TW200813086A - Immunereconstituted mouse - Google Patents

Description

200813086 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於產生抗體之方法、抗體產生細胞之址合 物、其產生方法及其用途。 【先前技術】 長期以來將單株抗體（MAB)視為用於癌症、感染或自體 免疫疾病等之免疫療法中的魔方(magic bullet)。然而，第 一代用於人類之鼠抗體由於人類抗小鼠免疫反應而相當失 敗。 人類抗體大多數衍生自具有受限人類1§基因組之轉殖基 團小鼠，或選自使用噬菌體呈現、酵母呈現或類似重組技 •術之大型人造抗體庫σ已設計該等策略以消除任何對抗人 類背景中單株抗體之免疫反應。人類抗體可產生於能夠經 由免疫作用在不產生内因性免疫球蛋白之情況下產生人類 抗體的轉殖基因動物（例如小鼠）中。人類生殖細胞系（胚 系）(germ line)免疫球蛋白基因陣列在該生殖細胞系轉殖基 因小鼠中之轉移導致經由抗原挑釁產生人類抗體（參看例 如 van Dijk，Μ·Α·及 van de Winkel，J.G·，Curr. Opin· Chem. Biol. 5 (2001) 368-374; Jakobovits，A.等人，Proc· Natl· Acad. Sci· USA 90 (1993) 255 1_2555 ; Jakobovits，A·等 人，Nature 362 (1993) 255-258 ; Bruggemann，M等人， Year Immunol· 7 (1993) 33-40)。人類抗體亦可產生於噬菌 體呈現庫中（Hoogenboom，H.R.及 Winter，G.，J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388 ; Marks, J.D·等人，J· Mol· Biol. 222 120514.doc 200813086 (1991) 581·:5 97)。Cole等人及B0erner等人之技術亦可用於 製備人類單株抗體（Cole等人，Monocl〇nal Antibodies and

Cancer Therapy，Alan R. LisS，第 77頁（1985);及 Boerner， Ρ·等人，J· Immunol· 147 (1991) 86j5)。然而，該等轉殖 基因小鼠僅能夠提供具有受限人類Ig基因組之抗體—其來 自於經轉染之免疫球蛋白基因陣列。 基於針對人類免疫球蛋白基因之小鼠轉殖基因的方法已 允許生成衍生自人類生殖細胞系序列之抗體，其據報導已 相較於鼠或小鼠-人類嵌合抗體而言降低所得抗體藥妫之 免疫原性。然而，衍生自轉殖基因小鼠之人類抗體在其多 樣丨生、親和性及特異性方面與天然人類免疫系統全部 (immune repertoires)相比有所限制。 類似地，基於噬菌體呈現或酵母呈現之組合庫方法的主 要缺陷在於抗體重鏈及輕鏈之隨機配對。原始抗體重鏈及 輕鏈配對（非同源配對）之解離需要筛選大量純系以識別高 親和性之重鏈及輕鏈配對。另外，該等非同源配對可展現 對於人類自體抗原而言非所要之交又反應性。最後，藉由 組合庫之選擇及篩選所識別之靶向特異性抗體的遺傳多樣 性由於固有選擇偏差而通常為有限的。

Traggai, E.f A ^ Science 304 (2004) 104-107^^-¾ 用於在人類臍帶血（eGrd blQGd)細胞移植㈣Μ卞小鼠 中研發人類免㈣、統之方法，其可用作臨床前模型以評估 料疫苗或活感染性病原體及對於以人類免疫系統絲之 樂理學化合物的反應。顯示經重組且隨後經病原體接種之 120514.doc 200813086 小鼠可產生低水平之破傷風類毒素特異性抗體反應。 【發明内容】 本發明包含一種用於自免疫缺乏非人類動物產生人類單 株抗紐之方法’忒方法包含使新生免疫缺乏非人類動物與 ; 人類胚胎肝幹細胞（FL細胞）接觸，以生成免疫移植之非人 • 類動物（重組動物），隨後使該重組動物與抗原接觸，自該 重、、且動物收集產生對抗該抗原之人類抗體的人類細胞，且 ζ, 自泫抗體產生細胞分離該抗體。 本發明較佳包含一種根據本發明之方法，其特徵在於較 佳藉由轉化方法或細胞融合方法形成該抗體產生細胞，即 永生抗體產生細胞。該永生細胞較佳能夠存活至少5〇繼 代。 口亥非人類動物較佳為齧齒動物，且更佳為小鼠、大鼠或 兔進步較佳的疋，小鼠為Rag2-/-yc-/-、裸Rag2-/_、 NOD(NOD意謂根據本發明較佳為N〇IXCg· 〇 ㈣或SCID beige小鼠，且大鼠為裸大 鼠。 本&明包含一種根據本發明之方法，其特徵在於該 • 胞為人類造血胚胎肝幹細胞（HFL細胞），較佳為cD133+、 • CD117+、CD31+及 /或 CD34+。 在另一實施例中，該方法之特徵較佳在於該FL細胞為 HFL細胞與人類非造血胚胎肝幹細胞之組合。 本發明包含一種根據本發明之方法，其特徵在於該抗體 產生細胞為人類B細胞。 120514.doc 200813086 本發明包含-種根據本發明之方法，其特徵在於該几細 胞係用於經腹膜内、皮下或肝内接觸性注射至動物體内。 、本發明包含-種根據本發明之方法，其特徵在於該抗原 為多肽、MHC/肽錯合物或DNA。 、亡發明包含一種根據本發明之方法，其特徵在於該抗原 以抗原、抗原片段、編碼抗原之簡八及/或帶有抗原之細 胞形式與重組動物接觸。 f Ο 本發明包含-種根據本發明之方法，其特徵在於該免疫 缺乏非人類動牧在與F L細胞接觸前經亞致命性照射。 本發明包含-種根據本發明之方法，其特徵在於當小鼠 與該FL細胞㈣5至18職使料鼠與抗原首次接觸。 本發明包含一種根攄太菸日月夕古、、土 很骒桊嗌明之方法，其特徵在於該小鼠 與抗原至多接觸1 〇次。 其特徵在於所收集 其特徵在於該細胞 其特徵在於融合搭 本t明包含一種根據本發明之方法 之該細胞為人類€〇19+或0〇22 +細胞。 本發明包含一種根據本發明之方法 係藉由融合瘤技術而形成。 本發明包含一種根據本發明之方法 配物細胞株為MFP-2、Ηκ]28、K6H6/B5或“㈣川人細 胞株。 本發明包含一種用於產生多數人類B細胞（其產生全部多 數對抗抗原之人類抗體）之方法，該方法之特徵在於使新 生免疫缺乏非人類動物與FL細胞接觸以生成免疫重組動 物，隨後使該重組動物與抗原接觸，收集該等人類^細 120514.doc 200813086 胞，產生該全部多數抗體。 本發明包含非人類動物用於產生根據本發明之抗原產生 X生、’、田胞的用返。若该永生細胞為融合瘤細胞，則用於生 成融合瘤之一種融合搭配物為來自該移植及重組動物之人 : 類B細胞，另一融合搭配物為例如來自人類、齧齒動物或 • 其他動物之骨髓瘤細胞。或者，藉由EBV轉化作用生成永 生移植及重組B細胞。 (、 本發明包含多數人類B細胞，其產生全部多數對抗人類 蛋白之人類抗體。 本發明包含永生細胞之組合物，其提供全部多數對抗人 類蛋白之人類抗體。 本發明包含重組動物用於產生多數永生B細胞（其產生全 部多數對抗人類蛋白之人類抗體）之用途。 本發明包含一種用於在非人類動物體内生成及產生單株 人類抗體之方法，該抗體係針對與該非人類動物之相應蛋 〇 白至少80%(BLAST)同源之人類蛋白（包括片段）。如此: 一實例為CXCR5。人類及鼠CXCR5為84%同源。因此，本 發明提供一種用於生成對抗高度保守性蛋白或蛋白區之人 • 類抗體的方法，即使人類與該非人類動物之間的蛋白或其 - 片^又為至少95 0/〇或以上同源或甚至1 0Q%同源。 因此，本發明之另一目標為對與非人類動物（較佳為小 鼠、大鼠及/或兔）之相應蛋白具有至少95%、較佳98%且甚 至1〇〇%同源性（BLAST)之人類蛋白具有特異性之單株人類 抗體。本發明之一較佳目標為對與相應鼠（小鼠）蛋白具^ 120514.doc -10- 200813086 至少95%、更佳98%且甚至100%同源性（BLAST)之人類蛋 白具有特異性之單株人類抗體。 本發明包含一種用於抗體之重組產生的方法，其特徵在 於使新生免疫缺乏非人類動物與FL細胞接觸，隨後使該非 人類動物與抗原接觸，自該非人類動物收集產生對抗該抗 原之人類抗體的人類細胞，且分離該抗體，對可變區定 序’建構與人類恆定鏈組合之編碼重鏈及/或輕鏈，至少

L) 編碼CDR之表現載體，在適當宿主細胞中表現該（等）載 肢’且自該（等）宿主細跑或撥酵上清液分離該抗體（免疫反 應性蛋白）。 本發明包含一種用於重組產生抗體之方法，其特徵在於 使新生免疫缺乏非人類動物與几細胞接觸，隨後使該非人 類動物與抗原接觸，自該非人類動物收集產生對抗該抗原 ^人類抗體的人類細胞，且自該產生人類抗體之人類細胞 刀離mRNA，生成抗體特異性cDNA(例如藉由利用免疫球 蛋白特異性引子），建構與人類怪定鏈組合編碼重鏈及/或 fe鏈’至少編碼CDR之表現載體，在適當宿主細胞中表現 該（等）載體，且自該⑷宿主細胞或酸酵上清液分離該抗 體（免疫反應性蛋白）。 本發明包含一種用於選擇產生展示與抗原特異性結合之 人類抗體之水生細胞的方法，該方法之特徵在於自產生全 二多數人類抗體之非人類動物脾臟提供多數人類B細胞， 使该等細胞或其亞群盘永吐 各从 ^ 水生月^瘤細胞融合或藉由EBV轉 乍用使该等B細胞或亞群永生 &玍化且選擇產生展示與該 120514.doc 200813086 抗原特異性結合 之人類抗體之融合瘤細胞。 本發明包含—插^ 用於選擇產生對至少1·5 gg/ml量之抗原 展不至少兔1 τ ; 胞之方、、' mo 1之特異性結合親和性之抗體的永生細 # 名方去之特徵在於自產生全部多數人類抗體之 : ’動：脾臟提供多數人類B細胞，使該等細胞或其亞 ： I、水生骨髓瘤細胞融合或藉由EBV轉化作用使該等B細 3亞夢永生化，且選擇產生對抗原展示至少10_6 mol/ι之 G #異性結合親和性之抗體的融合瘤細胞。 經分離抗體之量較隹為至少1.5 卜 該抗體較佳對該抗原展示至少1〇-9则社特異性結合親 和性。 【實施方式】 /餘""王邛夕數人類抗體或人類免疫球蛋白基因"係指包 含或編碼下列各鏈之抗體或免疫球蛋白基因·· -來自染色體2(76個基因，其中31至35個為官能性的） 〇 上2pl1處之至少20個、較佳至33個κ基因之κ鏈， -來自染色體22上22qll位置處之至少2〇個、較佳“至 33個λ基因與J基因之人鏈；（存在4至5個官能性人鏈基 ’ 因，其各自均位於XJ基因之後），及 • _來自染色體14(〗1個重鏈基因，其中9個為官能性的 且分別對應於9個重鏈同型μ、δ、γ1、γ2、、_、 αΐ、α2及ε)上14q32處之至少5個、較佳9個重基因之 重鏈。 舉例而言，抗原可為衍生自人類之物質，如人類蛋白、 1205I4.doc -12- 200813086 激素、與腫瘤相 之人㈣“ 脂(例如us 5,091，178)或天然存在 之人類新陳代射φ % —人 災 衍生之μΓ 另—㈣。抗原亦可為非人類 I马健康人類所耐受 7又之物貝以便人類不會以對抗該 原之可偵測方式來研發抗體。 術語’’人類| ώ，，/ 、 （八包括多肽）係指人類之任竟蛋白，盆 經天然耐受或在 ^ 〜、 八 體免疫疾病中受侵襲。根據熟習此項技 仳之知硪，術語’’人類蛋白，，亦包括該蛋白之片段，其能

Ο 目° 1對於根據本發明合適之非人類動物體内之人類蛋白 具有特異性之抗體。舉例而言，$等片段可包括於較大蛋 白中，例如已熟知藉由使用來自另—物種（如小f〇之同源 蛋白的免疫作用可引入對抗人類蛋白之抗體。人類蛋白較 佳為耐受人類蛋白。 術耐又人類蛋白”係指天然耐受且在自體免疫疾病中 不受侵襲之人類蛋白，該等自體免疫疾病例如古德巴斯德 氏症候群（G〇〇dpasture，s Syndr〇me)、胰島素依賴型糖尿病 (IDDM)、免疫性溶血性貧血、免疫性血小板缺乏紫斑 症、重症肌無力（MG)、多發性硬化症（MS)、類風濕性關 節炎、全身性紅斑性狼瘡症（SLE)或甲狀腺中毒症（葛瑞夫 茲氏病（Graves1 disease))。 舉例而言，人類蛋白可為跨膜分子（例如受體）或配位體 (諸如生長因子）。例示性抗原包括諸如腎素之分子；生長 激素、生長激素釋放因子’·副甲狀腺激素；f狀腺刺激激 素，脂蛋白；α-l-抗胰蛋白酶；胰島素a鏈；胰島素B鏈，· 胰島素原，毛囊刺激激素；降血約素；促黃體生成激素； 1205I4.doc -23- 200813086 升糖素；凝血因子，諸如因子VIII、因子IX、組織因子 (TF)及溫韋伯氏因子（von Willebrands factor);抗凝血因 子，諸如蛋白C ;心房利尿鈉（natriuretic)因子；肺界面活 性劑；胞漿素原（plasminogen)活化劑，諸如床激酶或人類 尿或組織型胞漿素原活化劑（t-PA);鈴蟾素（bombesin);凝 血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因子α及β ;腦啡肽酶 (enkephalinase) ; RANTES(調節活化正常Τ細胞表現及分 泌）；人類巨噬細胞發炎性蛋白（MIP-1-α);血清白蛋白， 諸如人類血清白蛋白；缪勒抑制物質（Muellerian-inhibiting substance);鬆弛素A鏈；鬆他素B鏈；鬆弛素原 (prorelaxin);小鼠促性腺激素相關肽；微生物蛋白，諸如 β-内醢胺酶；DNase ; IgE ;細胞毒性T淋巴細胞相關抗原 (CTLA)，諸如CTLA-4 ;抑制素；活化素（activin);血管内 皮生長因子（VEGF);激素或生長因子之受體；蛋白A或 D ;類風濕因子；神經營養因子，諸如骨源性神經營養因 子（BDNF)、神經營養激素（neurotrophin)-3、-4、-5 或-6 (NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)或神經生長因子，諸如NGF-b ; 血小板衍生之生長因子（PDGF);纖維母細胞生長因子，諸 如aFGF及bFGF ;表皮生長因子（EGF);轉化生長因子 (TGF)，諸如 TGF-α及 TGF-β，其包括 TGF-bl、TGF-b2、 TGF-b3、TGF-b4或TGF-b5 ;腫瘤壞死因子（TNF)，諸如 TNF-a或TNF-β ;類胰島素生長因子-I及-II ;類胰島素生長 因子結合蛋白；CD蛋白，諸如CD3、CD4、CD8、CD19、 CD20、CD22及CD40 ;紅血球生成素；骨誘導因子；免疫 120514.doc -14- 200813086 毒素；骨形態形成蛋白（BMP);干擾素，諸如干擾素-α、-β 及-γ ;群落刺激因子（CSFs)，例如M-CSF、GM-CSF及 G-CSF ;介白素（ILs)，例如 IL-l、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、 IL-6、IL-7、IL-8、IL-9及IL-10 ;超氧化物歧化酶；T細胞 受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒抗原，諸如一部 分AIDS包膜；轉運蛋白；回歸受體（homing receptors);地 址素；調節蛋白；整合素，諸如CDlla、CDllb、 CDllc、CD18、ICAM、VLA-4 及 VCAM ;腫瘤相關抗原， 钱‘ WFT? 9、WFR 3式ΗΠΡΤ? 4奋總：马紅右Γ卜♦折别恭厶少Η 段。其他人類蛋白為ErbB受體家族之成員，諸如EGF受 體、HER2、HER3或HER4受體；腫瘤壞死受體總科之成 員，包括DR5 ;前列腺幹細胞抗原（PSCA);細胞附著分 子，諸如 LFA-1、Macl、pl50.95、VLA-4、ICAM-1、 VCAM、α4/β7整合素及αν/β3整合素，包括其α或β次單位 (例如抗-€〇11&、抗-0〇18或抗-€〇1113抗體）；組織因子 (TF) ; α干擾素（α-IFN);介白素，諸如IL-8 ; IgE ;血型抗 原；flk2/flt3受體；肥胖（OB)受體或mpl受體。 術語”永生細胞”係指融合瘤細胞或藉由其他方法（諸如 EDV轉化、端粒酶置換或反轉錄病毒永生化）永生化之細 胞。 如本文所用之術語n動物”係指非人類動物，較佳為齧齒 動物且尤其較佳為小鼠或大鼠。 該非人類動物較佳為齧齒動物且更佳為小鼠、大鼠或 兔。進一步較佳的是，小鼠為Rag2-/-yc-/-、裸Rag2-/-、 120514.doc -15 - 200813086 NOD或SCID beige小鼠且大鼠為裸大鼠。 SCID beige為攜帶scid突變之雙突變小鼠，scid突變由於 V(D) J重組缺陷而導致缺乏τ淋巴細胞及b淋巴細胞。其亦 攜帶beige突變，該突變導致細胞毒素τ細胞及巨噬細胞缺 陷以及NK細胞功能之選擇性損傷。SCID beige小鼠潛在地 為用於接收人類造血細胞之改良模型。

較佳 NOD小鼠為NOD.Cg-i?%产/处/szj、NOD.Cg-Prkdcscld Il2rgtmlWjl/Szl、NOD. 129S7(B6)-7?ag；rm/Mom/J、 ^QO.Cg^Prkdcscld B2mtmlUnc/] ^^nD.CBl7-Prkdcscid/Sz1 〇 母一菌株均缺乏成熟T細胞及B細胞，且不具有可彳貞測之 NK細胞毒素活性。該等菌株支持以人類造血細胞之增強 移植，具有相對較長壽命且顯著更耐照射。 對於在T細胞及b細胞中生成官能性抗原受體之 V(D)J基因重排而言不可或缺；純合突變體不具有 成热之官能性T細胞及B細胞。常見γ(γε) κ〇小鼠缺乏對於 多種細胞激素（包括IL-2、IL_4、IL_7、IL_9及IL_15)之官 能性文體》因此’、淋巴細胞發育受到極大危害。該小氣缺 乏自然殺手（NK)細胞且僅產生少量τ細胞及B細胞。 如本文所用之術語，，人類抗體"包括具有可變及恒定區（址 構域）之抗體，其可分配至經界定之人類生殖細胞系免疫 球蛋白序列，此係由於盆盘诗隹 ，、興及專生殖細胞系序列之高度序 列相似性或-致性。人類抗體涵蓋多種形式之抗體，較佳 為單株抗體’其包括（但不限於）完整抗體、單—重鏈或輕 鏈、抗體片段、轉型抗體及經基因工程設計之抗體(變異: 120514.doc -16- 200813086 體或突變體抗體），其限制條件為保留本發明之特徵性特 性。尤其較佳者為重組人類抗體。如本文所用之術語，，單 株抗體’’係指均具有大體上相同之胺基酸序列之抗體分子 的製備。 如本文所用之術語”重組人類抗體”預期包括所有藉由重 組方式製備、表現、形成或分離之人類抗體，諸如自宿主 細胞（諸如NSO、HEK 293或CHO細胞）分離之抗體，其包含 能夠表現該抗體之重鏈及/或輕鏈且能夠轉染至該宿主細 胞中之重絚表現載體.該等重組人類抗體具有重排形式之 可變及恆定區。根據本發明之重組人類抗體已經受活體内 體細胞超突變。因此，重組抗體之VH&VL區的胺基酸序 列為可分配至經界定人類生殖細胞系VH& VL序列，但可 月&並非天然存在於活體内人類抗體生殖細胞系清單中的序 列。 如本文所用之，，可變區”（輕鏈可變區（VL)、重鏈可變區 (VH))表示抗體與抗原之結合中直接所涉及之各對輕鏈及 重鏈。可變人類輕鏈及重鏈之結構域具有相同通式結構且 每一結構域包含四個構架（FR)區，其序列係廣泛保守的， 藉由三個’’高變區”（或互補判定區，CDR)相連接。該等構 架區採用P(beta)薄片構造，且該等CDR可形成與β薄片結 構相連接之環。各鏈中之CDR藉由構架區保持其三維結 構，且與來自其他鏈之CDR—起形成抗原結合位點。抗體 重鏈及輕鏈CDR3區（較佳為重鏈CDR3)在根據本發明之抗 體的結合特異性/親和性中具有尤為重要之作用，且因此 120514.doc -17- 200813086 提供本發明之另一目標。 如本文所用之術語，，高變區”或”抗體之抗原結合部分，，係 指負責抗原結合之抗體的胺基酸殘基。高變區包含來自 ’’互補判定區，，或"CDR"之胺基酸殘基。”構架”或”fr，，區為 除如本文所定義之高變區殘基以外之彼等可變結構域區。 因此’抗體之輕鏈及重鏈包含自N端至C端之下列結構 域：FRl、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR;^FR4。cdr 及 FR 區係根據 Kabat 等人，Sequences of Proteins of immunol〇gical interest，第 5 版，Public Health Service National Institutes 0f Health，Bethesda，MD (1991)之標準 定義進行判定。 ’4互定結構域”並不直接涉及在抗體與抗原之結合中，但 其展現多種效應功能。視其重鏈恆定區之胺基酸序列而 定，抗體或免疫球蛋白分為以下種類：IgA、IgD、IgE、

IgG及IgM，且該等種類中若干者可進一步分為子類（同 型），例如IgGl、IgG2、IgG3及IgG4 ;以幻及私〕。對應 於不同種類免疫球蛋白之重鏈恆定區分別验么，，^

修改。

用選自下列方法中之一或多者來純化抗體 而言，可使 免疫親和純 120514.doc 200813086 化、硫酸銨沉澱、蛋白a/g純化、離子交換層析、凝膠過 濾及/或硫酸銨沉澱。該等方法係描述於Nau，D.R.， Optimization of monoclonal antibody purification, In:

Techniques in Protein Chemistry，Hugli，T·(編），Academic

Press，New York，1989,第 339-347 頁；Coligan，J.E.等人 (編），Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons,

Inc. (2005)中。

U 可使用替代方法來代替融合瘤生成，用以產生根據本發 明之抗體。該等方法例如係基於抗體核酸序列之識別。其 通常足以識別可變區、CDR區或甚至僅重鏈CDR3區之序 列。mRNA較佳自一組抗體產生細胞分離，且用於建構在 適當表現載體中編碼該（等）區之cDNA庫。將該cDNA庫轉 染至諸如NSG或CHO之宿主細胞中且篩選特異性抗體產 生，且識別及分離特異性純系，並用於無融合瘤生成之抗 體產生。 FL細胞為能夠發育為各種血細胞類型（例如b細胞、丁細 月〇粒、、、田胞*小板及紅血球）之幹細胞。人類造血胚胎 肝幹細胞通常表現表面抗MD31、⑶34、cdu7㈣組） 及/或CD133。根據本發明，較佳使用表現cdi33之几細 胞0作為F L細胞，亦可存用尤a , x .. j」便用在經細胞激素處理後發育為 FL細胞之前驅體細胞（亦即，胚胎幹細胞）。 表現C则之FL細胞可自人_料分離且進—步藉由 ⑶⑶㈣、肖佳藉由免疫磁性分離程序（例如顧tenyi MACS分離系統，·）分離。另—分離fl細胞之較佳方法包 I2G514.doc -19~ 200813086 括用生物素共軛CD 133抗體標記單核細胞及回收CD 133陽 性肝細胞群體之額外步驟。 在X染色體上攜帶細胞毒素受體常見γ鏈（yc)之無效突變 的小鼠已由 DiSanto，J.P.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA - 92 (1995) 377-381描述。γςΓ"雌性可與對於突變純合之雄 性雜交，以使RAG2基因分裂（Shinkai，Υ.等人，Cell 68 (1992) 855-867)。對於RAG2缺失雜合且對於缺失半合之 ^ F1雄性可與丫 C-/-RAG2+/+雌性回交。所得後代之RAG2基因 型可藉由尾部DNA PCR來測定（Horton, R.M·等人，

BioTechniques 19 (1995) 690-691)。RAG2雜合子經繁殖以 產生yc RAG2雖性及丫c /yRAG2 /雄性小鼠（yc-/RAG2 J。 該等小鼠具有129 Ola、Balb/c及C57BL/6之混合背景。 根據本發明之免疫重組藉由將適量人類FL細胞移植至新 生且經預照射免疫缺乏動物（例如小鼠或大鼠）之肝中而發 生0 〇 根據本發明之人類單株抗體可藉由用抗原、編碼該抗原 之核酸及/或表現該抗原之細胞的經純化或經富集學備使 根據本發明之免疫重組非人類動物（較佳為免疫重組奪會 • 動物’最佳為免疫重組大鼠或小鼠）免疫而產生。接著养 _ 得動物之B細胞（例如脾B細胞），且與適當人類融合柊配物 (如月知瘤細胞）融合以形成永生融合瘤細胞，1 , υ 丹經由與適 當人類融合搭配物（如骨髓瘤細胞）融合或藉由以例如EBv 永生化该等細胞而分泌對抗該抗原之人類單株抗體兴〇 而言，將可溶性抗原或其片段視情況與其他分子共輕，且 120514.doc -20- 200813086 用作免疫原以生成抗體。對於跨膜分子（諸如受體）而言， 其片段（例如受體之細胞外結構域）可用作免疫原。或者， 表現跨膜分子之細胞可用作免疫原。該等細胞可得自天然 來源（例如癌細胞株）或可為已藉由重組技術轉化以表現跨 ， 膜分子之細胞。適用於製備抗體之其他抗原及其形式對於 熟習此項技術者將顯而易見。 • 免疫重組非人類動物較佳在首次免疫時為6至16週大。 (、 舉例而言，編碼所關注抗原（例如CD20或HER3抗原）之 DNA的經純化或經富集製備可兩於肌肉内免疫根據本發明 之免疫重組非人類動物。可經由免疫方法之過程監控免疫 反應，其中血漿樣品係藉由後眼窩取血而獲得。可藉由 ELIS A篩選血漿，且具有足夠對抗該抗原之抗體力價的免 疫重組非人類可用於相應B細胞之永生化。在脾臟及淋巴 結以及末梢血液死亡及移除之前可用所關注之抗原對小鼠 靜脈内加強注射。已發現對於各抗原需要進行2至3次融 〇 合。若干小鼠將對每一抗原免疫。 使用基於標準方法之PEG或電融合可使小鼠淋巴細胞分 離且與人類細胞或雜骨髓瘤細胞融合，以生成融合瘤。電 • 融合係基於細胞膜之可逆結構變化，其係由電場之效應引 • 起且適用於廣泛範圍之細胞，用以融合兩種或兩種以上相 同或不同來源之細胞，包括其完整結構（細胞核、細胞 膜、細胞器、細胞質），以形成新型可變細胞。 接著篩選所得融合瘤以產生抗原特異性抗體。舉例而 。，由免疫小鼠之脾及淋巴結衍生之淋巴細胞的單一細胞 120514.doc -21 - 200813086 懸浮液與K6H6/B5非分泌性雜骨髓瘤（heter〇myel〇ma)細胞 (ATCC，CRL 1823)融合。細胞以約2xl〇5之量塗於平底微 1滴疋盤中，繼而在選擇性培養基中培育約2週。 接著各孔以ELIS A篩選對抗該抗原之人類單株抗體（例如 IgG)。一旦發生廣泛之融合瘤生長，則分析培養基（通常 _ 在ι〇β14天之後）。再塗分泌抗體之融合瘤，再篩選，若對 • 於對抗該抗原之人類單株抗體仍為陽性，則可以限制稀釋 (-) 法次選殖至少兩次。接著活體外培養穩定之次選殖，以在 組織培養基中產生抗體用以表徵。 抗原可藉由任何合適方法引入動物體内。較佳經脾内、 靜脈内、腹膜内、皮内、肌肉内、皮下，單獨或與適當免 疫調節劑（例如CFA)組合而將動物免疫。各抗原之劑量應 較佳於1-500 pg間之範圍内。 本發明之方法較佳包含在最後注射後7_28天向動物供應 1-500 抗原之加強劑量的其他步驟。較佳對該等動物加 U 強注射1至5次。 可在有或無醫藥載劑之情況下進行動物之免疫。合適载 劑為例如IFA、A13(〇H)4、Abisco。 • 另外，該等載劑可用作免疫刺激劑（，，佐劑"）。除醫藥载 • 劑以外，可在有或無佐劑之情況下進行動物之免疫。 用於增強組合物功效之較佳佐劑包括（但不限於）··例如 CFA、IFA、A13(〇H)4、Abisco。 用於本發明之較佳抗體產生細胞包括B細胞。用於本發 明之該等抗體產生細胞可藉由移除動物免疫系統之任何合 120514.doc -22- 200813086 適細胞組份而回收。抗體產生細胞較佳藉由移除動物之 脾、淋巴結、末梢血液或骨髓或其部分而自動物回收。 實例 材料及方法 . 小鼠：繁殖以BALB/c為背景之Rag2-/>c·/·小鼠且保持於 符合 ICH、AAALAC 及 EU Directive on Animal Welfare， • 86/609準則之特異性無病原體條件下。 新生再增瘦（repopulation)檢定··於出生日以3-4小時之 〇 — 間隔用來自鉋 137 源（Biobeam 8000， STS GmbH， Braunschweig, Germany)之 2x2 Gy 以 2 Gy/分鐘照射新生小 鼠，此劑量經滴定係亞致死的。照射後4-12小時，對於小 鼠使用 30 號針（Hamilton Bonaduz AG， Bonaduz， Switzerland)將例如CD 13 3+ FL細胞單獨或與25 μΐ PBS中之 非造血CD 133_肝細胞組合或與生長因子組合移植至肝中 (下丘腦内（i.h·))。新生小鼠始終自單一供體接受細胞。小 Q 鼠在3週大時斷奶。小鼠分析：為獲得末梢血液細胞及血 漿，在醚麻醉情況下自後眼眶靜脈竇對小鼠取血。

流式細胞分析及細胞分類。對於FACS分析及細胞分類 - 而言，使用對抗下列抗原之經生物素標記或與FITC、PE . 或 APC 共軛之單株抗體：CD3(UCHT1)、CD4(13B8.2)、 CD8(B9.11)、CD40(MAB89)、CD80(MAB104)、CD83(HB15a)、 CD86(HA5.2B7)(均購自 Imunotech/Beckman Coulter， Marseille, France) 、CD19(HIB19) 、 CD20(2H7)、 CD34(58 1) 、 IL-3Ra/CD123(9F5) 、 CDllc(B-ly6)、 120514.doc -23 - 200813086 CD 14(M5E2)(均購自 BD Pharmingen，SanDiego，CA)、 CD45(HI30)、CD45RA(MEM56)、HLA-DR(TU36)(均購自 Caltag，Burlingame，CA)、TLR2(TL2.1)、TLRR4(HTA125)、 TCRab(IP26)(均購自 eBioscience，San Diego, CA)、BDCA-1、 BDCA-2、BDCA4、CD25(4E3)(均購自 Miltenyi Biotec)、 IgM(Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) ^ CCR7(3D 12，由 M. Lipp，Berlin，Germany提供）。IOTest Beta Mark 用於Vb分析（Imunotech/Beckman Coulter)。抗生蛋白鏈菌 素共挺FITC、PE或APC(均講自BD Pharmingen)用於觀測 經生物素標記之抗體。藉由碘化丙啶染色排除死亡細胞。 使用適當之同型匹配、非相關對照mAb來測定背景染色之 水平。使用FACS calibur分析細胞，且使用FACS Vantage SE(Becton Dickinson Immunocytometry Systems，Mountain View, CA)將細胞分類。 胚胎肝細胞。胚胎肝細胞源：Cambrex Corp. USA及 StemCell Technologies Corp. USA 〇 實例1 重組小鼠之免疫程序 用100 pg編碼人類HER3蛋白之質體DNA使三種Rag2·" 小鼠（3隻雌性）免疫。經肌肉内（i.m.)提供總計多達6次 免疫。當發現抗HER3之血清力價足夠時，在融合前3、2 及1天時用100 μΐ PBS中之30 pg經純化HER3蛋白經靜脈内 (i.v.)對小鼠額外加強注射3次。 實例2 120514.doc -24- 200813086 移植後第15週時對重組小鼠末梢血液之流式細胞分析 、將小鼠以異氟_麻醉，且接著自眼眶靜脈叢採集末梢血 液，用於藉由使用流式細胞儀量測人類血細胞之陽性比。 :斤採市血液立即與EDTA-2Na充分摻合，且保持於室溫 ： 下直至分析。將最佳量之FITC共軛抗人類CD45抗體添加 • 至5〇 μ1王血中且在室溫下與全血反應20分鐘。隨後，使用 FACS，合液貫現溶血及固定，且使用facs CaUbur量測比 〇 率。圖1展不二隻受檢小鼠末梢血液中人類CD45陽性細胞 之比率（％)。 實例3 對重組小鼠中人類HER3抗體產生能力之檢驗 藉由ELISA畺測重組小鼠末梢血液中人類“ο之總量。 將經稀釋之小鼠血清塗佈於MaxiS〇rb 96孔盤（NUNc)上且 於至μ下培用1小時。在室溫下用2〇/。CroteinC溶液阻斷1 小時後進行洗務’且隨後添加過氧化酶共輛之抗人類kG Ο 單株抗體。於室溫下培育45分鐘後進行洗滌，且在室溫下 添加ABTS基質溶液以進行1〇分鐘反應。接著在4〇5 nmT 量測吸收率（圖2)。根據標準曲線計算IgG濃度。 • 實例4 免疫後第7週對重組小鼠末梢血液中人類11£113抗體之流式 細胞分析 1 7週後用所關注之人類蛋白使重組小鼠免疫。使用 2 5 -100 pg/小鼠之編碼所關注人類蛋白的dnA連同作為增 強免疫學反應之佐劑的細胞激素混合液一起經肌肉内進行 120514.doc -25- 200813086 免疫。每四週進行一次相同免疫，且採用血清以藉由 FACS量測人類蛋白特異性抗體。將經簡單稀釋之抗血清 添加至人類蛋白表現細胞中，且於室溫下培育20分鐘。在 洗務後將最佳量之FITC共軛抗人類抗體添加至細胞中且於 室溫下再與細胞反應20分鐘。隨後使用FACS Calibur量測 經染色人類蛋白表現細胞之陽性比。圖3展示經重組免疫 • 小鼠之不同血清稀釋物（1/20及1/150)染色之人類蛋白陽性 ζ % 細胞與作為陰性對照之正常小鼠血清（NMS)相比或與作為 陽性對照之經純化人類蛋白特異性抗體相比之比率。 實例5 ^ 使用Dynabeads(S^CD19 +細胞陽性選擇 根據標準Dynal方法Dynabeads® CD19(Pan B)(產品號 1 1 1.03/11 1.04)及 DETACHaBEAM CD19(產品號 125 〇6)直 接自末梢血液或脾細胞懸浮液分離CD19+ B細胞： -將25 μΐ Dynabeads®添加至例如2」xl〇7之所製備細胞中 〇 -在輕度傾斜及旋轉情況下於2-8t下培育20分鐘。 -將試管置於磁體中2分鐘。 -丟棄上清液且使用下列程序將珠粒結合（beadb〇und)細胞 • 輕柔洗滌4次： • -母1 x 1 〇 Dynabeads②添加1 緩衝液1。 -將試管置於磁體中1分鐘且丟棄上清液。 -將細胞重新懸浮於緩衝液/培養基中用以下游應用。 實例ό 用於融合瘤生成之電融合 120514.doc -26- 200813086 經分離之CD 19+細胞經計數且經由電融合方法融合（第58 號電融合之Eppendorf應用）： -藉由離心作用（200 X g，10分鐘室溫）收集經分離之 CD1 9細胞及融合搭配物（例如κ6Η6/B 5)。 • -將離心塊重新懸浮於生長培養基中且測定細胞數。 . -將各融合搭配物之細胞數設定為例如3 X 1 〇5/融合。 • -甩吸管吸取兩種搭配物且以200 X g於室溫下離心1〇分 f 鐘0 C, 在電融合缓衝液中洗滌離心塊兩次，且如上所述進杆離 〇 -母次融合將離心塊重新懸浮於200 μΐ電融合緩衝液中。 -填充融合腔室且立即融合（參看Fusi〇nappam，Eppend〇rf 之應用方法）。 -融合之後，允許腔室在室溫下保持1〇分鐘。 -用培養基沖洗腔室且將經融合細胞轉移至選殖盤。 (J -培育24小時（5%C〇2，37t：)後添加HAT選擇培養基。 -培育7-21天後對雜種進行計數及分析。 5後14天時，以確疋之ELISA分析成熟人類融合瘤 • 個純系）之總體及人類蛋白特異性IgG，且偵測到至少6個 - 純系為陽性。 120514.doc •27· 200813086 融合瘤 HER3 ELISA濃度 (pg/ml) IgG ELISA濃度 &g/ml) IgF ELISA濃度 (μβ/mi) G2:l 0.006 0.015 <0 G3:l 0.165 0.017 <0 C4:l <-0.001 0.015 <0 E9:l 0.001 0.010 <0 G9:l 0.002 0.020 <0 C10:l 0.055 0.014 <-0.001 實例7 重組小鼠之免疫程序 用100 pg編碼人類CXCR5蛋白之質體DNA使三種Rag2·" γ(Γ·“小鼠（4隻雌性）免疫。經肌肉内(i.m.)提供總計多達6次 免疫。 小鼠之加強注射 當發現抗CXCR5之血清力價足夠時，在融合前3、2及1 天時用100 μΐ PBS中5xl06之CXCR5表現細胞經靜脈内 (i.v.)對小鼠額外加強注射3次。 實例8 〇 對重組小鼠中人類CXCR5抗體產生能力之檢驗 藉由ELISA量測重組小鼠末梢血液中人類IgG之總量。 將經稀釋之小鼠血清塗佈於MaxiSorb 96孔盤（NUNC)上且 於室溫下培育1小時。在室溫下用2% CroteinC溶液阻斷1 小時後進行洗滌，且隨後添加過氧化酶共軛之抗人類IgG 單株抗體。於室溫下培育45分鐘後進行洗滌，且在室溫下 添加ABTS基質溶液以進行10分鐘反應。接著在405 nm下 量測吸收率（圖4)。根據標準曲線計算IgG濃度（250 pg/ml 總人類IgG)。 120514.doc -28- 200813086 實例9 第三次免疫後分析重組小鼠中之人類CXCR5抗體 藉由CXCR5特異性ELISA量測重組小鼠血清中人類 CXCR5特異性IgG之量（圖5)。將經稀釋之小鼠血清塗佈於 MaxiSorb 96孔盤（NUNC)上且於室溫下培育1小時。在室溫 下用2% CroteinC溶液阻斷1小時後進行洗滌，且隨後添加 過氧化酶共輛之抗人類IgG單株抗體。於室溫下培育45分 鐘後進行洗滌，且在室温下添加ABTS基質溶液以進行1 0 分鐘反應。接著在405 nm下量满吸收率。 【圖式簡單說明】 圖1移植後第15週重組小鼠末梢血液之流式細胞分析 人類造血細胞移植。直方圖展示在使用抗人類 CD45-FITC mAb(填充區域）染色之重組或使用同型匹配、 非相關對照mAb(暗線）自相同動物背景染色之後15週時， 來自三種代表性動物之活性閘控末梢血液細胞的覆蓋圖， 其用作用於生成覆蓋直方圖統計之分母直方圖 (denominator histogram)。統計表示與閘内事件總數相 比，指定部分（Ml、M2)中之事件的數目及百分比。如下 展示平均螢光強度。 A : 分子直方圖 文件：Probe_002 X參數：Anti-hu-CD45-FITC 分母直方圖 120514.doc -29- 200813086

文件：Probe.001 X參數：Anti-hu-CD45-FITC 標記 事件 閘控百分比 全部 18110 108.79 Ml 16705 100.35 M2 860 5.17 B ： 分子直方圖 文件：Probe.004

X參數：Anti-hu-CD45-FTTC 分母直方圖 文件：Probe.003

X參數：Anti-hu-CD45-FITC 標記 事件 閘控百分比 全部 14622 231.91 Ml 11833 187.68 M2 2136 33.88 分子直方圖 文件：Probe.006

X參數：Anti-hu-CD45-FITC 分母直方圖 文件：Probe.005

X參數：Anti-hu-CD45-FITC 120514.doc -30- 200813086 標記 事件 閘控百分比 全部 4181 95.59 Ml 2992 68.40 M2 844 19.30 圖2對重組小鼠中人類抗體產生能力之檢驗。 圖3免疫後第7週重組小鼠末梢血液中人類抗原特異性抗 體之流式細胞分析 展示使用一種代表性重組且免疫小鼠之不同血清稀釋物 (1/20(C)及1/1 5 0(D))染色之抗原陽性細胞與作為陰性對照 (第二直方圖（B))之對照小鼠正常血清（NMS)相比或與作為 陽性對照（上直方圖（A))之經純化抗原特異性抗體相比的比 率（％)。統計表示與閘内事件總數相比指定部分（M2及Ml 標記展示對於抗原而言分別經陽性或陰性染色之細胞）中 之事件數及百分比。如下展示平均螢光強度。 A :陽性對照 分子直方圖 總事件：6764 分母直方圖 總事件：7072 標記 閘控百分比 總數百分比 全部 95.54 95.05 Ml 2.02 2.01 M2 93.55 93.07 B :陰性對照NMS 分子直方圖 總事件：7093 120514.doc -31 - 200813086 分母直方圖 總事件：7072 標記 閘控百分比 總數百分比 全部 100.38 99.87 Ml 99.33 98.83 M2 1.08 1.07

C :血清小鼠1(1/20)相對NMS 分子直方圖 總事件：15544 分母直方圖 總事件：7093 標記 閘控百分比 總數百分比 全部 160.13 159.45 Ml 125.33 124.80 M2 34.84 34.70

D :血清小鼠l(l/150)相對NMS 分子直方圖 總事件：7102 分母直方圖 總事件：7093 標記 閘控百分比 總數百分比 全部 100.03 99.61

Ml 92.18 91.79 M2 7.86 7.82 圖4對重組小鼠中人類CXCR5抗體產生能力之檢驗。 圖5對第三次免疫後重組小鼠中人類CXCR5特異性抗體 產生能力之檢驗。 120514.doc -32-

Claims (1)

1. 200813086 十、申請專利範圍： 1 · 一種由免疫缺乏之非人類動物產生人類單株抗體之方 法’該方法包含使新生之免疫缺乏非人類動物與人類胚 胎肝幹細胞（FL細胞）接觸，以生成免疫移植之非人類動 物（重組動物），隨後使該重組動物與一種抗原接觸，自 • 該重組動物收集一種可產生對抗該抗原之人類抗體的人 - 類細胞，及由該抗體產生細胞分離該抗體。 『 2.如請求項1之方法，其特徵在於該免疫重組非人類動物 為齧齒動物。 3 ·如叫求項1或2之方法，其特徵在於該重組非人類動物為 小鼠或大鼠。 4·如請求項1或2之方法，其特徵在於該重組小鼠為 Rag2 /、_/·、裸 Rag2々_、n〇D 或 SCID beige小鼠。 5 ·如μ求項1或2之方法，其特徵在於該fl細胞為人類造血 胚胎肝幹細胞（HFL細胞）。 (J 士叫求項1或2之方法，其特徵在於該FL細胞為HFL細胞 與人類非造血胚胎肝幹細胞之組合。 士叫求項1或2之方法，其特徵在於該抗體產生細胞為人 . 類B細胞。 8·如请求項1或2之方法，其特徵在於該抗原為多肽。 月求項1或2之方法，其特徵在於該抗原係以抗原、抗 原片段、MHC/肽錯合物、編碼抗原iDNA&/或帶抗原 之細胞與該重組動物接觸。 月求項1或2之方法，其特徵在於該重組非人類動物在 120514.doc 200813086 與該fl細胞接觸前經亞致死照射。 11 .如請求項1或2之方法，其特徵在於在該小氣與該扎細胞 接觸後5至18週使該小鼠與該抗原首次接觸。 12 •如請求項1或2之方法，其特徵在於該小鼠與該抗原接觸 達10次。 13.如請求項丨或2之方法，其特徵在於所收集之該細胞為人 ’ 類CD19 +或CD22 +細胞。 ( I4·如明求項1或2之方法，其特徵在於該細胞係藉由融合瘤 技術形成。 1 5·如明求項丨或2之方法，其特徵在於該融合搭配細胞株為 MFP-2、HK-128、K6H6/B5 或 Karpas 707細胞株。 16· —種用於產生多數可產生對抗一種抗原之多數人類抗體 之人類B細胞的方法，該方法之特徵在於使新生之免疫 缺乏非人類動物與FL細胞接觸以生成免疫重組動物，^ 後使忒重组動物與一種抗原接觸，由該非人類動物收集 (J 多數產生抗體之人類B細胞。 17.多數人類B細胞，其產生全部多數對抗一種人類蛋白之 人類抗體。 • I8· 一種永生6細胞之組合物，其提供全部多數對抗一種人 _ 類蛋白之人類抗體。 19. 一種重組動物用於產生多數永生B細胞之用途，其產生 全部多數對抗一種人類蛋白之人類抗體。 2〇· —種用於重組產生抗體之方法，其特徵在於使新生之免 疫缺乏非人類動物與FL細胞接觸，隨後使該非人類動物 120514.doc 200813086 與一種抗原接觸，由該非人類動物收集-種可產生對於 該抗原之人類抗體的人類細胞，及分離該抗體，對可； 區定序’建構與-個人難定鏈組合之編碼重鏈及/或^ 鏈至少CDRS之表現載體，在適當宿主細胞中表現該（等） 載體’及由該(等)宿主細胞或醱酵上清液分離該抗體(免 疫反應性蛋白）。 21. 22. 23. 一種用於重組產生抗體之方法，其特徵在於使新生之免 疫缺乏非人類動物與FL細胞接觸，隨後使該非人類動物 與一種抗原接觸，自該非人類動牷收集一種可產生對抗 該抗原之人類抗體的人類細胞，及由該產生人類抗體之 人類細胞分離mRNA，生成抗體特異性cDNA(例如藉由 使用免疫球蛋白特異性引子），建構與一個人類恆定鏈組 合之編碼重鏈及/或輕鏈至少CDRs之表現載體，在適當 宿主細胞中表現該（等）載體，及由該（等）宿主細胞或醱 酵上清液分離該抗體（免疫反應性蛋白）。 一種包含全部多數對抗一種抗原之人類免疫球蛋白基因 的多數人類B細胞用於生成對抗該抗原之單株抗體的用 途’其特徵在於該多數B細胞具有至少1 〇6個b細胞/毫升 之濃度用於產生融合瘤細胞。 一種用於選擇可產生顯示與一種抗原特異性結合之人類 抗體之永生細胞的方法，該方法之特徵在於由產生全部 多數人類抗體之非人類動物脾臟提供多數人類B細胞， 使該等細胞或其亞群與永生骨聽瘤細胞融合，或藉由 EB V轉化作用使該等B細胞或亞群永生化，及選擇可產 120514.doc 200813086 生顯示與該抗原特異性結合之人 一 員抗體之融合瘤細胞。 24· -種用於選擇可產生對一種抗原顯示至少w 異性結合親和力之抗體的永生細胞之方法，該方法之特 徵在於由產生全部多數人来g > ' 人頜抗體之非人類動物脾臟提佴 多數人類B細胞’使該等細胞或其亞群與永生骨鑛瘤: 胞融合，或藉由EBV轉化作用使該等B細胞或亞群永生 化，及選擇可產生對一種抗原顯示至少1〇_6 m〇m之特異 性結合親和力之抗體的融合瘤細胞。 ^ 〇 120514.doc