BRPI0711807A2 - método para a produção de anticorpos em um animal imunodeficiente injetado com células tronco de fìgado fetal humano - Google Patents

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BRPI0711807A2
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Abstract

MéTODO PARA A PRODUçãO DE ANTICORPOS EM UM ANIMAL IMUNODEFICIENTE INJETADO COM CéLULAS TRONCO DE FìGADO FETAL HUMANO.A presente invenção refere-se a um método para a produção de um anticorpo monoclonal humano a partir de um animal não-humano imunodeficiente, o dito método compreendendo colocar um animal não-humano imunodeficiente recém-nascido em contato com uma célula tronco de fígado fetal humano (célula FL) para gerar um animal não-humano imunotransplantado (animal reconstituido), posteriormente colocando em contato o dito animal reconstituido com um antígeno, coletando do dito animal reconstituido uma célula humana produzindo anticorpo humano contra o dito antígeno, e isolando o dito anticorpo da dita célula de produção de anticorpo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE ANTICORPOS EM UM ANIMAL IMUNODEFICI- ENTE INJETADO COM CÉLULAS TRONCO DE FÍGADO FETAL HUMA- NO".
A presente invenção refere-se a métodos para a produção de anticorpos, às composições de células para a produção de anticorpo, méto- dos para sua produção e uso das mesmas.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO.
Os anticorpos monoclonais (MAB) foram, por muito tempo, con- siderados como uma munição mágica na imunoterapia do câncer, na infec- ção ou nas doenças autoimunes, etc. Entretanto, a primeira geração de anti- corpos de murino que foram usados em seres humanos foi bastante malsu- cedida devido às respostas imune humanas anti-rato.
Os anticorpos humanos foram na sua maior parte ou derivados de camundongos transgênicos que carregam um conjunto restrito de genes da Ig humana ou selecionados de grandes bibliotecas de anticorpos artifici- ais usando exposição fago, exposição de levedura ou tecnologias recombi- nantes similares. Essas estratégias foram projetadas para eliminar qualquer reação imune contra o anticorpo monoclonal no ambiente humano. Os anti- corpos humanos podem ser produzidos em animais transgênicos (por exem- plo, ratos) que são capazes, quando da imunização, de produzir anticorpos humanos na ausência da produção de imunoglobulina endógena. A transfe- rência do vetor genético da imunoglobulina da linhagem germinativa humana em tais camundongos transgênicos de linhagem germinativa resulta na pro- dução de anticorpos humanos durante a provocação antigênica (ver, por e- xemplo, van Dijk, M.A. e van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374; Jakobovits, A., et al., Proc. Nati Acad. Sei. EUA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258; Bruggemann, M., et al., Year Immunol. 7 (1993) 33-40). Os anticorpos humanos também podem ser produzidos em bibliotecas de exposição de fago (Hoogenboom, H. R. e Winter, G., J. Moi Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J.D., et al., J. MoIrBioi 222 (1991) 581-597). As técnicas de Cole et al., e Boerner et al., também estão disponíveis para a preparação de anticorpos monoclonais humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); e Boerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95). Entre- tanto tais camundongos transgênicos são somente capazes de fornecer an- ticorpos com um conjunto restrito de genes da Ig humana - aqueles que re- sultam do vetor genético de imunoglobulina transfectada.
As metodologias baseadas em camundongos transgênicos para genes de imunoglobulina humana permitiram a geração de anticorpos deri- vados da seqüência da linhagem germinativa humana, que reduziu segundo relatos a imunogenicidade dos fármacos feitos dos anticorpos resultantes em comparação com o murino ou anticorpos quiméricos humano-rato. Entretan- to, anticorpos transgênicos humanos derivados de rato são limitados nas suas pluralidade, afinidade e especificidade em comparação com repertórios imunes humanos naturais.
Similarmente uma desvantagem principal da abordagem da bi- blioteca combinatória baseada na exposição de fago ou levedura aproxima é o pareamento aleatório de anticorpos de cadeias pesadas e leves. A disso- ciação do anticorpo, o pareamento de anticorpos originais de cadeias pesa- das e leves, pareamento não-cognato, exige a avaliação de um grande nú- mero de clones para identificar pares de cadeias pesadas e leves de alta afinidade. Além disso, tais pares não-cognatos podem expor uma reação cruzada não desejada com auto-antígenos humanos. Finalmente, a plurali- dade genética de anticorpos específicos para alvos identificados por seleção e avaliação de bibliotecas combinatórias é comumente limitada devido a er- ros sistemáticos inerentes à seleção.
Traggai, E. et al., Science 304 (2004) 104-107 descreve um mé- todo para o desenvolvimento de um sistema imune humano em camundon- gos Rag 2 -/- yc -/- transplantados com células sangüíneas do cordão umbili- cal humano que pode ser usado como um modelo pré-clínico para avaliar as respostas a vacinas ou agentes patogênicos contagiosos vivos e a compos- tos farmacológicos que visam o sistema imune humano. Mostrou-se que os camundongos reconstituídos e posteriormente vacinados com agentes pato- gênicos podem produzir respostas de anticorpos específicos contra o toxóide tetânico a níveis baixos. SUMÁRIO DA INVENÇÃO.
A presente invenção compreende um método para a produção de um anticorpo monoclonal humano a partir de um animal não-humano i- munodeficiente, o dito método compreendendo colocar em contato um ani- mal não-humano imunodeficiente recém-nascido com uma célula tronco de fígado fetal humano (célula FL) para gerar um animal não-humano imuno- transplantado (animal reconstituído), posteriormente colocando em contato o dito animal reconstituído com um antígeno, coletando do dito animal recons- tituído uma célula humana produzindo anticorpos humanos contra o dito an- tígeno, e isolando o dito anticorpo da dita célula de produção de anticorpo.
A presente invenção preferivelmente compreende um método de acordo com a invenção, caracterizado pelo estabelecimento da dita célula de produção de anticorpos como uma célula imortal produtora de anticorpos preferivelmente por um método de transformação ou um método de fusão celular. A dita célula imortal preferivelmente sendo capaz de ser viável por pelo menos 50 passagens.
O dito animal não-humano preferivelmente é um roedor e mais preferivelmente um camundongo, rato ou coelho. Também é preferível que o camundongo seja um Rag 2 -/- yc -/-, um rato nu Rag 2 -/-, NOD (NOD signi- fica de acordo com a invenção preferivelmente um camundongo NOD.Cg- Rag|tm/Mom ρjftm/Sdz/sζj]) 0u o camundongo bege SCID e o rato são um rato nu.
A presente invenção compreende um método de acordo com a invenção, caracterizado pelo fato de que a dita célula FL é uma célula tronco hematopoiética de fígado fetal humano (célula HFL), preferivelmente CD133+, CD117+, CD31+ e/ou CD34+.
Em uma modalidade adicional, o método é preferivelmente ca- racterizado pelo fato de que a dita célula FL é uma combinação de uma célu- la HFL e uma célula tronco hematopoiética de fígado fetal humano.
A presente invenção compreende um método de acordo com a invenção, caracterizado pelo fato de que a dita célula de produção de anti- corpo é uma Célula B humana.
A presente invenção compreende um método de acordo com a invenção, caracterizado pelo fato de que a dita célula FL deve entrar em contato através de injeção i.p., s.c. ou intra-hepática no animal.
A presente invenção compreende um método de acordo com a invenção, caracterizado pelo fato de que o antígeno é um polipeptídio, um complexo MHC/peptídio ou DNA.
A presente invenção compreende um método de acordo com a invenção, caracterizado pelo fato de que o antígeno é colocado em contato com o animal reconstituído na forma de um antígeno, um fragmento de antí- geno, um antígeno codificando um DNA e/ou uma célula carregando um an- tígeno.
A presente invenção compreende um método de acordo com a invenção, caracterizado pelo fato de que o animal não-humano imunodefici- ente é subletalmente irradiado antes de ser colocado em contato com a célu- la FL.
A presente invenção compreende um método de acordo com a invenção, caracterizado pelo fato de que o rato é colocado em contato a pri- meira vez com o antígeno de 5 a 18 semanas depois de colocar o dito rato em contato com a dita célula FL.
A presente invenção compreende um método de acordo com a invenção, caracterizado pelo fato de que o rato é colocado em contato por até dez vezes com o antígeno.
A presente invenção compreende um método de acordo com a invenção, caracterizado pelo fato de que a dita célula coletada é uma célula humana CD19+ ou CD22+.
A presente invenção compreende um método de acordo com a invenção, caracterizado pelo fato de que a dita célula é estabelecida pela tecnologia de hibridomas.
A presente invenção compreende um método de acordo com a invenção, caracterizado pelo fato-de que a linhagem celular de fusão de pa- res é uma linhagem de células MFP-2, HK-128, K6H6/B5 ou de células Kar- pas 707.
A presente invenção compreende um método para a produção de diversas células B humanas produzindo uma pluralidade completa de an- ticorpos humanos contra um antígeno, o dito método sendo caracterizado pelo contato de um animal não-humano imunodeficiente recém-nascido com uma célula FL para gerar um animal imunorreconstituído, posteriormente colocando o dito animal reconstituído em contato com um antígeno, coletan- do as ditas células B humanas, produzindo a dita variedade completa de an- ticorpos.
A presente invenção compreende o uso de um animal não- humano para a produção de um antígeno produzindo a célula imortal de a- cordo com a invenção. Se a célula imortal for uma célula de hibridoma, um par de fusão para a geração do hibridoma é uma célula B humana do dito animal transplantado e reconstituído, o outro par de fusão sendo uma célula de mieloma, por exemplo, de um ser humano, de um roedor ou de outro a- nimal. Alternativamente as células B imortais transplantadas e reconstituídas são geradas pela transformação EBV.
A presente invenção compreende diversas células B humanas produzindo uma pluralidade completa de anticorpos humanos contra uma proteína humana.
A presente invenção compreende uma composição de células imortais produzindo uma pluralidade completa de anticorpos humanos contra uma proteína humana.
A presente invenção compreende o uso de um animal reconstitu- ído para a produção de diversas células B imortais, produzindo uma plurali- dade completa de anticorpos humanos contra uma proteína humana.
A presente invenção compreende um método para geração e produção de um anticorpo humano monoclonal em um animal não-humano, o dito anticorpo sendo direcionado contra uma proteína humana (incluindo fragmentos) que é pelo menos 80%, (BLAST) homóloga à proteína corres- pondente do-dito animal não-humano. Tal exemplo é a CXCR5. A célula CXCR5 humana e a célula CXCR5 da murina são 84% homólogas. A pre- sente invenção, assim, fornece um método para gerar anticorpos humanos contra proteínas ou regiões de proteínas altamente conservadoras, mesmo se a proteína ou o fragmento da mesma forem pelo menos 95%, ou mais, homólogas entre a humana e a do dito animal não-humano, ou mesmo 100% homóloga.
Por isso, um objetivo adicional da presente invenção é um anticorpo humano monoclonal específico para uma proteína humana que tenha pelo menos 95 %, preferivelmente 98 % e mesmo 100 % de homologia (BLAST) com a proteína correspondente de um animal não-humano, preferivelmente um camundongo, rato e/ou coelho. Um objetivo preferido de acordo com a presente invenção é um anticorpo humano monoclonal específico para uma proteína humana que tenha pelo menos 95 %, mais preferivelmente 98 % e mesmo 100 % de homologia (BLAST) com a correspondente proteína do murino (rato).
A presente invenção compreende um método para a produção recombinante de um anticorpo, caracterizado por colocar em contato um a - nimal não-humano imunodeficiente recém-nascido com uma célula FL, pos- teriormente colocar o dito animal não-humano em contato com um antígeno, coletando do dito animal não-humano uma célula humana que produz anti- corpo humano contra o dito antígeno, e isolando o dito antígeno, seqüenci- ando as regiões variáveis, construindo vetores de expressão que codificam pelo menos CDRs de cadeia pesada e/ou de cadeia leve, combinada com uma cadeia constante humana, expressando os ditos vetores nas células hospedeiras adequadas e isolando o dito anticorpo (proteína imunorreativa) das ditas células hospedeiras ou do sobrenadante da fermentação.
A presente invenção compreende um método para a produção recombinante de um anticorpo, caracterizado pelo fato de colocar em conta- to um animal não-humano imunodeficiente recém-nascido com uma célula FL, posteriormente colocar o dito animal não-humano em contato com um antígeno, coletando do dito animal não-humano uma célula humana que - produz anticorpo humano contra o dito antígeno, e isolando o mRNA da dita célula humana que produz anticorpo humano, gerando um anticorpo cDNA específico (por exemplo, pelo uso de iniciadores específicos da imunoglobu- lina), construindo vetores de expressão codificando pelo menos CDRs de cadeia pesada e/ou de cadeia leve, combinadas com uma cadeia constante humana, expressando os ditos vetores nas células hospedeiras adequadas e isolando o dito anticorpo (proteína imunorreativa) das ditas células hospedei- ras ou do sobrenadante da fermentação.
A presente invenção compreende um método para a seleção de uma célula imortal que produz um anticorpo humano exibindo ligação espe- cífica a um antígeno, o dito método sendo caracterizado pelo fornecimento de diversas células B humanas a partir do baço de um animal não-humano produzindo uma pluralidade completa de anticorpos humanos, fundindo as ditas células, ou um subconjunto das mesmas, com uma célula imortal de mieloma ou imortalizando as ditas células B, ou um subconjunto das mes- mas, pela transformação EBV, e selecionando uma célula de hibridoma que produz um anticorpo humano exibindo ligação específica ao dito antígeno.
A presente invenção compreende um método para a seleção de uma célula imortal que produz um anticorpo exibindo afinidade de ligação específica de pelo menos 10"6 mol/l a um antígeno em uma quantidade de pelo menos 1,5 pg/ml, o dito método sendo caracterizado pelo fornecimento de diversas células B humanas do baço de um animal não-humano produ- zindo uma pluralidade completa de anticorpos humanos, fundindo as ditas células ou um subconjunto das mesmas com uma célula imortal de mieloma ou imortalizar as ditas células B ou um subconjunto pela transformação EBV, e selecionando uma célula de hibridoma que produz um anticorpo exibindo afinidade de ligação específica de pelo menos 10~6 mol/l a um antígeno.
Preferivelmente a quantidade de anticorpo isolado é de pelo menos 1,5 pg/ml.
Preferivelmente o anticorpo mostra uma afinidade de ligação específi- ca de pelo menos 10'9 mol/l ao dito antígeno.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO.
O termo "uma pluralidade completa de anticorpos humanos ou genes de imunoglobulina humana" se refere a anticorpos ou genes de imunoglobu- lina compreendendo ou codificando:
- as cadeias kapa de pelo menos 20 genes, preferivelmente de 31 a 33 genes kapa na posição 2p11 no cromossomo 2(76 genes, dos quais de 31 a 35 são funcionais),
- as cadeias lambda de pelo menos 20 genes, preferivelmente de 29 a 33 genes lambda na posição 22q11 no cromossomo 22 e um gene J; (há de 4 a 5 genes de cadeia lambda funcionais, cada um dos quais é precedido por um gene lambda J), e
- as cadeias pesadas de pelo menos 5, preferivelmente 9 genes pesados, na posição 14q32 no cromossomo 14 (11 genes de cadeia pesa- das, 9 dos quais são funcionais e eqüivalem respectivamente a 9 isotipos μ de cadeia pesada, μ, δ, γ1, γ2, γ3, γ4, α1, α2 e εα).
Por exemplo, ο antígeno pode ser uma substância derivada do ser humano, como uma proteína humana, um hormônio, um glicolipídio as- sociado ao tumor (por exemplo, a Patente US 5.091.178) ou outra substân- cia implicada no metabolismo humano natural que ali ocorre. O antígeno também pode ser uma substância derivada de um animal não-humano que é tolerada por um ser humano saudável, para que tal ser humano não desen- volva anticorpos de um modo detectável contra tal antígeno.
O termo "proteína de ser humano" (que inclui polipeptídios) se refere a uma proteína arbitrária de um ser humano que é naturalmente tole- rada ou atacada em doenças autoimunes. O termo "proteína de ser humano" inclui de acordo com o conhecimento de uma pessoa versada na técnica também fragmentos da dita proteína que são capazes de induzir anticorpos específicos para uma tal proteína humana no animal não-humano conveni- ente de acordo com a presente invenção. Tais fragmentos podem ser incluí- dos, por exemplo, em uma proteína maior, por exemplo, é bem conhecido que os anticorpos contra a proteína humana podem ser induzidos pela imu- nização com uma proteína homóloga de outras espécies, como o rato. A pro- teína humana é preferivelmente uma proteína humana tolerada.
O termo "proteína humana tolerada" se refere a uma proteína de um ser humano que é naturalmente tolerada e não é atacada em doenças autoimunes como a Síndrome de Goodpasture, diabete melitus dependente de insulina (IDDM), anemia hemolítica autoimune, púrpura trombocitopênica autoimune, Myasthenia gravis (MG), esclerose múltipla (MS), artrite Reuma- tóide, lupus eritematoso sistêmico (SLE) ou Tirotoxicose (a doença de Gra- ves).
Por exemplo, a proteína humana pode ser uma molécula trans- membrana (por exemplo, receptora) ou um ligante, tal como um fator de crescimento. Os exemplos de antígenos incluem moléculas, tais como a re- nina; um hormônio de crescimento, fator de liberação do hormônio de cres- cimento; hormônio da paratirôide; hormônio estimulante da tireóide; Iipopro- teínas; alfa-1-antitripsina; Insulina de cadeia A; Insulina de cadeia B; pró- insulina; hormônio estimulante de folículo; calcitonina; hormônio luteinizante; glucagon; fatores coagulantes, tais como fator VIII, fator IX, fator de tecido (TF), e fator von Willebrands; fatores anticoagulantes, tais como a Proteína C; fator natriurético atrial; pulmão tensoativo; um ativador de plasminogênio, tal como a uroquinase ou urina humana ou um tipo do tecido ativador de plasminogênio (t-PA); bombesina; trombina; fator de crescimento hemopoié- tico; fator alfa e fator beta de necrose tumoral; encefalinase; RANTES (regu- lado na ativação normalmente da célula T expressada e segregada); proteí- na inflamatória do macrófago humano (ΜΙΡ-1-alfa); uma albumina de soro, tal como a albumina de soro humano; substância inibidora Muellerian; cadeia A da relaxina; cadeia B da relaxina; pró-relaxina; peptídio associado com gonadotropina de camundongo; uma proteína microbiana, tal como a beta- lactamase; DNase; IgE; um antígeno associado com linfócito T citotóxico (CTLA), tal como o CTLA-4; inibina; ativina; fator de crescimento vascular endotelial (VEGF); receptores para hormônios ou para fatores de crescimen- to; proteína A ou D; fatores reumatóides; um fator neutrófico tal como o fator neutrófico derivado dos ossos (BDNF), neutrofina-3, 4, 5, ou 6 (NT-3, NT-4, NT-5 ou NT-6), ou fator de crescimento de nervo, tal como NGF-b; fator de crescimento derivado da plaqueta (PDGF); fator de crescimento de fibroblas- to, tal como aFGF e bFGF; fator de crescimento epidérmico (EGF); transfor- mação de fator de crescimento (TGF), tal como TGF-alfa e TGF-beta, inclu- sive as TGF-b1, TGF-b2, TGF-b3, TGF-b4, ou TGF-b5; um fator de necrose de tumor (TNF), tal como TNF-alfa ou TNF-beta; fator-l e fator-ll de cresci- mento similar à insulina; proteína de ligação ao fator de crescimento similar à insulina; proteínas CD, tal como CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD22 e CD40; erotropoietina; fatores osteoindutivos; imunotoxinas; uma proteína morfogenética do osso (BMP); um interferon tal como o interferon alfa, beta, e gama; fatores estimulantes de colônia (CSFs), por exemplo, M-CSF, GM- CSF, e G-CSF; interleucinas (ILs), por exemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL- 6, IL-7, IL-8, IL-9 e IL-10; superóxido dismutase; receptores de célula T; pro- teína da membrana da superfície; fator de aceleração de decaimento; antí- geno viral tal como, por exemplo, uma porção do envelope do vírus da AIDS; proteína de transporte; receptores de homing; adressinas; proteína regulado- ra; integrinas, tal como CD11a, CD11b, CD11c, CD18, um ICAM, VLA-4 e VCAM; um antígeno associado a um tumor, tal como o receptor HER2, HER3 ou HER4; e fragmentos de qualquer uma das proteínas acima lista- das. Proteínas humanas adicionais são os membros da família do receptor ErbB, tais como o receptor EGF, receptor HER2, HER3 ou HER4; um mem- bro da superfamília de receptores de necrose de tumor, incluindo o DR5; antígeno de célula tronco da próstata (PSCA); moléculas de adesão celular tais como LFA-1, Macl, p150.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, integrina al- fa4/beta7 e integrina alfav/beta3 incluindo ou as subunidades alfa ou subuni- dades beta das mesmas (por exemplo, anti-CD11a, anti-CD18 ou anticorpos anti-CD11b); fator de tecido (TF); alfa interferon (alfa-IFN); uma interleucina, tal como a IL-8; a IgE; antígenos de grupo sangüíneo; receptor de flk2/flt3; receptor da obesidade (OB) ou receptor mp1.
O termo "célula imortal" se refere a uma célula de hibridoma ou uma célula imortalizada por outros meios, tal como a transformação EDV, reposição de telomerase ou imortalização retroviral.
O termo "animal" tal com aqui utilizado se refere a um animal não-humano, preferivelmente um roedor e especialmente preferido um ca- mundongo ou rato. O dito animal não-humano preferivelmente é um roedor e mais preferivelmente um camundongo, rato ou coelho. Também é preferível que o rato seja um Rag2 -I- γο -/-, Rato nu 2-1-, NOD ou camundongo bege SCID e o rato é um rato nu.
SCID bege é um camundongo mutante duplo que transporta a mutação scid que causa falta tanto de linfócito T como de linfócito B devido a um defeito na recombinação V(D)J. Ele também transporta a mutação bege que resulta na célula T citotóxica e defeitos de macrófago bem como prejuí- zo seletivo de funções da célula NK. Os camundongos beges SCID são po- tencialmente um modelo melhorado das células receptoras hematopoiéticas humanas.
Os camundongos NOD preferidos são NOD.Cg-Ragltm1Mom Pr- fltm/Sdz/Sz], N0D.Cg-Prkdcscidll2rgtm/Wil/SzJ, NOD.129S7(B6)-Ragltm/Mom/J, NOD.Cg-PrkdcscidB2mtm/Un7J e NOD.CB17-Prkdcscid/S2. Cada cepa necessita de células TeB maduras e não possui nenhuma atividade NK citotóxica. O suporte das cepas que melhorou a enxertia com as células hematopoiéticas humanas, tem um tempo de vida relativamente mais longo e é significativa- mente mais resistente à irradiação.
O Rag2 é essencial para os rearranjos genéticos V(D)J que ge- ram receptores de antígeno funcionais nas células T e B; os mutantes ho- mozigóticos Rag2-/- não têm nenhuma célula TeB maduras funcionais. O camundongo KO gama comum (yc) não possuem receptores funcionais para muitas citocinas incluindo IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 e IL-15. Por conseguinte o de- senvolvimento de linfócitos é muito comprometido. O camundongo não pos- sui células Natural Killer (NK) e produz somente uma pequena quantidade de células T e células B.
O termo "anticorpo humano", tal com aqui utilizado, inclui anti- corpos que têm regiões (domínios) variáveis e constantes que podem ser destinadas para definir as seqüências da imunoglobulina da linhagem germi- nativa humana por causa da sua alta semelhança de seqüência ou de iden- tidade com essas seqüências de linhagem germinativa. Um anticorpo huma- no abrange as várias formas de anticorpos, preferivelmente anticorpos mo- noclonais incluindo, mas não limitado a anticorpos totais, cadeias únicas pe- sadas ou cadeias únicas leves, fragmentos de anticorpos, anticorpos de classe alterada e anticorpos geneticamente projetados (anticorpos variantes ou mutantes) enquanto as propriedades características de acordo com a in- venção forem conservadas. Especialmente preferidos são anticorpos huma- nos recombinantes. O termo "anticorpo monoclonal" tal com aqui utilizado se refere a uma preparação de moléculas de anticorpo todos possuindo subs- tancialmente a mesma seqüência de aminoácidos.
O termo "anticorpo humano recombinante", tal com aqui utiliza- do, é destinado a incluir todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios de recombinação, tais como anti- corpos isolados de uma célula de hospedeiro, tais como um NSO, HEK 293 ou célula CHO compreendendo um vetor de expressão recombinante capaz de expressar as cadeias pesada e/ou leve do dito anticorpo e sendo trans- fectado para tal célula de hospedeiro. Tais anticorpos humanos recombinan- tes têm regiões variáveis e constantes em uma forma rearranjada. Os anti- corpos humanos recombinantes de acordo com a invenção foram submeti- dos à hipermutação somática in vivo. Assim, as seqüências de aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são seqüências que po- dem ser destinadas a definirem as seqüências de linhagens germinativas humanas VH e VL, mas podem não existir naturalmente dentro do repertório de linhagem germinativa do anticorpo humano in vivo.
A "região variável" (a região variável de uma cadeia leve (VL), região variável de uma cadeia pesada (VH)) tal como aqui utilizada denota cada cadeia do par de cadeias leves e pesadas que está implicado direta- mente na ligação do anticorpo a um antígeno. Os domínios de cadeias leves e pesadas humanas variáveis têm a mesma estrutura geral e cada domínio compreende quatro regiões estruturais (FR) cujas seqüências são ampla- mente conservadas, unidas por três "regiões hipervariáveis" (ou regiões de determinação de complementaridade, CDRs). As regiões estruturais adotam a conformação de folha β (beta) e as CDRs podem formar laços que se co- nectam com a estrutura de folha β (beta). As CDRs em cada cadeia são mantidas nas suas estruturas tri-dimensionais pelas regiões estruturais e formam em conjunto com a CDRs de outra cadeia o sítio de ligação com an- tígeno. As regiões de CDR3 de cadeias pesada e leve do anticorpo, preferi- velmente a cadeia pesada CDR3, desempenham um papel especialmente importante na especificidade/afinidade de ligação dos anticorpos de acordo com a invenção e por isso fornecem um objetivo adicional da presente in- venção.
Os termos "região hipervariável" ou "porção de um anticorpo pa- ra ligação com antígeno" quando aqui utilizados se referem aos resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis pela ligação com antí- geno. A região hipervariável compreende resíduos de aminoácidos das "re- giões de determinação de complementaridade" ou "CDRs". A "região estru- tural" ou as regiões "FR" são aquelas regiões de domínios variável diferentes dos resíduos de região hipervariáveis tal como aqui definido. Desse modo, as cadeias leves e pesadas de um anticorpo compreendem da extremidade N até a extremidade C, os domínios FRI, CDRI, FR2, CDR2, FR3, CDR3, e FR4. As regiões CDR e FR são determinados segundo a definição padrão de Kabat et aí., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ê ed., Pu- blic Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).
Os "domínios constantes" não estão implicados diretamente na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas expõem várias funções efeto- ras. Dependendo da seqüência de aminoácidos das cadeias pesadas da região constante, os anticorpos ou as imunoglobulinas são divididos nas classes: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias dessas podem ser adicionalmente divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgGI, lgG2, lgG3, e lgG4, IgA, e IgA2. A regiões constantes de cadeia pesada que correspondem às classes diferentes de imunoglobulinas são chamadas de μ, δ, γ, α, e ε, res- pectivamente. Os seguintes exemplos, referências, listagem de seqüência e figuras são fornecidos para ajudar na compreensão da presente invenção, o escopo verdadeiro da qual é apresentado nas reivindicações anexadas. En- tende-se que modificações podem ser feitas nos procedimentos apresenta- dos sem fugir do espírito da invenção. O isolamento do anticorpo da célula de produção de anticorpo, o ascites e/ou o sobrenadante podem ser realizados de acordo com os méto- dos conhecidos no estado da técnica tal como cromatografia ou diálise. Por exemplo, o anticorpo pode ser purificado usando um ou vários dos métodos selecionados entre purificação por imunoafinidade, precipitação por sulfato de amônio, purificação A/G de proteína, cromatografia por troca iônica, filtra- ção em gel e/ou precipitação com sulfato de amônio. Tais métodos são des- critos em Nau, D. R., Optimization of monoclonal antibody purification, em: Techniques in Protein Chemistry, Hugli, T. (ed.), Academic Press, Nova Ior- que, 1989, pags. 339-347; Coligan, J.E. et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons1Inc. (2005).
Em vez da geração do hibridoma, métodos alternativos podem ser usados para a produção de um anticorpo de acordo com a presente in- venção. Tais métodos são, por exemplo, baseados na identificação da se- quência de ácidos nucléicos do anticorpo. Normalmente é suficiente identifi- car a seqüência das regiões variáveis, as regiões CDR ou mesmo somente a região CDR3 de cadeia pesada. Preferivelmente, o mRNA é isolado de um aglomerado de células para a produção de anticorpos e é usado para cons- truir um banco de cDNA que codifica tal região em um vetor de expressão apropriado. A biblioteca de cDNA é transfectada nas células do hospedeiro, tais como NSO ou CHO e é avaliada para a produção de anticorpo específi- co e os clones específicos são identificados e isolados e usados para a pro- dução de anticorpo sem a geração de hibridoma.
As células FL são células tronco que são capazes de se desen- volver em vários tipos de células do sangue, por exemplo, células B, células T, granulócitos, plaquetas, e eritrócitos. As células tronco hematopoiéticas de fígado fetal humano comumente expressam os antígenos de superfície CD31, CD34, CDI17 (c-kit) e/ou CD133. De acordo com a presente invenção é utilizada preferivelmente uma célula FL que expressa o CD133. Como a célula FL também é uma célula precursora (isto é, uma célula tronco embri- onária), ela pode ser usada quando se desenvolve depois do tratamento com citocinas dentro de uma célula FL. As células FL que expressam CD133 podem ser isoladas do fí- gado fetal humano e são também separadas pela linhagem do CD133, pre- ferivelmente por um procedimento de separação imunomagnético, por e- xemplo, Miltenyi "sistema de separação MACS®". Outro método preferido de isolamento das células FL inclui as etapas adicionais de marcar os monóci- tos com um anticorpo CD133 conjugado com biotina e recuperar uma popu- lação positiva de células tronco CD133.
Os camundongos transportando uma mutação nula do receptor de citoquina cadeia gama comum (γο) no cromossoma X foram descritos por DiSanto, J.P. et al., Proc. NatL Acad. Sci., EUA 92 (1995) 377-381. As fê- meas TC -/- podem ser cruzadas com machos homozigotos para uma muta- ção que interrompe o gene RAG2 (Shinkai, Y. et al., Cell68 (1992) 855-867). Os machos de Fl heterozigotos para a eliminação RAG2 e homozigotos para a eliminação yc podem ser retro-cruzados nas fêmeas tc"/-RAG2+/+. O genó- tipo RAG2 da descendência resultante pode ser determinado por PCR de cauda do DNA (Horton, R.M. et al., BioTechniques 19 (1995) 690-691). Os RAG2 heterozigotos são gerados para produzir a camundongos fêmeas yc'*' RAG2 a e camundongos machos TC"/yRAG2"/' (yc7RAG2 ). Estes camundon- gos possuem uma formação variada de 129 01a, Balb/c e C57BL/6.
A imunorreconstituição de acordo com a presente invenção ocor- re pela transplantação de quantidades adequadas de células FL humanas no fígado de animais imunodeficientes recém-nascidos e pré-irradiados, por exemplo, camundongos ou ratos.
Os anticorpos monoclonais humanos de acordo com a presente invenção podem ser produzidos imunizando um animal não-humano imunor- reconstituído de acordo com a presente invenção, preferivelmente um roedor imunorreconstituído, mais preferivelmente um camundongo ou rato imunor- reconstituído, com uma preparação purificada ou enriquecida do antígeno, do ácido nucléico que codifica o dito antígeno e/ou as células que expres- sam o dito antígeno. Células B (por exemplo, células B esplênicas) do ani- mal são então obtidas e fundidas com um par de fusão humano apropriado, - tal como uma célula de mieloma para formar células de hibridoma imortais que segregam anticorpos monoclonais humanos contra o antígeno via a fu- são com um par de fusão humano apropriado, tal como uma célula de mie- loma, ou pela imortalização das ditas células com, por exemplo, a EBV. Por exemplo, os antígenos solúveis ou os fragmentos dos mesmos são opcio- nalmente conjugados a outras moléculas, e usados como imunógenos para gerar anticorpos. Para moléculas transmembrana, tais como receptores, fragmentos dos mesmos (por exemplo, o domínio extracelular de um recep- tor) podem ser usados como o imunógeno. Alternativamente, as células que expressam a molécula transmembrana podem ser usadas como o imunóge- no. Tais células podem ser derivadas de uma fonte natural (por exemplo, linhagens de células do câncer) ou podem ser células que foram transforma- das por técnicas recombinantes para expressar a molécula transmembrana. Outros antígenos e formas dos mesmos que são úteis para preparar os anti- corpos serão evidentes para aqueles versados na técnica.
Preferivelmente, o animal não-humano imunorreconstituído terá de 6 a 16 semanas da idade na primeira imunização. Por exemplo, uma pre- paração purificada ou enriquecida de DNA que codifica o antígeno de inte- resse (por exemplo, CD20 ou antígeno HER3) pode ser usada para imunizar o animal não-humano imonorreconstituído, de acordo com a presente inven- ção, por via intramuscular. A resposta imune pode ser controlada durante o curso do protocolo de imunização com amostras plasmáticas que são obti- das por coleta retroorbital de sangue. O plasma pode ser avaliado por ELI- SA, e o animal não-humano imunorreconstituído com titulações suficientes de anticorpos contra o dito antígeno pode ser usado para a imortalização das células B correspondentes. Os camundongos podem ser carregados por via intravenosa com o antígeno de interesse antes do sacrifício para a remo- ção do baço, nódulos linfáticos e sangue periférico. Considerou-se que pos- sa ser necessário executar de 2 a 3 fusões de cada antígeno. Vários ca- mundongos serão imunizados para cada antígeno.
Os linfócitos de camundongo podem ser isolados e fundidos com uma célula humana ou célula de heteromieloma usando PEG ou eletrofusão, baseado em protocolos padrão, para gerar os hibridomas. A eletrofusão é baseada em uma modificação estrutural reversível das membranas da célu- la, que é causada pelos efeitos de um campo elétrico e é aplicável em um amplo espectro de células de fusão de duas ou mais células das mesmas ou diferentes origens, incluindo as suas estruturas completas (núcleo, membra- nas, organelas, plasma celular) para criar uma nova célula viável.
Os hibridomas resultantes então são avaliados para a produção de anticorpos específicos para o antígeno. Por exemplo, suspensões sim- ples de células esplênicas e nodos linfáticos derivados de linfócitos de ca- mundongos imunizados são fundidas nas células não secretoras de hetero- mieloma K6H6/B5 (ATCC, CRL 1823). As células são distribuídas em micro- placa de fundo chato com aproximadamente 2 χ 105 células por poço, segui- da por uma incubação de até duas semanas em meio seletivo.
Os poços individuais então são analisados por ELISA em rela- ção a anticorpos monoclonais humanos contra o antígeno (por exemplo, IgG). Uma vez que tenha ocorrido um extensivo crescimento do hibridoma, o meio é analisado, normalmente depois de 10 a 14 dias. O anticorpo que se- grega hibridomas é distribuído em placa, avaliado novamente, e se ainda for positivo para anticorpos monoclonais humanos contra o antígeno, podem ser subclonados pelo menos duas vezes por diluição limitante. Os subclones estáveis são então cultivados in vitro para produzirem o anticorpo no meio de cultura de tecido para caraterização.
O antígeno pode ser introduzido no animal por qualquer meio conveniente. Preferivelmente, o animal é imunizado somente por via intra- esplênica, por via intra-venosa, por via intraperitonial, por via intradérmica, por via intramuscular, por via subcutânea ou em combinação com agentes imunomoduladores apropriados (por exemplo, CFA). A dose de cada antíge- no deve preferivelmente estar em uma faixa de variação entre 1 μg e 500 μg.
Preferivelmente, o método da presente invenção compreende a etapa adicional de fornecer ao animal uma dose de reforço auxiliar do antí- geno de 1 μg a 500 μg uma dose de reforço de 7 a 28 dias depois da última injeção. Preferivelmente, os animais são reforçados de 1 a 5 vezes.
A imunização do animal pode ser realizada com ou sem veículos farmacêuticos. Os veículos convenientes são, por exemplo, IFA, AI3(OH)4, Abisco.
Adicionalmente, esses veículos podem funcionar como agentes imunoestimulantes ("adjuvantes"). A imunização do animal pode ser realiza- da com ou sem adjuvantes adicionados aos veículos farmacêuticos.
Os adjuvantes preferidos para melhorar a eficácia da composi- ção incluem, mas não são limitados a, por exemplo: CFA, IFA, AI3(OH)4, Abisco.
As células que produzem anticorpo, preferidas para uso na pre- sente invenção, incluem as células B. Essas células que produzem anticor- pos para uso na presente invenção podem ser recuperados pela remoção de qualquer componente celular conveniente do sistema imune do animal. Pre- ferivelmente, as células que produzem anticorpo são recuperadas pela re- moção do baço, dos nódulos linfáticos, da medula óssea ou do sangue peri- férico ou de porções dos mesmos, do animal.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS.
Figura 1 Análise de citometria de fluxo de sangue periférico de camundon- gos reconstituídos na 15â semana depois da enxertia.
Enxertia de célula hematopoiética humana. Os histogramas mostram a sobreposição de células viáveis de sangue periférico atracadas de três animais representativos 15 semanas depois da reconstituição colori- da com CD45-FITC mAb (área enchida) anti-humano ou com coloração de fundo do mesmo animal com marcador isotópico, controle irrelevante mAb (linha escura) que foi usado como histograma denominador para gerar a es- tatística de histogramas sobrepostos. As estatísticas representam o número e a percentagem de eventos nas seções indicadas (Μ1, M2) em comparação com o número total de eventos dentro da porta. São mostradas as intensida- des médias de fluorescência. A:
Histograma Numerador
Arquivo: Sonda 002
Parâmetro X: Anti-hu-CD45-FITC Histograma Denominador
Arquivo: Sonda 001
Parâmetro X: Anti-hu-CD45-FITC
<table>table see original document page 20</column></row><table>
B:
Histograma Numerador
Arquivo: Sonda 004
Parâmetro X: Anti-hu-CD45-FITC
Histograma Denominador
Arquivo: Sonda 003
Parâmetro X: Anti-hu-CD45-FITC
<table>table see original document page 20</column></row><table>
C:
Histograma Numerador
Arquivo: Sonda 006
Parâmetro X: Anti-hu-CD45-FITC
Histograma Denominador
Arquivo: Sonda 005
Parâmetro X: Anti-hu-CD45-FITC
<table>table see original document page 20</column></row><table>
Figura 2 Exame da capacidade de produção de anticorpos humanos nos camundongos reconstituídos.
Figura 3 Análise de citometria de fluxo de anticorpos específicos para antí- geno humano em sangue periférico de camundongos reconstituídos na 1- semana depois da imunização.
É mostrada a proporção (%) de células positivas para antígeno coradas com diferentes diluições de soro (1/20 (C) e 1/150 (D)) de um ca- mundongo representativo reconstituído e imunizado em comparação com o soro normal do camundongo de controle (NMS) como controle negativo (29 histograma (B)) e em comparação com anticorpos específicos para antígeno purificado como um controle positivo (histograma superior (A)). As estatísti- cas representam a quantidade e a percentagem de eventos nas seções indi- cadas (os marcadores M2 e Ml mostram células positivas coradas ou negati- vas para o antígeno, respectivamente) em comparação com o número total de eventos dentro da porta. São mostradas as intensidades médias de fluo- rescência.
A: Controle Positivo
Histograma Numerador
Total de Eventos: 6764
Histograma Denominador
Total de Eventos: 7072
<table>table see original document page 21</column></row><table>
B: Controle Negativo NMS
Histograma Numerador
Total de Eventos: 7093
Histograma Denominador
Total de Eventos: 7072
<table>table see original document page 21</column></row><table>
C: Soro do Camundongo 1 (1/20) vs NMS:
Histograma Numerador Total de Eventos: 155,44 Histograma Denominador Total de Eventos: 7093
<table>table see original document page 22</column></row><table>
D: Soro do Camundongo 1 (1/150) vs NMS: Histograma Numerador Total de Eventos: 7102 Histograma Denominador Total de Eventos: 7093
<table>table see original document page 22</column></row><table>
Figura 4 Exame da capacidade de produção de anticorpos CXCR5 humanos nos camundongos reconstituídos.
Figura 5 Exame da capacidade de produção de anticorpos específicos CX- CR5 humanos nos camundongos reconstituídos após a terceira imunização.
EXEMPLOS.
Materiais e Métodos
Camundongos: camundongos Rag2'/'yc"/' em uma formação
BALB/c foram produzidos e mantidos sob condições específicas de ausência de agentes patogênicos conforme as orientação do ICH, AAALAC e Diretiva da UE sobre o Bem-Estar de Animais, 86/609.
Ensaio de repopulacão de recém-nascidos: no dia do nascimen- to, os camundongos recém-nascidos foram radiados em um intervalo de 3 a 4 horas com 2x2 Gy de uma fonte de Césio 137 (Biobeam 8000, STS GmbH, Braunschweig, Alemanha) a 2 Gy/min., uma dose que foi titulada para ser subletal. Em 4 a 12 horas após a irradiação, os camundongos foram trans- plantados com, por exemplo, células FL CD133+ sozinhas ou em combina- ção com células não-hematopoiéticas de fígado CD133" em 25 μL de PBS ou em combinação com fatores de crescimento no fígado (i.h.) utilizando uma agulha de 30G (Hamilton Bonaduz AG, Bonaduz, Suíça). Os recém-nascidos sempre receberam células de doadores únicos. Os camundongos foram desmamados em 3 semanas da idade.
Análise dos camundongos: para obter células de sangue perifé- rico e plasma, os camundongos foram sangrados a partir do seio venoso retroorbital sob anestesia com éter.
Análise de citometria de fluxo e classificação de células: Para análise FACS (citometria) e classificação de células de anticorpos monoclo- nais, biotinilados ou conjugado com FITC, PE, ou com APC contra os se- guintes antígenos, foram usados: CD3 (UCHTI), CD4 (13B8.2), CD8 (B9.11), CD40 (MAB89), CD80 (MAB104), CD83 (HB15a), CD86 (HA5.2B7) (todos com Imunotech/Beckman Coulter, Marselha, França), CD19 (HIB19), CD20 (2H7), CD34 (581), IL-3Ra/CD123 (9F5), CD11c (B-ly6) CD14 (M5E2) (todos com BD Pharmingen, San Diego, Califórnia), CD45 (HI30), CD45RA (MEM56), HLA-DR (TU36) (todos com Caltag, Burlingame, Califórnia), TLR2 (TL2.1), TLRR4 (HTA125), TCRab (IP26), (todos com Bioscience, São Die- go, Califórnia), BDCA-I, BDCA-2, BDCA-4, CD25 (4E3) (todos com Miltenyi Biotec), IgM (Jackson lmmunoresearch, West Grove, Pensilvânia), CCR7 (3D12, fornecido por M. Lipp, Berlim, Alemanha). O teste IOTest Beta Mark foi usado para análise Vb (Imunotech/Beckman Coulter). FITC, PE, ou APC conjugados com estreptavidina (todos da BD Pharmingen) foram usados para a visualização de anticorpos biotinilados. As células mortas foram ex- cluídas por coloração com iodeto de propídio. O isotipo combinado adequa- do, o controle irrelevante mAbs foram usados para determinar o nível de co- loração de fundo. As células foram analisadas utilizando-se um equipamento FACScaIibur e classificadas utilizando um equipamento FACSVantage SE (Sistemas de Imunocitometria da Becton Dickinson, Mountain View, Califór- nia).
Células de Fígado Fetal: Fontes de células de fígado fetal: Cam- brex Corp., EUA e StemCeII Technologies Corp., EUA. Exemplo 1 Procedimento para imunização de camundonqos reconstituídos.
Três camundongos Rag2-/-γc-/- (3 fêmeas), foram imunizados com 100 μg de plasmídio com codificação de DNA da proteína HER3 huma- na. Em um total de até seis imunizações dadas por via intramuscular (i.m.). Quando as titulações do soro de anti-HER3 foram consideradas suficientes, os camundongos foram adicionalmente reforçados três vezes com 30 μg de proteína HER3 purificada em 100 μg de PBS por via intravenosa (i.v.) 3, 2 e 1 dias antes da fusão. Exemplo 2
Análise de citometria de fluxo do sangue periférico de camun- dongos reconstituídos na 15ê semana depois da enxertia.
Os camundongos foram anestesiados com isoflurano e o sangue periférico foi coletado do plexo veno-orbital para medir a proporção positiva de hemócitos humanos pelo uso da citometria de fluxo. O sangue coletado foi imediatamente misturado com EDTA-2Na e conservado na temperatura ambiente até a análise. Uma quantidade ótima de FITC conjugado com anti- corpos CD45 anti-humanos foi acrescentada e reagiu com 50 μΙ de sangue total na temperatura ambiente durante 20 minutos. Depois disso, a hemólise e a imobilização foram realizadas usando uma solução de FACS e a propor- ção foi medida usando o FACSCalibur. A Figura 1 mostra a proporção (%) de células positivas CD45 humanas no sangue periférico de três camundon- gos testados.
Exemplo 3
Exame da capacidade de produção de anticorpos HER3 huma- nos nos camundongos reconstituídos.
A quantidade do ser IgG humana total no sangue periférico de camundongos reconstituídos foi medida por ELISA. O soro diluído de ca- mundongos foi revestido em uma microplaca MaxiSorb 96 cavidades (NUNC) e incubado por 1 hora na temperatura ambiente. Depois de bloquear com a solução de Croteína C a 2% por 1 hora na temperatura ambiente a lavagem foi realizada e depois disso foi acrescentado o conjugado de pero- xidase com o anticorpo monoclonal anti-lgG humana. Depois que de uma incubação durante 45 minutos na temperatura ambiente a lavagem foi reali- zada e uma solução de substrato de ABTS foi acrescentada na reação de 10 minutos na temperatura ambiente. Então a absorbância foi medida a 405 nm (Figura 2). A concentração de IgG foi calculada de acordo com a curva pa- drão.
Exemplo 4
Análise de citometria de fluxo de anticorpos HER3 humanos no sangue periférico de camundongos reconstituídos na 1- semana depois da imunização.
17 semanas depois dos camundongos reconstituídos terem sido imunizados com a proteína humana de interesse. A imunização foi realizada por via intramuscular com 25 μg a 100 μg/camundongo de DNA codificando uma proteína humana de interesse em conjunto com o coquetel de citoqui- nas como adjuvante para o aumento da resposta imunológica. A mesma i- munização foi realizada a cada quatro semanas e o soro foi coletado para medir os anticorpos específicos contra a proteína humana por FACS. O anti- soro pouco diluído foi acrescentado às células expressando proteínas hu- manas e incubado durante 20 minutos na temperatura ambiente. Depois da lavagem uma quantidade ótima de anticorpos anti-humanos conjugados com FITC foram acrescentados e reagiram com as células durante 20 minutos adicionais na temperatura ambiente. Depois disso, a proporção positiva de células coradas expressando proteínas humanas foi medida usando FACS- Calibur. A Figura 3 mostra a proporção (%) de células positivas para proteí- na humana coradas com uma diluição diferente de soro (1/20 e 1/150) uma de camundongos reconstituídos e imunizados em comparação com soro de camundongo normal (NMS), como controle negativo, ou contra anticorpos específicos para proteína humana purificada, como um controle positivo.
Exemplo 5
Seleção Positiva de células CD19+ usando Dvnabeads®.
As Células B CD19+ foram isoladas diretamente do sangue peri- férico ou de uma suspensão de esplenócitos de acordo com os protocolos padrão de Dynal Dynabeads® CD19 (Pan B) (Produto Ne. 111.03/111.04) e DETACHaBEAD® CD19 (Produto Ne. 125.06):
- Acrescente 25 μΙ de Dynabeads® a, por exemplo, 2,5x107 célu- las preparadas.
- Incubar por 20 minutos em 2 a 8°C com rotação e leve agita- ção.
- Coloque o tubo em um magneto por 2 minutos.
- Despreze o sobrenadante e lave suavemente 4 vezes as célu- las ligadas nas pérolas, usando o seguinte procedimento:
- Acrescente 1 ml do Tempão 1 por 1 χ 107 Dynabeads®.
- Coloque o tubo no magneto por 1 minuto e despreze o sobre- nadante.
- Ressuspender as células no tampão/meio por aplicação a ju- sante.
Exemplo 6
Eletrofusão para a geração do hibridoma.
As células isoladas de CD19+ foram contadas e fundidas via pro- tocolos de eletrofusão (aplicação Eppendorf de Eletrofusão NQ. 58):
- Colher tanto as células CD19+ isoladas quanto o par de fusão, por exemplo, K6H6/B5 por centrifugação (200 χ g, 10 minutos Temp. Ambi- ente).
- Ressuspender os péletes no meio de crescimento e determinar o número de células.
- Ajuste o número de células de cada par de fusão para, por e- xemplo, 3x105 por fusão.
- Pipetar em conjunto ambos os pares e centrifugar em 200 χ g durante 10 minutos na temperatura ambiente.
- Lavar os péletes duas vezes no tampão de electrofusão, centri- fugar como descrito acima.
- Ressuspender os pérletes em 200 μΙ do tampão de eletrofusão por fusão.
- Encher a câmara de fusão e fundir imediatamente (ver o proto- colo de apicação para o Fusionapparat, Eppendorf). - Seguir a fusão, deixando as câmaras em repouso por 10 minu- tos na temperatura ambiente.
- Enxaguar a câmara com o meio e transferir as células fundidas para as placas de clonagem.
- Acrescentar o meio de seleção HAT depois da incubação de 24 horas (5 % de CO2, 37 °C).
- Depois da incubação de 7 a 21 dias contar e analisar os híbri- dos.
Hibridomas humanos cultivados (40 clones) foram analisados 14 dias depois da fusão para proteínas totais e IgG específicas para proteínas humana em ELISA estabelecido e pelo menos 6 clones foram detectados como positivos.
<table>table see original document page 27</column></row><table>
Exemplo 7.
Procedimento de imunização de camundonqos reconstituídos
Três camundongos Rag2-/-yc-/- (4 fêmeas), foram imunizados com 100 μg de plasmídio codificando o DNA para a proteína CXCR5 huma- na. Um total de até seis imunizações foi dada por via intramuscular (i.m.).
Reforço dos Camundongos.
Quando as titulações de anti-CXCR5 foram consideradas sufici- entes, os camundongos foram adicionalmente reforçados três vezes com 5x106 de células expressando CXCR5 em 100 μg de PBS por via intraveno- sa (i.v.) 3, 2 e 1 dias antes de fusão. Exemplo 8.
Exame da capacidade de produção de anticorpos humanos CX- CR5 nos camundonqos reconstituídos A quantidade do ser IgG humana total no sangue periférico de camundongos reconstituídos foi medida por ELISA. O soro diluído de ca- mundongos foi revestido em uma microplaca MaxiSorb 96 cavidades (NUNC) e incubado por 1 hora na temperatura ambiente. Depois de bloquear com a solução de Croteína C a 2% por 1 hora na temperatura ambiente a lavagem foi realizada e depois disso foi acrescentado o conjugado de pero- xidase com o anticorpo monoclonal anti-lgG humana. Depois que de uma incubação durante 45 minutos na temperatura ambiente a lavagem foi reali- zada e uma solução de substrato de ABTS foi acrescentada na reação de 10 minutos na temperatura ambiente. Então, a absorbância foi medida a 405 nm (Figura 4). A concentração de IgG foi calculada de acordo com a curva padrão (250 μg/ml de IgG humana total).
Exemplo 9
Análise de anticorpos CXCR5 humanos em camundongos re- constituídos depois de terceira imunização.
A quantidade de IgG específica para CXCR5 humano no soro de camundongos reconstituídos foi medida por ELISA específica para CXCR5 (Figura 5). O soro diluído de camundongos foi revestido em uma microplaca MaxiSorb 96 cavidades (NUNC) e incubado por 1 hora na temperatura am- biente. Depois de bloquear com a solução de Croteína C a 2 % por 1 hora na temperatura ambiente, a lavagem foi realizada e depois disso foi acrescen- tado o conjugado de peroxidase com o anticorpo monoclonal anti-lgG huma- na. Depois que de uma incubação durante 45 minutos na temperatura ambi- ente a lavagem foi realizada e uma solução de substrato de ABTS foi acres- centada na reação de 10 minutos na temperatura ambiente. Então a absor- bância foi medida a 405 nm.

Claims (24)

1. Método para a produção de um anticorpo monoclonal humano a partir de um animal não-humano imunodeficiente, o dito método compre- endendo colocar em contato um animal não-humano imunodeficiente recém- nascido com uma célula tronco de fígado fetal humano (célula FL) para gerar um animal não-humano imunotransplantado (animal reconstituído), posteri- ormente colocando em contato o dito animal reconstituído com um antígeno, coletando do dito animal reconstituído uma célula humana que produz anti- corpo humano contra o dito antígeno, e isolando o dito anticorpo da dita cé- lula produtora de anticorpo.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito animal não-humano imunorreconstituído é um roedor.
3.Método de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o dito animal não-humano reconstituído é um camundongo ou um rato.
4. Método de acordo com as reivindicações de 1 a 3, caracteri- zado pelo fato de que o dito camundongo reconstituído é um camundongo Rag2"/"7C"/\ um camundongo nu 2-1-, um camundongo NOD ou um camun- dongo bege SCID.
5. Método de acordo com as reivindicações de 1 a 4, caracteri- zado pelo fato de que a dita célula FL é uma célula tronco hematopoiética de fígado fetal humano (célula HFL).
6. Método de acordo com as reivindicações de 1 a 5, caracteri- zado pelo fato de que a dita célula FL é uma combinação de uma célula HFL e uma célula tronco de fígado fetal não-hematopoiética humana.
7. Método de acordo com as reivindicações de 1 a 6, caracteri- zado pelo fato de que a dita célula de produção de anticorpo é uma Célula B humana.
8. Método de acordo com as reivindicações de 1 a 7, caracteri- zado pelo fato de que o antígeno é um polipeptídio.
9. Método de acordo com as reivindicações de 1 a 8, caracteri- zado pelo fato de que o antígeno é colocado em contato com o animal re- constituído como antígeno, fragmento de antígeno, complexo MHC/peptídio, antígeno codificando um DNA e/ou célula carregando antígeno.
10. Método de acordo com as reivindicações 1 ou 9, caracteriza- do pelo fato de que o animal não-humano reconstituído é subletalmente irra- diado antes de ser colocado em contato com a célula FL.
11. Método de acordo com as reivindicações de 1 a 10, caracte- rizado pelo fato de que o camundongo é colocado em contato a primeira vez com o antígeno de 5 a 18 semanas depois de colocar o dito camundongo em contato com a dita célula FL.
12. Método de acordo com as reivindicações de 1 a 11, caracte- rizado pelo fato de que o camundongo é colocado em contato com o antíge- no por até dez vezes.
13. Método de acordo com as reivindicações de 1 a 12, caracte- rizado pelo fato de que a dita célula coletada é uma célula humana CD19+ ou CD22+.
14. Método de acordo com as reivindicações de 1 a 13, caracte- rizado pelo fato de que a dita célula é estabelecida pela tecnologia de hibri- domas.
15. Método de acordo com as reivindicações de 1 a 14, caracte- rizado pelo fato de que a linhagem celular de fusão de pares é uma linhagem celular MFP-2, HK-128, K6H6/B5 ou Karpas 707.
16. Método para a produção de diversas células B humanas produzindo diversos anticorpos humanos contra um antígeno, o dito método sendo caracterizado pelo fato de colocar um animal não-humano imunodefi- ciente recém-nascido em contato com uma célula FL para gerar o animal imuno reconstituído, posteriormente colocando o dito animal reconstituído em contato com um antígeno, coletando a dita pluralidade de anticorpos produzindo células B humanas para fora do dito animal não-humano.
17. Pluralidade de células B humanas produzindo uma pluralida- de completa de anticorpos humanos contra uma proteína humana.
18. Composição de células B imortais fornecendo uma pluralida- de completa de anticorpos humanos contra uma proteína humana.
19. Uso de um animal reconstituído para a produção de uma va- riedade de células B imortais, produzindo uma pluralidade completa de anti- corpos humanos contra uma proteína humana.
20. Método para a produção recombinante de um anticorpo, ca- racterizado pelo fato de se colocar em contato um animal não-humano imu- nodeficiente recém-nascido com uma célula FL, posteriormente colocando o dito animal não-humano em contato com um antígeno, coletando do dito a- nimal não-humano uma célula humana que produz anticorpo humano contra o dito antígeno, e isolando o dito antígeno, seqüenciando as regiões variá- veis, construindo vetores de expressão codificando pelo menos CDRs de cadeia pesada e/ou de cadeia leve, combinado com uma cadeia constante humana, expressando os ditos vetores nas células hospedeiras adequadas e isolando o dito anticorpo (proteína imunorreativa) das ditas células hospedei- ras ou do sobrenadante de fermentação.
21. Método para a produção recombinante de um anticorpo, ca- racterizado pelo fato de colocar um animal não-humano imunodeficiente re- cém-nascido em contato com uma célula FL, posteriormente colocar o dito animal não-humano em contato com um antígeno, coletando do dito animal não-humano uma célula humana que produz anticorpo humano contra o dito antígeno, e isolando o mRNA da dita célula humana que produz anticorpo humano, gerando anticorpo cDNA específico (por exemplo, pelo uso de ini- ciadores específicos para imunoglobulina), construindo vetores de expressão que codificam pelo menos CDRs de cadeia pesada e/ou de cadeia leve, combinado com uma cadeia constante humana, expressando os ditos veto- res nas células hospedeiras adequadas e isolando o dito anticorpo (proteína imunorreativa) das ditas células hospedeiras ou do sobrenadante da fermen- tação.
22. Uso da pluralidade de células B humanas compreendendo a pluralidade completa de genes de imunoglobulina humana contra um antíge- no para a geração de um anticorpo monoclonal contra o dito antígeno, carac- terizado pelo fato de que a dita pluralidade de células B tem uma concentra- ção de pelo menos 106 células B/ml para a produção de uma célula de hibri- doma.
23. Método para a seleção de uma célula imortal produzindo um anticorpo humano exibindo ligação específica a um antígeno, o dito método sendo caracterizado pelo fornecimento de uma pluralidade de células B hu- manas do baço de um animal não-humano produzindo uma pluralidade completa de anticorpos humanos, fundindo as ditas células, ou um subcon- junto das mesmas, com uma célula imortal de mieloma ou imortalizando as ditas células B ou um subconjunto pela transformação EBV, e selecionando uma célula de hibridoma produzindo um anticorpo humano exibindo ligação específica ao dito antígeno.
24. Método para a seleção de uma célula imortal produzindo um anticorpo exibindo afinidade de ligação específica de pelo menos 10"6 mol/l a um antígeno, o dito método sendo caracterizado pelo fornecimento de uma pluralidade de células B humanas provenientes do baço de um animal não- humano produzindo uma pluralidade completa de anticorpos humanos, fun- dindo as ditas células, ou um subconjunto das mesmas, com uma célula i- mortal de mieloma ou imortalizando as ditas células B, ou seu subconjunto, pela transformação EBV, e selecionando uma célula de hibridoma produzin- do um anticorpo exibindo afinidade de ligação específica de pelo menos 10"6 mol/l a um antígeno.
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