JP6166303B2 - 抗体の発現のための骨髄白血病起源のヒト細胞の使用 - Google Patents
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Description
本発明は、増大した活性および/または増大した収率および/または改善された均一性を有するタンパク質分子組成物、特に抗体分子組成物の産生のための生物工学的に有利な方法、ならびにヒトグリコシル化を提供する。さらに、本発明は、新規な宿主細胞、核酸、およびタンパク質分子組成物を提供する。
当業界の重要な主要点および努力目標は組換えタンパク質の作製であり、生産性、コスト、均一性、およびタンパク質活性は、最適化の余地がある重要な課題である。また、グリコシル化も、均一な組換え糖タンパク質の高収率作製における重要な課題であるが、かかるタンパク質の作製に一連の大きな問題点を課す。現在使用されている各産生細胞株は、異なる一連の努力目標および問題点(これは、主として、グリコシル化の複雑性ならびに種、組織および部位特異性による)をもたらす。したがって、グリコシル化に関する産生系の最適化は、最適化の余地がある重要な側面の1つである。これは、特に、多くの場合、グリコシル化パターンの違いが、そのタンパク質分子の活性、免疫原性、バイオアベイラビリティおよび半減期に相当な影響を及ぼすためである。種々の種に由来する種々の細胞株および非哺乳動物産生系のグリコシル化の性質の概要の詳細は、Jenkinsら(Getting the glycosylation right:implications for the biotechnology industry,Nat
Biotechnology,1996,14:975−981)に示されている。
タンパク質は、その機能および存在度が互いに大きく異なる多様性のある一群である。潜在的に治療用のタンパク質のうち、ほとんどのタンパク質はグリコシル化されたものであり、例えば、多くのホルモン(例えば、成長ホルモン、グリカゴン、FSHおよびLH)、増殖因子(例えば、GM−CSF、G−CSF、VEGFおよびエリトロポイエチン)、サイトカイン(例えば、IL−2、IL−7、インターフェロン−αおよび−β、TNF−α)、抗凝血剤(coagulantia)(例えば、Lepirudin、Desirudin)、血液凝固因子(例えば、第VII因子、第VIII因子および第IX因子)、ワクチン(例えば、B型肝炎抗原)ならびに抗体などである。確立された細胞産生系は、元々のヒトグリコシル化を有するタンパク質を産生することができない。原核生物(例えば、細菌)ならびにほとんどの真核生物の細胞系(例えば、酵母、昆虫および植物細胞)は、グリコシル化がないタンパク質、またはヒト糖鎖と大きく異なるグリカンを有するタンパク質を合成する。チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞は、一般的に使用されている産生系であり、ヒト細胞と同様の様式でタンパク質をグリコシル化することができる。しかしながら、依然として、例えばガラクトシル化、フコシル化、N−アセチルグルコサミンによる具体的なグリコシル化、および特にシアリル化の種々の側面に重要な違いがある。このような違いは、活性、バイオアベイラビリティ、免疫原性および半減期に影響を及ぼす。
また、糖鎖の修飾、したがってタンパク質のグリコシル化は、組換え発現タンパク質の血清半減期を改善するためである。そのため、当該技術は、組換え糖タンパク質のシアリル化度の最大化に焦点をあてたものである。シアル酸は、真核生物細胞の表面上で最もよく見られる末端単糖であり、一般的に、糖タンパク質が多くシアリル化されているほど、その循環中の血清半減期が長くなると考えられている。これは、循環中の非シアリル化タンパク質に結合し、これを細胞に指向して分解させる肝臓内のアシアロタンパク質受容体としてのある種の受容体の存在に基づく。
CHO細胞において発現させた場合、特定のある抗体のADCC活性が増大され得ることが報告された[特許文献2]。この結果はまた、抗体の活性に対するグリコシル化パターンの重要性および複雑性を示す。
(a)不死化ヒト血液細胞である宿主細胞内に、前記タンパク質の少なくとも一部分をコードする少なくとも1つの核酸を導入すること;
(b)前記宿主細胞を前記タンパク質分子組成物の産生を許容する条件下で培養すること;および
(c)前記タンパク質組成物を単離すること
を含む、タンパク質組成物を産生させる方法が提供される。
(a)宿主細胞としての不死化ヒト血液細胞内に、タンパク質またはその少なくとも一部分をコードする少なくとも1つの核酸を導入すること;
(b)前記宿主細胞を前記タンパク質組成物の産生を許容する条件下で培養すること;および
(c)目的の特徴的グリコシル化を有する前記タンパク質組成物を単離すること
を含む、規定のグリコシル化パターンを有するタンパク質組成物、好ましくは抗体分子組成物を産生させる方法が提供される。
−該アミノ酸種(strain)に近位のGlcNAc残基に対してα1,6結合;
−アンテナ型で存在するGlcNAc残基に対してα1,3およびα1,4結合;
−アンテナ型で存在するGal残基に対してα1,2結合
で非常に特別に見られる。
バイセクトN−アセチルグルコサミン(bisGlcNAc)は、多くの場合、抗体中に見られるN−グリカンのトリ−マンノシルコア構造の中央のマンノース残基にβ1,4結合した状態で見られる。抗体Fc−N−グリカンの中央のマンノース残基におけるバイセクトGlcNAcの存在により、抗体のADCC活性が増大する。
活性、半減期およびバイオアベイラビリティに対するシアリル化度/パターンの影響は、種々のタンパク質/抗体間で異なる。したがって、各タンパク質/抗体分子について、最適化シアリル化パターンを事前に本発明によるスクリーニング方法を用いることによって調べた後、所望のグリコシル化パターンをもたらす最も適当な宿主細胞で産生の確立を行なうことは有益である。例えば、下流の効果、すなわちCDCおよびADCCに対する、抗体のFcグリカン上に存在するシアル酸残基の負の影響を報告する刊行物がいくつか存在している。しかしながら、高度なシアリル化により、そのシアリル化分子の半減期が長くなることがわかった。したがって、産生されるタンパク質/抗体にもよるが、種々のシアリル化パターンが好都合であり得、本発明は、種々のシアリル化活性を有し、この場合、最適化されたグリコシル化パターンを示すタンパク質/抗体を得ることが可能な不死化ヒト血液細胞株を提供する。
およびNM-H9D8−E6である。
−細胞株CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させたときの同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物と比べて増大した活性、増大した収率および/または改善された均一性を有する;および/または
−細胞株CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させたときの同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物の収率よりも少なくとも10%高い平均または最大収率の増大を有する;および/または
−細胞株CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させたとき、改善されたグリコシル化の均一性である改善された均一性を有し、ここで前記抗体分子組成物が、同じ抗体分子の少なくとも1種類の抗体分子組成物のシアリル化度よりも小さいシアリル化度を有する;および/または
−細胞株CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させたとき、前記タンパク質分子が抗体分子である場合、同じ抗体分子の少なくとも1種類の抗体分子組成物のFc媒介性細胞性細胞傷害より少なくとも2倍大きいFc媒介性細胞性細胞傷害の増大を有する;および/または
−細胞株CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させたとき、前記タンパク質分子が抗体分子である場合、同じ抗体分子の少なくとも1種類の抗体分子組成物の結合より少なくとも50%高い抗原媒介性またはFc媒介性結合の増大を有する、
の産生のための宿主細胞が使用される。
−検出可能なNeuGcがない;
−検出可能なNeuNAcがない;
−細胞株CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させたときの同じタンパク質分子のタンパク質分子組成物よりもNeuNAcが多い;
−検出可能なα2−6結合NeuNAc
の少なくとも1つを含む前記タンパク質分子組成物の改善されたグリコシル化の均一性である。
(a)
−検出可能なNeuGcが含まれない
−検出可能なGalα1−3Galが含まれない
−請求項2に記載のガラクトシル化パターンが含まれる
−請求項2に記載のフコース含量を有する
−bisecGlcNAcが含まれる
−細胞株CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させたときの同じタンパク質分子のタンパク質組成物と比べて、またはNM−F9およびNM−D4などのシアリル化のない細胞株と比べて増加した量のシアル酸が含まれる
(b)
−検出可能なNeuGcが含まれない
−検出可能なGalα1−3Galが含まれない
−請求項2に記載のガラクトシル化パターンが含まれる
−請求項2に記載のフコース含量を有する
−bisecGlcNAcが含まれる
−細胞株CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させたときの同じタンパク質分子のタンパク質組成物と比べて減少した量のシアル酸が含まれる
(c)
−検出可能なNeuGcが含まれない
−検出可能なGalα1−3Galが含まれない
−請求項2に記載のガラクトシル化パターンが含まれる
−請求項2に記載のフコース含量を有する
−bisecGlcNAcが含まれる
−2−6 NeuNAcが含まれる
の1つを有するタンパク質分子を含むタンパク質組成物が産生されるように選択される。
M−CSFおよびG−CSF;インターロイキン(IL)、例えば、IL−1〜IL−12;スーパーオキシドジスムターゼ;T細胞受容体;表面膜タンパク質;崩壊促進因子;抗体およびイムノアドヘシン;グリコホリンA;MUC1などの分子が挙げられる。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
(項目1)
タンパク質分子組成物を産生させる方法であって、
(a)不死化ヒト血液細胞である宿主細胞内に、上記タンパク質の少なくとも一部分をコードする少なくとも1つの核酸を導入すること;
(b)上記宿主細胞を上記タンパク質分子組成物の産生を許容する条件下で培養すること;ならびに
(c)上記タンパク質分子組成物を単離すること
を含む、方法。
(項目2)
以下の工程:
(a)不死化ヒト血液細胞である宿主細胞内に、タンパク質またはその少なくとも一部分をコードする少なくとも1つの核酸を導入すること;ここで、上記宿主細胞は、以下の特徴的グリコシル化:
(i)検出可能なNeuGcが含まれない;および/または
(ii)該細胞において発現させたとき、上記タンパク質分子組成物中の諸タンパク質分子の糖鎖構造全体またはその諸タンパク質分子のうちのタンパク質1分子の特定の1つのグリコシル化部位の糖鎖構造において、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離された同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物中の同じ量のタンパク質分子と比べて増大したガラクトシル化度を有する;および/または
(iii)該細胞において発現させたとき、上記タンパク質分子組成物中の上記諸タンパク質分子の糖鎖構造全体またはその諸タンパク質分子のうちのタンパク質1分子の特定の1つのグリコシル化部位の糖鎖構造において、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離された同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物中の同じ量のタンパク質分子と比べて少なくとも5%多いG2構造量を有する;および/または
(iv)該細胞において発現させたとき、上記タンパク質分子組成物中の上記諸タンパク質分子の糖鎖構造全体またはその諸タンパク質分子のうちのタンパク質1分子の特定の1つのグリコシル化部位の糖鎖構造において、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離された同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物中の同じ量のタンパク質分子と比べて少なくとも5%少ないG0構造量を有する;および/または
(v)検出可能な末端Galα1−3Galを含まない;および/または
(vi)該細胞において発現させたとき、上記タンパク質分子組成物中の上記諸タンパク質分子の糖鎖構造全体またはその諸タンパク質分子のうちのタンパク質1分子の特定の1つのグリコシル化部位の糖鎖構造において、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離された同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物中の同じ量のタンパク質分子と比べて少なくとも5%少ないフコース量を含む;および/または
(vii)バイセクトGlcNAcを含有する少なくとも1つの糖鎖構造を含む;および/または
(viii)該細胞において発現させたとき、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離された同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物のシアリル化パターンと比べて改変されたシアリル化パターンを有する、
の少なくとも1つを有するタンパク質組成物が産生されるように選択される、
(b)上記宿主細胞を上記タンパク質分子組成物の産生を許容する条件下で培養すること;ならびに
(c)上記タンパク質分子組成物を単離すること、ここで、該タンパク質分子は特徴的グリコシル化(i)〜(viii)の少なくとも1つを有する、
を含む、タンパク質分子組成物、好ましくは抗体分子組成物を産生させるための項目1に記載の方法。
(項目3)
上記シアリル化パターンが、以下の特徴:
−α2−6結合NeuNAcを含む;および/または
−該細胞において発現させたとき、上記タンパク質分子組成物中の諸タンパク質分子の糖鎖構造全体またはその諸タンパク質分子のうちのタンパク質1分子の特定の1つのグリコシル化部位の糖鎖構造において、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離された同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物中の同じ量のタンパク質分子と比べて少なくとも15%多い量のNeuNAcによる、増大したシアリル化度を有する、および/または
−該細胞において発現させたとき、上記タンパク質分子組成物中の諸タンパク質分子の糖鎖構造全体またはその諸タンパク質分子のうちのタンパク質1分子の特定の1つのグリコシル化部位の糖鎖構造において、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離された同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物の同じ量のタンパク質分子よりも少なくとも15%少ない量のNeuNAcによる、減少したシアリル化度を有する、および/または
−該細胞において発現させたとき、上記タンパク質分子組成物中の諸タンパク質分子の糖鎖単位全体またはその諸タンパク質分子のうちのタンパク質1分子の特定のグリコシル化部位の少なくとも1つの特定の糖鎖に荷電N−グリコシド結合糖鎖が、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離された同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物中の同じ量のタンパク質分子と比べて少なくとも20%多く含まれる、および/または
−該細胞において発現させたとき、上記タンパク質分子組成物中の諸タンパク質分子の糖鎖単位全体またはその諸タンパク質分子のうちのタンパク質1分子の特定のグリコシル化部位の少なくとも1つの特定の糖鎖に荷電N−グリコシド結合糖鎖が、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離された同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物中の同じ量のタンパク質分子と比べて少なくとも20%少なく含まれる、
の少なくとも1つを特徴とする、項目1または2に記載の方法。
(項目4)
上記宿主細胞が、上記タンパク質分子組成物中の諸タンパク質分子の糖鎖単位全体またはその諸タンパク質分子のうちのタンパク質1分子の特定のグリコシル化部位の少なくとも1つの特定の糖鎖の少なくとも10%の糖鎖構造を含み、フコースがない糖タンパク質が産生されるように選択される、項目1〜3の少なくとも1項に記載の方法。
(項目5)
上記宿主細胞が、上記タンパク質分子組成物中の諸タンパク質分子の糖鎖単位全体またはその諸タンパク質分子のうちのタンパク質1分子の特定のグリコシル化部位の少なくとも1つの特定の糖鎖の少なくとも2%の糖鎖構造を含み、バイセクトGlcNAcを含有する糖鎖構造を含む糖タンパク質が産生されるように選択される、項目1〜4の少なくとも1項に記載の方法。
(項目6)
上記宿主細胞が、
−上記タンパク質分子組成物中の糖鎖構造全体またはそのうちのタンパク質1分子の特定の1つのグリコシル化部位の糖鎖構造において、35%より多くのG2構造を含む;および/または
−上記タンパク質分子組成物中の糖鎖構造全体またはそのうちのタンパク質1分子の特定の1つのグリコシル化部位の糖鎖構造において、22%未満のG0構造を含む
糖タンパク質が産生されるように選択される、項目1〜5の少なくとも1項に記載の方法。
(項目7)
産生される上記タンパク質分子組成物が、以下の特徴:
−特に細胞株CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させたときの同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物と比べて増大した活性および/または増大した収率を有する;
−特に細胞株CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させたときの同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物と比べて改善された均一性を有する;
−細胞株CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させたときの同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物の収率よりも少なくとも10%高い平均または最大収率の増大を有する;および/または
−細胞株CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させたときの同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物と比べて改善されたグリコシル化の均一性である改善された均一性を有する;
−細胞株CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させたときの同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物と比べて増大した活性を有する;
−上記タンパク質分子が抗体分子である場合、細胞株CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させたときの同じ抗体分子の少なくとも1種類の抗体分子組成物のFc媒介性細胞性細胞傷害より少なくとも2倍大きいFc媒介性細胞性細胞傷害の増大を有する;および/または
−上記タンパク質分子が抗体分子である場合、細胞株CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させたときの同じ抗体分子の少なくとも1種類の抗体分子組成物の結合よりも少なくとも15%、好ましくは20%、25%、30%、35%、40%、45%、好ましくは50%大きい抗原媒介性またはFc媒介性結合の増大を有する
の少なくとも1つを有する、項目1〜6の少なくとも1項に記載の方法。
(項目8)
宿主細胞を無血清条件下で培養して該タンパク質分子組成物を産生させる、項目1〜7の少なくとも1項に記載の方法。
(項目9)
宿主細胞が、以下の特徴的なグリコシル化の組合せ:
(a)
−検出可能なNeuGcが含まれない
−検出可能なGalα1−3Galが含まれない
−項目2に記載のガラクトシル化パターンが含まれる
−項目2に記載のフコース含量を有する
−bisecGlcNAcが含まれる
−細胞株CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させたときの同じタンパク質分子のタンパク質組成物と比べて、またはNM−F9およびNM−D4などのシアリル化のない細胞株と比べて増加した量のシアル酸が含まれる;
(b)
−検出可能なNeuGcが含まれない
−検出可能なGalα1−3Galが含まれない
−項目2に記載のガラクトシル化パターンが含まれる
−項目2に記載のフコース含量を有する
−bisecGlcNAcが含まれる
−細胞株CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させたときの同じタンパク質分子のタンパク質組成物と比べて減少した量のシアル酸が含まれる;(c)
−検出可能なNeuGcが含まれない
−検出可能なGalα1−3Galが含まれない
−項目2に記載のガラクトシル化パターンが含まれる
−項目2に記載のフコース含量を有する
−bisecGlcNAcが含まれる
−2−6 NeuNAcが含まれる
を有するタンパク質分子を含むタンパク質組成物が産生されるように選択される、項目1〜8の少なくとも1項に記載の方法。
(項目10)
以下のグループ1〜4:
(a)K562などの高いシアリル化活性を有する宿主細胞またはその誘導細胞株を含むグループ1;
(b)遺伝子欠失または発現抑制系のためシアリル化活性が低いか、または該活性がないNM−F9[DSM ACC2606]、NM−D4[DSM ACC2605]およびGT−2Xと同等の宿主細胞およびこれらを含む宿主細胞、またはその誘導細胞株を含むグループ2;
(c)NM−H9およびNM−H9D8などのK562よりも高いシアリル化度を有する宿主細胞またはその誘導細胞株を含むグループ3;
(d)NM−H9D8−E6およびNM−H9D8−E6Q12などのフコシル化活性が低いか、または該活性がない宿主細胞またはその誘導細胞株を含むグループ4
から選択される宿主細胞が使用される、項目1〜9の少なくとも1項に記載の方法。
(項目11)
宿主細胞が、ヒト骨髄性白血病起源のものであり、好ましくは、K562、NM−F9[DSM ACC2606]、NM−D4[DSM ACC2605]、GT-2X[DS
M ACC ]、NM−H9、NM−E−2F9、NM−C−2F5、NM−H9D8[DSM ACC 2806]、NM−H9D8−E6、NM−H9D8−E6Q12またはその誘導細胞もしくは誘導細胞株からなる群より選択される、項目1〜10の少なくとも1項に記載の方法。
(項目12)
葉酸代謝拮抗薬耐性DHFRバリアントをコードする核酸が宿主細胞内に導入される、項目1〜11の少なくとも1項に記載の方法。
(項目13)
上記葉酸代謝拮抗薬耐性DHFRバリアントをコードする核酸が、発現対象の上記タンパク質の少なくとも一部分をコードする核酸を含むベクターとは別の別個のベクターによって導入されるか、または発現対象の上記タンパク質の少なくとも一部分をコードする核酸と、該葉酸代謝拮抗薬耐性DHFRバリアントをコードする核酸とを少なくとも含むベクターが使用される、項目12に記載の方法。
(項目14)
宿主細胞が上記葉酸代謝拮抗薬とともに培養される、項目12または13に記載の方法。
(項目15)
発現対象の上記タンパク質分子の少なくとも一部分をコードする核酸配列を、培養液中の葉酸代謝拮抗薬濃度を段階的に上げることにより増幅する、項目12〜14の少なくとも1項に記載の方法。
(項目16)
以下の特徴:
(a)葉酸代謝拮抗薬がメトトレキサートである
(b)上記葉酸代謝拮抗薬耐性DHFRバリアントをコードする核酸が、配列番号1〜9の群、好ましくは配列番号1のポリペプチドをコードする
の少なくとも1つを満足す、項目12〜15の少なくとも1項に記載の方法。
(項目17)
上記タンパク質が抗体である、項目1〜16の少なくとも1項に記載の方法。
(項目18)
(a)ヒト骨髄性白血病起源の宿主細胞内に、抗体分子またはその少なくとも一部分をコードする少なくとも1つの核酸、および配列番号1〜配列番号9の群の少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列を含む少なくとも1つの核酸を導入すること;
(b)上記宿主細胞をメトトレキサートとともに培養することにより、上記抗体分子またはその少なくとも一部分をコードする核酸配列を増幅させること;
(c)上記抗体分子組成物の産生を許容する条件下で上記宿主細胞を培養すること;ならびに
(d)上記抗体分子組成物を単離すること
を含む、抗体分子組成物を産生させるための項目1〜17の少なくとも1項に記載の方法。
(項目19)
(a)ヒト骨髄性白血病起源の宿主細胞内に、抗体分子またはその少なくとも一部分をコードする少なくとも1つの核酸を導入すること;
(b)上記抗体分子組成物の産生を許容する条件下で上記宿主細胞を培養すること;ならびに
(c)増大した活性および/または増大した収率および/または改善された均一性を有する上記抗体分子組成物を単離すること
を含む、増大した活性および/または増大した収率および/または改善された均一性を有する抗体分子組成物を産生させるための項目1〜18の少なくとも1項に記載の方法。
(項目20)
(a)ヒト骨髄性白血病起源の宿主細胞内に、抗体分子またはその少なくとも一部分をコードする少なくとも1つの核酸、および配列番号1〜配列番号9の群の少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列を含む少なくとも1つの核酸を導入すること;
(b)上記宿主細胞をメトトレキサートとともに培養することにより、上記抗体分子またはその少なくとも一部分をコードする核酸配列を増幅させること;
(c)上記抗体分子組成物の産生を許容する条件下で上記宿主細胞を培養すること;ならびに
(d)増大した活性および/または増大した収率および/または改善された均一性を有する上記抗体分子組成物を単離すること
を含む、増大した活性および/または増大した収率および/または改善された均一性を有する抗体分子組成物を産生させるための項目1〜19の少なくとも1項に記載の方法。
(項目21)
宿主細胞を、以下の特徴的グリコシル化:
(i)検出可能なNeuGcが含まれない;および/または
(ii)該細胞において発現させたとき、上記タンパク質分子組成物中の諸タンパク質分子の糖鎖構造全体またはその諸タンパク質分子のうちのタンパク質1分子の特定の1つのグリコシル化部位の糖鎖構造においてGlcNAc結合ガラクトースのガラクトシル化度が、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離された同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物中の同じ量のタンパク質分子と比べて増大している;および/または
(iii)該細胞において発現させたとき、上記タンパク質分子組成物中の上記諸タンパク質分子の糖鎖構造全体またはその諸タンパク質分子のうちのタンパク質1分子の特定の1つのグリコシル化部位の糖鎖構造において、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離された同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物中の同じ量のタンパク質分子と比べて少なくとも5%多いG2構造量を有する;および/または
(iv)該細胞において発現させたとき、上記タンパク質分子組成物中の上記諸タンパク質分子の糖鎖構造全体またはその諸タンパク質分子のうちのタンパク質1分子の特定の1つのグリコシル化部位の糖鎖構造において、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離された同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物中の同じ量のタンパク質分子と比べて少なくとも5%少ないG0構造量を有する;および/または
(v)検出可能な末端Galα1−3Galを含まない;および/または
(vi)該細胞において発現させたとき、上記タンパク質分子組成物中の上記諸タンパク質分子の糖鎖構造全体またはその諸タンパク質分子のうちのタンパク質1分子の特定の1つのグリコシル化部位の糖鎖構造において、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離された同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物中の同じ量のタンパク質分子と比べて少なくとも5%少ないフコース量を含む;および/または
(vii)バイセクトGlcNAcを含有する少なくとも1つの糖鎖構造を含む;および/または
(viii)該細胞において発現させたとき、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離された同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物のシアリル化パターンと比べて改変されたシアリル化パターンを有する
の少なくとも1つを有するタンパク質組成物の産生に関して、
以下の工程
(a)相違するグリコシル化パターンをもたらす少なくとも2種類の異なる宿主細胞内に、タンパク質またはその少なくとも一部分をコードする少なくとも1つの核酸を導入すること;ここで、上記宿主細胞の少なくとも1種類は不死化ヒト血液細胞である、
(b)上記少なくとも2種類の異なる宿主細胞を培養すること、ここで、異なる各宿主細胞は、その他の宿主細胞によってもたらされるグリコシル化パターンと相違するグリコシル化パターンを有するタンパク質組成物を産生する;
(c)該少なくとも2種類の異なる宿主細胞と異なるグリコシル化パターンを有する上記発現されたタンパク質組成物を単離すること;および
(d)(i)〜(viii)に規定した特徴的グリコシル化の少なくとも1つを有するタンパク質組成物を産生する上記宿主細胞を選択すること
によって選択するための方法。
(項目22)
上記タンパク質組成物が、以下の特徴:
−抗体分子組成物である場合、細胞株CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させたときの同じ抗体分子の少なくとも1種類の抗体分子組成物のFc媒介性細胞性細胞傷害より少なくとも2倍大きいFc媒介性細胞性細胞傷害の増大を有する;
および/または
−抗体分子組成物である場合、細胞株CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させたときの同じ抗体分子の少なくとも1種類の抗体分子組成物の結合より少なくとも50%高い抗原媒介性またはFc媒介性結合の増大を有する;
および/または
−細胞株CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させたときの同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物の収率よりも少なくとも10%高い平均または最大収率の増大を有する、
の少なくとも1つを示す、項目21記載の方法。
(項目23)
ヒト骨髄性白血病起源の上記少なくとも2種類の異なる宿主細胞の少なくとも一方が、K562、NM−F9[DSM ACC2606]、NM−D4[DSM ACC2605]、GT-2X[DSM ACC ]、NM−H9、NM−E−2F9、NM−C−
2F5、NM−H9D8[DSM ACC 2806]、NM−H9D8−E6、NM−H9D8−E6Q12またはその誘導細胞もしくは誘導細胞株である、項目21または22に記載の方法。
(項目24)
該少なくとも2種類の異なる宿主細胞が、以下のグループ1〜4:
(a)K562などの高いシアリル化活性を有する宿主細胞またはその誘導細胞株を含むグループ1;
(b)遺伝子欠失のためシアリル化が低いか、またはシアリル化がないNM−F9[DSM ACC2606]、NM−D4[DSM ACC2605]およびGT−2Xなどの宿主細胞またはその誘導細胞株を含むグループ2;
(c)NM−H9およびNM−H9D8などのK562よりも高いシアリル化度を有する宿主細胞またはその誘導細胞株を含むグループ3;
(d)NM−H9D8−E6もしくはNM−H9D8−E6Q12などのフコシル化活性が低いか、または該活性がない宿主細胞またはその誘導細胞株を含むグループ4
から選択される、項目21または22に記載の方法。
(項目25)
項目2〜9に規定されたグリコシル化パターンを示すタンパク質組成物、好ましくは抗体組成物を産生する少なくとも1種類の宿主細胞が選択される、項目21〜24の少なくとも1項に記載の方法。
(項目26)
項目1〜20の少なくとも1項に記載の産生方法によって得られ得るタンパク質またはタンパク質分子組成物。
(項目27)
上記組成物が、以下の特徴:
(i)検出可能なNeuGcが含まれない;および/または
(ii)該細胞において発現させたとき、上記タンパク質分子組成物中の諸タンパク質分子の糖鎖構造全体またはその諸タンパク質分子のうちのタンパク質1分子の特定の1つのグリコシル化部位の糖鎖構造において、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離された同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物中の同じ量のタンパク質分子と比べて増大したGlcNAc結合ガラクトースのガラクトシル化度を有する;および/または
(iii)該細胞において発現させたとき、上記タンパク質分子組成物中の上記諸タンパク質分子の糖鎖構造全体またはその諸タンパク質分子のうちのタンパク質1分子の特定の1つのグリコシル化部位の糖鎖構造において、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離された同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物中の同じ量のタンパク質分子と比べて少なくとも5%多いG2構造量を有する;および/または
(iv)該細胞において発現させたとき、上記タンパク質分子組成物中の上記諸タンパク質分子の糖鎖構造全体またはその諸タンパク質分子のうちのタンパク質1分子の特定の1つのグリコシル化部位の糖鎖構造において、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離された同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物中の同じ量のタンパク質分子と比べて少なくとも5%少ないG0構造量を有する;および/または
(v)検出可能な末端Galα1−3Galを含まない;および/または
(vi)該細胞において発現させたとき、上記タンパク質分子組成物中の上記諸タンパク質分子の糖鎖構造全体またはその諸タンパク質分子のうちのタンパク質1分子の特定の1つのグリコシル化部位の糖鎖構造において、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離された同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物中の同じ量のタンパク質分子と比べて少なくとも5%少ないフコース量を含む;および/または
(vii)バイセクトGlcNAcを含有する少なくとも1つの糖鎖構造を含む;および/または
(viii)該細胞において発現させたとき、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離された同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物のシアリル化パターンと比べて改変されたシアリル化パターンを有する
の少なくとも1つを有する、項目26に記載のタンパク質またはタンパク質分子組成物。
(項目28)
該タンパク質分子組成物が、以下の特徴:
−α2−6結合NeuNAcを含む、および/または
−該細胞において発現させたとき、上記タンパク質分子組成物中の諸タンパク質分子の糖鎖構造全体またはその諸タンパク質分子のうちのタンパク質1分子の特定の1つのグリコシル化部位の糖鎖構造において、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離された同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物中の同じ量のタンパク質分子と比べて少なくとも15%多い量のNeuNAcによる増大したシアリル化度を有する、および/または
−該細胞において発現させたとき、上記タンパク質分子組成物中の諸タンパク質分子の糖鎖構造全体またはその諸タンパク質分子のうちのタンパク質1分子の特定の1つのグリコシル化部位の糖鎖構造において、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離された同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物の同じ量のタンパク質分子よりも少なくとも15%少ない量のNeuNAcによる、減少したシアリル化度を有するおよび/または
−該細胞において発現させたとき、上記タンパク質分子組成物中の諸タンパク質分子の糖鎖単位全体またはその諸タンパク質分子のうちのタンパク質1分子の特定のグリコシル化部位の少なくとも1つの特定の糖鎖に荷電N−グリコシド結合糖鎖が、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離された同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物中の同じ量のタンパク質分子と比べて少なくとも20%多く含まれる、および/または
−該細胞において発現させたとき、上記タンパク質分子組成物中の諸タンパク質分子の糖鎖単位全体またはその諸タンパク質分子のうちのタンパク質1分子の特定のグリコシル化部位の少なくとも1つの特定の糖鎖に荷電N−グリコシド結合糖鎖が、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離された同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物中の同じ量のタンパク質分子と比べて少なくとも20%少なく含まれる;および/または
−上記タンパク質分子組成物中の諸タンパク質分子の糖鎖単位全体またはその諸タンパク質分子のうちのタンパク質1分子の特定のグリコシル化部位の少なくとも1つの特定の糖鎖の少なくとも10%糖鎖構造が含まれ、フコースがない;および/または
−上記タンパク質分子組成物中の諸タンパク質分子の糖鎖単位全体またはその諸タンパク質分子のうちのタンパク質1分子の特定のグリコシル化部位の少なくとも1つの特定の糖鎖の少なくとも2%の糖鎖構造を含み、バイセクトGlcNAcを含有する;および/または
−上記タンパク質組成物中の諸タンパク質分子の糖鎖構造全体またはその諸タンパク質分子のうちのタンパク質1分子の特定の1つのグリコシル化部位の糖鎖構造において、35%より多くのG2構造が含まれる;および/または
−上記タンパク質組成物中の諸タンパク質分子の糖鎖構造全体またはその諸タンパク質分子のうちのタンパク質1分子の特定の1つのグリコシル化部位の糖鎖構造において、22%未満のG0構造が含まれる;および/または
−細胞株CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させたときの同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物と比べて増大した活性および/または増大した収率を有する;および/または
−細胞株CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させたときの同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物と比べて改善された均一性を有する;および/または
−細胞株CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させたときの同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物の収率よりも少なくとも10%高い平均または最大収率の増大を有する;および/または
−細胞株CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させたときの同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物の収率よりも少なくとも10%大きく増大した活性を有する;および/または
−細胞株CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させたとき、改善されたグリコシル化の均一性である改善された均一性を有し、ここで上記抗体分子組成物が、同じ抗体分子の少なくとも1種類の抗体分子組成物のシアリル化度よりも小さいシアリル化度を有する;および/または
−上記タンパク質分子が抗体分子である場合、細胞株CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させたときの同じ抗体分子の少なくとも1種類の抗体分子組成物のFc媒介性細胞性細胞傷害より少なくとも2倍大きいFc媒介性細胞性細胞傷害の増大を有する;および/または
−上記タンパク質分子が抗体分子である場合、細胞株CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させたときの同じ抗体分子の少なくとも1種類の抗体分子組成物の結合より少なくとも20%、好ましくは30%または50%高い抗原媒介性またはFc媒介性結合の増大を有する、
の少なくとも1つを有する、項目27に記載のタンパク質またはタンパク質分子組成物。
(項目29)
上記組成物が、MUC1エピトープに結合し、細胞外タンデム反復領域のアミノ酸配列DTRを含む少なくとも1つの抗体分子を含む、項目26〜28の少なくとも1項に記載のタンパク質またはタンパク質分子組成物。
(項目30)
上記抗体が、Tがグリコシル化されているアミノ酸配列DTRを含むTA−MUC1エピトープに結合する、項目29に記載のタンパク質またはタンパク質分子組成物。
(項目31)
上記抗体が該グリコシル化エピトープに、非グリコシル化エピトープよりも高い親和性で結合する、項目30に記載の抗体または抗体分子組成物。
(項目32)
上記抗体が、
−PankoMabと同じTA−MUC 1エピトープに競合的に結合する抗体PankoMabまたはそのバリアント;
−Panko1と同じTA−MUC 1エピトープに競合的に結合する抗体Panko1またはそのバリアント;
−Panko2と同じTA−MUC 1エピトープに競合的に結合する抗体Panko2またはそのバリアント
から選択される、項目30または31に記載の抗体または抗体分子組成物。
(項目33)
上記抗体が、以下の特徴的グリコシル化:
(a)該細胞において発現させたとき、上記抗体分子組成物の諸抗体分子の糖鎖構造全体またはその諸抗体分子のうちの抗体1分子の特定の1つのグリコシル化部位の糖鎖構造において、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離された同じ抗体分子の少なくとも1種類の抗体分子組成物の同じ量の抗体分子よりも少なくとも15%多い量のN−アセチルノイラミン酸による増大したシアリル化度を有する;
(b)該細胞において発現させたとき、上記抗体分子組成物の諸抗体分子の糖鎖構造全体またはその諸抗体分子のうちの抗体1分子の特定の1つのグリコシル化部位の糖鎖構造において、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離された同じ抗体分子の少なくとも1種類の抗体分子組成物の同じ量の抗体分子よりも少なくとも5%多い量のG2構造による高いガラクトシル化度を有する;
(c)bisecGlcNAcが含まれる、
の少なくとも1つを有する、項目26〜32のうちの1項、特に項目32に記載の抗体または抗体分子組成物。
(項目34)
グリコシル化パターンにより、以下の活性パターン:
(a)CHO細胞において発現させた同じ抗体の活性よりも15%超高いCDC活性;
(b)検出可能なシアリル化がないか、または低い程度で有する抗体と比べて2倍長くなった血清半減期;
(c)細胞株CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させたときの同じ抗体分子の少なくとも1種類の抗体分子組成物のFc媒介性細胞性細胞傷害より少なくとも2倍大きいFc媒介性細胞性細胞傷害の増大を有する、
がもたらされる、項目26〜33のうちの1項、特に項目33に記載の抗体または抗体分子組成物。
(項目35)
上記抗体が、以下の:
(a)
(i)細胞株CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させた同じ抗体分子の抗体分子組成物の活性よりも少なくとも2〜4倍高く増大したADCC活性;および/または
(ii)細胞株CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させた同じ抗体分子の抗体分子組成物の活性よりも少なくとも2倍高く増大したCDC活性;および/または
(iii)細胞株CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させた同じ抗体分子の抗体分子組成物の活性よりも少なくとも20%、好ましくは30%または40%高い高抗原結合活性;および/または
(iv)該細胞において発現させたとき、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離された同じ抗体分子の少なくとも1種類の抗体分子組成物の同じ量の抗体分子と比べて少なくとも50%多い、上記抗体分子組成物の上記諸抗体分子の糖鎖構造全体またはその諸抗体分子のうちの抗体1分子の特定の1つのグリコシル化部位の糖鎖構造におけるG2構造の量;および/または
(v)該細胞において発現させたとき、上記抗体分子組成物の上記諸抗体分子の糖鎖構造全体またはその諸抗体分子のうちのタンパク質1分子の特定の1つのグリコシル化部位の糖鎖構造において、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離された同じ抗体分子の少なくとも1種類の抗体分子組成物の同じ量の抗体分子と比べて少なくとも20%多いバイセクトGlcNAc構造の量
を有するPankoMab抗体またはそのバリアント、
ここで、該細胞において発現させたとき、上記PankoMab分子組成物は、宿主細胞NM−F9において産生させることにより、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離されたPankoMab分子組成物と比べて高収率で得られ得る;
(b)
(i)細胞株CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させた同じ抗体分子の抗体分子組成物の活性よりも少なくとも3倍高く増大したADCC活性;および/または
(ii)細胞株CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させた同じ抗体分子の抗体分子組成物の活性よりも少なくとも20%、好ましくは30%または40%高く増大したCDC活性;および/または
(iii)検出可能な2−6 NeuNAcおよび/または
(iv)該細胞において発現させたとき、NM−F9から単離された同じ抗体分子の抗体分子組成物と比べて少なくとも1.5倍長くなった血清半減期;および/または
(v)該細胞において発現させたとき、上記抗体分子組成物の上記諸抗体分子の糖鎖構造全体またはその上記諸抗体分子のうちの抗体1分子の特定の1つのグリコシル化部位の糖鎖構造における、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離された同じ抗体分子の少なくとも1種類の抗体分子組成物の同じ量の抗体分子と比べて少なくとも50%多いG2構造の量;および/または
(vi)該細胞において発現させたとき、上記抗体分子組成物の上記諸抗体分子の糖鎖構造全体またはその諸抗体分子のうちのタンパク質1分子の特定の1つのグリコシル化部位の糖鎖構造において、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離された同じ抗体分子の少なくとも1種類の抗体分子組成物の同じ量の抗体分子と比べて少なくとも20%多いバイセクトGlcNAc構造の量;
を有するPankoMab抗体またはそのバリアント、
ここで、該細胞において発現させたとき、上記PankoMab分子組成物は、宿主細胞NM−H9D8において産生させることにより、該細胞において発現させたときCHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離されたPankoMab分子組成物と比べて高収率で得られ得る;
(c)
(i)細胞株CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させた同じ抗体分子の抗体分子組成物の活性よりも少なくとも4倍高く増大したADCC活性;および/または
(ii)検出可能な2−6 NeuNAcおよび/または
(iii)細胞株CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させた同じ抗体分子の抗体分子組成物の活性よりも少なくとも30%、好ましくは40%または50%高い高抗原結合活性
を有するPanko2抗体またはそのバリアント、
ここで、上記Panko2分子組成物は、宿主細胞NM−H9D8において産生させることにより得られ得る;
(d)
(i)細胞株CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させた同じ抗体分子の抗体分子組成物の活性よりも少なくとも4倍高く増大したADCC活性;および/または
(ii)細胞株CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させた同じ抗体分子の抗体分子組成物の活性よりも少なくとも30%、好ましくは40%または50%高い高抗原結合活性
を有するPanko2抗体またはそのバリアント、
ここで、上記Panko2分子組成物は、宿主細胞GT−2xにおいて産生させることにより得られ得る;
(e)
(i)細胞株CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させた同じ抗体分子の抗体分子組成物の活性よりも少なくとも8倍高く増大したADCC活性;および/または
(ii)該細胞において発現させたとき、上記抗体分子組成物の上記諸抗体分子の糖鎖構造全体またはその諸抗体分子のうちの抗体1分子の特定の1つのグリコシル化部位の糖鎖構造における、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離された同じ抗体分子の少なくとも1種類の抗体分子組成物の同じ量の抗体分子と比べて少なくとも50%多いG2構造の量;および/または
(iii)該細胞において発現させたとき、上記抗体分子組成物の上記諸抗体分子の糖鎖構造全体またはその諸抗体分子のうちの抗体1分子の特定の1つのグリコシル化部位の糖鎖構造における、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離された同じ抗体分子の少なくとも1種類の抗体分子組成物の同じ量の抗体分子と比べて少なくとも70%多い高量の非フコシル化構造
を有するPanko1抗体またはそのバリアント、
ここで、上記Panko1分子組成物は、宿主細胞NM−H9D8−E6において産生させることにより得られ得る;
(f)
(i)細胞株CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させた同じ抗体分子の抗体分子組成物の活性よりも少なくとも50%高く増大したADCC活性;および/または
(ii)該細胞において発現させたとき、上記抗体分子組成物の上記諸抗体分子の糖鎖構造全体またはその諸抗体分子のうちの抗体1分子の特定の1つのグリコシル化部位の糖鎖構造における、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離された同じ抗体分子の少なくとも1種類の抗体分子組成物の同じ量の抗体分子と比べて少なくとも50%多いG2構造の量;および/または
(iii)該細胞において発現させたとき、上記抗体分子組成物の上記諸抗体分子の糖鎖構造全体またはその諸抗体分子のうちの抗体1分子の特定の1つのグリコシル化部位の糖鎖構造における、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離された同じ抗体分子の少なくとも1種類の抗体分子組成物の同じ量の抗体分子と比べて少なくとも50%多い高量の非フコシル化構造
を有するPanko1抗体またはそのバリアント、
ここで、上記Panko1分子組成物は、宿主細胞NM−H9D8において産生させることにより得られ得る、
からなる群より選択される、項目29〜34の少なくとも1項に記載の抗体または抗体分子組成物。
(項目36)
抗体セツキシマブまたはセツキシマブと同じエピトープに結合するそのバリアントである、項目26〜34の少なくとも1項に記載の抗体。
(項目37)
上記タンパク質がFSHである、項目26〜30の少なくとも1項に記載のタンパク質。
(項目38)
上記FSHが、検出可能な2−6結合NeuNAcを含む、項目37に記載のタンパク質。
(項目39)
適切な発現ベクター内にタンパク質分子またはその少なくとも一部分をコードする少なくとも1つの核酸を含む、項目26〜38の少なくとも1項に記載のタンパク質、特に抗体組成物を産生させるための不死化ヒト血液細胞、好ましくはヒト骨髄性白血病起源の宿主細胞。
(項目40)
タンパク質分子またはその少なくとも一部分をコードする少なくとも1つの核酸、および配列番号1〜配列番号9の群の少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列を含む少なくとも1つの核酸を含む、項目39に記載の宿主細胞。
(項目41)
宿主細胞が、タンパク質分子またはその少なくとも一部分をコードする少なくとも1つの核酸、および配列番号1〜配列番号9の群の少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列を含む少なくとも1つの核酸を含む、K562、NM−F9[DSM ACC2606]、NM−D4[DSM ACC2605]、NM−H9、H9、NM−H10、NM−E−2F9、NM−C−2F5、NM−H9D8、もしくはNM−H9D8−E6、または上記宿主細胞のいずれかに由来する細胞もしくは細胞株である、項目39または36に記載の宿主細胞。
(項目42)
項目41または42の少なくとも1つの核酸(を含む、項目39〜41の少なくとも1項に記載の宿主細胞。
(項目43)
コードされた抗体分子が、項目31〜36に記載の抗体である、項目39〜42いずれかに記載の宿主細胞。
(項目44)
コードされた抗体分子がキメラまたはヒト化抗体、特に、PankoMab、Panko1、Panko2もしくはセツキシマブ、または同じエピトープに結合するそのバリアントである、項目39〜43いずれかに記載の宿主細胞。
(項目45)
無血清条件下で培養して該抗体分子組成物を産生させる、項目39〜44いずれかに記載の宿主細胞。
(項目46)
(a)タンパク質分子またはその少なくとも一部分をコードする配列、および
(b)配列番号1〜配列番号9の群の配列をコードする少なくとも1つの配列
を含む核酸。
(項目47)
(a)タンパク質分子またはその少なくとも一部分をコードする配列、および
(b)配列番号1の群の配列をコードする少なくとも1つの配列
を含む核酸。
(a)K562などの高いシアリル化活性を有する宿主細胞を含むグループ1;
(b)遺伝子欠失または発現阻害手段(例えば、RNAi)のためシアリル化が低いか、またはシアリル化がなく、NM−F9[DSM ACC2606]、NM−D4[DSM ACC2605]およびGTX−2と同等の活性を有する宿主細胞ならびにNM−F9[DSM ACC2606]、NM−D4[DSM ACC2605]およびGTX−2を含むグループ2;
(c)NM−H9およびNM−H9D8などのK562よりも高いシアリル化度を有する宿主細胞を含むグループ3;
(d)NM−H9D8−E6およびNM H9D8−E6Q12などのフコシル化活性が低いか、または該活性がない宿主細胞を含むグループ4から選択される不死化ヒト血液細胞が宿主細胞として使用される。
(a)ヒト骨髄性白血病起源の宿主細胞内に、タンパク質、好ましくは抗体分子またはその少なくとも一部分をコードする少なくとも1つの核酸、および配列番号1〜配列番号9の群のポリペプチドの少なくとも1つ、好ましくは配列番号1のポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列を含む少なくとも1つの核酸を導入すること;
(b)前記タンパク質、好ましくは抗体分子またはその少なくとも一部分をコードする核酸配列を、前記宿主細胞をメトトレキサートとともに培養することにより、好ましくは、前記宿主細胞をメトトレキサートとともに連続して少なくとも2回培養することにより増幅させること、このとき、メトトレキサートの濃度は、連続する各回において、好ましくは少なくとも約50%、より好ましくは少なくとも約100%増加する;
(c)前記宿主細胞を前記タンパク質、好ましくは抗体分子組成物の産生を許容する条件下で培養すること、および
(d)好ましくは抗体分子組成物である前記タンパク質を単離すること
を含む、タンパク質、好ましくは抗体分子組成物を産生させる方法を提供する。
(a)ヒト骨髄性白血病起源の宿主細胞内に、タンパク質、好ましくは抗体分子またはその少なくとも一部分をコードする少なくとも1つの核酸導入すること;
(b)前記宿主細胞を、好ましくは抗体分子組成物である前記タンパク質組成物の産生を許容する条件下で培養すること;および
(c)増大した活性および/または増大した収率および/または改善された均一性を有する好ましくは抗体分子組成物である前記タンパク質組成物を単離すること
を含む、増大した活性および/または増大した収率および/または改善された均一性を有するタンパク質組成物、好ましくは抗体分子組成物を産生させる方法を提供する。
(a)ヒト骨髄性白血病起源の宿主細胞内に、タンパク質、好ましくは抗体分子またはその少なくとも一部分をコードする少なくとも1つの核酸、および配列番号1〜配列番号9の群のポリペプチドの少なくとも1つ、好ましくは配列番号1のポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列を含む少なくとも1つの核酸を導入すること;
(b)前記宿主細胞をメトトレキサートとともに培養することにより、好ましくは、前記宿主細胞をメトトレキサートとともに連続して少なくとも2回培養することにより、前記抗体分子またはその少なくとも一部分をコードする核酸配列を増幅させること、このとき、メトトレキサートの濃度は、連続する各回において、好ましくは少なくとも約50%、より好ましくは少なくとも約100%増加する;
(c)前記宿主細胞を、好ましくは抗体分子組成物である前記タンパク質組成物の産生を許容する条件下で培養すること;および
(d)増大した活性および/または増大した収率および/または改善された均一性を有する好ましくは抗体分子組成物である前記タンパク質組成物を単離すること
を含む、増大した活性および/または増大した収率および/または改善された均一性を有するタンパク質組成物、好ましくは抗体分子組成物を産生させる方法を提供する。
(i)検出可能なNeuGcが含まれない;および/または
(ii)該細胞において発現させたとき、前記タンパク質分子組成物中の諸タンパク質分子の糖鎖構造全体またはその諸タンパク質分子のうちのタンパク質1分子の特定の1つのグリコシル化部位の糖鎖構造において、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離された同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物中の同じ量のタンパク質分子と比べて増大したガラクトシル化度を有する;および/または
(iii)該細胞において発現させたとき、前記タンパク質分子組成物中の前記諸タンパク質分子の糖鎖構造全体またはその諸タンパク質分子のうちのタンパク質1分子の特定の1つのグリコシル化部位の糖鎖構造において、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離された同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物中の同じ量のタンパク質分子と比べて少なくとも5%多いG2構造量を有する;および/または
(iv)該細胞において発現させたとき、前記タンパク質分子組成物中の前記諸タンパク質分子の糖鎖構造全体またはその諸タンパク質分子のうちのタンパク質1分子の特定の1つのグリコシル化部位の糖鎖構造において、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離された同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物中の同じ量のタンパク質分子と比べて少なくとも5%少ないG0構造量を有する;および/または
(v)検出可能な末端Galα1−3Galを含まない;および/または
(vi)該細胞において発現させたとき、前記タンパク質分子組成物中の前記諸タンパク質分子の糖鎖構造全体またはその諸タンパク質分子のうちのタンパク質1分子の特定の1つのグリコシル化部位の糖鎖構造において、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離された同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物中の同じ量のタンパク質分子と比べて少なくとも5%少ないフコース量を含む;および/または
(vii)バイセクトGlcNAcを含有する少なくとも1つの糖鎖構造を含む;および/または
(viii)該細胞において発現させたとき、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離された同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物のシアリル化パターンと比べて改変されたシアリル化パターンを有する、
の少なくとも1つを有するタンパク質の産生に関して、
以下の工程:
(a)宿主細胞として少なくとも2種類の異なる不死化ヒト血液細胞内に、タンパク質またはその少なくとも一部分をコードする少なくとも1つの核酸を導入すること;
(b)前記少なくとも2種類の異なる宿主細胞を培養すること、ここで、異なる各宿主細胞は、その他の宿主細胞によってもたらされるグリコシル化パターンと相違するグリコシル化パターンを有するタンパク質組成物を産生する;
(c)該少なくとも2種類の異なる宿主細胞と異なるグリコシル化パターンを有する前記発現されたタンパク質組成物を単離すること;および
(d)(i)〜(viii)に規定した特徴的グリコシル化の少なくとも1つを有するタンパク質組成物を産生する前記宿主細胞を選択すること
によって選択するための方法を提供する。
(a)細胞株CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させたとき、抗体分子組成物である場合、同じ抗体分子の少なくとも1種類の抗体分子組成物のFc媒介性細胞性細胞傷害より少なくとも2倍大きいFc媒介性細胞性細胞傷害の増大を有する;
および/または
(b)細胞株CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させたとき、抗体分子組成物である場合、同じ抗体分子の少なくとも1種類の抗体分子組成物の結合より少なくとも50%高い抗原媒介性またはFc媒介性結合の増大を有する;および/または
(c)細胞株CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させたときの同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物の収率よりも少なくとも10%高い平均または最大収率の増大を有する、
の少なくとも1つを示す。
(a)K562などの高いシアリル化活性を有する宿主細胞またはその誘導細胞もしくは誘導細胞株を含むグループ1、
(b)NM−F9[DSM ACC2606]、NM−D4[DSM ACC2605]およびGTX−2などの、遺伝子欠失または発現抑制手段(例えば、RNAi)のためシアリル化が低いか、またはシアリル化がない宿主細胞またはその誘導細胞もしくは誘導細胞株を含むグループ2、
(c)NM−H9およびNM−H9D8などのK562よりも高いシアリル化度を有する宿主細胞またはその誘導細胞もしくは誘導細胞株を含むグループ3、
(d)NM−H9D8−E6などのフコシル化活性が低いか、または該活性がない宿主細胞またはその誘導細胞もしくは誘導細胞株を含むグループ4
のうちの1つから選択され得る。
(a)本明細書の他の箇所に記載したタンパク質、好ましくは抗体分子またはその少なくとも一部分をコードする配列、および
(b)配列番号1〜配列番号9の群の配列をコードする少なくとも1つの配列
を含む核酸を提供する。
(a)本明細書の他の箇所に記載したタンパク質、好ましくは抗体分子またはその少なくとも一部分をコードする配列、および
(b)配列番号1をコードする配列
を含む。
antibody.Danielczykら]、好ましくは、PankoMabとすべてのヒト定常ドメインとのキメラ形態、より好ましくはヒト化PankoMabである上記の宿主細胞を提供する。
供する。
)、例えば、M−CSF、GM−CSFおよびG−CSF;インターロイキン(IL)、例えば、IL−1〜IL−12;スーパーオキシドジスムターゼ;T細胞受容体;表面膜タンパク質;分解促進因子;抗体およびイムノアドヘシン;グリコホリンA;MUC1の群の任意のタンパク質分子に由来するものである。
−少なくともアミノ酸配列PDTRPを含むエピトープに結合する;
−Gal−NacαでPDTRP配列がグリコシル化されている場合、1,5TRを含む30アミノ酸の短鎖MUCペプチドに結合するが、同ペプチドがグリコシル化されていない場合は、結合しない;
−25超、好ましくは28(最も好ましくは、29,5の比)の長さ付加効果を示す;
−造血系細胞に対して低結合性を示すか、または示さないことすらある(検出法に関しては、Danielczykら2006(引用により本明細書に組み込まれる)を参照されたい);
−Scatchardプロット解析で測定したときほぼ少なくともKass=0.2〜1×109M−1の範囲の腫瘍細胞に対して高親和性を有する
の少なくとも1つを有する。
(i)該細胞において発現させたとき、前記抗体分子組成物の諸抗体分子の糖鎖構造全体またはその諸抗体分子のうちの抗体1分子の特定の1つのグリコシル化部位の糖鎖構造において、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離された同じ抗体分子の少なくとも1種類の抗体分子組成物の同じ量の抗体分子よりも少なくとも15%多い量のN−アセチルノイラミン酸による増大したシアリル化度を有する;
(ii)該細胞において発現させたとき、前記抗体分子組成物の諸抗体分子の糖鎖構造全体またはその諸抗体分子のうちの抗体1分子の特定の1つのグリコシル化部位の糖鎖構造において、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離された同じ抗体分子の少なくとも1種類の抗体分子組成物の同じ量の抗体分子よりも少なくとも5%多い量のG2構造による高ガラクトシル化度を有する;
(iii)検出可能な量のbisecGlcNAcを含む;
(iv)ハイブリッド型または高次マンノース構造を含まないか、または2%未満で有する
の少なくとも1つの特徴的グリコシル化を有する。
(i)CHO細胞において発現させた同じ抗体の活性よりも15%超高いCDC活性;
(ii)検出可能なシアリル化のない抗体と比べて2倍(1.5倍超)長くなった血清半減期;
(iii)細胞株CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させたときの同じ抗体分子の少なくとも1種類の抗体分子組成物のFc媒介性細胞性細胞傷害より少なくとも2倍大きいFc媒介性細胞性細胞傷害の増大を有する、
の驚くべき有益な活性パターンがもたらされる。
細胞内でのfut8発現の解析
RNAを、NM−F9[DSM ACC2606]、NM−D4[DSM ACC2605]、NM−H9、K562、NM−H9D8[DSM ACC2806]、GT−2x[DSM ACC ]およびHepG2(対照)細胞から、標準的な手順(RNeasy−Mini−Kit、Qiagen)に従って抽出した。mRNAを、磁気ビーズ手法を使用し、製造業者の使用説明書(HDynabeads(登録商標)Oligo(dT)25H、Invitrogen)に従って単離した。第1鎖PPcDNA合成には、各試料の50μlのビーズ懸濁液とOmniscript Reverse Transcriptase(Qiagen)を製造業者の使用説明書に従って使用した。その後のPPRT-PCR反応には、5μlのcDNA生成物PPと特異的fut8プライマー
を使用し、212bp断片を得た。対照として、アクチン特異的プライマーを使用すると、240bp断片が得られた。得られたPCR産物(1つまたは複数)PPを1.5%ゲル上で解析した。
K562細胞の糖鎖操作
K562細胞の糖鎖操作ならびにNM−D4およびNM−F9細胞株の作製は、EP1654353に記載されている。
Coulter)を使用し、定量的解析を行なった。
K562、NM−F9、NM−D4、NM−H9、NM−E−2F9、NM−C−2F5、NM−H9D8、NM−H9D8−E6、NM−H9D8−E6Q12、およびGT−2x細胞株とCHOdhfr−細胞の培養ならびに無血清細胞株の作製
K562、NM−F9、NM−D4、NM−H9、NM−E−2F9、NM−C−2F5、NM−H9D8[DSM ACC2806]、NM−H9D8−E6[DSM ACC2807]、NM−H9D8−E6Q12[DSM ACC2856]、またはGT−2x[DSM ACC ]を、10%FCSおよび2mMのグルタミンを補給したRPMI 1640中または無血清のX−Vivo 20培地で培養し、8%の加湿雰囲気中、37℃で増殖させた。
真核生物細胞においてキメラ抗体PankoMab、Panko1、Panko2、またはセツキシマブを発現させるためのベクターのクローニング
PankoMabの可変配列を、PankoMab[HCancer Immunol
Immunother.H 2006 Nov;55(11):1337−47.Epub 2006 Feb.PankoMab:a potent new generation anti−tumor MUC1 antibody.Danielczykら]を産生するマウスハイブリドーマ細胞由来の特異的プライマーを用いてPCR増幅した。
EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRSKANNHATYYAESVKGRFTISRDVSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTRGGYGFDYWGQGTTLTVS
Panko1の可変軽鎖:
DIVLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGDGTKLELKR
Panko2の可変重鎖:
EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYTTHYAESVKGRFTISRDDSKSSVSLQMNNLRVEDTGIYYCTRHYYFDYWGQGTTLTVS
Panko2の可変軽鎖:
DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYFFWYLQKPGLSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPPTFGGGTKLEIKR
セツキシマブのVHおよびVLの可変アミノ酸配列を、http://redpoll.pharmacy.ualberta.ca/drugbank/cgi−bin/getCard.cgi?CARD=BTD00071.txtから入手し、VectorNTIを使用することにより、cDNAコード配列に逆翻訳した。
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYN
TPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVS
セツキシマブの可変軽鎖:
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPS
RFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKR
該cDNA配列を、VLの場合はNcoI/NheIによって、VHの場合はNcoI/SalIによって伸張してcDNAを作製した。NcoI/XhoI切断可変重鎖断片VHを、WO2004/065423に記載のNcoI/SalI切断BS−リーダーベクター内にクローニングした。BS−リーダーベクターは、T細胞受容体シグナルペプチド配列を該可変ドメインの5’末端に、およびスプライスドナー配列を3’末端に導入するためのクローニングカセットを含む。対応する抗体の可変軽鎖VLは、3’末端にさらにスプライスドナー部位をコードする特異的プライマーを用いて増幅し、NcoI/NheIにより、同様の消化BS−リーダーベクター内にクローニングした。その後、BS−リーダーベクターの各HindIII/BamHI断片を、対応する真核生物の発現ベクター内にクローニングした。このようなベクター(pEFpuroCγ1VBHB、pEFdhfrCκVBLB、pEFdhfrBmutBCκVBLB)は、EF−1αプロモーターとHCMVエンハンサー、SV40起点、ポリアデニル化シグナル、プロマイシン耐性遺伝子を重鎖用のベクター内に、CHO細胞発現のためのマウスジヒドロホラーゼ(dihydrofolase)遺伝子(dhfr)、またはK562、NM−F9[DSM ACC2606]、NM−D4[DSM ACC2605]、NM−H9、NM−E−2F9、NM−C−2F5、NM−H9D8[DSM ACC2806]、NM−H9D8−E6[DSM ACC2807]、NM−H9D8−E6Q12[DSM ACC2856]、もしくはGT−2x[DSM ACC ]発現のための配列番号1(配列1#)を、選択と遺伝子増幅のために軽鎖用ベクター内に、ならびに重鎖用ではヒト定常γ1領域のゲノム配列、または軽鎖用ではヒト定常κ領域を含む(ヒトゲノムDNAからの増幅のためのプライマーおよびベクターマップはWO2004/065423を参照のこと)。
キメラ抗体PankoMab、Panko1、Panko2、またはセツキシマブを発現させるための真核生物細胞のトランスフェクション、ならびに血清の存在下で高産生の細胞クローンを作製するための遺伝子増幅手順
該キメラ抗体をNM−F9[DSM ACC2606]またはCHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させるため、細胞を、重鎖および軽鎖用の上記のベクター(1:1〜1:3)の混合物で、DMRIE−Cを用いたリポフェクションによって、またはNM−F9とリポフェクタミンの懸濁細胞ではエレクトロポレーション、または付着細胞株CHOdhfr−ではエレクトロポレーションによってコトランスフェクトした。トランスフェクションの2日後、増殖培地を選択培地(NM−F9は、RPMI 1640+10%FCS+2mM L−グルタミン+0.75μg/mlプロマイシン+50nMメトトレキサート中;CHOdhfr−は、DMEM+10%透析FCS+2mM L−グルタミン+5μg/mlプロマイシン+50mMメトトレキサート)に1週間交換した。最初の増幅は、メトトレキサート濃度を100nMに上げることにより、さらに2週間行なった。増幅細胞集団の一部を、プロマイシンおよびメトトレキサート無添加の培地中で単一細胞クローニングし、残りの細胞は、メトトレキサート濃度を上げることにより新たな回の遺伝子増幅に供した。このようにして、4〜6回の遺伝子増幅(100、200、500、1000、2000、3000nMメトトレキサート)を行なった。さらに、クローンスクリーニングおよび解析によって特定された最良の産生クローンを、同様にしてさらに増幅した。
比産生速度(SPR)および倍加時間(g)の測定
各クローンについて、2×10P4P細胞/ウェルを24ウェル組織培養プレートの500μlの増殖培地中に播種した。細胞を3日間培養し、ならし培地を回収して解析し、必要に応じてAccutaseによって細胞を取り出し、計数した。特異的抗体価を培地試料からELISAによって定量的に測定した。アッセイプレートをヒトκ鎖特異的抗体(BD)でコートした。結合された組換え抗体を、抗ヒトIgG(H+L)ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲート(Jackson Immunoresearch Laboratories)により検出した。定量では、精製組換えキメラ抗体を標品として使用した。
g=log2×(培養時間)/log(最終細胞数/最初の細胞数)
によって計算した。
細胞株の平均収率および最大収率の測定
上記の限界希釈(0.5細胞/ウェル)を用いた96ウェルプレート内での単一細胞クローニング後、理論的に200個の平板培養単一クローンから、増殖中の細胞クローンのSPRを測定し、種々の細胞株および種々の条件での平均および偏差ならびに最大収率を求めた。表1では、血清含有条件下で生成されたCHOdhfr−とNM−F9のキメラPankoMab産生細胞クローンのデータを比較している。
抗体分子組成物を産生する無血清高収率細胞クローンの作製
無血清培地X−Vivo 20に適応させたNM−H9D8、NM−H9D8−E6、NM−H9D8−E6Q12、またはGT−2xのトランスフェクションを、無血清条件下、DMRIE−Cまたはエレクトロポレーション(Nucleofector,Amaxa)を用いて行なった。トランスフェクションの2日後、増殖培地を選択培地(X−Vivo 20+0.75μg/mlプロマイシン+50nMメトトレキサート)に1週間交換した。最初の増幅は、メトトレキサート濃度を100nMに上げることにより、さらに2週間行なった。増幅細胞集団の一部を、プロマイシンおよびメトトレキサート無添加のX−Vivo中で単一細胞クローニングし、残りの細胞は、メトトレキサート濃度を上げることにより新たな回の遺伝子増幅に供した。このようにして、4〜6回の遺伝子増幅(100、200、500、1000、2000、3000nMメトトレキサート)を行なった。さらに、クローンスクリーニングおよび解析によって特定された最良の産生クローンを、同様にしてさらに増幅した。限界希釈(0.5細胞/ウェル)を用いた96ウェルプレート内での単一細胞クローニング後、プレートを2〜3週間培養し、増殖中の細胞クローンを顕微鏡により解析し、クローニング効率を%で(増殖中の細胞クローンの入ったウェルの数×100/播種細胞の理論数)調べた。血清の存在下でのNM−F9懸濁細胞と同じ手順(上記参照)を使用し、増殖中のクローンを産生能に関してスクリーニングした。
細胞クローンの平均収率および最大収率の測定
上記の限界希釈(0.5細胞/ウェル)を用いた96ウェルプレート内での単一細胞クローニング後、理論的に200個の平板培養単一クローンから、増殖中の細胞クローンのSPRを測定し、異なる条件での平均および偏差ならびに最大収率を求めた。表2は、完全に無血清条件下で生成されたNM−H9D8[DSM ACC2806]のキメラPankoMab産生細胞クローンのデータを示す。
抗体分子組成物の単離
本発明による抗体分子組成物の産生および単離のため、キメラ抗体PankoMab、Panko1、Panko2、またはセツキシマブを分泌する安定にトランスフェクトされた細胞を、細胞密度が約1〜2×10P6P細胞/mlに達するまで無血清培地中で培養した。遠心分離(400×g、15分間)によって細胞培養上清みから細胞を除去した後、キメラ抗体を、プロテインAカラム(HiTrap r−protein AFF、Amersham Pharmacia Biotech)を用いて精製した。急速pH変化によって溶出された精製抗体画分をPBS中で再緩衝化し、Centriprep遠心チューブ(50kDa排除、Millipore)を用いて濃縮した。
本発明による抗体分子組成物のFc媒介性細胞性細胞傷害の測定
エフェクター細胞としての献血者からのPBMCの単離
PBMCを健常ドナーの血液から、Ficoll−Hypaque(Biochrom)を用いた密度遠心分離によって単離した。細胞を、5%FCS補給RPMI 1640で3回洗浄し、5×107細胞の個々のバッチで低温保存した。PBMCを解凍し、フローサイトメトリーにおいて、または細胞傷害アッセイのエフェクター細胞として直接使用するか、または使用前に10%FCSを補給したRPMI 1640(RPMI/FCS)中に一晩維持した。
インビトロモデルでの抗体依存性細胞性細胞傷害の検出
本発明による組換え抗体の抗体依存性細胞性細胞傷害(ADCC)を、ユーロピウム放出アッセイにおいて調べた。標的細胞(ZR−75−1、5×106)を6分間氷上にて、800μlのユーロピウムバッファー(50mMのHEPES、pH7.4、93mM
NaCl、5mM KCl、2mM MgCl2、10mMジエチレントリアミン五酢酸、2mM酢酸ユーロピウム(III))中でインキュベートし、Multiporator(eppendorf)においてエレクトロポレーションし(710V、1パルス、30μs)、続いて、氷上でさらに6分間インキュベートした。その後、細胞をRPMI
1640/5%FCS中で5回洗浄し、96ウェル丸底プレート内に播種した(Nunc;100μl中1×104細胞/ウェル)。種々の濃度(200μlのインキュベーション容量中0.5〜25μg/ml終濃度)の20μlの組換え抗体または対応する対照(培地、アイソタイプ対照ヒトIgG)の添加後、ヒト末梢血細胞(80μl/ウェル)を、エフェクター細胞としてエフェクター/標的細胞比50:1を用いて添加した。エフェクター細胞を含まない80μlのRPMI/FCSを添加し、自発放出を測定した。標的細胞をエタノールで完全に溶解させた後、最大放出を測定した。インキュベータ内で37℃にて4時間インキュベーション後、プレートを500×gで5分間遠心分離し、25μlの各試料を200μlの増強溶液(Perkin−Elmer Wallac)/ウェルにピペッティングした。室温で15分間のインキュベーション後、蛍光を測定した(VictorP2P Fluorometer、Perkin−Elmer Wallac)。特異的細胞傷害は、等式(実験溶解-自発溶解)/(最大溶解-自発溶解)*100から得られる。
A−011を用いたNucleofector II(Amaxa)においてエレクトロポレーションし、続いて、氷上でさらに6分間インキュベートした。その後、細胞をRPMI 1640/5%FCS中で4回洗浄し、96ウェル丸底プレート内に播種した(Nunc;100μl中5〜10×103細胞/ウェル)。種々の濃度(セツキシマブでは、200μlのインキュベーション容量中0.001〜100ng/ml終濃度;キメラPankoMab、Panko1、またはPanko2では、0.16〜5μg/ml)の20μlの組換え抗体または対応する対照(培地、アイソタイプ対照ヒトIgG)の添加後、ヒト末梢血細胞(80μl/ウェル)を、エフェクター細胞としてエフェクター/標的細胞比100:1〜50:1を用いて添加した。エフェクター細胞を含まない80μlのRPMI/FCSを添加し、自発放出を測定した。標的細胞を%Triton X−100で完全に溶解させた後、最大放出を測定した。インキュベータ内で37℃にて4時間または一晩インキュベーション後、プレートを500×gで5分間遠心分離し、25μlの各試料を200μlの増強溶液(Perkin−Elmer Wallac)/ウェルにピペッティングした。室温で10分間のインキュベーション後、蛍光を測定した(Victor2 Fluorometer、Perkin−Elmer Wallac)。特異的細胞傷害は、等式(実験溶解-自発溶解)/(最大溶解-自発溶解)*100から得られる。
インビトロモデルでの補体依存性細胞性細胞傷害の検出
抗体の補体依存性細胞性細胞傷害(CDC)を、ユーロピウム放出アッセイにおいて調べた。Eu3+負荷標的細胞(ZR−75−1、3×106)は、上記のようにして作製した。
抗体分子組成物の食作用活性を解析するためのコンジュゲート形成アッセイ(CFA)
PKH26での腫瘍細胞の染色:
1×10P7P〜2×10P7Pの腫瘍細胞をPBS中で2回洗浄し、1mlの希釈剤C中に再懸濁し、1mlのPKH26を濃度12×10P−6PMで、ZR−74−1、ZR−74−1TF、MCF−7およびMT−3に対して添加した。
CFA:
PKH−26標識腫瘍細胞をトリプシン/EDTAにより回収し、PBSで1回洗浄し、組換え抗体分子組成物の存在下または非存在下のMAK細胞培地(Invitrogen)中に、0.8×10P6P細胞/mlで再懸濁させた。腫瘍細胞(250μl、0.2×10P6P細胞)を、非付着性ポリプロピレンチューブ内に播種した。
ELISAでの抗体分子組成物結合活性の解析
種々の細胞株で発現させた抗体分子組成物の抗原結合を解析するため、キメラPankoMabとPanko2の精製抗体分子組成物を、ELISAで、配列APPAHGVTSAPDT[GalNAcα]RPAPGSTAPPAHGVTSAを有する合成30量体グリコシル化MUC1ペプチドにおいて測定した。非グリコシル化MUC1ペプチドを対照として使用した。
NM−F9、NM−およびCHOdhfr−細胞において発現させた抗体分子組成物のグリカン解析
少なくとも100μgの精製抗体のグリカンを酸加水分解によって切断した。シアル酸を、蛍光色素DMBとのコンジュゲーションによって特異的に標識した。解析は、HPLCによって例えばAsahipak−NH2カラムにおいて、個々の糖鎖に対して行なった。シアル酸の同定および計算は、適切なシアル酸標準物質によって行なった。
NM−F9、NM−H9D8およびCHOdhfr−細胞において発現させた抗体分子組成物のバイオアベイラビリティの検出
NM−H9D8において発現させたシアリル化抗体PankoMabでは、NM−F9細胞において発現させた非シアリル化抗体PankoMabと比べて長いバイオアベイラビリティが、ヌードマウスにおいて測定された。マウス1匹あたり5μgの精製抗体を、1群あたり少なくとも3匹のマウスにi.v.注射した。血液試料を注射後の種々の時点(注射の5分後、2、5、8、24、48、72および144時間後)で採取し、血清を単離し、解析まで試料を−80℃で保存した。これらの試料の抗体価をELISAによって測定した。図15は、NM−H9D8細胞から単離したキメラPankoMabが、NM−F9から単離したものよりも細胞よりもバイオアベイラビリティが長いことを示し、これは、おそらく抗体の種々のシアリル化によって引き起こされる。
真核生物細胞内でhFSHを発現させるためのベクターのクローニング
FSHαおよびFSHβ鎖のコード配列を、特異的プライマーにより、BACクローンRZPDB737B122053D(FSHαゲノム)、IRAUp969E0752D(FSHα cDNA)およびRZPDB737H0619D6(FSHβゲノム)(RZPD、ドイツ製)を用いてPCR増幅した。
FSHα鎖のプライマー:
FSHa−wt−f−KpnI:AAAGGTACCATGGATTACTACAGAAAATATG/
FSHa−b−BamHI:AAAGGATCCTTAAGATTTGTGATAATAAC;
FSHβ鎖のプライマー:
FSHb−wt−f−HindIII:TTTAAGCTTATGAAGACACTCCAGTTTTTC/
FSHb−b−BamHI:TTTGGATCCTTATTCTTTCATTTCACC
増幅後、産生物を、HindIII/BamHI(FSHゲノムβ)およびKpnI/BamHI(FSHゲノムαまたはFSHcDNAα)により、対応する真核生物の発現ベクター内にクローニングした。cDNA配列を、TCR−リーダー配列に融合されたFSHβ鎖をコードするGenesynthesisによって作製し、真核生物の発現ベクター(FSHcDNAβ)内にクローニングした。
配列FSHcDNAβ(TCR−リーダー配列に下線):
ヒト組換えhFSHを発現させるための真核生物細胞のトランスフェクション、ならびに無血清条件下で高産生の細胞クローン(GT−2xおよびNM−H9D8)または血清含有条件下で高産生の細胞クローン(CHOdhfr−)を作製するための遺伝子増幅手順
hFSHをGT−2x[DSM ACC ]、NM−H9D8(DSM ACC2806)、およびCHOdhfr−(ATCC No.CRL−9096)において発現させるため、細胞を、αおよびβ鎖用の上記のベクター(1:1〜1:3)の混合物で、DMRIE−Cを用いたリポフェクションによって、またはGT−2x(FSHcDNAα/FSHゲノムβ)およびNM−H9D8(FSHcDNAα/FSHcDNAβ)とリポフェクタミンの懸濁細胞ではエレクトロポレーション(Nucleofector;Amaxa)、または付着細胞株CHOdhfr−(FSHゲノムα/FSHゲノムβ)ではエレクトロポレーションによってコトランスフェクトした。これらは、このような設定で使用される例示的な組合せである。他の組合せのhFSHαとhFSHβ鎖発現プラスミドでも、各々、同等の結果がもたらされる。
比産生速度(SPR)および倍加時間(g)の測定
各クローンについて、2×10P4P細胞/ウェルを24ウェル組織培養プレートの500μlの増殖培地中に播種した。細胞を3日間培養し、ならし培地を回収して解析し、必要に応じてAccutaseによって細胞を取り出し、計数した。特異的抗体価を培地試料からELISAによって定量的に測定した。アッセイプレートをhFSHβに特異的なマウスmAB(ab22473)でコートした。結合された組換えhFSHをhCGαに特異的なヤギポリクローナル抗体(ab20712)とともにインキュベートし、ロバ抗ヤギIgG H+L−POD(JacksonImmunoカタログ番号305−035−003)により検出した。定量では、精製組換えhFSHを標品として使用した。
g=log2×(培養時間)/log(最終細胞数/最初の細胞数)
によって計算した。
細胞株の平均収率および最大収率の測定
上記の限界希釈(0.5細胞/ウェル)を用いた96ウェルプレート内での単一細胞クローニング後、理論的に200個の平板培養単一クローンから、増殖中の細胞クローンのSPRを測定し、種々の細胞株および種々の条件での平均および偏差ならびに最大収率を求めた。表7および表8では、血清含有条件下(CHOdhfr−)ならびに無血清条件(GT−2xおよびNM−H9D8)で生成されたhFSHを産生するCHOdhfr−、GT−2x、およびNM−H9D8の細胞クローンのデータを比較している。
hFSH分子組成物の単離
本発明によるhFSH分子組成物産生および単離のため、hFSHを分泌する安定にトランスフェクトされた細胞を、細胞密度が約1〜2×10P6P細胞/mlに達するまで無血清培地中で培養した。遠心分離(400×g、15分間)によって細胞培養上清みから細胞を除去した後、キメラ抗体を、NHS活性化カラム(HiTrap NHS−activated HP;GE Healthcare)に結合させたhCGαに対するポリクローナル抗体を使用する親和性クロマトグラフィーを用いて精製した。急速pH変化によって溶出された精製FSH画分をPBS中で再緩衝化し、Centriprep遠心チューブ(10kDa排除、Millipore)を用いて濃縮し、SDS−PAGEによって解析した(図16参照)。
本発明によるFSH分子組成物の活性の測定
異なるグリコシル化パターンを有するFSH分子の活性は、以下に記載する方法に従って測定され得る。最適化されたグリコシル化をもたらす本発明によるスクリーニング方法により適当な細胞株を選択するため、FSH分子を種々の細胞株で発現させ、それにより、例えばシアリル化度、ガラクトシル化および/またはフコシル化度に関して相違するグリコシル化パターンを示す個々の細胞株からFSH組成物を得る。最も有利な活性、したがってグリコシル化パターンを有するFSH分子/組成物は、以下の方法の少なくとも1つによって決定され得る。
ラット顆粒膜細胞アッセイ:
顆粒膜細胞を、DES処理した脳下垂体摘出ラットから採取した。該細胞の調製方法は、JiaおよびHsueh 1985に詳細に記載されている。
293HEK アッセイ:
hFSH−受容体(2×105細胞/35mm培養皿)で安定にトランスフェクトされたHEK293細胞を、GT−2xおよびNM−H9D8細胞から得られた漸増用量の各FSHタンパク質分子組成物(0〜1μg/ml FSHの範囲)に、0.125mMの1−メチル−3−イソブチルキサンチンの存在下、37℃で24時間から72時間までで曝露した。インキュベーション後、全(細胞内および細胞外)cAMP濃度を、cAMP
Direct BiotrakTM EIA(GE Healthcare、カタログ番号:RPN225)によって製造業者の使用説明書に従って測定した。
GFSHR−17細胞アッセイ:
細胞を、5%ウシ胎仔血清(Biochrom KG,ベルリン,ドイツ)を含むダルベッコ改変イーグル培地Ham F12(1:1 v:v;Biochrom KG,ベルリン,ドイツ)で培養した。細胞を2×105細胞/24ウェルプレートで平板培養し、GT−2xおよびNM−H9D8細胞から得られたFSHタンパク質分子組成物とともに24時間、0〜1μg/mlの範囲で1〜24時間インキュベートした。インキュベーション後に培地を回収し、プロゲステロンELISAアッセイ(Biochem Immunosystems,フライブルク,ドイツ)を製造業者の使用説明書に従って使用することによるプロゲステロンの定量まで−20℃で保存した。
ヒト顆粒膜細胞アッセイ
ミュンスター大学で体外受精プログラムに参加している女性から得た卵胞採取による顆粒膜−黄体細胞を、Khanら,1990に記載のようにして富化し、6ウェルプレート内に播種した(1〜1.5×105バイアブル細胞/ウェル)。10%熱不活化ウシ胎仔血清(FCS;Gibco,エッゲンシュタイン,ドイツ)、ペニシリン(50単位/ml)、ストレプトマイシン(50pg/ml)、ゲンタマイシン(100pg/rnl)およびアンホテリシン(0.6pg/ml)を補給したハムF12/ダルベッコ改変必須培地(DMEM)(1:1;ICN Biomedicals,メッケンハイム,ドイツ)中で、5%CO2雰囲気下37℃にて細胞をインキュベートした。細胞を、GT−2xおよびNM−H9D8細胞から得られた漸増用量の各FSHタンパク質分子組成物(0〜1μg/ml FSHの範囲)に、0.125mMの1−メチル−3−イソブチルキサンチンの存在下、37℃で24時間から72時間までで曝露した。インキュベーション後、全(細胞内および細胞外)cAMP濃度を、cAMP Direct BiotrakTM EIA(GE Healthcare、カタログ番号:RPN225)によって製造業者の使用説明書に従って測定した。
GT−2x およびCHOdhfr−細胞において発現させたFSH組成物のグリカン解析
ウエスタンブロット解析を行なうと、CHOdhfr−、GT−2x[DSM ACC
]、またはNM−H9D8[DSM ACC2806]において発現させた種々にシアリル化されたFSH分子組成物が確認された。5μgの各抗体分子組成物を、還元条件下での10%アクリルアミドゲルにおけるSDS−Pageによって分離した。タンパク質をニトロセルロースに移し、2−6シアリル化を検出するSNAによって可視化した(図17)。
IUPAC−IUBMB推奨(1996)による定義:
Neu5Gc:5−N−グリコリル−α−ノイラミン酸
Neu5AcおよびNeuNAc:5−N−アセチル−α−ノイラミン酸
Gala1,3Gal:α−D−ガラクトピラノシル−(1→3)ガラクトピラノシル−隣接糖
2,3結合ノイラミン酸:5−N−アセチル−α−ノイラミニル−(2→3)−隣接糖
2,6結合ノイラミン酸:5−N−アセチル−α−ノイラミニル−(2→6)−隣接糖
本発明は、本明細書に記載した具体的な方法論、プロトコルおよび/または試薬が種々であり得るため、これらに限定されないことは理解されよう。また、本明細書で使用した専門用語は、具体的な実施形態を示す目的にすぎず、特許請求の範囲によってのみ制限される本発明の範囲を制限することは意図しないことも理解されよう。
配列番号
配列#1
配列番号1
受託番号DSM ACC2606についての、PCT/RO/134様式に基づくさらなる表示
出願人はここにおいて、個々の規定を有する国に対して、本願において言及されている寄託された生物学的材料の試料の供与は、無関係の、指名された専門家に対してのみなさ得ることを要求する(適用可能な場合、特にオーストラリア、カナダ、クロアチア、デンマーク、フィンランド、ドイツ、アイスランド、ノルウェー、シンガポール、スペイン、スウェーデン、英国、ヨーロッパにおいて、「エキスパートソリューション(expert solution)」の要求)。
出願人はここにおいて、個々の規定を有する国に対して、本願において言及されている寄託された生物学的材料の試料の供与は、無関係の、指名された専門家に対してのみなさ得ることを要求する(適用可能な場合、特にオーストラリア、カナダ、クロアチア、デンマーク、フィンランド、ドイツ、アイスランド、ノルウェー、シンガポール、スペイン、スウェーデン、英国、ヨーロッパにおいて、「エキスパートソリューション(expert solution)」の要求)。
したがって、ヨーロッパに関しては、出願人は、寄託された生物学的材料が、EPC規則28(3)において規定されるように、特許を付与する旨の告示が公表されるまで、または特許出願が拒絶され、取り下げられ、もしくは取り下げられたものとみなされる場合には出願の日から20年間、試料の請求人により指名された専門家に試料を分譲することによってのみ入手可能となされる(EPC規則28(4))ことを要求する。
出願人はここにおいて、個々の規定を有する国に対して、本願において言及されている寄託された生物学的材料の試料の供与は、無関係の、指名された専門家に対してのみなさ得ることを要求する(適用可能な場合、特にオーストラリア、カナダ、クロアチア、デンマーク、フィンランド、ドイツ、アイスランド、ノルウェー、シンガポール、スペイン、スウェーデン、英国、ヨーロッパにおいて、「エキスパートソリューション(expert solution)」の要求)。
出願人はここにおいて、個々の規定を有する国に対して、本願において言及されている寄託された生物学的材料の試料の供与は、無関係の、指名された専門家に対してのみなさ得ることを要求する(適用可能な場合、特にオーストラリア、カナダ、クロアチア、デンマーク、フィンランド、ドイツ、アイスランド、ノルウェー、シンガポール、スペイン、スウェーデン、英国、ヨーロッパにおいて、「エキスパートソリューション(expert solution)」の要求)。
したがって、ヨーロッパに関しては、出願人は、寄託された生物学的材料が、EPC規則28(3)において規定されるように、特許を付与する旨の告示が公表されるまで、または特許出願が拒絶され、取り下げられ、もしくは取り下げられたものとみなされる場合には出願の日から20年間、試料の請求人により指名された専門家に試料を分譲することによってのみ入手可能となされる(EPC規則28(4))ことを要求する。
出願人はここにおいて、個々の規定を有する国に対して、本願において言及されている寄託された生物学的材料の試料の供与は、無関係の、指名された専門家に対してのみなさ得ることを要求する(適用可能な場合、特にオーストラリア、カナダ、クロアチア、デンマーク、フィンランド、ドイツ、アイスランド、ノルウェー、シンガポール、スペイン、スウェーデン、英国、ヨーロッパにおいて、「エキスパートソリューション(expert solution)」の要求)。
したがって、ヨーロッパに関しては、出願人は、寄託された生物学的材料が、EPC規則28(3)において規定されるように、特許を付与する旨の告示が公表されるまで、または特許出願が拒絶され、取り下げられ、もしくは取り下げられたものとみなされる場合には出願の日から20年間、試料の請求人により指名された専門家に試料を分譲することによってのみ入手可能となされる(EPC規則28(4))ことを要求する。
出願人はここにおいて、個々の規定を有する国に対して、本願において言及されている寄託された生物学的材料の試料の供与は、無関係の、指名された専門家に対してのみなさ得ることを要求する(適用可能な場合、特にオーストラリア、カナダ、クロアチア、デンマーク、フィンランド、ドイツ、アイスランド、ノルウェー、シンガポール、スペイン、スウェーデン、英国、ヨーロッパにおいて、「エキスパートソリューション(expert solution)」の要求)。
したがって、ヨーロッパに関しては、出願人は、寄託された生物学的材料が、EPC規則28(3)において規定されるように、特許を付与する旨の告示が公表されるまで、または特許出願が拒絶され、取り下げられ、もしくは取り下げられたものとみなされる場合には出願の日から20年間、試料の請求人により指名された専門家に試料を分譲することによってのみ入手可能となされる(EPC規則28(4))ことを要求する。
出願人はここにおいて、個々の規定を有する国に対して、本願において言及されている寄託された生物学的材料の試料の供与は、無関係の、指名された専門家に対してのみなさ得ることを要求する(適用可能な場合、特にオーストラリア、カナダ、クロアチア、デンマーク、フィンランド、ドイツ、アイスランド、ノルウェー、シンガポール、スペイン、スウェーデン、英国、ヨーロッパにおいて、「エキスパートソリューション(expert solution)」の要求)。
Claims (21)
- タンパク質分子組成物を産生させるための方法であって、前記方法は:
(a)ヒト骨髄性白血病起源の不死化ヒト血液細胞である宿主細胞内に、前記タンパク質の少なくとも一部分をコードする少なくとも1つの核酸を導入する工程であって、ここで、前記宿主細胞はK562細胞に由来し、セイヨウニワトコ凝集素(SNA)に、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]よりも強く結合することができる、工程;
(b)前記宿主細胞を前記タンパク質分子組成物の産生を許容する条件下で培養する工程;ならびに
(c)前記タンパク質分子組成物を単離する工程
を含み、
ここで、前記宿主細胞は、以下の特徴的グリコシル化:
(i)NeuGcを含まない;
(ii)α2−6結合NeuNAcを含む;かつ
(iii)前記細胞において発現させたとき、前記タンパク質分子組成物中の諸タンパク質分子の糖鎖構造全体またはその諸タンパク質分子のうちのタンパク質1分子の特定の1つのグリコシル化部位の糖鎖構造において、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離された前記少なくとも1つの核酸によってコードされる同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物中の同じ量のタンパク質分子と比べて少なくとも15%多い量のNeuNAcによる、増大したシアリル化度を有する;
を有するタンパク質分子組成物を産生するように選択され、
ここで、前記CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]は、10%FCS、2mMのグルタミンおよび2%HT補給物を補給したDMEM中、または無血清のCHO−S−SFM II培地で培養され、8%の加湿雰囲気中、37℃で増殖させられることを特徴とする、
方法。 - 前記宿主細胞が、Thomsen-Friedenreich(TF)抗原を低量で発現するか、または発現しない、請求項1に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、以下の特徴:
(i)末端Galα1−3Galを含まない;
(ii)前記タンパク質分子組成物中の諸タンパク質分子の糖鎖単位全体またはその諸タンパク質分子のうちのタンパク質1分子の特定のグリコシル化部位の少なくとも1つの特定の糖鎖の少なくとも2%の糖鎖構造を含み、バイセクトGlcNAcを含有する;
(iii)前記タンパク質分子組成物中の諸タンパク質分子の糖鎖単位全体またはその諸タンパク質分子のうちのタンパク質1分子の特定のグリコシル化部位の少なくとも1つの特定の糖鎖の少なくとも5%の糖鎖構造を含み、バイセクトGlcNAcを含有する;
(iv)前記細胞において発現させたとき、前記タンパク質分子組成物中の諸タンパク質分子の糖鎖構造全体またはその諸タンパク質分子のうちのタンパク質1分子の特定の1つのグリコシル化部位の糖鎖構造において、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離された同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物中の同じ量のタンパク質分子と比べて少なくとも20%多い量のNeuNAcによる、増大したシアリル化度を有する;
(v)前記タンパク質分子組成物中の諸タンパク質分子の糖鎖単位全体またはその諸タンパク質分子のうちのタンパク質1分子の特定のグリコシル化部位の少なくとも1つの特定の糖鎖の少なくとも50%の糖鎖構造を含み、フコースがない;かつ
(vi)NM−F9細胞[DSM ACC2606]またはNM−D4細胞[DSM ACC2605]で達成されるものより高いシアリル化度を有し、ここで、前記NM−F9細胞[DSM ACC2606]または前記NM−D4細胞[DSM ACC2605]において、前記宿主細胞で得られるシアリル化度の50%〜60%しか達成されない;のうちの少なくとも1つを有するタンパク質分子組成物を産生するように選択される、
請求項1または2に記載の方法。 - 前記宿主細胞は、以下の特徴的グリコシル化:
(i)前記細胞において発現させたとき、前記タンパク質分子組成物中の諸タンパク質分子の糖鎖構造全体またはその諸タンパク質分子のうちのタンパク質1分子の特定の1つのグリコシル化部位の糖鎖構造において、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離された同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物中の同じ量のタンパク質分子と比べて増大したガラクトシル化度を有する;
(ii)前記細胞において発現させたとき、前記タンパク質分子組成物中の前記諸タンパク質分子の糖鎖構造全体またはその諸タンパク質分子のうちのタンパク質1分子の特定の1つのグリコシル化部位の糖鎖構造において、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離された同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物中の同じ量のタンパク質分子と比べて少なくとも5%多いG2構造量を有する;
(iii)前記細胞において発現させたとき、前記タンパク質分子組成物中の前記諸タンパク質分子の糖鎖構造全体またはその諸タンパク質分子のうちのタンパク質1分子の特定の1つのグリコシル化部位の糖鎖構造において、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離された同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物中の同じ量のタンパク質分子と比べて少なくとも5%少ないG0構造量を有する;
(iv)前記細胞において発現させたとき、前記タンパク質分子組成物中の前記諸タンパク質分子の糖鎖構造全体またはその諸タンパク質分子のうちのタンパク質1分子の特定の1つのグリコシル化部位の糖鎖構造において、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離された同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物中の同じ量のタンパク質分子と比べて少なくとも5%少ないフコース量を含む;ならびに
(v)前記細胞において発現させたとき、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離された同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物のシアリル化パターンと比べて改変されたシアリル化パターンを有する、
の少なくとも1つを有するタンパク質組成物が産生されるように選択され、かつここで、
前記タンパク質分子は特徴的グリコシル化(i)〜(v)の少なくとも1つを有する、
タンパク質分子組成物を産生させるための請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。 - 前記シアリル化パターンが、以下の特徴:
−前記細胞において発現させたとき、前記タンパク質分子組成物中の諸タンパク質分子の糖鎖構造全体またはその諸タンパク質分子のうちのタンパク質1分子の特定の1つのグリコシル化部位の糖鎖構造において、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離された同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物中の同じ量のタンパク質分子と比べて少なくとも20%多い量のNeuNAcによる、増大したシアリル化度を有する、および/または
−前記細胞において発現させたとき、前記タンパク質分子組成物中の諸タンパク質分子の糖鎖単位全体またはその諸タンパク質分子のうちのタンパク質1分子の特定のグリコシル化部位の少なくとも1つの特定の糖鎖に荷電N−グリコシド結合糖鎖が、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離された同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物中の同じ量のタンパク質分子と比べて少なくとも20%多く含まれる、
の少なくとも1つを特徴とする、請求項4に記載の方法。 - 前記宿主細胞が、
−前記タンパク質分子組成物中の諸タンパク質分子の糖鎖単位全体またはその諸タンパク質分子のうちのタンパク質1分子の特定のグリコシル化部位の少なくとも1つの特定の糖鎖の少なくとも10%の糖鎖構造を含み、フコースがない、および/または
−前記タンパク質分子組成物中の諸タンパク質分子の糖鎖単位全体またはその諸タンパク質分子のうちのタンパク質1分子の特定のグリコシル化部位の少なくとも1つの特定の糖鎖の少なくとも5%の糖鎖構造を含み、バイセクトGlcNAcを含有する糖鎖構造を含む、および/または
−前記タンパク質分子組成物中の糖鎖構造全体またはそのうちのタンパク質1分子の特定の1つのグリコシル化部位の糖鎖構造において、35%より多くのG2構造を含む;および/または
−前記タンパク質分子組成物中の糖鎖構造全体またはそのうちのタンパク質1分子の特定の1つのグリコシル化部位の糖鎖構造において、22%未満のG0構造を含む
糖タンパク質が産生されるように選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。 - 産生される前記タンパク質分子組成物が、以下の特徴:
−細胞株CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させたときの同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物と比べて増大した活性および/または増大した収率を有する;
−細胞株CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させたときの同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物と比べて改善された均一性を有する;
−細胞株CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させたときの同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物の収率よりも少なくとも10%高い平均または最大収率の増大を有する;
−細胞株CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させたときの同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物と比べて改善されたグリコシル化の均一性である改善された均一性を有する;
−細胞株CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させたときの同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物と比べて増大した活性を有する;
−前記タンパク質分子が抗体分子である場合、細胞株CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させたときの同じ抗体分子の少なくとも1種類の抗体分子組成物のFc媒介性細胞性細胞傷害より少なくとも2倍大きいFc媒介性細胞性細胞傷害の増大を有する;および/または
−前記タンパク質分子が抗体分子である場合、細胞株CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させたときの同じ抗体分子の少なくとも1種類の抗体分子組成物の結合よりも少なくとも15%大きい抗原媒介性またはFc媒介性結合の増大を有する
の少なくとも1つを有する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。 - 前記宿主細胞が、以下の特徴的なグリコシル化の組合せ:
(a)
−NeuGcが含まれない
−Galα1−3Galが含まれない
−請求項3に記載のガラクトシル化パターンが含まれる
−請求項3に記載のフコース含量を有する
−bisecGlcNAcが含まれる
−細胞株CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]において発現させたときの同じタンパク質分子のタンパク質組成物と比べて、または、前記シアリル化のない細胞株であるNM−F9[DSM ACC2606]もしくはNM−D4[DSM ACC2605]と比べて増加した量のシアル酸が含まれる;あるいは
(b)
−NeuGcが含まれない
−Galα1−3Galが含まれない
−請求項3に記載のガラクトシル化パターンが含まれる
−請求項3に記載のフコース含量を有する
−bisecGlcNAcが含まれる
−2−6 NeuNAcが含まれる
を有するタンパク質分子を含むタンパク質組成物が産生されるように選択される、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。 - 葉酸代謝拮抗薬耐性DHFRバリアントをコードする核酸が前記宿主細胞内に導入され、かつ前記宿主細胞が前記葉酸代謝拮抗薬とともに培養される、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法であって、
ここで、前記葉酸代謝拮抗薬耐性DHFRバリアントをコードする核酸が、配列番号1から配列番号9からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、方法。 - 前記葉酸代謝拮抗薬がメトトレキサートである、請求項9に記載の方法。
- 前記タンパク質が、サイトカインおよびその受容体の群、腫瘍壊死因子TNF−αおよびTNF−β;レニン;ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン;成長ホルモン放出因子;副甲状腺ホルモン;甲状腺刺激ホルモン;リポタンパク質;α−1−抗トリプシン;インスリンA−鎖およびB−鎖;ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン(FSH)、黄体形成ホルモン(LH)、サイロトロピン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG);カルシトニン;グルカゴン;凝固因子、第VIIIC因子、第IX因子、第VII因子、組織因子、フォン・ビルブラント因子;抗凝固因子、プロテインC;心房性ナトリウム利尿因子;肺サーファクタント;プラスミノゲン活性化因子、ウロキナーゼ、ヒト尿および組織型プラスミノゲン活性化因子;ボンベシン;トロンビン;造血増殖因子;エンケファリナーゼ;ヒトマクロファージ炎症性タンパク質;血清アルブミン、ヒト血清アルブミン;ミュラー阻害物質;レラキシンA−鎖およびB−鎖;プロレラキシン;マウスゴナドトロピン関連ペプチド;血管内皮増殖因子;ホルモンまたは増殖因子の受容体;インテグリン;プロテインAおよびD;リウマチ因子;神経栄養因子、骨由来神経栄養因子、ニューロトロフィン−3、ニューロトロフィン−4、ニューロトロフィン−5、ニューロトロフィン−6、神経成長因子−β;血小板由来増殖因子;線維芽細胞増殖因子;上皮増殖因子;トランスホーミング増殖因子、TGF−α、TGF−β;インスリン様増殖因子−Iおよび−II;インスリン様増殖因子結合タンパク質;CDタンパク質、CD−3、CD−4、CD−8、CD−19;エリトロポイエチン(EPO);骨誘導因子;イムノトキシン;骨形成タンパク質;インターフェロン、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ;コロニー刺激因子(CSF)、M−CSF、GM−CSF、G−CSF;インターロイキン、IL−1〜IL−12;スーパーオキシドジスムターゼ;T細胞受容体;表面膜タンパク質;崩壊促進因子;抗体、イムノアドヘシン;グリコホリンA;ならびにMUC1からなる群より選択される、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記タンパク質が抗体またはその断片である、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抗体が、ガングリオシドGD3に対する抗体、ヒトインターロイキン−5受容体α鎖に対する抗体、HER2に対する抗体、CCケモカイン受容体4に対する抗体、CD20に対する抗体、CD22に対する抗体、神経芽腫に対する抗体、MUC1に対する抗体、上皮増殖因子受容体に対する抗体からなる群より選択される、請求項12に記載の方法。
- 前記抗体が、PankoMab、ムロモナブ、ダクリズマブ、バシリキシマブ、アブシキシマブ、リツキシマブ、ハーセプチン、ゲムツズマブ、アレムツズマブ、イブリツモマブ、セツキシマブ、ベバシズマブ、トシツモマブ、パブリズマブ、インフリキシマブ、エクリズマブ、エプラツズマブ、オマリズマブ、エファリズマブ、アダリムマブ、カンパス−1H、C2B8、パノレックス、ブレバレックス、シムレクト、アントバ、OKT3、ゼナパックス、レオプロ、シナジス、オスタビル、プロトビル、オバレックス、ビタキシン、抗CCケモカイン受容体4抗体KM2160、および抗神経芽腫抗体chCE7からなる群より選択される、請求項12に記載の方法。
- 前記抗体が、MUC1に対する抗体;HER2に対する抗体;および、EGFRに対する抗体からなる群より選択される、請求項12に記載の方法。
- 前記抗体が、PankoMab、Panko 1、Panko 2、ハーセプチン、および、セツキシマブからなる群より選択される、請求項15に記載の方法。
- (i)前記タンパク質を、リンカー、活性化分子、および、毒素からなる群より選択される別のペプチドまたはポリペプチド配列に融合させるか;あるいは
(ii)前記タンパク質が、サイトカイン、共起刺激因子、毒素、他の抗体由来の抗体断片、多量体化配列、および、検出、精製、分泌または安定化のための配列からなる群より選択される別のタンパク質配列に融合した抗体断片であるか;あるいは
(iii)前記タンパク質が、免疫エフェクター分子、毒素、および、放射性同位体からなる群より選択される、治療効果を媒介するエフェクター分子にカップリングさせた抗体または抗体断片である、
請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。 - タンパク質分子組成物を産生することができる、ヒト骨髄性白血病起源の不死化ヒト血液細胞であって、前記タンパク質分子組成物は、以下の特徴的グリコシル化:
(i)NeuGcを含まない;
(ii)α2−6結合NeuNAcを含む;かつ
(iii)前記細胞において発現させたとき、前記タンパク質分子組成物中の諸タンパク質分子の糖鎖構造全体またはその諸タンパク質分子のうちのタンパク質1分子の特定の1つのグリコシル化部位の糖鎖構造において、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離された同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物中の同じ量のタンパク質分子と比べて少なくとも15%多い量のNeuNAcによる、増大したシアリル化度を有する;
を有し、
ここで、前記CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]は、10%FCS、2mMのグルタミンおよび2%HT補給物を補給したDMEM中、または無血清のCHO−S−SFM II培地で培養され、8%の加湿雰囲気中、37℃で増殖させられることを特徴とし;
ここで、前記細胞はK562細胞に由来し、セイヨウニワトコ凝集素(SNA)にCHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]よりも強く結合することができる、不死化ヒト血液細胞。 - 前記細胞が、Thomsen-Friedenreich(TF)抗原を低量で発現するか、または発現しない、請求項18に記載の不死化ヒト血液細胞。
- 前記タンパク質分子組成物が、以下の特徴:
(i)末端Galα1−3Galを含まない;
(ii)前記タンパク質分子組成物中の諸タンパク質分子の糖鎖単位全体またはその諸タンパク質分子のうちのタンパク質1分子の特定のグリコシル化部位の少なくとも1つの特定の糖鎖の少なくとも2%の糖鎖構造を含み、バイセクトGlcNAcを含有する;
(iii)前記タンパク質分子組成物中の諸タンパク質分子の糖鎖単位全体またはその諸タンパク質分子のうちのタンパク質1分子の特定のグリコシル化部位の少なくとも1つの特定の糖鎖の少なくとも5%の糖鎖構造を含み、バイセクトGlcNAcを含有する;
(iv)前記細胞において発現させたとき、前記タンパク質分子組成物中の諸タンパク質分子の糖鎖構造全体またはその諸タンパク質分子のうちのタンパク質1分子の特定の1つのグリコシル化部位の糖鎖構造において、CHOdhfr−[ATCC No.CRL−9096]から単離された同じタンパク質分子の少なくとも1種類のタンパク質分子組成物中の同じ量のタンパク質分子と比べて少なくとも20%多い量のNeuNAcによる、増大したシアリル化度を有する;
(v)前記タンパク質分子組成物中の諸タンパク質分子の糖鎖単位全体またはその諸タンパク質分子のうちのタンパク質1分子の特定のグリコシル化部位の少なくとも1つの特定の糖鎖の少なくとも50%の糖鎖構造を含み、フコースがない;ならびに/あるいは
(vi)NM−F9細胞[DSM ACC2606]またはNM−D4細胞[DSM ACC2605]で達成されるものより高いシアリル化度を有し、ここで、前記NM−F9細胞[DSM ACC2606]または前記NM−D4細胞[DSM ACC2605]において、前記宿主細胞で得られるシアリル化度の50%〜60%しか達成されない、の少なくとも1つをさらに有する、請求項18または19に記載の細胞。 - タンパク質分子または少なくともその一部分をコードする少なくとも1つの核酸、ならびに配列番号1〜9からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列を含む少なくとも1つの核酸を含む、請求項18〜20のいずれか一項に記載の細胞。
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