рУУ8438. рУУ8437 несет только ген устойчивости к пуромицину. РХУ8438 дает возможность экспрессии устойчивости к пуромицину и куриного антиапоптического гена ΝΒ13.
Куриные прикрепленные клетки ΕΒx® трансфицировали векторами рУУ8437 или рУУ8438 и отбирали лучшие клоны-продуценты.
Стабильно трансфицированные клетки ΕΒx®, которые экспрессируют белок ΝΒ13, культивировали при прикреплении в 100 мм чашках. Клетки ΕΒx®, которые не экспрессируют белок ΝΒ13, не выживают в культуре, и большинство из них погибает после 6-7 суток в культуре. Только небольшая и стабильная доля ΕΒx®, экспрессирующих белок ΝΒ13, погибает в культуре, а большинство клеток ΝΒ13 ΕΒx® остается живым в течение более длительного периода в культуре (фиг. 11).

Claims (15)

1. Способ продуцирования в клетках птиц по меньшей мере одной молекулы антитела, фрагмента антитела или гибридного белка, включающего область, эквивалентную Рс-области иммуноглобулина, причем эта молекула антитела, фрагмент антитела или гибридный белок обладают повышенной Рс опосредованной клеточной токсичностью, где указанный способ включает стадии:
а) получение указанных клеток птиц путем трансфекции по меньшей мере одним экспрессионным вектором, экспрессирующим указанную молекулу антитела, фрагмент антитела или гибридный белок;
б) культивирование указанной клетки в пригодных условиях и в пригодной среде;
в) сбор указанной молекулы антитела, фрагмента антитела или гибридного белка из этой клетки птиц и из этой пригодной среды или как из указанной клетки птиц, так и из указанной среды, где указанные клетки птиц происходят из стабильных, прикрепленных или суспензионных, непрерывных клеточных линий, которые были получены путем культивирования ίη νίίΓΟ и экспансии эмбриональных стволовых клеток птиц с последующим прогрессивным исключением сыворотки, фидерных клеток и ростовых факторов из клеточной культуральной среды и адаптации клеток к суспензионной культуре.
2. Способ по п.1, где экспрессионный вектор дополнительно включает по меньшей мере одну экспрессионную кассету, содержащую, по меньшей мере, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую селективный маркер, оперативно сцепленную с промоторной последовательностью, способной к осуществлению экспрессии указанного селективного маркера в клетке-хозяине.
3. Способ по п.2, где селективный маркер выбран из гена глутаминсинтазы, ксантингуанинфосфорибозилтрансферазы, пуромицина, гигромицина В, неомицина и дигидрофолатредуктазы (ИНРК).
4. Способ по любому из пп.1-3, где промоторная последовательность выбрана из промотора цитомегаловируса (СМУ), раннего промотора обезьяньего вируса 40 (8У40), промотора тимидинкиназы вируса простого герпеса (Н8У), промотора вируса саркомы Рауса (К8У), промотора мышиной фосфоглицераткиназы, промотора е1Р4альфа, химерного промотора ЕР1альфа/НТЬУ, промотора САО, промотора бета-актина.
5. Способ по любому из пп.1-4, где указанная экспрессионная кассета(ы) дополнительно включает один или более регуляторный элемент или регуляторные последовательности, выбранные из группы, состоящей из последовательности инициации транскрипции, энхансерной последовательности, интронной последовательности, последовательности полиаденилирования, последовательности терминации, хроматинового изолирующего элемента.
6. Способ по п.5, где хроматиновый изолирующий элемент выбран из элементов границы (ВЕ), участка присоединения к матриксу (МАК), участка локусного контроля (ЬСК), универсальных элементов, открывающих хроматин (ИСОЕ).
7. Способ по любому из пп.1-6, где клетка дополнительно содержит экспрессионный вектор, включающий, по меньшей мере, экспрессионную кассету, содержащую последовательность ДНК, кодирующую антиапоптический белок, оперативно сцепленную с промоторной последовательностью, способной к осуществлению экспрессии указанного антиапоптического белка в клетке.
8. Способ по любому из пп.1-7, где экспрессионный вектор(ы) стабильно включен в хромосомную ДНК клетки.
9. Способ по любому из пп.1-8, где клетки птиц представляют собой куриные или утиные клетки.
10. Способ по любому из пп.1-9, где клетки птиц представляют собой суспензионные клетки, адаптированные к среде, свободной от сыворотки.
11. Способ по любому из пп.1-9, где клетки птиц представляют собой прикрепленные клетки, адаптированные к среде, свободной от сыворотки.
12. Способ по любому из пп.1-11, где клетки птиц трансфицируют путем электропорации по меньшей мере одним экспрессионным вектором в прикрепленной культуре в среде, свободной от сыворотки.
13. Способ по любому из пп.1-11, где клетки птиц трансфицируют путем трансфекции, опосредованной липосомами, по меньшей мере одним экспрессионным вектором в суспензионной культуре в среде, свободной от сыворотки.
14. Применение молекулы антитела, фрагмента антитела или гибридного белка, полученного согласно способу по любому из пп.1-13, для изготовления фармацевтической композиции для предупреждения или лечения заболеваний человека и животного.
15. Фармацевтическая композиция, содержащая молекулу антитела, фрагмент антитела или гибридный белок, полученные согласно способу по любому из пп.1-13, и фармацевтически приемлемый носитель.
EA200971056A 2007-05-21 2008-05-21 Способ продуцирования антител или гибридных белков в клетках птиц и применение полученных антител и белков EA017964B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP07301058A EP1995309A1 (en) 2007-05-21 2007-05-21 Recombinant protein production in avian EBx® cells
US3278608P 2008-02-29 2008-02-29
PCT/EP2008/056285 WO2008142124A1 (en) 2007-05-21 2008-05-21 Recombinant protein production in avian ebx® cells

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200971056A1 EA200971056A1 (ru) 2010-06-30
EA017964B1 true EA017964B1 (ru) 2013-04-30

Family

ID=38521438

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200971056A EA017964B1 (ru) 2007-05-21 2008-05-21 Способ продуцирования антител или гибридных белков в клетках птиц и применение полученных антител и белков

Country Status (15)

Country Link
US (1) US20100226912A1 (ru)
EP (2) EP1995309A1 (ru)
JP (1) JP2010529833A (ru)
KR (1) KR20100016540A (ru)
CN (1) CN101688179A (ru)
AU (1) AU2008252902B2 (ru)
BR (1) BRPI0810322A2 (ru)
CA (1) CA2687493A1 (ru)
EA (1) EA017964B1 (ru)
IL (1) IL202213A0 (ru)
MX (1) MX2009012747A (ru)
MY (1) MY159013A (ru)
NZ (1) NZ580820A (ru)
WO (1) WO2008142124A1 (ru)
ZA (1) ZA200908195B (ru)

Families Citing this family (74)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010081890A1 (en) 2009-01-19 2010-07-22 Innate Pharma Anti-kir3d antibodies
WO2010138184A2 (en) 2009-05-27 2010-12-02 Synageva Biopharma Corp. Avian derived antibodies
WO2011015918A2 (en) * 2009-08-03 2011-02-10 Avesthagen Limited Vectors and compounds for expression of recombinant cetuximab
WO2011015924A2 (en) * 2009-08-03 2011-02-10 Avesthagen Limited Vectors and compounds for expression of recombinant trastuzumab
JP5699377B2 (ja) * 2009-09-30 2015-04-08 国立大学法人帯広畜産大学 α−ガラクトースエピトープ発現ウイルス及びワクチンの作製方法
WO2011095596A1 (en) 2010-02-04 2011-08-11 Vivalis Fed-batch process using concentrated cell culture medium for the efficient production of biologics in eb66 cells
EP2374816B1 (en) 2010-04-07 2016-09-28 Agency For Science, Technology And Research Binding molecules against Chikungunya virus and uses thereof
WO2011124635A1 (en) 2010-04-07 2011-10-13 Humalys Binding molecules against chikungunya virus and uses thereof
AU2011288412A1 (en) 2010-08-13 2013-02-21 Medimmune Limited Monomeric polypeptides comprising variant Fc regions and methods of use
WO2012022734A2 (en) 2010-08-16 2012-02-23 Medimmune Limited Anti-icam-1 antibodies and methods of use
NZ604510A (en) 2010-08-17 2013-10-25 Csl Ltd Dilutable biocidal compositions and methods of use
WO2012095514A1 (en) * 2011-01-14 2012-07-19 Vivalis Recombinant protein production system
US20140287402A1 (en) 2011-06-27 2014-09-25 Valneva Method for screening cells
KR101982899B1 (ko) 2011-09-30 2019-05-27 테바 파마슈티컬즈 오스트레일리아 피티와이 엘티디 ＴＬ1ａ에 대한 항체 및 그의 용도
US9265817B2 (en) 2011-10-28 2016-02-23 Patrys Limited PAT-LM1 epitopes and methods for using same
US9580509B2 (en) 2011-11-07 2017-02-28 Medimmune, Llc Multispecific and multivalent binding proteins and uses thereof
MX355624B (es) 2011-12-22 2018-04-25 Hoffmann La Roche Combinaciones de elementos de vector de expresion, metodos novedosos de generacion de celulas de produccion y su uso para la produccion recombinante de polipeptidos.
SG10201805622QA (en) 2011-12-22 2018-08-30 Hoffmann La Roche Expression Vector Organization, Novel Production Cell Generation Methods And Their Use For The Recombinant Production Of Polypeptides
CN104244977A (zh) 2012-02-07 2014-12-24 先天制药公司 Mica结合剂
TWI775096B (zh) 2012-05-15 2022-08-21 澳大利亞商艾佛蘭屈澳洲私營有限公司 使用腺相關病毒(aav)sflt-1治療老年性黃斑部退化(amd)
KR20140015999A (ko) * 2012-07-27 2014-02-07 한화케미칼 주식회사 신규 ＭＡＲｓ 및 이를 이용하여 목적 단백질을 생산하는 방법
WO2014100073A2 (en) * 2012-12-21 2014-06-26 Merck Sharp & Dohme Corp. Expression vectors for recombinant protein production in mammalian cells
DK2951208T3 (da) 2013-02-01 2020-01-13 Kira Biotech Pty Ltd Anti-cd83 antistoffer og anvendelse deraf
JP6545105B2 (ja) 2013-02-07 2019-07-17 シーエスエル、リミテッド Ｉｌ−１１ｒ結合タンパク質及びその使用
US9534041B2 (en) 2013-02-12 2017-01-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Monoclonal antibodies that neutralize a norovirus
ES2747920T3 (es) 2013-02-14 2020-03-12 Innate Pharma Anticuerpo anti-NKP46 para diagnóstico de un linfoma de células T periféricas no cutáneo (PTCL)
US20160002345A1 (en) 2013-02-20 2016-01-07 Innate Pharma A compound that specifically binds to kir3dl2 for use in the treatment of peripheral t cell lymphoma
US9101597B2 (en) 2013-03-14 2015-08-11 The Administration Of The Tulane Educational Fund Immunoprotective primary mesenchymal stem cells and methods
US10000556B2 (en) 2013-05-09 2018-06-19 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Single-domain VHH antibodies directed to norovirus GI.1 and GII.4 and their use
WO2015050959A1 (en) 2013-10-01 2015-04-09 Yale University Anti-kit antibodies and methods of use thereof
CN113667013B (zh) 2013-10-02 2024-04-09 免疫医疗有限责任公司 中和抗甲型流感抗体及其用途
KR101591823B1 (ko) 2013-12-27 2016-02-04 재단법인 목암생명공학연구소 증가된 유전자 발현능을 갖는 발현벡터
IL259321B2 (en) 2014-03-17 2023-10-01 Univ Washington Preparations and methods for increasing gene expression in frogs
EP3169407A4 (en) 2014-07-15 2018-04-25 Medimmune, LLC Neutralizing anti-influenza b antibodies and uses thereof
WO2016030488A1 (en) 2014-08-27 2016-03-03 Innate Pharma Treatment of celiac disease
US9982061B2 (en) 2014-10-01 2018-05-29 Medimmune Limited Antibodies to ticagrelor and methods of use
CN104531699B (zh) * 2014-10-09 2017-03-15 河南农业大学 一种增强外源基因表达的猪的ucoe调控元件片段
NZ731491A (en) 2014-10-23 2021-12-24 Kira Biotech Pty Ltd Cd83 binding proteins and uses thereof
US10584175B2 (en) 2014-10-23 2020-03-10 La Trobe University FN14-binding proteins and uses thereof
WO2016090170A1 (en) 2014-12-05 2016-06-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services A potent anti-influenza a neuraminidase subtype n1 antibody
ES2784264T3 (es) 2014-12-17 2020-09-23 Fundacion Para La Investig Medica Aplicada Construcciones de ácido nucleico y vectores de terapia génica para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Wilson y otras afecciones
PL3233130T3 (pl) 2014-12-17 2021-11-22 Fundacion Para La Investigacion Medica Aplicada Konstrukty kwasów nukleinowych i wektory do terapii genowej do zastosowania w leczeniu choroby wilsona
CN114480502A (zh) 2015-03-02 2022-05-13 阿德夫拉姆生物技术股份有限公司 用于将多核苷酸玻璃体内递送到视网膜视锥的组合物和方法
CN107667114B (zh) 2015-06-01 2021-07-02 免疫医疗有限责任公司 中和抗流感结合分子及其用途
GB2545763A (en) 2015-12-23 2017-06-28 Adverum Biotechnologies Inc Mutant viral capsid libraries and related systems and methods
US20170267764A1 (en) 2016-03-15 2017-09-21 Innate Pharma Anti-mica antibodies
CL2016001661A1 (es) * 2016-06-29 2017-03-03 Univ Chile Promotor hibrido de ß-actina (de cricetulus griseus) y citomegalovirus (cmv), con región rica en dinucleótidos, citosina-guanina, vectores, líneas celulares, procedimiento para producir proteínas recombinantes.
IL264962B2 (en) 2016-08-23 2024-09-01 Medimmune Ltd Antibodies against VEGF-A and against ANG2 and their uses
US10919958B2 (en) 2016-08-23 2021-02-16 Medimmune Limited Anti-VEGF-A antibodies and uses thereof
KR20230173745A (ko) 2016-10-21 2023-12-27 이나뜨 파르마 에스.에이. 항-kir3dl2 작용제에 의한 치료
GB201710838D0 (en) 2017-07-05 2017-08-16 Ucl Business Plc Bispecific antibodies
WO2019109051A1 (en) 2017-12-01 2019-06-06 Encoded Therapeutics, Inc. Engineered dna binding proteins
CN108300704B (zh) * 2018-02-08 2022-04-05 华农（肇庆）生物产业技术研究院有限公司 一种用传代细胞系悬浮培养传染性支气管炎病毒的方法
EP3794127A1 (en) 2018-05-14 2021-03-24 Vivet Therapeutics Gene therapy vectors comprising s/mar sequences
WO2020074690A1 (en) 2018-10-12 2020-04-16 Vivet Therapeutics Codon-optimized transgene for the treatment of progressive familiar intrahepatic cholestasis type 3 (pfic3)
BR112021008434A2 (pt) 2018-11-07 2021-09-28 Vivet Therapeutics Transgene abcb11 otimizado por códon para o tratamento de colestase intra-hepática familiar progressiva tipo 2 (pfic2)
WO2020102723A1 (en) 2018-11-16 2020-05-22 Encoded Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating wilson's disease
SG11202104869SA (en) * 2018-11-23 2021-06-29 Valneva Se Food products comprising avian stem cells
JP2022516317A (ja) * 2019-01-04 2022-02-25 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド ファブリー病の処置のための方法及び組成物
CN110484546B (zh) * 2019-06-24 2021-05-14 四川农业大学 一种3型鸭甲肝病毒突变基因isa-c4334a及构建方法
AU2020299718A1 (en) 2019-07-02 2022-02-24 Fundacion Para La Investigacion Medica Aplicada cPLA2e inducing agents and uses thereof
MX2023000968A (es) 2020-08-06 2023-03-01 Fundacion Para La Investig Medica Aplicada Particulas virales para usarse en el tratamiento contra tauopatias tales como enfermedad de alzheimer mediante terapia genica.
US20230265456A1 (en) 2020-08-10 2023-08-24 Fundacion Para La Investigacion Medica Aplicada Gene therapy vector expressing cyp27a1 for the treatment of cerebrotendinous xanthomatosis
US20220098617A1 (en) * 2020-09-29 2022-03-31 NeuExcell Therapeutics Inc. Ascl1 vector
EP4221836A1 (en) * 2020-09-29 2023-08-09 Neuexcell Therapeutics Inc. Neurod1 and dlx2 vector
EP4221761A1 (en) * 2020-09-29 2023-08-09 Neuexcell Therapeutics Inc. Neurod1 combination vector
US20220106614A1 (en) * 2020-09-29 2022-04-07 NeuExcell Therapeutics Inc. Dlx2 vector
EP4222270A1 (en) * 2020-09-29 2023-08-09 Neuexcell Therapeutics Inc. Neurod1 vector
WO2022072324A1 (en) * 2020-09-29 2022-04-07 NeuExcell Therapeutics Inc. Isl1 and lhx3 vector
JP2023544264A (ja) 2020-10-09 2023-10-23 ユーシービー バイオファルマ エスアールエル 核酸構築物、ウイルスベクター及びウイルス粒子
EP4267197A1 (en) 2020-12-23 2023-11-01 Vivet Therapeutics Minimal bile acid inducible promoters for gene therapy
WO2022153212A1 (en) 2021-01-13 2022-07-21 Axon Neuroscience Se Antibodies neutralizing sars-cov-2
CN113215097B (zh) * 2021-06-24 2023-03-24 成都中医药大学 一种高比例b7h4阳性脐带间充质干细胞、其培养方法及培养液
CA3234666A1 (en) 2021-10-28 2023-05-04 UCB Biopharma SRL Nucleic acid constructs, viral vectors and viral particles

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003043415A1 (fr) * 2001-11-22 2003-05-30 Vivalis Systeme d'expression de proteines exogenes dans un systeme aviaire
WO2003076601A1 (fr) * 2002-03-08 2003-09-18 Vivalis Lignées de cellules aviaires utiles pour la production de substances d'intérêt
FR2861080A1 (fr) * 2003-10-20 2005-04-22 Lab Francais Du Fractionnement Anticorps presentant un taux de fucose et de galactose optimise
WO2006005367A1 (en) * 2004-07-14 2006-01-19 Igeneon Krebs-Immuntherapie Forschungs-Und Entwicklungs-Ag N-glycosylated antibody

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4515893A (en) * 1979-04-26 1985-05-07 Ortho Pharmaceutical Corporation Hybrid cell line for producing complement-fixing monoclonal antibody to human T cells
IL85035A0 (en) * 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US5720937A (en) * 1988-01-12 1998-02-24 Genentech, Inc. In vivo tumor detection assay
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5340740A (en) * 1992-05-15 1994-08-23 North Carolina State University Method of producing an avian embryonic stem cell culture and the avian embryonic stem cell culture produced by the process
ES2112431T3 (es) * 1992-08-21 1998-04-01 Genentech Inc Procedimiento para el tratamiento de un trastorno mediado por lfa-1.
US5736137A (en) * 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
FR2726003B1 (fr) * 1994-10-21 2002-10-18 Agronomique Inst Nat Rech Milieu de culture de cellules embryonnaires totipotentes aviaires, procede de culture de ces cellules, et cellules embryonnaires totipotentes aviaires
PT841392E (pt) * 1996-11-12 2004-11-30 Univ Auburn Vacina viva atenuada de neospora
US6946292B2 (en) * 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US20020108132A1 (en) * 2001-02-02 2002-08-08 Avigenics Inc. Production of a monoclonal antibody by a transgenic chicken
WO2004005493A1 (en) * 2002-07-09 2004-01-15 Baxter International, Inc. Animal protein free media for cultivation of cells
EP2248892B1 (en) * 2003-01-22 2015-04-22 Roche Glycart AG Fusion constructs and use of same to produce antibodies with increased FC receptor binding affinity and effector function
BRPI0607796A2 (pt) * 2005-02-18 2009-06-13 Medarex Inc composto ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, processo para preparação e uso do mesmo, e, composição farmacêutica
CA2605781A1 (en) * 2005-05-09 2007-04-12 Glycart Biotechnology Ag Antigen binding molecules having modified fc regions and altered binding to fc receptors
DK1945666T3 (da) * 2005-10-21 2013-07-01 Genzyme Corp Antistoffer med forøget antistofafhængig cellulær cytotoksicitetsaktivitet, fremgangsmåder til fremstilling af disse og anvendelse heraf

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003043415A1 (fr) * 2001-11-22 2003-05-30 Vivalis Systeme d'expression de proteines exogenes dans un systeme aviaire
WO2003076601A1 (fr) * 2002-03-08 2003-09-18 Vivalis Lignées de cellules aviaires utiles pour la production de substances d'intérêt
FR2861080A1 (fr) * 2003-10-20 2005-04-22 Lab Francais Du Fractionnement Anticorps presentant un taux de fucose et de galactose optimise
WO2006005367A1 (en) * 2004-07-14 2006-01-19 Igeneon Krebs-Immuntherapie Forschungs-Und Entwicklungs-Ag N-glycosylated antibody

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DAVIES J. ET AL.: "Expression of GnTIII in a recombinant anti-CD20 CHO production cell line: Expression of antibodies with altered glycoforms leads to an increase in ADCC through higher affinity for FC gamma RIII". BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING - COMBINATORIAL CHEMISTRY, WILEY, NEW YORK, NY, US, vol. 74, no. 4, 20 August, 2001 (2001-08-20), pages 288-294, XP002285964, the whole document *
MICHAEL BUTLER: "Animal cell cultures: recent achievements and perspectives in the production of biopharmaceuticals". APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, SPRINGER-VERLAG, BE, vol. 68, no. 3, 1 August, 2005 (2005-08-01), pages 283-291, XP019331930, ISSN: 1432-0614, page 286, last paragraph - page 288, paragraph 2 *
PAIN B. ET AL.: "CHICKEN EMBRYONIC STEM CELLS AND TRANSGENIC STRATEGIES". CELLS TISSUES ORGANS, KARGER, BASEL, CH, vol. 165, 1999, pages 212-219, XP000882175, ISSN: 1422-6405, page 215-page 217 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2008142124A1 (en) 2008-11-27
MY159013A (en) 2016-11-30
NZ580820A (en) 2012-01-12
JP2010529833A (ja) 2010-09-02
IL202213A0 (en) 2010-06-16
BRPI0810322A2 (pt) 2014-10-14
CA2687493A1 (en) 2008-11-27
AU2008252902B2 (en) 2013-04-04
CN101688179A (zh) 2010-03-31
EP2152855A1 (en) 2010-02-17
MX2009012747A (es) 2010-02-24
KR20100016540A (ko) 2010-02-12
ZA200908195B (en) 2010-07-28
US20100226912A1 (en) 2010-09-09
AU2008252902A1 (en) 2008-11-27
EP1995309A1 (en) 2008-11-26
EA200971056A1 (ru) 2010-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA017964B1 (ru) Способ продуцирования антител или гибридных белков в клетках птиц и применение полученных антител и белков
EP0931162B1 (en) Production of a multimeric protein by cell fusion method
US7429380B2 (en) Production of a multimeric protein by cell fusion method
EP1850659B1 (en) Long term culture of chicken primordial germ cells
JPWO2002092812A1 (ja) ヒト抗体λ軽鎖遺伝子を含むヒト人工染色体、および子孫伝達可能な該ヒト人工染色体を含む非ヒト動物
US20230110342A1 (en) Compositions and methods of stimulating and expanding t cells
KR20080113279A (ko) 인간 태아 간 줄기 세포가 주입된 면역결핍 동물에서 항체를 생성시키는 방법
JP6775224B2 (ja) マウス人工染色体ベクター及びその使用
JP2005224240A (ja) ノックアウト非ヒト動物から樹立された不死化細胞株
KR102363891B1 (ko) ＨＯ-1 유전자 및 ＴＮＦＲ1-Ｆｃ 유전자를 동시에 발현하며 GGTA1 유전자 및 CMAH 유전자가 넉아웃된 형질전환 돼지 및 이의 용도
US10717991B2 (en) Transgenic pig which simultaneously expresses HO-1 gene and TNFR1-Fc gene, and comprises knocked-out GGTA1 gene, and use thereof
AU2012201824B2 (en) Transgenic chickens
WO2009111086A1 (en) Transgenic non-human mammals with kappa light chain of xenogenous immunoglobulin
AU768101B2 (en) Production of a multimeric protein by cell fusion method
AU2014216037A1 (en) Transgenic chickens

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU