KR20080113279A - 인간 태아 간 줄기 세포가 주입된 면역결핍 동물에서 항체를 생성시키는 방법 - Google Patents
인간 태아 간 줄기 세포가 주입된 면역결핍 동물에서 항체를 생성시키는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 면역결핍 비-인간 동물로부터 인간 단일클론성 항체를 생성시키는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 신생의 면역결핍 비-인간 동물을 인간 태아 간 줄기 세포(FL 세포)와 접촉시켜 면역 이식된 비-인간 동물(재구성된 동물)을 발생시키는 단계, 이어서 상기 재구성된 동물을 항원과 접촉시키는 단계, 상기 재구성된 동물로부터 상기 항원에 대한 인간 항체를 생성하는 인간 세포를 모으는 단계, 및 상기 항체 생성 세포로부터 상기 항체를 단리시키는 단계를 포함한다.
Description
본 발명은 항체 생성 방법, 항체 생성 세포의 조성물, 이들의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.
단일클론성 항체(MAB)는 암, 감염 또는 자가면역 질환 등의 면역요법에서 마법의 탄환으로서 오랫동안 간주되어 왔다. 그러나, 인간에 사용되는 뮤린 항체의 제 1 세대는 인간 항-마우스 면역 반응으로 인해 다소 실패하였다.
인간 항체는 주로 한정된 세트의 인간 Ig 유전자가 잠복되어 있는 유전자이전 마우스로부터 유래되거나 또는 파지 디스플레이, 효모 디스플레이 또는 유사한 재조합 기법을 사용하여 풍부한 인공 항체 라이브러리로부터 선택되어 왔다. 이러한 전략들은 인간 배경에서 단일클론성 항체에 대한 임의의 면역 반응을 제거하도록 설계되어 있다. 인간 항체는, 면역화될 때 내인성 면역글로불린 생성의 부재하에 인간 항체를 생성할 수 있는 유전자이전 동물(예컨대, 마우스)에서 생성될 수 있다. 인간 생식 계열 면역글로불린 유전자 정렬의 상기 생식 계열 유전자이전 마우스에서의 전이는 항원 공격시에 인간 항체를 생성시킨다(예컨대, 문헌[van Dijk, M.A. and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374], 문헌[Jakobovits, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555], 문헌[Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258] 및 문헌[Bruggemann, M., et al., Year Immunol. 7 (1993) 33-40]을 참고한다). 또한, 인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리에서 생성될 수 있다(문헌[Hoogenboom, H.R. and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388] 및 문헌[Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597]). 또한, 인간 단일클론성 항체의 제조를 위해 콜(Cole) 등 및 보에르너(Boerner, P.) 등의 기법을 이용할 수 있다(콜 등의 문헌[Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)] 및 보에르너 등의 문헌[J. Immunol. 147 (1991) 86-95]). 그러나, 상기 유전자이전 마우스는 단지 한정된 세트의 인간 Ig 유전자를 갖는 항체, 즉 트렌스펙션된 면역글로불린 유전자 정렬로부터 발생하는 것들을 제공할 수 있을 뿐이다.
인간 면역글로불린 유전자를 위한 마우스의 유전자이전을 기초로 하는 방법론은 인간 생식 계열 서열로부터 유래된 항체의 발생을 허용하며, 이는 뮤린 또는 마우스-인간 키메라 항체와 비교하여 생성된 항체 약물의 면역원성을 감소시키는 것으로 보고되어 있다. 그러나, 천연 인간 면역 레퍼토리와 비교하여 유전자이전 마우스-유래된 인간 항체는 그들의 다양성, 친화성 및 특이성 면에서 제한된다.
유사하게, 파지 또는 효모 디스플레이에 기초한 조합 라이브러리 접근의 주 요 단점은 항체 중질 및 경질 쇄의 무작위 짝짓기이다. 원래의 항체 중질 및 경질 쇄 짝짓기, 즉 비-동족 짝짓기의 분리는 높은 친화성을 갖는 중질 및 경질 쇄 짝을 식별하기 위해 다수의 클론들의 선별을 필요로 한다. 또한, 그러한 비-동족 짝은 인간 자가-항원에 대해 원하지 않는 교차-반응성을 보일 수 있다. 마지막으로, 조합 라이브러리의 선택 및 선별에 의해 식별된 표적-특이적 항체의 유전적 다양성은 고유의 선택 오차로 인해 통상적으로 제한된다.
문헌[Traggai, E. et al., Science 304 (2004) 104-107]에서는 백신 또는 살아있는 감염성 병원체 및 인간 면역 체계를 표적으로 하는 약리학적 화합물에 대한 반응을 평가하기 위한 임상전 모델로서 사용될 수 있는, 인간 제대혈 세포-이식된 Rag 2-/-γc-/-마우스에서 인간 면역 체계의 발달 방법을 기재하고 있다. 이는, 재구성되고 연이어 병원체 백신접종된 마우스가 낮은 수준으로 파상풍 변성독소 특이적 항체를 생성할 수 있음을 보여주었다.
발명의 개요
본 발명은 면역결핍 비-인간 동물로부터 인간 단일클론성 항체를 생성시키는 방법을 포함하며, 상기 방법은 신생의 면역결핍 비-인간 동물을 인간 태아 간 줄기 세포(FL 세포)와 접촉시켜 면역 이식된 비-인간 동물(재구성된 동물)을 발생시키는 단계, 이어서 상기 재구성된 동물을 항원과 접촉시키는 단계, 상기 재구성된 동물로부터 상기 항원에 대한 인간 항체를 생성하는 인간 세포를 모으는 단계, 및 상기 항체 생성 세포로부터 상기 항체를 단리시키는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명은 상기 항체 생성 세포의 확립시에 바람직하게는 형질전환 방법 또는 세포 융합 방법에 의한 불멸 항체 생성 세포를 특징으로 하는 본 발명에 따른 방법을 포함한다. 바람직하게는, 상기 불멸 세포는 50 계대(passage) 이상 동안 생존할 수 있다.
바람직하게는 상기 비-인간 동물은 설치류이고, 보다 바람직하게는 마우스, 래트 또는 토끼이다. 마우스가 Rag 2-/-γc-/-, 누드 Rag 2-/-, NOD(NOD는 본 발명에 따라 바람직하게는 NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Prf1 tm1Sdz /SzJ를 의미한다) 또는 SCID 베이지 마우스이고, 래트가 누드 래트인 것이 바람직하다.
본 발명은 상기 FL 세포가 인간 조혈 태아 간 줄기 세포(HFL 세포), 바람직하게는 CD 133+, CD 117+, CD 31+ 및/또는 CD 34+인 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 방법을 포함한다.
추가의 실시양태에서, 본 방법은 바람직하게는 상기 FL 세포가 HFL 세포 및 인간 비 조혈 태아 간 줄기 세포의 조합인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 상기 항체 생성 세포가 인간 B-세포인 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 방법을 포함한다.
본 발명은 상기 FL 세포가 접촉을 위해 동물로 복강내, 피하 또는 간내 주입되는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 방법을 포함한다.
본 발명은 항원이 폴리펩타이드, MHC/펩타이드 복합체 또는 DNA인 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 방법을 포함한다.
본 발명은 항원이 항원, 항원 단편, 항원 암호화 DNA 및/또는 항원 함유 세포로서 재구성된 동물과 접촉하는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 방법을 포함한다.
본 발명은 면역결핍 비-인간 동물을 치사량에 가깝게 FL 세포와 접촉시키기 전에 조사하는 것을 특징을 하는 본 발명에 따른 방법을 포함한다.
본 발명은 마우스가 FL 세포와 접촉 한 후 5 내지 18주에 상기 마우스를 항원과 처음으로 접촉시키는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 방법을 포함한다.
본 발명은 마우스를 항원과 10회 이하로 접촉시키는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 방법을 포함한다.
본 발명은 상기 모아진 세포가 인간 CD 19+ 또는 CD 22+ 세포인 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 방법을 포함한다.
본 발명은 상기 세포가 하이브리도마 기법에 의해 확립된 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 방법을 포함한다.
본 발명은 융합 파트너 세포주가 MFP-2, HK-128, K6H6/B5 또는 카퍼스(Karpas) 707 세포주인 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 방법을 포함한다.
본 발명은 항원에 대한 완전한 다수의 인간 항체를 생성하는 다수의 인간 B 세포의 생성 방법을 포함하며, 상기 방법은 신생의 면역결핍 비-인간 동물을 FL 세포와 접촉시켜 면역재구성된 동물을 발생시키는 단계, 이어서 상기 재구성된 동물을 항원과 접촉시키는 단계, 상기 인간 B 세포를 모으는 단계, 및 상기 완전한 다 수의 항체를 생성시키는 단계를 특징으로 한다.
본 발명은 본 발명에 따른 불멸 세포를 생성하는 항원의 생성에 있어서 비-인간 동물의 용도를 포함한다. 불멸 세포가 하이브리도마 세포인 경우, 하이브리도마 발생을 위한 하나의 융합 파트너는 상기 이식되고 재구성된 동물로부터의 인간 B 세포이고, 다른 융합 파트너는 예컨대 인간, 설치류 또는 다른 동물로부터의 골수종 세포이다. 다르게는, 불멸의 이식되고 재구성된 B 세포는 EBV 형질전환에 의해 발생된다.
본 발명은 인간 단백질에 대한 완전한 다수의 인간 항체를 생성하는 다수의 인간 B 세포를 포함한다.
본 발명은 인간 단백질에 대한 완전한 다수의 인간 항체를 제공하는 불멸 세포의 조성물을 포함한다.
본 발명은 인간 단백질에 대한 완전한 다수의 인간 항체를 생성하는 다수의 불멸 B 세포의 생성에 있어서 재구성된 동물의 용도를 포함한다.
본 발명은 비-인간 동물에서 단일클론성 인간 항체를 발생 및 생성시키는 방법을 포함하며, 상기 항체는 상기 비-인간 동물의 상응하는 단백질에 대해 80% 이상, (블라스트(BLAST)) 상동성인 인간 단백질(단편 포함)에 대해 유도된다. 이러한 예로는 CXCR5가 있다. 인간 및 뮤린 CXCR5는 84% 상동한다. 따라서, 본 발명은 고도의 보전성 단백질 또는 단백질 영역에 대해, 심지어 그의 단백질 또는 단편이 인간과 상기 비-인간 동물간에 적어도 95% 이상 또는 심지어 100% 상동하는 경우에도, 인간 항체를 발생시키는 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명의 추가의 목적은 비-인간 동물, 바람직하게는 마우스, 래트 및/또는 토끼의 상응하는 단백질에 대해 95% 이상, 바람직하게는 98%, 심지어 100% 상동 (블라스트)을 갖는 인간 단백질에 대해 특이적인 단일클론 인간 항체이다. 본 발명의 바람직한 목적은 상응하는 뮤린(마우스) 단백질에 대해 95% 이상, 보다 바람직하게는 98%, 심지어 100% 상동 (블라스트)을 갖는 인간 단백질에 대해 특이적인 단일클론성 인간 항체이다.
본 발명은 신생의 면역결핍 비-인간 동물을 FL 세포와 접촉시키는 단계, 이어서 상기 비-인간 동물을 항원과 접촉시키는 단계, 상기 비-인간 동물로부터 상기 항원에 대한 인간 항체를 생성하는 인간 세포를 모으는 단계, 상기 항체를 단리하는 단계, 가변 영역을 서열 분석하는 단계, 인간 불변 쇄와 합쳐진, 중질 및/또는 경질 쇄 적어도 CDR을 암호화하는 발현 벡터를 구성하는 단계, 상기 벡터를 적절한 숙주 세포에서 발현시키는 단계 및 상기 숙주 세포 또는 발효 상청액으로부터 상기 항체(면역 반응성 단백질)를 단리하는 단계를 특징으로 하는 항체의 재조합 생성 방법을 포함한다.
본 발명은 신생의 면역결핍 비-인간 동물을 FL 세포와 접촉시키는 단계, 이어서 상기 비-인간 동물을 항원과 접촉시키는 단계, 상기 비-인간 동물로부터 상기 항원에 대한 인간 항체를 생성하는 인간 세포를 모으고, 상기 인간 항체를 생성하는 인간 세포로부터 mRNA를 단리하는 단계, (예컨대, 면역글로불린 특이적 프라이머를 사용함으로써) 항체 특이적 cDNA를 발생시키는 단계, 인간 불변 쇄와 합쳐진, 중질 및/또는 경질 쇄 적어도 CDR을 암호화하는 발현 벡터를 구성하는 단계, 상기 벡터를 적절한 숙주 세포에서 발현시키는 단계 및 상기 숙주 세포 또는 발효 상청액으로부터 상기 항체(면역 반응성 단백질)를 단리하는 단계를 특징으로 하는 항체의 재조합 생성 방법을 포함한다.
본 발명은 항원에 대해 특이적 결합을 보이는 인간 항체를 생성하는 불멸 세포의 선택 방법을 포함하며, 상기 방법은 완전한 다수의 인간 항체를 생성하는 비-인간 동물의 비장으로부터 다수의 인간 B 세포를 제공하는 단계, 상기 세포 또는 그의 하위세트를 불멸의 골수종 세포와 융합하거나 상기 B 세포 또는 그의 하위세트를 EBV 형질전환에 의해 불멸화하는 단계, 및 상기 항원에 대해 특이적 결합을 보이는 인간 항체를 생성하는 하이브리도마 세포를 선택하는 단계를 특징으로 한다.
본 발명은 1.5㎍/ml 이상의 양으로 항원에 대해 10-6 몰/l 이상의 특이적 결합 친화성을 보이는 항체를 생성하는 불멸 세포의 선택 방법을 포함하며, 상기 방법은 완전한 다수의 인간 항체를 생성하는 비-인간 동물의 비장으로부터 다수의 인간 B 세포를 제공하는 단계, 상기 세포 또는 그의 하위세트를 불멸의 골수종 세포와 융합하거나 상기 B 세포 또는 그의 하위세트를 EBV 형질전환에 의해 불멸화하는 단계, 및 항원에 대해 10-6 몰/l 이상의 특이적 결합 친화성을 보이는 항체를 생성하는 하이브리도마 세포를 선택하는 단계를 특징으로 한다.
바람직하게는, 단리된 항체의 양은 1.5㎍/ml 이상이다.
바람직하게는, 항체는 상기 항원에 대해 10-9 몰/l 이상의 특이적 결합 친화 성을 보인다.
도 1: 접목 후 15번째 주에 재구성된 마우스의 말초혈의 유세포 분석.
인간 조혈 세포 접목. 막대 그래프는, 항 인간 CD45-FITC mAb로 염색된 재구성 후 15주에 3 마리의 대표적인 동물들로부터의 생존가능한 관문(gated) 말초혈 세포의 중첩(채워진 면적), 또는 중첩된 막대 그래프 통계량을 산출하기 위해 분모 막대 그래프로서 사용되는 동형-일치된 무관계 대조군 mAb를 갖는 동일한 동물로부터 염색된 배경(검은 선)을 보여준다. 통계량은 관문 내의 총 사건의 수와 비교하여 지정된 구획(M1, M2)에서의 사건의 수 및 퍼센트를 표시한다. 평균 형광 강도를 보여주고 있다.
A:
분자 막대 그래프
파일: 프로브.002
X 매개변수: 항-hu-CD45-FITC
분모 막대 그래프
파일: 프로브.001
X 매개변수: 항-hu-CD45-FITC
| 표지자 | 사건 | 관문(%) |
| 모두 | 18110 | 108.79 |
| M1 | 16705 | 100.35 |
| M2 | 860 | 5.17 |
B:
분자 막대 그래프
파일: 프로브.004
X 매개변수: 항-hu-CD45-FITC
분모 막대 그래프
파일: 프로브.003
X 매개변수: 항-hu-CD45-FITC
| 표지자 | 사건 | 관문(%) |
| 모두 | 14622 | 231.91 |
| M1 | 11833 | 187.68 |
| M2 | 2136 | 33.88 |
C:
분자 막대 그래프
파일: 프로브.006
X 매개변수: 항-hu-CD45-FITC
분모 막대 그래프
파일: 프로브.005
X 매개변수: 항-hu-CD45-FITC
| 표지자 | 사건 | 관문(%) |
| 모두 | 4181 | 95.59 |
| M1 | 2992 | 68.40 |
| M2 | 844 | 19.30 |
도 2: 재구성된 마우스에서 인간 항체의 생성 능력의 시험.
도 3: 면역화 후 7번째 주에 재구성된 마우스의 말초혈 중의 인간 항원 특이 적 항체의 유세포 분석.
음성 대조군(두 번째 막대 그래프(B))으로서 대조군 마우스의 정상 혈청 (NMS) 또는 양성 대조군(위의 막대 그래프(A))으로서 정제된 항원 특이적 항체와 비교하여 하나의 대표적인 재구성되고 면역화된 마우스의 상이한 혈청 희석(1/20(C) 및 1/150(D))으로 염색된 항원 양성 세포의 비율(%)을 보여준다. 통계량은 관문 내의 총 사건의 수와 비교하여 지정된 구획(M1 및 M2 표지자는 각각 항원에 대한 양성 또는 음성 염색된 세포를 보여준다)에서의 사건의 수 및 퍼센트를 표시한다. 평균 형광 강도를 보여주고 있다.
A: 양성 대조군
분자 막대 그래프
총 사건: 6764
분모 막대 그래프
총 사건: 7072
| 표지자 | 관문(%) | 총(%) |
| 모두 | 95.54 | 95.05 |
| M1 | 2.02 | 2.01 |
| M2 | 93.55 | 93.07 |
B: 음성 대조군 NMS
분자 막대 그래프
총 사건: 7093
분모 막대 그래프
총 사건: 7072
| 표지자 | 관문(%) | 총(%) |
| 모두 | 100.38 | 99.87 |
| M1 | 99.33 | 98.83 |
| M2 | 1.08 | 1.07 |
C: 혈청 마우스 1(1/20) 대 NMS
분자 막대 그래프
총 사건: 15544
분모 막대 그래프
총 사건: 7093
| 표지자 | 관문(%) | 총(%) |
| 모두 | 160.13 | 159.45 |
| M1 | 125.33 | 124.80 |
| M2 | 34.84 | 34.70 |
D: 혈청 마우스 1(1/150) 대 NMS
분자 막대 그래프
총 사건: 7102
분모 막대 그래프
총 사건: 7093
| 표지자 | 관문(%) | 총(%) |
| 모두 | 100.03 | 99.61 |
| M1 | 92.18 | 91.79 |
| M2 | 7.86 | 7.82 |
도 4: 재구성된 마우스에서 인간 CXCR5 항체의 생성 능력의 시험.
도 5: 제 3의 면역화 후 재구성된 마우스에서 인간 CXCR5 특이적 항체의 생성 능력의 시험.
용어 "완전한 다수의 인간 항체" 또는 "인간 면역글로불린 유전자"는
- 염색체 2번 상의 2p11에서 20개 이상, 바람직하게는 31 내지 33개의 카파 유전자로부터의 카파 쇄(76개의 유전자, 이 중 31 내지 35개가 기능적이다),
- 염색체 22번 상의 22q11 위치에서 20개 이상, 바람직하게는 29 내지 33개의 람다 유전자, 및 J 유전자로부터의 람다 쇄(4 내지 5개의 기능성 람다 쇄 유전자가 있으며, 각각은 람다 J 유전자에 앞선다), 및
- 염색체 14번 상의 14q32에서 5개 이상, 바람직하게는 9개 이상의 중질 유전자로부터의 중질 쇄(11개의 중질 쇄 유전자, 이 중 9개가 기능적이며 각각 9개의 중질 쇄 동형 μ, δ, γ1, γ2, γ3, γ4, α1, α2 및 ε에 상응한다)
를 포함하거나 암호화하는 항체 또는 면역글로불린 유전자를 지칭한다.
예를 들면, 항원은 인간 단백질, 호르몬, 종양-관련 당지질(예컨대, 미국 특허 제 5,091,178 호) 또는 자연적으로 발생하는 인간 대사에 수반되는 다른 물질과 같은 인간으로부터 유래되는 물질일 수 있다. 또한, 항원은 건강한 인간에 의해 내성이 생긴 비-인간 유래된 물질일 수 있어서, 이러한 인간은 상기 항원을 검출할 수 있는 정도로 항체를 발달시키지 않는다.
용어 "인간 단백질(폴리펩타이드를 포함함)"은 자가면역 질환에 자연적으로 내성이 생기거나 상기 질환에 걸린 인간의 임의 단백질을 지칭한다. 용어 "인간 단백질"은 당해 분야의 숙련자의 지식에 따라 본 발명에 따른 적합한 비-인간 동물에서 상기 인간 단백질에 대해 특이적인 항체를 유도할 수 있는 상기 단백질의 단편을 또한 포함한다. 이러한 단편은, 예를 들면 보다 큰 단백질 중에 포함될 수 있으며, 예컨대 인간 단백질에 대한 항체는 마우스와 같은 다른 종으로부터의 상동성 단백질에 의한 면역화에 의해 유도될 수 있는 것으로 공지되어 있다. 인간 단백질은 바람직하게는 내성이 생긴 인간 단백질이다.
용어 "내성이 생긴 인간 단백질"은 구드패스츄어 증후군(Goodpasture's Syndrome), 인슐린 의존 당뇨병(IDDM), 면역 용혈성 빈혈, 면역 혈소판감소 자색반, 중증 근육무력증(MG), 다발 경화증(MS), 류마티스 관절염, 전신 홍반 루프스(SLE) 또는 갑상샘중독증(그레이브스 병(Graves' disease))과 같은 자가면역 질환에 자연적으로 내성이 생기거나 상기 질병에 걸리지 않는 인간의 단백질을 지칭한다.
예를 들면, 인간 단백질은 성장 인자와 같은 막통과 분자(예컨대, 수용체) 또는 리간드일 수 있다. 전형적인 항원은 분자, 예컨대 레닌; 성장 호르몬, 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상샘 호르몬; 갑상샘 자극 호르몬; 지질단백질; 알파-1-항트립신; 인슐린 A-쇄; 인슐린 B-쇄; 전구인슐린; 난포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체 형성 호르몬; 글루카곤; 응고 인자, 예컨대 인자 VIII, 인자 IX, 조직 인자(TF) 및 폰 빌레블란드(von Willebrand) 인자; 항응고 인자, 예컨대 단백질 C; 심방성 나트륨 이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성제, 예컨대 우로키나제 또는 인간 뇨 또는 조직-형 플라스미노겐 활성제(t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 엔케팔리나제(enkephalinase); RANTES(발현 및 분비된 정상 T-세포의 활성화에 대한 조절(regulated on activation normally T-cell expressed and secreted)); 인간 대식세포 염증성 단백질(MIP-1-알파); 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민; 뮬러리안(Muellerian)-억제 물질; 이완 A-쇄; 이완 B-쇄; 전이완(prorelaxin); 마우스 생식샘자극호르몬-관련 펩타이드; 미생물 단백질, 예컨대 베타-락타마제; DNase; IgE; 세포독성 T-림프구 관련 항원(CTLA), 예컨대 CTLA-4; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자(VEGF); 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체; 단백질 A 또는 D; 류마티스 인자; 향신경 인자, 예컨대 뼈-유래된 향신경 인자(BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5 또는 -6(NT-3, NT-4, NT-5 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-b; 혈소판-유래된 성장 인자(PDGF); 섬유모세포 성장 인자, 예컨대 aFGF 및 bFGF; 표피 성장 인자(EGF); 전환 성장 인자(TGF), 예컨대 TGF-알파 및 TGF-베타(TGF-b1, TGF-b2, TGF-b3, TFG-b4 또는 TGF-b5 포함); 종양 괴사 인자(TNF), 예컨대 TNF-알파 또는 TNF-베타; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II; 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질; CD 단백질, 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD22 및 CD40; 적혈구생성인자; 골유도 인자; 면역독소; 뼈 형성 단백질(BMP); 인터페론, 예컨대 인터페론-알파, -베타 및 -감마; 콜로니 자극 인자(CSF), 예컨대 M-CSF, GM-CSF 및 G-CSF; 인터루킨(IL), 예컨대 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9 및 IL-10; 수퍼옥사이드 디스뮤타제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 붕괴 촉진 인자; 바이러스 항원, 예컨대 AIDS 외피의 일부; 운반 단백질; 귀소 수용체; 어드레신; 조절 단백질; 인테그린, 예컨대 CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 및 VCAM; 종양 관련 항원, 예컨대 HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 및 상기 기재된 임의의 단백질의 단편을 포함한다. 추가의 인간 단백질은 ErbB 수용체 과, 예컨대 EGF 수용체, HER2, HER3 또는 HER4 수용체의 일원; DR5를 포함한, 종양 괴사 수용체 상과의 일원; 전립샘 줄기 세포 항원(PSCA); 세포 부착 분자, 예컨대 LFA-1, Mac1, p150.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, 알파4/베타7 인테그린, 및 알파v/베타3 인테그린(그의 알파 또는 베타 아단위 중 하나를 포함함)(예컨대, 항-CD11a, 항-CD18 또는 항-CD11b 항체); 조직 인자(TF); 알파 인터페론(알파-IFN); 인터루킨, 예컨대 IL-8; IgE; 혈액형 항원; flk2/flt3 수용체; 비만(OB) 수용체 또는 mp 1 수용체이다.
용어 "불멸 세포"는 EDV 형질전환, 텔로메라아제 대체 또는 레트로바이러스 불멸화와 같은 다른 수단에 의해 불멸화된 세포 또는 하이브리도마 세포를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "동물"은 비-인간 동물, 바람직하게는 설치류, 특히 바람직하게는 마우스 또는 래트를 지칭한다.
바람직하게는, 상기 비-인간 동물은 설치류이고, 보다 바람직하게는 마우스, 래트 또는 토끼이다. 마우스가 Rag2-/-γc-/-, 누드 Rag 2-/-, NOD 또는 SCID 베이지 마우스이고, 래트가 누드 래트인 것이 더욱 바람직하다.
SCID 베이지는 V(D)J 재조합시의 결함으로 인해 T 및 B 림프구의 결핍을 유발하는 중증 혼합 면역결핍(scid) 돌연변이를 갖는 이중 돌연변이주 마우스이다. 이는 또한 NK 세포 기능의 선택적 손상뿐만 아니라 세포독성 T 세포 및 대식세포 결함이 생성되는 베이지 돌연변이를 갖는다. SCID 베이지 마우스는 인간 조혈 세포의 수용을 위한 잠재적으로 개선된 모델이다.
바람직한 NOD 마우스는 NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Prf1 tm1Sdz /SzJ, NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl /SzJ, NOD.129S7(B6)-Rag1 tm1Mom /J, NOD.Cg-Prkdc scid B2m tm1Unc /J 및 NOD.CB-17-Prkdc scid /SzJ이다. 모든 균주에는 성숙 T 및 B 세포가 없고, 검출할 수 있는 NK 세포독성 활성을 갖지 않는다. 인간 조혈 세포와의 접목이 강화된 균주 지지체는 비교적 긴 수명을 갖고, 유의적으로 조사에 대해 보다 저항적이다.
Rag2는 T 및 B 세포에서 기능성 항원 수용체를 발생시키는 V(D)J 유전자 재정렬을 위해 필수적이고; 동종접합 Rag2-/- 돌연변이주는 성숙한, 기능성 T 및 B 세포를 갖지 않는다. 공통 감마(γc) KO 마우스에는 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 및 IL-15를 포함한 다수의 시토카인에 대한 기능성 수용체가 없다. 결과적으로 림프구 발달이 크게 손상된다. 마우스에는 자연 살상(NK) 세포가 없고 단지 적은 수의 T 및 B 세포를 생성한다.
본원에서 사용되는 용어 "인간 항체"는 생식 계열 서열과의 높은 서열 유사성 또는 동일성으로 인해 한정된 인간 생식 계열 면역글로불린 서열로 할당될 수 있는 가변 및 불변 영역(도메인)을 갖는 항체를 포함한다. 인간 항체는 다양한 형태의 항체, 바람직하게는 본 발명에 따른 특징적인 성질을 보유하는 한 비제한적으로 전체 항체, 단일 중질 또는 경질 쇄, 항체 단편, 분류-변경 항체 및 유전 공학처리된 항체(변형체 또는 돌연변이주 항체)를 포함한 단일클론성 항체를 포함한다. 재조합 인간 항체가 특히 바람직하다. 본원에서 사용되는 용어 "단일클론성 항체"는 모두 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 항체 분자의 제제를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 또는 단리되는 모든 인간 항체를 포함하는 것으로 의도되며, 예를 들면 숙주 세포, 예컨대 NS0, HEK 293 또는 CHO 세포로부터 단리된 항체가 있으며, 이때 상기 세포는 상기 항체의 중질 및/또는 경질 쇄를 발현할 수 있고 상기 숙주 세포로 트렌스펙션될 수 있는 재조합 발현 벡터를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 재정렬된 형태에서 가변 및 불변 영역을 갖는다. 본 발명에 따른 재조합 인간 항체는 생체 내 체성 과다돌연변이를 겪어 왔다. 따라서, 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 한정된 인간 생식 계열 VH 및 VL 서열로 할당될 수 있지만 생체 내 인간 항체 생식 계열 레퍼토리내에 자연적으로 존재할 수 없는 서열이다.
본원에서 사용되는 용어 "가변 영역(경질 쇄의 가변 영역(VL), 중질 쇄의 가변 영역(VH))"은 직접적인 항원에 대한 항체의 결합에 관련되는 각각의 경질 및 중질 쇄 쌍을 의미한다. 가변 인간 경질 및 중질 쇄의 도메인은 동일한 일반 구조를 가지며, 각각의 도메인은 서열이 3개의 "과가변 영역"(또는 상보성 결정 영역, CDR)에 의해 넓게 보존되고 연결되어 있는 4개의 골격(FR) 영역을 포함한다. 골격 영역은 β(베타)-시트 형태를 채택하고 있으며, CDR은 β-시트 구조를 연결하는 루프를 형성할 수 있다. 각각의 쇄에서의 CDR은 골격 영역에 의해 그들의 3차원 구조를 유지하며, 다른 쇄로부터 상기 CDR과 함께 항원 결합 부위를 형성한다. 항체 중질 및 경질 쇄 CDR3 영역, 바람직하게는 중질 쇄 CDR3은 본 발명에 따른 항체의 결합 특이성/친화성에 특히 중요한 역할을 하고, 따라서 이는 본 발명의 추가의 목적을 제공한다.
본원에서 사용되는 경우 용어 "과가변 영역" 또는 "항체의 항원-결합 부분"은 항원-결합을 초래하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 과가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. "골격" 또는 "FR" 영역은 본원에서 정의되는 과가변 영역 잔기 이외의 그것의 가변 도메인 영역이다. 따라서, 항체의 경질 및 중질 쇄는 N-말단으로부터 C-말단까지 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. CDR 및 FR 영역은 카바트(Kabat) 등의 문헌[Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health SErvice, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]의 표준 정의에 따라 결정된다.
용어 "불변 도메인"은 직접적인 항원에 대한 항체의 결합에 관련되지 않지만, 다양한 효과기 작용을 나타낸다. 그들 중질 쇄, 항체 또는 면역글로불린의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 분류되고, 이들 중 몇몇은 하위분류(동형), 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4, IgA1 및 IgA2로 더 분류될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 분류에 상응하는 중질 쇄 불변 영역은 μ, δ, γ, α 및 ε으로 각각 불린다. 하기의 실시예, 참조문헌, 서열 목록 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되며, 그의 진정한 범위는 첨부된 청구범위에 기재되어 있다. 본 발명의 범주를 벗어나지 않으면서 기재된 과정으로 변화가 생길 수 있음을 이해한다.
항체 생성 세포, 복수 및/또는 상청액으로부터 항체를 단리시키는 것은 크로마토그래피 또는 투석과 같은 당해 분야에 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들면, 항체는 면역친화성 정제, 황산암모늄 침전, 단백질 A/G 정제, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 및/또는 황산암모늄 침전으로 이루어진 군 중에서 선택된 방법 중 하나 이상을 사용하여 정제될 수 있다. 이러한 방법은 문헌[Nau, D.R., Optimization of monoclonal antibody purification, In: Techniques in Protein Chemistry, Hugli, T. (ed.), Academic Press, New York, 1989, pp. 339-347; Coligan, J.E. et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc. (2005)]에 기재되어 있다.
하이브리도마 발생 대신에, 본 발명에 따른 항체의 생성을 위해 다른 방법을 사용할 수 있다. 그러한 방법은, 예컨대 항체의 핵산 서열의 식별을 기준으로 한다. 일반적으로, 가변 영역, CDR 영역 또는 심지어 단지 중질 쇄 CDR3 영역의 서열을 식별하기에 충분하다. 바람직하게는, mRNA는 항체 생성 세포의 집단으로부터 단리되고, 적절한 발현 벡터에서 상기 영역(들)을 코딩하는 cDNA-벵크를 구성하는데 사용된다. cDNA-라이브러리는 NS0 또는 CHO와 같은 숙주 세포로 트렌스펙션되고 특이적 항체 생성을 위해 선별되며, 특이적 클론이 식별되고 단리되어 하이브리도마 발생 없이 항체 생성을 위해 사용된다.
FL 세포는 다양한 혈액 세포 유형, 예컨대 B 세포, T 세포, 과립구, 혈소판 및 적혈구로 발달할 수 있는 줄기 세포이다. 인간 조혈 태아 간 줄기 세포는 통상적으로 표면 항원(들), CD31, CD34, CD117(c-키트) 및/또는 CD133을 발현한다. 본 발명에 따라, 바람직하게는 CD133을 발현하는 FL 세포를 사용한다. FL 세포로서 또한 시토카인에 의한 FL 세포로의 처리 후에 발달되는 전구 세포(즉, 배아 줄기 세포)를 사용할 수 있다.
CD133을 발현하는 FL 세포는 인간 태아 간으로부터 단리될 수 있으며, CD133 계통에 의해, 바람직하게는 면역자기 분리 과정(예, 밀테니(Miltenyi) "MACS(등록상표) 분리 시스템")에 의해 추가로 분리된다. FL 세포를 단리하는 다른 바람직한 방법은 단핵구를 비오틴-접합 CD133 항체에 의해 라벨링하고 CD133 양성 줄기 세포 개체군을 회수하는 추가의 단계를 포함한다.
X 염색체 상에 시토카인 수용체 공통 감마 쇄(γc)의 무효 돌연변이(null mutation)를 갖는 마우스는 문헌[DiSanto, J.P. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 377-381]에 기재되어 있다. γc-/- 암컷은 RAG2 유전자를 붕괴시키는 돌연변이를 위해 동종접합 수컷과 교배될 수 있다(문헌[Shinkai, Y. et al., Cell 68 (1992) 855-867]). RAG2 결실을 위한 이종접합 및 γc 결실을 위한 반접합 F1 수컷은 γc-/-RAG2+/+ 암컷으로 역교배될 수 있다. 생성된 자손의 RAG2 유전자형은 꼬리 DNA PCR에 의해 결정될 수 있다(문헌[Horton, R.M. et al., BioTechniques 19 (1995) 690-691]). RAG2 이종접합은 γc-/-RAG2-/- 암컷 및 γc-/yRAG2-/- 수컷 마우스(γc-/RAG2-)를 낳도록 번식된다. 이들 마우스는 129 Ola, Balb/c 및 C57BL/6의 혼합된 배경을 갖는다.
본 발명에 따른 면역재구성은 적절한 양의 인간 FL 세포를 신생 및 미리조사된 면역결핍 동물, 예컨대 마우스 또는 래트의 간으로 이식시킴으로써 발생된다.
본 발명에 따른 인간 단일클론성 항체는 본 발명에 따른 면역재구성된 비-인간 동물, 바람직하게는 면역재구성된 설치류, 보다 바람직하게는 면역재구성된 래트 또는 마우스를 항원, 상기 항원을 암호화하는 핵산 및/또는 상기 항원을 발현하는 세포의 정제되거나 농축된 제제로 면역화시킴으로써 생성될 수 있다. 그 후, 동물의 B 세포(예컨대, 비장의 B 세포)를 수득하고 골수종 세포와 같은 적절한 인간 융합 파트너와 융합시켜, 골수종 세포와 같은 적절한 인간 융합 파트너와의 융합을 거치거나 또는 상기 세포를 예컨대 EBV에 의해 불멸화시킴으로써 항원에 대한 인간 단일클론성 항체를 분비하는 불멸의 하이브리도마 세포를 형성한다. 예를 들면, 가용성 항원 또는 그의 단편은 다른 분자에 선택적으로 접합되고, 항체를 발생시키는 면역원으로서 사용된다. 막통과 분자, 예컨대 수용체에 있어서, 이들 단편(예, 수용체의 세포외 도메인)은 면역원으로서 사용될 수 있다. 다르게는, 막통과 분자를 발현하는 세포는 면역원으로서 사용될 수 있다. 이러한 세포는 천연 공급원(예, 암 세포주)으로부터 유래될 수 있거나, 또는 재조합 기법에 의해 형질전환되어 막통과 분자를 발현하는 세포일 수 있다. 항체를 제조하는데 유용한 다른 항원 및 그의 형태는 당해 분야의 숙련자에게 명백할 것이다.
바람직하게는, 면역재구성된 비-인간 동물의 나이는 제 1의 면역화시에 6 내지 16주일 수 있다. 예를 들면, 관심있는 항원(예컨대, CD20 또는 HER3 항원)을 암호화하는 DNA의 정제되거나 농축된 제제를 사용하여 본 발명에 따른 면역재구성된 비-인간 동물을 근육내 면역화할 수 있다. 혈장 샘플을 안와후방 채혈에 의해 수득하면서 면역화 프로토콜의 과정에 대해 면역 반응을 모니터할 수 있다. 혈장은 ELISA에 의해 선별될 수 있고, 상응하는 B 세포의 불멸화를 위해 충분한 역가의 상기 항원에 대한 항체에 의해 면역재구성된 비-인간이 사용될 수 있다. 비장 및 림프절 및 말초혈의 희생 및 제거 전에 관심있는 항원으로 마우스를 정맥내에 추가접종시켰다. 각각의 항원에 대해 2 내지 3회의 융합을 수행할 필요가 있을 수 있음을 발견하였다. 몇몇 마우스는 각각의 항원에 대해 면역화된다.
마우스 림프구는 단리되고 표준 프로토콜을 기준으로 PEG 또는 전기융합을 사용하여 인간- 또는 이종골수종 세포와 융합되어 하이브리도마를 발생시킬 수 있다. 전기융합은 세포 막의 가역적인 구조적 변화를 기초로 하며, 이는 전기장의 효과에 의해 유발되고, 새로운 생존 세포를 만들도록 완전한 구조체(핵, 막, 세포기관, 세포 혈장)를 비롯한 동일하거나 상이한 기원의 둘 이상의 세포들의 융합을 위해 넓은 범위의 세포에 적용될 수 있다.
이어서, 생성된 하이브리도마는 항원-특이적 항체의 생성을 위해 선별된다. 예를 들면, 면역화된 마우스로부터의 비장 및 림프절-유래된 림프구의 단일 세포 현탁액은 K6H6/B5 비분비 이종골수종 세포(ATCC, CRL 1823)에 융합된다. 세포는 평평한 바닥의 미량 역가판에서 대략 2 × 105으로 평판배양되고 선택적 배지에서 약 2주 배양된다.
이어서, 개개의 웰은 항원에 대한 인간 단일클론성 항체(예, IgG)에 대해서 ELISA에 의해 선별된다. 대규모 하이브리도마 성장이 발생되면, 일반적으로 10 내지 14일 후에 배지를 분석한다. 항체 분비 하이브리도마를 재평판배양하고 다시 선별하며, 항원에 대한 인간 단일클론성 항체에 대해 여전히 양성인 경우 적어도 2회 희석을 제한함으로써 서브클론할 수 있다. 그 후, 안정한 서브클론을 생체 외 배양하여 특성화를 위한 조직 배양 배지에서 항체를 생성시킬 수 있다.
임의의 적합한 수단에 의해 항원을 동물로 도입시킬 수 있다. 바람직하게는, 동물은 적절한 면역조절제(예컨대, CFA)와 함께 또는 단독으로 비장내, 정맥내, 복막내, 진피내 근육내, 피하 면역화된다. 각각의 항원의 투여량은 바람직하게는 1 내지 500㎍ 범위에 있어야 한다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 동물에게 마지막 주입 후 추가접종 7 내지 28일에 항원 1 내지 500㎍의 추가 접종량을 공급하는 추가의 단계를 포함한다. 바람직하게는, 동물은 1 내지 5회 추가접종된다.
동물의 면역화는 약학적 담체와 함께 또는 담체 없이 수행될 수 있다. 적합한 담체는, 예컨대 IFA, Al3(OH)4, 아비스코(Abisco)이다.
부가적으로, 이들 담체는 면역자극제("애주번트")로서 작용할 수 있다. 동물의 면역화는 약학적 담체 외에도 애주번트와 함께 또는 애주번트 없이 수행될 수 있다.
조성물의 효능을 강화시키기 위한 바람직한 애주번트는 CFA, IFA, Al3(OH)4, 아비스코를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 사용하기 위한 바람직한 항체-생성 세포는 B 세포를 포함한다. 본 발명에 사용하기 위한 이들 항체-생성 세포는 동물로부터 임의의 적합한 면역 체계의 세포 성분을 제거함으로써 회수될 수 있다. 바람직하게는, 항체-생성 세포는 동물로부터 비장, 림프절, 말초혈 또는 골수 또는 이의 일부를 제거함으로써 회수된다.
물질 및 방법
마우스: 동물 복지, 86/609 상의 ICH, AAALAC 및 EU 지시의 지침에 따라 특이적 병원체-부재 조건하에 BALB/c 배경의 Rag2-/-γc-/- 마우스를 채혈하고 이를 유지시켰다.
신생 재증식 분석: 출생 일에, 2 Gy/분, 치사량에 가깝게 적정된 투여량으로 세슘 137 공급원(바이오빔(Biobeam) 8000, 독일 브라운슈바이크 소재의 STS 게엠베하(STS GmbH))으로부터 2 × 2 Gy를 사용하여 3 내지 4시간 간격으로 신생 마우스를 조사하였다. 4 내지 12시간 후 조사시에, 마우스는, 30-척도 바늘을 사용하여 예컨대 25㎕ PBS 중의 비 조혈 CD133- 간 세포와 함께 또는 단독으로 또는 성장 인자와 함께 CD133+ FL 세포를 간(i.h.)으로 이식하였다(스위스 보나듀쯔 소재의 할민톤 보나듀쯔 아게(Hamilton Bonaduz AG)). 신생아는 항상 단일 제공자로부터의 세포를 수용하였다. 3주된 마우스에게 젖을 떼게 하였다. 마우스 분석: 말초혈 세포 및 혈장을 수득하기 위해, 에터 마취하에 안와후방 정맥굴로부터 마우스를 채혈하였다.
유세포 분석 및 세포 분류: FACS 분석 및 세포 분류를 위해, 다음의 항원에 대한 비오틴화되거나 FITC, PE 또는 APC로 접합된 단일클론성 항체를 사용하였다: CD3 (UCHTl), CD4 (13B8.2), CD8(B9.11), CD40 (MAB89), CD80 (MAB104), CD83 (HB15a), CD86 (HA5.2B7) (모두 프랑스 마르세유 소재의 이뮤노테크/베크만 코울터(Imunotech/Beckman Coulter)), CD19 (HIB19), CD20 (2H7), CD34(581), IL-3Ra/CD123 (9F5), CD11c (B-ly6) CD14 (M5E2) (모두 캐나다 샌디에고 소재의 비디 파민겐(BD Pharmingen)), CD45 (HI30), CD45RA (MEM56), HLA-DR (TU36) (모두 캐나다 벌링게임 소재의 칼타그(Caltag)), TLR2 (TL2.1), TLRR4 (HTA125), TCRab (IP26), (모두 캐나다 샌디에고 소재의 바이오사이언스(Bioscience)), BDCA-1, BDCA-2, BDCA-4, CD25 (4E3) (모두 밀테니 바이오테크(Miltenyi Biotec)), IgM (미국 팬실베니아주 웨스트 그루브 소재의 젝슨 이뮤노리서치(Jackson Immunoresearch)), CCR7 (3D12, 독일 베를린 소재의 엠. 리프(M. Lipp)에 의해 제공됨). IO 시험 베타 마커(IO Test Beta Mark)를 Vb 분석을 위해 사용하였다(이뮤노테크/베크만 코울터). 비오틴화된 항체의 시각화를 위해 스트렙타비딘 접합된 FITC, PE 또는 APC(모두 BD 파민겐)를 사용하였다. 프로피디움 요오드화물 염색에 의해 사멸 세포를 제외하였다. 적절한 동형-일치된 무관계 대조군 mAb를 사용하여 배경 염색 수준을 결정하였다. FACS칼리버(calibur)를 사용하여 세포를 분석하고 FACSV안티지(antage) SE를 사용하여 분류하였다(캐나다 마운틴 뷰 소재의 벡톤 디킨슨 이뮤노사이토메트리 시스템스(Becton Dickinson Immunocytometry Systems).
태아 간 세포: 태아 간 세포 공급원: 미국 소재의 캠브렉스 코포레이 션(Cambrex Corp.) 및 미국 소재의 스템셀 테크놀로기스 코포레이션(StemCell Technologies Corp.)
실시예 1
재구성된 마우스의 면역화 과정
인간 HER3 단백질에 대해 코딩하는 100㎍ 플라스미드 DNA로 3 마리의 Rag2-/-γc-/- 마우스(3 마리 암컷)를 면역화시켰다. 총 6회 이하의 면역화는 근육내(i.m.)에 주어졌다. 항-HER3의 혈청 역가가 충분한 것으로 발견되는 경우, 추가로 마우스를 융합 전 3, 2 및 1일에 100㎕ PBS 정맥내(i.v.)로 30㎍의 정제된 HER3 단백질을 사용하여 3회 추가접종시켰다.
실시예 2
접목 후 15번째 주에 재구성된 마우스의 말초혈의 유세포 분석
마우스를 아이소플루란-마취시킨 후, 유세포 분석을 사용하여 인간 혈구의 양성 비율을 측정하기 위해 안와 정맥 총으로부터 말초혈을 모았다. 모아진 혈액을 EDTA-2Na와 즉시 잘 혼합하고, 분석할 때까지 실온에서 유지시켰다. 최적 양의 FITC 접합된 항-인간 CD45 항체를 첨가하고 20분 동안 실온에서 50㎕의 전혈과 반응시켰다. 그 후, FACS 용액을 사용하여 용혈 및 면역화를 실행하였고, FACS 칼리버를 사용하여 비율을 측정하였다. 도 1은 3 마리의 시험된 마우스의 말초혈 중의 인간 CD45 양성 세포의 비율(%)을 도시하고 있다.
실시예 3
재구성된 마우스에서 인간 HER3 항체의 생성 능력의 시험
재구성된 마우스의 말초혈 중의 총 인간 IgG 양을 ELISA에 의해 측정하였다. 희석된 마우스 혈청을 막시소브(MaxiSorb) 96 웰 판(NUNC) 상에 코팅시키고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 실온에서 1시간 동안 2% 크로테인 C(Crotein C) 용액으로 차단시킨 후, 세척하고 그 후에 퍼옥시다제 접합된 항-인간 IgG 단일클론성 항체를 첨가하였다. 실온에서 45분 동안 배양한 후, 세척하고 ABTS 기질 용액을 실온에서 10분 반응 동안에 첨가하였다. 그 후, 405nm에서 흡광도를 측정하였다(도 2). 표준 곡선에 따라 IgG 농도를 계산하였다.
실시예 4
면역화 후 7번째 주에 재구성된 마우스의 말초혈 중의 인간 HER3 항체의 유세포 분석
재구성 후 17 주에 마우스를 관심있는 인간 단백질로 면역화시켰다. 면역 반응의 강화를 위한 애주번트로서 시토카인 칵테일과 함께 관심있는 인간 단백질에 대해 코딩하는 DNA를 갖는 마우스 당 25 내지 100㎍으로 근육내 면역화를 수행하였다. 동일한 면역화를 매 4주 마다 수행하였고, FACS에 의해 인간 단백질 특이적 항체를 측정하기 위해 혈청을 취하였다. 간단히 희석된 항 혈청을 인간 단백질 발현 세포에 첨가하고 실온에서 20분 동안 배양하였다. 세척 후, 최적 양의 FITC 접합된 항-인간 항체를 첨가하고 실온에서 추가로 20분 동안 세포와 반응시켰다. 그 후, 염색된 인간 단백질 발현 세포의 양성 비율을 FACS 칼리버를 사용하여 측정하였다. 도 3은 음성 대조군으로서 정상 마우스 혈청(NMS) 또는 양성 대조군으로서 정제된 인간 단백질 특이적 항체와 비교하여 재구성되고 면역화된 마우스 중 하나의 상이한 혈청 희석(1/20 및 1/150)으로 염색된 인간 단백질 양성 세포의 비율(%)을 도시하고 있다.
실시예 5
디나비즈(Dynabeads, 등록상표)를 사용한 CD19
+
세포의 양성 선택
CD19+ B 세포를 표준 디날(Dynal) 프로토콜 디나비즈(등록상표) CD19(Pan B)(제품 번호 111.03/111.04) 및 데타카비드(DETACHaBEAD, 등록상표) CD19(제품 번호 125.06)에 따라 말초혈 또는 비장세포 현탁액으로부터 직접 단리하였다:
- 25㎕ 디나비즈(등록상표)를 예컨대 2.5 × 107 제조된 세포에 첨가함,
- 온화한 경사 및 회전과 함께 2 내지 8℃에서 20분 동안 배양함,
- 튜브를 2분 동안 자석에 놓음,
- 다음의 절차를 사용하여, 상청액을 버리고 비드결합 세포를 4회 온화하게 세척함:
- 1 × 107 디나비즈(등록상표) 당 1ml 완충액 1을 첨가함,
- 튜브를 1분 동안 자석에 놓고 상청액을 버림,
- 하류 적용을 위해 완충액/배지에서 세포를 재현탁시킴.
실시예 6
하이브리도마 발생을 위한 전기융합
단리된 CD19+ 세포를 계수하고 전기융합 프로토콜을 거쳐 융합하였다(전기융합 번호 58에 대한 에펜도르프(Eppendorf) 적용):
- 단리된 CD19+ 세포 및 융합 파트너, 예컨대 K6H6/B5 둘 다를 원심분리에 의해 수확함(200 × g, 10분 실온),
- 성장 배지에서 펠릿을 재현탁하고 세포 수를 결정함,
- 각 융합 파트너의 세포 수를 예컨대 융합 당 3 × 105로 설정함,
- 파트너들과 함께 피펫팅하고 10분 동안 실온에서 200 × g에서 원심분리함,
- 펠릿을 전기 융합 완충액에서 2회 세척하고, 상기와 같이 원심분리함,
- 펠릿을 융합 당 200㎕ 전기 융합 완충액에서 재현탁함,
- 융합 챔버를 충전시키고 즉시 융합함(에펜도르프의 융합 기구에 대한 적용 프로토콜을 참고),
- 융합 후, 챔버를 실온에서 10분 동안 정치시킴,
- 챔버를 배지로 세정하고 융합된 세포를 클로닝 판으로 옮김,
- 24시간 배양(5% CO2, 37℃) 후에 HAT 선택 배지를 첨가함,
- 7 내지 21일 후에, 배양을 계수하고 하이브리드를 분석함.
성장한 인간 하이브리도마(40개의 클론)를 총 융합 후 14일에 분석하였고 확립된 ELISA에서 인간 단백질 특이적 IgG 및 6개 이상의 클론이 양성으로서 검출되었다.
| 하이브리도마 | HER3 ELISA 농도 (㎍/ml) | IgG ELISA 농도 (㎍/ml) | IgF ELISA 농도 (㎍/ml) |
| G2:1 | 0.006 | 0.015 | <0 |
| G3:1 | 0.165 | 0.017 | <0 |
| C4:1 | <-0.001 | 0.015 | <0 |
| E9:1 | 0.001 | 0.010 | <0 |
| G9:1 | 0.002 | 0.020 | <0 |
| C10:1 | 0.055 | 0.014 | <-0.001 |
실시예 7
재구성된 마우스의 면역화 과정
인간 CXCR5 단백질에 대해 코딩하는 100㎍ 플라스미드 DNA로 3 마리의 Rag2-/-γc-/- 마우스(4 마리 암컷)를 면역화시켰다. 총 6회 이하의 면역화는 근육내(i.m.)에 주어졌다.
마우스의 추가접종
항-CXCR5의 혈청 역가가 충분한 것으로 발견되는 경우, 추가로 마우스를 융합 전 3, 2 및 1일에 100㎕ PBS 정맥내(i.v.)로 5 × 106의 CXCR5 발현 세포를 사용하여 3회 추가접종시켰다.
실시예 8
재구성된 마우스에서 인간 CXCR5 항체의 생성 능력의 시험
재구성된 마우스의 말초혈 중의 총 인간 IgG 양을 ELISA에 의해 측정하였다. 희석된 마우스 혈청을 막시소브 96 웰 판(NUNC) 상에 코팅시키고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 실온에서 1시간 동안 2% 크로테인 C 용액으로 차단시킨 후, 세척하고 그 후에 퍼옥시다제 접합된 항-인간 IgG 단일클론성 항체를 첨가하였다. 실온에서 45분 동안 배양한 후, 세척하고 ABTS 기질 용액을 실온에서 10분 반응 동안에 첨가하였다. 그 후, 405nm에서 흡광도를 측정하였다(도 4). 표준 곡선에 따라 IgG 농도를 계산하였다(250㎍/총 인간 IgG ml).
실시예 9
제 3의 면역화 후 재구성된 마우스 중의 인간 CXCR5 항체의 분석
재구성된 마우스의 혈청 중의 인간 CXCR5 특이적 IgG의 양을 CXCR5 특이적 ELISA에 의해 측정하였다(도 5). 희석된 마우스 혈청을 막시소브 96 웰 판(NUNC) 상에 코팅시키고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 실온에서 1시간 동안 2% 크로테인 C 용액으로 차단시킨 후, 세척하고 그 후에 퍼옥시다제 접합된 항-인간 IgG 단일클론성 항체를 첨가하였다. 실온에서 45분 동안 배양한 후, 세척하고 ABTS 기질 용액을 실온에서 10분 반응 동안에 첨가하였다. 그 후, 405nm에서 흡광도를 측정하였다.
Claims (24)
- 신생의 면역결핍 비-인간 동물을 인간 태아 간 줄기 세포(FL 세포)와 접촉시켜 면역 이식된 비-인간 동물(재구성된 동물)을 발생시키는 단계,이어서, 상기 재구성된 동물을 항원과 접촉시키는 단계,상기 재구성된 동물로부터 상기 항원에 대한 인간 항체를 생성하는 인간 세포를 모으는 단계, 및상기 항체 생성 세포로부터 상기 항체를 단리시키는 단계를 포함하는, 면역결핍 비-인간 동물로부터 인간 단일클론성 항체를 생성시키는 방법.
- 제 1 항에 있어서,면역재구성된 비-인간 동물이 설치류인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,재구성된 비-인간 동물이 마우스 또는 래트인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,재구성된 마우스가 Rag2-/-γc-/-, 누드 Rag 2-/-, NOD 또는 SCID 베이지 마우 스인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,FL 세포가 인간 조혈 태아 간 줄기 세포(HFL 세포)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,FL 세포가 HFL 세포 및 인간 비-조혈 태아 간 줄기 세포의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,항체 생성 세포가 인간 B-세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,항원이 폴리펩타이드인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,항원이 항원, 항원 단편, MHC/펩타이드 복합체, 항원 암호화 DNA 및/또는 항원 함유 세포로서 재구성된 동물과 접촉하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 또는 제 9 항에 있어서,재구성된 비-인간 동물을 치사량에 가깝게 FL 세포와 접촉시키기 전에 조사하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,마우스가 FL 세포와 접촉 한 후 5 내지 18주에 마우스를 항원과 처음으로 접촉시키는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,마우스를 항원과 10회 이하로 접촉시키는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,모아진 세포가 인간 CD 19+ 또는 CD 22+ 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,세포가 하이브리도마 기법에 의해 확립된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,융합 파트너 세포주가 MFP-2, HK-128, K6H6/B5 또는 카퍼스 707 세포주인 것 을 특징으로 방법.
- 신생의 면역결핍 비-인간 동물을 FL 세포와 접촉시켜 면역재구성된 동물을 발생시키는 단계,이어서, 상기 재구성된 동물을 항원과 접촉시키는 단계, 및상기 비-인간 동물 중에서 다수의 항체 생성 인간 B 세포를 모으는 단계를 특징으로 하는, 항원에 대한 다수의 인간 항체를 생성하는 다수의 인간 B 세포의 생성 방법.
- 인간 단백질에 대한 완전한 다수의 인간 항체를 생성하는 다수의 인간 B 세포.
- 인간 단백질에 대한 완전한 다수의 인간 항체를 제공하는 불멸 B 세포의 조성물.
- 인간 단백질에 대한 완전한 다수의 인간 항체를 생성하는, 다수의 불멸 B 세포의 생성에 있어서 재구성된 동물의 용도.
- 신생의 면역결핍 비-인간 동물을 FL 세포와 접촉시키는 단계,이어서, 상기 비-인간 동물을 항원과 접촉시키는 단계,상기 비-인간 동물로부터 상기 항원에 대한 인간 항체를 생성하는 인간 세포를 모으는 단계,상기 항원을 단리하는 단계,가변 영역을 서열 분석하는 단계,인간 불변 쇄와 합쳐진, 중질 및/또는 경질 쇄 적어도 CDR을 암호화하는 발현 벡터를 구성하는 단계,상기 벡터를 적절한 숙주 세포에서 발현시키는 단계, 및상기 숙주 세포 또는 발효 상청액으로부터 상기 항체(면역 반응성 단백질)를 단리하는 단계를 특징으로 하는, 항체의 재조합 생성 방법.
- 신생의 면역결핍 비-인간 동물을 FL 세포와 접촉시키는 단계,이어서, 상기 비-인간 동물을 항원과 접촉시키는 단계,상기 비-인간 동물로부터 상기 항원에 대한 인간 항체를 생성하는 인간 세포를 모으는 단계,상기 인간 항체를 생성하는 인간 세포로부터 mRNA를 단리하는 단계,(예컨대, 면역글로불린 특이적 프라이머를 사용함으로써) 항체 특이적 cDNA를 발생시키는 단계,인간 불변 쇄와 합쳐진, 중질 및/또는 경질 쇄 적어도 CDR을 암호화하는 발현 벡터를 구성하는 단계,상기 벡터를 적절한 숙주 세포에서 발현시키는 단계, 및상기 숙주 세포 또는 발효 상청액으로부터 상기 항체(면역 반응성 단백질)를 단리하는 단계를 특징으로 하는, 항체의 재조합 생성 방법.
- 다수의 B 세포가 하이브리도마 세포의 생성에 있어서 106 B 세포/ml 이상의 농도를 갖는 것을 특징으로 하는, 항원에 대한 단일클론성 항체의 발생에 있어서 항원에 대한 완전한 다수의 인간 면역글로불린 유전자를 포함하는 다수의 인간 B 세포의 용도.
- 완전한 다수의 인간 항체를 생성하는 비-인간 동물의 비장으로부터 다수의 인간 B 세포를 제공하는 단계,상기 세포 또는 그의 하위세트를 불멸의 골수종 세포와 융합하거나 상기 B 세포 또는 그의 하위세트를 EBV 형질전환에 의해 불멸화하는 단계, 및항원에 대해 특이적 결합을 보이는 인간 항체를 생성하는 하이브리도마 세포를 선택하는 단계를 특징으로 하는, 항원에 대해 특이적 결합을 보이는 인간 항체를 생성하는 불멸 세포의 선택 방법.
- 완전한 다수의 인간 항체를 생성하는 비-인간 동물의 비장으로부터 다수의 인간 B 세포를 제공하는 단계,상기 세포 또는 그의 하위세트를 불멸의 골수종 세포와 융합하거나 상기 B 세포 또는 그의 하위세트를 EBV 형질전환에 의해 불멸화하는 단계, 및항원에 대해 10-6 몰/l 이상의 특이적 결합 친화성을 보이는 항체를 생성하는 하이브리도마 세포를 선택하는 단계를 특징으로 하는, 항원에 대해 10-6 몰/l 이상의 특이적 결합 친화성을 보이는 항체를 생성하는 불멸 세포의 선택 방법.
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