JP2010529833A - トリEBx細胞における組換えタンパク質作製 - Google Patents
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Abstract
Description
胚性幹細胞は、(i)未分化細胞としてインビトロで無期限に自己複製することができ、(ii)無制限の再生能力を有しており、(iii)安定した染色体量を維持し、(iv)高レベルのテロメラーゼおよび特異的細胞表面マーカーを発現するという点で、独特である。世界中で多くの努力が払われているものの、極めて限られた数の種(マウス、ヒト、サル)からしか、ES細胞を単離することに成功していない。本発明者は、様々なトリ種、主にニワトリおよびアヒルからES細胞を単離し樹立するために、これまで何年にも渡って、かなりの資源を捧げてきた。このような研究努力によって、ニワトリES細胞[Pain et al. 1999. Cell Tissues Organs 165: 212-219]およびアヒルES細胞の単離および特徴付けに成功した。次いで、本発明者は、分化を誘導することなくニワトリES細胞およびアヒルES細胞を効率的にインビトロで培養し、大規模に増殖させることを可能にする、所有権を持った手順を開発した。
次に、本発明者は、トリES細胞から安定で持続的な、接着細胞株または浮遊細胞株を誘導するための所有権を持った方法を確立した。この方法は、細胞培養培地から血清、フィーダー細胞、および増殖因子を漸進的に取り除くことならびに浮遊培養液に細胞を順応させることを含む。これらの胚由来トリ細胞株は、ES細胞の望ましい特徴の大半(すなわち、無期限の増殖、テロメラーゼのようなES特異的マーカーの発現、核型の安定性)を維持しただけでなく、さらに、新しい「産業的に好都合な」特徴(無血清培地に浮遊した状態で高い細胞濃度まで増殖する)も示した。
-「ガンカモ目(Anseriformes)」(すなわち、アヒル、ガチョウ、ハクチョウ、および同類のもの)。ガンカモ目は、次の3つのファミリーに属する約150種の鳥を含む:サケヒドリ科(Anhimidae)(サケビドリ(screamer))、カササギガン科(Anseranatidae)(カササギガン(Magpie-goose))、ならびに、140種を超える水鳥を含み、アヒル、ガチョウ、およびハクチョウが挙げられるガンカモ科(Anatidae)。この目の種はすべて、水面での水上生活に高度に順応している。すべて、効率的に泳ぐための水かきのある足を持つ(ただし、一部はその後、主に陸生になった)。
-「キジ目(Galliformes)」(すなわち、ニワトリ、ウズラ、シチメンチョウ、キジ、および同類のもの)。キジ目は、ニワトリ、シチメンチョウ、ウズラ、およびキジを含む、鳥の目である。全世界で約256種が存在する。
-「ハト目(Columbiformes)」(すなわち、大型のハトおよび同類のもの)。鳥のハト目は、極めて広範囲に及ぶ小型のハトおよび大型のハトを含む。
-East Lansing USDAの家禽貯蔵物である家畜ニワトリ0系統(ELL-0系統)。East Lansing 0系統のニワトリは、ALVに関係した内因性ウイルス座位(ev)をまったく含まない(DunwiddieおよびFaras, 1985 Proc. Natl. Acad. Sci USA 82:5097-5101)。
-Charles River (SPAFAS)社製の白色レグホーンニワトリ22系統。
-国立農学研究所(Institut National de la Recherche Agronomique)(Domaine de Magneraud, Surgeres, France)から得られるDE系統およびPE11系統。
(a)複製可能な内因性レトロウイルス粒子を産生し得る完全な内因性プロウイルス配列もその断片も含まない、より具体的にはEAVプロウイルス配列および/またはALV-Eプロウイルス配列ならびにその断片も含まない、鳥由来の胚性幹(ES)細胞を、それらの増殖を可能にさせるすべての因子を含む完全培地において、フィーダー層の存在下で、動物血清を添加して、単離、培養、および増殖する段階; 任意で、該完全培地は、付加的なアミノ酸(すなわちグルタミンなど)、ピルビン酸ナトリウム、β-メルカプトエタノール、動物以外に由来するタンパク加水分解物(すなわち酵母加水分解物、植物加水分解物など)などの添加物を含んでよい;
(b)前記因子、前記フィーダー層、および前記血清、ならびに任意で前記添加物を完全に取り除くために培地を改変すること、ならびに、複製可能な内因性レトロウイルス粒子を産生せず、外因性増殖因子、フィーダー層、および動物血清の不在下で、基本培地において長期間に渡って増殖することができる、EBx(登録商標)と名付けられた接着トリ細胞株または浮遊トリ細胞株をさらに得ることによって、継代する段階。
-フィーダー層/血清/増殖因子;
-フィーダー層/増殖因子/血清;
-血清/増殖因子/フィーダー層;
-血清/フィーダー層/増殖因子;
-増殖因子/血清/フィーダー層;
-増殖因子/フィーダー層/血清。
-タイワンアヒル:段階VII
-ホロホロチョウ:段階VII〜VIII
-シチメンチョウ:段階VII〜VIII
-ペキンアヒル:段階VIII
-ニワトリ:段階X
-ニホンウズラ:段階XI
-ガチョウ:段階XI。
(a)イヤル-ギラディの分類(EYAL-GILADI's classification:EYAL-GILADIおよびKOCHAN, 1976, 「From cleavage to primitive streack formation : a complementary normal table and a new look at the first stages of the development in the chick」、"General Morphology" Dev. Biol., 49:321-337)の段階VIごろから、孵化前、好ましくは産卵前後を含む発生段階に、好ましくはアヒルまたはニワトリ、好ましくはev-0ニワトリから鳥胚を単離する段階。好ましくは、該鳥のゲノムは、複製可能な内因性レトロウイルス粒子を産生し得る内因性プロウイルス配列を含まない;
(b)段階(a)の胚を分離することによって得られるトリ胚性幹(ES)細胞を、以下を添加した基本培地中に懸濁する段階:
-インスリン増殖因子1(IGF-1)および繊毛様神経栄養因子(CNTF);
-動物血清; および
-任意で、インターロイキン6(IL-6)、インターロイキン6受容体(IL-6R)、幹細胞因子(SCF)、および線維芽細胞増殖因子(FGF)を含む群より選択される増殖因子;
(c)段階(b)で得られたES細胞の懸濁液をフィーダー細胞の層に播種し、さらに、少なくとも1回の継代の間、ES細胞を培養する段階;
(d)任意で、継代1回〜約15回までの範囲の数回の継代に渡って、IL-6、IL-6R、SCF、FGFを含む群より選択される増殖因子すべてを培地から取り除き、さらに、少なくとも1回の継代の間、トリES細胞を培養する段階。好ましくは、IL-6、IL-6R、SCF、FGFを含む群より選択される増殖因子すべての培地から取り除くのは、1回の継代の間に同時に行う。通常、IL-6、IL-6R、SCF、FGFを取り除くのは、第10〜15代ぐらいで実施する;
(e)IGF-1およびCNTFを培地から取り除き、さらに、少なくとも1回の継代の間、トリES細胞を培養する段階。好ましくは、IGF-1およびCNTFを含む群より選択される増殖因子の培地から取り除くのは、1回の継代の間に同時に行う。通常、IGF-1およびCNTFを取り除くのは、第15〜25代ぐらいで実施する。あるいは、IGF-1およびCNTFを取り除くのは、数回の継代(少なくとも2回の継代、最高約15回の継代)の間に漸進的に減少させることによって実施する;
(f)数回の継代後にフィーダー層を完全に取り除くために、培地中のフィーダー細胞の濃度を漸進的に低下させ、さらに、細胞を培養する段階;
(g)任意で、少なくとも1回の継代後に添加物を完全に取り除くために、培地中の添加物の濃度を漸進的に低下させる段階;および
(h)任意で、数回の継代後に動物血清を完全に取り除くために、培地中の動物血清の濃度を漸進的に低下させる段階;および
(i)増殖因子、フィーダー層の不在下、任意で動物血清および添加物を含まない基本培地中で増殖することができる、ES細胞に由来するEBx(登録商標)と名付けられた接着トリ細胞株を得る段階であって、該持続的2倍体トリ細胞株が、好ましくは、複製可能な内因性レトロウイルス粒子を産生しない段階;
(j)任意で、前記接着トリEBx(登録商標)細胞株を浮遊培養条件にさらに順応させる段階;
(k)任意で、例えば限界希釈によって、前記トリEBx(登録商標)細胞をさらにサブクローニングする段階。
(a)産卵前後の発生段階に鳥胚を単離する段階であって、該鳥のゲノムが、複製可能な内因性レトロウイルス粒子を産生し得る内因性プロウイルス配列を含まない段階;
(b)段階(a)の胚を分離することによって得られるトリ胚性幹(ES)細胞を、少なくとも以下を添加した基本培地中に懸濁する段階:
- インスリン増殖因子1(IGF-1)および繊毛様神経栄養因子(CNTF); ならびに
- ウシ胎仔血清のような哺乳動物血清;
(c)段階(b)で得られたES細胞の懸濁液をフィーダー細胞の層に播種し、さらに、少なくとも1回の継代の間、ES細胞を培養する段階;
(e)IGF-1およびCNTFを培地から取り除き、さらに、少なくとも1回の継代の間、細胞を培養する段階;
(f)数回の継代後にフィーダー層を完全に取り除くために、培地中のフィーダー細胞の濃度を漸進的に低下させ、さらに、細胞を培養する段階;
(g)数回の継代後に哺乳動物血清を完全に取り除くために、培地中の哺乳動物血清の濃度を漸進的に低下させる段階; および
(h)増殖因子、フィーダー層、および哺乳動物血清の不在下、基本培地中で増殖することができる、ES細胞に由来する接着トリEBx(登録商標)細胞株を得る段階であって、該持続的2倍体トリ細胞株が、複製可能な内因性レトロウイルス粒子を産生しない段階;
(i)任意で、好ましくは、浮遊液としての増殖を促進することによって、より好ましくは、段階(h)で得られた接着トリEBx(登録商標)細胞株を、最初の支持体より接着特性が劣る別の支持体(すなわち、超低接着支持体など)中に移すことによって、接着トリEBx(登録商標)細胞株を浮遊培養条件にさらに順応させる段階。
接着トリEBx(登録商標)細胞株を浮遊培養条件に順応させる段階(j)を実施する場合、別の好ましい態様において、培地中の哺乳動物血清の濃度を漸進的に低下させる段階(g)の前に実施することができる。
(d)任意で、IL-6、IL-6R、SCF、FGFを含む群より選択される増殖因子すべてを培地から取り除き、さらに、少なくとも1回の継代の間、ES細胞を培養する段階。
- 0.1〜5mMのL-グルタミン、好ましくは2〜3mMの間のL-グルタミン;
- 0.05〜2mMのピルビン酸ナトリウム、好ましくは0.1mM〜1mMの間のピルビン酸ナトリウム;
- 0.1〜2.5%の非必須アミノ酸、好ましくは約1%の非必須アミノ酸;
- 0.05〜5mMのβ-メルカプト-エタノール、好ましくは約0.16mMのβ-メルカプト-エタノール;
- 動物以外に由来するタンパク質加水分解物。
- 高い核細胞質比、
- 内因性テロメラーゼ活性、
- 任意で、アルカリホスファターゼ、SSEA-1マーカー、EMA-1マーカー、ENS1マーカーなど1種または複数種の別のESマーカーを発現する場合がある。
- 本発明の方法の段階(a)のトリES細胞の倍加時間(39℃で48時間〜72時間)より短い倍加時間:37℃で約30時間またはそれ以下(好ましくは24時間)。
-次のDNA配列を次の順序で含む第1の発現カセット:配列番号1のCMVプロモーター配列またはその断片もしくは変種、イントロン配列、関心対象の組換えタンパク質をコードするDNA配列、ポリアデニル化配列、および
-次のDNA配列を次の順序で含む第2の発現カセット:SV40プロモーター、抗生物質耐性遺伝子(好ましくはネオマイシン耐性遺伝子)、ポリアデニル化配列;
-任意で、WO 02/074969に記載されている少なくとも1つのニワトリリゾチーム5'MARエレメントまたはWO 2005/040377に記載されているヒトMARエレメント。
- 次のDNA配列を次の順序で含む第1の発現カセット:配列番号2のキメラEF1α/HTLVプロモーター配列またはその断片もしくは変種、イントロン配列、関心対象の組換えタンパク質をコードするDNA配列、ポリアデニル化配列; および
- 次のDNA配列を次の順序で含む第2の発現カセット:SV40プロモーター、抗生物質耐性遺伝子(好ましくはネオマイシン耐性遺伝子)、ポリアデニル化配列;
- 任意で、WO 02/074969に記載されている少なくとも1つのニワトリリゾチーム5'MARエレメントまたはWO 2005/040377に記載されているヒトMARエレメント。
- 次のDNA配列を次の順序で含む第1の発現カセット:配列番号3のRSVプロモーター配列またはその断片もしくは変種、イントロン配列、関心対象の組換えタンパク質をコードするDNA配列、ポリアデニル化配列; および
- 次のDNA配列を次の順序で含む第2の発現カセット:SV40プロモーター、抗生物質耐性遺伝子(好ましくはネオマイシン耐性遺伝子)、ポリアデニル化配列;
- 任意で、WO 02/074969に記載されている少なくとも1つのニワトリリゾチーム5'MARエレメントまたはWO 2005/040377に記載されているヒトMARエレメント。
- 次のDNA配列を次の順序で含む第1の発現カセット:プロモーター配列、イントロン配列、抗体の重鎖またはその断片をコードするDNA配列(好ましくはcDNA配列)、ポリアデニル化配列;
- 次のDNA配列を次の順序で含む第2の発現カセット:プロモーター配列、イントロン配列、抗体の軽鎖またはその断片をコードするDNA配列(好ましくはcDNA配列)、ポリアデニル化配列;
- 次のDNA配列を次の順序で含む第3の発現カセット:ウイルスプロモーター、抗生物質耐性遺伝子、ポリアデニル化配列;
- 任意で、WO 02/074969に記載されている少なくとも1つのニワトリリゾチーム5'MARエレメントまたはWO 2005/040377に記載されているヒトMARエレメント。
- 次のDNA配列を次の順序で含む第1の発現カセット:プロモーター配列、イントロン配列、抗体の軽鎖またはその断片をコードするDNA配列(好ましくはcDNA配列)、ポリアデニル化配列;
- 次のDNA配列を次の順序で含む第2の発現カセット:プロモーター配列、イントロン配列、抗体の重鎖またはその断片をコードするDNA配列(好ましくはcDNA配列)、ポリアデニル化配列;
- 次のDNA配列を次の順序で含む第3の発現カセット:ウイルスプロモーター、抗生物質耐性遺伝子、ポリアデニル化配列;
- 任意で、WO 02/074969に記載されている少なくとも1つのニワトリリゾチーム5'MARエレメントまたはWO 2005/040377に記載されているヒトMARエレメント。
- 次のDNA配列を次の順序で含む第1の発現カセット:配列番号1のCMVプロモーターまたはその断片もしくは変種、イントロン配列、抗体の重鎖またはその断片をコードするcDNA配列、ポリアデニル化配列;
- 次のDNA配列を次の順序で含む第2の発現カセット:配列番号1のCMVプロモーターまたはその断片もしくは変種、イントロン配列、抗体の軽鎖またはその断片をコードするcDNA配列、ポリアデニル化配列;
- 次のDNA配列を次の順序で含む第3の発現カセット:SV40プロモーター、ネオマイシン耐性遺伝子、ポリアデニル化配列;
- 任意で、WO 02/074969に記載されている少なくとも1つのニワトリリゾチーム5'MARエレメントまたはWO 2005/040377に記載されているヒトMARエレメント。
- 次のDNA配列を次の順序で含む第1の発現カセット:配列番号2のキメラEF1α/HTLVプロモーターまたはその断片もしくは変種、イントロン配列、抗体の重鎖またはその断片をコードするcDNA配列、ポリアデニル化配列;
- 次のDNA配列を次の順序で含む第2の発現カセット:配列番号2のキメラEF1α/HTLVプロモーターまたはその断片もしくは変種、イントロン配列、抗体の軽鎖またはその断片をコードするcDNA配列、ポリアデニル化配列;
- 次のDNA配列を次の順序で含む第3の発現カセット: SV40プロモーター、ネオマイシン耐性遺伝子、ポリアデニル化配列;
- 任意で、WO 02/074969に記載されている少なくとも1つのニワトリリゾチーム5'MARエレメントまたはWO 2005/040377に記載されているヒトMARエレメント。
- 次のDNA配列を次の順序で含む第1の発現カセット:配列番号3のRSVプロモーターまたはその断片もしくは変種、イントロン配列、抗体の重鎖またはその断片をコードするcDNA配列、ポリアデニル化配列;
- 次のDNA配列を次の順序で含む第2の発現カセット:配列番号3のRSVプロモーターまたはその断片もしくは変種、イントロン配列、抗体の軽鎖またはその断片をコードするcDNA配列、ポリアデニル化配列;
- 次のDNA配列を次の順序で含む第3の発現カセット:SV40プロモーター、ネオマイシン耐性遺伝子、ポリアデニル化配列;
- 任意で、WO 02/074969に記載されている少なくとも1つのニワトリリゾチーム5'MARエレメントまたはWO 2005/040377に記載されているヒトMARエレメント。
- 次のDNA配列を次の順序で含む第1の発現カセット:CMVプロモーター配列、RSVプロモーター配列、またはキメラEF1α/HTLVプロモーター配列、イントロン配列、抗アポトーシスNR13タンパク質をコードするcDNA配列、ポリアデニル化配列; および
- 次のDNA配列を次の順序で含む第2の発現カセット:SV40プロモーター、ピューロマイシン耐性遺伝子、ポリアデニル化配列;
- 任意で、次のDNA配列を次の順序で含む第3の発現カセット:SV40プロモーター、ネオマイシン耐性遺伝子、ポリアデニル化配列;
- 任意で、WO 02/074969に記載されているニワトリリゾチーム5'MARエレメントまたはWO 2005/040377に記載されているヒトMARエレメント。
(a)少なくとも1つの発現ベクターをトランスフェクションすることによって、本発明によるEBx(登録商標)細胞を調製する段階; トランスフェクションは、接着EBx(登録商標)細胞または浮遊EBx(登録商標)細胞のいずれかに対して実施してよい;
(b)該トランスフェクトされたEBx(登録商標)細胞を、適切な条件下で、細胞培養培地中で培養する段階; および
(c)該トランスフェクトされたEBx(登録商標)細胞、細胞培養培地、または該EBx(登録商標)細胞および該培地の両方から、関心対象の生物学的産物を回収する段階。
(1)このアッセイ法は、抗体の抗原結合領域によって認識される標的抗原を発現することが公知である標的細胞を使用する。このアッセイ法は、ランダムに選択した健常なドナーの血液から単離したヒト末梢血単核細胞(PBMC)をエフェクター細胞として使用する;
(2)このアッセイ法は次のプロトコールに従って実施される:(i)標準的な密度遠心分離手順を用いてPBMCを単離し、RPMI細胞培養培地中に5×106細胞/mlの濃度で懸濁する; (ii)標準的な組織培養方法によって標的細胞を増殖させ、生存率が90%を超える指数増殖期に回収し、RPMI細胞培養培地中で洗浄し、100マイクロキュリーの51Crで標識し、細胞培養培地で2回洗浄し、105細胞/mlの濃度で細胞培養培地中に再懸濁する; (iii)上記の標的細胞の最終懸濁液100マイクロリットルを96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに移す; (iv)細胞培養培地中で抗体を4000ng/mlから0.04ng/mlまで段階的に希釈し、結果として得られる抗体用溶液を50マイクロリットルずつ、96ウェルマイクロタイタープレート中の標的細胞に添加して、上記の濃度範囲全体を包含する様々な抗体濃度を三つ組で試験する; (v)最大放出(MR)対照とするために、標識された標的細胞を含むプレート中の別の3つのウェルに、抗体溶液(上記のivの時点)の代わりに、非イオン系洗剤(Nonidet, Sigma, St.Louis)の2%(V/V)水溶液50マイクロリットルを添加する; (vi)自発的放出(SR)対照とするために、標識された標的細胞を含むプレート中の別の3つのウェルに、抗体溶液(上記のivの時点)の代わりに、RPMI細胞培養培地50マイクロリットルを添加する; (vii)次いで、96ウェルマイクロタイタープレートを50×gで1分間遠心分離し、4℃で1時間インキュベートする; (viii)PBMC懸濁液(上記のiの時点)50マイクロリットルを各ウェルに添加して、エフェクター:標的細胞比率を25:1とし、37℃、5%CO2雰囲気下のインキュベーター中に4時間、プレートを置く; (ix)細胞を含まない上清を各ウェルから回収し、実験によって放出された放射能(ER)をγ線計数器によって定量する; (x)式(ER-MR)/(MR-SR)×100に従って、各抗体濃度での特異的溶解率(%)を算出する。式中、ERはその抗体濃度において定量された(上記ixの時点を参照されたい)平均放射能であり、MRはMR対照(上記vの時点を参照されたい)において定量された(上記ixの時点を参照されたい)平均放射能であり、SRはSR対照(上記viの時点を参照されたい)において定量された(上記ixの時点を参照されたい)平均放射能である;
(4)「増加したADCC」とは、上記に試験した抗体濃度範囲内で観察される特異的溶解の最大比率(%)の増加、および/または上記に試験した抗体濃度範囲内で観察される特異的溶解の最大比率(%)の半分(one half)を実現するのに必要とされる抗体濃度の低下のいずれかと定義される。ADCCの増加は、上記のアッセイ法を用いて測定した、当業者に公知である同じ標準的な作製、精製、調製、および保存方法を用いて別のタイプの宿主細胞によって産生された同じ抗体によって媒介されるADCCを基準とする。例えば、本発明の方法によって作製されたIgG1サブタイプの抗体は、ハイブリドーマ細胞またはCHO細胞において産生された同じ抗体と比べて増加したADCC活性を有する。
実施例1:SPFニワトリVALO種に由来するニワトリEBv13細胞株
1.1 原材料
卵
Valoと呼ばれる特定病原体除去(SPF)種。valo種は、ドイツのLohmann社によって生産され提供される白色レグホーン種である。これらのSPFニワトリの卵は、分析証明書と共に供給され、以下に関して試験される:CAV、トリアデノウイルス(1群、血清型1〜12および3群)、EDS、トリ脳脊髄炎ウイルス、トリ白血病ウイルス/RSV(血清型ALV-Jを含む)、トリ腎炎ウイルス、トリレオウイルス、鶏痘ウイルス、感染性気管支炎ウイルス、感染性滑液包炎ウイルス(IBDV)、感染性喉頭気管炎ウイルス、A型インフルエンザウイルス、マレック病ウイルス、マイコプラズマ病(Mg+Ms)、マイコバクテリウム・アビウム(Mycobacterium avium)、ニューカッスル病ウイルス、細網内皮症ウイルス、ひな白痢菌(Salmonella pullorum)、他のサルモネラ感染症病原菌、トリ鼻気管炎ウイルス(ART)、ヘモフィルス・パラガリナルム(Hemophilus paragallinarum)。除染装置を用いた殺菌にValoニワトリ卵を1回だけ供して(only submitted)、輸送の間の卵の取扱いに関係した任意の汚染リスクを回避した。
EBv13を樹立する方法の第1の段階において、マウス由来の細胞(STO細胞)をフィーダー層として用いて、ニワトリ幹細胞の多能性を維持した。これらのフィーダー細胞は、プラスチック上に播種する前に、ガンマ線照射(45〜55グレイ)によって有糸分裂を不活性化される。放射線照射のこの線量は、細胞周期の決定的停止を誘導するが、非分化細胞の細胞増殖の促進のために必要な増殖因子および細胞外マトリックスの産生は引き続き許容する致死未満量である。
DMEM-HamF12 (Cambrex、カタログ番号BE04-687)
Optipro培地(Invitrogen、カタログ番号12309)
EX-CELL(商標)65195、60947、および65319 (SAFC、特別注文による培地)
グルタミン(Cambrex、カタログ番号BE17-605E)
ペニシリン(Pencillin)/ストレプトマイシン(Cambrex、カタログ番号BE17-602E)
非必須アミノ酸(Cambrex、カタログ番号BE13-114E)
ピルビン酸ナトリウム(Cambrexカタログ番号BE13-115)
ビタミン(Cambrex、カタログ番号13-607C)
βメルカプトエタノール(Sigma、カタログ番号M7522)
PBS 1×(Cambrex、カタログ番号BE17-516F)
パラホルムアルデヒド4%(Sigma、カタログ番号P6148)
KCl 5.6%(Sigma、カタログ番号P9333)
メタノール/酢酸(3/1):メタノール(Merck、カタログ番号K34497209); 酢酸(Sigma、カタログ番号A6283)
コルセミド、Karyomax(Gibco、カタログ番号15212-046)
ジメチルスルホキシド(DMSO)(Sigma、カタログ番号D2650)
以下の2種の異なる組換え因子を使用した:
・組換えヒト繊毛様神経栄養因子(CNTF)(Peprotech Inc、カタログ番号450-13)
・組換えヒトインスリン様因子I(IGF1)(Peprotech Inc、カタログ番号100-11)
これらの2種の因子は、大腸菌において産生させた。
放射線照射されていないウシ胎仔血清(FBS)(JRH、カタログ番号12103)
この計画で使用した放射線照射されていない血清は、米国で採取され製造された。採取のために使用された動物は、USDAによる検査を受け、屠殺が容認されたものであった。これは、トリ幹細胞を培養する間に培地に添加した。このバッチは、培養状態の幹細胞の維持のために不可欠であると確認された重要なタンパク質または成分の破壊を回避するために、放射線照射には供さなかった。
この計画で使用した放射線照射されたバッチもまた、米国で採取された。放射線照射されたこのバッチを、STO細胞またはFED細胞(フィーダー細胞)の培養のために使用されるDMEM培地に補充物として添加した。これらの細胞は、幹細胞とは違って(as stem cells)、培養状態で増殖および維持するために特定の品質の血清を必要としない。培地中の高濃度の血清を最小限にするために、本発明者らは、わずか4%のFBSの存在下での増殖にSTO細胞を順応させた。
・プロナーゼ(Roche、カタログ番号165 921)
プロナーゼは、Roche Diagnostics, Germanyによって製造された組換えプロテアーゼであり、接着トリ幹細胞の分離のために使用される。
・トリプシンEDTA(Cambrex、カタログ番号BE17-161E)
トリプシンは、STO細胞またはFED細胞の分離のために、後期の継代培養では、無血清培地に順応したトリ細胞を分離するために使用される。ブタ由来のこの酵素は、cGMPの指示要件に従って、有効な滅菌ろ過法によって無菌的に製造され、現行のE.Pに従って試験される。この原材料は、調製する前に放射線照射され、9/CFR113.53に忠実に従って、ブタパルボウイルスに関して試験される。
・非酵素的細胞解離溶液(Sigma、カタログ番号C5914)
この解離剤は、培養管の増殖表面から細胞を穏やかに剥離するために使用される、すぐ使用できる調製物である。この調製物は、タンパク質を含まず、酵素を用いずに細胞を取り外すことを可能にする。細胞タンパク質は保存されるため、細胞表面タンパク質の認識に依存する免疫化学的研究が可能になる。この酵素は、EMA-1(Epithelial Membrane Antigen 1)およびSSEA1(Stage Specific Embryonic antigen- 1)のような生物学的マーカーをFACS解析する前に、細胞を剥離するために使用された。
卵を割り、開卵する間に卵白から卵黄を分離した。パスツールピペットを用いて直接、または穴開け機を用いて穴の開いた輪の形に予め切り抜いた小型の吸収性ろ紙(Whatmann 3M紙)を用いて、卵黄から胚を取り出した。穴の直径は約5mmであった。これらの小型の輪は、オーブン中で約30分間、乾熱滅菌した。この小型の紙の輪を卵黄の表面に置き、胚の中央に合わせ、このようにして紙の輪で胚を取り囲む。次いで、小型のはさみを用いて後者を切り抜き、取り出した全体を、PBSまたは生理食塩水で満たしたペトリ皿に入れる。輪を用いてこのようにして取り出した胚を媒体(medium)中で洗浄して過剰な卵黄を除き、このようにして過剰なビテリンを取り除いた胚盤をパスツールピペットで採取する。
2.1 原材料
アヒルの卵
ペキン種GL30に由来するアヒルの卵を、GRIMAUD FRERES SELECTION (La Corbiere, Roussay France)から入手した。親アヒルは、大腸菌(Escherichia Coli)(自己ワクチンColi01および02)、パスツレラ・マルトシダ(Pasteurella multocida)(Landavax)、アヒルウイルス肝炎(Hepatovax)、豚丹毒菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)(Ruvax)、トリメタニューモウイルス(Nemovac)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)および腸炎菌(Salmonella Enteridis)(自己ワクチン)、リエメレラ・アンティペステイファー(Riemerella antipestifer) (自家ワクチンRiemerella)、トリメタニューモウイルス(Nobilis RTV不活性)、ならびに豚丹毒菌(Ruvax)の予防接種を受けていた。受領後、ペキンアヒルの受精卵を次亜塩素酸浴(hypochloryde bath)中での殺菌、続いてFermacidal (Thermo)を用いた汚染除去に供して、殻に付着した粉塵に関係する任意の汚染リスクを回避した。
方法の第1の段階において、マウス由来の細胞(STO細胞)をフィーダー層として用いて、アヒル幹細胞の多能性を維持した。これらのフィーダー細胞は、プラスチック上に播種する前に、ガンマ線照射(45〜55グレイ)によって有糸分裂を不活性化される。放射線照射のこの線量は、細胞周期の決定的停止を誘導するが、非分化細胞の細胞増殖の促進のために必要な増殖因子および細胞外マトリックスの産生は引き続き許容する致死未満量である。STO細胞株は、A. Bernstein(Ontario Cancer Institute, Toronto, Canada)によって、SIM(Sandos Inbred Mice)マウスの胚線維芽細胞の持続的株から誘導され、American Type Culture Collection (ATCC)によって供給された(STO製品番号:CRL-1503、バッチ番号1198713)。新鮮なフィーダー層を週に2回調製した。指数期の細胞を分離し、計数した。生存能力がある培養物を維持するために細胞の一部分を播種し、別の部分に放射線照射した。放射線照射のために、本発明者らは、10×106細胞/mLの細胞懸濁液をチューブ中で調製した。細胞を45〜55グレイの線量に曝露し、プラスチック上に播種した。播種後、不活性化したフィーダー細胞でコーティングしたシャーレまたはプレートを、最長5日間使用した。
EX-CELL(商標)65788、65319、63066、および66444培地(SAFC、特別注文による培地)
GTM-3培地(Sigma、カタログ番号G9916)
DMEM-HamF12(Cambrex、カタログ番号BE04-687)
DMEM(Cambrex、カタログ番号BE 12-614F)
グルタミン(Cambrex、カタログ番号BE17-605E)
ペニシリン/ストレプトマイシン(Cambrex、カタログ番号BE17-602E)
非必須アミノ酸(Cambrex、カタログ番号BE13-114E)
ピルビン酸ナトリウム(Cambrex、カタログ番号BE13-115)
ビタミン(Cambrex、カタログ番号13-607C)
βメルカプトエタノール(Sigma、カタログ番号M7522)
酵母加水分解物(SAFC、カタログ番号58902C)
PBS 1×(Cambrex、カタログ番号BE17-516F)
ジメチルスルホキシド(DMSO)(Sigma、カタログ番号D2650)
以下の2種の異なる組換え因子を使用した:
・組換えヒト繊毛様神経栄養因子(CNTF)(Peprotech Inc、カタログ番号450-13)
・組換えヒトインスリン様因子I(IGF1)(Peprotech Inc、カタログ番号100-11)
これらの2種の因子は、大腸菌において産生させた。
放射線照射されていないウシ胎仔血清(FBS)(JRH、カタログ番号12003)
この計画で使用した放射線照射されていない血清は、オーストラリアで採取され製造された。採取のために使用された動物は、USDAによる検査を受け、屠殺が容認されたものであった。これは、トリ幹細胞を培養する間に培地に添加した。このバッチは、培養状態の幹細胞の維持のために不可欠であると確認された重要なタンパク質または成分の破壊を回避するために、放射線照射には供さなかった。
この計画で使用した放射線照射されたバッチは、米国で採取された。放射線照射されたこのバッチを、STO細胞(フィーダー細胞)の培養のために使用されるDMEM培地に補充物として添加した。これらの細胞は、幹細胞とは違って、培養状態で増殖および維持するために特定の品質の血清を必要としない。培地中の高濃度の血清を最小限にするために、本発明者らは、わずか4%のFBSの存在下での増殖にSTO細胞を順応させた。
・プロナーゼ(Roche、カタログ番号165 921)
プロナーゼは、Roche Diagnostics,Germanyによって製造された組換えプロテアーゼであり、接着トリ幹細胞の分離のために使用される。
・トリプシンEDTA(Cambrex、カタログ番号BE17-161E)
トリプシンは、STO細胞の分離のために、後期の継代培養では、無血清培地に順応したトリ細胞を分離するために使用される。ブタ由来のこの酵素は、cGMPの指示要件に従って、有効な滅菌ろ過法によって無菌的に製造され、現行のE.Pに従って試験される。この原材料は、調製する前に放射線照射され、9/CFR113.53に忠実に従って、ブタパルボウイルスに関して試験される。
・トリプジーン(Trypzean)(Sigma、カタログ番号T3449)
トリプジーン溶液は、ウシ組換えトリプシンを用いて調製され、トウモロコシにおいて発現され、Sigma Aldrichにより、ProdiGene社専有のトランスジェニック植物タンパク質発現系を利用して、製造される。この製品は、無血清の接着細胞培養物および血清を添加した接着細胞培養物の両方における細胞解離のために最適化されている。
・非酵素的細胞解離溶液(Sigma、カタログ番号C5914)
この解離剤は、培養管の増殖表面から細胞を穏やかに剥離するために使用される、すぐ使用できる調製物である。この調製物は、タンパク質を含まず、酵素を用いずに細胞を取り外すことを可能にする。細胞タンパク質は保存されるため、細胞表面タンパク質の認識に依存する免疫化学的研究が可能になる。この酵素は、EMA-1(Epithelial Membrane Antigen 1)およびSSEA1(Stage Specific Embryonic antigen- 1)のような生物学的マーカーをFACS解析する前に、細胞を剥離するために使用された。
約360個のアヒル受精卵を割り、開卵する間に、卵白から卵黄を分離した。穴開け機を用いて穴の開いた輪の形に予め切り抜いた小型の吸収性ろ紙(Whatmann 3M紙)を用いて、卵黄から胚を取り出した。穴の直径は約5mmである。これらの小型の輪は、オーブン中で約30分間、乾熱滅菌した。実際には、胚採取の段階の間に、小型の紙の輪を卵黄の表面に置き、胚の中央に合わせ、このようにして紙の輪で胚を取り囲む。次いで、小型のはさみを用いて後者を切り抜き、取り出した全体を、PBSで満たしたペトリ皿に入れる。輪を用いてこのようにして取り出した胚を媒体中で洗浄して過剰な卵黄を除き、このようにして過剰なビテリンを取り除いた胚盤をパスツールピペットで採取した。
3.1 原材料
アヒルの卵、フィーダー細胞、添加物、緩衝液および固定液、凍結保護剤、ウシ胎仔血清、ならびに解離剤(実施例3と同じ)
ペキン種GL30に由来するアヒルの卵を使用した。
EX-CELL 65319、63066、および66444培地(SAFC、特別注文による培地)
GTM-3培地(Sigma、カタログ番号G9916)
DMEM(Cambrex、カタログ番号BE 12-614F)
以下の6種の異なる組換え因子を使用した:
・組換えヒト繊毛様神経栄養因子(CNTF)(Peprotech Inc、カタログ番号450-13)
・組換えヒトインスリン様因子I(IGF1)(Peprotech Inc、カタログ番号100-11)
・組換えヒトインターロイキン6(IL6)(Peprotech Inc、カタログ番号200-06)
・組換えヒト可溶性インターロイキン6受容体(sIL6r) (Peprotech Inc、カタログ番号200-06 R)
・組換えヒト幹細胞因子(SCF)(Peprotech Inc、カタログ番号300-07)
・組換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)(Peprotech Inc、カタログ番号100-18B)
IL6r以外のこれらの因子はすべて、大腸菌において産生させる。可溶性IL6rは、トランスフェクトされたHEK293細胞において発現させる。
EB66に関して先に説明したようにして、アヒル胚を採取した。PBS 1×を含む50mLチューブにアヒル胚を入れた。次いで、アヒル胚を機械的に分離し、PBS中で洗浄し、39℃、7.5%CO2で、完全培地中のフィーダーSTO細胞の不活性化層に播種した。フィーダー細胞は、約2.7×104細胞/cm2の濃度で6ウェルプレートまたはシャーレに播種した。完全培地は、5%ウシ胎仔血清、最終濃度1ng/mlのIGF1、CNTF、Il-6、Il-6R、SCF、およびFGF、ならびに1%の非必須アミノ酸、1%の市販のビタミン混合物、最終濃度0.1mMのピルビン酸ナトリウム、最終濃度0.5mMのβ-メルカプト-エタノール、最終濃度2.1mMのグルタミン、最終濃度100U/mlのペニシリン、最終濃度100μg/mlのストレプトマイシン、および酵母加水分解物1×を添加した無血清培地GTM-3から構成される。細胞の最初の継代後、速やかに、抗生物質混合物を培地に添加するのを止める。速やかに、という表現は、一般に最初の3〜9回の継代の後を意味すると理解される。アヒルES細胞を完全培地中で第9代まで培養した。第9代の後に、完全培地の因子をある程度枯渇させる。すなわち、第10代〜第13代の間に、SCF、IL6、IL6r、およびbFGFを培地から除去し、組換えIGF1およびCNTFのみを濃度1ng/mlで維持した。次に、第13代〜第16代の間にIGF1およびCNTFの濃度を同時に低下させて、組換え因子無しで増殖できる細胞を第17代で最終的に得た。因子の枯渇は、低濃度の因子に漸進的に順応させることによって実施した。ペキンアヒル胚に由来するアヒルES細胞を1つの培養シャーレから別の培養シャーレに継代する場合、培養シャーレへの播種は、完全培地において約7×104個/cm2〜12×104個/cm2の間のアヒルES細胞を用いて実施した。好ましくは、播種は、約7.3×104個/cm2(4×106細胞/55cm2または4×106細胞/100mmシャーレ)で行う。組換え因子を枯渇させた後、第23代の時点で酵母加水分解物を減少させて、最終濃度を0.5倍にした。次いで、第31代の後に、数回の継代に渡ってフィーダー細胞濃度を漸進的に低下させることにより、フィーダー細胞の枯渇を実施した。最初にフィーダー細胞約2.7×104個/cm2をシャーレに播種し、次いで、第32代〜第38代の間にフィーダー細胞約1.8×104個/cm2、次いで第39代〜第44代の間に細胞約1.4×104個/cm2、次いで第45代〜第47代の間にフィーダー細胞約1×104個/cm2、次いで第48代〜第50代の間にフィーダー細胞約0.7×104個/cm2を播種し、最後に、第51代からはトリ細胞のみをシャーレに播種し、フィーダー細胞は播種しなかった。フィーダー枯渇の最後に、トリ細胞9×104個/cm2〜トリ細胞12.7×104個/cm2をシャーレに播種する。フィーダー細胞の枯渇は第32代に開始し、第51代で終了した。フィーダー細胞を枯渇させる間、段階(a)より高い濃度、すなわち約9×104細胞/cm2〜約12.7×104細胞/cm2でアヒルES細胞を培養シャーレに播種する。フィーダー細胞無しで数回継代した後、増殖パラメーター(集団倍加時間(PDT)および濃度)を調査して、細胞の安定性および強健性を確認し、浮遊液としての細胞増殖を開始した。PDTが約40時間より短く、細胞濃度が約26×104細胞/cm2より高い場合、細胞は十分に強健で、浮遊培養に供することができるとみなされる。さらに、細胞の形態は、円形、屈折性(refringent)、非常に小型であるべきであり、細胞はプラスチックシャーレにあまり多く接着すべきではない。
4.1 原材料
アヒルの卵、フィーダー細胞、添加物、緩衝液および固定液、凍結保護剤、ウシ胎仔血清、ならびに解離剤(実施例3と同じ)
ペキン種GL30に由来するアヒルの卵を使用した。
EX-CELL(商標)65319、63066、および66444培地(SAFC、特別注文による培地)
GTM-3培地(Sigma、カタログ番号G9916)
DMEM F12(Cambrex、カタログ番号BE04-687)
DMEM (Cambrex、カタログ番号BE12-614F)
以下の6種の異なる組換え因子を使用した:
・組換えヒト繊毛様神経栄養因子(CNTF)(Peprotech Inc、カタログ番号450-13)
・組換えヒトインスリン様因子I(IGF1)(Peprotech Inc、カタログ番号100-11)
・組換えヒトインターロイキン6(IL6)(Peprotech Inc、カタログ番号200-06)
・組換えヒト可溶性インターロイキン6受容体(sIL6r) (Peprotech Inc、カタログ番号200-06 R)
・組換えヒト幹細胞因子(SCF)(Peprotech Inc、カタログ番号300-07)
・組換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)(Peprotech Inc、カタログ番号100-18B)
IL6r以外のこれらの因子はすべて、大腸菌において産生させる。可溶性IL6rは、トランスフェクトされたHEK293細胞において発現させる。
EB66に関して先に説明したようにして、アヒル胚を採取した。PBS 1×を含む50mlチューブにアヒル胚を入れた。次いで、アヒル胚を機械的に分離し、39℃、7.5%CO2で、完全培地中のフィーダーSTO細胞の不活性化層に播種する。フィーダー細胞は、約2.7×104細胞/cm2の濃度で6ウェルプレートまたはシャーレに播種した。完全培地は、10%ウシ胎仔血清、最終濃度1ng/mlのIGF1、CNTF、Il-6、Il-6R、SCF、およびFGF、ならびに1%の非必須アミノ酸、1%の市販のビタミン混合物、最終濃度0.1mMのピルビン酸ナトリウム、最終濃度0.5mMのβ-メルカプト-エタノール、最終濃度2.1mMのグルタミン、最終濃度100U/mlのペニシリン、最終濃度100μg/mlのストレプトマイシン、および1×酵母加水分解物を添加した無血清培地DMEM-Ham F12から構成される。細胞の最初の継代後、速やかに、抗生物質混合物を培地に添加するのを止める。速やかに、という表現は、一般に最初の3〜9回の継代の後を意味すると理解される。
5.1 親となる空発現ベクター:pVVS431(pKNexp)
VIVALISベクターのバックボーンは、大腸菌におけるプラスミド増幅およびトリEBx(登録商標)細胞への発現ベクタートランスフェクション後のクローン選択を可能にする単一の耐性カセットを含む。nptII遺伝子は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼタンパク質をコードし、原核生物ではカナマイシン耐性および真核生物ではネオマイシン耐性を生物に与える。転写は、nptII遺伝子の上流に縦に並んでクローニングされた原核生物プロモーターおよび真核生物プロモーターの両方によって推進される。関心対象のタンパク質をコードするcDNAは、容易に交換可能な(easely exangeable)プロモーター(すなわちCMVプロモーターなど)、イントロン、およびポリA領域を含む空発現カセット中に位置するMCS(multiple cloning site)内にクローニングされる(図1)。
ヒト-マウスのキメラMab IgG1(κ軽鎖)をMAT-Biopharma(Evry, France)の好意により頂いた。pIgG1-L-クローン10(MAT-Biopharma)に由来する平滑末端化したNcoI-KpnI DNA断片を、pKNexp MCS領域の平滑末端化したNheI-NotI部位内にクローニングして、pVVS451(pCMV-IgG1-L)を作製した。pVVS451において、Mab軽鎖の発現は、CMVプロモーターによって推進される。RSVプロモーター(ラウス肉腫ウイルス)をPhilippe Moullier (Inserm U649 - Laboratoire de Therapie Genique, CHU Hotel-Dieu, Nantes)から入手した。RSVプロモーターは、SO29
プライマーおよびSO30
プライマーを用いて、pAAV5RSVLacZからPCR増幅した。RSVプロモーターのPCR断片およびpVVS451をBglIIおよびIPpoIで消化した。pVVS451のCMVプロモーターを含まないDNA断片をアガロースゲル精製し、pVVS452を作製するためにRSVプロモーターに連結した(図2A)。
Mabγ1アイソタイプをMAT-Biopharma(Evry, France)から入手した。pHIgG1-H-クローン28(MAT-Biopharma)に由来する平滑末端化したNcoI-HindIII DNA断片を、pKNexp MCS領域の平滑末端化したNheI-NotI部位内にクローニングして、pVVS449(pCMV-HIgG1L)を作製した。pVVS449において、Mab重鎖の発現は、CMVプロモーターによって推進される。RSVプロモーターのPCR断片およびpVVS449をBglIIおよびIPpoIで消化した。pVVS449のCMVプロモーターを含まないDNA断片をアガロースゲル精製し、pVVS450を作製するためにRSVプロモーターに連結した(図2B)。
RSVプロモーターによって推進されるIgG1軽鎖発現カセットを、SO29プライマーおよびAS455
プライマー(配列番号9)を用いたPCRによってpVVS452から増幅した。RSVプロモーター、H90軽鎖、およびSV40後期ポリAを有するこのDNA断片をAscIおよびBamHIによって消化した。レシピエントpVVS450ベクターをAscI-BglIIで消化した。直線化したベクターの5'末端を脱リン酸した後に、精製した増幅DNA断片と連結して、pVVS455(pRSV-LH-IgG1)を作製した(図3A)。
S86N45セキショクヤケイ(Gallus gallus)種から精製した全RNAに対してRT-PCR実験を実施して、NR13抗アポトーシス遺伝子をコードするcDNAを作製した。それぞれNheI部位およびNotI部位を有するオリゴヌクレオチドAS376
およびAS377
を用いて、NR13 cDNA断片を作製した。CMVプロモーターを欠失させRSVプロモーターで置き換えた、pCiNeoベースのベクターを、NR13 cDNAのレシピエントとして使用した。両方のDNAのNheI消化およびNotI消化に続いて、ライゲーション実験を行った。ライゲーション産物を使用して、プライマーSO29およびプライマーAS4349を用いたPCR増幅を実行して、NR13 RSV推進性プロモーター発現カセットを得た。このPCR断片をBglIIおよびSwaIによって消化した。レシピエントpVVS437ベクターをBglII-SwaIで消化した。精製した挿入断片およびベクターの両方を一つに連結してpVVS438(pNR13-ピューロ)を作製した。
6.1 ニワトリEBx細胞における一過性トランスフェクション
8種の異なるプロモーターによってそれぞれ推進される2つのレポーター遺伝子(赤蛍光タンパク質dsREDnucおよびヒト血液凝固因子IX)の一過性発現を接着ニワトリEBx細胞において実施して、最も優れたプロモーターを単離した。
GFP:蛍光性レポータータンパク質; DsRed2nuc:蛍光性レポータータンパク質; hFIX:ヒト凝固因子IX; IgG1-LHまたはHL:同じベクター内にクローニングされ、通知された(notified)同じプロモーターによって推進される、IgG1をコードする軽鎖および重鎖。LH:軽鎖は重鎖の上流にクローニングされる; HL:重鎖は軽鎖の上流にクローニングされる。pVVSxxxは、Vivalisのデータベースに登録されているベクターの名称に対応する。
方法
6ウェルプレート中の2.5mMグルタミンを添加した無血清培地(SAFC Biosciences社製のExcell GTM3培地)に懸濁したアヒルEBx 細胞に、ヌクレオフェクチン(nucleofection)(Amaxa, DE)を用いて発現ベクター[pEF1/HTLV-IgG1軽鎖および重鎖](pvVS490)を一過性にトランスフェクトした。トランスフェクション後24時間目および48時間目に、ELISAアッセイ法によってIgG1発現をモニターした。DNA無しで対照ヌクレオフェクチンを実施した。
アヒルEBx細胞は、最大約4.5μg/mlのIgG1抗体を一過性に発現した(図4)。
7.1 材料および方法:
細胞:
2.5mMグルタミンを添加した無血清培地(SAFC Biosciences社製のExcell)中のニワトリEB14細胞およびアヒルEB66細胞。
EB14細胞に対してはpVVS490(pEF1/HTLV)およびpVVS455(pRSV)。EB66細胞に対してはpVVS490(pEF1/HTLV)。
エレクトロポレーション(Amaxa)により、無血清培地中のEB14細胞およびEB66細胞に発現ベクターをトランスフェクトした。トランスフェクション後3日目に、選択剤(EB14細胞に対しては0.25mg/ml、EB66細胞に対しては0.15mg/mLのジェネテシン)を細胞培養培地に添加する。ジェネテシン耐性クローンを単離し、採取し、より大きな容器(マイクロプレート、フラスコ、次いでバイオリアクター)において培養した。
安定にトランスフェクトされたクローンに対してELISAスクリーニングアッセイ法を実施して、上清中の抗体発現レベルを検出した。このアッセイ法は、定量的なサンドイッチ式酵素イムノアッセイ技術を使用する。96ウェルプレートに抗IgG-Fc特異的抗体を予めコーティングする。標準物質、試料、および結合体をこれらのウェルに添加し、固定化された抗体とIgG-κに特異的な第2の酵素結合モノクローナル抗体によって、存在する任意のIgGをサンドイッチ状にはさむ。任意の未結合の物質および/または抗体-酵素反応物を除去するために洗浄した後、基質溶液をウェルに添加すると、結合されたIgGの量に比例して発色が起こる。反応を停止し、発色強度を測定する(光学濃度、490nm)。各標準物質の平均吸光度をy軸に、濃度をx軸にプロットすることによって検量線を作成し、グラフのプロット点を通る最良適合曲線を引いた。平均吸光度に対応するIgG濃度を検量線から算出することによって、未知の各試料の濃度を決定する。試料の場合、検量線から決定した濃度に希釈率を掛けなければならない。
ヒト-マウスキメラIgG1の重鎖および軽鎖cDNAをコードする発現ベクターを安定にトランスフェクトされた多くのEBx(登録商標)細胞クローンを獲得し、ELISAを用いて選択した。最も優れた産生クローンを選択し、より大きな容器で培養した(図5)。IgG1を発現する安定にトランスフェクトされた1つのEB14クローンおよびEB66クローンを浮遊培養に順応させ、3リットルの攪拌槽バイオリアクターでさらに培養した。3Lバイオリアクター中の9日間の非最適化培養後、EB14細胞濃度は細胞1600万個/mlに達し、細胞培養上清中のIgG1濃度は約0.25g/lであった(図6A)。非最適化条件下で、IgG1はまた、3Lバイオリアクター中のEB66細胞においても効率的に発現された(図6B)。
EBxによって産生されたIgG1に結合しているグリカンのキャピラリー電気泳動解析を実施して、ヒト血清IgGに結合しているグリカンのキャピラリー電気泳動解析と比較した。得られた結果から、EBxのグリコシル化プロファイルが、ヒトのグリコシル化プロファイルに類似していることが実証された(図7A)。
EBx(登録商標)細胞およびハイブリドーマにおいて産生させたIgG1による腫瘍細胞増殖の阻害の解析
ニワトリEB14細胞またはハイブリドーマいずれかにおいて産生させたIgG1免疫グロブリンの細胞増殖阻害活性を測定するためにアッセイ法を開発した。IgG1抗体は、ヒト腫瘍細胞表面で発現されるCDマーカーを対象とする。トリチウム標識チミジンの存在下で腫瘍細胞を増殖させ、正常な患者から精製した単球またはナチュラルキラーT細胞と共に、IgG1免疫グロブリンの存在下でインキュベートした。このアッセイ法では、単球またはNK細胞によるIgG1を介した腫瘍細胞溶解の後、腫瘍細胞中に取り込まれたトリチウム標識チミジンの量を測定する。4日間培養した後、少量のトリチウム標識チミジンが、NK細胞または単球細胞で処理し、かつニワトリEB14細胞において産生させたIgG1抗体で処理した腫瘍細胞に取り込まれていた。反対に、NK細胞または単球細胞で処理し、かつハイブリドーマにおいて産生させたIgG1抗体で処理した腫瘍細胞では、より高レベルのH3-チミジンが観察された。
10.1 方法
健常なドナー2名に由来するPBMCを標準的な密度遠心分離手順を用いて単離し、RPMI細胞培養培地中に5×106細胞/mlの濃度で懸濁した。
異なる健常なドナー2名のPBMCから精製したNK細胞を用いて2回の独立した実験を行ったところ、疾患に関連した標的細胞を対象とし、かつニワトリEB14細胞およびアヒルEB66細胞において産生させたIgG1抗体が、CHO細胞において産生させた同じ抗体と比べて増加したADCC活性を有することが示された(図10、15、および16)。ADCC活性は、クロミウム放出法によって測定するか、またはIFNγもしくはCD107マーカーを発現するNK細胞の比率に基づいて評価した(図15)。
2つの異なる発現ベクター、pVVS437ベクターおよびpVVS438ベクター、を構築した。pVVS437は、ピューロマイシン耐性遺伝子のみを含む。PVVS438は、ピューロマイシン耐性遺伝子およびニワトリ抗アポトーシス遺伝子NR13の発現を可能にする。
Claims (27)
- 細胞において関心対象の組換えタンパク質の発現を引き起こすことができるプロモーター配列に機能的に連結された、該タンパク質をコードする核酸配列を含む少なくとも1つの発現カセットを含む少なくとも1つの発現ベクターをトランスフェクトされた、トリEBx(登録商標)細胞。
- 発現ベクターが、宿主細胞において選択マーカーの発現を引き起こすことができるプロモーター配列に機能的に連結された、該選択マーカーをコードする少なくとも1つの核酸配列を含む少なくとも1つの発現カセットをさらに含む、請求項1記載のEBx(登録商標)細胞。
- 選択マーカーが、グルタミン合成酵素、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ピューロマイシン、ハイグロマイシンB、ネオマイシン遺伝子、およびジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)より選択される、請求項1および2のいずれか一項記載のEBx(登録商標)細胞。
- プロモーター配列が、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、サルウイルス40(SV40)初期プロモーター、単純ヘルペスウイルス(HSV)チミジンキナーゼプロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、マウスホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、eIF4αプロモーター、キメラEF1α/HTLVプロモーター、CAGプロモーター、β-アクチンプロモーターより選択される、請求項3記載のEBx(登録商標)細胞。
- 発現カセットが、転写開始配列、エンハンサー配列、イントロン配列、ポリアデニル化配列、終結配列、クロマチンインスレーターエレメントからなる群より選択される、1つまたは複数の制御エレメントまたは調節配列をさらに含む、請求項1および4のいずれか一項記載のEBx(登録商標)細胞。
- クロマチンインスレーターエレメントが、バウンダリーエレメント(BE)、マトリックス結合領域(MAR)、遺伝子座調節領域(LCR)、普遍的クロマチンオープニングエレメント(UCOE)より選択される、請求項5記載のEBx(登録商標)細胞。
- 発現ベクターが少なくとも以下を含む、請求項1〜6のいずれか一項記載のEBx(登録商標)細胞:
次のDNA配列を次の順序で含む第1の発現カセット:配列番号1のCMVプロモーター配列、イントロン配列、関心対象の組換えタンパク質をコードするcDNA配列、ポリアデニル化配列、および
次のDNA配列を次の順序で含む第2の発現カセット:SV40プロモーター、ネオマイシン遺伝子、ポリアデニル化配列。 - 発現ベクターが少なくとも以下を含む、請求項1〜6のいずれか一項記載のEBx(登録商標)細胞:
次のDNA配列を次の順序で含む第1の発現カセット:配列番号2のキメラEF1α/HTLVプロモーター配列、イントロン配列、関心対象の組換えタンパク質をコードするcDNA配列、ポリアデニル化配列、および
次のDNA配列を次の順序で含む第2の発現カセット:SV40プロモーター、ネオマイシン遺伝子、ポリアデニル化配列。 - 発現ベクターが少なくとも以下を次の順序で含む、請求項1〜6のいずれか一項記載のEBx(登録商標)細胞:
次のDNA配列を次の順序で含む第1の発現カセット:配列番号1のCMVプロモーター、イントロン配列、抗体の重鎖またはその断片をコードするcDNA配列、ポリアデニル化配列;
次のDNA配列を次の順序で含む第2の発現カセット:配列番号1のCMVプロモーター、イントロン配列、抗体の軽鎖またはその断片をコードするcDNA配列、ポリアデニル化配列;
次のDNA配列を次の順序で含む第3の発現カセット:SV40プロモーター、ネオマイシン遺伝子、ポリアデニル化配列。 - 発現ベクターが少なくとも以下を次の順序で含む、請求項1〜6のいずれか一項記載のEBx(登録商標)細胞:
次のDNA配列を次の順序で含む第1の発現カセット:配列番号2のキメラEF1α/HTLVプロモーター、イントロン配列、抗体の重鎖またはその断片をコードするcDNA配列、ポリアデニル化配列;
次のDNA配列を次の順序で含む第2の発現カセット:配列番号2のキメラEF1α/HTLVプロモーター、イントロン配列、抗体の軽鎖またはその断片をコードするcDNA配列、ポリアデニル化配列;
次のDNA配列を次の順序で含む第3の発現カセット:SV40プロモーター、ネオマイシン遺伝子、ポリアデニル化配列。 - 細胞において抗アポトーシスタンパク質の発現を引き起こすことができるプロモーター配列に機能的に連結された、該抗アポトーシスタンパク質をコードするDNA配列を含む少なくとも1つの発現カセットを含む発現ベクターをさらに含む、請求項1〜10のいずれか一項記載のEBx(登録商標)細胞。
- 抗アポトーシスタンパク質が、ニワトリNR13タンパク質である、請求項11記載のEBx(登録商標)細胞。
- 細胞の染色体DNAに発現ベクターが安定に組み込まれる、請求項1〜12のいずれか一項記載のEBx(登録商標)細胞。
- EB14細胞およびEBv13細胞より選択されるニワトリEBx(登録商標)細胞であり、かつEB24、EB24-12、EB26、およびEB66より選択されるアヒルEBx細胞である、請求項1〜13のいずれか一項記載のEBx(登録商標)細胞。
- 無血清培地に順応させた浮遊EBx(登録商標)細胞である、請求項14記載のEBx(登録商標)細胞。
- 無血清培地に順応させた接着EBx(登録商標)細胞である、請求項14記載のEBx(登録商標)細胞。
- 以下の段階を含む、トリEBx(登録商標)細胞において少なくとも1種の関心対象の生物学的産物を産生させるための方法:
(a)少なくとも1つの発現ベクターをトランスフェクションすることによって、請求項1〜16のいずれか一項記載のEBx(登録商標)細胞を調製する段階;
(b)該EBx(登録商標)細胞を、適切な条件下で、かつ適切な培地中で培養する段階;および
(c)該EBx(登録商標)細胞、該適切な培地、または該EBx(登録商標)細胞および該培地の両方から、関心対象の生物学的産物を回収する段階。 - エレクトロポレーションにより、無血清培地中での接着培養において少なくとも1つの発現ベクターをEBx(登録商標)細胞にトランスフェクトする、請求項17記載の方法。
- リポソームを介したトランスフェクションにより、無血清培地中での浮遊培養において少なくとも1つの発現ベクターをEBx(登録商標)細胞にトランスフェクトする、請求項17記載の方法。
- 関心対象の生物学的産物が、抗体分子、抗体断片、または免疫グロブリンのFc領域に等価な領域を含む融合タンパク質であり、Fcを介した増加した細胞毒性を有する、請求項17〜19のいずれか一項記載の方法。
- ニワトリEBx(登録商標)グリコシル化またはアヒルEBx(登録商標)グリコシル化を有する、関心対象の生物学的産物。
- EBx(登録商標)細胞において産生され、かつEBx(登録商標)グリコシル化を有する抗体集団であって、該抗体集団またはその断片が、末端GlcNacを有し、高度にガラクトシル化された長鎖を含み、かつ強いADCC活性を該抗体に与える共通の2分岐型N結合型フコシル化オリゴ糖構造体を有する抗体を高比率で含むFc領域を含む、抗体集団。
- EBx(登録商標)細胞において産生され、かつハイブリドーマ細胞またはCHO細胞において産生された同じ抗体と比べて増加したADCC活性を有する、IgG1サブタイプまたはIgG3サブタイプの請求項22記載の抗体。
- 薬剤としての、請求項21記載の関心対象の生物学的産物。
- 薬剤としての、請求項22および23のいずれか一項記載の抗体またはその断片。
- ヒトおよび動物の疾患を予防または治療するための薬学的組成物の調製のための、請求項24記載の生物学的産物または請求項25記載の抗体もしくはその断片の使用。
- 請求項24記載の生物学的産物または請求項25記載の抗体もしくはその断片、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
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