BRPI0716997B1 - Proteína ou composição de moléculas de proteína, métodos para produção e uso da mesma - Google Patents

Proteína ou composição de moléculas de proteína, métodos para produção e uso da mesma Download PDF

Info

Publication number
BRPI0716997B1
BRPI0716997B1 BRPI0716997-3A BRPI0716997A BRPI0716997B1 BR PI0716997 B1 BRPI0716997 B1 BR PI0716997B1 BR PI0716997 A BRPI0716997 A BR PI0716997A BR PI0716997 B1 BRPI0716997 B1 BR PI0716997B1
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
protein
antibody
molecule
composition
cell
Prior art date
Application number
BRPI0716997-3A
Other languages
English (en)
Inventor
Steffen Goletz
Antje Danielczyk
Hans Baumeister
Renate Stahn
Anja Löffler
Anja Loffler
Lars Stöckl
Lars Stôckl
Original Assignee
Glycotope Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=39157600&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=BRPI0716997(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from EP06090171A external-priority patent/EP1900750A1/en
Priority claimed from EP06090190A external-priority patent/EP1911766A1/en
Application filed by Glycotope Gmbh filed Critical Glycotope Gmbh
Publication of BRPI0716997A2 publication Critical patent/BRPI0716997A2/pt
Publication of BRPI0716997A8 publication Critical patent/BRPI0716997A8/pt
Publication of BRPI0716997B1 publication Critical patent/BRPI0716997B1/pt
Publication of BRPI0716997B8 publication Critical patent/BRPI0716997B8/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g.hCG [human chorionic gonadotropin]; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
    • C07K16/3092—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties against tumour-associated mucins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0006—Modification of the membrane of cells, e.g. cell decoration
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A61K38/1735—Mucins, e.g. human intestinal mucin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • A61K38/4846—Factor VII (3.4.21.21); Factor IX (3.4.21.22); Factor Xa (3.4.21.6); Factor XI (3.4.21.27); Factor XII (3.4.21.38)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/72—Increased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E60/00—Enabling technologies; Technologies with a potential or indirect contribution to GHG emissions mitigation
    • Y02E60/10—Energy storage using batteries

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

sistema de produção totalmente humano de rendimento elevado para proteínas e anticorpos melhorados a presente invenção refere-se a um método para a produção de uma composição de molécula protéica com um padrão de glicosilação definido, compreendendo: a introdução numa célula hospedeira, a qual é uma célula sanguínea humana imortalizada, de pelo menos um ácido nucleico codificando pelo menos uma parte da referida proteína; e b) o cultivo da referida célula hospedeira sob condições as quais permitem a produção da referida composição da molécula proteica; e c) o isolamento da referida composição de molécula protéica.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para PROTEÍNA OU COMPOSIÇÃO DE MOLÉCULAS DE PROTEÍNA, MÉTODOS PARA PRODUÇÃO E USO DA MESMA.
SUMÁRIO
A presente invenção refere-se métodos biotecnologicamente favoráveis para a produção de composições de moléculas de proteína e, particularmente às composições de moléculas de anticorpo com atividade aumentada e/ou rendimento aumentado e/ou homogeneidade aumentada e uma glicosilação humana. Ela ainda fornece novas células hospedeiras, ácidos nucléicos e composições de moléculas de proteína.
INTRODUÇÃO
Uma característica-chave e um desafio para a indústria é a produção de proteínas recombinantes e produtividade, custo, homogeneidade e atividade proteica são questões-chave, as quais ainda devem ser otimiza das. Glicosilação também é um assunto-chave na produção com altos rendimentos de glicoproteínas recombinantes homogêneas as quais possuem uma série de problemas críticos para a sua produção. Cada linhagem celular de produção atual oferece uma série de diferentes desafios e problemas, os quais são em grande parte devido à complexidade e espécies, tecido e especificidade tecidual da glicosilação. Consequentemente, a otimização dos sistemas de produção em relação à glicosilação permanece um dos aspectos-chave para otimização. Isto particularmente como diferenças no padrão de glicosilação geralmente tem um impacto considerável na atividade, imunogenicidade, biodisponibilidade e meia-vida das moléculas de proteína. Uma visão geral detalhada das propriedades de glicosilação de diferentes linhagens celulares derivadas de diferentes espécies e de sistemas de produção diferente de mamíferos é dada em Jenkins et al (Getting the glycosylation right: implications for the biotechnology industry, Nat Biotechnology, 1996, 14: 975 - 981).
Anticorpos são ferramentas principais para diagnóstico e pesquisa, e provavelmente se tornarão a maior família de terapêuticos. Geralmente dez anticorpos recombinantes terapêuticos estão no mercado e centenas em
Petição 870200030248, de 06/03/2020, pág. 6/27
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para SISTEMA DE PRODUÇÃO TOTALMENTE HUMANO DE RENDIMENTO ELEVADO PARA PROTEÍNAS E ANTICORPOS MELHORADOS.
SUMÁRIO
A presente invenção refere-se métodos biotecnologicamente favoráveis para a produção de composições de moléculas proteicas e, particularmente às composições de moléculas de anticorpo com atividade aumentada e/ou rendimento aumentado e/ou homogeneidade aumentada e uma glicosilação humana. Ela ainda fornece novas células hospedeiras, ácidos nucleicos e composições de moléculas proteicas.
INTRODUÇÃO
Uma característica-chave e um desafio para a indústria é a produção de proteínas recombinantes e produtividade, custo, homogeneidade e atividade proteica são questões-chave, as quais ainda devem ser otimizadas. Glicosilação também é um assunto-chave na produção com altos rendimentos de glicoproteínas recombinantes homogêneas as quais possuem uma série de problemas críticos para a sua produção. Cada linhagem celular de produção atual oferece uma série de diferentes desafios e problemas, os quais são em grande parte devido à complexidade e espécies, tecido e especificidade tecidual da glicosilação. Consequentemente, a otimização dos sistemas de produção em relação à glicosilação permanece um dos aspectos-chave para otimização. Isto particulamnente como diferenças no padrão de glicosilação geralmente tem um impacto considerável na atividade, imunogenicidade, biodisponibilidade e meia-vida das moléculas proteicas. Uma visão geral detalhada das propriedades de glicosilação de diferentes linhagens celulares derivadas de diferentes espécies e de sistemas de produção diferente de mamíferos é dada em Jenkins et al (Getting the glycosylation right: implications for the biotechnology industry, Nat Biotechnology, 1996, 14: 975-981).
Anticorpos são ferramentas principais para diagnóstico e pesquisa, e provavelmente se tornarão a maior família de terapêuticos. Geralmente dez anticorpos recombinantes terapêuticos estão no mercado e centenas em desenvolvimento clínico. Uma característica-chave e desafio para a indústria é a produção de anticorpos recombinantes (rMAbs) e produtividade, custo, homogeneidade e atividade do anticorpo são questões-chave as quais ainda devem ser otimizadas. Quase todos os rMAbs terapêuticos no mercado foram produzidos em linhagens de células de roedores a partir de hamster (CHO) e camundongo (NSO ou Sp2/0). De longe a maioria dos rMABs em desenvolvimento são produzidos em células de roedores, e outras estão em desenvolvimento, entretanto, nenhuma foi suficiente para otimizar a produtividade, custo, homogeneidade e atividade de anticorpo.
Glicosilação também é um assunto-chave na produção de altos rendimentos de rMABs homogêneos e potentes os quais apresentam uma série de problemas críticos para a produção dos rMAbs. Cada linhagem celular de produção atual oferece uma série de diferentes desafios e problemas os quais são amplamente devido à complexidade e espécies, tecido e especificidade do sítio de glicosilação [Review: Royston Jefferis, CCE IX: Glycosylation of Recombinant Antibody Therapeutics; Biotechnol. Prog. 2005,21,11-16].
Consequentemente, a otimização de proteínas e, particularmente, sistemas de produção de anticorpos em relação à glicosilação permanece um dos aspectos-chaves para a otimização.
A presente invenção proporciona novos sistemas de expressão baseados em células sanguíneas humanas imortalizadas e, particularmente, baseados em células de origem leucêmica mieloide. Essas células surpreendentemente melhoram a produção de proteínas glicosiladas e, particularmente, de anticorpos em relação à atividade, rendimento e/ou homogeneidade.
TÉCNICA ANTERIOR
Proteínas é um grupo diverso do qual a função e ocorrência variam amplamente entre elas. Dentre as proteínas de potencial terapêutico, a maior parte das proteínas são glicosiladas, tais como muitos hormônios (por exemplo, hormônio do crescimento, glucagon, FSH e LH), fatores de crescimento (por exemplo, GM-CSF, G-CSF, VEGF e eritropoietina), citocinas (por exemplo, IL-2, IL-7, interferon-alfa e beta, TNF-alfa), anti-coagulante (por exemplo, Lepirudina, Desirudina), fatores de coagulação sanguínea (por exemplo, fatores VII, VIII e IX), vacinas (por exemplo, antígeno da hepatite B) e anticorpos. Os sistemas de produção celular estabelecidos são incapazes de produzir proteínas com a glicosilação humana original. Sistemas de células procarióticas (por exemplo, bactérias) e a maioria das células eucarióticas (por exemplo, leveduras, insetos e células vegetais) sintetizam proteínas que não têm glicosilação ou carregam glicanos os quais diferem muito das cadeias de carboidrato humanas. Células de ovário de hamster chinês (CHO) é um sistema de produção comumente usado que é capaz de glicosilar as proteínas de uma forma similar a das células humanas. Entretanto, ainda permanecem diferenças importantes, tais como na galactosilação, fucosilação, particularmente glicosilação com N-acetilglicosaminas e especialmente em vários aspectos da sialilação. Essas diferenças influenciam a atividade, a biodisponibilidade, a imunogenicidade e a meia-vida.
No momento em que esses sistemas de produção foram estabelecidos, isto foi suficiente para produzir proteínas terapêuticas que eram pelo menos até certo grau ativas. Entretanto, atualmente grandes esforços se concentram para melhorar a atividade de uma proteína terapêutica com o objetivo (i) de reduzir a quantidade e concentração das doses aplicadas das proteínas terapêuticas, (ii) de reduzir os custos de uma terapia, e (iii) de reduzir os efeitos colaterais.
A principal estratégia para melhorar a bioatividade das proteínas é prolongar a sua meia-vida do soro onde certas formas de polietilenoglicol são adicionadas/ligadas quimicamente à proteína produzida. PEG aumenta o peso molecular e, dessa forma, a meia-vida no soro. Entretanto, vários problemas estão associados a esse processo. Por exemplo, em quase todos os casos a PEGuilação reduz a atividade de uma proteína através de sua função efetora celular, a administração repetitiva em seres humanos geralmente resulta em uma resposta imune adversa como anticorpos neutralizantes, e/ou o processo de produção necessita de modificação química adicional resultando em um processo com múltiplas etapas com custos adicionais, perdas e tempo. Sistemas veículos similares (por exemplo, HESilação ou ligação de albumina) existem, os quais têm desvantagens comparáveis.
Também a modificação das cadeias de carboidrato e, deste modo, a glicosilação de proteínas está no foco para melhorar a meia-vida do soro das proteínas recombinantemente expressas. As tecnologias, deste modo, focam na maximização do grau de sialilação de uma glicoproteína recombinante. Ácidos siálicos são os monossacarídeos terminais mais prevalentes na superfície das células eucarióticas, e acredita-se de um modo geral que quanto mais a glicoproteína está sialilada mais longa é a sua meiavida no soro durante a circulação. Isto é baseado na presença de certos receptores como o receptor de asialoproteína no fígado, o qual se liga às proteínas não-sialiladas circulantes e as direciona para dentro da célula para degradação.
Várias classes de anticorpos estão presentes nos seres humanos e na maioria dos mamíferos, a saber, IgG, IgM, IgE, IgA e IgD. Enquanto as moléculas de todas as classes de anticorpos são usadas em diagnóstico ou como ferramentas de pesquisa, a maioria dos terapêuticos baseados em anticorpos no mercado e sob desenvolvimento são IgG e, em uma menor extensão, IgM. A classe de IgG humana é ainda classificada em quatro subclasses, lgG1, lgG2, lgG3 e lgG4. A estrutura básica de uma molécula de IgG consiste em duas cadeias leves e de duas cadeias pesadas compreendendo duas regiões Fab, cada uma com um domínio variável compreendendo o sítio de ligação a antígeno e um domínio constante, uma região Fc compreendendo outros domínios constantes e os sítios de interação para ligantes, e a região de dobradiça flexível a qual conecta as regiões Fab e Fc. Anticorpos podem existir como moléculas inteiras ou como fragmentos de anticorpos, tais como fragmentos Fab ou Fv de cadeia individual, os quais compreendem as duas regiões variáveis das cadeias pesada e leve conectadas através de um ligante. A figura 18 mostra um anticorpo IgG.
Anticorpos recombinantes para uso terapêutico são mais frequentemente as sequências de proteína quiméricas, humanizadas ou chamadas de proteínas totalmente humanas para reduzir a sua imunogenicida de. Entretanto, moléculas verdadeiramente totalmente humanas não foram prontamente obtidas, uma vez que as modificações pós-traducionais, tal como particularmente a glicosilação, não são humanas devido à produção em roedores ou células CHO e, deste modo, podem diferir daquelas modificações encontradas em anticorpos humanos no soro humano. Diferenças na modificação, particularmente no padrão de glicosilação, podem ter um grave impacto na atividade e na imunogenicidade do anticorpo respectivamente produzido.
A atividade de um anticorpo pode ser devido a e influenciada por uma combinação de efeitos. Por um lado o anticorpo tem certa especificidade a qual é mediada pela região variável do anticorpo (região V) localizada na região Fab, em que certas sequências, as regiões CDR, da região V. Eles desempenham um papel-chave na determinação da especificidade e afinidade particular de um anticorpo. As regiões V são, deste modo, decisivas para as características de ligação ao etitopo e variam de anticorpo para anticorpo. A afinidade de um anticorpo descreve a força e a cinética da ligação de uma única região de ligação de um anticorpo ao seu etitopo. Uma vez que várias classes e subclasses de anticorpo carregam entre duas e dez regiões variáveis idênticas na molécula do anticorpo, a força e a cinética da ligação de um anticorpo são influenciadas pela quantidade de sítios de ligação disponíveis para ligação a e a acessibilidade dos etitopos no antígenoalvo ou célula e é expressa na sua avidez.
Outro fator importante para a qualidade de um anticorpo para o seu uso em diagnose e especialmente na terapia é a quantidade de sítios de ligação de um anticorpo na sua estrutura-alvo ou célula, assim como a sua taxa de internalização. Essas qualidades influenciam os efeitos e a adequabilidade de um anticorpo para o seu uso, especialmente na terapia.
Por outro lado, mecanismos efetores relevantes para o uso terapêutico de um anticorpo são de várias vezes, por meio dos quais alguns dos anticorpos atuam somente por um mecanismo, e os outros por uma combinação de vários mecanismos efetores. Uma estratégia é acoplar os anticorpos ou fragmentos de anticorpo às moléculas efetoras, as quais medeiam um efeito terapêutico, tal como o acoplamento a uma molécula efetora imune, por exemplo, interleucina 2, para recrutar o sistema imune, ou o acoplamento a toxinas ou radioisótopos para matar as células-alvo, por exemplo, para terapias antitumorais. Anticorpos radiomarcados ou fragmentos de anticorpo também são valiosos para o diagnóstico in vivo.
A outra estratégia é usar anticorpos não-marcados, chamados de nus, os quais podem ter importantes vantagens tais como toxicidade mais baixa, logísticas menos complicadas, o uso de braços efetores imunes naturais ou o desencadeamento de efeitos terapêuticos sem a necessidade de moléculas efetoras adicionais. Uma grande quantidade de estudos foram efetuados para elucidar os mecanismos de atividade e o modo de ação dos anticorpos, assim como para desenvolver anticorpos usando essas atividades. Dentre as atividades e efeitos mais importantes estão a atividade da citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (aqui referida como atividade ADCC), a atividade de citotoxicidade dependente do complemento (aqui referida como atividade CDC), a atividade de citotoxicidade mediada por fagocitose (aqui referida como atividade de faqocitose), uma atividade mediada por receptor (aqui referida como atividade mediada por receptor), as quais compreendem todo um grupo de diferentes efeitos e atividades.
Atividades mediadas por receptor são principalmente baseadas na ligação do anticorpo a uma molécula ou receptor em uma célula-alvo ou pela prevenção da ligação de certas moléculas a uma célula-alvo, desta forma incluindo ou inibindo certos efeitos nessas células, tal como a atividade antagonística ou agonística ou o bloqueio do receptor de um anticorpo, levando, por exemplo, à indução ou inibição da apoptose ou proliferação de células-alvo ou à secreção ou inibição da secreção de certas moléculas em uma célula-alvo, ou o bloqueio ou desencadeamento de certos outros eventos mediados por receptor, tais como interações entre moléculas e células ou entre células. A atividade ADCC, a atividade CDC e a atividade de fagocitose são atividades citotóxicas as quais são mediadas pela região Fc do anticorpo (aqui referidas como atividades mediadas pela parte Fc), enquanto que as atividades mediadas por receptor, afinidade, avidez e especificidade do anticorpo são principalmente mediadas através da região de ligação do anticorpo compreendida na região Fab.
As atividades mediadas pela parte Fc são mediadas através de células efetoras imunológicas tais como células assassinas, células assassinas naturais e macrófagos ativados, ou vários componentes do complemento pela ligação aos ligantes efetores, tais como Fc-gama RI, Fc-gama Rll, Fc-gamaRIII, componente Cq1 do complemento, o receptor Fc neonatal (FcRn), etc. A subclasse de lgG1 humana é reportada como tendo a maior atividade ADCC e CDC dentre as moléculas de classe IgG humanas. Para IgM, a atividade CDC é um mecanismo efetor dominante. A atividade ADCC e a atividade CDC envolvem a ligação da região Fc, a região constante do anticorpo, aos receptores Fc tais como Fc-gama RI, Fc-gama Rll, Fc-gamaRIII da célula efetora ou dos componentes do complemento, tal como C1q. Resíduos de aminoácidos importantes estão na região da dobradiça e, particularmente, no segundo domínio da região constante (domínio Cgama2). Uma cadeia de carboidrato se ligando aos domínios Cgama2 é importante para a atividade. A cadeia de carboidrato é ligada ao aminoácido asparagina 297 (Asn-297) de Cgama2 (cadeias de carboidrato ligadas por N-glicosídeo). O terminal da cadeia de carboidratos, o qual se liga à asparagina, é chamada de extremidade redutora e a extremidade oposta é chamada de extremidade não-redutora. A região Fc de um anticorpo IgG tem dois sítios de ligação de carboidratos. A figura 18 mostra a estrutura de uma molécula IgG e indica a posição, onde tipicamente as estruturas de carboidratos podem ser encontradas. Além disso, a estrutura e a composição química dessas estruturas de carboidratos são explicadas.
Das atividades mediadas pela parte Fc, duas são consideradas como sendo influenciadas pela qlicosilação do anticorpo: foi demonstrado que a remoção da cadeia de açúcar na parte Fc do anticorpo resulta no desaparecimento da atividade CDC e ADCC e também uma redução de galactoses nesses N-glicanos causa um decréscimo na atividade CDC [Boyd et al., Molecular Immunol., 32,1311, (1995); US6946292]. Além disso, é descri to que a expressão dos anticorpos em células de ratos resulta em uma atividade ADCC aumentada de certos anticorpos ali expressos [Lifely et al., Glycobiology,Dezembro de 1995; 5(8): 813-22; WOOO/61739] em comparação com o mesmo anticorpo expresso em células de ratos e hamster. Ambos os relatórios assumem que alterações na glicosilação causam diferenças na atividade ADCC do anticorpo, entretanto, isto não está claro. Lifely et al. 1995 assumem que a N-acetilglicosamina dividindo em duas partes (bisecGlcNAc) é responsável por uma atividade ADCC aumentada do anticorpo, enquanto que WOOO/61739 assume que um decréscimo dramático de fucose alfa-1,6-ligada a N-acetilglicosamina na extremidade redutora de Nglicanos (fucose central) é responsável por uma atividade ADCC aumentada. Além disso, é descrito que a expressão recombinante da enzima GnTHI em células CHO, a qual é responsável por ligar o açúcar bisecGIcNAc em Nglicanos resulta em um aumento da atividade ADCC de certos anticorpos quando expressos nessas células em comparação com o mesmo anticorpo expresso em células CHO não-transfectadas recombinantemente com GbTIlI [US 6602684, Umana et al., Nature Biotechn 17: 176-180 (1999)]. Adicionalmente, foi descrito que o knouck-out do gene FUT8 em células CHO, o qual resulta na falta de fucose central pode aumentar a atividade ADCC de certos anticorpos quando expressos em tais células CHO KO FUT8 [US 6946292]. Esses resultados também demonstram a importância e complexidade do padrão de glicosilação para a atividade do anticorpo.
Entretanto, um padrão de glicosilação não-otimizado estrangeiro pode não somente ser prejudicial para a atividade, mas também pode ser imunogênico. Os atuais sistemas de produção e expressão para proteínas e, particularmente, anticorpos são principalmente linhagens celulares derivadas de roedores e são baseados em linhagens celulares de hamster, camundongos ou ratos, tais como CHO, BHK, NS0, Sp2/0 e YB2/0. Sabe-se que células de roedores podem produzir, sob condições não-ótimas, uma variedade de produtos proteicos anormalmente glicosilados que não têm potência ou que sejam imunogênicos. Além disso, células de roedores são conhecidas por expressar estruturas de carboidratos com diferenças importantes para aquelas expressas em células humanas compreendendo a presença de açúcares não-humanos e a falta de certas porções de açúcares nãohumanos,a qual pode tornar as proteínas expressas nessas células, por exemplo, imunogênicas, menos eficazes, com menor rendimento ou com requerimentos estruturais subótimos ou dobradura. A maioria das células de roedores expressa, por exemplo, ácido N-glicolilneuramínico (NeuGc), uma alternativa para o ácido N-acetilneuramínico (NeuNAc) não presente em seres humanos o qual é imunogênico em seres humanos e/ou a modificação da alfa(1-3) galactose, galactose imunogênica (Gal alfa1-3Gal), e/ou elas não têm carboidratos importantes, tal como NeuNAc alfa2-6 ligado ou elas não têm bisecGIcNAc. Também existem outras diferenças conhecidas e desconhecidas. Além disso, sabe-se a partir da produção de roedores que os perfis de qlicoforma são na sua maioria heterogêneos e também o perfil de glicoforma clone-específico, o qual pode variar amplamente de clone para clone nas células CHO, NSO ou Sp2/0 e são dependentes do modo de produção e condições de cultivo.
Além disso, sistemas de expressão existem para a produção de proteínas, os quais incorporam células humanas, tais como células Hek 293, as quais são derivadas das células de rim embrionárias humanas ou o sistema de células PerC6®, o qual é derivado de uma única célula derivada da retina humana, a qual foi propositalmente imortalizada usando tecnologia do DNA recombinante. Entretanto, essas linhagens celulares embora geralmente preferidas em relação aos sistemas celulares não-humanos, ainda têm algumas desvantagens. Elas têm um único padrão de glicosilação o qual é atribuível à maquinaria de glicosilação das células respectivas. Entretanto, dependendo da proteína a ser produzida, elas podem não distribuir um perfil de glicosilação otimizado, por exemplo, em relação à atividade e/ou meiavida do soro da proteína. Particularmente, certo grau e padrão de sialilação é difícil de ser alcançado com essas células. Por exemplo, os sistemas celulares conhecidos no estado da técnica não são geralmente capazes de proporcionar uma sialilação alfa 2-6 ligada detectável, a qual, entretanto, é importante para a meia-vida do soro.
A partir desses fatos, fica claro que ainda há uma necessidade por sistemas de produção e expressão os quais podem ainda otimizar a produtividade, homogeneidade e/ou atividade do anticorpo proporcionando alternativas e/ou sistemas de expressão melhorados. Além disso, a partir desses fatos, também se torna claro que não pode ser dito quais estruturas de carboidratos e especialmente quais estruturas de carboidratos humanos são ótimas para melhorar a atividade ou homogeneidade das proteínas e, particularmente, de anticorpos e que tipo de padrão de glicosilação uma linhagem celular e especialmente uma linhagem celular humana tem que proporcionar para otimizar a atividade de uma proteína, particularmente de um anticorpo. Consequentemente, existe uma necessidade por sistemas de expressão, proporcionar produtos com um padrão de glicosilação divergente em comparação com os produtos obtidos com os sistemas de expressão conhecidos no estado da técnica.
A presente invenção proporciona soluções para esses problemas proporcionando novos sistemas de expressão baseados nas linhagens de células sanguíneas imortais humanas e, particularmente, células com origem leucêmica mieloide. O uso de células sanguíneas humanas imortalizadas é vantajoso em comparação com o sistema conhecido na técnica anterior porque essas células proporcionam um perfil de glicosilação diferente do que outros sistemas celulares humanos conhecidos derivados de diferentes tecidos (por exemplo, rim ou retina). Essas diferenças podem ser vantajosas em relação à atividade, homogeneidade e rendimento de produto. Além disso, essas células podem ser transfectadas e crescidas em suspensão sob condições sem-soro.
Deste modo, de acordo com uma primeira modalidade, um método para a produção de uma composição proteica é fornecido, compreendendo os seguintes passos:
(a) introduzir em células hospedeiras, as quais são uma célula sanguínea humana imortalizada, pelo menos um ácido nucleico codificando pelo menos uma parte da referida proteína; e (b) cultivar a referida célula hospedeira sob condições as quais permitam a produção da referida composição protéica; e (c) isolar a referida composição protéica.
O método utilizando células sanguíneas humanas imortalizadas melhora a produção de proteínas e, particularmente, de anticorpos em relação à atividade, rendimento e/ou homogeneidade. Isto é surpreendente, uma vez que até agora não foi demonstrado que células sanguíneas humanas imortalizadas e, particularmente, células leucêmicas mieloides humanas são adequadas para a produção de proteínas e, particularmente, levam a anticorpos com propriedades respectivamente melhoradas. Enquanto certa parede leucêmica de rato foi usada para a expressão dos anticorpos, a maquinaria de glicosilação entre seres humanos e ratos são criticamente diferentes, por meio do que a última pode expressar porções de carboidratos os quais podem ser imunogênicos em seres humanos, tal como a NeuGc e Gal alfa1-3 Gal. A célula leucêmica YB2/0 de rato foi descrita como produzindo anticorpos com atividade ADCC maior devido à maior presença de bisecGlcNAc ou devido à infrarregulação drástica de fucose central.
Foi ainda mais surpreendente que o problema pôde ser solucionado por essa invenção usando células sanguíneas humanas imortalizadas e, particularmente, células mieloides, uma vez que foi anteriormente reportado que a linhagem celular K562 - uma célula leucêmica mieloide - não expressa a enzima para bisecGcINAc, uma descoberta que foi descrita e demonstrada pela hibridização gênica de GnTIII [Yoshimura M et ai., Cancer Res. 56(2): 412-8 (1996)] e expressa o gene FUT8, o qual expressa a fucosiltransferase, a qual causa adição de fucose central conforme demonstrado por RT-PCR [exemplo 1]. Foi surpreendente porque K562 não é resistente ao tratamento de lectina, uma vez que ela está ligada fortemente pela LCA de lectina, a base para as células negativas ou fortemente infrarregulada para fucosilação central. Devido a essa informação no perfil de glicosilação das células K 562, não poderia ser esperado que aquelas células pudessem melhorar a atividade dos anticorpos expressos ali, uma vez que foi assumido que a maquinaria de glicosilação necessária para um padrão de atividade favorável não estava presente. Também foi surpreendente que proteínas e, particularmente, anticorpos com atividade de ligação melhorada, homogeneidade melhorada e/ou maiores rendimentos possam ser gerados e alcançados com o método de produção da presente invenção em comparação com as células dos atuais sistemas de expressão.
A estratégia da invenção é gerar linhagens de células humanas adequadas para obter um sistema, o qual possa proporcionar produtos proteicos com um grupo inteiro de modificações pós-tradução o mais próximo possível do sistema humano, e deste modo propriedades não ou menos imunogênicas e/ou atividade melhorada no sistema humano. O objetivo é proporcionar um padrão de glicosilação feito sob medida para cada proteína/anticorpo a ser expresso.
Devido ao fato de que as estruturas dos carboidratos são muito complexas, de que a maquinaria de glicosilação das células compreende várias centenas de enzimas as quais estão envolvidas nas suas sínteses e que aquelas enzimas são principalmente espécies específicas e expressas por tecidos específicos, a principal estratégia dos inventores para obter uma glicosilação humana é proporcionar sistemas de expressão biotecnologicamente humanos adequados para expressar proteínas e, particularmente, anticorpos, com um padrão de glicosilação otimizado. Uma vez que o padrão de glicosilação otimizado pode diferir de proteína para proteína e de anticorpo para anticorpo, a invenção proporciona linhagens celulares produzindo diferentes padrões de glicosilação, permitindo dessa forma a seleção da linhagem celular para produção, a qual produz um padrão de glicosilação otimizado para o respectivo produto de proteína/anticorpo.
Deste modo, a invenção proporciona métodos biotecnologicamente favoráveis para a produção de composições proteicas e, particularmente, de composições de moléculas de anticorpo com atividade aumentada e/ou rendimento aumentado e/ou homogeneidade aumentada e glicosilação totalmente humana. Ela ainda proporciona novas células hospedeiras, ácidos nucleicos e composições de moléculas.
Deste modo, um método para a produção de uma composição proteica, preferivelmente uma composição de molécula de anticorpo com um padrão de glicosilação definido é fornecida, compreendendo as seguintes etapas:
(a) introduzir em uma célula sanguínea humana imortalizada como célula hospedeira pelo menos um ácido nucleico codificando uma proteína ou pelo menos uma parte da mesma; e (b) cultivar a referida célula hospedeira sob condições as quais permitam a produção da referida composição proteica; e (c) isolar a referida composição proteica com as características de glicosilação tencionadas.
Para obter uma composição proteica e particularmente uma composição de anticorpo com propriedades melhoradas de acordo com a presente invenção, a célula hospedeira é selecionada para produzir uma composição de proteína/anticorpo com pelo menos uma das seguintes características de glicosilação:
(i) ela não compreende NeuGc detectável.
Conforme foi esboçado acima, uma glicosilação NeuGc pode ter propriedades imunogênicas em seres humanos. Deste modo, é desejável evitar a glicosilação respectiva o tanto quanto for possível. Uma glicosilação respectiva é evitada pelo uso de células sanguíneas humanas imortalizadas e, particularmente, pelo uso de uma célula hospedeira de origem leucêmica mieloide humana.
(ii) ela tem um grau de glicosilação nas estruturas de carboidrato totais ou nas estruturas de carboidrato em um sítio de glicosilação particular da molécula proteica das moléculas de proteína na referida composição de molécula proteica que é aumentado em comparação com a mesma quantidade de moléculas de proteína em pelo menos uma composição de molécula proteica da mesma molécula proteica isolada de CHOdhfr-[ATCC No. CRL-9096] quando ali expressa.
Os resíduos de galactose são encontrados principalmente beta 1-4 ligados aos resíduos de GlcNAc nas antenas do complexo tipo N-glicano dos anticorpos, porém também ligações beta-1,3 foram encontradas. Entretanto, eles geralmente ocorrem em estruturas triantenadas. A influência do grau de galactosilação na atividade está particularmente envolvendo anticorpos notáveis. Foi demonstrado que a depleção de galactose leva à atividade CDC reduzida. Deste modo, pode ser preferível ter um alto grau de galactosilação. A galactosilação também pode desempenhar um papel importante para outras proteínas.
Ao se referir à estrutura de carboidrato total de uma molécula de proteína, todas as glicosilações da molécula proteica são consideradas. No caso das estruturas de carboidrato em um sítio de glicosilação particular da molécula proteica a ser analisada, o foco se baseia em estrutura(s) de carboidrato específica(s), tal(is) como, por exemplo, a(s) estrutura(s) de carboidrato ligada(s) ao Asn 297 da parte Fc de uma molécula de anticorpo (favor se referir à figura 18). No caso de uma estrutura específica respectiva ser avaliada, o teor/composição dessa estrutura específica é determinado. Alguém também poderia se referir às unidades de carboidrato totais e às cadeias de carboidrato particulares para definir as referidas características (são sinônimos).
(iii) ela tem uma quantidade de estruturas G2 nas estruturas de carboidrato total ou nas estruturas de carboidrato em um sítio de glicosilação particular da molécula proteica das moléculas de proteína na referida composição de molécula proteica a qual é pelo menos 5% mais alta em comparação com a mesma quantidade de moléculas de proteína em pelo menos uma composição de molécula proteica da mesma molécula proteica isolada a partir de CHOdhfr-[ATCC No. CRL-9096] quando ali expressa.
Particularmente, no caso de um anticorpo ser produzido de acordo com os métodos da presente invenção, uma alta quantidade de estruturas G2 é benéfica. Uma estrutura G2 define um padrão de glicosilação em que galactose é encontrada em ambas as extremidades da estrutura biantenada ligada à região Fc no caso de um anticorpo (favor se referir à figura 18). Se uma molécula de galactose for encontrada, ela é chamada de estrutura G1, se não houver galactose, ela é chamada de estrutura GO. Um padrão de glicosilação G2 foi comumente considerado como melhorando CDC dos anticorpos. Deste modo, é preferível que pelo menos uma quantidade 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 85%, 95% ou mesmo mais de 100% maior de estruturas G2 esteja presente na composição de proteína/anticorpo produzida. Linhagens celulares adequadas alcançando um alto padrão de glicosilação G2 respectivo são aqui descritas.
Uma vez que um grau de galactosilação global é geralmente benéfico para CDC dos anticorpos, é geralmente preferível obter 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mesmo mais do que 95% de estruturas G2 e/ou estruturas G1 nas estruturas de carboidratos total ou nas estruturas de carboidratos em um sítio de glicosilação particular da proteína, particularmente uma molécula de anticorpo.
De acordo com outra modalidade, mais de 35% (40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% ou mais de 70%) de estruturas G2 está presente nas estruturas de carboidratos total ou nas estruturas de carboidratos em um sítio de glicosilação particular da molécula proteica das moléculas de proteína na referida composição proteica.
(iv) ela tem uma quantidade de estruturas G0 nas estruturas de carboidrato total ou nas estruturas de carboidrato em um sítio de glicosilação particular da molécula proteica das moléculas de proteína na referida composição de molécula proteica a qual é pelo menos 5% mais baixa em comparação com a mesma quantidade de moléculas de proteína em pelo menos uma composição de molécula proteica da mesma molécula proteica isolada a partir de CHOdhfr-[ATCC No. CRL-9096] quando ali expressa.
Conforme esboçado acima, um alto grau de galactosilação é geralmente vantajoso. Deste modo, as linhagens celulares são preferivelmente selecionadas de modo que estruturas G0 sejam evitadas. A quantidade de estruturas G0 é preferivelmente menor do que 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou a quantidade é ainda mais baixa.
De acordo com outra modalidade, menos de 22% (20%, 18%, 15%, 12%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, menos de 5%) de estruturas G0 estão presentes nas estruturasde carboidratos total ou nas estruturas de carboidratos em um sítio de^cosilação particular da molécula de proteína das moléculas proteicas na «ferida composição proteica.
(v) ela nãBcompreende Galalpha1-3Gal terminal detectável.
Conforme Wesumido acima, uma glicosilação Galalpha1-3Gal pode ser imunogênica an seres humanos. Essa glicosilação caracteriza um padrão, em que um sqpindo resíduo de galactose está ligado na posição alfa-1,3 ao primeiro reáihjo de galactose, resultando no dissacarídeo galalfa 1-3 Gal altamente wunogênico. Através do uso de células sanguíneas humanas imortalizadas# particularmente de uma célula hospedeira de origem leucêmica mieloide humana, uma glicosilação desvantajosa respectiva é evitada.
(vi) ela compreende uma quantidade de fucose nas estruturas de carboidrato total ou nas estruturas de carboidrato em um sítio de glicosilação particular da molécula proteica das moléculas de proteína na referida composição de molécula proteica a qual é pelo menos 5% menor em comparação com a mesma quantidade de moléculas de proteína em pelo menos uma composição de molécula proteica da mesma molécula proteica isolada a partir de CHOdhfr-[ATCC No. CRL-9096] quando ali expressa.
Resíduos de fucose são encontrados em diferentes sítios na árvore N-glicano, particularmente:
- alfa 1,6 ligado ao resíduo GlcNAc próximo da fita de aminoácidos;
- alfa 1,3 e alfa 1,4 ligado ao resíduo GlcNAc localizado na antena;
- alfa 1,2 ligado ao resíduo Gal localizado na antena.
No anticorpo ligado aos N-glicanos a grande maioria dos resíduos de fucose é enconteada 1,6 ligada ao resíduo GlcNAc próximo (chamado de fucose central). Fbi descoberto que a ausência da fucose central na extremidade redutora do tM-glicano ligado aos anticorpos aumenta a atividade ADCC dos anticorpos por um fator de 25 a 100. Devido a este efeito benéfico em ADCC, é preferível que a quantidade de fucose seja pelo menos
10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 1000%, 1500% ou mais de 2000% menor em comparação com a mesma quantidade de moléculas de proteína em pelo menos uma composição de moléculas proteicas em pelo menos uma composição de moléculas proteicas da mesma molécula de proteína isolada de CHOdhfr-[ATCC No. CRL-9096] quando ali expressa. A presente invenção também proporciona linhagens celulares especialmente projetadas, as quais alcançam uma fucosilação global respectiva baixa.
De acordo com outra modalidade, a referida célula hospedeira é selecionada para produzir uma glicoproteína, compreendendo pelo menos 10% (15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% ou mais de 80%) de carboidratos das estruturas de carboidrato totais ou de pelo menos uma estrutura de carboidrato particular em um sítio de glicosilação particular da molécula de proteína das referidas moléculas proteicas na referida composição de moléculas de proteína, as quais não têm fucose. Em relação aos anticorpos, é particularmente preferido que as cadeias de carboidratos ligadas ao N-glicosídeo ligadas à região Fc compreendem uma extremidade redutora compreendendo GlcNAc, em que as cadeias de carboidratos não contêm fucose ligada à posição 6 de GlcNAc na extremidade redutora da cadeia de carboidratos.
(vii) ela compreende pelo menos uma estrutura de carboidratos contendo GlcNAc bifurcado.
N-acetilglicosamina bifurcada (bisGIcNAc) é geralmente encontrada beta 1,4 ligada ao resíduo de manose central da estrutura central de tri-manosil das N-glicanas encontradas nos anticorpos. A presença de GlcNAc bifurcada no resíduo de manose central do anticorpo Fc-N-glicano aumenta a atividade ADCC dos anticorpos.
De acordo com outra modalidade, a referida célula hospedeira é selecionada de modo que a referida proteína produzida compreenda mais estruturas de carboidratos das unidades do carboidrato total (ou de pelo menos uma cadeia de carboidrato particular em um sítio de glicosilação particular da molécula de proteína) das moléculas de proteína na referida composi ção de molécula proteica sem conter fucose e sem GlcNAc bifurcado do que aquelas estruturas de carboidratos respectivas as quais contêm GlcNAC bifurcado e sem-fucose.
De acordo com outra modalidade, a referida célula hospedeira é selecionada de modo que a referida proteína produzida compreenda mais estruturas de carboidratos das unidades do carboidrato total (ou de pelo menos uma cadeia de carboidrato particular em um sítio de glicosilação particular da molécula de proteína) das moléculas de proteína na referida composição de molécula proteica contendo mais GlcNAc bifurcada e fucose do que aquelas estruturas de carboidratos respectivas as quais contêm GlcNAC bifurcado e sem-fucose.
(viii) ela tem um padrão de sialilação o qual é alterado em comparação com o padrão de sialilação de pelo menos uma composição de molécula proteica da mesma molécula proteica isolada de CHOdhfr-[ATCC No. CRL-9096] quando ali expressa.
A influência do grau/padrão de sialilação na atividade, meia-vida e biodisponibilidade difere entre diferentes proteínas/anticorpos. Deste modo, é benéfico determinar para cada molécula de proteína/anticorpo o padrão de sialilação otimizado antecipadamente através do método de varredura de acordo com a presente invenção, antes de estabelecer a produção com a célula hospedeira mais adequada, fornecendo o padrão de glicosilação desejado. Por exemplo, várias publicações existem reportando o impacto negativo dos resíduos de ácido siálico presentes no Fc glicano dos anticorpos em efeitos a jusante, isto é, CDC e ADCC. Entretanto, foi descoberto que uma elevada sialilação prolonga a meia-vida das moléculas sialiladas. Deste modo, dependendo da proteína/anticorpo produzido, um diferente padrão de sialilação podería ser vantajoso e a presente invenção fornece linhagens de células sanguíneas humanas imortalizadas com diferentes atividades de sialilação, permitindo dessa forma obter proteínas/anticorpos descrevendo um padrão de glicosilação otimizado.
De acordo com uma modalidade, a célula hospedeira é selecionada de modo que ela produza uma proteína, com um grau de sialilação re duzido com uma quantidade pelo menos 10% (preferivelmente 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, >95%) menor de ácidos siálicos nas estruturas de carboidrato totais ou nas estruturas de carboidratos em um sítio de glicosilação particular da molécula de proteína das moléculas proteicas na referida composição de moléculas proteicas do que a mesma quantidade de moléculas proteicas em pelo menos uma composição de moléculas de proteína da mesma molécula proteica isolada de CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096] quando ali expressa. De acordo com uma modalidade, o produto compreende até mesmo nenhum NeuNAc detectável. Dependendo da proteína/anticorpo produzido, a presença de ácidos siálicos e particularmente NeuNAc pode não contribuir para a atividade da proteína/anticorpo. Nesses casos, pode ser favorável evitar a glicosilação dos ácidos siálicos para tornar o produto mais homogêneo. Isto uma vez que o padrão de glicosilação de NeuNAc pode também variar na composição proteica resultante. Isso pode causar dificuldades na aprovação regulatória do produto porque este ocorre devido à variação do teor de NeuNAc menos homogênea.
Para proteínas/anticorpos os quais não se baseiam na presença de uma glicosilação NeuNAc para as suas atividades, uma evitação de glicosilação NeuNAc pode ser benéfica para aumentar a homogeneidade. Entretanto, nenhum NeuNAc detectável não significa necessariamente que não existe absolutamente NeuNAc presente. De modo contrário, também as modalidades estão englobadas, as quais tem antes um grau mais baixo de NeuNAc (por exemplo, de 1 a 10%). Um exemplo de uma proteína respectiva é a FSH.
De acordo com uma modalidade, o produto tem um grau de sialilação reduzido com uma quantidade pelo menos 15% (20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, >500%) menor de NeuNAc nas estruturas de carboidrato totais ou nas estruturas de carboidratos em um sítio de glicosilação particular da molécula de proteína das moléculas proteicas na referida composição de moléculas proteicas do que a mesma quantidade de moléculas proteicas de pelo menos uma composição de moléculas de proteína da mesma molécula proteica isolada de CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096] quando ali expressa. Essa modalidade é benéfica no caso de uma proteína/anticorpo ser suspeito de ser expresso, em que a sialilação tem um efeito negativo na atividade da proteína/anticorpo.
Uma glicosilação respectiva (ausência ou grau muito baixo de ácido siálico ou particularmente NeuNAc) pode ser alcançada pelo uso de células deficientes de sialilação, tais como NM-F9 e NM-D4 em um meio sem-soro.
De acordo com outra modalidade, o produto tem um grau de sialilação aumentado com uma quantidade de NeuNAc nas estruturas de carboidrato totais ou nas estruturas de carboidratos em um sítio de glicosilação particular da molécula de proteína das moléculas proteicas na referida composição de molécula de proteína a qual é pelo menos 15% (20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450% ou mais de 500%) maior em comparação com a mesma quantidade de moléculas proteicas em pelo menos uma composição de moléculas de proteína da mesma molécula proteica isolada de CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096] quando ali expressa.
Conforme foi resumido acima, um grau aumentado respectivamente de sialilação pode proporcionar um efeito positivo da meia-vida no soro da proteína através de seu prolongamento. Nesses casos, é preferível usar uma linhagem celular a qual proporcione um grau mais alto de sialilação do que o alcançado nas células CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096] e o qual também proporcione um grau mais elevado de sialilação do que o alcançado nas células deficientes de sialilação (tais como, por exemplo, NMF9 e NM-D4), em que um precursor precisa ser adicionado para permitir que a sialilação ocorra. Entretanto, mesmo se um precursor respectivo for adicionado durante o crescimento dessas células deficientes de sialilação, essas células geralmente não alcançam cerca de 50 a 60% do grau de sialilação que é obtido com as células sanguíneas humanas imortalizadas sem mutação/defeito genético na maquinaria de glicosilação necessária para a sialilação. Deste modo, para modalidades, em que um grau mais alto de sialilação é objetivado, é preferível usar linhagens celulares capazes de proporcionar um respectivo alto grau de sialilação e não usar NM-F9 e nem NMD4.
De acordo com outra modalidade, o produto compreende NeuNAc alfa 2-6 ligado. Adicionalmente, NeuNac alfa2-3 ligado pode estar presente a algum grau. Em relação a algumas proteínas/anticorpos, a presença de uma glicosilação NeuNAc é benéfica particularmente em relação à meiavida da proteína/anticorpo. Para fornecer uma NeuNAc alfa 2-6 ligada benéfica, uma vez que esse padrão de glicosilação lembra um padrão de glicosilação humano. As células dos roedores geralmente proporcionam uma NeuNAc alfa 2-3 ligada. Também outras linhagens celulares humanas existentes não são capazes de proporcionar uma NeuNAc glicosilação alfa 2-6 ligada suficiente.
São linhagens celulares adequadas para proporcionar um padrão de glicosilação respectivo NM-H9D8 e NM-H9D8-E6.
De acordo com outra modalidade, uma célula hospedeira é usada, a qual produz uma proteína compreendendo pelo menos 20% a mais de cadeias de carboidrato N-glicosidicamente ligadas carregadas das unidades de carboidrato totais ou de pelo menos uma cadeia de carboidrato particular em um sítio de glicosilação particular da molécula de proteína das referidas moléculas proteicas na referida composição de molécula proteica em comparação com a mesma quantidade de moléculas de proteína em pelo menos uma composição de moléculas proteicas da mesma molécula de proteína isolada de CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096] quando ali expressa.
O perfil de carga de uma cadeia de carboidratos pode também influenciar as propriedades e deve ser, deste modo, considerado. Grupos químicos com cadeias de carboidrato carregadas são, por exemplo, grupos sulfurosos ou ácido siálico.
De acordo com uma modalidade alternativa, o referido produto compreende pelo menos 20% a menos de cadeias de carboidrato Nglicosidicamente ligadas carregadas das unidades de carboidrato totais ou de pelo menos uma cadeia de carboidrato particular em um sítio de glicosilação particular da molécula de proteína das referidas moléculas proteicas na referida composição de molécula proteica em comparação com a mesma quantidade de moléculas de proteína em pelo menos uma composição de moléculas proteicas da mesma molécula de proteína isolada de CHOdhfr[ATCC No. CRL-9096] quando ali expressa.
De acordo com outra modalidade, a referida célula hospedeira é selecionada para produzir uma glicoproteína, compreendendo pelo menos 2% (5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% ou mais de 45%) de estruturas de carboidratos das unidades de carboidratos totais ou de pelo menos uma cadeia de carboidratos particular em um sítio de glicosilação particular da molécula de proteína das moléculas proteicas na referida composição de molécula de proteína a qual contém GlcNAC bifurcado.
De acordo com uma modalidade, uma célula hospedeira é usada para a produção da proteína, a qual apresenta as seguintes propriedades
- ela tem uma atividade aumentada, rendimento aumentado e/ou homogeneidade aumentada em comparação com pelo menos uma composição da molécula de proteína da mesma molécula de proteína quando expressa na linhagem celular CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096]; e/ou
- ela tem uma média aumentada ou rendimento máximo o qual é pelo menos 10% maior do que o rendimento de pelo menos uma composição de molécula proteica para a mesma molécula de proteína quando expressa na linhagem celular CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096]; e/ou
- ela tem uma homogeneidade melhorada, a qual é uma homogeneidade de glicosilação melhorada em que a composição de molécula do anticorpo tem um grau de sialilação menor do que o grau de sialilação de pelo menos uma composição da molécula do anticorpo a partir da mesma molécula de anticorpo quando expressa na linhagem celular CHOdhfr-[ATCC No. CRL-9096]; e/ou
- no caso da referida molécula proteica ser uma molécula de anticorpo, ela tem uma citotoxicidade celular mediada por Fc aumentada a qual é pelo menos 2 vezes maior do que a citotoxicidade celular mediada por Fc de pelo menos uma composição da molécula de anticorpo a partir da mesma molécula de anticorpo quando expressa na linhagem celular CHOdhfr-[ATCC No. CRL-9096]; e/ou
- no caso da molécula de proteína ser uma molécula de anticorpo, ela tem uma ligação mediada por Fc ou mediada por antígeno aumentada a qual é pelo menos 50% maior do que a ligação de pelo menos uma composição da molécula de anticorpo a partir da mesma molécula de anticorpo quando expressa na linhagem celular CHOdhfr- [ATCC No. CRL9096],
Conforme foi resumido acima, as propriedades respectivas podem ser obtidas através da otimização da glicosilação da proteína, conforme aqui descrito. Foi surpreendente observar que também o perfil de ligação pode ser alterado e melhorado com algumas modalidades baseando-se no perfil de glicosilação. Células hospedeiras adequadas também são aqui descritas.
De acordo com outra modalidade, a homogeneidade melhorada da referida composição da molécula de proteína é uma homogeneidade de glicosilação melhorada da referida composição de molécula proteica compreendendo pelo menos uma das seguintes características:
- sem NeuGc detectável;
- sem NeuNAc detectável;
- mais NeuNAc do que uma composição de molécula proteica a partir da mesma molécula proteica quando expressa na linhagem celular CHOdhfr-[ATCC No. CRL-9096];
- NeuNAc alfa 2-6 ligado detectável.
De acordo com outra modalidade, a referida célula hospedeira é selecionada para produzir uma composição proteica compreendendo moléculas de proteína com um dos seguintes padrões de glicosilação característicos:
(a)
- ela não compreende NeuGc detectável;
- ela não compreende Galalfa1-3Gal detectável;
- ela compreende um padrão de galactosilação conforme definido na reivindicação 2;
- ela tem um teor de fucose conforme definido na reivindicação 2;
- ela compreende bisecGIcNAc;
- ela compreende uma quantidade aumentada de ácido siálico em comparação com uma composição proteica da mesma molécula proteica quando expressa na linhagem celular CHOdhfr-[ATCC No. CRL-9096] ou em comparação com uma linhagem celular deficiente de sialilação, tal como NM-F9 e NM-D4.
(b)
- ela não compreende NeuGc detectável;
- ela não compreende Galalpha1-3Gal detectável;
- ela compreende um padrão de galactosilação conforme definido na reivindicação 2;
- ela tem um teor de fucose conforme definido na reivindicação 2;
- ela compreende bisecGIcNAc;
- ela compreende uma quantidade reduzida de ácido siálico em comparação com uma composição proteica da mesma molécula proteica quando expressa na linhagem celular CHOdhfr-[ATCC No. CRL-9096].
(c)
- ela não compreende NeuGc detectável;
- ela não compreende Galalpha1-3Gal detectável;
- ela compreende um padrão de galactosilação conforme definido na reivindicação 2;
- ela tem um teor de fucose conforme definido na reivindicação 2;
- ela compreende bisecGIcNAc;
- ela compreende 2-6 NeuNAc.
Outras combinações de características adequadas que levam a características melhoradas estão descritas na Tabela 9.
De acordo com a presente invenção, o termo molécula proteica significa a proteína de interesse ou fragmentos ativos e/ou mutantes seus, por meio dos quais uma proteína pode ser usada, preferivelmente qualquer glicoproteína de origem humana. O termo molécula proteica significa qualquer molécula de polipeptídeo ou uma parte da mesma. Ela pode ser codificada por um ou vários ácidos nucleicos. Ela pode ser produzida de um modo secretório ou uma fração sua ou uma proteína de fusão com um parceiro de fusão. Preferivelmente, a proteína é secretada no sobrenadante. Essa modalidade é particularmente benéfica considerando o processo de produção global, como, por exemplo, as etapas de derramamento (por exemplo, com ésteres forbol) podem ser evitados.
Exemplos de glicoproteínas de mamíferos incluem moléculas, tais como citocinas e seus receptores, por exemplo, os fatores de necrose tumoral TNF-alfa e TNF-beta; renina; hormônio do crescimento humano e hormônio do crescimento bovino; fator de liberação do hormônio de crescimento; hormônio de paratireoide; hormônio estimulador da tireóide; lipoproteínas; alfa-1-antitripsina; cadeia A e cadeia B de insulina; gonadotrofinas, por exemplo, hormônio folículo estimulante (FSH), hormônio luteinizante (LH), tirotrofina e gonadotrofina coriônica humana (hCG); calcitonina; glucagon; fatores de coagulação, tais como fator VIIIC, fator IX, fator VII, fator tecidual e fator de Von Willebrands; fatores anticoagulantes tal como proteína C; fator natriurético atrial; tensoativo pulmonar; ativadores do plasminogênio, tal como uroquinase, ativador do plasminogênio tipo tecidual e urina humana; bombesina; trombina; fator do crescimento hematopoiético; encefalinase; proteína inflamatória do macrófago humano; albumina do soro, tal como albumina do soro humana; substância inibidora de Müller; cadeia A e cadeia B da relaxina; prorrelaxina; peptídeo associado à gonadotrofina de camundongo; fator de crescimento endotelial vascular; receptores de hormônios ou fatores de crescimento; integrina; proteína A e D; fatores da reumatoide; fatores neurotróficos tais como fator neurotrófico derivado ósseo, neurotrofina 3, 4, 5, 6 e beta-fator de crescimento de nervos; fator de crescimento derivado de plaquetas; fatores de crescimento do fibroblasto; fator de crescimento epidérmico; fator transformador de crescimento, tal como TGF-alfa e TGFbeta; fator de crescimento tipo insulina I e II; proteínas de ligação ao fator de crescimento tipo insulina; proteínas CD, tal como CD-3, CD-4, CD-8 e CD19; eritropoietina (EPO); fatores osteoindutores; imunotoxinas; uma proteína morfogenética óssea; um interferon, tal como interferon alfa, beta e gama; fatores estimuladores de colônia (CSFs); por exemplo, M-CSF, GM-CSF e G-CSF; interleucinas (ILs), por exemplo, IL-1 até IL-12; superóxido desmutase; receptores de células T; proteínas da membrana de superfície; fator acelerador de decaimento/ anticorpos e imunoadesinas; glicoforina A; MUC1.
Muitas das glicoproteínas acima mencionadas pertencendo às citocinas aqui se referindo à classe geral de hormônios ocorrendo nas células do sistema imune, tanto linfocinas quanto monocinas, e outros. A definição é tencionada a incluir, porém não está limitada, àqueles hormônios que agem localmente e que não circulam no sangue, e os quais, quando usados de acordo com a presente invenção, irão resultar na aceleração da resposta imune individual. Exemplos de outras citocinas imunomodulatórias adequadas incluem, porém não estão limitados, aos interferons (por exemplo, IFNalfa, IFN-beta e IFN-gama), interleucinas (por exemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10 e IL-12), fatores de necrose tumoral (por exemplo, TNF-alfa e TNF-beta), eritropoietina (EPO), ligante FLT-3, fator estimulante de colônias de macrófago (M-CSF), fator estimulante e colônia de granulócito (G-CSF), fator estimulante de colônia de granulócito-macrófago (GM-CSF), CD2 E ICAM. Tomando-se a eritropoietina, acredita-se que a molécula faça com que as células progenitoras amadureçam nos eritrócitos, enquanto que se acredita que a trombopoietina direcione as células progenitoras ao longo da via trombocítica. CSF se refere a uma família de linfocinas as quais incluem as células progenitoras encontradas na medula óssea para se diferenciarem em tipos específicos de células sanguíneas maduras. O tipo particular de célula sanguínea madura que resulta de uma célula progenitora depende do tipo de CSF presente. Semelhantemente, a formação de colônias de granulócito-macrófago é dependente da presença de GM-CSF. Adicionalmente, as citocinas de outros mamíferos com homologia substanci al às formas humanas de IL-2, GM-CSF, TNF-alfa e outras serão úteis na invenção quando demonstradas como exibindo atividade similar no sistema imune. Moléculas de adesão ou acessórias ou suas combinações podem ser empregadas sozinhas ou em combinação com as citocinas.
Semelhantemente, as proteínas que são substancialmente análogas a qualquer proteína particular, porém apresentam alterações relativamente mínimas da sequência de proteína, irão encontrar uso na presente invenção. É bem sabido que algumas pequenas alterações na sequência de aminoácidos na sequência proteica podem ser geralmente possíveis sem perturbar as capacidades funcionais da molécula proteica, e deste modo as proteínas podem ser feitas do modo da função das proteínas paternas na presente invenção, porém diferindo levemente das sequências atualmente conhecidas. Variantes respectivas mantendo a função biológica são deste modo também incluídas.
Glicoproteínas preferidas são selecionadas do grupo consistindo em glicoforina A, EPO, G-CSF, GM-CSF, FSH, hCG, LH, interferons, interleucinas, anticorpos e/ou fragmentos seus.
Todas as moléculas proteicas mencionadas acima podem ser fundidas com outras sequências peptídicas ou polipeptídicas tais como, porém sem se limitar, a ligantes, moléculas ativantes ou toxinas.
Em uma modalidade preferida da invenção, o ácido nucleico codifica uma forma secretória da proteína ou fragmento seu. Em uma modalidade preferida, a forma secretória não tem domínios transmembranares.
De acordo com a presente invenção, o termo composição de molécula proteica significa as moléculas de qualquer molécula proteica expressas de acordo com os métodos da presente invenção e, particularmente, em uma célula hospedeira da invenção a qual possa ser isolada. A referida composição de molécula proteica compreende pelo menos uma molécula proteica. A referida composição proteica compreende pelo menos uma glicoforma de uma molécula proteica. A referida qlicoforma de uma molécula proteica significa uma molécula proteica a qual carregue uma glicosilação particular ou cadeia de carboidrato a qual seja diferente em pelo menos um bloco de construção de açúcar, por exemplo, porém sem se limitar, a uma galactose, ácido siálico, bisecGIcNAc, fucose ou outra modificação de açúcar adicional, tal como, porém sem se limitar, a acetilação ou sulfatação de outra glicoforma da mesma molécula protéica. Em outra modalidade da invenção, a composição da molécula protéica pode compreender moléculas de mais de uma molécula protéica expressa em uma célula hospedeira. Em uma modalidade preferida, a composição da molécula protéica da invenção compreende mais moléculas em porcentagem de tal glicoforma ou tais glicoformas da molécula protéica, a qual medeia uma atividade mais elevada do que uma composição de molécula protéica da mesma molécula de proteína obtida a partir de pelo menos uma das linhagens celulares CHO, ou CHOdhfr-, ou BHK, ou NSO, ou SP2/0, ou PerC.6 ou hibridoma de camundongo, preferivelmente CHOdhfr-[ATCC No. CRL-9096], quando ali expresso. Em outra modalidade preferida, a composição da molécula protéica da invenção compreende mais moléculas de tal glicoforma ou glicoformas da molécula proteica em uma porcentagem a qual medeia uma atividade maior do que a composição da molécula protéica da mesma molécula protéica obtida a partir das linhagens celulares CHO, ou CHOdhfr-, ou BHK, ou NSO, ou SP2/0 ou PerC.6 ou hibridoma de camundongo, preferivelmente CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096], quando ali expressos.
De acordo com a presente invenção, o termo molécula de anticorpo significa qualquer anticorpo inteiro ou fragmento de anticorpo ou uma molécula compreendendo um fragmento de anticorpo. O referido anticorpo inteiro pode ser qualquer anticorpo ou molécula de imunoglobulina de qualquer classe ou subclasse ou qualquer molécula compreendendo pelo menos um domínio de imunoglobulina conhecido pelas pessoas versadas na técnica compreendendo, porém sem se limitar, a IgG, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgM, IgA, IgD de origem animal, tal como, porém sem se limitar, a seres humanos, símios, roedores, camundongos, rato, hamster, coelho, camelo, aves, galinhas ou de origem de tubarões, e também pode ser uma molécula a qual compreenda sequências de proteínas a partir de anticorpos que se originem de vários animais, tais como anticorpos quiméricos ou humanizados onde várias porcentagens de, por exemplo, sequências de murino e humanas são combinadas em, anticorpos inteiros e/ou são modificadas, por exemplo, para reduzir a imunogenicidade ou aumentar a afinidade conforme é conhecido pelas pessoas versadas na técnica. Em outra modalidade da in5 venção, o referido anticorpo inteiro pode também ser o anticorpo inteiro acima descrito com pelo menos uma sequência polipeptídica ou de aminoácido adicional.
Em uma modalidade preferida, o referido anticorpo inteiro é um ser humano, humanizado ou IgG, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, ou IgM, o qual 10 compreende uma região Fc humana. Em uma modalidade ainda mais preferida da invenção, o referido anticorpo inteiro é um ser humano, humanizado ou lgG1, lgG4 ou IgM com uma região Fc humana. A referida região Fc humana compreende pelo menos uma sequência de 20 aminoácidos, mais preferivelmente de pelo menos 100 aminoácidos de um domínio constante da 15 região Fc de um anticorpo humano, preferivelmente ela compreende pelo menos um domínio Fc de um anticorpo humano, mais preferivelmente ela compreende o domínio Cgama2 humano, e mais preferivelmente ela compreende todos os domínios constantes da região Fc de um anticorpo humano de certa classe ou subclasse. A referida região Fc humana também pode 20 compreender sequências humanas das quais pelo menos um aminoácido tenha sido modificado.
Na modalidade mais preferida da invenção, a molécula de anticorpo inteira é ou (i) um anticorpo humano completo gerado, por exemplo, de um anticorpo humano produzindo células sanguíneas ou células ou de 25 um camundongo transgênico no qual o local do gene do anticorpo de camundongo é pelo menos parcialmente trocado pelas sequências de anticorpo humano, ou (ii) um anticorpo inteiro humanizado no qual pelo menos partes das regiões variáveis de um anticorpo de rato ou murino, tais como as regiões estruturais de pelo menos um aminoácido e uma estrutura, foram 30 trocados com sequências humanas ou modificadas para serem menos imunogênicos em seres humanos, o qual compreende domínios constantes humanos, ou (iii) um anticorpo inteiro quimérico no qual a região variável é de murino ou rato e compreende domínios constantes humanos.
Os referidos anticorpos completamente humanos, anticorpos inteiros humanizados e anticorpos inteiros quiméricos ou suas partes, assim como os métodos para construir, identificar, testar, otimizar e selecionar essas moléculas de anticorpo com ou sem sequências adicionais adequadas, assim como métodos para construir, identificar, testar e selecionar a maioria dos ácidos nucleicos adequados codificando essas moléculas de anticorpo são conhecidos pelas pessoas versadas na técnica.
O referido fragmento e anticorpo é qualquer fragmento de um anticorpo compreendendo pelo menos 20 aminoácidos do referido anticorpo inteiro, preferivelmente pelo menos 100 aminoácidos. Em uma modalidade preferida, o fragmento de anticorpo compreende a região ligante do anticorpo, tal como Fab, um F(ab)2, multicorpos compreendendo múltiplos domínios de ligação tais como diacorpos, triacorpos ou tetracorpos, aficorpos ou anticorpos de domínio único. Em outra modalidade preferida, o fragmento de anticorpo compreende a região Fc com todo ou partes dos seus domínios constantes, preferivelmente compreendendo o segundo domínio (domínio Cgama2). Em outra modalidade, o fragmento de anticorpo é um anticorpo inteiro cortado onde pelo menos um aminoácido, trechos polipeptídicos ou domínios inteiros são anulados. Aquelas moléculas podem ser combinadas com sequências adicionais para estabilização ou para melhorar a ligação das moléculas, tais como ligantes.
A referida molécula compreendendo um fragmento de anticorpo é qualquer molécula a qual compreende qualquer um dos referidos fragmentos de anticorpo ou outros domínios de imunoglobulina de pelo menos 20 aminoácidos. Em uma modalidade preferida, a referida molécula compreendendo um fragmento de anticorpo são moléculas de fusão, onde um fragmento de anticorpo é fundido com outras sequências proteicas, tais como com sequências efetoras, por exemplo, citocinas, fatores coestimulatórios, toxinas ou fragmentos de anticorpo de outros anticorpos para gerar moléculas com múltiplas especificidades de ligação, tais como anticorpos bi ou triespecíficos, ou sequências de multimerização tais como domínios MBP (pro teína de ligação a manam) para resultar na multimerização dos domínios de ligação, ou sequências para detecção, purificação, secreção ou estabilização, tais como etiquetas, sinais de localização ou ligantes, ou similares. Em outra modalidade preferida, a referida molécula compreendendo um fragmento de anticorpo são moléculas de fusão compreendendo a região Fc de um anticorpo inteiro ou suas partes, preferivelmente compreendendo o segundo domínio constante (domínio Cgama2). AS referidas moléculas de fusão são fundidas por meios genéticos, onde as moléculas são codificadas por um ácido nucleico ou são fundidas pela coexpressão de pelo menos dois ácidos nucleicos por meio do qual a fusão é causada por interações de proteínas não-covalentes ou covalentes ou são fundidas por uma combinação de ambas. A fusão genética entre um fragmento de anticorpo e outra sequência polipeptídica ou molécula proteica pode ser alcançada por engenharia genética, onde ambas as partes são codificadas por um ácido nucleico único com ou sem aminoácidos adicionais entre eles. Em outra modalidade preferida, as referidas moléculas de fusão compreendem pelo menos uma região de ligação de um fragmento de anticorpo, tal como de um único domínio de anticorpo, ou Fab ou uma sequência de ligação não derivada dos anticorpos, tal como um domínio de lectina, e uma região Fc ou suas partes compreendendo o segundo domínio (domínio Cgama). Em outra modalidade preferida, as moléculas de fusão compreendem IL-2, IL-12, IL-15, GM-CSF uma toxina peptídica ou suas partes. Elas estão, por exemplo, fundidas por meios genéticos, onde as moléculas são codificadas por um ácido nucleico ou são fundidas pela coexpressão de pelo menos dois ácidos nucleicos por meio do que a fusão é causada por interações proteicas não-covalentes ou covalentes ou são fundidas por um comion de fragmento de anticorpo, tal como um anticorpo de domínio único, Fab ou Fab o qual esteja ligado a uma sequência de multimerização do MBP.
Todas aquelas moléculas de anticorpo ou suas partes, assim como os métodos para construir, identificar, testar e selecionar essas moléculas de anticorpo com ou sem sequências adicionais estáveis, assim como métodos para construir, identificar, testar e selecionar a maioria dos ácidos nucleicos adequados codificando essas moléculas de anticorpo são conhecidos pelas pessoas versadas na técnica.
De acordo com a presente invenção, o termo composição de molécula de anticorpo significa as moléculas de qualquer molécula de anticorpo expressas em uma célula hospedeira da invenção, a qual pode ser isolada. A referida composição da molécula de anticorpo compreende pelo menos uma molécula de anticorpo. A referida composição de anticorpo compreende pelo menos uma glicoforma de uma molécula de anticorpo. A referida glicoforma de uma molécula de anticorpo significa uma molécula de anticorpo a qual carrega uma cadeia de carboidratos ou glicosilação particular a qual é diferente em pelo menos um bloco de construção de açúcar, por exemplo, mas sem se limitar, a uma galactose adicional, ácido siálico, bisecGIcNAc, fucose ou outra modificação de açúcar, tal como, porém sem se limitar, a acetilação ou sulfatação de outra glicoforma da mesma molécula de anticorpo. Em outra modalidade da invenção, a composição da molécula de anticorpo pode compreender moléculas de mais de uma molécula de anticorpo expressas em uma célula hospedeira. Em uma modalidade preferida, a composição da molécula de anticorpo da invenção compreende mais moléculas em porcentagem de tal glicoforma ou tais glicoformas da molécula de anticorpo, as quais medeiam uma citotoxicidade celular mediada por Fc maior e/ou uma ligação aumentada em relação a uma composição de molécula de anticorpo da mesma molécula de anticorpo obtida a partir de pelo menos uma das linhagens celulares CHO, ou CHOdhfr-, ou BHK, ou NSO, ou SP2/0, ou PerC.6 ou hibridoma de camundongo, preferivelmente CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096], quando all expressas. Em outra modalidade preferida, a composição da molécula de anticorpo da invenção compreende mais moléculas de tal glicoforma ou glicoformas da molécula de anticorpo em porcentagem, as quais medeiam uma citotoxicidade celular mediada por Fc maior e/ou uma ligação aumentada em relação a uma composição de molécula de anticorpo da mesma molécula de anticorpo obtida a partir das linhagens celulares CHO, ou CHOdhfr-, ou BHK, ou NSO, ou SP2/0, ou PerC.6 ou hibridoma de camundongo, preferivelmente CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096], quando ali expressas.
De acordo com a presente invenção, o termo célula hospedeira de origem leucêmica mieloide humana ou formulações equivalentes significa qualquer célula ou linhagem celular de origem leucêmica mieloide humana, ou qualquer célula precursora mieloide ou mieloide humana ou linhagem celular a qual possa ser obtida a partir de um paciente com leucemia, ou qualquer célula precursora mieloide ou mieloide ou linhagem celular a qual possa ser obtida a partir de um doador humano, ou uma célula ou linhagem celular derivada a partir de qualquer uma das referidas células hospedeiras, ou uma mistura de células ou linhagens celulares compreendendo pelo menos uma daquelas células acima mencionadas.
Em outra modalidade da invenção, a referida célula hospedeira de origem leucêmica mieloide humana ou a referida célula sanguínea humana imortalizada da invenção também compreende tais células ou linhagens celulares as quais foram obtidas pela fusão de pelo menos uma das células hospedeiras acima mencionadas, particularmente aquelas de origem leucêmica mieloide humana com outra célula de origem humana ou animal, tal como, porém sem se limitar, às células B, células CHO. As pessoas versadas na técnica são capazes de identificar e usar fontes adequadas e métodos para obter, gerar e/ou imortalizar células adequadas e linhagens celulares de seres humanos para células hospedeiras adequadas de origem leucêmica mieloide humana.
O termo célula ou linhagem celular derivada da referida célula hospedeira significa qualquer célula ou linhagem celular a qual possa ser obtida através do cultivo e clonagem com ou sem mutação prévia ou engenharia genética da referida célula hospedeira de origem mieloide humana e compreende a seleção daquelas células ou linhagens celulares derivadas da referida célula hospedeira com as propriedades desejadas. O referido cultivo e clonagem é baseado no fato de que os clones de células com diferentes propriedades podem ser obtidos a partir de culturas de células primárias, culturas de células e mesmo culturas de clones de células por vários ciclos de passagem e clonagem das células usando preferivelmente métodos de clonagem de células únicas, tais como diluição limitada ou escolha de células baseada em citometria de fluxo. Em uma modalidade preferida, a referida célula ou linhagem celular derivada das referidas células hospedeiras é selecionada pela ligação a um anticorpo de ligação a carboidrato ou lectina. A referida mutação pode ser efetuada por um tratamento conhecido pelas pessoas versadas na técnica com mutágenos, tais como, porém sem se limitar, a radiação, agentes de alquilação ou EMS (etilmetanossulfonato), proteínas tais como lectinas ou partículas virais. A referida engenharia genética pode ser efetuada por métodos conhecidos pelas pessoas versadas na técnica, tais como nocaute ou genes através de recombinação de homólogos sítioespecífica, uso de transposons, mutagênese sítio-específica, transfeçção e certos ácidos nucleicos ou silenciamento de genes, ou produtos de genes. Métodos para o referido cultivo e clonagem, a referida mutação e mutágenos e a referida engenharia genética são conhecidos pelas pessoas versadas na técnica e alguns exemplos estão descritos detalhadamente em W02005/017130 A2, US 2003/0115614 A1 ou estão aqui descritos. As pessoas versadas na técnica são capazes de selecionar e/ou adotar e/ou modificar um método adequado ou combinação de métodos para a geração de uma célula ou linhagem celular adequada derivada da referida célula hospedeira da invenção.
A referida célula ou linhagens celulares derivadas da referida célula hospedeira são selecionadas devido às propriedades daquelas células as quais são vantajosas em comparação com as suas células ou linhagens celulares de origem, tais como, porém sem se limitar, a tempos de duplicação dobrados, crescimento mais rápido, possibilidade de crescer sob elevadas densidades, maior produtividade, crescimento sob condições sem-soro e/ou em meio sem-proteína, maiores eficiências de clonagem, maiores eficiências de transfeçção para DNA, maiores taxas de expressão das composições de moléculas de anticorpo, maiores atividades para uma composição da molécula de anticorpo ali expressa, maiores homogeneidades de uma composição de molécula de anticorpo ali expressa e/ou melhor robustez ao acúmulo. Métodos para selecionar aquelas células com propriedades vanta josas são conhecidos pelas pessoas versadas na técnica ou são aqui descritos. A invenção proporciona um método para gerar uma célula hospedeira da invenção, compreendendo (a) a incubação de uma célula de leucemia mieloide humana com uma lectina ou um anticorpo reconhecendo um etitopo dessialilado ou um etitopo sem um ácido siálico, porém o qual não se ligue ou se ligue significativamente menos do que a forma sialilada do etitopo, e (b) isolamento das células ligadas à referida lectina ou anticorpo, e (c) o cultivo das células isoladas por m período de tempo adequado, è (d) a seleção de uma célula, células ou de um clone celular o qual se ligue fortemente a uma lectina ou a um anticorpo o qual se ligue a um etitopo com ácido siálico.
É mais preferido o método conforme descrito acima, em que a referida lectina ou o referido anticorpo reconhecendo um etitopo dessialilado ou um etitopo sem um ácido siálico é Nemod-TF1, Nemod-TF2, A78-G/A7, ou PNA, e em que a referida célula de leucemia mieloide humana é a linhagem celular K562, KG-1, MUTZ-3, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-H9, H9, NM-H10.
O método para gerar uma célula hospedeira da invenção com elevada sialilação e propriedades biotecnológicas favoráveis, tais como rápido crescimento celular compreendendo (i) incubação de uma célula de leucemia mieloide humana da invenção como célula de origem, preferivelmente K562, com uma lectina ou preferivelmente um anticorpo reconhecendo um etitopo dessialilado ou um etitopo sem um ácido siálico, porém o qual não se ligue ou se ligue menos à forma sialilada do etitopo, tal como, porém sem se limitar, a Nemod-TF1, Nemod-TF2, A78-G/A7, ou PNA (lectina de Arachis hypogaea, aglutinina de amendoim), preferivelmente ligado a contas magnéticas, e (ii) o isolamento de células ligadas à referida lectina ou anticorpo, e (iii) o cultivo das células isoladas por um tempo adequado, e (iv) a seleção da célula, células ou um clone celular, preferivelmente depois da clonagem de célula única, a qual se liga fortemente a uma lectina ou um anticorpo o qual se liga a um etitopo com ácido siálico, tal como SNA (aglutinina de Sambucus nigra) ou MAL (lectina de Maackia amurensis), MAL I (lectina I de Maackia amurensis), preferivelmente SNA.
Em uma modalidade preferida, a invenção proporciona um método para gerar uma célula hospedeira da invenção com elevada sialilação e propriedades biotecnológicas favoráveis, tais como rápido crescimento celular compreendendo (i) incubação de K562 com Nemod-TF1, Nemod-TF2, A78-G/A7, ou PNA ligado a contas magnéticas, e (ii) o isolamento de células ligadas à referida lectina ou anticorpo, e (iii) o cultivo das células isoladas por um tempo adequado de cerca de uma a 6 semanas, e (iv) a seleção de um clone celular depois da clonagem de célula única, a qual se liga fortemente a SNA. Em uma modalidade preferida, aquelas células se ligam mais fortemente a SNA do que a célula de origem, e em outra modalidade preferida elas crescem mais rapidamente do que a célula de origem.
Em uma modalidade preferida da invenção, a célula de origem é tratada com etilmetanossulfonato antes da etapa (i).
As pessoas versadas na técnica são capazes de selecionar condições adequadas e métodos e otimizá-los para gerar essas células hospedeiras no sentido da invenção. Mais detalhes para alguns das etapas podem ser encontrados em W02005/017130 A2 e W02005/080585 A1.
De acordo com uma modalidade, as células sanguíneas humanas imortalizadas são usadas como células hospedeiras, as quais são selecionadas a partir dos seguintes grupos 1 a 4:
(a) grupo 1, compreendendo células hospedeiras com atividade de sialilação elevada, tal como K562;
(b) grupo 2, compreendendo células hospedeiras tendo devido a uma deficiência genética ou meios de inibição de expressão (por exemplo, RNAi) uma baixa ou ausente sialilação; atividade comparável a e incluindo NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605] e GT-2X;
(c) grupo 3, compreendendo células hospedeiras com um grau de sialilação maior do que K562, tal como NM-H9 e NMH9D8;
(d) grupo 4, compreendendo células hospedeiras com uma atividade baixa ou ausente de fucosilação, tais como NM
H9D8-E6 e NM-H9D8-E6Q12.
Em uma modalidade preferida, a referida linhagem celular gerada é NM-H9D8. Como o clone celular mais preferido gerado pelo método descrito acima, NM-H9D8 foi selecionado e depositado sob DSM ACC 2806 em DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH em Braunschweig (Alemanha), por Glycotope GmbH, Robert-Rõssle-Str. 10, 13125 Berlim (Alemanha) em 15 de setembro de 2006. Outros clones celulares, tais como NM-E-2F9, NM-C-2F5, ou NM-H9D8-E6 (DSM ACC 2807) foram selecionados por incubação das células de origem com uma ou mais lectinas e após a clonagem celular única usando escolha de células por citometria de fluxo por meio do qual um procedimento de seleção positivo ou uma combinação de seleções negativa e positiva foi efetuada. Para obter clones celulares com características estáveis os clones celulares obtidos foram reclonados pelo menos uma vez por diluição limitada conforme descrito acima.
Em uma modalidade preferida da invenção, a referida célula sanguínea humana imortalizada, a qual é preferivelmente uma célula hospedeira de origem de leucemia mieloide, cresce e produz a composição da molécula de proteína/anticorpo da invenção sob condições sem-soro. Em uma modalidade ainda mais preferida, a referida célula sanguínea humana imortalizada, a qual é preferivelmente uma célula hospedeira de origem mieloide humana cresce sob condições sem-soro. Além disso, também o ácido nucleico codificando a molécula de proteína/anticorpo pode ser introduzido nessas células e a composição da molécula de proteína/anticorpo pode também ser isolada sob condições sem-soro. A possibilidade de se trabalhar sob condições sem-soro é particularmente importante ao preparar proteínas terapêuticas, uma vez que contaminações com soro são inaceitáveis no processo regulatório.
Em uma modalidade preferida da invenção, a célula hospedeira de origem de leucemia mieloide humana da invenção é a célula ou linhagem celular K562, KG1, MUTZ-3, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605] ou uma célula ou linhagem celular de qualquer uma das referidas células hospedeiras, ou uma mistura de células ou linhagens celulares compreendendo pelo menos uma das células acima mencionadas. A célula hospedeira é preferivelmente selecionada do grupo consistindo em NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8 [DSM ACC 2806], ou NM-H9D8-E6 DSM ACC 2807, ou NM H9D8-E6Q12 (DSM ACC 2856), GT-2X (depositado em DSM ACC___________em DSMZDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH em Braunschweig (Alemanha), por Glycotope GmbH, Robert-Rõssle-Str. 10, 13125 Berlim (Alemanha) em 7 de setembro de 2007) ou uma célula ou linhagem celular derivada de qualquer uma dessas linhagens celulares.
As células NM-F9 [DSM ACC2606] e NM-D4 [DSM ACC2605] foram depositadas por Nemod Biotherapeutics GmbH & Co. KG, RobertRõssle-Str. 10, 13125 Berlim, Alemanha, que autorizou o requerente a se referir ao material biológico depositado aqui descrito.
Em outra modalidade preferida da invenção, a célula hospedeira de origem da leucemia mieloide humana da invenção é a célula ou linhagem celular K562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], ou uma célula ou linhagem celular de qualquer uma das referidas células hospedeiras.
Em uma modalidade preferida da invenção, a célula hospedeira de origem da leucemia mieloide humana da invenção é a célula ou linhagem celular K562, tal como K562 [ATCC CCL-243], ou um célula ou linhagem celular derivada da referida célula hospedeira.
Em outra modalidade preferida da invenção, a célula hospedeira de origem da leucemia mieloide humana da invenção é a célula ou linhagem celular K562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8, ou NM-H9D8-E6, ou GT-2X, ou NM H9D8-E6Q12 ou uma célula ou linhagem celular derivada de qualquer uma das referidas células hospedeiras.
Em um modalidade ainda mais preferida da invenção, a célula hospedeira de origem da leucemia mieloide humana da invenção é a célula, as células ou a linhagem celular K562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8, ou NM-H9D8-E6, ou
GT-2X, ou NM H9D8-E6Q12, as quais crescem e produzem uma composição de molécula de anticorpo da invenção sob condições sem-soro, e mais preferivelmente a célula, células ou linhagem celular abaixo crescendo sob condições sem-soro e o ácido nucleico codificando a molécula de anticorpo pode ser introduzido nessas células e uma composição de molécula de anticorpo é isolada sob condições sem-soro.
Na modalidade mais preferida da invenção, a célula hospedeira de origem da leucemia mieloide humana da invenção é a célula, as células ou a linhagem celular NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8, GT-2X, ou NM H9D8-E6Q12 ou NM M9D8-E6Q12, as quais crescem e produzem uma composição de molécula de anticorpo da invenção sob condições sem-soro, e mais preferivelmente a célula, células ou linhagem celular abaixo crescendo sob condições semsoro e o ácido nucleico codificando a molécula de anticorpo pode ser introduzido nessas células e uma composição de molécula de anticorpo é isolada sob condições sem-soro.
De acordo com uma modalidade, a célula sanguínea humana imortalizada e a célula hospedeira de origem da leucemia mieloide humana não é uma das linhagens celulares deficientes de sialilação NM-F9 e NM-D4 ou uma célula ou linhagem celular derivada de qualquer uma das referidas células hospedeiras com as mesmas propriedades. Essa modalidade é benéfica no caso de um alto grau de sialilação ser objetivado. Para essas modalidades, a célula hospedeira é preferivelmente selecionada do grupo consistindo em K562, NM H9D8, NM H9D8-E6, NM H9D8-E6Q12 e células hospedeiras derivadas de qualquer uma dessas células hospedeiras.
As linhagens celulares descritas juntamente com a presente invenção têm um tempo dobrado de 14 a 24 horas, o que é muito rápido em comparação com outros sistemas de expressão mamíferos, dependendo da linhagem celular da invenção.
Além disso, nenhum sistema de vetor de expressão elevada adequado é conhecido para a expressão de anticorpo de rendimento elevado em linhagens de células humanas, uma vez que as células humanas nor malmente não têm o gene DHFR e, deste modo, não permitem o uso do sistema de amplificação dhfr/metotrexato. Portanto, de acordo com outra modalidade da presente invenção, é fornecida uma modalidade, a qual permite aumentar o rendimento de produto.
De acordo com essa modalidade, adicionalmente um ácido nucleico é introduzido na célula hospedeira, codificando uma variante DHFR resistente ao antifolato. A di-hidrofolato redutase, ou DHFR, reduz o ácido dihidrofólico a ácido tetraidrofólico, usando NADPH como doador de elétrons, o qual pode ser convertido nos tipos de cofatores de tetra-hidrofolato usados na química de transferência de 1 carbono. Antifolatos inibem a enzima DHFR, levando até a morte celular. Para proporcionar um ácido nucleico codificando uma variante de DHFR resistente ao antifolato, é fornecida uma ferramenta para selecionar células as quais tenham sido transfectadas com o ácido nucleico e, além disso, que permita a amplificação dos ácidos nucleicos a serem expressos nas células hospedeiras.
O ácido nucleico codificando a referida variante DHFR resistente ao antifolato pode, por exemplo, ser introduzido através de um vetor separado ao invés do ácido nucleico codificando a proteína/anticorpo a ser expresso na célula hospedeira. É preferível transfectar o vetor codificando a variante DHFR resistente ao antifolato basicamente ao mesmo tempo que o vetor compreendendo o ácido nucleico codificando a proteína/anticorpo. Essa modalidade estimula que o ácido nucleico codificando a referida proteína/anticorpo a ser expresso seja integrado no genoma da célula hospedeira no mesmo sítio genético que o ácido nucleico codificando a variante DHFR resistente ao antifolato, o que é benéfico no caso de se desejar uma amplificação do ácido nucleico codificando a referida proteína/anticorpo.
Alternativamente, um sistema de vetor pode ser usado, o qual compreende o ácido nucleico codificando pelo menos uma parte da referida proteína a ser expressa, assim como o ácido nucleico codificando a variante DHFR resistente ao antifolato.
As células hospedeiras são, a seguir, cultivadas com o referido antifolato. Isso causa o efeito de que aquelas células hospedeiras, as quais foram transfectadas com sucesso com o ácido nucleico codificando a referida variante DHFR resistente ao antifolato, cresçam independentemente da presença do antifolato. Deste modo, as células transfectadas com sucesso podem ser selecionadas.
De acordo com outra modalidade, a sequência de ácidos nucleicos codificando pelo menos parte da referida proteína/anticorpo é amplificada passo a passo, aumentando a concentração de antifolato na cultura. O aumento da concentração de antifolato no meio de cultura leva a um aumento das cópias da variante DHFR resistente ao antifolato no genoma. Assume-se que isto é conseguido pelos eventos de recombinação nas células. Deste modo, também a quantidade de cópias do ácido nucleico codificando pelo menos parte da proteína a ser expressa é aumentada se o ácido nucleico codificando a referida proteína estiver localizado próximo da variante DHFR resistente ao antifolato no genoma, o que pode ser promovido ou pela transfecção de vetores separados simultânea ou pelo uso de um vetor compreendendo ambas as sequências de ácidos nucleicos. Através deste mecanismo, as células hospedeiras são obtidas, as quais expressam a proteína/anticorpo com um rendimento aumentado.
Preferivelmente, o antifolato é metotrexato.
A sequência de ácido nucleico codificando a referida proteína, preferivelmente uma molécula de anticorpo ou uma parte da mesma, é preferivelmente amplificada através do cultivo da referida célula hospedeira com pelo menos dois ciclos sucessivos de antifolato, preferivelmente metotrexato, por meio do que a concentração do referido antifolato, preferivelmente metotrexato, é aumentada em pelo menos 100% em cada ciclo sucessivo.
Um ácido nucleico adequado para proporcionar a referida variante DHFR resistente ao antifolato codifica um polipeptídeo do grupo da sequência ID No. 1 a 9, preferivelmente a sequência ID No. 1.
Outros detalhes e modalidades dessa sistema de aplicação também estão descritos em mais detalhes abaixo.
A invenção também fornece um método para produzir uma proteína, preferivelmente uma composição de molécula de anticorpo, compre42 endendo:
(a) introduzir em uma célula hospedeira de origem leucêmica mieloide humana pelo menos um ácido nucleico codificando uma proteína e preferivelmente uma molécula de anticorpo ou pelo menos uma parte da mesma, e pelo menos um ácido nucleico compreendendo pelo menos uma sequência de ácido nucleico codificando pelo menos um polipeptídeo do grupo da sequência N° 1 até a sequência N° 9, preferivelmente a sequência N° 1; e (b) amplificar a sequência de ácido nucleico codificando a referida proteína, preferivelmente uma molécula de anticorpo ou pelo menos uma parte da mesma pelo cultivo da referida célula hospedeira com metotrexato, preferivelmente pelo cultivo da referida célula hospedeira com pelo menos dois ciclos sucessivos de metotrexato, por meio do qual a concentração de metotrexato é preferivelmente aumentada em pelo menos cerca de 50%, mais preferivelmente por pelo menos cerca de 100% em cada ciclo sucessivo; e (c) cultivar a referida célula hospedeira sob condições as quais permitam a produção da referida proteína, preferivelmente uma composição da molécula de anticorpo, e
d) isolar a referida proteína, a qual é preferivelmente uma composição da molécula de anticorpo.
A invenção também proporciona um método para produzir uma composição proteica, preferivelmente uma composição de molécula de anticorpo, com atividade aumentada e/ou rendimento aumentado e/ou homogeneidade melhorada, compreendendo:
(a) introduzir em uma célula hospedeira de origem de leucemia mieloide humana pelo menos uma proteína codificadora de ácido nucleico, preferivelmente uma molécula de anticorpo ou pelo menos uma parte da mesma; e (b) cultivar a referida célula hospedeira sob condições as quais permitam a produção da referida composição proteica, a qual é preferivelmente uma composição da molécula de anticorpo; e (c) isolar a referida composição proteica, a qual é preferivelmente uma composição da molécula de anticorpo com atividade aumentada e/ou rendimento aumentado e/ou homogeneidade melhorada.
Além disso, a invenção fornece um método para produzir uma composição proteica, preferivelmente uma composição de molécula de anticorpo, com atividade aumentada e/ou rendimento aumentado e/ou homogeneidade melhorada, compreendendo:
(a) introduzir em uma célula hospedeira de origem leucêmica mieloide humana pelo menos um ácido nucleico codificando uma proteína, preferivelmente uma molécula de anticorpo ou pelo menos uma parte da mesma, e pelo menos um ácido nucleico compreendendo pelo menos uma sequência de ácido nucleico codificando pelo menos um polipeptídeo do grupo da sequência N° 1 até a sequência N° 9, preferivelmente a sequência N° 1; e (b) amplificar a sequência de ácido nucleico codificando a referida molécula de anticorpo ou pelo menos uma parte da mesma pelo cultivo da referida célula hospedeira com metotrexato, preferivelmente pelo cultivo da referida célula hospedeira com pelo menos dois ciclos sucessivos de metotrexato, por meio do que a concentração de metotrexato é preferivelmente aumentada em pelo menos cerca de 50%, mais preferivelmente por pelo menos cerca de 100% em cada ciclo sucessivo; e (c) cultivar a referida célula hospedeira sob condições as quais permitam a produção da referida proteína, a qual é preferivelmente uma composição da molécula de anticorpo, e
d) isolar a referida composição proteica, a qual é preferível44 mente uma composição da molécula de anticorpo com atividade aumentada e/ou rendimento aumentado e/ou homogeneidade melhorada.
O referido ácido nucleico codificando uma molécula de anticorpo ou pelo menos uma parte da mesma e o referido ácido nucleico compreendendo pelo menos uma sequência de ácido nucleico codificando pelo menos um polipeptídeo do grupo da sequência N° 1 até a sequência N° 9, preferivelmente a sequência N° 1, pode ser um ácido nucleico ou dois ácidos nucleicos separados.
Para selecionar uma célula hospedeira adequada para obter uma proteína com um perfil de glicosilação otimizado, é vantajoso efetuar o método de varredura/seleção de acordo com a presente invenção. Depois de uma célula hospedeira adequada ser determinada pelo método de seleção de acordo com a presente invenção, a referida célula hospedeira é usada para produzir a proteína conforme definido nas reivindicações 1 a 20.
Portanto, a invenção também proporciona um método para selecionar uma célula hospedeira para produzir uma proteína com pelo menos uma das seguintes características de glicosilação:
(i) ela não compreende NeuGc detectável; e/ou (ii) ela tem um grau de galactosilação nas estruturas de carboidrato total, ou nas estruturas de carboidrato em um sítio de glicosilação particular da molécula proteica das moléculas de proteína na referida composição de molécula proteica que é aumentado em comparação com a mesma quantidade de moléculas de proteína em pelo menos uma composição de molécula proteica da mesma molécula proteica isolada de CHOdhfr-[ATCC No. CRL-9096] quando ali expressa; e/ou (iii) ela tem uma quantidade de estruturas G2 nas estruturas de carboidrato total ou nas estruturas de carboidrato em um sítio de glicosilação particular da molécula proteica das referidas moléculas de proteína na referida composição de molécula proteica a qual é pelo menos 5% mais alta em comparação com a mesma quantidade de moléculas de proteína em pelo menos uma composição de molécula proteica da mesma molécula proteica isolada a partir de CHOdhfr-[ATCC No. CRL-9096] quando ali expressa; e/ou (iv) ela tem uma quantidade de estruturas GO nas estruturas de carboidrato total ou nas estruturas de carboidrato em um sítio de glicosilação particular da molécula proteica das referidas moléculas de proteína na referida composição de molécula proteica a qual é pelo menos 5% mais baixa em comparação com a mesma quantidade de moléculas de proteína em pelo menos uma composição de molécula proteica da mesma molécula proteica isolada a partir de CHOdhfr-[ATCC No. CRL-9096] quando ali expressa; e/ou (v) ela não compreende Galalpha1-3Gal terminal detectável; e/ou (vi) ela compreende uma quantidade de fucose nas estruturas de carboidrato total ou nas estruturas de carboidrato em um sítio de glicosilação particular da molécula proteica das referidas moléculas de proteína na referida composição de molécula proteica a qual é pelo menos 5% menor em comparação com a mesma quantidade de moléculas de proteína em pelo menos uma composição de molécula proteica da mesma molécula proteica isolada a partir de CHOdhfr[ATCC No. CRL-9096] quando ali expressa; e/ou (vii) ela compreende pelo menos uma estrutura de carboidratos contendo GlcNAc bifurcado; e/ou (viii) ela tem um padrão de sialilação o qual é alterado em comparação com o padrão de sialilação de pelo menos uma composição de molécula proteica da mesma molécula proteica isolada de CHOdhfr-[ATCC No. CRL-9096] quando ali expressa;
pelas seguintes etapas (a) introduzir em pelo menos duas células sanguíneas humanas imortalizadas diferentes como células hospedeiras pelo menos um ácido nucleico codificando uma proteína ou pelo menos uma parte da mesma; e (b) cultivar as referidas pelo menos duas células hospedeiras diferentes, em que cada célula hospedeira diferente produz uma composição proteica com um padrão de glicosilação divergindo do padrão de glicosilação produzido pela outra célula hospedeira;
(c) isolar as referidas composições proteicas expressas carregando um diferente padrão de glicosilação a partir de pelo menos duas células hospedeiras diferentes; e (d) selecionar a referida célula hospedeira produzindo uma composição proteica a qual tenha pelo menos uma das características de glicosilação definidas em (i) a (viii).
Os detalhes em relação ao padrão de glicosilação e linhagens celulares adequadas para obter o referido padrão estão descritos acima e também são aplicáveis a e adequados para o método de varredura para selecionar uma célula hospedeira adequada de acordo com a presente invenção.
É vantajoso efetuar uma etapa de varredura respectivo antes de estabelecer o método de produção, conforme descrito nas reivindicações 1 a 20, uma vez que essa modalidade permite a seleção da célula hospedeira mais adequada para produzir a composição da molécula de proteína/anticorpo com um padrão de glicosilação melhorado. De acordo com a idéia básica desse sistema de varredura, a proteína de interesse é expressa em pelo menos duas linhagens celulares diferentes as quais têm um padrão de glicosilação divergente. Por exemplo, uma linhagem celular pode demonstrar um alto grau de sialilação e a outra pode demonstrar um baixo grau de sialilação (ou fucosilação e/ou galactosilação) ou mesmo características de glicosilação desconhecidas. Os produtos obtidos a partir das diferentes linhagens celulares poetem concordantemente carregar uma característica do padrão de glicosilação para a respectiva linhagem celular.
As caracterfelfcas das proteínas produzidas nas diferentes linhagens celulares, por exenrçplo, em relação às suas atividades (por exemplo, ADCC e CDC nos anticoipos), afinidade, meia-vida do soro e outras características importantes podem ser, deste modo, determinadas. Os resultados permitem escolher a linhagem celular, a qual tem a melhor maquinaria de glicosilação para obter uma proteína a qual seja otimizada, considerando seu padrão de glicosilação. Uma vez que as características decisivas variam (por exemplo, afinidade, meia-vida no soro, etc.), esse método é particularmente vantajoso.
Preferivelmente, a referida proteína a ser produzida demonstra pelo menos uma das seguintes características:
(a) no caso dela ser uma composição da molécula de anticorpo, ela tem uma citotoxicidade celular mediada por Fc a qual é pelo menos 2 vezes maior do que a citotoxicidade celular mediada por Fc de pelo menos uma composição da molécula de anticorpo a partir da mesma molécula de anticorpo quando expressa na linhagem celular CHOdhfr[ATCC No. CRL-9096]; e/ou (b) no caso dela ser uma composição da molécula de anticorpo, ela tem uma ligação mediada por antígeno ou mediada por Fc aumentada a qual é pelo menos 50% maior do que a ligação de pelo menos uma composição da molécula de anticorpo a partir da mesma molécula de anticorpo quando expressa na linhagem celular CHOdhfr- [ATCC No. CRL9096];
e/ou (c) ela tem uma média aumentada de rendimento máximo da referida composição da molécula proteica a qual é pelo menos 10% maior do que o rendimento de pelo menos uma composição de molécula proteica a partir da mesma molécula de proteína quando expressa na linhagem celular CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096],
De acordo com uma modalidade, pelo menos uma das referidas células hospedeiras é uma célula sanguínea humana imortalizada e preferivelmente uma célula de origem leucêmica mieloide humana tal como K562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8, NM-H9D8-E6, NM-H9D8-E6Q12, GT-2X ou uma célula ou linhagem celular derivada delas.
A referida pelo menos uma célula hospedeira de origem leucêmica mieloide humana pode ser selecionada a partir de um dos seguintes grupos 1 a 4:
(a) grupo 1, compreendendo células hospedeiras com atividade de sialilação elevada, tal como K562 ou uma célula ou linhagem celular derivada dela, (b) grupo 2, compreendendo células hospedeiras tendo devido a uma deficiência genética ou meios de inibição de expressão (por exemplo, RNAi) uma baixa ou ausente sialilação, tais como NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605] e GT-2X ou uma célula ou linhagem celular derivada dela;
(c) grupo 3, compreendendo células hospedeiras com um grau de sialilação maior do que K562, tal como NM-H9 e NMH9D8, ou uma célula ou linhagem celular derivada dela;
(d) grupo 4, compreendendo células hospedeiras com uma atividade baixa ou ausente de fucosilação, tais como NMH9D8-E6 ou uma célula ou linhagem celular derivada dela.
Preferivelmente, pelo menos duas das três células hospedeiras usadas no processo de varredura são selecionadas a partir dos grupos acima. Entretanto, também é possível incluir outras células hospedeiras derivadas de outra origem (por exemplo, células Hek 293) no sistema de varredura de acordo com a presente invenção para ampliar ainda mais os diferentes padrões de glicosilação analisados.
A célula hospedeira obtida preferivelmente inclui uma proteína, particularmente um anticorpo exibindo pelo menos um dos padrões de glicosilação demonstrados na Tabela 9.
De acordo com a invenção, o termo introduzindo um ácido nucleiço se refere a qualquer método conhecido pelas pessoas versadas na técnica para introduzir um ácido nucleico, ou dois ou mais ácidos nucleicos em uma célula ou células hospedeiras de mamíferos por métodos tais como, porém sem se limitar, a eletroporação, transfecção usando lipídeos catiônicos, fosfato de cálcio, DEAd-dextrano ou infecção por partículas virais, tais como adenovirus ou retrovirus ou uma combinação desses. As pessoas versadas na técnica são capazes de selecionar e otimizar um método adequado para a introdução de um ou mais ácidos nucleicos da invenção.
De acordo com a presente invenção, o ácido nucleico codificando uma molécula de anticorpo é qualquer ácido nucleico o qual codifique a molécula de anticorpo ou pelo menos uma parte da mesma. A molécula de anticorpo da invenção pode, deste modo, ser codificada por moléculas de ácido nucleico únicas ou múltiplas.
A referida parte da molécula de anticorpo codificada pelo referido ácido nucleico compreende pelo menos uma sequência de 20 aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos 100 aminoácidos de uma molécula de anticorpo ou de um domínio constante e/ou variável da molécula de anticorpo. A sequência compreendida codificando a molécula de anticorpo ou pelo menos uma parte da mesma pode ser separada por pelo menos outra sequência, tal como, por exemplo, um intron. A sequência de um domínio pode compreender pelo menos uma mutação de aminoácido.
De acordo com a presente invenção, o ácido nucleico codificando uma molécula proteica é qualquer ácido nucleico o qual codifica a molécula proteica ou pelo menos uma parte da mesma. A molécula proteica da invenção pode, deste modo, ser codificada por uma única ou por várias moléculas de ácidos nucleicos. A sequência codificando a molécula de proteína ou pelo menos uma parte da mesma pode ser separada por pelo menos outra sequência, tal como, por exemplo, um intron. A sequência da molécula de proteína pode compreender pelo menos uma mutação de aminoácido.
Em uma modalidade preferida, o ácido nucleico codificando uma molécula de anticorpo ou pelo menos uma parte da mesma compreende pelo menos um domínio variável e/ou pelo menos um domínio constante da molécula de anticorpo, mais preferivelmente ambos, mais particularmente de modo que compreenda uma sequência humana pelo menos na parte do domínio ou domínios constantes, e ainda mais preferivelmente de modo que a tal compreenda o domínio Cgama2 humano, e mais preferivelmente que compreenda todos os domínios constantes da região Fc de um anticorpo humano de certa classe ou subclasse e o domínio variável.
De acordo com uma modalidade, a proteína e particularmente a molécula de anticorpo particular é codificada por um único ácido nucleico. Em outra proteína da modalidade preferida, particularmente uma molécula de anticorpo é codificada por dois ácidos nucleicos ou por três ácidos nucleicos.
Em outra modalidade preferida, um ácido nucleico codifica uma parte da molécula de anticorpo, a qual codifica o domínio variável e/ou o constante da cadeia leve e outro ácido nucleico codifica outra parte da molécula de anticorpo, o qual codifica o domínio variável e/ou pelo menos um domínio constante da cadeia pesada.
De acordo com a presente invenção, o ácido nucleico compreendendo pelo menos uma sequência de ácido nucleico codificando pelo menos um polipeptídeo do grupo da sequência N° 1 até a sequência N° 9 significa que aquele ácido nucleico codifica pelo menos um polipeptídeo do grupo da sequência N° 1 até a sequência N° 9, preferivelmente a sequência N° 1. Qualquer quantidade dessas sequências é adequada, contanto que ela possa ser introduzida com sucesso na célula hospedeira da invenção. Em uma modalidade preferida, o referido ácido nucleico codifica um, dois ou três polipeptídeos do grupo da sequência N° 1 até a sequência N° 9, mais preferivelmente para um polipeptídeo, e mais preferivelmente para o polipeptídeo da sequência N° 1. No sentido da invenção, o referido ácido nucleico pode também codificar um polipeptídeo do grupo da sequência N° 1 até a sequên cia N° 9, preferivelmente a sequência N° 1, o qual tem pelo menos uma mutação de aminoácido, contanto que essa mutação permita a amplificação do ácido nucleico codificando uma molécula de anticorpo ou pelo menos uma parte da mesma por metotrexato, conforme descrito aqui em outras partes.
A sequência de ácido nucleico codificando pelo menos um polipeptídeo do grupo da sequência N° 1 até a sequência N° 9, preferivelmente sequência N° 1, pode ser parte da mesma molécula de ácido nucleico que o ácido nucleico codificando uma molécula de anticorpo ou pelo menos uma parte da mesma conforme descrito em outros lugares aqui ou em moléculas de ácido nucleico separadas.
Em outra modalidade preferida da invenção, um ácido nucleico separado compreendendo uma sequência selecionada do grupo da sequência N° 1 até a sequência N° 9, mais preferivelmente sequência N° 1, pode ser introduzido na célula hospedeira da invenção separadamente do referido ácido nucleico ou ácidos nucleicos codificando a molécula de anticorpo ou partes suas da invenção. Isso pode ser feito ou pela introdução do referido ácido nucleico separado compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando uma sequência selecionada do grupo da sequência N° 1 até a sequência N° 9, juntamente, antes ou depois da introdução do referido ácido nucleico ou ácidos nucleicos codificando a molécula de anticorpo ou suas partes da invenção. Em uma modalidade preferida, isso é efetuado em paralelo e em outra modalidade preferida, a célula hospedeira da invenção já compreende o referido ácido nucleico separado compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando uma sequência selecionada do grupo da sequência N° 1 até a sequência N° 9, mais preferivelmente a sequência N° 1.
Outras modalidades preferidas estão descritas nos exemplos.
A amplificação do referido ácido nucleico estavelmente introduzido ou várias cópias do referido ácido nucleico codificando a proteína, o qual é preferivelmente uma molécula de anticorpo ou fração sua, pode ser efetuada conforme descrito aqui em outros locais e nos exemplos usando metotrexato.
Em uma modalidade preferida, o ácido nucleico codificando a proteína, o qual é preferivelmente uma molécula de anticorpo ou pelo menos uma parte da mesma compreende pelo menos outro elemento genético, o qual permite a seleção daquelas células nas quais o ácido nucleico foi introduzido de modo bem sucedido, tal como, porém sem se limitar, aos genes de resistência a antibiótico, tais como, porém sem se limitar, ao elemento genético codificando resistência a puromicina ou neomicina. Além disso, esses ácidos nucleicos compreendem um ou vários elementos genéticos tais como promotores, intensificadores, sítios de poliadenilação e/ou introns, para expressão da molécula de anticorpo nas células hospedeiras da invenção, e elementos genéticos tais como origem de replicação bacteriana, promotores e elementos para seleção de bactérias transfectadas, tais como genes de resistência a antibióticos para multiplicar o ácido nucleico na bactéria.
Promotores adequados incluem o promotor do gene IE (precoce imediato) do citomegalovírus (CMV), promotor precoce SV40, promotor de um retrovirus, promotor da metalotioneína, promotor do choque térmico, promotor SR alfa, promotor EF-1 alfa, etc. O intensificador do gene IE de CMV humano pode ser usado juntamente com o promotor.
Aqueles e outros elementos genéticos são conhecidos pelas pessoas versadas na técnica e podem ser selecionados, combinados, otimizados e introduzidos no referido ácido nucleico codificando a proteína, o qual é preferivelmente uma molécula de anticorpo ou pelo menos uma parte da mesma pelas pessoas versadas na técnica. Modalidades preferidas do referido ácido nucleico codificando uma proteína, o qual é preferivelmente uma molécula de anticorpo ou pelo menos uma parte da mesma ou uma combinação de ácidos nucleicos são aqui descritos e nos exemplos, assim como elementos genéticos preferidos para uso e combinação, entretanto, a invenção não está restrita ao uso desses e pode ser combinada ou ainda otimizada pelas pessoas versadas na técnica.
As pessoas versadas na técnica são capazes de selecionar e/ou combinar o elemento genético adequado, construir os elementos ou vetores de ácido nucleico adequadamente para introduzir um ou mais ácidos nuclei cos da invenção em uma linhagem celular de acordo com a invenção.
O referido ácido nucleico ou combinação de ácidos nucleicos codificando a proteína, a qual é preferivelmente uma molécula de anticorpo ou pelo menos uma parte da mesma, assim como os referidos elementos genéticos adicionais, assim como os métodos para introduzi-los, tais como a transferência para as células hospedeiras da invenção para expressão da composição da molécula de anticorpo ou em bactérias para multiplicação são conhecidos pelas pessoas versadas na técnica, assim como os métodos para construir, identificar, testar, otimizar, selecionar e combinar esse ácido ou ácidos nucleicos e combiná-los com sequências adicionais adequadas para seleção daquelas células as quais são transfectadas com sucesso, assim como métodos para construir, identificar, testar e selecionar a maior parte dos ácidos nucleicos codificando essas moléculas de anticorpo são conhecidos pelas pessoas versadas na técnica.
Modalidades preferidas da invenção estão descritas nos exemplos.
Em uma modalidade preferida da invenção, o ácido nucleico codificando uma proteína, a qual é preferivelmente uma molécula de anticorpo ou pelo menos uma parte da mesma compreende um elemento genético para a seleção daquelas células hospedeiras da invenção, nas quais o ácido nucleico é introduzido com sucesso tais como, porém sem se limitar, à neomicina ou à puromicina, mais preferivelmente ele compreende além disso um promotor, tal como EF-1alfa ou o promotor CMV, mais preferivelmente ele compreende além disso um intensificador CMV, mais preferivelmente ele compreende além disso um elemento genético o qual permita a seleção de bactérias as quais são transfectadas com o ácido nucleico e um elemento genético para a replicação, tal como a origem de replicação ColE1 para multiplicação do referido ácido nucleico em bactérias, e ainda mais preferivelmente ele compreende além disso um elemento genético para multiplicação do referido ácido nucleico em células COS tal como a origem SV40. Esses elementos são conhecidos pelas pessoas versadas na técnica e podem ser selecionados, combinados, otimizados e usados pelas pessoas versadas na técnica.
Em uma modalidade ainda mais preferida da invenção, o referido ácido nucleico descrito acima codificando uma molécula proteica ou pelo menos uma parte da mesma compreende uma sequência de ácidos nucleicos. Preferivelmente o referido ácido nucleico codificando a molécula de proteína ou pelo menos uma parte da mesma codifica adicionalmente o elemento genético codificando a resistência à puromicina, ou a resistência à neomicina, ou uma sequência de ácido nucleico codificando pelo menos uma sequência selecionada do grupo da sequência N° 1 até a sequência N° 9, mais preferivelmente a sequência N° 1.
Em uma modalidade ainda mais preferida da invenção, o referido ácido nucleico descrito acima codificando uma molécula de anticorpo ou pelo menos uma parte da mesma compreende pelo menos uma sequência codificando o domínio variável e pelo menos um domínio constante da cadeia pesada e/ou leve da molécula de anticorpo.
Em uma modalidade ainda mais preferida da invenção, o referido ácido nucleico descrito acima codificando uma molécula de anticorpo ou pelo menos uma parte da mesma compreende pelo menos uma sequência codificando o domínio variável e o domínio constante da cadeia leve da molécula de anticorpo ou o domínio variável e todos os domínios constantes da cadeia pesada da molécula de anticorpo inteira.
Em uma modalidade ainda mais preferida da invenção, um dos referidos ácidos nucleicos descritos acima codifica pelo menos uma parte da molécula de anticorpo compreendendo pelo menos uma sequência codificando o domínio variável e o domínio constante da cadeia leve da molécula de anticorpo e uma segunda do referido ácido nucleico descrito acima codificando pelo menos outra parte da molécula de anticorpo compreendo pelo menos uma sequência codificando o domínio variável e pelo menos um domínio constante, preferivelmente todos os domínios constantes da cadeia pesada da molécula de anticorpo, e ambos os ácidos nucleicos são introduzidos na mesma célula hospedeira da invenção. Preferivelmente, um dos referidos ácidos nucleicos codifica adicionalmente o elemento genético codificando a resistência à puromicina e o outro referido ácido nucleico codifica adicionalmente o elemento genético codificando a resistência à neomicina.
Em uma modalidade ainda mais preferida da invenção, o referido ácido nucléico descrito acima codificando uma molécula proteica ou pelo menos uma parte da mesma compreende pelo menos duas sequências de ácido nucléico codificando duas sequências de aminoácidos codificando duas sequências de aminoácidos da molécula proteica ou pelo menos uma parte da mesma.
Preferivelmente, um dos referidos ácidos nucleicos codifica adicionalmente o elemento genético codificando a resistência à puromicina, outro referido ácido nucléico codifica adicionalmente o elemento genético codificando a resistência à neomicina. Mais preferivelmente, um dos referidos ácidos nucleicos codifica adicionalmente o elemento genético codificando a resistência à puromicina ou neomicina, preferivelmente a resistência à puromicina, e outro referido ácido nucléico compreende além disso uma sequência de ácido nucléico codificando pelo menos uma sequência selecionada do grupo de sequência N° 1 até a sequência N° 9, mais preferivelmente a sequência N° 1.
Em uma modalidade ainda mais preferida da invenção, o referido ácido nucléico descrito acima codificando uma molécula proteica ou pelo menos uma parte da mesma compreende três sequências de ácido nucléico codificando três sequências de aminoácidos da molécula proteica ou pelo menos uma parte da mesma.
Preferivelmente, um dos referidos ácidos nucleicos codifica adicionalmente o elemento genético codificando a resistência à puromicina, outro referido ácido nucléico codifica adicionalmente o elemento genético codificando a resistência à neomicina, e outro referido ácido nucléico compreende além disso uma sequência de ácido nucléico codificando pelo menos uma sequência selecionada do grupo de sequência N° 1 até a sequência N° 9, mais preferivelmente a sequência N° 1.
Em uma modalidade ainda mais preferida da invenção, um dos referidos ácidos nucleicos codifica adicionalmente o elemento genético que codifica a resistência à puromicina ou neomicina, e o outro referido ácido nucleico compreende além disso uma sequência de ácido nucleico que codifica pelo menos uma sequência selecionada do grupo da sequência N° 1 até a sequência N° 9, mais preferivelmente a sequência N° 1. Em uma modalidade ainda mais preferida, um dos referidos ácidos nucleicos compreende as sequências codificando o domínio variável e o domínio constante da cadeia leve e compreende além disso uma sequência de ácido nucleico codificando pelo menos uma sequência selecionada do grupo da sequência N° 1 até a sequência N° 9, mais preferivelmente a sequência N° 1, e o outro referido ácido nucleico compreende sequências codificando o domínio variável e pelo menos um domínio constante, preferivelmente todos os domínios constantes da cadeia pesada da molécula de anticorpo e compreende além disso uma sequência de ácido nucleico codificando a resistência à puromicina ou à neomicina, preferivelmente a resistência à puromicina.
Em uma modalidade ainda mais preferida da invenção, o referido ácido nucleico codificando a molécula de anticorpo ou pelo menos uma parte da mesma compreende pelo menos uma sequência codificando o domínio variável e o domínio constante da cadeia leve da molécula de anticorpo e pelo menos uma sequência codificando o domínio variável e pelo menos um domínio constante, preferivelmente todos os domínios constantes da cadeia pesada da molécula de anticorpo.
Em uma modalidade preferida da invenção, os domínios constantes codificados pelos ácidos nucleicos descritos acima ou em outros lugares da invenção são domínios constantes humanos de IgG ou IgM, preferivelmente lgG1, lgG4 ou IgM humana, ou um domínio ou uma combinação de seus domínios, por meio do que preferivelmente as sequências genômicas ou sequências derivadas de sequências genômicas compreendendo pelo menos um íntron são usadas, as quais podem ser selecionadas, construídas e otimizadas pelas pessoas versadas na técnica.
Em uma modalidade ainda mais preferida da invenção, o referido ácido nucleico codificando uma proteína, a qual é preferivelmente uma molécula de anticorpo ou pelo menos uma parte da mesma da invenção compreende ainda o promotor EF-1alfa / intensificador CMV ou um promotor derivado do promotor CMV, preferivelmente CMV-E.
Em outra modalidade preferida da invenção, o referido ácido nucleico codificando uma proteína, o qual é preferivelmente uma molécula de anticorpo ou pelo menos uma parte da mesma da invenção compreende ainda um peptídeo de sinal de secreção, preferivelmente o sinal de secreção do receptor da célula T.
Em outra modalidade ainda mais preferida da invenção, o referido ácido nucleico codificando uma proteína, o qual é preferivelmente uma molécula de anticorpo ou pelo menos uma parte da mesma da invenção compreende ainda um peptídeo de sinal de secreção, preferivelmente a sequência N° 10.
O referido ácido nucleico ou combinação de ácidos nucleicos codificando a proteína, o qual é preferivelmente uma molécula de anticorpo ou pelo menos uma parte da mesma, assim como os referidos elementos genéticos adicionais, assim como os métodos para introduzi-los são conhecidos pelas pessoas versadas na técnica, assim como os métodos para construir, identificar, testar, otimizar, selecionar e combinar esse ácido ou ácidos nucleicos e combiná-los com sequências adicionais adequadas para seleção daquelas células as quais são transfectadas com sucesso, assim como métodos para construir, identificar, testar e selecionar a maior parte dos ácidos nucleicos codificando essas moléculas de anticorpo são conhecidos pelas pessoas versadas na técnica.
Modalidades preferidas da invenção estão descritas nos exemplos.
A introdução do ácido nucleico pode ser ou transiente ou estável.
De acordo com a presente invenção, o termo amplificando a sequência de ácido nucleico codificando uma proteína ou molécula de anticorpo ou pelo menos uma parte da mesma pelo cultivo da referida célula hospedeira com um antifolato, particularmente metotrexato, significa que uma célula hospedeira da invenção descrita em outros lugares aqui, nas quais pelo menos um ácido nucleico codificando a proteína a ser expressa, tal como, por exemplo, uma molécula de anticorpo ou pelo menos uma parte da mesma, e pelo menos um ácido nucleico compreendendo pelo menos uma sequência de ácido nucleico codificando uma variante DHFR resistente ao antifolato, preferivelmente pelo menos um polipeptídeo do grupo da sequência N° 1 até a sequência N° 9, preferivelmente a sequência N° 1, foi introduzido e é cultivado por pelo menos uma antifolato, preferivelmente concentração de metotrexato. Um tempo de cultivo típico está entre uma a duas semanas para cada ciclo, em concentrações típicas de cerca de 20 nM até 3000 nM, preferivelmente entre cerca de 50 nM até 2000 nM, mais preferivelmente entre cerca de 100 nM até 2000 nM. A duração do tratamento de amplificação de antifolato/metotrexato, assim como a concentração e os vetores correspondentes dos ácidos nucleicos da invenção podem ser otimizados pelas pessoas versadas na técnica e é também descrito em uma modalidade preferida nos exemplos. As condições de amplificação ótimas podem diferir entre diferentes moléculas de proteína/anticorpo codificadas e o uso de diferentes ácidos nucleicos ou construtos de ácidos nucleicos ou combinações suas descritas anteriormente. As pessoas versadas na técnica são capazes de selecionar e otimizar as condições mais adequadas e ácidos nucleicos da invenção. A referida amplificação leva a uma integração de mais cópias de ácidos nucleicos codificando a molécula de proteína/anticorpo ou pelo menos uma parte da mesma no genoma da célula hospedeira do que sem o cultivo de antifolato/metotrexato ou do que sem a introdução da sequência de ácido nucleico codificando pelo menos uma variante DHFR resistente a antifolato, particularmente um polipeptídeo do grupo da sequência N° 1 até a sequência N° 9, e/ou leva a uma produção aumentada da composição da molécula de proteína/anticorpo.
Em uma modalidade preferida da invenção, a referida célula hospedeira para amplificação do ácido nucleico ou ácidos nucleicos codificando uma molécula proteína/anticorpo ou pelo menos uma parte da mesma, a qual foi introduzida na referida célula hospedeira na qual pelo menos um ácido nucleico compreendendo pelo menos uma sequência de ácido nucleico codificando pelo menos um polipeptídeo do grupo de sequência N° 1 até a sequência N° 9, preferivelmente a sequência N° 1, foi introduzida, con59 forme descrito em outi>iugares aqui incluindo as suas modalidades preferidas, são uma célula vlinhagem celular de origem leucêmica mieloide humana KG1, MUTZ-3, K562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9JW-C-2F5, NM-H9D8, ou NM-H9D8-E6, NM-H9D85 E6Q12, GT-2X ou um^éiula ou linhagem celular derivada de qualquer uma das referidas células hepedeiras, mais preferivelmente a célula ou linhagem celular K562, NM-F9 |BM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8,au NM-H9D8-E6, NM-H9D8-E6Q12, GT-2X ou uma célula ou linhagem cdhfar derivada de qualquer uma das referidas células 10 hospedeiras, e ainda auís preferivelmente a célula ou linhagem celular NMF9 [DSM ACC2606], *D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NMH9D8, ou NM-H9D8-EB, NM- H9D8-E6Q12, GT-2X ou uma célula ou linhagem celular derivada de Qualquer uma das referidas células hospedeiras.
Em uma modalidade preferida da invenção, a referida célula hospedeira é cultivada cem pelo menos dois ciclos sucessivos de antifolato/metotrexato, por meio do que a concentração de antifolato/metotrexato é preferivelmente aumentada em pelo menos cerca de 50%, mais preferivelmente por pelo menos cerca de 100% em cada ciclo sucessivo. Em uma modalidade ainda mais preferida da invenção, a referida célula hospedeira é 20 cultivada com pelo menos três, mais preferivelmente com quatro, mais preferivelmente com 5, e ainda mais preferivelmente com 6 ciclos sucessivos de antifolato/metotrexato, por meio do que a concentração de antifolato/metotrexato é preferivelmente aumentada em pelo menos cerca de 50%, mais preferivelmente por pelo menos cerca de 100% em cada ciclo sucessivo. São a25 inda mais preferidas as concentrações de antifolato/metotrexato entre cerca de 20 nM e 3000 nM, mais preferidas entre cerca de 50 nM a 2000 nM, mais preferivelmente entre cerca de 100 nM a 2000 nM, e ainda mais preferidas de cerca de 100 nM, 200 nM, 500 nM, 1000 nM 2000 nM, as quais estão na modalidade preferida e s§o usadas em ciclos sucessivos, a partir de 100 nM.
É surpreendente gue a introdução de uma sequência de ácido nucleico codificando uns® variante DHFR resistente ao antifolato e preferivelmente pelo menos tw polipeptídeo do grupo de sequência N° 1 até a se quência N° 9 permita a amplificação da sequência de ácido nucleico codificando a referida molécula de proteína/anticorpo ou pelo menos uma parte da mesma na célula hospedeira de origem leucêmica mieloide humana da invenção, e especialmente em K562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8, ou NM-H9D8-E6, NM-H9D8E6Q12, GT-2X ou uma célula ou linhagem celular derivada de qualquer uma das referidas células hospedeiras, pelo cultivo com antifolato/metotrexato.
É especialmente surpreendente que a introdução de uma sequência de ácido nucleico codificando pelo menos um polipeptídeo da sequência N° 1 permita a amplificação da sequência de ácido nucleico codificando a referida molécula de anticorpo ou pelo menos um aparte da mesma na célula hospedeira da invenção, e especialmente em K562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8, ou NM-H9D8-E6, NM-H9D8-E6Q12, GT-2X ou em uma célula ou linhagem celular derivada de qualquer uma das referidas células hospedeiras, pelo cultivo com metotrexato.
É ainda mais surpreendente que a introdução de uma sequência de ácido nucleico codificando pelo menos um polipeptídeo do grupo de sequência N° 1 até a sequência N° 9 permita uma amplificação ainda maior de ácido nucleico codificando a referida molécula de anticorpo ou pelo menos um aparte da mesma na célula hospedeira da invenção, e especialmente em K562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C2F5, NM-H9D8, ou NM-H9D8-E6, NM-H9D8-E6Q12, GT-2X ou em uma célula ou linhagem celular derivada de qualquer uma das referidas células hospedeiras, pelo cultivo da referida célula hospedeira com pelo menos dois ciclos sucessivos de metotrexato, por meio do que a concentração de metotrexato é aumentada por pelo menos cerca de 50%, mais preferivelmente por pelo menos cerca de 100% em cada ciclo sucessivo.
É ainda mais surpreendente que a introdução de uma sequência de ácido nucleico codificando pelo menos um polipeptídeo do grupo de sequência N° 1 permita uma amplificação ainda maior da sequência de ácido nucleico codificando a referida molécula de anticorpo ou pelo menos uma parte da mesma na célula hospedeira da invenção, e especialmente em K562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C2F5, NM-H9D8, ou NM-H9D8-E6, NM-H9D8-E6Q12, GT-2X ou em uma célula ou linhagem celular derivada de qualquer uma das referidas células hospedeiras, pelo cultivo da referida célula hospedeira com pelo menos dois ciclos sucessivos de metotrexato, por meio do que a concentração de metotrexato é aumentada por pelo menos cerca de 50%, mais preferivelmente por pelo menos cerca de 100% em cada ciclo sucessivo.
Em uma modalidade preferida, o termo que amplificação é estável significa que ela leva à produção de altos rendimentos da composição da molécula de anticorpo em pelo menos 35 gerações de ciclos de divisão de células hospedeiras. A amplificação do referido ácido nucleico ou ácidos nucleicos estavelmente introduzidos codificando a molécula de proteína/anticorpo ou fração sua pode ser efetuada conforme descrito acima e nos exemplos usando metotrexato.
Modalidades ainda mais preferidas estão descritas nos exemplos.
Em uma modalidade preferida da invenção, as células hospedeiras da invenção com ácidos nucleicos introduzidos são preferivelmente usadas depois de pelo menos um ciclo de clonagem celular individual e a seleção daqueles clones celulares com expressão adequada e secreção da referida composição de proteína/anticorpo. Preferivelmente, a referida clonagem de célula única e seleção daqueles clones celulares com expressão e seleção adequados da referida composição de proteína/anticorpo ocorre depois de pelo menos um ciclo de amplificação de metotrexato descrito aqui em outros locais. Em uma modalidade ainda mais preferida, os referidos clones celulares são adicionalmente amplificados por pelo menos um ciclo adicional de amplificação com metotrexato, preferivelmente uma concentração aumentada de metotrexato, preferivelmente pelo menos aproximadamente o dobro da concentração de metotrexato, e ainda mais preferivelmente seguido por outro ciclo de clonagem e seleção de célula única daqueles clones celulares com expressão e secreção adequados da referida composição de proteína/anticorpo. Com essas modalidades preferidas, os clones celulares com rendimentos de expressão particularmente elevados podem ser selecionados.
De acordo com a presente invenção, o termo cultivo da referida célula hospedeira sob condições as quais permitam a produção da referida composição da molécula de anticorpo ou uma formulação respectiva para proteínas em geral significa que a célula hospedeira da invenção compreendendo pelo menos um ácido nucleico codificando uma molécula de proteína/anticorpo, preferivelmente as modalidades preferidas do referido ácido nucleico da invenção descritos em outros lugares por aqui é cultivada sob condições de cultivo as quais permitem a expressão da molécula de proteína/anticorpo na forma de uma composição de molécula de proteína/anticorpo, preferivelmente a secreção no meio, preferivelmente com altos rendimentos e/ou atividade elevada e/ou alta homogeneidade, conforme descrito aqui em outros locais. As pessoas versadas na técnica são capazes de selecionar as condições de cultivo mais adequadas através do uso de meios e condições de cultivo tais como, porém sem se limitar, a tempo adequado, temperatura, pH, gaseificação, alimentação, meio, suplementos de meio, tamanhos do reator ou frasco e princípios conhecidos pelas pessoas versadas na técnica. As pessoas versadas na técnica são capazes de selecionar e otimizar as condições mais adequadas. Modalidades preferidas são descritas nos exemplos, porém não estão limitadas a esses.
O cultivo das células da presente invenção pode ser efetuado por qualquer um dos métodos de cultivo gerais para células animais capazes de produzir eficientemente a composição da molécula de anticorpo desejada, por exemplo, cultura em batelada, cultura em batelada repetida, cultura em alimentação em batelada e cultura em perfusão. Preferivelmente, cultura em alimentação-batelada ou cultura em perfusão são empregadas para elevar a produtividade dos polipeptídeos desejados.
Em outra modalidade da invenção, o referido cultivo é efetuado sob condições livres de soro e ainda mais préferivelmente com meio livre de proteína ou meio livre de componentes animais.
A adaptação das células hospedeiras da presente invenção a um meio sem-soro de acordo com a presente invenção é surpreendentemente rápido e robusto. A adaptação pode ser efetuada, por exemplo, através da adaptação de células subcultivadas em um meio contendo soro diretamente em um meio livre de soro comercialmente disponível, ou pela adaptação contínua por meio do que a adaptação direta ao meio sem-soro é preferida e vantajosa. Durante o processo de adaptação a um meio sem-soro, a viabilidade das células reduz temporariamente, o que em algumas vezes causa a extinção das células. Consequentemente, é preferível inocular as células em um meio para a adaptação a um meio sem-soro em uma densidade celular de 1 x 10<5> a 5 x 10<5> células/mL, preferivelmente 2 x 10<5> células/mL, para restaurar a viabilidade das células ou mantê-la alta. Depois de 4 a 7 dias de cultivo, as células cuja densidade alcançou 5 x 10<5> a 10x10<5> células/mL são selecionadas como as células adaptadas a um meio sem-soro. A adaptação a meio sem-soro pode também ser efetuada pela diluição sucessiva do meio suplementado com FCS por uma composição de meio livre de soro (adaptação contínua). As pessoas versadas na técnica são capazes de selecionar e otimizar as condições mais adequadas. Modalidades preferidas são descritas nos exemplos, porém não estão limitadas a esses.
Depois de as células da presente invenção estarem adaptadas a um meio sem-soro, uma linhagem celular clonada ode ser preparada pelo uso do método de diluição limitada com uma placa de 96 cavidades, o método de formação de colônia ou similar, e as células ou linhagem celular são selecionadas devido às propriedades daquelas células as quais são vantajosas em comparação com a sua célula ou linhagem celular de origem tal como, porém sem se limitar a tempos de duplicação reduzidos, crescimento mais rápido, possibilidade de crescer sob elevadas densidades, maior capacidade de produção, maiores eficiências de clonagem, maiores eficiências de transfecção para o DNA, maiores taxas de expressão de composições de molécula de anticorpo, maiores atividades para uma composição de molécula de anticorpo ali expressa, maiores homogeneidades de uma composição de molécula de anticorpo aqui expressa e/ou maior robustez ao aumento.
Métodos para a seleção da célula com propriedades vantajosas são conhecidos pelas pessoas versadas na técnica ou aqui descritos.
De acordo com a presente invenção, o termo isolamento da referida composição da molécula de anticorpo ou uma formulação correspondente para proteínas em geral significa que a composição da molécula de proteína/anticorpo expressa pela célula hospedeira compreendendo pelo menos um dos referidos ácidos nucleicos codificando molécula de proteína/anticorpo ou fração sua descrita aqui em outros locais é ganha pelo uso de meio de cultura depois do cultivo ou enriquecimento ou purificação adicional da composição de molécula de proteína/anticorpo ou partes da composição da molécula de proteína/anticorpo por métodos conhecidos pelas pessoas versadas na técnica. A referida composição da molécula de proteína/anticorpo no sentido da invenção também significa partes da referida composição da molécula de proteína/anticorpo enriquecida para certas moléculas de proteína/anticorpo descritas aqui em outros locais.
Em uma modalidade preferida, a composição da molécula de proteína/anticorpo é isolada pela separação do meio após o cultivo das células e/ou fragmentos celulares, por exemplo, através de técnicas de centrifugação.
Em outra modalidade preferida da invenção, uma composição da molécula de proteína/anticorpo da invenção é isolada ou adicionalmente enriquecida por ultrafiltração, métodos de precipitação ou outros métodos de concentração conhecidos pelas pessoas versadas na técnica.
Em outra modalidade preferida da invenção, uma composição da molécula de proteína/anticorpo da invenção é isolada por purificação da composição da molécula de proteína/anticorpo por métodos cromatográficos, tais como, porém sem se limitar, a cromatografia de afinidade usando materiais de afinidade apropriados tais como, porém sem se limitar, a proteína A, proteína G, anticorpos de isotipo antianticorpo, cromatografia de lectina, anticorpos contra certa etiqueta introduzida na molécula de anticorpo, tal como rótulo HIS ou rótulo myc, ou antígeno, ou por cromatografia de troca iônica conhecida pelas pessoas versadas na técnica.
Outros métodos de purificação ou enriquecimento de proteínas ou certas glicoformas de proteínas são conhecidos pelas pessoas versadas na técnica e podem ser selecionados, adotados, otimizados e usados sozinhos ou em combinação com os métodos anteriormente descritos pelas pessoas versadas na técnica para isolar ou adicionalmente purificar, fracionar ou enriquecer a composição da molécula de proteína ou suas frações da invenção.
Em uma modalidade preferida da invenção, uma composição da molécula de anticorpo da invenção principalmente de IgG é isolada por cromatografia da proteína A com ou sem prévia ultracentrifugação.
Em outra modalidade preferida da invenção, uma composição da molécula de anticorpo da invenção principalmente de IgM é isolada por cromatografia de anticorpo anti-lgM com ou sem prévia ultracentrifugação.
Em outra modalidade preferida da invenção, uma composição da molécula de anticorpo da invenção enriquecida em certas glicoformas da molécula de anticorpo é isolada por cromatografia de afinidade de lectina com ou sem prévia ultracentrifugação. Outros métodos de purificação ou enriquecimento das proteínas ou certas glicoformas de proteínas são conhecidos pelas pessoas versadas na técnica e podem ser selecionados, adotados, otimizados e usados sozinhos ou em combinação com os métodos anteriormente descritos pelas pessoas versadas na técnica para isolar ou adicionalmente purificar, fracionar ou enriquecer a composição da molécula de anticorpo ou suas frações da invenção.
Em uma modalidade preferida, a composição da molécula de anticorpo é isolada usando colunas de proteína A. Em outra modalidade preferida, a composição da molécula de anticorpo é isolada usando uma coluna anti-lgM.
De acordo com a presente invenção, o termo atividade aumentada significa que a atividade de uma composição de molécula de proteína e/ou anticorpo da invenção expressa em uma célula hospedeira de origem leucêmica mieloide humana é maior do que a atividade de pelo menos uma composição da molécula de proteína/anticorpo da mesma molécula de prote ína/anticorpo quando expressa em pelo menos uma das linhagens celulares CHO, ou CHOdhfr-, ou BHK, ou NSO, ou SP2/0, ou PerC.6 ou hibridoma de camundongo. Na modalidade preferida da invenção, isso significa que a atividade de uma composição da molécula de proteína/anticorpo da invenção expressa em uma célula hospedeira de origem leucêmica mieloide humana é maior do que a atividade de uma composição da molécula de proteína/anticorpo da mesma molécula de proteína/anticorpo quando expressa em CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096]. Para os anticorpos, a referida atividade aumentada é uma citotoxicidade celular mediada por Fc aumentada ou uma atividade de ligação aumentada.
No sentido da invenção, atividade é também uma função ou grupo de funções efetuado por uma molécula proteica em um contexto biológico. No sentido da invenção, o termo atividade aumentada, equivalentes dos teors e seus equivalente gramaticais é para ser entendido como uma atividade melhorada ou ótima em relação à aplicação selecionada, por meio do que a atividade poderia ser ou aproximada até um valor limitante, por exemplo, sendo minimizada ou maximizada, ou estabelecida em um valor médio representando uma atividade maior ou menor em comparação com a molécula proteica correspondente produzida pela técnica anterior. A atividade melhorada ou aumentada no sentido da invenção também significa uma atividade favorável no sentido de seu significado biológico e/ou farmacêutico, como meia-vida no soro, farmacocinética, estabilidade, atividade biológica, ligação, antigenicidade e/ou imunogenicidade aumentados. Por exemplo, a atividade biológica de uma composição da molécula proteica poderia ser aumentada até uma extensão através da redução dos efeitos biológicos adversos, por exemplo, pela estimulação reduzida dos efeitos imunes adversos ou uma imunogenicidade reduzida.
A atividade da composição da molécula proteica de acordo com a invenção pode ser determinada em um bioensaio adequado, o qual é capaz de determinar a atividade da proteína. As pessoas versadas na técnica são capazes de identificar bioensaios adequados ou de construir bioensaios adequados. De acordo com a presente invenção, tais bioensaios incluem, por exemplo, ensaios biológicos in vitro, incluindo ensaios celulares ou moleculares ou misturados, tais como ensaios de proliferação, ensaios de apoptose, ensaios de adesão celular, ensaios de sinalização, ensaios de migração, ensaios de citotoxicidade celular, ensaios de fagocitose, ensaios de lise e ensaios de ligação. Tais bioensaios também incluem ensaios in vivo usando modelos animais ou humanos, tais como biodistribuição, farmacocinética, teste farmacodinâmico, testes de meia-vida no soro, testes para a biodisponibilidade, teste de eficácia, testes de localização, tratamento e testes de profilaxia de doenças incluindo estudos clínicos. Tais bioensaios também incluem testes químicos, físicos, físico-químicos, biofísicos e bioquímicos, tais como estabilidade em relação à temperatura, estresse de cisalhamento, pressão, pH, conjugação e outros. Tais bioensaios também incluem testes para a imunogenicidade e/ou antigenicidade para melhorar as propriedades da composição da molécula proteica em relação ao seu uso clínico. As pessoas versadas na técnica são capazes de determinar a atividade ou uma combinação de atividades descritas das composições da molécula proteica.
Em uma modalidade preferida, a atividade mais elevada da composição da molécula proteica é caracterizada por uma maior atividade em pelo menos um modelo in vitro e/ou uma atividade maior em pelo menos um modelo in vivo e/ou uma maior estabilidade e/ou uma maior meia-vida no soro e/ou uma biodisponibilidade mais longa e/ou uma imunogenicidade melhorada e/ou uma antigenicidade melhorada determinada por pelo menos um bioensaio. A melhoria na atividade global a qual é também chamada aqui atividade mais alta pode levar, por exemplo, a melhorias como dosagens mais baixas, intervalos de tempo mais longos para administração, menos efeitos colaterais e ausência ou baixa toxicidade do produto quando usado em seres humanos ou organismos correspondentes, resultando em medicamentos muito melhorados.
Em uma modalidade preferida da invenção, a atividade de uma composição da molécula proteica da invenção expressa em uma célula hospedeira de origem leucêmica mieloide humana é maior do que a atividade de pelo menos uma composição da molécula de proteína a partir da mesma molécula proteica produzida pela técnica anterior.
A referida citotoxicidade celular mediada por Fc aumentada é uma citotoxicidade celular dependente de anticorpo melhorada (atividade ADCC), citotoxicidade dependente do complemento (atividade CDC) e/ou citotoxicidade causada por fagocitose (atividade de fagocitose). A citotoxicidade celular mediada por Fc aumentada incluindo atividade ADCC, atividade CDC ou atividade de fagocitose pode ser determinada por vários métodos conhecidos pelas pessoas versadas na técnica e alguns estão descritos em detalhes nos exemplos sem limitá-la àqueles métodos por meio dos quais os métodos descritos nos exemplos são modalidades preferidas da invenção.
A referida atividade de ligação aumentada é uma ligação aumentada ao etitopo da molécula de anticorpo, tal como o etitopo, o antígeno, outro polipeptídeo compreendendo o etitopo ou uma célula compreendendo o etitopo da molécula de anticorpo, ou uma ligação aumentada a pelo menos um receptor Fc ou outro ligante efetor, tal como Fc-gamaRI, Fc-gamaRII, FcgamaRIII e suas subclasses tais como Fc-gamaRlla, Fc-gamallla, FcgamaRlllb ou o componente C1q do complemento, ou FcRn ou uma molécula ou célula compreendendo qualquer um daqueles receptores Fc ou ligantes efetores. A atividade de ligação aumentada pode ser uma maior afinidade, uma avidez aumentada e/ou um número maior de sítios de ligação ou suas combinações. A atividade de ligação aumentada pode resultar em vários efeitos e atividades tais como, porém sem se limitar, às formas de atividade mediada por receptor conforme descrito nos antecedentes da técnica. A afinidade, avidez de ligação e atividade mediada por receptor aumentados podem ser determinados por pelo menos um dos vários métodos conhecidos pelas pessoas versadas na técnica tais como, porém sem se limitara, medição Biacore, análise de Scatchard, medições baseadas em ELISA ou RIA, medições de citometria de fluxo, teste para determinar a indução de apoptose em células-alvo adequadas, testes para a determinação da proliferação de células-alvo adequadas, teste para bloqueio antagonístico, agonístico e/ou de receptor de uma composição da molécula de anticorpo tal como, porém sem se limitar, a inibição da ligação mediada célula-célula, desenca deamento de eventos moleculares internos celulares. As pessoas versadas na técnica são capazes de selecionar e/ou de adotar e/ou de modificar um método adequado ou combinação de métodos para testar a afinidade de ligação, avidez, quantidade de sítios de ligação e/ou atividade mediada por receptor.
Os métodos da invenção podem ser usados para testar a capacidade de um anticorpo ser capaz de obter uma citotoxicidade celular mediada por Fc aumentada, preferivelmente a atividade ADCC, a atividade CDC e/ou a citotoxicidade causada por fagocitose, e/ou uma atividade de ligação aumentada ao etitopo da molécula de anticorpo ou preferivelmente a pelo menos um receptor Fc ou outro ligante efetor, em geral e/ou particularmente com as células hospedeiras da invenção e suas modalidade preferidas descritas aqui em outros locais.
Em uma modalidade preferida da invenção, a atividade de uma composição da molécula de proteína/anticorpo da invenção expressa em uma célula hospedeira de origem leucêmica mieloide humana é maior do que a atividade de pelo menos uma composição da molécula de anticorpo a partir da mesma molécula de anticorpo a parte de pelo menos uma das linhagens celulares CHO, ou CHOdhfr- ou BHK, ou NSO, ou SP2/0, ou PerC.6 ou hibridoma de camundongo, preferivelmente CHOdhfr- [ATCC No. CRL9096], quando ali expressas.
Em uma modalidade preferida da invenção, a atividade de uma composição da molécula de proteína/anticorpo da invenção expressa em uma célula hospedeira de origem leucêmica mieloide humana é pelo menos 50% maior do que a atividade da composição da molécula de anticorpo a partir da mesma molécula de anticorpo expressa na linhagem celular CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096], mais preferivelmente pelo menos 2 vezes, mais preferivelmente pelo menos 3 vezes, mais preferivelmente pelo menos 4 vezes, mais preferivelmente pelo menos 5 vezes, mais preferivelmente pelo menos 7 vezes, mais preferivelmente pelo menos 10 vezes, mais preferivelmente pelo menos 15 vezes, mais preferivelmente pelo menos 23 vezes, mais preferivelmente pelo menos 30 vezes, mais preferivelmente pelo me nos 50 vezes, mais preferivelmente pelo menos 75 vezes, mais preferivelmente pelo menos 100 vezes, mais preferivelmente pelo menos 150 vezes, mais preferivelmente pelo menos 150 vezes, mais preferivelmente pelo menos 230 vezes, mais preferivelmente pelo menos 300 vezes, mais preferivelmente pelo menos 500 vezes, mais preferivelmente pelo menos 750 vezes e mais preferivelmente pelo menos mais de 1000 vezes.
Por meio disso cada bioensaio não tem que mostrar uma atividade maior, porém dependendo do uso e das características de uma composição da molécula de proteína particular, alguns efeitos biológicos favoráveis podem compensar outros os quais sejam menos favoráveis e ainda resultar em uma atividade global maior da composição da molécula de proteína no sentido da invenção. Por exemplo, certa composição de molécula proteica pode resultar em uma atividade muito maior através da ligação aos seus receptores às células, deste modo desencadeando um efeito secundário, tal como indução da proliferação, porém exibir uma meia-vida séria levemente reduzida. Em combinação, a maior atividade desencadeando o receptor mais do que compensa a biodisponibilidade mais curta na bioatividade global. Em outro exemplo, uma meia-vida mais curta e uma atividade maior em relação ao desencadeamento do receptor são ambas vantajosas. Em ainda outra modalidade, atividade in vivo não é melhorada, porém a estabilidade in vitro melhora a produção e o armazenamento da composição da molécula proteica. Em ainda outro exemplo, uma meia-vida mais longa, porém com uma atividade menor é necessária.
Em uma modalidade preferida da invenção, a atividade aumentada de uma composição da molécula de anticorpo é uma atividade ADCC aumentada. Em outra modalidade preferida, a atividade aumentada de uma composição da molécula de anticorpo é uma CDC aumentada. Em outra modalidade preferida, a atividade aumentada de uma composição da molécula de anticorpo é uma citotoxicidade causada por fagocitose. Em outra modalidade preferida a atividade aumentada de uma composição da molécula de anticorpo é uma atividade de ligação aumentada ao etitopo. Em outra modalidade preferida, a atividade aumentada de uma composição da molé cuia de anticorpo é uma atividade de ligação aumentada a pelo menos um receptor Fc, preferivelmente FcyRIIIA. Em outra modalidade preferida, a atividade aumentada de uma composição da molécula de anticorpo é uma citotoxicidade celular mediada por Fc aumentada e uma atividade de ligação 5 aumentada ao etitopo. Em outra modalidade preferida, a atividade aumentada de uma composição da molécula de anticorpo é uma atividade ADCC aumentada e uma atividade de ligação aumentada ao etitopo. Em outra modalidade preferida, a atividade aumentada de uma composição da molécula de anticorpo é uma atividade ADCC aumentada, uma atividade CDC aumen10 tada, uma atividade de ligação aumentada ao etitopo e uma atividade de ligação aumentada a pelo menos um receptor Fc. Em outra modalidade preferida, a atividade aumentada de uma composição da molécula de anticorpo é uma atividade ADCC aumentada, uma citotoxicidade aumentada causada por fagocitose, uma atividade de ligação aumentada ao etitopo e uma ativi15 dade de ligação aumentada a pelo menos um receptor Fc. Na modalidade mais preferida, a atividade aumentada de uma composição da molécula de anticorpo é uma ADCC aumentada, citotoxicidade aumentada causada por fagocitose, uma atividade CDC aumentada e uma atividade de ligação aumentada ao etitopo e uma atividade de ligação aumentada a pelo menos um 20 receptor Fc.
De acordo com a presente invenção, o termo homogeneidade melhorada significa que uma composição da molécula de proteína/anticorpo da invenção expressa em uma célula hospedeira de origem leucêmica mieloide humana da invenção compreende menos glicoformas diferentes, ou 25 mais de uma glicoforma favorável ou de glicoformas favoráveis, ou pelos de pelo menos uma glicoforma de uma molécula de anticorpo (preferivelmente daquelas glicoformas as quais representam pelo menos 1 % da composição da molécula de anticorpo total por si só) do que pelo menos uma composição da molécula de anticorpo da mesma molécula de anticorpo isolada a 30 partir de pelo menos uma das linhagens celulares CHO, CHOdhfr-, ou BHK, ou NSO ou SP2/0 ou PerC.6 ou hibridoma de camundongo quando ali expressa. Em uma modalidade preferida da invenção, isso significa que uma composição da molécula de anticorpo da invenção expressa em uma célula hospedeira de origem leucêmica mieloide humana da invenção compreende menos glicoformas diferentes, ou mais de uma glicoforma favorável ou de glicoformas favoráveis, ou menos de pelo menos uma glicoforma de uma molécula de anticorpo do que uma composição da molécula de anticorpo da mesma molécula de anticorpo isolada da linhagem celular CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096/ quando ali expressa.
Uma heterogeneidade particularmente problemática para a produção e uso em seres humanos é a sialilação. Em uma modalidade preferida, a composição da molécula de proteína/anticorpo da invenção tem uma homogeneidade melhorada compreendendo nenhuma glicoforma com o ácido siálico ácido N-glicolilneuramínico (NeuGC), por meio do que neste caso nenhuma glicoforma significa ausência de glicoforma de mais de 1 % de todas as cadeias de carboidrato obteníveis a partir da composição da molécula de anticorpo purificada e mais preferivelmente ausência de cadeias de carboidrato detectáveis em qualquer caso, como sendo detectável pelos métodos conhecidos pelas pessoas versadas na técnica. Uma vez que NeuGc é conhecido como sendo capaz de ser imunogênico em seres humanos, isto é uma grande vantagem das células hospedeiras da invenção em relação aos outros sistemas de produção tais como CHO, NSO, SP2/0.
Em uma modalidade preferida, a composição da molécula de proteína/anticorpo da invenção tem uma homogeneidade melhorada em relação à sialilação compreendendo menos de 5% de glicoformas, mais preferivelmente menos de 3%, e ainda mais preferivelmente menos de 1%, e mais preferivelmente ausência de glicoformas da composição da molécula de proteína/anticorpo com ácido siálico detectável conforme descrito nos exemplos. Em outra modalidade preferida, uma composição da molécula de proteína/anticorpo com homogeneidade melhorada em relação á sialilação é alcançada pelo uso de uma célula hospedeira de origem leucêmica mieloide humana da invenção, a qual tem um defeito na via do precursor do açúcar nucleotídico e, deste modo, é deficiente para ou tem CMP-ácido siálico reduzido e a qual resulta em ausência de sialilação ou em sialilação muito re duzida das cadeias de açúcares de carboidratos das moléculas de proteína/anticorpo quando as células crescem em um meio sem-soro. Em uma modalidade ainda mais preferida, tal composição da molécula de proteína/anticorpo com homogeneidade melhorada em relação à sialilação pode ser alcançada pelo uso de NM-F9 [DSM ACC2606] ou NM-D4 DSM ACC2605] como uma célula hospedeira da invenção que cresceu em um meio sem-soro conforme descrito em mais detalhes nos exemplos.
Em outra modalidade ainda mais preferida, uma composição da molécula de proteína/anticorpo com homogeneidade melhorada em relação à sialilação é alcançada pelo uso de uma célula hospedeira de origem leucêmica mieloide humana a invenção, a qual tem um defeito no transportador de açúcar de nucleotídeo do GMP-ácido siálico ou em pelo menos uma sialiltransferase, o que resulta em ausência ou em reduzida sialilação das cadeias de açúcares de carboidratos das moléculas de proteína/anticorpo quando as células crescem em um meio sem-soro. São exemplos NM-F9, NM-D4 e GT-2X.
Em outra modalidade preferida da invenção, a composição da molécula de proteína/anticorpo com homogeneidade melhorada em relação à sialilação é alcançada pelo uso de uma célula hospedeira de origem leucêmica mieloide humana da invenção, a qual tem grau de sialilação aumentado. O referido grau de sialilação significa que a quantidade de ácido siálico N-acetilneuramínico (NeuNc ou NeuNAc) nas moléculas de proteína/anticorpo em uma composição da molécula de anticorpo é de pelo menos 5%, mais preferivelmente de pelo menos 15%, mais preferivelmente de pelo menos 20%, mais preferivelmente de pelo menos 25%, mais preferivelmente de pelo menos 30%, mais preferivelmente de pelo menos 35%, mais preferivelmente de pelo menos 40%, mais preferivelmente de pelo menos 50%, mais preferivelmente de pelo menos 60%, mais preferivelmente de pelo menos 70%, mais preferivelmente de pelo menos 80%, mais preferivelmente de pelo menos 90%, mais preferivelmente de pelo menos 100%, mais preferivelmente pelo menos 3 vezes, mais preferivelmente pelo menos 5 vezes, mais preferivelmente pelo menos 10 vezes, mais preferivelmente pelo me nos 25 vezes, mais preferivelmente pelo menos 50 vezes e mais preferivelmente pelo menos 100 vezes maior do que a quantidade de ácido siálico Nacetilneuramínico (NeuNc ou NeuNAc) das unidades de carboidrato total ou da cadeia de carboidrato particular em um sítio de glicosilação particular da molécula de proteína/anticorpo em comparação com a mesma quantidade de moléculas de proteína/anticorpo de uma composição da molécula de proteína/anticorpo da mesma molécula de proteína/anticorpo isolada de pelo menos uma das linhagens celulares CHO, ou CHOdhfr-, ou BHK, ou NS0, ou SP2/0, ou PerC.6 ou hibridoma de camundongo, preferivelmente CHOdhfr[ATCC No. CRL-9096] quando ali expressa. O grau de sialilação pode ser detectado por métodos conhecidos pelas pessoas versadas na técnica, tais como, porém sem se limitar, a análise de imunoblot ou ELISA usando lectinas cujas ligações dependem da sialilação da estrutura do carboidrato, tal como SNA, MAL, MAL I ou PNA, por métodos de detecção químicos tal como o método do ácido tiobarbitúrico, por HPLC ou espectrometria de massa ou uma combinação desses. As pessoas versadas na técnica podem selecionar o método mais adequado e adotá-lo e otimizá-lo para o propósito e maiores detalhes são descritos nos exemplos. É preferível uma análise de imunoblot usando SNA.
Em outra modalidade ainda mais preferida uma composição da molécula de proteína/anticorpo com homogeneidade melhorada em relação à sialilação é alcançada pelo uso de uma célula hospedeira de origem leucêmica mieloide humana da invenção, preferivelmente K562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E- 2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8, ou NM-H9D8-E6, NM-H9D8-E6Q12, GT-2X e células ou linhagens celulares derivadas dessas, e mais preferivelmente K562, NM-E-2F9, NM-C-2F5, NMH9D8, ou NM-H9D8-E6, NM-H9D8-E6Q12, GT-2X, as guais têm um grau de sialiação aumentado, e resulta em uma composição da molécula de proteína/anticorpo a qual compreende ácido siálico alfa 2-6 ligado, para ser detectável, por exemplo, por ligação de SNA, em uma versão mais preferida a composição da molécula de proteína/anticorpo compreende ácidos siálicos alfa 2-6 e alfa 2-3 ligados.
Em outra modalidade preferida, uma composição da molécula de proteína/anticorpo com homogeneidade melhorada em relação à sialilação é obtida pelo uso de uma célula hospedeira de origem leucêmica mieloide humana, a qual compreende pelo menos uma sialiltransferase capaz de ligar NeuNAc em alfa 2-3 e pelo menos uma sialiltransferase capaz de ligar NeuNAc na ligação alfa 2-6 em grupos de açúcares, tais como, porém sem se limitar, a K562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E2F9, NM-C-2F5, NM- H9D8, ou NM-H9D8-E6, NM-H9D8-E6Q12, GT-2X e células ou linhagens celulares derivadas dessas, resultando dessa forma em uma composição mais preferida de glicoformas da molécula de proteína/anticorpo na composição da molécula de proteína/anticorpo.
Em uma modalidade ainda mais (preferida) da invenção, a referida composição da molécula de anticorpo com homogeneidade aumentada em relação à sialilação compreende pelo menos uma glicoforma de uma molécula de anticorpo com pelo menos uma cadeia de carboidratos ligada a outro sítio de glicosilação da molécula de anticorpo do que o aminoácido Asn-297 no segundo domínio (domínio Cgama2) da região Fc.
Em uma modalidade ainda mais preferida da composição da molécula de anticorpo inicial com homogeneidade melhorada em relação à sialilação é expressa em uma célula hospedeira de origem leucêmica mieloide humana a qual tem um grau de sialilação aumentado e/ou compreende pelo menos uma sialiltransferase capaz de se ligar ao ácido siálico em alfa 2-3 e pelo menos uma sialiltransferase capaz de se ligar ao ácido siálico na ligação alfa 2-6 aos grupos de açúcares, tais como K562, NM-E-2F9, NM-C2F5, NM- H9D8, ou NM-H9D8-E6, NM-H9D8-E6Q12, GT-2X e células ou linhagens celulares dela derivadas.
Em uma modalidade ainda mais preferida, a primeira molécula de anticorpo tem pelo menos um sítio de N-glicosilação (Asn-X-Ser/Thr, por meio do qual X pode ser qualquer aminoácido, exceto Pro) e/ou pelo menos um sítio de O-glicosilação em uma sequência da região Fab.
Em outra modalidade, a composição da molécula de anticorpo da invenção com homogeneidade em relação á sialilação melhorada com76 preendendo uma molécula de anticorpo a qual compreende pelo menos uma cadeia de carboidrato ligada a outro sítio de glicosilação da molécula de anticorpo diferente de Asn-297 no segundo domínio (domínio Cgama2) da parte Fc tem uma meia-vida no soro prolongada e/ou biodisponibilidade quando medida em pelo menos um mamífero, tal como camundongos, ratos ou preferivelmente em seres humanos em relação à composição da molécula de anticorpo da mesma molécula de anticorpo isolada de pelo menos uma das linhagens celulares CHO, CHOdhfr- ou BHK, ou NSO ou SP2/0, NM-F9, NMD4 ou PerC6 ou hibridoma de camundongo, preferivelmente a linhagem celular CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096] quando ali expressa.
A biodisponibilidade dos anticorpos pode ser otimizada usando a presente invenção. A expressão das moléculas de anticorpo, particularmente em células com uma alta ou mesmo uma sialilação muito alta (grupos 1 e 3 discutidos acima) pode levar a uma composição de anticorpo com uma biodisponibilidade prolongada, enquanto que a expressão das moléculas de anticorpo nas células do grupo 2 pode levar a uma composição de anticorpo com uma biodisponibilidade comparavelmente reduzida. A biodisponibilidade pode ser testada conforme é conhecido pelas pessoas versadas na técnica e conforme descrito nos exemplos usando animais ou preferivelmente seres humanos. Animais incluem camundongos, ratos, porquinhos-da-índia, cachorros ou macacos, porém não estão restrito àquelas espécies. Devido à natureza humana, aqueles animais os quais têm uma glicosilação e mais importante sialilação mais próxima do ser humano são preferidos, sendo os mais preferidos os seres humanos.
Em uma modalidade ainda mais preferida, a composição da molécula de anticorpo com homogeneidade melhorada em relação à sialilação é expressa em uma célula hospedeira de origem leucêmica mieloide humana da invenção, a qual tem um grau de sialilação aumentado e/ou compreende pelo menos uma sialiltransferase capaz de ligar o ácido siálico em alfa 2-3 e pelo menos uma sialiltransferase capaz de ligar ácido siálico na ligação alfa 2-6 em grupos de açúcares, tais como K562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8, ou NM-H9D8
E6, e células ou linhagens celulares delas derivadas, e compreende pelo menos uma cadeia de carboidrato ligada a pelo menos um sítio de glicosilação e/ou pelo menos um sítio de O-glicosilação em uma sequência da região Fab da molécula de anticorpo e tem uma meia-vida no soro e/ou biodisponibilidade prolongada quando medida em pelo menos um mamífero tal como camundongo, ratos ou preferivelmente em seres humanos, do que a composição da molécula de anticorpo da mesma molécula de anticorpo isolada de pelo menos uma das linhagens celulares CHO, ou CHOdhfr-, ou BHK, ou NSO, ou SP2/0, ou PerC.6 ou hibridoma de camundongo, preferivelmente a linhagem celular CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096] quando ali expressa. Em outra modalidade preferida, a molécula de anticorpo expressa é Erbitux (Cetuximab).
De acordo com a presente invenção, o termo rendimento aumentado significa que a média do rendimento máximo de uma composição da molécula de proteína/anticorpo da invenção produzida em uma célula hospedeira de origem leucêmica mieloide humana é maior do que a respectiva média ou rendimento máximo de pelo menos uma composição da molécula de proteína/anticorpo da mesma molécula de proteína/anticorpo quando expressa em pelo menos uma das linhagens celulares CHO, ou CHOdhfr-, ou BHK, ou NSO, ou SP2/0 ou PerC.6 ou hibridoma de camundongo. Na modalidade preferida da invenção, isso significa que o rendimento médio ou máximo de uma composição da molécula de proteína/anticorpo da invenção expresso em uma célula hospedeira de origem leucêmica mieloide humana é maior do que a média respectiva ou rendimento máximo de uma composição da molécula de proteína/anticorpo da mesma molécula de proteína/anticorpo quando expressa em CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096] usando o gene dhfr de murino e metotrexato para amplificação em CHOdhfr-. O rendimento máximo e médio é medido em SPR, o qual reflete a produtividade de uma célula, mistura celular ou linhagem celular, pode ser determinado pelas pessoas versadas na técnica e é descrito na sua modalidade preferida nos exemplos.
Em uma modalidade ainda mais preferida da invenção pelo me nos o rendimento máximo ou o médio de uma composição da molécula de proteína/anticorpo da invenção em uma célula hospedeira de origem leucêmica mieloide humana, preferivelmente K562, NM-F9 [DSM ACC2606], NMD4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8, ou NM-H9D8-E6, NM-H9D8-E6Q12, GT-2X ou uma célula ou linhagem celular derivada delas, é pelo menos 10% maior do que de acordo com a composição da molécula de proteína/anticorpo da mesma molécula de proteína/anticorpo expressa na linhagem celular CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096] usado o gene dhfr de murino e metotrexato para amplificação em CHOdhfr-, mais preferivelmente pelo menos 15%, mais preferivelmente pelo menos 20%, mais preferivelmente pelo menos 25%, mais preferivelmente pelo menos 30%, mais preferivelmente pelo menos 35%, mais preferivelmente pelo menos 45%, mais preferivelmente pelo menos 50%, mais preferivelmente pelo menos 55%, mais preferivelmente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 100%, mais preferivelmente pelo menos 3 vezes, mais preferivelmente pelo menos 4 vezes e mais preferivelmente mais de 5 vezes.
A invenção ainda fornece um ácido nucleico compreendendo (a) uma sequência codificadora de uma proteína, preferivelmente uma molécula de anticorpo ou pelo menos uma parte da mesma, conforme descrito aqui em outros locais, e (b) pelo menos uma sequência codificando uma sequência do grupo da sequência N° 1 até a sequência N° 9.
Em uma modalidade preferida da invenção, o ácido nucleico da invenção compreende (a) uma sequência codificadora de uma proteína, preferivelmente uma molécula de anticorpo ou pelo menos uma parte da mesma, conforme descrito aqui em outros locais, e (b) sequência codificando a sequência N° 1.
Em outra modalidade preferida da invenção, o ácido nucleico acima descrito da invenção ainda compreende uma sequência codificando um marcador de seleção, preferivelmente uma sequência codificando um polipeptídeo o qual induz uma resistência a antibiótico de células hospedeiras nas quais o referido ácido nucleico é introduzido, tal como, porém sem se limitar, à neomicina ou à puromicina.
Em outra modalidade preferida da invenção, o ácido nucleico acima descrito da invenção compreende ainda pelo menos uma sequência de pelo menos um elemento genético descrito aqui em outros lugares.
A invenção ainda fornece uma célula hospedeira de origem leucêmica mieloide humana ou qualquer célula precursora ou linhagem celular mieloide ou mieloide humana a qual possa ser obtida a partir de um paciente com leucemia, ou qualquer célula precursora ou linhagem celular mieloide ou mieloide humana a qual possa ser obtida a partir de um doador humano ou uma mistura de células ou linhagens celulares compreendendo pelo menos uma célula de origem leucêmica mieloide humana, ou célula, células ou linhagem celular a qual tenha sido obtida pela fusão de pelo menos uma célula, células ou linhagem celular de origem leucêmica mieloide humana ou qualquer célula precursora ou linhagem celular mieloide ou mieloide humana a qual tenha sido obtida a partir de um paciente com leucemia, ou qualquer célula precursora ou linhagem celular mieloide ou mieloide humana a qual tenha sido obtida a partir de um doador humano, com outra célula de origem animal ou humana, tal como, porém sem se limitar, às células B, células CHO, compreendendo pelo menos um ácido nucleico codificando uma molécula de proteína/anticorpo ou partes suas, as quais tenham sido introduzidas nas referidas células.
A invenção fornece uma célula hospedeira da invenção descrita acima compreendendo pelo menos um ácido nucleico codificando uma molécula de proteína/anticorpo ou pelo menos uma parte da mesma.
Em uma modalidade preferida, a invenção proporciona a célula hospedeira K562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8, ou NM-H9D8-E6, NM-H9D8-E6Q12, GT- 2X ou uma célula ou linhagem celular derivada de qualquer uma das referidas células hospedeiras, preferivelmente aquelas que crescem sob condições livres de soro e a partir das quais uma composição da molécula de proteína/anticorpo é isolada sob condições livres de soro, e ainda mais preferivelmente aquelas nas quais o ácido nucleico codificando a molécula de anticorpo tenha sido introduzido sob condições livres de soro, compreendendo pelo menos um ácido nucleico codificando uma molécula de proteína/anticorpo ou partes suas, preferivelmente um ácido nucleico compreendendo uma sequência codificando uma molécula de proteína/anticorpo ou pelo menos uma parte da mesma, conforme descrito aqui em outros locais.
A invenção proporciona uma célula hospedeira da invenção descrita acima compreendendo pelo menos um ácido nucleico codificando pelo menos um polipeptídeo do grupo da sequência N° 1 até a sequência N° 9, preferivelmente sequência N° 1.
A invenção proporciona uma célula hospedeira da invenção descrita acima compreendendo pelo menos um ácido nucleico codificando uma molécula de anticorpo ou partes suas e pelo menos um ácido nucleico codificando pelo menos um polipeptídeo do grupo da sequência N° 1 até a sequência N° 9, preferivelmente sequência N° 1.
Em uma modalidade preferida, a invenção fornece a célula hospedeira K562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8, ou NM-H9D8-E6, NM-H9D8-E6Q12, GT- 2X ou uma célula ou linhagem celular derivada de qualquer uma das referidas células hospedeiras, preferivelmente aquelas que crescem sob condições livres de soro e a partir das quais uma composição da molécula de proteína/anticorpo é isolada sob condições livres de soro, e ainda mais preferivelmente aquelas nas quais o ácido nucleico codificando a molécula de proteína/anticorpo tenha sido introduzido sob condições livres de soro, compreendendo pelo menos um ácido nucleico codificando uma molécula de proteína/anticorpo ou partes suas, preferivelmente um ácido nucleico compreendendo uma sequência codificando uma molécula de proteína/anticorpo ou pelo menos uma parte da mesma, conforme descrito aqui em outros locais, e pelo menos uma sequência codificando uma sequência do grupo de sequência N° 1 até a sequência N° 9, preferivelmente a sequência N° 1.
Em outra modalidade preferida, a invenção proporciona as células hospedeiras descritas acima, em que a molécula de anticorpo codificada é um anticorpo de W02004/065423.
Em uma modalidade ainda mais preferida, a invenção proporciona as células hospedeiras acima descritas, em que a molécula de anticorpo codificada é o anticorpo PankoMab [Cancer Immunol Immunother. Novembro de 2006; 55 (11): 1337-47. Epub Fevereiro de 2996. PankoMab: a potent new generation anti-tumour MUC1 antibody. Danielczyk et al], preferivelmente uma forma quimérica de PankoMab com todos os domínios constantes humanos, e mais preferivelmente um PankoMab humanizado.
A invenção ainda fornece uma composição de molécula de proteína/anticorpo com atividade aumentada e/ou rendimento aumentado e/ou homogeneidade melhorada e glicosilação totalmente humana produzida por qualquer um dos métodos da invenção, conforme aqui descrito em outros locais.
Em uma modalidade preferida, a invenção proporciona uma composição da molécula de proteína/anticorpo produzida por qualquer um dos métodos da invenção que tem uma atividade aumentada e/ou rendimento aumentado e/ou homogeneidade melhorada e glicosilação totalmente humana produzida por qualquer um dos métodos da invenção, em comparação com uma composição da molécula de proteína/anticorpo da mesma molécula de proteína/anticorpo isolada de pelo menos uma das linhagens celulares CHO, ou CHOdhfr-, ou BHK, ou NSO, ou SP2/0, ou PerC.6 ou hibridoma de camundongo, preferivelmente CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096], quando ali expressa.
A molécula proteica ou parte da mesma expressa pode ser qualquer proteína ou parte de proteína ou fragmento de proteína. A molécula de proteína ou parte da mesma expressa pode ser qualquer anticorpo ou parte de anticorpo ou fragmento de anticorpo.
Composições de moléculas proteicas da presente invenção podem ser usadas para o tratamento terapêutico ou profilático de doenças, tais como leucemia, neutropenia, citopenia, câncer, transplante de medula ós sea, doenças dos sistemas hematopoiéticos, infertilidade e doenças autoimunes. O espectro de aplicações terapêuticas conhecidas pelas pessoas no campo da técnica, das composições de moléculas proteicas, é muito extenso. Por exemplo, G-CSF é um importante terapêutico para tratar neutropenia, um decréscimo de neutrófilos que põe a vida em risco como consequência de uma quimioterapia de pacientes com câncer leucêmico. GM-CSF é especificamente usado para o tratamento de pacientes AML em idade relativamente avançada depois de quimioterapia para obter uma rápida recuperação de neutropenia. GM-CSF é adicionalmente aprovado como terapêutico para várias aplicações em transplantes de medula óssea e para a mobilização de células tronco do sangue periféricas. Além disso, existem várias aplicações clínicas de GM-CSF que estão atualmente sob investigação, tais como para o tratamento de HIV e câncer. Certas doenças do sistema hematopoiético são tratadas com EPO, e IFN-beta é atualmente um importante terapêutico para o tratamento de esclerose múltipla, uma doença autoimune. Outro exemplo é FSH, o qual é amplamente utilizado para o tratamento de infertilidade masculina ou feminina. hCG é também aplicado para o tratamento de infertilidade, porém com foco na anovulação em mulheres. hGH tem benefícios clinicamente comprovados, tais como redução da gordura corporal e aumento no tecido muscular.
Composições de moléculas proteicas da presente invenção também podem ser usadas para a produção de um medicamento para tratamentos profiláticos e/ou terapêuticos de doenças selecionadas do grupo compreendendo leucemia, neutropenia, citopenia, câncer, transplante de medula óssea, doenças do sistema hematopoiético, infertilidade e doenças autoimunes.
Em uma modalidade preferida da invenção, a molécula de anticorpo expressa é uma molécula de anticorpo reconhecendo psoríase, artrite reumatoide, doença de Crohn, colite ulcerativa, doenças autoimunes, SLE, esclerose múltipla, distúrbios hematológicos autoimunes, asma, alergia, doença de enxerto versus hospedeiro, rejeição de aloenxerto, cirurgia de glaucoma, enfarte do miocárdio, vírus como RSV, HIV, Hep B ou CMV, câncer, sarcoma, CLL, AML ou NHL.
Em uma modalidade ainda mais preferida da invenção, a molécula de anticorpo expressa é uma molécula de anticorpo reconhecendo câncer, tumor ou metástase, pelo menos uma célula cancerígena ou célula tumoral em pelo menos um ser humano, preferivelmente selecionada do grupo das doenças cancerígenas ou doenças tumorais da região ouvido-narizgarganta, dos pulmões, mediastino, trato gastrintestinal, sistema urogenital, sistema ginecológico, mama, sistema endócrino, sarcomas de tecido conjuntivo, pele e osso, mesoteliomas, melanomas, neoplasmas do sistema nervoso central, doenças cancerígenas ou doenças tumorais durante a infância, linfomas, leucemias, síndromes paraneoplásticas, metástases com tumor primário desconhecido (síndrome CPU), carcinomatoses peritoneais, malignidades relacionadas à imunossupressão e/ou metástases tumorais.
Em uma modalidade preferida da invenção, o anticorpo expresso ou parte da mesma é um anticorpo anti-MUC1.
Em outra modalidade preferida da invenção, a molécula de anticorpo codificada pelo ácido nucleico ou ácidos nucleicos da invenção é o anticorpo Rituximab, Herceptina, Erbitux, Campath 1H ou anticorpos destes derivados.
Em uma modalidade ainda mais preferida da invenção, a molécula de anticorpo codificada pelo ácido nucleico ou ácidos nucleicos da invenção é um anticorpo de W02004/050707, e ainda mais preferivelmente de W02004/065423, e ainda mais preferivelmente PankoMab [Cancer Immunol Immunother. Novembro de 2006; 55 (11): 1337-47. Epub Fevereiro de 2006. PankoMab: a potent new generation anti-tumour MUC1 antibody. Danielczyk et al], e ainda mais preferivelmente uma versão quimérica sua compreendendo todos os domínios constantes humanos, e ainda mais preferivelmente um anticorpo humanizado seu.
Em uma modalidade ainda mais preferida da invenção, a molécula de anticorpo codificada pelo ácido nucleico ou ácidos nucleicos da invenção são qualquer molécula inteira da invenção, preferivelmente Rituximab, Herceptina, Erbitux, mais preferivelmente W02004/065423, mais prefe rivelmente PankoMab, por meio do que a composição da molécula de anticorpo isolada de qualquer célula hospedeira da invenção, preferivelmente K562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C2F5, NM-H9D8 ou NM-H9D8-E6, NM-H9D8-E6Q12, GT-2X ou uma célula ou linhagem celular derivada de qualquer uma das referidas células hospedeiras compreende nenhum NeuGc detectável. O mesmo se aplica às proteínas em geral.
Em uma modalidade ainda mais preferida da invenção, a molécula de anticorpo codificada pelo ácido nucleico ou ácidos nucleicos da invenção é qualquer molécula de anticorpo inteira ou uma molécula de anticorpo compreendendo o domínio Cgama2 da invenção, preferivelmente Rituximab, Herceptina, Erbitux, mais preferivelmente W02004/065423, mais preferivelmente PankoMab, por meio do que a composição da molécula de anticorpo isolada de uma célula hospedeira da invenção, preferivelmente K562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C2F5, NM-H9D8 ou NM-H9D8-E6, NM-H9D8-E6Q12, GT-2X ou uma célula ou linhagem celular derivada de qualquer uma das referidas células hospedeiras compreende pelo menos uma glicoforma com ácido alfa 2-6 siálico. O mesmo se aplica às proteínas em geral.
Em uma modalidade ainda mais preferida da invenção, a molécula de anticorpo codificada pelo ácido nucleico ou ácidos nucleicos da invenção é qualquer molécula de anticorpo inteira ou uma molécula de anticorpo compreendendo o domínio Cgama2 da invenção, preferivelmente Rituximab, Herceptina, Erbitux, Campath 1H, mais preferivelmente W02004/065423, mais preferivelmente PankoMab, por meio do que a composição da molécula de anticorpo isolada de uma célula hospedeira NM-E2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8 ou NM-H9D8-E6, NM-H9D8-E6Q12, GT-2X ou uma célula ou linhagem celular derivada de qualquer uma das referidas células hospedeiras compreende ácido alfa 2-6 siálico, o qual é detectável por análise de imunoblot com a lectina SNA conforme descrito nos exemplos. O mesmo se aplica às proteínas em geral.
Em uma modalidade preferida da invenção, a molécula de anti corpo codificada pelo ácido nucleico ou ácidos nucleicos da invenção é qualquer molécula de anticorpo, preferivelmente Rituximab, Herceptina, Erbitux, Campath 1H, mais preferivelmente W02004/065423, mais preferivelmente PankoMab, e a composição da molécula de anticorpo isolada de uma célula hospedeira NM-F9 ou NM-D4 da invenção após o cultivo em meio livre de soro e mais preferivelmente em meio sem-proteína tem uma homogeneidade melhorada sem ácidos siálicos detectáveis. O mesmo se aplica às proteínas em geral.
Em uma modalidade preferida da invenção, a molécula de anticorpo codificada pelo ácido nucleico ou ácidos nucleicos da invenção é o anticorpo Rituximab, Herceptina, Campath 1H ou anticorpos desses derivados, e a composição da molécula de anticorpo isolada da célula hospedeira da invenção tem uma atividade ADCC aumentada de pelo menos 4 vezes em relação à atividade da composição da molécula de anticorpo a partir da mesma molécula de anticorpo expressa na linhagem celular de CHOdhfr[ATCC No. CRL-9096],
Em uma modalidade ainda mais preferida da invenção, a molécula de anticorpo codificada pelo ácido nucleico ou ácidos nucleicos da invenção é qualquer molécula de W02004/065423, mais preferivelmente PankoMab, e a composição da molécula de anticorpo isolada da célula hospedeira da invenção tem uma atividade ADCC aumentada de pelo menos 4 vezes maior quando produzida em pelo menos uma das células K562, NMF9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NMH9D8, ou NM-H9D8-E6, NM-H9D8-E6Q12, GT-2X ou uma célula ou linhagem celular derivada de qualquer uma das referidas células hospedeiras em relação à atividade da composição da molécula de anticorpo a partir da mesma molécula de anticorpo expressa na linhagem celular CHOdhfr[ATCC No. CRL-9096].
Em outra modalidade preferida da invenção, a molécula de anticorpo codificada pelo ácido nucleico ou ácidos nucleicos da invenção é um anticorpo de W02004/065423, mais preferivelmente PankoMab, e a composição da molécula de anticorpo isolada da célula hospedeira da invenção
K562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C2F5, NM-H9D8, ou NM-H9D8-E6, NM-H9D8-E6Q12, GT-2X ou uma célula ou linhagem celular derivada de qualquer uma das referidas células hospedeiras tem uma atividade de ligação aumentada ao seu etitopo pelo menos 50% maior, preferivelmente 2 vezes maior do que a atividade da composição da molécula de anticorpo a partir da mesma molécula de anticorpo expressa na linhagem celular CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096].
Em outra modalidade preferida da invenção, a molécula de anticorpo codificada pelo ácido nucléico ou ácidos nucleicos da invenção é um anticorpo de WO 2004/065423, mais preferivelmente PankoMab, e a composição da molécula de anticorpo isolada da célula hospedeira NM-F9 ou NMD4 da invenção após o cultivo em meio sem-soro e mais preferivelmente sem-proteína tem uma homogeneidade melhorada sem ácidos siálicos detectáveis. O mesmo se aplica às proteínas em geral.
Em outra modalidade preferida da invenção, a molécula de anticorpo codificada pelo ácido nucléico ou ácidos nucleicos da invenção é um anticorpo de W02004/065423, mais preferivelmente PankoMab, e a composição da molécula de anticorpo isolada da célula hospedeira da invenção K562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C2F5, NM-H9D8, ou NM-H9D8-E6, NM-H9D8-E6Q12, GT-2X ou uma célula ou linhagem celular derivada de qualquer uma das referidas células hospedeiras tem uma homogeneidade melhorada com pelo menos 10% a mais de ácidos siálicos do que a composição da molécula de anticorpo a partir da mesma molécula de anticorpo expressa na linhagem celular CHOdhfr[ATCC No. CRL-9096]. O mesmo se aplica às proteínas em geral.
Em outra modalidade preferida da invenção, a molécula de anticorpo codificada pelo ácido nucléico ou ácidos nucleicos da invenção é um anticorpo de W02004/065423, mais preferivelmente PankoMab, e a composição da molécula de anticorpo isolada da célula hospedeira da invenção tem uma homogeneidade melhorada com um grau mais elevado de ausência de ácidos siálicos detectáveis quando expresso em NM-F9 ou NM-D4 em comparação com uma composição da molécula de anticorpo a partir da mesma molécula de anticorpo expressa na linhagem celular de CHOdhfr[ATCC No. CRL-9096]. O mesmo se aplica às proteínas em geral.
Em outra modalidade preferida da invenção, a molécula de anticorpo codificada pelo ácido nucleico ou ácidos nucleicos da invenção é um anticorpo de W02004/065423, mais preferivelmente PankoMab, e a composição da molécula de anticorpo isolada da célula hospedeira da invenção tem uma homogeneidade melhorada conforme descrito acima, e uma atividade ADCC de pelo menos 4 vezes maior do que a atividade da composição da molécula de anticorpo a partir da mesma molécula de anticorpo expressa na linhagem celular de CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096].
Na modalidade mais preferida da invenção, a molécula de anticorpo codificada pelo ácido nucleico ou ácidos nucleicos da invenção é um anticorpo de W02004/065423, mais preferivelmente PankoMab.
A invenção ainda fornece uma célula hospedeira para produzir uma composição da molécula de proteína/anticorpo com atividade aumentada e/ou rendimento aumentado e/ou homogeneidade melhorada e glicosilação totalmente humana no sentido da invenção, conforme descrito aqui em outros locais, em que a célula hospedeira e qualquer célula, células ou linhagem celular de origem leucêmica mieloide humana ou qualquer célula precursora ou linhagem celular mieloide ou mieloide humana a qual pode ser obtida a partir de um paciente com leucemia, ou qualquer célula precursora ou linhagem celular mieloide ou mieloide humana a qual pode ser obtida a partir de um doador humano ou uma mistura de células ou linhagens celulares compreendendo pelo menos uma célula de origem leucêmica mieloide humana, ou uma célula ou linhagem celular derivada delas conforme descrito aqui em outros locais, ou uma mistura de células ou linhagens celulares compreendendo pelo menos uma daquelas células anteriormente mencionadas.
A invenção também fornece uma célula hospedeira para produzir uma composição de molécula de proteína/anticorpo com atividade aumentada e/ou rendimento aumentado e/ou homogeneidade melhorada e glicosilação totalmente humana no sentido da invenção, conforme descrito aqui em outros locais, em que a célula hospedeira é qualquer célula, células ou linhagem celular a qual tenha sido obtida pela fusão de pelo menos uma célula, células ou uma linhagem celular de origem leucêmica mieloide humana ou qualquer célula ou linhagem celular precursora mieloide ou mieloide humana a qual possa ser obtida a partir de um paciente com leucemia, ou qualquer célula ou linhagem celular precursora mieloide ou mieloide humana a qual possa ser obtida a partir de um doador humano, com outra célula de origem humana ou animal, tal como, porém sem se limitar, às células B e células CHO.
Em uma modalidade preferida, a referida célula hospedeira da invenção que proporciona a produção de uma composição de molécula de proteína/anticorpo com atividade aumentada e/ou rendimento aumentado e/ou homogeneidade melhorada no sentido da invenção conforme descrito aqui em outros locais, é a célula ou linhagem celular KG1, MUTZ-3, K562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM- H9D8 ou NM-H9D8-E6, NM-H9D8-E6Q12, GT-2X ou uma célula ou linhagem celular derivada destas, ou uma mistura de células ou linhagens celulares compreendendo uma daquelas células anteriormente mencionadas.
Em outra modalidade preferida, a referida célula hospedeira da invenção que proporciona a produção de uma composição de molécula de proteína/anticorpo com atividade aumentada e/ou rendimento aumentado e/ou homogeneidade melhorada no sentido da invenção conforme descrito aqui em outros locais, é a célula ou linhagem celular K562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8, ou NM-H9D8-E6, NM-H9D8-E6Q12, GT-2X ou uma célula ou linhagem celular derivada destas.
Em outra modalidade preferida, a referida célula hospedeira da invenção que proporciona a produção de uma composição de molécula de proteína/anticorpo com atividade aumentada e/ou rendimento aumentado e/ou homogeneidade melhorada no sentido da invenção conforme descrito aqui em outros locais, é a célula ou linhagem celular NM-F9 [DSM ACC2606],
NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8, ou NM-H9D8E6, NM-H9D8-E6Q12, GT-2X ou uma célula ou linhagem celular derivada destas ou uma célula ou linhagem celular derivada destas conforme descrito aqui em outros locais.
Em uma modalidade ainda mais preferida, a referida célula hospedeira da invenção que proporciona a produção de uma composição de molécula de proteína/anticorpo com atividade aumentada e/ou rendimento aumentado e/ou homogeneidade melhorada no sentido da invenção conforme descrito aqui em outros locais, é a célula ou linhagem celular derivada de KG1, MUTZ-3, K562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NME-2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8 ou NM-H9D8-E6, NM-H9D8-E6Q12, GT-2X ou uma célula ou linhagem celular derivada destas conforme descrito aqui em outros locais, as quais crescem sob condições sem-soro, e preferivelmente aquelas nas quais o ácido nucleico codificando a molécula de proteína/anticorpo pode ser introduzida nessas células e uma composição da molécula de anticorpo é isolada sob condições sem-soro.
Em uma modalidade ainda mais preferida, a referida célula hospedeira da invenção que proporciona a produção de uma composição de molécula de proteína/anticorpo com atividade aumentada e/ou rendimento aumentado e/ou homogeneidade melhorada no sentido da invenção conforme descrito aqui em outros locais é a célula ou linhagem celular derivada de K562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C2F5, NM-H9D8 ou NM-H9D8-E6, NM-H9D8-E6Q12, GT-2X ou uma célula ou linhagem celular derivada destas conforme descrito aqui em outros locais, as quais crescem sob condições sem-soro.
Em uma modalidade ainda mais preferida, a referida célula hospedeira da invenção que proporciona a produção de uma composição de molécula de proteína/anticorpo com atividade aumentada e/ou rendimento aumentado e/ou homogeneidade melhorada no sentido da invenção conforme descrito aqui em outros locais é a célula ou linhagem celular derivada de K562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C2F5, NM-H9D8 ou NM-H9D8-E6, NM-H9D8-E6Q12, GT-2X ou uma célula ou linhagem celular derivada destas conforme descrito aqui em outros locais, as quais crescem sob condições sem-soro e nas quais o ácido nucleico codificando a molécula de proteína/anticorpo pode ser introduzido nessas células e uma composição da molécula de proteína/anticorpo é isolada sob condições sem-soro.
Na modalidade mais preferida, a referida célula hospedeira da invenção que proporciona a produção de uma composição de molécula de proteína/anticorpo com atividade aumentada e/ou rendimento aumentado e/ou homogeneidade melhorada no sentido da invenção conforme descrito aqui em outros locais é a célula ou linhagem celular NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8 ou NM-H9D8-E6, NM-H9D8-E6Q12, GT-2X ou uma célula ou linhagem celular derivada destas conforme descrito aqui em outros locais, as quais crescem sob condições sem-soro e preferivelmente aquelas nas quais o ácido nucleico codificando a molécula de proteína/anticorpo pode ser introduzido nessas células e a composição da molécula de proteína/anticorpo é isolada sob condições semsoro.
A invenção ainda fornece uma composição de proteína/proteína isolada por qualquer um dos métodos da invenção descritos em outros locais aqui.
A invenção ainda fornece uma composição da molécula de proteína isolada por qualquer um dos métodos da invenção descritos em outros locais aqui, a qual tem uma atividade aumentada e/ou rendimento aumentado e/ou homogeneidade melhorada e glicosilação totalmente humana no sentido da invenção e descrita aqui em outros locais.
Em outra modalidade preferida da invenção, a molécula de proteína ou parte da mesma tem um tamanho de pelo menos 10 KDa, preferivelmente um tamanho de pelo menos 15 KDa, mais preferivelmente um tamanho de pelo menos 20 KDa, mais preferivelmente um tamanho de pelo menos 25 KDa, mais preferivelmente um tamanho de pelo menos 30 KDa, mais preferivelmente um tamanho de pelo menos 35 KDa, mais preferivelmente um tamanho de pelo menos 40 KDa, mais preferivelmente um tama nho de pelo menos 45 KDa, mais preferivelmente um tamanho de pelo menos 50 KDa, mais preferivelmente um tamanho de pelo menos 55 KDa, mais preferivelmente um tamanho de pelo menos 60 KDa, mais preferivelmente um tamanho de pelo menos 65 KDa, mais preferivelmente um tamanho de pelo menos 70 KDa, mais preferivelmente um tamanho de pelo menos 75 KDa, mais preferivelmente um tamanho de pelo menos 80 KDa, mais preferivelmente um tamanho de pelo menos 85 KDa, mais preferivelmente um tamanho de pelo menos 90 KDa, mais preferivelmente um tamanho de pelo menos 95 KDa, mais preferivelmente um tamanho de pelo menos 100 KDa, mais preferivelmente um tamanho de pelo menos 105 KDa, mais preferivelmente um tamanho de pelo menos 110 KDa, mais preferivelmente um tamanho de pelo menos 115 KDa, mais preferivelmente um tamanho de pelo menos 120 KDa, mais preferivelmente um tamanho de pelo menos 125 KDa, mais preferivelmente um tamanho de pelo menos 130 KDa, mais preferivelmente um tamanho de pelo menos 135 KDa, mais preferivelmente um tamanho de pelo menos 140 KDa, mais preferivelmente um tamanho de pelo menos 145 KDa, mais preferivelmente um tamanho de pelo menos 150 KDa, mais preferivelmente um tamanho de pelo menos 155 KDa, mais preferivelmente um tamanho de pelo menos 160 KDa, mais preferivelmente um tamanho de pelo menos 165 KDa, mais preferivelmente um tamanho de pelo menos 170 KDa, mais preferivelmente um tamanho de pelo menos 175 KDa, mais preferivelmente um tamanho de pelo menos 180 KDa, mais preferivelmente um tamanho de pelo menos 185 KDa, mais preferivelmente um tamanho de pelo menos 190 KDa, mais preferivelmente um tamanho de pelo menos 195 KDa, mais preferivelmente um tamanho de pelo menos 200 KDa.
Em uma modalidade preferida da invenção, a referida composição de molécula de proteína originada de qualquer molécula proteica do grupo das citocinas e seus receptores, por exemplo, os fatores de necrose tumoral TNF-alfa e TNF-beta; renina; hormônio do crescimento humano e hormônio do crescimento bovino; fator de liberação do hormônio de crescimento; hormônio da paratireoide; hormônio estimulador da tireoide; lipoproteínas; alfa-1-antitripsina; cadeia A e cadeia B de insulina; gonadotrofinas, por exemplo, hormônio do folículo estimulante (FSH), hormônio luteinizante (LH), tirotrofina e gonadotrofina coriônica humana (hCG); calcitonina; glucagon; fatores de coagulação, tais como fator VIIIC, fator IX, fator VII, fator tecidual e fator de Von Willebrands; fatores anticoagulantes tal como proteína C; fator natriurético atrial; tensoativo pulmonar; ativadores do plasminogênio, tal como uroquinase, ativador do plasminogênio tipo tecidual e urina humana; bombesina; trombina; fator do crescimento hematopoiético; encefalinase; proteína inflamatória do macrófago humano; albumina do soro, tal como albumina do soro humana; substância inibidora de Müller; cadeia A e cadeia B da relaxina; prorrelaxina; peptídeo associado à gonadotrofina de camundongo; fator de crescimento endotelial vascular; receptores para hormônios ou fatores de crescimento; integrina; proteína A e D; fatores da reumatoide; fatores neurotróficos tais como fator neurotrófico derivado ósseo, neurotrofina 3, 4, 5, 6 e beta-fator de crescimento de nervps; fator de crescimento derivado de plaquetas; fatores de crescimento do fibroblasto; fator de crescimento epidérmico; fator transformador de crescimento, tal como TGF-alfa e TGFbeta; fator de crescimento tipo insulina I e II; proteínas de ligação ao fator de crescimento tipo insulina; proteínas CD, tais como CD-3, CD-4, CD-8 e CD19; eritropoietina (EPO); fatores osteoindutores; imunotoxinas; uma proteína morfogenética óssea; um interferon, tal como interferon alfa, beta e gama; fatores estimuladores de colônia (CSFs); por exemplo, M-CSF, GM-CSF e G-CSF; interleucinas (ILs), por exemplo, IL-1 até IL-12; superóxido desmutase; receptores de células T; proteínas da membrana de superfície; fator acelerador de decaimento; anticorpos e imunoadesinas; glicoforina A; MUC1.
Em uma modalidade mais preferida da invenção, a referida composição da molécula proteica é originada de qualquer uma das moléculas de proteína do grupo glicoforina A, EPO, G-CSF, GM-CSF, FSH, hCG, LH, interferons, interleucinas, anticorpos e/ou fragmentos seus.
É também fornecida uma proteína glicólica ou composição proteica obtenível pelos métodos de produção de acordo com a presente invenção. A referida proteína preferivelmente tem as características de glicosilação conforme definidas na reivindicação 27.
Preferivelmente, a referida composição de proteína é uma composição da molécula de anticorpo. A invenção ainda fornece uma composição da molécula de anticorpo isolada por qualquer um dos métodos da invenção descritos aqui em outros locais, a qual tenha uma atividade melhora5 da e/ou rendimento melhorado e/ou homogeneidade melhorada no sentido da invenção e descrita aqui em outros locais.
Exemplos de tais anticorpos incluem anticorpos contra o gangliosídeo GD3, a cadeia alfa receptora da interleucina 5 humana, HER2, receptor de quimiocina CO 4, CD20, CD22, neuroblastoma, MUC1, receptor do 10 fator de crescimento epidérmico (EGFR).
Em uma modalidade preferida da invenção, a referida composição da molécula de anticorpo é originada de qualquer uma das moléculas de anticorpo do grupo Muromomab, Daclizumab, Basiliximab, Abciximab, Rituximab, Herceptina, Gentuzumab, Alentuzumab, Ibritumomab, Cetuximab - 15 (Erbitux), Bevacizumab, Tositumomab, Pavlizumab, Infliximab, Eculizumab, Epratuzumab, Omalizumab, Efalizumab, Adalimumab, Campath-1 H, C2B8, Panorex, BrevaRex, Simulect, Antova, OKT3, Zenapax, ReoPro, Synagis, Ostavir, Protovir, OvaRex, Vitaxin.
Em uma modalidade mais preferida da invenção, a referida composição da molécula de anticorpo é originada de qualquer uma das moléculas de anticorpo do grupo Rituximab, Herceptina, anticorpo do receptor 4 de quimiocina anti-CC KM2160, Campath-1H, C2B8, Erbitux, anticorpo antineuroblastoma chCE7. Em uma modalidade mais preferida da invenção, a referida composição da molécula de anticorpo é originada da molécula de anticorpo do grupo W02004/065423, mais preferivelmente PankoMab, mais preferivelmente sua forma quimérica e mais preferivelmente sua forma humanizada.
É também fornecida uma proteína ou composição proteica obtenível pelo método de produção da presente invenção, em que a proteína é 30 um anticorpo o qual se liga ao etitopo MUC1, compreendendo a sequência de aminoácidos DTR.
MUC-1 é um marcador tumoral estabelecido expresso em uma variedade de tumores epiteliais e é um alvo tumoral potencial. MUC-1 é uma glicoproteína transmembranar altamente O-glicosilada. A porção extracelular consiste em uma quantidade variável de 20 a 120 repetições em tandem (TR), cada uma das quais consistindo em 20 aminoácidos com cinco potenciais lados de O-glicosilação. MUC 1 não é somente expresso em tecidos epiteliais, mas também em células hematopoiéticas. Vários anticorpos são conhecidos, os quais se ligam à porção DTR de MUC1, os quais também são proteínas/anticorpos adequados no contexto da presente invenção (para uma visão geral ver Karsten et al., 1998). Karsten também descreveu um novo etitopo conformacional induzido por carboidrato em MUC1 (TA MUC) de estrutura ...PDT*RP... onde T* é O-glicosilado. Os glicanos presentes neste sítio são eles próprios estruturas de carboidrato tumor-específicas.
Desta forma, é desejável usar um anticorpo MUC o qual possa discriminar entre o etitopo de tumor TA MUC e o etitopo não-glicosilado. Um anticorpo adequado capaz de reconhecer especificamente o etitopo TA MUC glicosilado é o anticorpo PankoMab. Sua produção é descrita em detalhes em Danielczyk et al 2006, aqui totalmente incorporado por referência (PankoMab: a potent new generation anti-tumor MUC-1 antibody). O anticorpo PankoMab ou uma variante sua, se ligando competitivamente ao mesmo etitopo TA-MUC 1 como o anticorpo Panko Mab de origem é preferivelmente usado. Tal variante de anticorpo tem pelo menos uma das seguintes características:
- ele se liga a um etitopo compreendendo pelo menos a sequência de aminoácidos PDTRP;
- ele se liga a um peptídeo MUC curto de 30 aminoácidos compreendendo 1,5 TRs quando ele é glicosilado com Gal-NAcalpha na sequência PDTRP, porém não se o mesmo peptídeo não for glicosilado;
- ele apresenta um efeito de comprimento aditivo maior do que 25, preferivelmente 28 (mais preferivelmente uma proporção de 29,5);
- ele demonstra uma baixa ou mesmo ausência de ligação às células do sistema hematopoiético (em relação ao método de detecção, ver DAnielczyk et al 2006, aqui incorporado por referência);
- ele tem uma alta afinidade para as células variando de aproximadamente pelo menos Kass = 0,2-1 x 109 M'1, conforme definido por análise do gráfico Scatchard.
Exemplos adequados das respectivas variantes são dados nos exemplos. O anticorpo pode ser de murino, origem, quimérico ou humanizado.
O anticorpo que se liga ao etitopo TA-MUC1, preferivelmente o anticorpo PankoMab ou os anticorpos Panko 1 e Panko 2, conforme aqui descritos, tem pelo menos uma das seguintes características de glicosilação:
(i) ele tem um grau de sialilação aumentado com uma quantidade pelo menos 15% maior de ácido N-acetilneuramínico nas estruturas de carboidrato totais ou nas estruturas do carboidrato em um sítio de glicosilação particular da molécula de anticorpo das moléculas de anticorpo na referida composição da molécula de anticorpo do que a mesma quantidade das moléculas de anticorpo de pelo menos uma composição da molécula de anticorpo da mesma molécula de anticorpo isolada de CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096] quando ali expressa;
(ii) ele tem um grau de galactosilação maior com pelo menos uma quantidade 5% maior de estruturas G2 nas estruturas de carboidrato totais ou nas estruturas do carboidrato em um sítio de glicosilação particular da molécula de anticorpo das moléculas de anticorpo na referida composição da molécula de anticorpo do que a mesma quantidade das moléculas de anticorpo de pelo menos uma composição da molécula de anticorpo da mesma molécula de anticorpo isolada de CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096] quando ali expressa;
(iii) ela compreende uma quantidade detectável de bisecGIcNac;
(iv) ela não tem ou é menos de 2% híbrida ou grandes estrutu ras de manose.
Um respectivo padrão de glicosilação resulta no seguinte padrão de atividade benéfico e surpreendente:
(i) uma atividade CDC a qual é maior de 15% superior do que a atividade do mesmo anticorpo expresso em células CHO;
(ii) uma meia-vida no soro a qual é prolongada por um fator de 2 (mais de 1,5) em comparação com um anticorpo o qual não possui grau de sialilação detectável;
(iii) ele tem uma citotoxicidade celular mediada por Fc aumentada a qual é pelo menos 2 vezes maior do que a citotoxicidade celular mediada por Fc de pelo menos uma composição de molécula de anticorpo a partir da mesma molécula de anticorpo quando expressa na linhagem celular CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096],
Um respectivo anticorpo pode ser obtido pela sua produção nas linhagens celulares de acordo com a presente invenção, o qual proporciona um alto grau de sialilação e galactosilação, porém preferivelmente uma fucosilação reduzida. Exemplos similares são NM-H9D8 e NM-H9D8-E6.
As tabelas e figuras a seguir ilustram a presente invenção.
As tabelas 1 a 8 a seguir e as figuras 1 a 17 ilustram a presente invenção.
Tabela 1: Rendimento do PankoMab quimérico expresso em CHOdhfr- e NM-F9 cultivados em meio suplementado com FCS.
Tabela 2: Rendimento do PankoMab quimérico expresso em NM-H9D8 [DSM ACC2806] cultivados em meio sem-soro.
Tabela 3: Quantificação do teor de ácido siálico em PankoMab e CetuxiMAb: os anticorpos foram produzidos pela linhagem celular idêntica e quantificados pela integração da área do pico obtido por cromatografia em fase reversa das variantes do ácido siálico marcado com DMB. NeuGc e NeuAc foram diferenciados pelo uso de um padrão de ácido siálico.
Tabela 4: Quantificação das estruturas diferentemente carregadas em Pankol e PankoMAb: O N-glicano marcado com 2-AB foram subme tido à cromatografia de troca aniônica (coluna Asahi-PAK) e os picos correspondentes às estruturas diferentemente carregadas foram quantificados por integração.
Tabela 5: O grau de galactosilação dos anticorpos Pankol e PankoMab foi determinado por HPLC de aminofase (coluna Luna-NH2) dos glicanos marcados com 2-AB. Os picos foram quantificados por integração e a estrutura do glicano subjacente foi analisada por espectrometria de massa.
Tabela 6: Quantificação das estruturas triantenadas e biantenadas/bifurcadas em Pankol e PankoMab. Os GlcNAc potencialmente bifurcados contendo frações da HPLC-aminofase foram coletados e submetidos a uma cromatografia de fase reversa (coluna RP18). Através disso, estruturas biantenadas + bifurcadas podem ser distintas. O grau de fucosilação dos anticorpos foi determinado por HPLC em aminofase (coluna Luna-NH2) dos glicanos 2-AB marcados. Os picos foram quantificados por integração e a estrutura do glicano subjacente foi analisada por espectrometria de massa. As estruturas fucosiladas e não-fucosiladas foram determinadas e as áreas dos picos integrados foram quantificadas.
Tabela 7: Rendimento de hFSH expresso em CHOdhfr- e GT-2x cultivados em meio suplementado com FCS (CHOdhfr-) ou meio sem-soro.
Tabela 8: Rendimento de hFSH expresso em NM-H9D8 [DSM ACC2806] cultivado em meio sem-soro.
Tabela 9: Glicosilação adequada e combinações de atividade obteníveis com o método de acordo com a presente invenção.
Tabela 10: Valores obtidos de bisecGIcNAc e fucose em diferentes linhagens celulares.
Figura 1: expressão de RNAm fut8 das células NM-F9, NM-D4 e NM-H9D8 [DSM ACC2806]. Como controle foram usadas células HepG2.
Figura 2: Ensaio de liberação de európio com Cetuximab isolado das células NM-H9D8-E6, células CHOdhfr- ou células SP2/0 contra as células LS174T como células-alvo. Os ensaios foram incubados por 4 h em uma proporção de efetor para célula-alvo de 50:1 com concentrações de anticorpo de 0 a 100 ng/mL.
Figura 3: Atividade ADCC de PankoMAb quimérico isolado de NM-F9 é ~ 5 vezes maior do que o PankoMab quimérico isolado das células CHOdhfr-.
Figura 4: Ensaio de liberação de európio com Pankol quimérico isolado das células NM-H9D8-E6, células CHOdhfr- e células NM-H9D8 contra as células ZR-75-1 como células-alvo. O ensaio foi incubado por 4 h em uma proporção de efetor para célula-alvo de 80:1 com concentrações de anticorpo de 0 a 1 μg/mL.
Figura 5: Atividade ADCC de Panko2 quimérico em um ensaio de liberação de európio contra as células ZR-75-1 depois de incubação com uma proporção de efetor para célula-alvo de 50:1 e 5000 células-alvo por cavidade. As amostras foram incubadas em triplicatas.
Figura 6: Atividade ADCC de Panko2 quimérico em um ensaio de liberação de európio contra as células ZR-75-1 depois de incubação com uma proporção de efetor para célula-alvo de 50:1 e 10000 células-alvo por cavidade. As amostras foram incubadas em triplicatas.
Figura 7: Ensaio CDC com PankoMAb quimérico contra ZR-751.
Figura 8: Atividade de ligação do PankoMAb quimérico isolado de NM-F9 para o peptídeo 30-mer MUC1 glicosilado sintético é cerca de 50% maior do que a atividade de ligação do PankoMab quimérico isolado das células CHOdhfr-.
Figura 9: Atividade de ligação do Panko2 quimérico isolado de GT-2x e NM-H9D8 para o peptídeo 30-mer MUC1 glicosilado sintético é cerca de 50% maior do que a atividade de ligação do Panko2 isolado das células CHOdhfr-.
Figura 10: Análise de Western blot foi efetuada para identificar a cadeia pesada diferentemente sialilada das composições da molécula de anticorpo expressa em CHOdhfr-, NM-F9 ou NM- H9D8 [DSM ACC2806]. As proteínas foram transferidas para nitrocelulose e visualizadas ou por anticorpos IgG anti-humanos secundários (figura 10A) ou SNA (figura 10B), os quais detectam a 2-6 sialilação.
Figura 11: Análise de Western blot foi efetuada para identificar a cadeia pesada diferentemente sialilada das composições da molécula de anticorpo expressas em CHOdhfr- ou NM-H9D8. As proteínas foram transferidas para nitrocelulose e visualizadas por SNA, o qual detecta a sialilação 2-
6.
Figura 12: Análise de ELISA foi efetuada para identificar as composições da molécula de anticorpo diferentemente sililadas expressas em CHOdhfr-, GT-2x, NM-H9D8 ou NM-H9D8-E6.
Figura 13: Análise de ELISA foi efetuada para identificar as composições da molécula de anticorpo diferentemente sililadas de Cetuximab expressas em CHOdhfr-, NM-F9 ou NM-H9D8. A sialilação foi analisada (A) por SNA, o qual detecta alfa-2-6-sialilação com ou sem-tratamento com neuraminidase e (B) por MAL I, o qual detecta sialilação alfa2-3.
Figura 14: Dot blots marcados por SNA dos anticorpos quiméricos Panko 1 e Panko 2 isolados das células CHOdhfr-, NM-F9, NM-H9D8, ou NM-H9D8-E6.
Figura 15: O PankoMab quimérico isolado das células NM-H9D8 é disponível por mais tempo no soro de camundongos nus do que aquele isolado de NM-F9.
Figura 16: Análise de SDS-Page de hFSH produzido em NMH9D8 (raia 1) e GT-2x (raia 2). 5 μg de hFSH purificado foram separados por SDS-PAGE sob condições redutoras por raia e marcados por azul brilhante Coomassie. O marcador indica uma faixa de 21 a 108 KD.
Figura 17: análise de Western blot foi efetuada para identificar as composições da molécula de hFSH diferencialmente sialiladas. 1 gg da composição da molécula hFSH de CHO (raia 1), NM-H9D8 (raia 2) e GT-2x (raia 3) foi separado por SDS-Page em gel de acrilamida 10% sob condições redutoras. As proteínas foram transferidas para nitrocelulose e SNA visualizadas, o que detecta a sialilação 2-6.
Figura 18: mostra um anticorpo IgG, em que N-glicanos são covalentemente ligados a um resíduo de Asn 297 conservado no domínio Ch2 de Fc. Conforme indicado, podem haver oligossacarídeos N-ligados adicio
100 nais no domínio Fab, o qual pode ainda influenciar a atividade de ligação do anticorpo. As estruturas de glicano somente na metade do anticorpo são exibidas. O carboidrato Fc é uma estrutura de cadeia ramificada a qual se baseia principalmente nos dois domínios Ch2, com um braço/antena de cada 5 oligossacarídeo interagindo com as áreas hidrofóbicas dos domínios Ch2. A análise estrutural das IgGs de mieloma humano e policlonais demonstraram que Fc contém várias quantidades de uma estrutura central de base biantenada conforme é demonstrado na figura 18. O significado dos símbolos é demonstrado na tabela correspondente. A referida estrutura central pode 10 não conter (GO), conter um (G1) ou dois (G2) resíduos de galactose terminais e/ou um resíduo de GlcNAc e/ou fucose bifurcado no GlcNAc proximal. Outras moléculas de fucose também podem estar presentes nos outros resíduos de GlcNAc ou nos resíduos de galactose. A diversidade é ainda mais aumentada conforme o ácido siálico terminal pode ou não estar presente 15 dependendo das propriedades do anticorpo, uma vez que o ácido siálico foi reportado como apresentando um impacto negativo em ADCC.
Exemplo 1
Análise de expressão de fut8 em células
RNA foi extraído de NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM 20 ACC2605], NM-H9, K562, NM-H9D8 [DSM ACC2806], GT-2x [DSM ACC ________] θ as células HepG2 (controle) de acordo com procedimentos padrões (RNeasy-Mini-Kit, Qiagen). O RNAm foi isolado usando a tecnologia de contas magnéticas de acordo com a instrução dos fabricantes (HDynabeads® Oligo(dT)25H, Invitrogen). Para a síntese da primeira fita de DNAcp, 50 25 μΙ_ de suspensão de contas de cada amostra e a transcriptase reversa Omniscript (Qiagen) foram usadas de acordo com as instruções do fabricante. Para a reação de pRT-PCR subsequente, 5 μΐ_ do produto P de DNAc p e iniciadores fut8 específicos foram usados, resultando em um fragmento de 212 pb. Como controle, iniciadores específicos de actina foram usados, re30 sultando em um fragmento de 240 pb. O(s) produto(s) de PCR Pp resultante^) foi (foram) analisado(s) em um gel de 1,5%.
NM-F9, NM-D4, NM-H9, K562, NM-H9D8 e GT-2x expressam o
101
RNAm para fut8.
Figura 1 mostra como um exemplo a expressão de RNAm fut8 de NM-F9, NM-D4 e NM-H9D8.
Exemplo 2
Glicoengenharia das células K562
A glicoengenharia das células K562 e a geração das linhagens celulares NM-D4 e NM-F9 estão descritas em EP1654353.
As células NM-H9, e uma célula ou linhagem celular derivada delas com alto potencial de sialilação foram geradas como se segue. Mutagênese aleatorizada foi efetuada pelo tratamento das células K562 com o agente alquilante metanossulfonato de etila. Por amostra, as células K562 foram lavadas em PBS e semeadas em meio de cultura de células a 10P6P células por mL suplementado com EMS (0,1 mg/mL, metanossulfonato de etila, Sigma-Aldrich) de um dia para o outro a 37°C e COB2b a 5%. As células foram lavadas e supridas com meio fresco. A cada segundo dia a vitalidade foi determinada por mancha com azul de trypan, e as células foram analisadas por manchamento imunocitoquímico.
Subsequentemente, as células expondo o novo fenótipo de alta expressão de TF foram selecionadas através de um anticorpo TF-específico. As células K562 foram lavadas em B-PBS (BSA 0,5% em PBS), incubadas com 50 pL de sobrenadante de culturas de hibridoma do anticorpo monoclonal A7Q-GIKT ou PankoMab e 950 pL de B-PBS a 4°C por 30 min. Depois da lavagem, o procedimento foi repetido com 50 pL de anticorpo IgM anticamundongo de rato ou anticorpo IgG anticamundongo de rato conjugado com MicroBEads (Miltenyi Biotec, Kõln, Alemanha). Depois da lavagem, as células K562 TF-positivas magneticamente marcadas foram separadas por duas colunas sucessivas fornecidas por Miltenyi Biotec (Kõln, Alemanha) conforme descrito no manual do fabricante. Após nove dias de cultivo, o procedimento de isolamento foi repetido em um total de três vezes. A análise FACS (citometria de fluxo) iniciou-se com a mancha do anticorpo: cerca de 3 x 105 células foram incubadas a 4°C por 1,5 h com anticorpo monoclonal primário (sobrenadantes da cultura do hibridoma de A78-G/A7 (IgM), PankoMab
102 (lgG1), todos diluídos 1:2 em meio de cultura de células) seguido pelo anticorpo IgM ou IgG anticamundongo de cabra conjugado com Cy3 secundário 1:200 diluído em PBS, a 4°C por 30 min e foram novamente lavadas. As células ressuspensas (200 μΙ_ de PBS) foram investigadas por citometria de fluxo (citometria de fluxo: Coulter Epics, Beckman Coulter, Krefeld, Ger). As análises quantitativas foram efetuadas usando o software Expo32 (Becton Coulter) com os seguintes parâmetros para as células marcadas com anticorpo: espalhamento dianteiro (FS): 26 V, ganho de 1, espalhamento para os lados (SS): 807 V, ganho de 5, FL2: 740 V, ganho de 1, e os seguintes parâmetros para as células marcadas com lectina: FS: 26 V, ganho de 1, SS: 807 V, ganho de 5, FL1: 740 V, ganho de 1).
Depois de três ciclos de isolamento, uma população de células K562 de 93% de células TF-positivas foi recebida. Entretanto, a porcentagem de células K562 TF-positivas foi reduzida no decorrer do tempo, alcançando um nível basal de cerca de 20% de células TF-positivas durante um período de 14 dias após o procedimento de isolamento. Para a estável expressão do fenótipo TF-positivo, as células K562 foram isoladas por uma quarta vez e, finalmente, as células K562 TF positivas foram clonadas depois disso por diluição limitada em placas de 96 cavidades (1 célula/100 μΙ_). Dentre os trinta clones de células K562 que foram obtidos, dezessete clones celulares expressaram baixas quantidades do antígeno TF ou não tinham antígeno TF. Esses clones celulares foram analisados por ligação de SNA em citometria de fluxo e para as taxas de proliferação (análise de tempo de duplicação, ver abaixo). Os clones celulares apresentando alta ligação de SNA e uma alta taxa de proliferação foram selecionados. O clone NM-H9 estável foi selecionado para o desenvolvimento clonal adicional por clonagem de célula individual e para otimizar o crescimento sob condições semsoro. Como o clone celular mais preferido, NM-H9D8 [DSM ACC2806] foi selecionado e depositado em DSM ACC2806 em DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH em Braunschweig (Alemanha), por Glycotope GmbH, Robert-Rõssle-Str. 10, 13125 Berlim (Alemanha) em 15 de setembro de 2006.
103
Exemplo 3
Cultivo das linhagens celulares K562, NM-F9, NM-D4, NMH9, NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8, NM-H9D8- E6, NM-H9D8-E6Q12, e GT-2x e células CHOdhfr- e geração de linhagens de células sem-soro
K562, NM-F9, NM-D4, NM-H9, NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8 [DSM ACC2806], NM-H9D8-E6 [DSM ACC2807], NM-H9D8-E6Q12 [DSM ACC2856 em DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH em Braunschweig (Alemanha), por Glycotope GmbH, Robert-RóssIe-Str. 10, 13125 Berlim (Alemanha) em 8 de agosto de 2007, ou GT-2x [DSM ACC____] foram cultivados em RPMI suplementado com FCS
10% e glutamina 2 mM ou sem-soro em meio X-Vivo 20 e crescidas a 37°C em uma atmosfera umidificada de 8%.
As células CHOdhfr- (ATCC No. CRL-9096) foram cultivadas em DMEM suplementado com FCS 10%, glutamina 2 mM e HT 2% suplementado ou sem-soro em meio CHO-S-SFM II e crescidas a 37°C em uma atmosfera umidificada de 8%.
K562, NM-F9, NM-D4, NM-H9, NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8 [DSM ACC2806], NM-H9D8-E6 [DSM ACC2807], NM-H9D8-E6Q12 [DSM ACC2856] ou GT-2x [DSM ACC____] e a célula ou linhagem celular derivada das respectivas células hospedeiras são facilmente adaptadas às condições sem-soro através de uma alteração completa do meio de cultura celular. As células e linhagens celulares de acordo com a presente invenção são inoculadas em um meio sem-soro como X-Vivo 20 em uma densidade de 1 x 10<5> até 5 x 10<5> células/mL, preferivelmente de 2 x 10<5> células/mL, e cultivadas por um método de cultivo comum para células animais. Depois de 4 a 7 dias de cultivo, as células cuja densidade alcançou 5 x 10<5> a 10 x 10<5> células/mL são selecionadas como as células adaptadas em um meio sem-soro. A adaptação ao meio sem-soro também pode ser efetuada pela diluição sucessiva do meio suplementado com FCS por uma composição de meio sem-soro (adaptação contínua). A produtividade dos clones de produção FCS convertidos da composição de anticorpo produzindo as células hospedeiras da presente invenção para as condições sem-soro é na sua
104 maior parte conservada.
A adaptação de CHOdhfr- (ATCC No. CRL-9096) às condições sem-soro tem que ser efetuada passo a passo e leva várias semanas, por meio da qual uma perda de produtividade de pelo menos a metade é co5 mum.
Exemplo 4
Clonagem de vetores para expressar os anticorpos quiméricos PankoMab, Pankoi, Panko2 ou Cetuximab em células eucarióticas
Sequências variáveis de PankoMab foram amplificadas por PCR com iniciadores específicos a partir das células do hibridoma de murino produzindo PankoMab ÍHCancer Immunol Immunother.H Novembro de 2006; 55 (11): 1337-47. Epub Fevereiro de 2006. PankoMab: a potent new generation anti-tumour MUC1 antibody. Danielczyk et al].
Sequências variáveis VH e VL de Pankoi e Panko2 estão des15 critas em W02004/065423, aqui incorporadas por referência.
Cadeia pesada variável de Pankol: EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRSKANNHA TYYAESVKGRFTISRDVSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTRGGYGFDYWGQGTTLTVS
Cadeia leve variável de Pankol:
DIVLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSG VPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGDGTKLELKR
Cadeia pesada variável de Panko2:
EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYT THYAESVKGRFTISRDDSKSSVSLQMNNLRVEDTGIYYCTRHYYFDYWGQGTTLTVS
Cadeia leve variável de Panko2:
DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYFFWYLQKPGLSPQLLIYQMSNLASG VPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPPTFGGGTKLEIKR
As sequências de aminoácidos variáveis de VH e VL de Cetuxi25 mab foram obtidas a partir de http://redpoll.pharmacv.ualberta.ca/druqbank/ cqi-bin/qetCard.cqi?CARD=BTD00071.txt e traduzidas em modo reverso nas sequências codificadoras de DNAc usando VectorNTI.
Cadeia pesada variável de Cetuximab:
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDY N TPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVS
105
Cadeia leve variável de Cetuximab:
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPS RFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKR
A sequência de DNA foi prolongada por Ncol/Nhel no caso para LV e Ncol/SAII no caso de VH e o DNAc foi gerado. Os fragmentos da cadeia pesada variável do corte Ncol/Xhil VH foram clonados no vetor-líder BS do corte Ncol/SAII conforme descrito em W02004/065423. O vetor BS-líder inclui um cassete de clonagem para introduzir a sequência de peptídeo de sinal receptor de célula T na extremidade 5' e uma sequência doadora de união na extremidade 3’ dos domínios variáveis. A cadeia leve variável VL do anticorpo correspondente foi amplificada com um iniciador específico na extremidade 3’ codificando adicionalmente o sítio doador de união e foi clonada através de Ncol/Nhel no vetor-líder BS digerido da mesma forma. Depois disso, cada fragmento Hindlll/BamHI do vetor-líder BS foi clonado no vetor de expressão eucariótico correspondente. Esses vetores (pEFpuroCgamalVBHB, pEFdhfrCkappaVBLB, pEFdhfrBmutBCkappaVBLB) compreendem o promotor EF-1-alfa e o intensificador HCMV, a origem SV40, o sinal de poliadenilação, o gene de resistência à puromicina no vetor para a cadeia pesada e o gene de di-hidrofolase de murino (dhfr) para a expressão da célula CHO ou da SEQ ID 1 (Sequência 1N° ) para K562, NM-F9 [DSM ACC2606], NM-D4 [DSM ACC2605], NM-H9, NM-E-2F9, NM-C-2F5, NMH9D8 [DSM ACC2806], NM-H9D8-E6 [DSM ACC2807], NM-H9D8-E6Q12 [DSM ACC2856], ou a expressão de GT-2x [DSM ACC________] para a seleção e amplificação de gene no vetor para a cadeia leve, assim como as sequências genômicas da região gamai constante humana para a cadeia pesada ou a região kappa constante humana para a cadeia leve (iniciadores para a amplificação do DNA humano genômico e mapa de vetores ver W02004/065423).
Exemplo 5
Transfecção de células eucarióticas para expressar os anticorpos quiméricos PankoMab, Pankoi, Panko2 ou Cetuximab e o procedimento de amplificação de gene para gerar clones celulares de alta produtividade na presença de soro
106
Para expressar os anticorpos quiméricos em NM-F9 [DSM ACC2606] ou CHOdhfr- [ATCC No. CRL- 9096], as células foram cotransfectadas com uma mistura dos vetores descritos acima para as cadeias pesada e leve (1:1 até 1:3) por lipofecção usando DMRIE-C ou eletroporação para as células em suspensão como NM-F9 e lipofectamina ou eletroporação para a linhagem celular aderente CHOdhfr-. Dois dias após a transfecção, o meio de crescimento foi alterado para o meio de seleção (NM-F9 em RPMI 1640 + FCS a 10% + 2 mM de L-glutamina + 0,75 pg/mL de puromicina + 50 nM de metotrexato; CHOdhfr- em DMEM + FCS a 10% dialisado + Lglutamina 2 mM + 5 gg/mL de puromicina + 50 mM de metotrexato) por 1 semana. A primeira amplificação foi efetuada aumentando a concentração de metotrexato até 100 nM por mais 2 semanas. Parte da população de células amplificadas foi clonada de uma única célula sem a adição de puromicina e metotrexato, o resto das células foi submetido a um novo ciclo de amplificação de gene pelo aumento da concentração de metotrexato. Dessa forma, de quatro a seis ciclos de amplificação de genes (100, 200, 500, 1000, 2000, 3000 nM de metotrexato) foram efetuados. Adicionalmente, os melhores clones produtores identificados por varredura e análise de clones foram adicionalmente amplificados semelhantemente.
Após a clonagem de uma única célula em placas de 96 cavidades usando diluição limitada (0,5 célula por cavidade), as placas foram cultivadas por 2 a 3 semanas, microscopicamente analisadas para os clones de células em crescimento e eficiência de clonagem em % (quantidade de cavidades com clones de células em crescimento x 100/quantidade teórica de células semeadas) foi determinada. Os clones em crescimento foram varridos quanto à produtividade usando diferentes procedimentos para células CHOdhfr- aderentes ou para células em suspensão NM-F9.
CHOdhfr-: as células dos clones em crescimento foram lavadas com PBS e colhidas por tratamento com Accutase. A metade das células ressuspensas foi semeada em uma placa de teste de 96 cavidades, a outra metade foi semeada em uma placa de 24 cavidades para o cultivo adicional. A placa de teste foi cultivada por 20 a 24 h. O sobrenadante de cada cavida
107 de foi analisado quanto ao título de anticorpos, conforme descrito em Determinação da taxa de produtividade específica (SPR) e tempo de duplicação (g) (ver abaixo). A densidade de células relativa foi medida usando o ensaio MTT. Em detalhes, as células foram incubadas com solução MTT por 2 h, a 5 solução foi descartada e as células lisadas por uma solução de HCl a 0,04 M em 2-propanol. Depois de 2 horas, a placa foi moderadamente misturada e medida usando um fotômetro de placa de microtitulação com um filtro de 570 nm em modo dual contra um filtro de referência de 630 nm.
NM-F9: As placas de 96 cavidades foram centrifugadas e o so10 brenadante foi descartado. As células foram ressuspensas em 200 μΙ_ de meio fresco. A metade das células ressuspensas foi semeada em uma placa de teste de 96 cavidades e diluída com 100 μΙ_ de meio, a outra metade permaneceu nas placas de clonagem para cultivo adicional. Depois de 2 dias de cultivo, a placa de teste foi centrifugada e 20 μΙ_ do sobrenadante foram 15 analisados para o título de anticorpo, conforme descrito em Determinação da taxa de produtividade específica (SPR) e tempo de duplicação (g) (ver abaixo). A densidade de células relativa foi medida usando o ensaio WST-1 pela adição de 10 μΐ de solução WST-1 (Roche) em cada cavidade. Depois de 1 a 3 horas de incubação, as medições foram efetuadas usando um fotômetro 20 de placa de microtitulação com um filtro de 450 nm em modo dual contra um filtro de referência de 630 nm.
Os clones celulares com uma alta proporção de título e anticorpo em relação à densidade celular foram selecionados e cultivados e posteriormente analisados.
As condições para K562, NM-D4 e NM-H9 foram as mesmas.
Determinação da taxa de produtividade específica (SPR) e tempo de duplicação (q)
Para cada clone, 2 x 10P4P células foram semeadas por cavidade de uma placa de cultivo tecidual de 24 cavidades em 500 μΙ_ de meio de 30 crescimento. As células foram deixadas crescer por 3 dias, o meio condicionado foi coletado para análise, e as células foram removidas, caso necessário, por Accutase e contadas. Os títulos de anticorpo específicos foram quan108 titativamente determinados a partir das amostras de meio por ELISA. As placas de ensaio foram revestidas com um anticorpo específico da cadeia kappa humana (BD). O anticorpo recombinante ligado foi detectado com o conjugado da peroxidase de rábano silvestre (HRP) IgG anti-humana (H+L) 5 (Jackson Immunoresearch Laboratories). Para a quantificação, o anticorpo quimérico recombinante purificado foi usado como padrão.
A SPR foi medida em picogramas de proteína específica por célula por dia (pcd) é uma função tanto da taxa de crescimento quanto da produtividade, e foi calculada pelas seguintes equações:
Massa de proteína total
SPR = ----------------Área celular integral (ICA) (quantidade de células final - número de células inicial x dias de cultivo
ICA = -----------------------------------------------------------Log B6b (número de células final/quantidade de células inicial . 10 O tempo de duplicação foi calculado pela seguinte equação:
G = log 2 x (horas em cultura)/log (quantidade de células final / quantidade de células inicial)
Determinação do rendimento médio e do rendimento máximo das linhagens celulares
Após a clonagem de célula única em placas de 96 cavidades usando diluição limitada (0,5 célula por cavidade) conforme descrito acima, a partir de 200 clones únicos teoricamente plaqueados, a SPR é determinada para os clones celulares em crescimento e a média e o desvio são determinados, assim como o rendimento máximo para as diferentes linhagens celu20 lares e diferentes condições. Tabela 1 compara os dados dos clones celulares produtores de PankoMab quimérico de CHOdhfr- e NM-F9 desenvolvidos sob condições contendo soro.
Exemplo 6
Geração de clones celulares com rendimento elevado livre 25 de soro produzindo uma composição de moléculas de anticorpo
A transfecção de NM-H9D8, NM-H9D8-E6, NM-H9D8-E6Q12 ou GT-2x adaptadas ao meio sem-soro X-Vivo 20 foi efetuada sob condições
109 sem-soro usando DMRB-c ou eletroporação (Nucleofector, Amaxa). Dois dias após a transfecçãçuo meio de crescimento foi alterado para o meio de seleção (X-Vivo 20 + (Wgg/mL de puromicina + 50 nM de metotrexato) por 1 semana. A primeira amplificação foi efetuada aumentando-se a concentração de metotrexato atéUDO nM por mais duas semanas. Parte da população celular amplificada foi dfcnada de célula única em X-Vivo sem a adição de puromicina e metotrexdb, o resto das células foi submetido a um novo ciclo de amplificação de gems através do aumento da concentração de metotrexato. Deste modo, de qKatro a seis ciclos de amplificação de gene (100, 200, 500, 1000, 2000, 3000 de metotrexato) foram efetuados. Adicionalmente, os melhores clones produtores identificados por varredura e análise de clones foram adicionalmenfe amplificados semelhantemente. Após a clonagem de uma única célula emplacas de 96 cavidades usando diluição limitada (0,5 célula por cavidade), as placas foram cultivadas por 2 a 3 semanas, microscopicamente analisadas para os clones de células em crescimento e eficiência de clonagem em % (quantidade de cavidades com clones de células em crescimento x 100/quarrtídade teórica de células semeadas) foi determinada. Os clones em crescimento foram varridos quanto à produtividade usando o mesmo procedimento para as células em suspensão NM-F9 na presença de soro (ver acima).
Determinação do rendimento médio e do rendimento máximo para os clones celulares
Após a clonagem de célula única em placas de 96 cavidades usando diluição limitada (0,5 célula por cavidade) conforme descrito acima, a partir de 200 clones únicos teoricamente plaqueados, a SPR é determinada para os clones celulares em crescimento e a média e desvio são determinados, assim como o rendimento máximo para as diferentes condições. Tabela 2 mostra os dados dos clones celulares produtores de PankoMab quimérico de NM-H9D8 [DSM ACQ2806] desenvolvidos sob completamente sob condições sem-soro.
As taxas de produção específicas (SPR) após a amplificação em linhagens celulares de sacordo com a invenção são maiores do que em
110
CHOdhfr-, e maiores em células NM-H9D8 [DSM ACC2806] produtoras de PankoMab quiméricas desenvolvidas sob condições sem-soro.
A taxa de produção da maioria dos clones é altamente estável durante pelo menos 6 semanas sem pressão de seleção. O melhor clone foi estável com uma SPR de 30 pcd em 6 semanas com uma taxa de duplicação de 24 h.
A data reflete a produtividade dos clones em escala pequena laboratorial com potencial adicional no aumento de produtividade por desenvolvimento de processo, otimização de meio e fermentação.
Uma produtividade mais alta e o rendimento dos clones de produção desenvolvidos sob condições sem-soro são vantajosos e as condições são as mesmas para todos os outros anticorpos e para todas as linhagens celulares, como K562, NM-F9, NM-D4, NM-H9, NM-E-2F9, NM-C-2F5, NM-H9D8-E6 [DSM ACC2807], NM-H9D8-E6Q12 [DSM ACC2856], ou GT15 2x [DSM ACC______] adaptado para as condições sem-soro.
Exemplo 7
Isolamento de uma composição de molécula de anticorpo
Para a produção e isolamento de uma composição de molécula de anticorpo de acordo com a invenção, as células estavelmente transfecta20 das secretando os anticorpos quiméricos PankoMab, Pankol, Panko2 ou Cetuximab foram cultivadas em meio sem-soro até uma densidade celular de cerca de 1 a 2 x 10P6P células/mL ser alcançada. Após a remoção das células do sobrenadante de cultura celular por centrifugação (400 x g, 15 min), o anticorpo quimérico foi purificado usando uma coluna de proteína A (HiTrap r-protein A FF, Amersham Pharmacia Biotech). A fração de anticorpo purificado que eluiu por alteração de pH repentina foi retamponada em PBS e concentrada usando tubos de centrífuga Centriprep (corte de 50 KDa, Millipore).
Exemplo 8
Determinação da citotoxicidade celular mediada por Fc das composições da molécula de anticorpo de acordo com a invenção Isolamento de PBMC dos doadores sanguíneos como célu111 las efetoras
PBMC foi isolada a partir do sangue de doadores saudáveis por centrifugação por densidade com Ficoll-Hypaque (Biochrom). As células foram lavadas 3 vezes com RPMI 1640 suplementado com 5% de FCS e crio5 conservadas em bateladas separadas de 5 x 107 células. PBMC foram descongelados e usados diretamente ou mantidos de um dia para o outro em RPMI 1640 suplementado com FCS 10% (RPMI/FCS) antes do uso em citometria de fluxo ou como células efetoras nos ensaios citotóxicos.
Detecção da citotoxicidade celular dependente de anticorpo 10 em um modelo in vitro
A citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) dos anticorpos recombinantes de acordo com a invenção foi investigada em um ensaio de liberação de európio. As células-alvo (ZR-75-1, 5 x 106) foram incubadas por 6 minutos em gelo em 800 μΙ_ de tampão európio (HEPES 50 15 mM, pH 7,4, NaCI a 93 mM, KCI a 5 mM, MgCh a 2 mM, ácido dietilenotriaminopentacético 10 mM, acetato de európio (III) 2 mM, eletroporadas (710 V, 1 pulso, 30 με) em um Multiporador (eppendorf) e subsequentemente incubadas em gelo por mais 6 min. A seguir, as células foram lavadas 5 vezes em RPMI 1640/FCS 5% e semeadas em uma placa de fundo redondo de 96 20 cavidades (Nunc; 1 x 104 células em 100 μ[_ por cavidade). Após a adição de 20 μΙ_ dos anticorpos recombinantes em concentrações variadas (09,5 a 25 μg/mL de concentração final em um volume de incubação de 200 μΙ_) ou os controles correspondentes (meio, IgG humana de controle de isotipo), células sanguíneas periféricas humanas (80 μΙ_ por cavidade) foram adicionadas 25 como células efetoras, usando uma proporção de efetor/célula-alvo de 50:1.
μΙ_ de RPMI/FCS sem células efetoras foram adicionados para determinar a liberação espontânea. A liberação máxima foi determinada após a completa lise das células-alvo com etanol. Após incubação em um incubador a 37°C por 4 horas, a placa foi centrifugada a 500 x g por 5 minutos, e 25 μι de ca30 da amostra foram pipetados em 200 μΙ_ por cavidade de solução de intensificação (Perkin-Elmer Wallac). Após a incubação por 15 min em temperatura ambiente, a fluorescência foi determinada (fluorímetro VictorP2P, Perkin112 v
Ίβ
Elmer Wallac). A citotoxicidade específica é obtida a partir da equação (lise experimental - lise espontânea)/(lise máxima - lise espontânea)*100.
Alternativamente, as células-alvo (LS174T ou ZR-75-1, 3 x 106 células) foram incubadas por 6 minutos em gelo em 100 μΙ_ de tampão euró5 pio (HEPES 50 mM, pH 7,4, NaCI 93 mM, KCI 5 mM, MgCI2 2 mM, ácido dietilenotriaminopentacético 10 mM, acetato de európio (III) 2 mM, eletroporadas em um Nucleofector II (Amaxa) com programa A-011 e subsequentemente incubadas em gelo por mais 6 min. A seguir, as células foram lavadas 4 vezes em RPMI 1640/FCS 5% e semeadas em uma placa de fundo redon10 do de 96 cavidades (Nunc; 5 a 10 x 103 células em 100 μΙ_ por cavidade). Após a adição de 20 μΙ_ dos anticorpos recombinantes em concentrações variadas (0,001 a 100 ng/mL de concentração final em um volume de incubação de 200 μΙ_ para Cetuximab; 0,16-5 pg/mL para PankoMab quimérico, Pankol ou Panko2) ou os controles correspondentes (meio, IgG humana de . 15 controle de isotipo), células sanguíneas periféricas humanas (80 pL por cavidade) foram adicionadas como células efetoras, usando uma proporção de efetor/célula-alvo de 100:1 até 50:1. 80 pL de RPMI/FCS sem células efetoras foram adicionados para determinar a liberação espontânea. A liberação máxima foi determinada após a completa lise das células-alvo com Triton X20 100. Após incubação em um incubador a 37°C por 4 horas de um dia para o outro, a placa foi centrifugada a 500 x g por 5 minutos, e 25 pL de cada amostra foram pipetados em 200 pL por cavidade de solução de intensificação (Perkin-Elmer Wallac). Após a incubação por 10 min em temperatura ambiente, a fluorescência foi determinada (fluorímetro Victor2, Perkin-Elmer 25 Wallac). A citotoxicidade específica é obtida a partir da equação (lise experimental - lise espontânea)/(lise máxima - lise espontânea)*100.
A atividade ADCC do Cetuximab isolado da linhagem celular NM-H9D8-E6 FUT8’ é significativamente maior do que a atividade ADCC do Cetuximab isolado a partir das células CHOdhfr- ou das células SP2/0. Con30 forme mostrado na figura 2, o Cetuximab isolado de NM-H9D8-E6 induz a mesma lise específica das células LS174T em cerca de concentrações de anticorpo 30 vezes menores como Cetuximab isolado de CHOdhfr- ou de
113
V células SP2/0 (Erbitux, obtido da Merck). Isso indica uma atividade ADCC 30 vezes maior em comparação com o produto comercialmente disponível. Esse resultado é obtido usando o método de produção da presente invenção, resultando em um padrão de glicosilação otimizado.
Também a atividade do PankoMab quimérico isolado de NM-F9
[DSM ACC2606], K562, NM-H9, NM-D4 [DSM ACC2605], NM-H9D8-E6 [DSM ACC2807], NM-H9D8-E6Q12 [DSM ACC2856], GT-X2 [DSM ACC _______], ou NM-H9D8 [DSM ACC2806] é cerca de 5 vezes maior do que a atividade ADCC do PankoMAb quimérico isolado das células CHOdhfr-. Cer10 ca de um quinto da concentração de PankoMab quimérico leva à mesma atividade ADCC que o PankoMab quimérico expresso nas células CHOdhfr-. Figura 3 mostra os respectivos resultados na linhagem celular NM-F9 para propósitos de comparação.
A atividade ADCC do Panko 1 quimérico isolado de NM-H9D815 E6 ou NM-H9D8-E6Q12 é cerca de 8 vezes maior do que a atividade ADCC do Pankol quimérico isolado das células CHOdhfr-. Cerca de um oitavo da concentração de Panko 1 quimérico leva à mesma atividade ADCC que o Panko 1 quimérico expresso nas células CHOdhfr-. Os respectivos resultados estão mostrados na figura 4.
A atividade ADCC do Panko 2 quimérico isolado de NM-H9D8 ou GT-2x é cerca de 6 vezes maior do que a atividade ADCC do Panko2 quimérico isolado das células CHOdhfr-. Cerca de um sexto da concentração de Panko 2 quimérico leva à mesma atividade ADCC que o Panko2 quimérico expresso nas células CHOdhfr-. Os respectivos resultados estão mostra25 dos na figura 5.
A atividade ADCC do Panko 2 quimérico isolado de NM-H9D8E6 é menor do que a atividade ADCC do Panko2 quimérico isolado das células NM-H9D8. Os respectivos resultados estão mostrados na Figura 6.
Detecção da citotoxicidade celular dependente de comple30 mento em um modelo in vitro.
A citotoxicidade celular dependente de complemento (CDC) dos anticorpos foi investigada em um ensaio de liberação de európio. Células
114 alvo carregadas com Eu3+ (ZR-75-1, 3 x 106) foram preparadas conforme descrito acima.
Depois disso, as células foram semeadas em uma placa de fundo redondo de 96 cavidades (Nunc; 5 x 103 células em 100 μι por cavidade). Após a adição de 20 μΙ_ dos anticorpos em concentrações variadas (0,5 a 50 pg/mL de concentração final em um volume de incubação de 200 μΙ_) as células foram incubadas em meia hora em temperatura ambiente. Após isso, 10 pL por cavidade de complemento de filhote de coelho (Cedarline, diluído de 1:5 a 1:10) foram adicionados. 10 pL de RPMI/FCS sem complemento foram adicionados para determinar a liberação espontânea. A liberação máxima foi determinada após a completa lise das células-alvo com etanol ou TritonX-100 1%. Após incubação em um incubador a 37°C por 3 a 3,5 horas, a placa foi centrifugada a 500 x g por 5 minutos, e 25 μΙ_ de cada amostra foram pipetados em 200 μΙ_ por cavidade de solução de intensificação (Perkin-Elmer Wallac). Após a incubação por 10 min em temperatura ambiente, a fluorescência foi determinada (fluorímetro VictorP2P, Perkin-Elmer Wallac). A citotoxicidade específica é obtida a partir da equação (lise experimental lise espontânea)/(lise máxima - lise espontânea)*100.
A atividade CDC do PankoMab quimérico isolado das células NM-F9 é 8 vezes maior do que a atividade CDC do PankoMab quimérico isolado das células CHOdhfr-. A mesma lise específica é induzida em uma concentração 8 vezes mais baixa de PankoMab quimérico isolado de NM-F9 em comparação com o PankoMab quimérico isolado das células CHOdhfr-. Os respectivos resultados estão mostrados na figura 7.
Ensaio de formação de conjugado (CFA) para analisar a atividade de fagocitose das composições da molécula de anticorpo
Mancha de células tumorais com PKH26:
De 1 x 10P7P a 2 x 10P7P células tumorais foram lavadas duas vezes em PBS, ressuspensas em 1 mL de diluente C, 1 mL de PKH26 foi adicionado na concentração de 12 x 10P'6P M para ZR-74-1, ZR-74-1TF, MCF-7 e MT-3.
Depois de 3 min de incubação em temperatura ambiente, a
115 mancha foi interrompida pela adição de 2 mL de FCS por 1 min em temperatura ambiente. Meio (4 mL, RPMI suplementado com L-glutamina 1%, FCS 10%) foi adicionado, as células foram decantadas por rotação e lavadas 4 vezes com meio. As células tumorais foram inoculadas a 37°C, COB2b 5% 5 para permitir a liberação do excesso de PKH-26.
A otimização do manchamento com PKH-26 foi efetuada com metade da quantidade e volumes de células.
CFA:
Células tumorais marcadas com PKH-26 foram coletadas com 10 tripsina/EDTA, lavadas uma vez com PBS e ressuspensas em 0,8 x 10P6P células/mL em meio de células MAK (Invitrogen) na presença ou ausência das composições das moléculas de anticorpo recombinantes. As células tumorais (250 pL, 0,2 x 10P6P células) foram semeadas em tubos de polipropileno não-aderentes.
As células MAK foram preparadas de acordo com Boyer et al.,
Exp. Hematol. 27, 751-761 (1999), lavadas e ressuspensas a 1,6 x 10P6P células/mL. 250 pL de células MAK (0,2 x 10P6P células) foram adicionadas às células tumorais marcadas com PKH-26 (proporção E:T de 2:1). As amostras individuais foram incubadas em duplicatas a 4°C e 37°C/5% de 20 COB2B por 3 h ou o. n. (18-20 h).
Depois da incubação a 3 h ou o. n. as células foram lavadas com PBS e marcadas com CD11c-FITC (1:18,5) + 7-AAD (1:500) em PBS/FCS 10%. As células foram coletadas com PBS, ressuspensas em 400 pL de PBS. A aquisição foi feita em 10.000 células em Epics XL (Beckman Coul25 ter). A porcentagem de células MAK colocalizadas foi determinada como a porcentagem de células PKH-26 positivas na população celular total para todas as células CD11c-FITC positivas viáveis.
Exemplo 9
Análise da atividade de ligação da composição da molécula 30 de anticorpo em ELISA
Para analisar a ligação de antígeno das composições da molécula de anticorpo expressas em diferentes linhagens celulares, as composi116 r
ι ções das moléculas de anticorpo purificadas de PankoMab2 quimérico e Panko 2 foram medidas em um ELISA em peptídeo 30 mer MUC1 glicosilado sintético com a sequência APPAHGVTSAPDT [GaINAcalfa] RPAPGSTAPPAHGVTSA. O peptídeo MUC1 não-glicosilado serviu como controle.
Usando soluções estoque (1 mg em 1 mL de HB2bO bidestilada) armazenadas em porções a -20°C, uma diluição de 1 pg/mL em PBS foi produzida. 50 pL/cavidade foram pipetados em uma imunoplaca NUNC F96 MaxiSorp, e a placa de teste foi incubada a 4°C de um dia para o outro. No dia seguinte, a placa de teste foi lavada 3 vezes com PBS/Tween-20 0,2%.
Subsequentemente, sítios de ligação não-específicos foram bloqueados com BSA 2% em PBS, incubados por pelo menos 1 h em temperatura ambiente, e 50 pL do PankoMab recombinante foram aplicados (1 - 400 ng/mL de PBS/BSA 1%). Depois de três passos de lavagem com PBS/Tween-20 0,2%, * o anticorpo Fcy1 anti-humano secundário acoplado à peroxidase foi empre. 15 gado para detectar o anticorpo especificamente ligado. Para detectar o anticorpo secundário ligado, uma reação colorida com TMB (3,3',5,5'tetrametilbenzidina) foi efetuada. Depois de 15 min, a reação foi interrompia pela adição de NB2BSOB4b 2,5 N. A medição foi efetuada usando um fotômetro de placa de microtitulação com filtro de 450 nm em modo dual contra um filtro de referência de 630 nm.
A atividade de ligação do PankoMab quimérico isolado de NMF9 é cerca de 50% maior do que a atividade de ligação do PankoMab quimérico isolado das células CHOdhfr (figura 8).
A atividade de ligação do Panko2 quimérico e isolado do clone de elevada sialilação NM-H9D8 em ELISA é comparável àquela de GT-2x e maior ainda em comparação com aquele das células CHOdhfr (figura 9).
Exemplo 10
Análise de glicana das composições da molécula de anticorpo expressas em células NM-F9, NM e CHOdhfr
Glicanos de pelo menos 100 μg de anticorpo purificado foram clivados por hidrólise ácida. Ácidos siálicos foram marcados especificamente por conjugação com o corante de fluorescência DMB. A análise foi efetuada
117 por HPLC, por exemplo, em uma coluna Asahipak-NH2 para separar os sacarídeos. A identificação e o cálculo dos ácidos siálicos foi efetuado por substâncias padrões dos ácidos siálicos apropriados.
A análise da composição da molécula de anticorpo PankoMab quimérica expressa em células CHOdhfr ou NM-F9 revelou em < de 10% de monossialilação do produto CHOdhfr e quase nenhuma sialilação do produto NM-F9 ou GT-2x. O último continha somente glicanos não-carregados.
Em maiores detalhes, glicanos de pelo menos 100 μg de anticorpo purificado foram clivados por hidrólise ácida. Os ácidos siálicos foram marcados especificamente por conjugação com os corantes fluorescentes, tipo DMB. A análise foi efetuada por HPLC, por exemplo, por cromatografia em fase reversa em uma coluna RP-18. A identificação e o cálculo dos ácidos siálicos foram efetuados por substâncias padrões dos ácidos siálicos apropriados.
Para a determinação das estruturas de glicanos carregadas e o estado de galactosilação, 100 μg de anticorpos foram digeridos por tripsina e os N-glicanos foram obtidos por tratamento com PNGaseF. Os glicanos purificados foram marcados com 2-aminobenzamida (2-AB) e submetidos à HPLC de cromatografia de troca aniônica (coluna Asahi-PAK) para a determinação de estruturas de Nglicano carregadas. Para a determinação do estado de galactosilação, os N-glicanos foram tratados por neuraminidase para o esgotamento do teor de ácido siálico e separados por HPLC Aminophase (coluna Lna-NH2) e os picos foram analisados por espectrometria de massa.
Os GlcNAc potencialmente bifurcados carregando glicano contendo picos foram separados em um segundo passo por cromatografia em fase reversa (coluna RP18). Através disso, estruturas triantenadas e biantenadas+ bifurcadas podem ser distintas. O grau de fucosilação dos anticorpos foi determinado por HPLC em amino fase (coluna Luna-NH2) dos glicanos 2AB marcados. Os picos foram quantificados por integração e a estrutura glicano subjacente foi analisada por espectrometria de massa. As estruturas fucosiladas e não-fucosiladas foram determinadas e as áreas dos picos integrados foram quantificadas.
118
Diferentes composições da molécula de anticorpo de Cetuximab, PankoMab e Pankol expressas em células NM-F9, GT-2x, NM-H9D8, NMH9D8-E6, ou CHOdhfr foram analisadas e os resultados estão resumidos nas tabelas 3 a 4.
Lecitinas as quais se ligam preferivelmente aos ácidos siálicos alfa 2-6 (SNA) ou alfa 2-3 (MAL-1) ligados foram usados para caracterizar a sialilação do anticorpo por ELISA ou análise de Western blot.
A análise de Western blot foi efetuada para identificar as cadeias pesadas diferentemente sialiladas das composições da molécula de anticorpo expressas em CHOdhfr, NM-F9, ou NM-H9D8 [DSM ACC2806]. 5 pg de cada composição da molécula de anticorpo foram separados por SDS-Page em um gel de acrilamida 10% sob condições redutoras. As proteínas foram transferidas para nitrocelulose e visualizadas por lecitinas e/ou por anticorpos IgG anti-humanos secundários. A figura 10 mostra as cadeias pesadas diferentemente sialiladas das composições da molécula de anticorpo de PankoMab quimérico expressas em CHOdhfr, NM-F9, ou NM-H9D8 [DSM ACC2806] ou por anticorpos IgG anti-humanos secundários (figura 10A) ou SNA (figura 10B) os quais detectam a sialilação 2-6. A figura 11 mostra as cadeias pesadas diferentemente sialiladas das composições da molécula de anticorpo de Cetuximab expressas em CHOdhfr ou NM-H9D8 visualizadas por ligação de SNA.
Experimentos de ELISA foram usados para analisar a sialilação dos anticorpos isolados dos sobrenadantes das células NM-F9, NM-H9D8 ou NM-H9D8-E6. Os anticorpos purificados de 2 μg/mL em PBS e 50 μί por cavidade foram coletados em placas de microtitulação de 96 cavidades (Maxisorp) a 4°C de um dia para o outro, bloqueados (PBS/BSA), lavados e incubados por 1 hora com SNA biotinilado (2 gg/mL, PBS/ BAS 1%) e novamente lavados. As cavidades foram, a seguir, incubadas com PODestreptavidina, lavadas e desenvolvida com TMB. A reação foi interrompida pela adição de H2SO4 2,5 N e a densidade ótica foi medida a 450 nm contra 630 nm como referência. A figura 12 mostra que a ligação do SNA ocorre aos anticorpos expressos nas células NM-H9D8 ou NM-H9D8-E6, porém
119 não nos anticorpos expressos nas células CHOdhfr ou GT-2x. AS intensidades de ligação são diferentes para os anticorpos individuais, o que indica um diferente grau de sialilação causado pela fina estrutura dos anticorpos individuais ou a disponibilidade dos sacarídeos sob as condições usadas.
Experimentos de ELISA foram efetuados através do revestimento dos anticorpos purificados expressos nas diferentes linhagens celulares nas cavidades das placas de microtitulação (2 pg/mL, 50 pL por cavidade) e a detecção por lectinas biotiniladas apropriadas SNA e MAL I. A dependência da ligação da lectina por sialilação foi verificada por tratamento com neuraminidase (0,1 U/mL e incubação em temperatura ambiente por 1 hora). Os resultados para o Cetuximab estão ilustrados na figura 13A e na figura 13B.
Análises dot blot foram efetuadas para identificar as diferenças na sialilação dos anticorpos expressos nas células CHOdhfr, NM-F9, NMH9D8 e NM-H9D8-E6. 3 pg dos anticorpos purificados foram marcados cada um com nitrocelulose, bloqueados com PBS/BSA, lavados e visualizados por SNA, que detecta sialilação 2-6. A figura 14 mostra marcas dos anticorpos quiméricos Pankol e Panko2 isolados das células CHOdhfr, NM-F9, NMH9D8, ou NM-H9D8-E6. A sialilação 2-6 somente é detectável nos anticorpos isolados das células NM-H9D8 ou NM-H9D8-E6.
Exemplo 11
Detecção da biodisponibilidade das composições de molécula de anticorpo expressas nas células NM-F9, NM-H9D8 e CHOdhfr
Uma biodisponibilidade mais longa foi medida nos camundongos nus para o anticorpo sialilado PankoMab expressa em NM-H9D8 em comparação com o anticorpo PankoMab não-sialilado expresso nas células NM-F9. 5 pg de anticorpo purificado por camundongo foram injetados i.v. para pelo menos 3 camundongos por grupo.
Amostras de sangue foram coletadas em diferentes pontos de tempo após a injeção (5 minutos, 2, 5, 8, 24, 48, 72 e 144 horas após a injeção), o soro foi isolado e as amostras foram armazenadas a -80°C até a análise. O título do anticorpo foi determinado nessas amostras por ELISA. A figura 15 mostra que o PankoMab quimérico isolado das células NM-H9D8 é
120 disponível por mais terqando que aquele isolado das células NM-F9, o que é provavelmente causadogela diferente sialilação dos anticorpos.
Exemplo 12
Clonagem As vetores para expressar hFSH em células eu5 ca ri óticas
As sequêndas codificadores da cadeia FSH alfa e FSH beta foram amplificadas por RCR com iniciadores específicos usando os clones
BAC RZPDB737B1220W (FSHalfa genômico), IRAUp969E0752D (FSHalfa DNAc) e RZPDB737HB619D6 (FSHbeta genômico) obtidos de RZPD, A10 lemanha.
Iniciadores para aeadeia FSH alfa:
FSHa-wt-f-Kpnl: AAAGGTACCATGGATTACTACAGAAAATATG /
FSHa-b-BamHI: AAAGGATCCTTAAGATTTGTGATAATAAC;
Iniciadores para a cadeia FSH beta:
FSHb-wt-f-Hindlll: TTTAAGCTTATGAAGACACTCCAGTTTTTC / FSHb-b-BamHI: TTTGGATCCTTATTCTTTCATTTCACC
Depois da amplificação, os produtos foram clonados através de
Hindlll/BamHI (FSH genômico beta) e Kpnl/BamHI (FSH genômico alfa ou FSH DNAc alfa) no vetor de expressão eucariótico correspondente. Uma sequência de DNAc foi produzida por Genesynthesis codificando a cadeia beta de FSH fundida a uma sequência-líder TOR e clonada no vetor de ex20 pressão eucariótico (FSHcDNAbeta).
Sequência FSHDNAcbeta (sequência-líder TCR sublinhada): atqqcctqccccqQcttcctqtqaaccctQqtaatcaqcacctQcctQQaattctccatqqctaacaQCtqcqaqctqacc aacatcaccatcgccatcgagaaagaggaatgccggttctgcatcagcatcaacaccacctggtgcgccggctactgc tacacccgggacctggtgtacaaggaccccgccaggcccaagatccagaaaacctgcaccttcaaagaactggtgta cgagaccgtgcgggtgcccggctgcgcccaccacgccgacagcctgtacacctaccccgtggccacccagtgccact gcggcaagtgcgacagcgacagceccgactgcaccgtgaggggcctgggccccagctactgcagcttcggcgagat gaaagagtga
Os vetores de expressão (pEF puro e pEFdhfrBmutB) compreendem o promotor EF-1-alfa e o intensificador HCMV, origem SV40, o sinal de 25 poliadenilação, o gene de resistência à puromicina no vetor para a cadeia alfa e o gene de di-hidrofolase de murino (dhfr) para a expressão da célula CHO ou da SEQ ID 1 (Sequência N° 1) para a expressão de NM-F9 GT-2x,
121
K562, NM-H9, NM-D4 ou NM-H9D8 para seleção e amplificação de gene no vetor para a cadeia beta.
Exemplo 13
Transfecção de células eucarióticas para expressar hFSH humana e procedimento de amplificação de gene para gerar clones de células de alta produtividade sob condições sem-soro (GT-2x e NMH9D8) ou condições contendo soro (CHOdhfr)
Para expressar hFSH em GT-2x [DSM ACC______], NM-H9D8 (DSM ACC2806), e CHOdhfr (ATCC No. CRL-9096) células foram cotransfectadas com uma mistura dos vetores descritos acima para as cadeias alfa e beta (1:1 a 1:3) por lipofecção usando DMRIE-C ou eletroporação (Nucleofector; Amaxa) para as células em suspensão como GT-2x (FSH DNAc alfa / FSH GENÔMICO BETA) E nm-h9d8 (FSH DNAc alfa / FSH DNAc beta) e lipofectamina ou eletroporação para a linhagem de célula aderente CHOdhfr (FSH genômico alfa / FSH genômico beta). Essas são combinações exemplares usadas nessa configuração. Cada outra combinação de um plasmídeo de expressão de cadeia hFSH alfa e hFSH beta leva a resultados comparáveis.
Dois dias após a transfecção, o meio de crescimento foi alterado para o meio de seleção (GT-2x e NM-H9D8 em meio X-Vivo20 + 0,75 pg/mL de puromicina + 50 nM de metotrexato; CHOdhfr em DMEM + FCS 10% dialisado + 2 mM de L-glutamina + 5 gg/mL e puromicina + 50 mM de metotrexato) por 1 semana. A primeira amplificação foi efetuada aumentando-se a concentração de metotrexato até 100 nM por mais duas semanas e 200 nM de metotrexato por outras 2 semanas. Parte da população celular amplificada foi clonada de célula única em meio sem a adição de puromicina e metotrexato. O resto das células foi submetido a um novo ciclo de amplificação de genes através do aumento da concentração de metotrexato. Deste modo, de dois a três ciclos de amplificação de gene (100, 200, 500 nM de metotrexato) foram efetuados. Adicionalmente, os melhores clones produtores identificados por varredura e análise de clones foram adicionalmente amplificados semelhantemente.
122
CHOdhfr-: as células dos clones em crescimento foram lavadas com PBS e colhidas por tratamento com Accutase. A metade das células ressuspensas foi semeada em uma placa de teste de 96 cavidades, a outra metade foi semeada em uma placa de 24 cavidades para o cultivo adicional. A placa de teste foi cultivada por 20 a 24 h. O sobrenadante de cada cavidade foi analisado quanto ao título de anticorpos, conforme descrito em Determinação da taxa de produtividade específica (SPR) e tempo de duplicação (g) (ver abaixo). A densidade de células relativa foi medida usando o ensaio MTT. Em detalhes, as células foram incubadas com solução MTT por 2 h, a solução foi descartada e as células lisadas por uma solução de HCI a 0,04 M em 2-propanol. Depois de 2 horas, a placa foi moderadamente misturada e medida usando um fotômetro de placa de microtitulação com um filtro de 570 nm em modo dual contra um filtro de referência de 630 nm.
aGT-2x e NM-H9D8: Placas de 96 cavidades foram centrifugadas e o sobrenadante foi descartado. As células foram ressuspensas em 200 μΙ_ de meio fresco. Metade das células ressuspensas foi semeada em uma placa de teste de 96 cavidades e diluída com 100 μΙ_ de meio, a outra metade permaneceu nas placas de clonagem para cultivo adicional. Depois de 2 dias de cultivo, a placa de teste foi centrifugada e 20 μΙ_ do sobrenadante foram analisados quanto ao título do anticorpo, conforme descrito em Determinação da taxa de produtividade específica (SPR) e tempo de duplicação (g) (ver abaixo). A densidade de células relativa foi medida usando o ensaio WST-1 pela adição de 10 pL de solução WSR-1 (Roche) em cada cavidade. Depois de 1 a 3 horas de incubação, a medição foi efetuada usando um fotômetro de placa de microtitulação com filtro de 450 nm em modo dual contra o filtro de referência de 630 nm.
Determinação da taxa de produtividade específica (SPR) e tempo de duplicação (q)
Para cada clone, 2 x 10P4P células foram semeadas por cavidade de uma placa de cultivo tecidual de 24 cavidades em 500 μΙ_ de meio de crescimento. As células foram deixadas crescer por 3 dias, o meio condicionado foi coletado para análise, e as células foram removidas, caso necessá
123 rio, por Accutase e contadas. Os títulos de anticorpo específicos foram quantitativamente determinados a partir das amostras de meio por ELISA. As placas de ensaio foram revestidas com mAB específico da hFSHbeta (ab22473). O hFSH recombinante ligado foi incubado com anticorpo policlonal de cabra específico para hCG alfa (ab20712) e detectado com uma IgG anticabra de macaco H+L-POD (Jacksonlmmuno No. Cat. 305-035-003). Para a quantificação, hFSH recombinante foi usado como padrão.
A SPR foi medida em picogramas de proteína específica por célula por dia (pcd) é uma função tanto da taxa de crescimento quanto da produtividade, e foi calculada pelas seguintes equações:
Massa de proteína total
SPR= -----------------Área celular integral (ICA) (número de células final - número de células inicial) x dias de cultivo)
ICA = ---------------------------------------------------------logBeB (número de células final / número de células inicial)
O tempo de duplicação foi calculado pela seguinte equação:
G = log 2 x (horas em cultura)/log (número de células final / número de células inicial)
Determinação do rendimento médio e do rendimento máximo das linhagens celulares
Após a clonagem de célula única em placas de 96 cavidades usando diluição limitada (0,5 células por cavidade) conforme descrito acima, a partir de 200 clones únicos teoricamente plaqueados, a SPR é determinada para os clones celulares em crescimento e a média e desvio são determinados, assim como o rendimento máximo para as diferentes linhagens celulares e diferentes condições. A tabela 7 e a tabela 8 comparam os dados dos clones celulares produtores de hFSH de CHOdhfr-, GT-2x e NM-H9D8 desenvolvidos sob condições contendo soro (CHOdhfr-) e condições sem-soro (GT-2x e NM-H9D8).
Exemplo 14
Isolamento da composição de molécula hFSH
Para a produção e isolamento de uma composição de molécula
124 hFSH de acordo com a invenção, as células estavelmente transfectadas secretando hFSH foram cultivadas em meio sem-soro até uma densidade celular de cerca de 1 a 2 x 10P6P células/mL ser alcançada. Após a remoção das células do sobrenadante de cultura celular por centrifugação (400 x g, 15 min), o anticorpo quimérico foi purificado compreendendo cromatografia de afinidade usando uma anticorpo policlonal a hCGalfa acoplado a uma coluna NHS ativada (HiTrap NHS - HP ativada; GE Healthcare). A fração de FSH purificado que eluiu por alteração de pH repentina foi retamponada em PBS e concentrada usando tubos de centrífuga Centriprep (corte de 10 KDa, Millipore) e analisada porSDS-PAGE (ver figura 16).
Exemplo 15
Determinação da atividade das composições de moléculas FSH de acordo com a invenção.
A atividade das moléculas FSH carregando um diferente padrão de glicosilação pode ser determinada de acordo com os métodos subsequentemente descritos. Para selecionar uma linhagem celular adequada com o método de varredura de acordo com a presente invenção, o qual proporciona uma glicosilação otimizada, a molécula FSH é expressa em diferentes linhagens celulares, obtendo desta forma composições de FSH a partir das linhagens celulares individuais apresentando um padrão de glicosilação diferente em relação a, por exemplo, o grau de sialilação, ao grau de galactosilação e/ou de fucosilação. A molécula/composição de FSH com a atividade mais favorável e, deste modo, o padrão de glicosilação pode ser determinada por pelo menos um dos seguintes métodos:
Ensaio de célula granulosa de rato:
Células granulosas foram obtidas a partir dos ratos hipofissectomizados tratados com DES. O método para a preparação das células está descrito em detalhes por Jia e Hsueh 1985.
As células obtidas foram cultivadas em uma escala de 24 cavidades com ~ 160000 células/cavidade em meio McCoy’s 5A contendo DES a 100 nM, 1-metil-3-isobutilxantina a 0,125 M, glutamina a 2 mM, androstenodiona a 1 μΜ, penicilina a 100 U/mL e estreptomicina a 100 pg/mL, insuli
125 na bovina a 1 μρ/ιηΐ. e concentrações crescentes de preparações rFSH derivadas de células GT-2x e NM-H9D8 (0-1 μ9/ιτιΙ_) por até 72 horas. Os meios foram coletados 72 h após a incubação e armazenados a -20°C até a quantificação de estradiol por ELISA (Calbiotech N° ES071S).
Ensaio de 293HEK:
Células HEK293 estavelmente transfectadas com o receptor hFSH (2 x 105 células/placas de cultura de 35 mm) foram expostas a doses crescentes de cada composição de molécula de proteína de FSH obtida a partir das células GT-2x e NM-H9D8 na faixa de 0 - 1 pg/mL de FSH na presença de 1-metil-3-isobutilxantina 0,125 mM por 24 h a 37°C por até 72 horas. Depois da incubação, as concentrações de AMPc (intra- e extracelulares) foram determinadas por cAMP Direct Biotrak® EIA (GE Healthcare, No. Cat: RPN225) de acordo com as instruções do fabricante.
Ensaio de células GFSHR-17:
As células foram cultivadas com meio Eagle modificado da Dulbecco Ham F12 (1:1 v/v; Biochrom KG, Berlim, Alemanha) contendo 5% de soro de bezerro fetal (Biochrom KG, Berlim, Alemanha). As células foram plaqueadas com placa de 2 x 105 células 24 cavidades e incubadas com as composições de molécula proteica FSH obtidas das células GT-2x e NMH9D8 por 24 h em uma faixa de 0 - 1 pg/mL por 1-24 horas. Os meios foram coletados após a incubação e armazenados a -20°C até a quantificação da progesterona através do uso de um ensaio ELISA de progesterona (Biochem Immunosystems, Freiburg, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante.
Ensaio de célula granulosa humana
As células de luteína granulosas de aspiratos foliculares, obtidas de mulheres participando de um programa de fertilização in vitro na Universidade de Münster, foram enriquecidas conforme descrito por Khan et al., 1990 e semeadas em placas de 6 cavidades (1 - 1,5 x 105 células viáveis por cavidade). As células foram incubadas a 37°C em HAM’s F12/meio essencial modificado da Dulbecco (DMEM) (1:1; ICN Biomedicals, Meckenheim, Alemanha) suplementado com 10% de soro de bezerro fetal inativado
126 por calor (FCS; Gibco, Iggenstein, Alemanha), penicilina (50 unidades/mL), estreptomicina (50 pgàL), gentamicina (100 pc/mL) e anfotericina (0,6 pg/mL) em uma atmosto de 5% de CO2. As células foram expostas a doses crescentes de cadaeomposição de molécula proteica de FSH obtida de células GT-2x e NM-H9E na faixa de 0 - 1 μg/mL de FSH na presença de 1-metil-3-isobutilxantinaa 0,125 mM por 24 h a 37°C por até 72 horas. Depois da incubação, as c®centrações de AMPc (intra- e extracelulares) foram determinadas por cAIW Direct Biotrak® EIA (GE Healthcare, No. Cat: RPN225) de acordo corsas instruções do fabricante.
Exemplo 16
Análise degíicano das composições FSH expressas nas células GT-2x e CHOdhfc.
Análise de Hfestern blot foi efetuada para identificar as composições de moléculas FSHi diferentemente sialiladas expressas em CHOdhfr, GT-2x [DSM ACC____Jou NM-H9D8 [DSM ACC2806], 5 μg de cada composição da molécula de anticorpo foram separados por SDS-Page em gel de acrilamida a 10% sob oundições redutoras. As proteínas foram transferidas para nitrocelulose e visualizadas por SNA (figura 17), a qual detecta a sialilação 2-6.
Uma análise de glicano detalhada pode ser efetuada de acordo com o exemplo 10 para a determinação do teor de ácido siálico, distribuição de carga, teor de fucose, estado de galactosilação e teor de GlcNAc bifurcado.
Os resultados mostram que o FSH pode ser produzido com rendimentos muito elevados ém GT-2x (ver figura 17). Nesse sentido, o produto também não apresentou qualquer NeuNAc 2-6 ligado detectável (ver raia 1 da figura 17). De modo contrário, FSH produzido em NM-H9D8 mostrou uma quantidade ainda maior de NeuNAc 2-6 ligado detectável. A atividade pode ser detectada pelos métodos descritos no exemplo 15.
Definições de acordo com as recomendações IUPAC-IUBMB (1996):
Neu5Gc: ácido 5-N-glicolil-a-neuramínico
127
Neu5Ac e NeuNAc: ácido 5-N-acetil-a-neuraminico
Gala1,3Gal e Galalpha 1,3Gal: sacarídeo adjacente ao a-Dgalactopiranosil-(1b>3)-galactopiranosila
Ácido neuraminico 2,3 ligado: sacarídeo adjacente ao 5-Nacetil-a-neuraminil-(2->3)
Ácido neuraminico 2,6 ligado: sacarídeo adjacente ao 5-Nacetil-a-neuraminil-(2->6) *****
É para ser compreendido que essa invenção não está limitada à metodologia, a protocolos e/ou a reagentes particulares conforme aqui descrito, e estes podem variar. Também é para ser entendido que a terminologia aqui utilizada é com o propósito somente de descrever modalidades particulares, e não é tencionada a limitar o escopo da presente invenção, o qual somente será limitado pelas reivindicações em anexo.
Sequência N° 1
SEQ ID 1
MVRPLNCIVAVSQDMGIGKNGDLPWPPLRNEWKYFQRMTTTSSVEGKQNLVIMG RKTWFSIPEKNRPLKDRINIVLSRELKEPPRGAHFLAKSLDDALRLIEQPELASKVDMVWIVG GSSVYQEAMNQPGHLRLFVTRIMQEFESDTFFPEIDLGKYKLLPEYPGVLSEVQEEKGIKYK FEVYEKKD
Sequência N° 2
SEQ ID 2
MVGSLNCIVAVSQNMGIGKNGDLPWPPLRNESRYFQRMTTTSSVEGKQNLVIMG KKTWFSIPEKNRPLKGRINLVLSRELKEPPQGAHFLSRSLDDALKLTEQPELANKVDMVWIV GGSSVYKEAMNHPGHLKLFVTRIMQDFESDTFFPEIDLEKYKLLPEYPGVLSDVQEEKGIKY KFEVYEKND
Sequência N° 3
SEQ ID 3
MVGSLNCIVAVSQNMGIGKNGDLPWPPLRNEARYFQRMTTTSSVEGKQNLVIMG KKTWFSIPEKNRPLKGRINLVLSRELKEPPQGAHFLSRSLDDALKLTEQPELANKVDMVWIV GGSSVYKEAMNHPGHLKLFVTRIMQDFESDTFFPEIDLEKYKLLPEYPGVLSDVQEEKGIKY KFEVYEKND
Sequência N° 4
SEQ ID 4
128
MVGSLNCIVAVSQNMGIGKNGDLPWPPLRNEGRYFQRMTTTSSVEGKQNLVIMG
KKTWFSIPEKNRPLKGRINLVLSRELKEPPQGAHFLSRSLDDALKLTEQPELANKVDMVWIV GGSSVYKEAMNHPGHLKLFVTRIMQDFESDTFFPEIDLEKYKLLPEYPGVLSDVQEEKGIKY KFEVYEKND
Sequência N° 5
SEQ ID 4
MVGSLNCIVAVSQNMGIGKNGDYPWPPLRNEFRYFQRMTTTSSVEGKQNLVIMG
KKTWFSIPEKNRPLKGRINLVLSRELKEPPQGAHFLSRSLDDALKLTEQPELANKVDMVWIV GGSSVYKEAMNHPGHLKLFVTRIMQDFESDTFFPEIDLEKYKLLPEYPGVLSDVQEEKGIKY KFEVYEKND
Sequência N° 6
SEQ ID 6
MVGSLNCIVAVSQNMGIGKNGDRPWPPLRNEFRYFQRMTTTSSVEGKQNLVIMG KKTWFSIPEKNRPLKGRINLVLSRELKEPPQGAHFLSRSLDDALKLTEQPELANKVDMVWIV GGSSVYKEAMNHPGHLKLFVTRIMQDFESDTFFPEIDLEKYKLLPEYPGVLSDVQEEKGIKY KFEVYEKND
Sequência N° 7
SEQ ID 7
MVGSLNCIVAVSQNMGIGKNGDFPWPPLRNEFRYFQRMTTTSSVEGKQNLVIMG KKTWFSIPEKNRPLKGRINLVLSRELKEPPQGAHFLSRSLDDALKLTEQPELANKVDMVWIV GGSSVYKEAMNHPGHLKLFVTRIMQDFESDTFFPEIDLEKYKLLPEYPGVLSDVQEEKGIKY KFEVYEKND
Sequência N° 8
SEQ ID 8
MVRPLNCIVAVSQNMGIGKNGDRPWPPLRNEFKYFQRMTTTSSVEGKQNLVIMG RKTWFSIPEKNRPLKDRINIVLSRELKEPPRGAHFLAKSLDDALRLIEQPELASKVDMVWIVG GSSVYQEAMNQPGHLRLFVTRIMQEFESDTFFPEIDLGKYKLLPEYPGVLSEVQEEKGIKYK FEVYÈKKD
Sequência N° 9
SEQ ID 9
MVRPLNCIVAVSQNMGIGKNGDYPWPPLRNEFKYFQRMTTTSSVEGKQNLVIMG RKTWFSIPEKNRPLKDRINIVLSRELKEPPRGAHFLAKSLDDALRLIEQPELASKVDMVWIVG GSSVYQEAMNQPGHLRLFVTRIMQEFESDTFFPEIDLGKYKLLPEYPGVLSEVQEEKGIKYK FEVYEKKD
Sequência N° 10
SEQ ID 10
MWLGSLLLLGTVACSISA
129
Tabela 1
CHOdhfr NM-F9
Taxa de produção (clgG1) Pcd determinado depois do 1o ao 4o ciclo de amplificação de gene (metotrexato) e clonagem de célula única a partir de 200 clones semeados (diluição limitada) 1o ciclo (MTX a 100 nM) Média: 2 +/- 1 pcd; Max: 3 pcd 2o ciclo (MTX a 200 nM) Média: 5 +/- 1 pcd; Max: 7 pcd 3o ciclo (MTX a 500 nM) Média: 9 +/- 5 pcd; Max: 17 pcd 4o ciclo: (MTX a 1000 nM) Média: 13+/-5 pcd; Max: 22 pcd 1o ciclo (MTX a 100 nM) Média: 5 +/- 1,5 pcd; Max: 13 pcd 2o ciclo (MTX a 200 nM) Média: 7,5 +/- 4,5 pcd; Max: 19 pcd 3° ciclo (MTX a 500 nM) Média: 12,5 +/- 4,5 pcd; Max: 19 pcd 4o ciclo: (MTX a 1000 nM) Média: 16,5 +/- 6 pcd; Max: 27 pcd
Tabela 2
NM-H9D8
Taxa de produção (clgG1) Pcd determinado depois do 1o ao 5o ciclo de amplificação de gene (metotrexato) e clonagem de célula única a partir de 200 clones semeados (diluição limitada) 1o ciclo (MTX a 100 nM) Média: 7 +/- 4 pcd; Max: 14 pcd 2o ciclo (MTX a 200 nM) Média: 14+/-4 pcd; Max: 23 pcd 3o ciclo (MTX a 500 nM) Média: 13+/-6 pcd; Max: 31 pcd 4o ciclo: (MTX a 1000 nM) Média: 23 +/- 8 pcd; Max: 34 pcd 5o ciclo (MTX a 2000 nM) Média: 23 +/- 9 pcd; Max: 38 pcd
Tabela 3
Pmol Neu5Gc Pmol Neu5Ac Pmol Neu5Gc/pg de proteína Pmol Neu5Ac/pg de proteína
Erbitux (Merck; SP2/0) 0,149 0,000 1,784 0,000
Cetuximab GT-2x 0,000 0,278 0,000 3,335
Cetuximab NM-H9D8 0,000 1,156 0,000 12,003
cPankoMab CHOdhfr 0,000 0,477 0,000 4,921
cPankoMab GT-2x 0,000 0,248 0,000 2,990
cPankoMab NM-H9D8 0,000 0,776 0,000 13,856
130
Tabela 4
AO A1 A2 A3 À4
Panko 1 CHOdhfr 75 9 11 4 1
Panko 1 NM-H9D8 43 14 32 10 1
Panko 1 NM-H9D8-E6 40 16 33 10 1
c-PankoMab CHOdhfr 93 7 0 0 0
cPankoMab NM-F9 99 1 0 0 0
cPankoMab NM-H9D8 62 26 11 1 0
Tabela 5
GO [%] G1 [%] G2 [%] G3 [%]
Pankol CHOdhfr 22 45 33 0
Pankol NM-H9D8 7 8 66 14
Pankol NM-H9D8-E6 5 18 58 19
cPankoMab CHOdhfr 28 36 35 1
cPankoMab NM-F9 7 26 65 2
cPankoMab NM-H9D8 7 32 59 0
Tabela 6
Fucosilado Não-fucosilado GlcNAc Biantenado+ bifurcado
Pankol CHOdhfr 100 0 0
Pankol NM-H9D8 45 55 5
Pankol NM-H9D8-E6 21 79 2
Biantenado GlcNAc biantenado + bifurcado Não-fucosilado
cPankoMab-CHO 99 0 0
cPankoMab-NM-F9 68 29 6
cPankoMab-NM-H9D8 59 39 1
131
Tabela 7
CHOdhfr GT-2X
Taxa de produção (FSH) Pcd determinado depois do 3o ciclo de amplificação de genes (metotrexato) e clonagem de célula única a partir de 200 clones teoricamente semeados (diluição limitada) 3o ciclo (MTX a 500 nM) Média: < 1 pcd; Max: 0,05 pcd 2o ciclo (MTX a 200 nM) Média: 2,5 +/- 2,0 pcd; Max: 6 pcd
Tabela 8
NM-H9D8
Taxa de produção (FSH) Pcd determinado depois do 2o ciclo de amplificação de genes (metotrexato) e clonagem de célula única a partir de 200 clones teoricamente semeados (diluição limitada) 2o ciclo (MTX a 200 nM) Média: 2,2 +/-1,2 pcd; Max: 4 pcd
132
Tabela 9
- Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - Galactose elevada, conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - Fucose baixa, conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - bisecGIcNAc - atividade elevada, particularmente atividade Fc - afinidade maior - rendimento elevado - 2-6 NeuNAc - 2-3 NeuNAc - mais ácido siálico conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - Galactose elevada, conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - Fucose baixa, conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - bisecGIcNAc - atividade elevada, particularmente atividade Fc - afinidade maior - rendimento elevado - ácido siálico baixo conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - Galactose elevada, conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - Fucose baixa, conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - bisecGIcNAc - atividade elevada, particularmente atividade Fc - afinidade maior - rendimento elevado - 2-6 NeuNAc
- Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - Galactose elevada, conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - Fucose baixa, conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - bisecGIcNAc - atividade elevada, particularmente atividade Fc - rendimento elevado - 2-6 NeuNAc - 2-3 NeuNAc - mais ácido siálico conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - Galactose elevada, conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - Fucose baixa, conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - bisecGIcNAc - atividade elevada, particularmente atividade Fc - rendimento elevado - ácido siálico baixo conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - Galactose elevada, conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - Fucose baixa, conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - bisecGIcNAc - atividade elevada, particularmente atividade Fc - rendimento elevado - 2-6 NeuNAc
- Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - Galactose elevada, conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - Fucose baixa, conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - bisecGIcNAc - rendimento elevado - 2-6 NeuNAc - Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - Galactose elevada, conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - Fucose baixa, conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - bisecGIcNAc - rendimento elevado - ácido siálico baixo confor- - Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - Galactose elevada, conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - Fucose baixa, conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - bisecGIcNAc - rendimento elevado - 2-6 NeuNAc
133
- 2-3 NeuNAc - mais ácido siálico conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes me definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes
- Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - Galactose elevada, conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - Fucose baixa, conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - bisecGIcNAc - atividade elevada, particularmente atividade Fc - 2-6 NeuNAc - 2-3 NeuNAc - mais ácido siálico conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - Galactose elevada, conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - Fucose baixa, conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - bisecGIcNAc - atividade elevada, particularmente atividade Fc - ácido siálico baixo conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - Galactose elevada, conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - Fucose baixa, conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - bisecGIcNAc - atividade elevada, particularmente atividade Fc - 2-6 NeuNAc
- Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - Galactose elevada, conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - bisecGIcNAc - atividade elevada, particularmente atividade Fc - rendimento elevado - 2-6 NeuNAc - 2-3 NeuNAc - mais ácido siálico conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - Galactose elevada, conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - bisecGIcNAc - atividade elevada, particularmente atividade Fc - rendimento elevado - ácido siálico baixo conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - Galactose elevada, conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - bisecGIcNAc - atividade elevada, particularmente atividade Fc - rendimento elevado - 2-6 NeuNAc
- Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - Galactose elevada, conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - bisecGIcNAc - atividade elevada, particularmente atividade Fc - 2-6 NeuNAc - 2-3 NeuNAc - mais ácido siálico conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - Galactose elevada, conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - bisecGIcNAc - atividade elevada, particularmente atividade Fc - ácido siálico baixo conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - Galactose elevada, conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - bisecGIcNAc - atividade elevada, particularmente atividade Fc - 2-6 NeuNAc
134
- Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - Galactose elevada, conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - bisecGIcNAc - rendimento elevado - 2-6 NeuNAc - 2-3 NeuNAc - mais ácido siálico conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - Galactose elevada, conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - bisecGIcNAc - rendimento elevado - ácido siálico baixo conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - Galactose elevada, conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - bisecGIcNAc - rendimento elevado - 6 NeuNAc
- Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - Galactose elevada, conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - atividade elevada, particularmente atividade Fc - 2-6 NeuNAc - 2-3 NeuNAc - mais ácido siálico conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - Galactose elevada, conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - atividade elevada, particularmente atividade Fc - ácido siálico baixo conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - Galactose elevada, conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - atividade elevada, particularmente atividade Fc - 2-6 NeuNAc
- Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - Galactose elevada, conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - rendimento elevado - 2-6 NeuNAc - 2-3 NeuNAc - mais ácido siálico conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - Galactose elevada, conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - rendimento elevado - ácido siálico baixo conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - Galactose elevada, conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - rendimento elevado - 2-6 NeuNAc
- Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - Fucose baixa, conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - bisecGIcNAc - atividade elevada, particularmente atividade Fc - afinidade maior - rendimento elevado - 2-6 NeuNAc - 2-3 NeuNAc - Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - Fucose baixa, conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - bisecGIcNAc - atividade elevada, particularmente atividade Fc - afinidade maior - rendimento elevado - ácido siálico baixo conforme definido na reivindicação - Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - Fucose baixa, conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - bisecGIcNAc - atividade elevada, particularmente atividade Fc - afinidade maior - rendimento elevado - 2-6 NeuNAc
135
- mais ácido siálico conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes 2 e nas reivindicações dependentes
- Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - Fucose baixa, conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - bisecGIcNAc - atividade elevada, particularmente atividade Fc - rendimento elevado - 2-6 NeuNAc - 2-3 NeuNAc - mais ácido siálico conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - Fucose baixa, conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - bisecGIcNAc - atividade elevada, particularmente atividade Fc - rendimento elevado - ácido siálico baixo conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - Fucose baixa, conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - bisecGIcNAc - atividade elevada, particularmente atividade Fc - rendimento elevado - 2-6 NeuNAc
- Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - Fucose baixa, conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - bisecGIcNAc - rendimento elevado - 2-6 NeuNAc - 2-3 NeuNAc - mais ácido siálico conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - Fucose baixa, conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - bisecGIcNAc - rendimento elevado - ácido siálico baixo conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - Fucose baixa, conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - bisecGIcNAc - rendimento elevado - 2-6 NeuNAc
- Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - Fucose baixa, conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - bisecGIcNAc - atividade elevada, particularmente atividade Fc - 2-6 NeuNAc - 2-3 NeuNAc - mais ácido siálico conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - Fucose baixa, conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - bisecGIcNAc - atividade elevada, particularmente atividade Fc - ácido siálico baixo conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - Fucose baixa, conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - bisecGIcNAc - atividade elevada, particularmente atividade Fc - 2-6 NeuNAc
- Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - bisecGIcNAc - atividade elevada, particularmente atividade Fc - Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - bisecGIcNAc - atividade elevada, particularmente atividade Fc - Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - bisecGIcNAc - atividade elevada, particularmente atividade Fc
136
- rendimento elevado - 2-6 NeuNAc - 2-3 NeuNAc - mais ácido siálico conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - rendimento elevado - ácido siálico baixo conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - rendimento elevado - 2-6 NeuNAc
- Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - bisecGIcNAc - atividade elevada, particularmente atividade Fc - 2-6 NeuNAc - 2-3 NeuNAc - mais ácido siálico conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - bisecGIcNAc - atividade elevada, particularmente atividade Fc - ácido siálico baixo conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - bisecGIcNAc - atividade elevada, particularmente atividade Fc - 2-6 NeuNAc
- Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - bisecGIcNAc - rendimento elevado - 2-6 NeuNAc - 2-3 NeuNAc - mais ácido siálico conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - bisecGIcNAc - rendimento elevado - ácido siálico baixo conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - bisecGIcNAc - rendimento elevado - 2-6 NeuNAc
- Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - atividade elevada, particularmente atividade Fc - 2-6 NeuNAc - 2-3 NeuNAc - mais ácido siálico conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - atividade elevada, particularmente atividade Fc - ácido siálico baixo conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - atividade elevada, particularmente atividade Fc - 2-6 NeuNAc
- Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - rendimento elevado - 2-6 NeuNAc - 2-3 NeuNAc - mais ácido siálico conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - rendimento elevado - ácido siálico baixo conforme definido na reivindicação 2 e nas reivindicações dependentes - Sem NeuGC - Sem galalpha 1-3 Gal terminal detectável - rendimento elevado - 2-6 NeuNAc
137
Tabela 10
Panko 1
Fuc neg + BisGIcNac neg H9D8 = 54% H9D8-E6 = 79%
Fuc pos + BisGIcNac pos H9D8 = 5% H9D8-E6 = 2%
Fuc neg + BisGIcNac pos H9D8 = 0% H9D8-E6 = 0%
Panko 2
Fuc neg + BisGIcNac neg H9D8 = ~ 0% F9 e GT-2X = ~ 5-6%
Fuc pos + BisGIcNac pos H9D8 = 36% F9 e GT-2X = 29%
Fuc neg + BisGIcNac pos H9D8 = 0% F9 e GT-2X = 0%
138
Número de referência de arquivo da requerente ou agente: 48 377 K International application No.
INDICAÇÕES REFERENTES A UM MICROORGANISMO DEPOSITADO (PCT Rule 13bzs)
A. As indicações feitas abaixo referem-se ao microorganismo mencionado no relatório descritivo na página_________23__________ ,linha 1________.
B. IDENTIFICAÇÃO DE DEPÓSITO Outros depósitos estão identificados em uma folha adicional X
Nome da instituição depositária Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ)
Endereço da instituição depositária: (incluindo código postal e País) Mascheroder Weg 1b 38124 Braunschweig DE
Data de depósito 14 de agosto de 2003 Número de acesso DSM ACC2606
C. Indicações Adicionais (deixar em branco se não for aplicável) Esta informação continua em uma folha adicional X
D. Estados designados para os quais as indicações são feitas:
E. FORNECIMENTO SEPARADO DE INDICAÇÕES (deixar em branco se não for aplicável)
As indicações listados adiante serão submetidos ao Escritório Internacional mais tarde (especifique a natureza geral das indicações, por exemplo, número de acesso do depósito)
Para uso apenas do Escritório Internacional
-----Para uso apenas da repartição receptora — x Essa folha foi recebido com o pedido internacional
Responsável autorizado:
Poels, Richard
Essa folha foi recebida pelo escritório internacional
Responsável autorizado:
Nossa ref: 48 377 K
139
Indicações adicionais de acordo com modelo PCT/RQ/134 para o Número de Acesso DSM ACC2606:
O requerente com isto requer para os países os quais têm uma cláusula respectiva que as guarnições de uma amostra de material biológico 5 depositado referidas no pedido somente podem ser feitas a um especialista nomeado e independente (requerimento de solução especialista, onde aplicável, particularmente em Austrália, Canadá, Croácia, Dinamarca, Finlândia, Alemanha, Islândia, Noruega, Cingapura, Espanha, Suécia, Reino Unido, Europa).
Para a Europa, o requerente em conformidade requer que uma amostra do material biológico depositado seja disponibilizada conforme estabelecido na Regra 28 (3) EPC até a publicação de menção da concessão de patente ou para 20 anos, a partir da data de depósito se o pedido for recusado ou retirado ou considerado a ser retirado, somente pela questão de 15 uma amostra a um especialista nomeado pela pessoa requerendo a amostra (Regra 28 (4) EPC).
140
TRATADO DE BUDAPESTE
SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS PARA FINS DE PROCESSAMENTO DE MATÉRIA DE PATENTES
FORMATO INTERNACIONAL
Nemod Biotherapeutcs GmbH & Co. KG RECIBO NO CASO DE DEPÓSITO ORIGINAL
Robert-Rõssle-Str. 10 emitido por força da regra 7.1 pela
13125 Berlin AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO identificada abaixo
1. IDENTIFICAÇÃO DO MICROORGANISMO
Referência de identificação fornecida pelo depositante NM-F9 Múmero de acesso fornecido pela AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO DSM ACC2606
II. DESCRIÇÃO CIENTÍFICA E/OU DESIGNAÇÃO TAXONÔMICA PROPOSTA
0 microorganismo identificado acima (1) foi acompanhado por: ( X) descrição científica ( ) designação taxonômica proposta (Marcar com um X quando aplicável).
III. RECIBO E ACEITAÇÃO
A presente Autoridade Internacional de Depósito aceita o microorganismo identificado acima (1), o qual foi recebido em 14-08-2003 (data do depósito original)1.
IV. AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO
Nome: DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROORGANISMENT UND ZELLKULTUREN GmbH Endereço: MascheroderWeg 1b, D-38124 Braunschweig Assinatura(s) da(s) pessoa(s) tendo o poder de representação da Autoridade Internacional de Depósito ou de oficial(is) responsável(is) Data: 16-10-2003
1 Quando aplicável a Regra 6.4 (d), a referida data é a data a qual o status na Autoridade Internacional de depósito foi obtido.
Formato DSMZ-BP/4(página única) 12/2001
Nossa ref: 48 377 K
141
Número de referência de arquivo da requerente ou agente: 48 377 K International application No.
INDICAÇÕES REFERENTES A UM MICROORGANISMO DEPOSITADO (PCTRule 13te)
A. As indicações feitas abaixo referem-se ao microorganismo mencionado no relatório descritivo na página__________23__________ ,linha 1________.
B. IDENTIFICAÇÃO DE DEPÓSITO Outros depósitos estão identificados em uma folha adicional X
Nome da instituição depositária Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ)
Endereço da instituição depositária: (incluindo código postal e País) Mascheroder Weg 1b 38124 Braunschweig DE
Data de depósito 14 de agosto de 2003 Número de acesso DSM ACC2605
C. Indicações Adicionais (deixar em branco se não for aplicável) Esta informação continua em uma folha adicional X
D. Estados designados para os quais as indicações são feitas:
E. FORNECIMENTO SEPARADO DE INDICAÇÕES (deixar em branco se não for aplicável)
As indicações listados adiante serão submetidos ao Escritório Internacional mais tarde (especifique a natureza geral das indicações, por exemplo, número de acesso do depósito)
Para uso apenas do Escritório Internacional
-----Para uso apenas da repartição receptora — x Essa folha foi recebido com o pedido internacional
Responsável autorizado:
Poels, Richard
Essa folha foi recebida pelo escritório internacional
Responsável autorizado:
Nossa ref: 48 377 k
142
Indicações adicionais de acordo com modelo PCT/RO/134 para o Número de Acesso DSM ACC2605:
O requerente com isto requer para os países os quais têm uma cláusula respectiva que as guarnições de uma amostra de material biológico 5 depositado referidas no pedido somente podem ser feitas a um especialista nomeado e independente (requerimento de solução especialista, onde aplicável, particularmente em Austrália, Canadá, Croácia, Dinamarca, Finlândia, Alemanha, Islândia, Noruega, Cingapura, Espanha, Suécia, Reino Unido, Europa).
Para a Europa, o requerente em conformidade requer que uma amostra do material biológico depositado seja disponibilizada conforme estabelecido na Regra 28 (3) EPC até a publicação de menção da concessão de patente ou para 20 anos, a partir da data de depósito se o pedido for recusado ou retirado ou considerado a ser retirado, somente pela questão de uma amostra a um especialista nomeado pela pessoa requerendo a amostra (Regra 28 (4) EPC).
143
TRATADO DE BUDAPESTE
SOBRE O RECONHW1ENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS Ma FINS DE PROCESSAMENTO DE MATÉRIA DE
PATENTES
W1ATO INTERNACIONAL
Nemod Biotherapeutcs GmbH & QMG Robert-Rõssle-Str. 10 13125 Berlin
RECIBO NO CASO DE DEPÓSITO ORIGINAL emitido por força da regra 7.1 pela AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO identificada abaixo
I. IDENTIFICAÇÃO DO MICRUBtGANISMO
Referência de identificação fowtída pelo depositante NM-D4 Número de acesso fornecido pela AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO DSM ACC2605
II. DESCRIÇÃO CIENTÍFICASCU DESIGNAÇÃO TAXONÔMICA PROPOSTA O microorganismo identificadt^atóffia (I) foi acompanhado por:
(X ) descrição cientíWgt ( ) designação taxon^mica proposta (Marcar com um X quando apfcável).
III. RECIBO E ACEITAÇÃO
A presente Autoridade Internacional de Depósito aceita o microorganismo identificado acima (I), o qual foi recebido em 14-08-2003 v ' (data do depósito original)1.
IV. AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO
Nome: DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROORGANISMENT UND ZELLKULTUREN GmbH Assinatura(s) da(s) pessoa(s) tendo o poder de representação da Autoridade Internacional de Depósito ou de oficial(is) responsável(is)
Endereço: MascheroderWeg 1t\ D-38124 Braunschweig *-!------‘--------- Data: 16-10-2003
Quando aplicável a Regra 6.4 (φ, a referida data é a data a qual o status na Autoridade Internacional de deposito foi obtido.
Formato DSMZ-BP/4(página única) 12/2001
144
Número de referência de arquivo da requerente ou agente: 48 377 K International application No.
INDICAÇÕES REFERENTES A UM MICROORGANISMO DEPOSITADO (PCT Rule 13te)
A. As indicações feitas abaixo referem-se ao microorganismo mencionado no relatório descritivo na página_________61_________ ,linha 21________.
B. IDENTIFICAÇÃO DE DEPÓSITO Outros depósitos estão identificados em uma folha adicional X
Nome da instituição depositária Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ)
Endereço da instituição depositária: (incluindo código postal e País) Mascheroder Weg lb 38124 Braunschweig DE
Data de depósito 15 de setembro de 2006 Número de acesso DSM ACC2806
C. Indicações Adicionais (deixar em branco se não for aplicável) Esta informação continua em uma folha adicional X
D. Estados designados para os quais as indicações são feitas:
E. FORNECIMENTO SEPARADO DE INDICAÇÕES (deixar em branco se não for aplicável)
As indicações listados adiante serão submetidos ao Escritório Internacional mais tarde (especifique a natureza geral das indicações, por exemplo, número de acesso do depósito)
Para uso apenas do Escritório Internacional
-----Para uso apenas da repartição receptora — x Essa folha foi recebido com o pedido internacional
Responsável autorizado:
Poels, Richard
Essa folha foi recebida pelo escritório internacional
Responsável autorizado:
Nossa ref: 48 377 k
145
Indicações adicionais de acordo com modelo PCT/RO/134 para o Número de Acesso DSM ACC2806:
O requerente com isto requer para os países os quais têm uma cláusula respectiva que as guarnições de uma amostra de material biológico 5 depositado referidas no pedido somente podem ser feitas a um especialista nomeado e independente (requerimento de solução especialista, onde aplicável, particularmente em Austrália, Canadá, Croácia, Dinamarca, Finlândia, Alemanha, Islândia, Noruega, Cingapura, Espanha, Suécia, Reino Unido, Europa).
Para a Europa, o requerente em conformidade requer que uma amostra do material biológico depositado seja disponibilizada conforme estabelecido na Regra 28 (3) EPC até a publicação de menção da concessão de patente ou para 20 anos, a partir da data de depósito se o pedido for recusado ou retirado ou considerado a ser retirado, somente pela questão de uma amostra a um especialista nomeado pela pessoa requerendo a amostra (Regra 28 (4) EPC).
146
TRATADO DE BUDAPESTE SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS PARA FINS DE PROCESSO EM MATÉRIA DE PEDIDOS DE PATENTES
MODELO INTERNACIONAL
Glycotope GmbH RECIBO EM CASO DE DEPOSITO INICIAL liberado em
Robert-Rõssle-Str. 10 virtude da regra 7.1 pela AUTORIDADE DE DEPOSITO
13125 Berlin INTERNACIONAL identificada na parte inferior desta página
I. IDENTIFICAÇÃO DO MICROORGANISMO
Referência de identificação fornecida pelo depositante NM-H9D8 Número de acesso fornecido pela AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO DSM ACC2806
I. DESCRIÇÃO CIENTÍFICA E/OU DESIGNAÇÃO TAXONÔMICA PROPOSTA
O microorganismo identifiado no item I foi acompanhado: ( ) descrição científica ( ) designação taxonômica proposta (Marcar o que for conveniente)
HL RECEBIMENTO E ACEITAÇÃO
A presente autoridade de depósito internacional aceita o microorganismo identificado no item I, que foi recebido em 14.08.2003 (data do deposito inicial)1
IV. RECEPÇÃO DE UM REQUERIMENTO DE CONVERSÃO
A presente autoridade de depósitco internacional recebeu o microorganismo identificado notanlem (datadodepositoinicial) e recebeu um requerimento de conveisão do depósitco inicial em depósito conformeoTiatadodeBudapesteem (dafadereoebimentodoiequerimentodeconvetsão)
V. AUTORIDADE DE DEPÓSITO INTERNACIONAL
Nome: dsmz-deutschesammlungvon Mikroorganismen und zellkulturen GmbH Endereço: Inhoffenstr. 7 B D38124Braunschwein Assinatura(s) da(s) pessoa(s) competente(s) para representar a autoridade de depósito international ou do(s) empregado(s) autorizado(s): Data: 09 de outubro 2006
Em caso de aplicação da regra 6.4.d), esta data é a data em que o estatuto de autoridade de depósitco internacional fbi adquirido.
Modelo BP/4 (página única)
147
Número de referência de arquivo da requerente ou agente: 48 377 K International application No.
INDICAÇÕES REFERENTES A UM MICROORGANISMO DEPOSITADO (PCT Rule 13&s)
A. As indicações feitas abaixo referem-se ao microorganismo mencionado no relatório descritivo na página_________22_________ ,linha 16________.
B. IDENTIFICAÇÃO DE DEPÓSITO Outros depósitos estão identificados em uma folha adicional X
Nome da instituição depositária Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ)
Endereço da instituição depositária: (incluindo código postal e País) Mascheroder Weg 1b 38124 Braunschweig DE
Data de depósito 05 de outubro de 2006 Número de acesso DSM ACC2807
C. Indicações Adicionais (deixar em branco se não for aplicável) Esta informação continua em uma folha adicional X
D. Estados designados para os quais as indicações são feitas:
E. FORNECIMENTO SEPARADO DE INDICAÇÕES (deixar em branco se não for aplicável)
As indicações listados adiante serão submetidos ao Escritório Internacional mais tarde (especifique a natureza geral das indicações, por exemplo, número de acesso do depósito)
Para uso apenas do Escritório Internacional
-----Para uso apenas da repartição receptora — x Essa folha foi recebido com o pedido internacional
Responsável autorizado:
Poels, Richard
Essa folha foi recebida pelo escritório internacional
Responsável autorizado:
Nossa ref: 48 377 k
148
Indicações adicionais de acordo com modelo PCT/RO/134 para o Número de Acesso DSM ACC2807:
O requerente com isto requer para os países os quais têm uma cláusula respectiva que as guarnições de uma amostra de material biológico 5 depositado referidas no pedido somente podem ser feitas a um especialista nomeado e independente (requerimento de solução especialista, onde aplicável, particularmente em Austrália, Canadá, Croácia, Dinamarca, Finlândia, Alemanha, Islândia, Noruega, Cingapura, Espanha, Suécia, Reino Unido, Europa).
Para a Europa, o requerente em conformidade requer que uma amostra do material biológico depositado seja disponibilizada conforme estabelecido na Regra 28 (3) EPC até a publicação de menção da concessão de patente ou para 20 anos, a partir da data de depósito se o pedido for recusado ou retirado ou considerado a ser retirado, somente pela questão de 15 uma amostra a um especialista nomeado pela pessoa requerendo a amostra (Regra 28 (4) EPC).
149
TRATADO DE BUDAPESTE SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS PARA FINS DE PROCESSO EM MATÉRIA DE PEDIDOS DE PATENTES
MODELO INTERNACIONAL
Glycotope GmbH RECIBO EM CASO DE DEPOSITO INICIAL liberado em
Robert-Rõssle-Str. 10 virtude da regra 7.1 pela AUTORIDADE DE DEPOSITO
13125 Berlin INTERNACIONAL identificada na parte inferior desta página
I. IDENTIFICAÇÃO DO MICROORGANISMO
Referência de identificação fornecida pelo depositante NM-H9D8-E6 Número de acesso fornecido pela AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO DSM ACC2807
I. DESCRIÇÃO CIENTÍFICA E/OU DESIGNAÇÃO TAXONÔMICA PROPOSTA
O microorganismo identifiado no item I foi acompanhado: ( ) descrição científica ( ) designação taxonômica proposta (Marcar o que for conveniente)
ΙΠ. RECEBIMENTO E ACEITAÇÃO
A presente autoridade de depósito internacional aceita o microorganismo identificado no item I, que foi recebido em 14.08.2003 (data do deposito inicial)1
IV. RECEPÇÃO DE UM REQUERIMENTO DE CONVERSÃO
A presente autoridade de depósitoo internacional recebeu o microorganismo identificado noitemlan (datadodepositoinidal) e recebeu um requerimento de conversão do depósitoo inicial em depósito confctmeoTrataciodeBuclapesteem (dataderecebimentorforequerimentodeconversão)
V. AUTORIDADE DE DEPÓSITO INTERNACIONAL
Nome: dsmz-deutschesammlungvon Mikrootganismen und zellkulturen GmbH Endereço: Inhoffenstr. 7 B D38124 Braunschwein Assinalura(s) da(s) pessoa(s) competente(s) para representar a autoridade de depósito internacional ou do(s) empregado(s) autorizado(s): Data: 18 de outubro 2006
Em caso de aplicação da regra 6.4.d), esta data é a data em que o estatuto de autoridade de depósitco internacional foi adquirido.
Modelo BP/4 (página única)
150
Número de referência de arquivo da requerente ou agente: 48 377 K International application No.
INDICAÇÕES REFERENTES A UM MICROORGANISMO DEPOSITADO (PCT Rule 13bis)
A. As indicações feitas abaixo referem-se ao microorganismo mencionado no relatório descritivo na página_________61_________ ,linha 28________.
B. IDENTIFICAÇÃO DE DEPÓSITO Outros depósitos estão identificados em uma folha adicional X
Nome da instituição depositária Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ)
Endereço da instituição depositária: (incluindo código postal e País) Mascheroder Weg 1b 38124 Braunschweig DE
Data de depósito 08 de agosto de 2007 Número de acesso DSM ACC2856
C. Indicações Adicionais (deixar em branco se não for aplicável) Esta informação continua em uma folha adicional X
D. Estados designados para os quais as indicações são feitas:
E. FORNECIMENTO SEPARADO DE INDICAÇÕES (deixar em branco se não for aplicável)
As indicações listados adiante serão submetidos ao Escritório Internacional mais tarde (especifique a natureza geral das indicações, por exemplo, número de acesso do depósito)
Para uso apenas do Escritório Internacional
-----Para uso apenas da repartição receptora — x Essa folha foi recebido com o pedido internacional
Responsável autorizado:
Poels, Richard
Essa folha foi recebida pelo escritório internacional
Responsável autorizado:
Nossa ref: 48 377 k
151
Indicações adicionais de acordo com modelo PCT/RO/134 para o Número de Acesso DSM ACC2856:
O requerente com isto requer para os países os quais têm uma cláusula respectiva que as guarnições de uma amostra de material biológico 5 depositado referidas no pedido somente podem ser feitas a um especialista nomeado e independente (requerimento de solução especialista, onde aplicável, particularmente em Austrália, Canadá, Croácia, Dinamarca, Finlândia, Alemanha, Islândia, Noruega, Cingapura, Espanha, Suécia, Reino Unido, Europa).
Para a Europa, o requerente em conformidade requer que uma amostra do material biológico depositado seja disponibilizada conforme estabelecido na Regra 28 (3) EPC até a publicação de menção da concessão de patente ou para 20 anos, a partir da data de depósito se o pedido for recusado ou retirado ou considerado a ser retirado, somente pela questão de 15 uma amostra a um especialista nomeado pela pessoa requerendo a amostra (Regra 28 (4) EPC).
152
TRATADO DE BUDAPESTE SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS PARA FINS DE PROCESSO EM MATÉRIA DE PEDIDOS DE PATENTES
MODELO INTERNACIONAL
Glycotope GmbH Robert-Rõssle-Str. 10 13125 Berlin
RECIBO EM CASO DE DEPOSITO INICIAL liberado em virtude da regra 7.1 pela AUTORIDADE DE DEPÓSITO INTERNACIONAL identificada na parte inferior desta página
LIDENTIFIC AÇÃO DO MICROORGANISMO
Referência de identificação fornecida pelo depositante NM-H9D8-E6Q12 Número de acesso fornecido pela AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO DSM ACC2856
I. DESCRIÇÃO CIENTÍFICA E/OU DESIGNAÇÃO TAXONÔMICA PROPOSTA
0 mi<TOorganismo identifiado no item I foi acompanhado: ( ) descrição científica ( ) designação taxonômica proposta (Marcar o que for conveniente)
ΠΙ. RECEBIMENTO E ACEITAÇÃO
A presente autoridade de depósito internacional aceita o microorganismo identificado no item I, que foi recebido em 08.08.2007 (data do deposito inicial)1
IV. RECEPÇÃO DE UM REQUERIMENTO DE CONVERSÃO
A presente autoridade de depósitoo internacional recebeu o microorganismo identificado noftemlem (datadodepositoinicial) e recebeu um requerimento de conversão do depóstoo inicial em depósito conforme o Tratado de Budapeste em (data de recebimento do requerimento de conversão)
V. AUTORIDADE DE DEPÓSITO INTERNACIONAL
Nome: dsm^deltschesammlungvon Mikroorganismen und zdlkuhuren GmbH Endereço: Inhoffenstr. 7 B D38124 Braunschwsin Assinatura(s) da(s) pessoa(s) competente(s) para representar a autoridade de depósito internacional ou do(s) empregado(s) autorizado(s): Data: 23 de agosto 2007
Em caso de aplicação da regra 6.4.d), esta data é a data em que o estatuto de autoridade de depósiteo internacional foi adquirido.
Modelo BP/4 (página única)
153
Número de referência de arquivo da requerente ou agente: 48 377 K International application No.
INDICAÇÕES REFERENTES A UM MICROORGANISMO DEPOSITADO (PCT Rule 13tó)
A. As indicações feitas abaixo referem-se ao microorganismo mencionado no relatório descritivo na página_____________________ ,linha ,______________.
B. IDENTIFICAÇÃO DE DEPÓSITO Outros depósitos estão identificados em uma folha adicional X
Nome da instituição depositária Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ)
Endereço da instituição depositária: (incluindo código postal e País) Mascheroder Weg 1b 38124 Braunschweig DE
Data de depósito 07 de setembro de 2007 Número de acesso Não disponível ainda
C. Indicações Adicionais (deixar em branco se não for aplicável) Esta informação continua em uma folha adicional X
D. Estados designados para os quais as indicações são feitas:
E. FORNECIMENTO SEPARADO DE INDICAÇÕES (deixar em branco se não for aplicável)
As indicações listados adiante serão submetidos ao Escritório Internacional mais tarde (especifique a natureza geral das indicações, por exemplo, número de acesso do depósito) Número de Acesso de depósito pa 6T-2X seguirá
Para uso apenas do Escritório Internacional
-----Para uso apenas da repartição receptora — x Essa folha foi recebido com o pedido internacional
Responsável autorizado:
Poels, Richard
Essa folha foi recebida pelo escritório internacional
Responsável autorizado:
Nossa ref: 48 377 k
154
Indicações adicionais de acordo com modelo PCT/RO/134 para GT-2X - Número de acesso ainda não disponível:
O requerente com isto requer para os países os quais têm uma cláusula respectiva que as guarnições de uma amostra de material biológico 5 depositado referidas no pedido somente podem ser feitas a um especialista nomeado e independente (requerimento de solução especialista, onde aplicável, particularmente em Austrália, Canadá, Croácia, Dinamarca, Finlândia, Alemanha, Islândia, Noruega, Cingapura, Espanha, Suécia, Reino Unido, Europa).
Para a Europa, o requerente em conformidade requer que uma amostra do material biológico depositado seja disponibilizada conforme estabelecido na Regra 28 (3) EPC até a publicação de menção da concessão de patente ou para 20 anos, a partir da data de depósito se o pedido for recusado ou retirado ou considerado a ser retirado, somente pela questão de uma amostra a um especialista nomeado pela pessoa requerendo a amostra (Regra 28 (4) EPC).
155
Número de referência de arquivo da requerente ou agente: 48 377 K
International application No.
PCT/EP2007/007877
INDICAÇÕES REFERENTES A UM MICROORGANISMO DEPOSITADO (PCT Rule 13tó)
A. As indicações feitas abaixo referem-se ao microorganismo mencionado no relatório descritivo na página_________94_________ ,linha 39________.
B. IDENTIFICAÇÃO DE DEPÓSITO Outros depósitos estão identificados em uma folha adicional X
Nome da instituição depositária Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ)
Endereço da instituição depositária: (incluindo código postal e País) Mascheroder Weg 1b 38124 Braunschweig DE
Data de depósito 07 de setembro de 2007 Número de acesso DSM ACC2858
C. Indicações Adicionais (deixar em branco se não for aplicável) Esta informação continua em uma folha adicional X
D. Estados designados para os quais as indicações são feitas:
E. FORNECIMENTO SEPARADO DE INDICAÇÕES (deixar em branco se não for aplicável)
As indicações listados adiante serão submetidos ao Escritório Internacional mais tarde (especifique a natureza geral das indicações, por exemplo, número de acesso do depósito)
Para uso apenas da repartição receptora
Para uso apenas do Escritório Internacional
Essa folha foi recebido com o pedido internacional
X Essa folha foi recebida pelo escritório internacional
NOVEMBRO DE 2007 (19.11.2007)
Responsável autorizado:
Poels, Richard
Responsável autorizado:
Kari Huynh-Khuong
156
Indicações adicionais de acordo com modelo PCT/RO/134 para o número de acesso DSM ACC2858:
O requerente com isto requer para os países os quais têm uma cláusula respectiva que as guarnições de uma amostra de material biológico 5 depositado referidas no pedido somente podem ser feitas a um especialista nomeado e independente (requerimento de solução especialista, onde aplicável, particularmente em Austrália, Canadá, Croácia, Dinamarca, Finlândia, Alemanha, Islândia, Noruega, Cingapura, Espanha, Suécia, Reino Unido, Europa).
- 10 Para a Europa, o requerente em conformidade requer que uma amostra do material biológico depositado seja disponibilizada conforme estabelecido na Regra 28 (3) EPC até a publicação de menção da concessão de patente ou para 20 anos, a partir da data de depósito se o pedido for recusado ou retirado ou considerado a ser retirado, somente pela questão de 15 uma amostra a um especialista nomeado pela pessoa requerendo a amostra (Regra 28 (4) EPC).
157
TRATADO DE BUD/OE SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO WCROORGANISMOS PARA FINS DE PROCESSO EMBTÉRIA DE PEDIDOS DEPATENTES
MODELO INTERNACIONAL
Glyco tope GmbH
Robert-Rõssle-Str. 10
13125 Berlin
RECIBO EM CASO DE DEPÓSITO INICIAL liberado em virtude daregra 7.1 pela AUTORIDADE DE DEPÓSITO INTERNACIONAL identificada na parte inferia· desta página
I. IDENTIFICAÇÃO DO WOORGANISMO
Referência de identificação fomeatt^elo depositante GT-2x Número de acesso fornecido pela AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO DSM ACC2858
I. DESCRIÇÃO CIENTÍFIOBOl J DESIGNAÇÃO TAXONÔMICA PROPOSTA
O microorganismo identifiadeo item I foi acompanhado: ( x) descrição científie ( ) designação taxafrnica proposta (Marcar o que for convenient!
ΙΠ. RECEBIMENTO E ACMACÂO
A presente autoridade de depwto internacional aceita o microorganismo identificado no item I, que foi recebido an 14,08.2003 (&ta do deposito inicial)1
IV. RECEPÇÃO DE UM REQUERIMENTO DE CONVERSÃO
Apesente autoridade de depósitoointeneiat^recebmomicrooigpnisrno identificado noitemlem (datadodepositoinicia]) e reoebai um requoimento de conversãsA dqsóstco Mdal em depósito confameoTiatadodeBudapesteem (dataderecebimento do requerimento deconversão)
V AUTORIDADE DE DEJÓS1TO INTERNACIONAL
Nome: dsmz-deutsghesammlungvon GmbH Endereço: Inhoffenstr. 7B D38124 Braunstiwun Assinaturas) da(s) pessoa(s) competente(s) para representar a autoridade de depósito internacional ou do(s) empregado(s) autorizado(s): Data: 20 de setembro 2007
Em caso de aphcaçao da regraesta dataé a data em que o estatuto de autoridade de depósitco internacional foi adquirido.
Modelo BP/4 (página única)
Nossa ref: 48 377 K
158
Indicações adicionais de acordo com modelo PCT/RQ/134 para o número de acesso DSM ACC2606:
O requerente com isto requer para os países os quais têm uma cláusula respectiva que as guarnições de uma amostra de material biológico 5 depositado referidas no pedido somente podem ser feitas a um especialista nomeado e independente (requerimento de solução especialista, onde aplicável, particularmente em Austrália, Canadá, Croácia, Dinamarca, Finlândia, Alemanha, Islândia, Noruega, Cingapura, Espanha, Suécia, Reino Unido, Europa).
Para a Europa, o requerente em conformidade requer que uma amostra do material biológico depositado seja disponibilizada conforme estabelecido na Regra 28 (3) EPC até a publicação de menção da concessão de patente ou para 20 anos, a partir da data de depósito se o pedido for recusado ou retirado ou considerado a ser retirado, somente pela questão de uma amostra a um especialista nomeado pela pessoa requerendo a amostra (Regra 28 (4) EPC).
159
TRATADO DE BUDAPESTE
SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS PARA FINS DE PROCESSAMENTO DE MATÉRIA DE PATENTES
FORMATO INTERNACIONAL
Nemod Biotherapeutes GmbH & Ca KG RECIBO NO CASO DE DEPÓSITO ORIGINAL
Robert-Rõssle-Str. 10 emitido por força da regra 7.1 pela
13125 Berlin AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO identificada abaixo
1. IDENTIFICAÇÃO DO MICROORGANISMO
Referência de identificação fornecida pelo depositante NM-F9 Número de acesso fornecido pela AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO DSM ACC2606
II. DESCRIÇÃO CIENTÍFICA E/OU DESIGNAÇÃO TAXONÔMICA PROPOSTA
0 microorganismo identificado acima (1) foi acompanhado por: (X ) descrição científica ( ) designação taxonômica proposta (Marcar com um X quando aplicável).
III. RECIBO E ACEITAÇÃO
A presente Autoridade Internacional de Depósito aceita o microorganismo identificado acima (1), o qual foi recebido em 14-08-2003 (data do depósito original)1.
IV. AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO
Nome: DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROORGANISMENT UND ZELLKULTUREN GmbH Endereço: MascheroderWeg 1b, D-38124 Braunschweig Assinatura(s) da(s) pessoa(s) tendo o poder de representação da Autoridade Internacional de Depósito ou de oficial(is) responsável(is) Data: 16-10-2003
1 Quando aplicável a Regra 6.4 (d), a referida data é a data a qual o status na Autoridade Internacional de depósito foi obtido.
Formato DSMZ-BP/4(página única) 12/2001
160
Número de referência de arquivo da requerente ou agente: 48 377 K International application No.
INDICAÇÕES REFERENTES A UM MICROORGANISMO DEPOSITADO (PCT Rule 13 to)
A. As indicações feitas abaixo referem-se ao microorganismo mencionado no relatório descritivo na página_________23__________ ,linha 1________.
B. IDENTIFICAÇÃO DE DEPÓSITO Outros depósitos estão identificados em uma folha adicional X
Nome da instituição depositária Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ)
Endereço da instituição depositária: (incluindo código postal e País) Mascheroder Weg 1b 38124 Braunschweig DE
Data de depósito 14 de agosto de 2003 Número de acesso DSM ACC2605
C. Indicações Adicionais (deixar em branco se não for aplicável) Esta informação continua em uma folha adicional X
D. Estados designados para os quais as indicações são feitas:
E. FORNECIMENTO SEPARADO DE INDICAÇÕES (deixar em branco se não for aplicável)
As indicações listados adiante serão submetidos ao Escritório Internacional mais tarde (especifique a natureza geral das indicações, por exemplo, número de acesso do depósito)
Para uso apenas do Escritório Internacional
-----Para uso apenas da repartição receptora — x Essa folha foi recebido com o pedido internacional
Responsável autorizado:
Poels, Richard
Essa folha foi recebida pelo escritório internacional
Responsável autorizado:
Nossa ref: 48 377 k
161
Indicações adicionais de acordo com modelo PCT/RO/134 para o número de acesso DSM ACC2605:
O requerente com isto requer para os países os quais têm uma cláusula respectiva que as guarnições de uma amostra de material biológico 5 depositado referidas no pedido somente podem ser feitas a um especialista nomeado e independente (requerimento de solução especialista, onde aplicável, particularmente em Austrália, Canadá, Croácia, Dinamarca, Finlândia, Alemanha, Islândia, Noruega, Cingapura, Espanha, Suécia, Reino Unido, Europa).
Para a Europa, o requerente em conformidade requer que uma amostra do material biológico depositado seja disponibilizada conforme estabelecido na Regra 28 (3) EPC até a publicação de menção da concessão de patente ou para 20 anos, a partir da data de depósito se o pedido for recusado ou retirado ou considerado a ser retirado, somente pela questão de uma amostra a um especialista nomeado pela pessoa requerendo a amostra (Regra 28 (4) EPC).
162
TRATADO DE BUDAPESTE
SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS PARA FINS DE PROCESSAMENTO DE MATÉRIA DE PATENTES
FORMATO INTERNACIONAL
Nemod Biotherapeutcs GmbH & Ca KG
Robert-Rõssle-Str. 10
13125 Berlin
RECIBO NO CASO DE DEPÓSITO ORIGINAL emitido por força da regra 7.1 pela AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO identificada abaixo
1. IDENTIFICAÇÃO DO MICROORGANISMO
Referência de identificação fornecida pelo depositante NM-D4 Número de acesso fornecido pela AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO DSM ACC2605
II. DESCRIÇÃO CIENTÍFICA E/OU DESIGNAÇÃO TAXONÔMICA PROPOSTA
0 microorganismo identificado acima (1) foi acompanhado por: (X ) descrição científica ( ) designação taxonômica proposta (Marcar com um X quando aplicável).
III. RECIBO E ACEITAÇÃO
A presente Autoridade Internacional de Depósito aceita o microorganismo identificado acima (1), o qual foi recebido em 14-08-2003 (data do depósito original)1.
IV. AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO
Nome: DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROORGANISMENT UND ZELLKULTUREN GmbH Endereço: MascheroderWeg 1b, D-38124 Braunschweig Assinatura(s) da(s) pessoa(s) tendo o poder de representação da Autoridade Internacional de Depósito ou de oficial(is) responsável(is) Data: 16-10-2003
Quando aplicável a Regra 6.4 (d), a referida data é a data a qual o status na Autoridade Internacional de depósito foi obtido.
Formato DSMZ-BP/4(página única) 12/2001
163
Número de referência de arquiva requerente ou agente: 48 377 K International application No.
INDICAÇÕES REFEIENTES A UM MICROORGANISMO DEPOSITADO (PCT Rule 13 to)
A. As indicações feitas abaixo rdftem-se ao microorganismo mencionado no relatório descritivo na página_________61_________,linha 21
B. IDENTIFICAÇÃO DE DEPOSIT® Outros depósitos estão identificados em uma folha adicional X
Nome da instituição depositária Deutsche Sammlung w Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ)
Endereço da instituição deposifeia: (incluindo código postal e País) Mascheroder Weg 1b 38124 Braunschweig DE
Data de depósito Número de acesso 15 de setembro de 2006 DSM ACC2806
C. Indicações Adicionais (deixar em banco se não for aplicável) Esta informação continua em uma folha adicional X
D. Estados designados para os quais as indicações são feitas:
E. FORNECIMENTO SEPARADO DE INDICAÇÕES (deixar em branco se não for aplicável)
As indicações listados adiante saio submetidos ao Escritório Internacional mais tarde (especifique a natureza geral das indicações, por exemplo, número de acesso do depósito)
Para uso apenas do Escritório Internacional
-----Para uso apenas da repartição receptora — x Essa folha foi recebido com e> pedido internacional
Responsável autorizado:
Poels, Richard
Essa folha foi recebida pelo escritório internacional
Responsável autorizado:
Nossa ref: 48 377 k
164
Indicações adicionais de acordo com modelo PCT/RO/134 para o número de acesso DSM ACC28906:
O requerente com isto requer para os países os quais têm uma cláusula respectiva que as guarnições de uma amostra de material biológico 5 depositado referidas no pedido somente podem ser feitas a um especialista nomeado e independente (requerimento de solução especialista, onde aplicável, particularmente em Austrália, Canadá, Croácia, Dinamarca, Finlândia, Alemanha, Islândia, Noruega, Cingapura, Espanha, Suécia, Reino Unido, Europa).
Para a Europa, o requerente em conformidade requer que uma amostra do material biológico depositado seja disponibilizada conforme estabelecido na Regra 28 (3) EPC até a publicação de menção da concessão de patente ou para 20 anos, a partir da data de depósito se o pedido for recusado ou retirado ou considerado a ser retirado, somente pela questão de uma amostra a um especialista nomeado pela pessoa requerendo a amostra (Regra 28 (4) EPC).
165
TRATADO DE BUDAPESTE
SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS PARA FINS DE PROCESSAMENTO DE MATÉRIA DE PATENTES
FORMATO INTERNACIONAL
Nemod Biotherapeutcs GmbH & Co. KG
Robert-Rõssle-Str. 10
13125 Berlin
RECIBO NO CASO DE DEPÓSITO ORIGINAL emitido por força da regra 7.1 pela AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO identificada abaixo
I. IDENTIFICAÇÃO DO MICROORGANISMO
Referência de identificação fornecida pelo depositante Número de acesso fornecido pela AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO
NM-H9D8 DSM ACC2806
II. DESCRIÇÃO CIENTÍFICA E/OU DESIGNAÇÃO TAXONÔMICA PROPOSTA
O microorganismo identificado acima (I) foi acompanhado por:
( ) descrição científica ( ) designação taxonômica proposta (Marcar com um X quando aplicável).
III. RECIBO E ACEITAÇÃO
A presente Autoridade Internacional de Depósito aceita o microorganismo identificado acima (I), o qual foi recebido em 15-09-2006 (data do depósito original)1.
IV. AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO
Nome: DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROORGANISMENT UND ZELLKULTUREN GmbH Assinatura(s) da(s) pessoa(s) tendo o poder de representação da Autoridade Internacional de Depósito ou de oficial(is) responsável(is)
Endereço: MascheroderWeglb, D-38124 Braunschweig Data: 10-09-2006
1 Quando aplicável a Regra 6.4 (d), a referida data é a data a qual o status na Autoridade Internacional de depósito foi obtido.
Formato DSMZ-BP/4(página única) 12/2001
166
Número de referência de arquivo da requerente ou agente: 48 377 K International application No.
INDICAÇÕES REFERENTES A UM MICROORGANISMO DEPOSITADO (PCT Rule 13 to)
A. As indicações feitas abaixo referem-se ao microorganismo mencionado no relatório descritivo na página_________22_________ ,linha 16_______.
B. IDENTIFICAÇÃO DE DEPÓSITO Outros depósitos estão identificados em uma folha adicional X
Nome da instituição depositária Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ)
Endereço da instituição depositária: (incluindo código postal e País) Mascheroder Weg 1b 38124 Braunschweig DE
Data de depósito 05 de outubro de 2006 Número de acesso DSM ACC2807
C. Indicações Adicionais (deixar em branco se não for aplicável) Esta informação continua em uma folha adicional X
D. Estados designados para os quais as indicações são feitas:
E. FORNECIMENTO SEPARADO DE INDICAÇÕES (deixar em branco se não for aplicável)
As indicações listados adiante serão submetidos ao Escritório Internacional mais tarde (especifique a natureza geral das indicações, por exemplo, número de acesso do depósito)
Para uso apenas da repartição receptora
Para uso apenas do Escritório Internacional x Essa folha foi recebido com o pedido internacional
Essa folha foi recebida pelo escritório internacional
Responsável autorizado:
Poels, Richard
Responsável autorizado:
167
Indicações aaticionais de acordo com modelo PCT/RO/134 para o número de acesso DSM ACC2807:
O requerente com isto requer para os países os quais têm uma cláusula respectiva que as guarnições de uma amostra de material biológico 5 depositado referidas no pedido somente podem ser feitas a um especialista nomeado e independente (requerimento de solução especialista, onde aplicável, particularmente em Austrália, Canadá, Croácia, Dinamarca, Finlândia, Alemanha, Islândia, Noruega, Cingapura, Espanha, Suécia, Reino Unido, Europa).
Para a Europa, o requerente em conformidade requer que uma amostra do material biológico depositado seja disponibilizada conforme estabelecido na Regra 28 (3) EPC até a publicação de menção da concessão de patente ou para 20 anos, a partir da data de depósito se o pedido for recusado ou retirado ou considerado a ser retirado, somente pela questão de uma amostra a um especialista nomeado pela pessoa requerendo a amostra (Regra 28 (4) EPC).
168
Número de referência de arquivo da requerente ou agente: 48 377 K International application No.
INDICAÇÕES REFERENTES A UM MICROORGANISMO DEPOSITADO (PCT Rule 13 bis)
A. As indicações feitas abaixo referem-se ao microorganismo mencionado no relatório descritivo na página_________22_________ ,linha 16________.
B. IDENTIFICAÇÃO DE DEPÓSITO Outros depósitos estão identificados em uma folha adicional X
Nome da instituição depositária Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ)
Endereço da instituição depositária: (incluindo código postal e País) Mascheroder Weg 1b 38124 Braunschweig DE
Data de depósito 05 de outubro de 2006 Número de acesso DSM ACC2807
C. Indicações Adicionais (deixar em branco se não for aplicável) Esta informação continua em uma folha adicional X
D. Estados designados para os quais as indicações são feitas:
E. FORNECIMENTO SEPARADO DE INDICAÇÕES (deixar em branco se não for aplicável)
As indicações listados adiante serão submetidos ao Escritório Internacional mais tarde (especifique a natureza geral das indicações, por exemplo, número de acesso do depósito)
Para uso apenas do Escritório Internacional
-----Para uso apenas da repartição receptora — x Essa folha foi recebido com o pedido internacional
Responsável autorizado:
Poels, Richard
Essa folha foi recebida pelo escritório internacional
Responsável autorizado:
Nossa ref: 48 377 k
169
Indicações adicionais de acordo com modelo PCT/RO/134 para o número de acesso DSM ACC2807:
O requerente com isto requer para os países os quais têm uma cláusula respectiva que as guarnições de uma amostra de material biológico 5 depositado referidas no pedido somente podem ser feitas a um especialista nomeado e independente (requerimento de solução especialista, onde aplicável, particularmente em Austrália, Canadá, Croácia, Dinamarca, Finlândia, Alemanha, Islândia, Noruega, Cingapura, Espanha, Suécia, Reino Unido, Europa).
Para a Europa, o requerente em conformidade requer que uma amostra do material biológico depositado seja disponibilizada conforme estabelecido na Regra 28 (3) EPC até a publicação de menção da concessão de patente ou para 20 anos, a partir da data de depósito se o pedido for recusado ou retirado ou considerado a ser retirado, somente pela questão de 15 uma amostra a um especialista nomeado pela pessoa requerendo a amostra (Regra 28 (4) EPC).
170
TRATADO DE BUDAPESTE SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS PARA FINS DE PROCESSO EM MATÉRIA DE PEDIDOS DE PATENTES
MODELO INTERNACIONAL
Glyco tope GmbH REOBO EM CASO DE DEPÓSITO IMCIAL liberado em
Robert-Rõssle-Str. 10 virtude da regra 7.1 pela AUTORIDADE DE DEPÓSITO
13125 Berlin INTERNACIONALid&itificadanaparteinÊTicrdestapágina
I. IDENTIFICAÇÃO DO MICROORGANISMO
Referência de identificação fornecida pelo depositante NM-H9D8-E6 Número de acesso fornecido pela AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO DSM ACC2807
I. DESCRIÇÃO CIENTÍFICA E/OU DESIGNAÇÃO TAXONÔMICA PROPOSTA
0 microorganismo identifiado no item I foi acompanhado: ( ) descrição científica ( ) designação taxonômica proposta (Marcar o que for conveniente)
HL RECEBIMENTO E ACEITAÇÃO
A presente autoridade de depósito internacional aceita o microorganismo identificado no item I, que foi recebido em 05.10.2006 (data do deposito inicial)1
IV. RECEPÇÃO DE UM REQUERIMENTO DE CONVERSÃO
A presente autoridade de depósitco internacional recebeu o nriaoaganismo identificado no item I em (datadodepositoinicial) e recebeu um requerimento de conversão do depósitco inicial em depósito conforme o Tratado de Budapeste em (data de recebimento do requerimento de conversão)
V. AUTORIDADE DE DEPÓSITO INTERNACIONAL
Nome: dsmz-deutsche sammlung von Mikrootganismen und zdlkulturen GmbH Endereço: Ihhoffenstr. 7 B D38124 Braunschwein Assinatura(s) da(s) pessoa(s) competente(s) para representar a autoridade de depósito internacional ou do(s) empregado(s) autorizado(s): Data: 18 de outubro 2006
Em caso de aplicação da regra 6.4.d), esta data é a data em que o estatuto de autoridade de depósitco internacional foi adquirido.
Modelo BP/4 (página única)
171
Número de referência de arquivo da requerente ou agente: 48 377 K International application No.
INDICAÇÕES REFERENTES A UM MICROORGANISMO DEPOSITADO (PCTRule 13 to)
A. As indicações feitas abaixo referem-se ao microorganismo mencionado no relatório descritivo na página_________61_________ ,linha 28________.
B. IDENTIFICAÇÃO DE DEPÓSITO Outros depósitos estão identificados em uma folha adicional X
Nome da instituição depositária Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ)
Endereço da instituição depositária: (incluindo código postal e País) Mascheroder Weg 1b 38124 Braunschweig DE
Data de depósito 08 de agosto de 2003 Número de acesso DSM ACC2856
C. Indicações Adicionais (deixar em branco se não for aplicável) Esta informação continua em uma folha adicional X
D. Estados designados para os quais as indicações são feitas:
E. FORNECIMENTO SEPARADO DE INDICAÇÕES (deixar em branco se não for aplicável)
As indicações listados adiante serão submetidos ao Escritório Internacional mais tarde (especifique a natureza geral das indicações, por exemplo, número de acesso do depósito)
Para uso apenas do Escritório Internacional
-----Para uso apenas da repartição receptora — x Essa folha foi recebido com o pedido internacional
Responsável autorizado:
Poels, Richard
Essa folha foi recebida pelo escritório internacional
Responsável autorizado:
Nossa ref: 48 377 k
172
Indicações adicionais de acordo com modelo PCT/RO/134 para o número de acesso DSM ACC2856:
O requerente com isto requer para os países os quais têm uma cláusula respectiva que as guarnições de uma amostra de material biológico 5 depositado referidas no pedido somente podem ser feitas a um especialista nomeado e independente (requerimento de solução especialista, onde aplicável, particularmente em Austrália, Canadá, Croácia, Dinamarca, Finlândia, Alemanha, Islândia, Noruega, Cingapura, Espanha, Suécia, Reino Unido, Europa).
Para a Europa, o requerente em conformidade requer que uma amostra do material biológico depositado seja disponibilizada conforme estabelecido na Regra 28 (3) EPC até a publicação de menção da concessão de patente ou para 20 anos, a partir da data de depósito se o pedido for recusado ou retirado ou considerado a ser retirado, somente pela questão de uma amostra a um especialista nomeado pela pessoa requerendo a amostra (Regra 28 (4) EPC).
173
TRATADO DE BUDAPESTE SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS PARA FINS DE PROCESSO EM MATÉRIA DE PEDIDOS DE PATENTES
MODELO INTERNACIONAL
Glycotope GmbH
Robert-Rõssle-Str. 10
13125 Berlin
RECIBO EM CASO DE DEPOSITO INICIAL liberado an virtudedaregra7.1 pela AUTORIDADE DE DEPOSITO INTERNACIONAL identificada na parte inferior desta página
I. IDENTIFICAÇÃO DO MICROORGANISMO
Referência de identificação fornecida pelo depositante NM-H9D8-E6Q12 Número de acesso fornecido pela AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO DSM ACC2856
I. DESCRIÇÃO CIENTÍFICA E/OU DESIGNAÇÃO TAXONÔMICA PROPOSTA
O microorganismo identifiado no item I foi acompanhado: ( ) descrição científica ( ) designação taxonômica proposta (Marcar o que for conveniente)
ΙΠ. RECEBIMENTO E ACEITAÇÃO
A presente autoridade de depósito internacional aceita o microorganismo identificado no item I, que foi recebido em 08.082008 (data do deposito inicial)1
IV. RECEPÇÃO DE UM REQUERIMENTO DE CONVERSÃO
A presente autoridade de depósitBo internacional recebeu o miaootganisno identificado notanlem (datadodepositoinicial) e recebeu um requerimento de conversão do depósitco inicial em depósito confotmeo Tratado de Budapesteem (dataderecebimento do requerimento deconversão)
V. AUTORIDADE DE DEPÓSITO INTERNACIONAL
Nome: dsmz-deutschesammlungvon Mikrootganismen und zeflkuhuren GmbH Endereço: Inhoffenstr. 7 B D38124 Braunschwein Assinatura(s) da(s) pessoa(s) competente(s) para representar a autoridade de depósito internacional ou do(s) empregado(s) autorizado(s): Data: 23 de agosto 2007
Em caso de aplicação da regra 6.4.d), esta data é a data em que o estatuto de autoridade de depósitco internacional foi adquirido.
Modelo BP/4 (página única)
174
Número de referência de arquivo da requerente ou agente: 48 377 K International application No.
INDICAÇÕES REFERENTES A UM MICROORGANISMO DEPOSITADO (PCT Rule 13tó)
A. As indicações feitas abaixo referem-se ao microorganismo mencionado no relatório descritivo na página__________23__________ ,linha 1________.
B. IDENTIFICAÇÃO DE DEPÓSITO Outros depósitos estão identificados em uma folha adicional X
Nome da instituição depositária Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ)
Endereço da instituição depositária: (incluindo código postal e País) Mascheroder Weg lb 38124 Braunschweig DE
Data de depósito 07 de julho de 2007 Número de acesso
C. Indicações Adicionais (deixar em branco se tão for aplicável) Esta informação continua em uma folha adicional X
D. Estados designados para os quais as indicações são feitas:
E. FORNECIMENTO SEPARADO DE INDICAÇÕES (deixar em branco se não for aplicável)
As indicações listados adiante serão submetidos ao Escritório Internacional mais tarde (especifique a natureza geral das indicações, por exemplo, número de acesso do depósito)
Para uso apenas do Escritório Internacional
-----Para uso apenas da repartição receptora — x Essa folha foi recebido com o pedido internacional
Responsável autorizado:
Poels, Richard
Essa folha foi recebida pelo escritório internacional
Responsável autorizado:
Nossa ref: 48 377 k
175
Indicações adicionais de acordo com modelo PCT/RO/134 para o número de acesso DSM ACC2858:
O requerente com isto requer para os países os quais têm uma cláusula respectiva que as guarnições de uma amostra de material biológico 5 depositado referidas no pedido somente podem ser feitas a um especialista nomeado e independente (requerimento de solução especialista, onde aplicável, particularmente em Austrália, Canadá, Croácia, Dinamarca, Finlândia, Alemanha, Islândia, Noruega, Cingapura, Espanha, Suécia, Reino Unido, Europa).
Para a Europa, o requerente em conformidade requer que uma amostra do material biológico depositado seja disponibilizada conforme estabelecido na Regra 28 (3) EPC até a publicação de menção da concessão de patente ou para 20 anos, a partir da data de depósito se o pedido for recusado ou retirado ou considerado a ser retirado, somente pela questão de uma amostra a um especialista nomeado pela pessoa requerendo a amostra (Regra 28 (4) EPC).

Claims (28)

1. Método para a produção de uma composição de moléculas de proteína, caracterizado pelo fato de que compreende:
(a) introduzir em uma célula hospedeira, a qual está numa célula sanguínea humana imortalizada, pelo menos um ácido nucléico codificando pelo menos uma parte da referida proteína; e (b) cultivar a referida célula hospedeira sob condições as quais permitam a produção da referida composição de moléculas de proteína; e (c) isolar a referida composição de moléculas de proteína , em que a referida célula hospedeira é selecionada do grupo que consiste em NM-H9D8 [DSM ACC2806], NM-H9D8-E6 [DSM ACC2807], NM-H9D8-E6Q12 [DSM ACC2856] e uma célula ou linhagem celular derivada a partir da mesma.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira é selecionada do grupo consistindo em NMH9D8 [DSM ACC 2806], NM-H9D8-E6 [DSM ACC2807], e NM-H9D8-E6Q12 [DSM ACC2856].
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que um ácido nucléico é introduzido na célula hospedeira, codificando uma variante DHFR resistente a antifolato; e em que a célula hospedeira é cultivada com o referido antifolato.
4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma das seguintes características é cumprida:
(a) o antifolato é metotrexato (b) o ácido nucléico codificando a referida variante DHFR resistente ao antifolato codifica um polipeptídeo possuindo a sequência de aminoácidos do grupo consistindo de SEQ ID No. 1 a 9.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a proteína é selecionada do grupo consistindo em citocinas e seus receptores, os fatores de necrose tumoral TNF-alfa e TNF-beta; renina; hormônio do crescimento humano, hormônio do crescimento bovino; fator de liberação do hormônio de crescimento; hormônio de
Petição 870200030248, de 06/03/2020, pág. 7/27
2 paratireoide; hormônio estimulador da tireoide; lipoproteínas; alfa-1antitripsina; cadeia A e cadeia B de insulina; gonadotrofinas, hormônio folículo estimulante (FSH), hormônio luteinizante (LH), tirotrofina, gonadotrofina coriônica humana (hCG); calcitonina; glucagon; fatores de coagulação, fator VIIIC, fator IX, fator VII, fator tecidual, fator de Von Willebrands; fatores anticoagulantes, proteína C; fator natriurético atrial; tensoativo pulmonar; ativadores do plasminogênio, uroquinase, ativador do plasminogênio tipo tecidual e urina humana; bombesina; trombina; fator do crescimento hematopoiético; encefalinase; proteína inflamatória do macrófago humano; albumina do soro, albumina do soro humana; substância inibidora de Müller; cadeia A e cadeia B da relaxina; prorrelaxina; peptídeo associado à gonadotrofina de camundongo; fator de crescimento endotelial vascular; receptores de hormônios ou fatores de crescimento; integrina; proteína A e D; fatores da reumatoide; fatores neurotróficos, fator neurotrófico derivado de osso, neurotrofina 3, neurotrofina 4, neurotrofina 5, neurotrofina 6, fator de crescimento de nervos beta; fator de crescimento derivado de plaquetas; fatores de crescimento de fibroblasto; fator de crescimento epidérmico; fator transformador de crescimento, TGF-alfa e TGF-beta; fator de crescimento tipo insulina I e II; proteínas de ligação ao fator de crescimento tipo insulina; proteínas CD, CD-3, CD-4, CD-8 e CD-19; eritropoietina (EPO); fatores osteoindutores; imunotoxinas; proteína morfogenética óssea; interferonn, interferon alfa, interferon beta, interferon gama; fatores estimuladores de colônia (CSFs); M-CSF, GMCSF e G-CSF; interleucinas (ILs), IL-1 até IL-12; superóxido desmutase; receptores de células T; proteínas da membrana de superfície; fator acelerador de decaimento, anticorpos, imunoadesinas; glicoforina A; e MUC1.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a referida proteína é um anticorpo ou um fragmento do mesmo que é uma construção Fv de cadeia única que compreende duas regiões variáveis da cadeia pesada e leve conectadas por meio de um ligante.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é selecionado do grupo que consiste em anticorpos
Petição 870200030248, de 06/03/2020, pág. 8/27
3 contra o gangliosídeos GD3, anticorpos contra a cadeia alfa do receptor da interleucina-5 humana, anticorpos contra HER2, anticorpos contra o receptor 4 da quimiocina CC, anticorpos contra CD20, anticorpos contra CD22, anticorpos contra neuroblastoma, anticorpos contra MUC1, anticorpos contra o receptor do fator de crescimento epidérmico.
8. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é selecionado do grupo consistindo de Pankomab, Muromomab, Daclizumab, Basiliximab, Abciximab, Rituximab, Herceptin, Gentuzumab, Alentuzumab, Ibritumomab, Cetuximab, Bevacizumab, Tositumomab, Pavlizumab, Infliximab, Eculizumab, Epratuzumab, Omalizumab, Efalizumab, Adalimumab, Campath-1H, C2B8, Panorex, BrevaRex, Simulect, Antova, OKT3, Zenapax, ReoPro, Synagis, Ostavir, Protovir, OvaRex, Vitaxin, anticorpo do receptor 4 de quimiocina anti-CC KM2160, e anticorpo antineuroblastoma chCE7.
9. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é selecionado do grupo consistindo de um anticorpo contra MUC1; um anticorpo contra HER2 e um anticorpo contra EGFR.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é selecionado do grupo consistindo de PankoMab, Panko 1, Panko 2, Herceptin and CetuxiMab.
11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a referida proteína (i) é fusionada a outra sequência peptídica ou polipeptídica selecionada do grupo consistindo de um ligante, uma molécula de ativação e uma toxina; ou (ii) um fragmento de anticorpo fusionado a outra sequência de proteína selecionada do grupo consistindo de citoquinas, fatores coestimuladores, toxinas, fragmentos de anticorpos de outros anticorpos, sequências de multimerização e sequências para detecção, purificação, secreção ou estabilização; ou (iii) um anticorpo ou fragmento de anticorpo acoplado a uma molécula efetora que medeia um efeito terapêutico selecionado do grupo que
Petição 870200030248, de 06/03/2020, pág. 9/27 consiste numa molécula efetora imune, uma toxina e um radioisótopo.
12. Proteína ou composição de moléculas de proteína, caracterizada pelo fato de que é obtenível pelo método de produção como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que a proteína ou composição de moléculas de proteína possui as seguintes características:
(i) ela não compreende NeuGc detectável;
(ii) ela compreende NeuNAc com ligação alfa-2,6; e (iii) ela tem um grau de sialilação aumentado com uma quantidade de NeuNAc na estrutura de carboidrato total ou nas estruturas de carboidrato de um sítio de glicosilação particular da molécula de proteína das moléculas de proteína na referida composição de moléculas de proteína o qual é pelo menos 15% maior em comparação com a mesma quantidade de moléculas de proteína em pelo menos uma composição de moléculas de proteína da mesma molécula de proteína isolada de CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096] quando expressa na mesma; e em que a proteína é um anticorpo quimérico ou humanizado inteiro, um fragmento de anticorpo ou uma proteína de fusão compreendendo um anticorpo quimérico ou humanizado inteiro ou um fragmento de anticorpo fusionado a um parceiro de fusão.
13. Proteína ou composição de moléculas de proteína de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que possui pelo menos uma das seguintes características:
(i) ela não compreende Galalpha1-3Gal terminal detectável; e/ou (ii) ela compreende pelo menos 2% de estruturas de carboidratos das unidades de carboidratos totais de pelo menos uma cadeia de carboidrato particular num sítio de glicosilação particular de uma molécula de proteína das moléculas de proteína na referida composição de moléculas de proteína, a qual contém GlcNAc bifurcada;
(iii) ela compreende pelo menos 5% de estruturas de carboidratos das unidades de carboidratos totais de pelo menos uma cadeia de carboidrato particular num sítio de glicosilação particular de uma molécula de proteína das moléculas de proteína na referida composição de moléculas de
Petição 870200030248, de 06/03/2020, pág. 10/27 proteína, a qual contém GlcNAc bifurcada;
(iv) ela tem um grau de sialilação aumentado com uma quantidade de NeuNAc na estrutura de carboidrato total ou nas estruturas de carboidrato de um sítio de glicosilação particular da molécula de proteína das moléculas de proteína na referida composição de moléculas de proteína o qual é pelo menos 20% maior em comparação com a mesma quantidade de moléculas de proteína em pelo menos uma composição de moléculas de proteína da mesma molécula de proteína isolada de CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096] quando expressa na mesma;
(v) ela compreende pelo menos 50% de estruturas de carboidrato das unidades de carboidrato totais ou de pelo menos uma cadeia de carboidrato particular num sítio de glicosilação particular da molécula de proteína das moléculas de proteína na referida composição da moléculas de proteína, sem fucose; e/ou (vi) ela tem um grau de sialilação maior do que é alcançado em células NM-F9 [DSM ACC2606] ou NM-D4 [DSM ACC2605]; em que as células NM-F9 [DSM ACC2606] e NM-D4 [DSM ACC2605] alcançam apenas cerca de 50 a 60% do grau de sialilação que é obtido com a referida célula hospedeira.
14. Proteína ou composição de moléculas de proteína de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizada pelo fato de que tem pelo menos uma das seguintes características:
- ela tem um grau de galactosilação de galactose na estrutura de carboidrato total ou nas estruturas de carboidratos em um sítio de glicosilação particular da molécula de proteína das moléculas de proteína na referida composição de moléculas de proteína que é aumentado em comparação com a mesma quantidade de moléculas de proteína em pelo menos uma composição de moléculas de proteína da mesma molécula de proteína isolada de CHOdhfr-[ATCC No. CRL-9096] quando ali expressa;
- ela tem uma quantidade de estruturas G2 nas estruturas de carboidrato total ou nas estruturas de carboidrato em um sítio de glicosilação particular da molécula de proteína das referidas moléculas de proteína na
Petição 870200030248, de 06/03/2020, pág. 11/27
6 referida composição de moléculas de proteína a qual é pelo menos 5% mais alta em comparação com a mesma quantidade de moléculas de proteína em pelo menos uma composição de moléculas de proteína da mesma molécula de proteína isolada a partir de CHOdhfr-[ATCC No. CRL-9096] quando ali expressa;
- ela tem uma quantidade de estruturas G0 nas estruturas de carboidrato total ou nas estruturas de carboidrato em um sítio de glicosilação particular da molécula de proteína das referidas moléculas de proteína na referida composição de moléculas de proteína a qual é pelo menos 5% mais baixa em comparação com a mesma quantidade de moléculas de proteína em pelo menos uma composição de moléculas de proteína da mesma molécula de proteína isolada a partir de CHOdhfr-[ATCC No. CRL-9096] quando ali expressa;
- ela compreende uma quantidade de fucose nas estruturas de carboidrato total ou nas estruturas de carboidrato em um sítio de glicosilação particular da molécula de proteína das referidas moléculas de proteína na referida composição de moléculas de proteína a qual é pelo menos 5% menor em comparação com a mesma quantidade de moléculas de proteína em pelo menos uma composição de moléculas de proteína da mesma molécula de proteína isolada a partir de CHOdhfr-[ATCC No. CRL-9096] quando ali expressa;
- ela tem um grau de sialilação aumentado com uma quantidade de NeuNAc na estrutura de carboidrato total ou nas estruturas de carboidrato de um sítio de glicosilação particular da molécula de proteína das moléculas de proteína na referida composição da molécula de proteína o qual é pelo menos 20% maior em comparação com a mesma quantidade de moléculas de proteína em pelo menos uma composição de moléculas de proteína da mesma molécula de proteína isolada de CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096] quando ali expressa,
- ela compreende pelo menos 20% a mais de cadeias de carboidratos N-glicosidicamente carregadas ligadas das unidades de carboidrato totais ou de pelo menos uma cadeia de carboidrato particular num sítio de
Petição 870200030248, de 06/03/2020, pág. 12/27 glicosilação particular da molécula de proteína das moléculas de proteína na referida composição da molécula de proteína em comparação com a mesma quantidade de moléculas de proteína em pelo menos uma composição da molécula de proteína da mesma molécula de proteína isolada de CHOdhfr[ATCC No. CRL-9096] quanto ali expressa,
- ela compreende pelo menos 10% de estruturas de carboidratos das unidades de carboidratos totais de pelo menos uma cadeia de carboidrato particular num sítio de glicosilação particular de uma molécula de proteína das moléculas de proteína na referida composição de moléculas de proteína, sem-fucose;
- ela compreende pelo menos 5% de estruturas de carboidratos das unidades de carboidratos totais de pelo menos uma cadeia de carboidrato particular num sítio de glicosilação particular de uma molécula de proteína das moléculas de proteína na referida composição de moléculas de proteína, a qual contém GlcNAc bifurcada;
- ela compreende mais de 35% de estruturas G2 nas estruturas de carboidrato total ou nas estruturas de carboidrato em um sítio de glicosilação particular da molécula de proteína das moléculas de proteína na referida composição de proteína;
- ela compreende menos de 22% de estruturas G0 nas estruturas de carboidratos totais ou nas estruturas de carboidrato em um sítio de glicosilação particular da molécula de proteína das moléculas de proteína na referida composição de proteína;
- ela tem uma atividade aumentada e/ou rendimento aumentado em comparação com pelo menos uma composição de moléculas de proteína da mesma molécula de proteína quando expressa na linhagem celular CHO dhfr- [ATCC No. CRL-9096];
- ela tem uma homogeneidade melhorada em comparação com pelo menos uma composição de moléculas de proteína da mesma molécula de proteína quando expressa na linhagem celular CHOdhfr- [ATCC No. CRL9096];
- ela tem uma média aumentada ou rendimento máximo o qual é
Petição 870200030248, de 06/03/2020, pág. 13/27
8 pelo menos 10% maior do que o rendimento de pelo menos uma composição de moléculas de proteína a partir da mesma molécula de proteína quando expressa na linhagem celular CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096];
- ela tem uma atividade aumentada, a qual é pelo menos 10% maior do que a atividade de pelo menos uma composição de moléculas de proteína a partir da mesma molécula de proteína quando expressa na linhagem celular CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096];
- ela tem uma homogeneidade melhorada, a qual é uma homogeneidade de glicosilação melhorada em que a referida composição da molécula do anticorpo tem um grau de sialilação mais baixo do que o grau de sialilação de pelo menos uma composição de moléculas de anticorpo a partir da mesma molécula de anticorpo quando expressa na linhagem celular CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096];
- ela tem uma citotoxicidade celular mediada por Fc a qual é pelo menos duas vezes maior do que a citotoxicidade celular mediada por Fc de pelo menos uma composição da molécula de anticorpo a partir da mesma molécula de anticorpo quando expressa na linhagem celular CHOdhfr[ATCC No. CRL-9096];
- ela tem uma ligação mediada por antígeno ou mediada por Fc aumentada, a qual é pelo menos 20%, preferivelmente 30 ou 50% maior do que a ligação de pelo menos uma composição da molécula de anticorpo a partir da mesma molécula de anticorpo quando expressa na linhagem celular CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096].
15. Proteína ou composição de moléculas de proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é da classe IgG e/ou uma IgG humanizada ou quimérica que compreende uma região Fc humana.
16. Proteína ou composição de moléculas de proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 15, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma glicoforma de uma molécula de anticorpo com pelo menos uma cadeia de carboidrato ligada a um outro sítio de glicosilação da molécula de anticorpo do que o aminoácido Asn-297 no segundo
Petição 870200030248, de 06/03/2020, pág. 14/27 domínio da região Fc.
17. Proteína ou composição de moléculas de proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 16, caracterizada pelo fato de que o anticorpo tem pelo menos uma sítio de N-glicosilação possuindo a sequência de aminoácidos Asn-Xaa-Ser/Thr, em que Xaa pode ser qualquer aminoácido exceto Pro, e/ou pelo menos um sítio de O-glicosilação na sequência da região Fab.
18. Proteína ou composição de moléculas de proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 17, caracterizada pelo fato de que compreende (i) uma molécula de anticorpo que compreende pelo menos uma cadeia de carboidrato ligada a um outro sítio de glicosilação da molécula de anticorpo do que o aminoácido Asn-297 no segundo domínio da parte Fc, em que a composição de anticorpo tem uma meia vida em soro e/ou biodisponibilidade prolongados, quando medida em pelo menos um mamífero, que a composição da molécula de anticorpo da mesma molécula de anticorpo isolada de pelo menos uma das linhagens celulares CHO, CHOdhfr-, BHK, NS0, SP2/0, NM-F9, NM-D4, PerC.6 ou hibridoma de camundongo quando expressos nas mesmas; ou (ii) uma molécula de anticorpo que compreende pelo menos uma cadeia de carboidrato ligada a pelo menos um sítio de N-glicosilação e/ou pelo menos um sítio de O-glicosilação numa sequência da região de Fab da molécula de anticorpo, em que a composição de anticorpo tem uma meiavida em soro e/ou biodisponibilidade prolongada, quando medida em pelo menos um mamífero, do que a composição de moléculas de anticorpos da mesma molécula de anticorpo isolada a partir de pelo menos uma das linhagens de células CHO, CHOdhfr-, BHK, NS0, SP2/0, PerC.6 ou hibridoma de camundongo quando nas mesmas.
19. Proteína ou composição de moléculas de proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18, caracterizada pelo fato de que (i) é fusionada a outra sequência peptídica ou polipeptídica sele-
Petição 870200030248, de 06/03/2020, pág. 15/27
10 cionada do grupo consistindo de um ligante, uma molécula de ativação e uma toxina; ou (ii) um fragmento de anticorpo fusionado a outra sequência de proteína selecionada do grupo consistindo de citoquinas, fatores coestimuladores, toxinas, fragmentos de anticorpos de outros anticorpos, sequências de multimerização e sequências para detecção, purificação, secreção ou estabilização; ou (iii) um anticorpo ou fragmento de anticorpo acoplado a uma molécula efetora que medeia um efeito terapêutico selecionado do grupo que consiste numa molécula efetora imune, uma toxina e um radioisótopo.
20. Proteína ou composição de moléculas de proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 19, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é selecionado do grupo que consiste em anticorpos contra o gangliosídeos GD3, anticorpos contra a cadeia alfa do receptor da interleucina-5 humana, anticorpos contra HER2, anticorpos contra o receptor 4 da quimiocina CC, anticorpos contra CD20, anticorpos contra CD22, anticorpos contra neuroblastoma, anticorpos contra MUC1, anticorpos contra o receptor do fator de crescimento epidérmico.
21. Proteína ou composição de moléculas de proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 19, caracterizada pelo fato de que o anticorpo é selecionado do grupo consistindo de Pankomab, Muromomab, Daclizumab, Basiliximab, Abciximab, Rituximab, Herceptin, Gentuzumab, Alentuzumab, Ibritumomab, Cetuximab, Bevacizumab, Tositumomab, Pavlizumab, Infliximab, Eculizumab, Epratuzumab, Omalizumab, Efalizumab, Adalimumab, Campath-1H, C2B8, Panorex, BrevaRex, Simulect, Antova, OKT3, Zenapax, ReoPro, Synagis, Ostavir, Protovir, OvaRex, Vitaxin, anticorpo do receptor 4 de quimiocina anti-CC KM2160, e anticorpo antineuroblastoma chCE7.
22. Proteína ou composição de moléculas de proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 19, caracterizada pelo fato de que a referida composição compreende pelo menos uma molécula de anticorpo, a ligação de um epítopo MUC1 compreendendo a sequência de ami-
Petição 870200030248, de 06/03/2020, pág. 16/27 noácidos DTR da região de repetição em sequência extracelular.
23. Proteína ou composição de moléculas de proteína de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que o referido anticorpo é selecionado dentre:
- o anticorpo PankoMab ou uma variante sua, se ligando competitivamente ao mesmo epítopo TA-MUC1 como PankoMab;
- o anticorpo Panko 1 ou uma variante sua, se ligando competitivamente ao mesmo epítopo TA-MUC1 como Panko 1; e
- o anticorpo Panko 2 ou uma variante sua, se ligando competitivamente ao mesmo epítopo TA-MUC1 como Panko 2;
24. Proteína ou composição de moléculas de proteína de acordo com a reivindicação 22 ou 23, caracterizada pelo fato de que o referido anticorpo é selecionado a partir do seguinte grupo consistindo:
(a) o anticorpo PankoMab ou uma variante do mesmo, com (i) uma atividade ADCC aumentada a qual é pelo menos 3 vezes maior do que a atividade da composição da molécula do anticorpo a partir da mesma molécula de anticorpo expressa na linhagem celular CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096]; e/ou (ii) uma atividade CDC aumentada a qual é pelo menos 20% maior do que a atividade da composição da molécula de anticorpo a partir da mesma molécula de anticorpo expressa na linhagem celular CHOdhfr[ATCC No. CRL-9096]; e/ou (iii) 2-6 NeuNAc detectável, e/ou (iv) uma meia-vida do soro a qual é preferivelmente pelo menos mais 1,5 vezes prolongada em comparação com uma composição da molécula do anticorpo da mesma molécula de anticorpo isolada de NM-F9 [DSM ACC2606] quando ali expressa; e/ou (v) uma quantidade de estruturas G2 na estrutura de carboidrato total ou nas estruturas de carboidrato em um sítio de glicosilação particular da molécula de anticorpo das referidas moléculas de anticorpo na referida composição da molécula de anticorpo a qual é pelo menos 50% maior em comparação com a mesma quantidade de moléculas de anticorpo em
Petição 870200030248, de 06/03/2020, pág. 17/27 pelo menos uma composição de moléculas de anticorpo da mesma molécula de anticorpo isolada de CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096] quando ali expressa, e/ou (vi) uma quantidade de estruturas GlcNAc bifurcada nas estrutura de carboidrato total ou nas estruturas de carboidratos em um sítio de glicosilação particular da molécula de proteína das referidas moléculas de anticorpo na referida composição da molécula de anticorpo a qual é pelo menos 20% maior em comparação com a mesma quantidade das moléculas de anticorpo em pelo menos uma composição da molécula de anticorpo da mesma molécula de anticorpo isolada de CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096] quando ali expressa, em que a referida composição da molécula PankoMab é obtenível com um rendimento superior pela sua produção na célula hospedeira NM-H9D8 [DSM ACC2806] em comparação com uma composição da molécula PankoMab isolada de CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096] quando ali expressa;
(b) o anticorpo Panko 2 ou uma variante sua, com (i) uma atividade ADCC aumentada a qual é pelo menos 4 vezes maior do que a atividade da composição da molécula do anticorpo a partir da mesma molécula de anticorpo expressa na linhagem celular CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096]; e/ou (ii) 2-6 NeuNAc detectável, e/ou (iii) uma atividade de ligação a antígeno maior que é pelo menos 30% maior do que a atividade da composição da molécula de anticorpo a partir da mesma molécula de anticorpo expressa na linhagem celular CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096];
em que a referida composição da molécula Panko 2 é obtenível pela sua produção na célula hospedeira NM-H9D8 [DSM ACC2806];
(c) o anticorpo Panco ou uma variante sua, com (i) uma atividade ADCC aumentada a qual é pelo menos 8 vezes maior do que a atividade da composição da molécula do anticorpo a partir da mesma molécula de anticorpo expressa na linhagem celular CHO-
Petição 870200030248, de 06/03/2020, pág. 18/27 dhfr- [ATCC No. CRL-9096]; e/ou (ii) uma quantidade de estruturas G2 na estrutura de carboidrato total ou nas estruturas de carboidrato em um sítio de glicosilação particular da molécula de anticorpo das referidas moléculas de anticorpo na referida composição da molécula de anticorpo a qual é pelo menos 50% maior em comparação com a mesma quantidade de moléculas de anticorpo em pelo menos uma composição de moléculas de anticorpo da mesma molécula de anticorpo isolada de CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096] quando ali expressa, e/ou (iii) uma quantidade maior de estruturas não-fucosiladas na estrutura de carboidrato total ou nas estruturas de carboidrato em um sítio de glicosilação particular da molécula de anticorpo das referidas moléculas de anticorpo na referida composição da molécula de anticorpo a qual é pelo menos 70% maior em comparação com a mesma quantidade de moléculas de anticorpo em pelo menos uma composição de moléculas de anticorpo da mesma molécula de anticorpo isolada de CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096] quando ali expressa;
em que a referida composição da molécula Panko 1 é obtenível pela sua produção na célula hospedeira NM-H9D8-E6 [DSM ACC2856]; e (d) o anticorpo Panko 1 ou uma variante sua, com (i) uma atividade ADCC aumentada a qual é pelo menos 50% maior do que a atividade da composição da molécula do anticorpo a partir da mesma molécula de anticorpo expressa na linhagem celular CHOdhfr[ATCC No. CRL-9096]; e/ou (ii) uma quantidade de estruturas G2 na estrutura de carboidrato total ou nas estruturas de carboidrato em um sítio de glicosilação particular da molécula de anticorpo das referidas moléculas de anticorpo na referida composição da molécula de anticorpo a qual é pelo menos 50% maior em comparação com a mesma quantidade de moléculas de anticorpo em pelo menos uma composição de moléculas de anticorpo da mesma molécula de anticorpo isolada de CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096] quando ali expressa, e/ou (iii) uma quantidade maior de estruturas não-fucosiladas na
Petição 870200030248, de 06/03/2020, pág. 19/27 estrutura de carboidrato total ou nas estruturas de carboidrato em um sítio de glicosilação particular da molécula de anticorpo das referidas moléculas de anticorpo na referida composição da molécula de anticorpo a qual é pelo menos 50% maior em comparação com a mesma quantidade de moléculas de anticorpo em pelo menos uma composição de moléculas de anticorpo da mesma molécula de anticorpo isolada de CHOdhfr- [ATCC No. CRL-9096] quando ali expressa;
em que a referida composição da molécula Panko 1 é obtenível pela sua produção na célula hospedeira NM-H9D8 [DSM ACC2806].
25. Proteína ou composição de moléculas de proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 19, caracterizada pelo fato de que é selecionada do grupo consistindo em (i) um anticorpo contra o receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR);
(ii) um anticorpo contra HER2; e (iii) um anticorpo contra CD20.
26. Proteína ou composição de moléculas de proteína de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que é selecionada do grupo consistindo em (i) o anticorpo é cetuximab ou uma variante sua, que se liga ao mesmo epítopo que cetuximab;
(ii) o anticorpo herceptin;.
(ii) o anticorpo Rituximab; e (iii) o anticorpo Rituximab.
27. Uso da proteína ou composição de moléculas de proteína como definida em qualquer uma das reivindicações 12 a 26, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para tratamento terapêutico ou profilático de um paciente com necessidade do mesmo.
28. Uso de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a doença é selecionada do grupo que consiste em leucemia, neutropenia, citopenia, câncer, transplante de medula óssea, doenças do sistema hematopoiético, infertilidade e doenças autoimunes.
BRPI0716997A 2006-09-10 2007-09-10 proteína ou composição de moléculas de proteína, métodos para produção e uso da mesma BRPI0716997B8 (pt)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP06090162 2006-09-10
EP06090162.6 2006-09-10
EP06090171.7 2006-09-18
EP06090171A EP1900750A1 (en) 2006-09-18 2006-09-18 Fully human high yield production system for improved antibodies
EP06090190.7 2006-10-13
EP06090190A EP1911766A1 (en) 2006-10-13 2006-10-13 Use of human cells of myeloid leukaemia origin for expression of antibodies
EP07090094.9 2007-05-04
EP07090094 2007-05-04
PCT/EP2007/007877 WO2008028686A2 (en) 2006-09-10 2007-09-10 Use of human cells of myeloid leukaemia origin for expression of antibodies

Publications (4)

Publication Number Publication Date
BRPI0716997A2 BRPI0716997A2 (pt) 2013-10-15
BRPI0716997A8 BRPI0716997A8 (pt) 2019-02-05
BRPI0716997B1 true BRPI0716997B1 (pt) 2020-06-02
BRPI0716997B8 BRPI0716997B8 (pt) 2021-05-25

Family

ID=39157600

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BRPI0716997A BRPI0716997B8 (pt) 2006-09-10 2007-09-10 proteína ou composição de moléculas de proteína, métodos para produção e uso da mesma

Country Status (25)

Country Link
US (3) US9051356B2 (pt)
EP (5) EP2073842B2 (pt)
JP (3) JP5767779B2 (pt)
KR (3) KR101603632B1 (pt)
CN (1) CN103436574B (pt)
AU (1) AU2007294122B2 (pt)
BR (1) BRPI0716997B8 (pt)
CA (1) CA2662226C (pt)
CU (1) CU23791A3 (pt)
CY (1) CY1116279T1 (pt)
DK (2) DK2073842T4 (pt)
EA (1) EA017622B1 (pt)
ES (2) ES2620261T3 (pt)
FI (1) FI2073842T4 (pt)
HR (1) HRP20150307T1 (pt)
IL (1) IL197459A (pt)
MX (1) MX2009002388A (pt)
NZ (1) NZ575974A (pt)
PL (1) PL2073842T3 (pt)
PT (1) PT2073842E (pt)
RS (1) RS53861B1 (pt)
SG (1) SG174792A1 (pt)
SI (1) SI2073842T1 (pt)
WO (1) WO2008028686A2 (pt)
ZA (1) ZA201001903B (pt)

Families Citing this family (75)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3528611B2 (ja) * 1998-07-16 2004-05-17 Ｊｆｅスチール株式会社 結束材の切断方法及びその装置
BRPI0716997B8 (pt) 2006-09-10 2021-05-25 Glycotope Gmbh proteína ou composição de moléculas de proteína, métodos para produção e uso da mesma
EP1920781B1 (en) * 2006-11-10 2015-03-04 Glycotope GmbH Compositions comprising a core-1 positive microorganism and their use for the treatment or prophylaxis of tumors
WO2008135259A2 (en) * 2007-05-04 2008-11-13 Glycotope Gmbh Antibody molecule composition
GB0812277D0 (en) * 2008-07-04 2008-08-13 Fusion Antibodies Ltd Antibody and uses thereof
NZ593816A (en) † 2009-01-22 2012-11-30 Momenta Pharmaceuticals Inc Galactose-alpha-1, 3-galactose-containing n-glycans in glycoprotein products derived from cho cells
US20120100576A1 (en) 2009-07-08 2012-04-26 Glycotope Gmbh Perfusion bioreactor
EP2281844A1 (en) 2009-07-31 2011-02-09 Glycotope GmbH MUC 1 antibodies
WO2012016576A1 (en) * 2010-08-04 2012-02-09 Glycotope Gmbh Improved recombinant human follicle-stimulating hormone
CN103025760A (zh) 2010-08-10 2013-04-03 葛莱高托普有限公司 人源化egfr抗体
US9051370B2 (en) 2010-08-10 2015-06-09 Glycotope Gmbh Humanized EGFR antibodies
JP6334166B2 (ja) * 2010-08-10 2018-05-30 グリコトープ ゲーエムベーハー Ｆａｂグリコシル化抗体
JP6096123B2 (ja) 2010-12-21 2017-03-15 グリコトープ ゲーエムベーハー ヒト骨髄性白血病細胞およびそれに由来する細胞を培養するための方法
EP2699268A2 (de) 2011-04-21 2014-02-26 Seattle Genetics, Inc. Neue binder-wirkstoff konjugate (adcs) und ihre verwendung
WO2012149197A2 (en) 2011-04-27 2012-11-01 Abbott Laboratories Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins
KR20140101331A (ko) * 2011-08-10 2014-08-19 라보라토이레 프란카이즈 듀 프락티온네먼트 에트 데스 바이오테크놀로지스 고도로 갈락토실화된 항체
WO2013026887A1 (en) 2011-08-22 2013-02-28 Glycotope Gmbh Microorganisms carrying a tumor antigen
US9181572B2 (en) 2012-04-20 2015-11-10 Abbvie, Inc. Methods to modulate lysine variant distribution
US9067990B2 (en) 2013-03-14 2015-06-30 Abbvie, Inc. Protein purification using displacement chromatography
US9150645B2 (en) 2012-04-20 2015-10-06 Abbvie, Inc. Cell culture methods to reduce acidic species
NZ701974A (en) 2012-07-18 2018-03-23 Glycotope Gmbh Novel therapeutic treatments with anti-her2 antibodies having a low fucosylation
US9512214B2 (en) 2012-09-02 2016-12-06 Abbvie, Inc. Methods to control protein heterogeneity
EP2945964A2 (en) 2013-01-18 2015-11-25 Glycotope GmbH Fusion peptides for enhancing protein expression
CN105308071A (zh) * 2013-02-13 2016-02-03 法国化学与生物科技实验室 高度半乳糖基化的抗her2抗体及其用途
MX2015010427A (es) 2013-02-13 2016-03-17 Lab Francais Du Fractionnement Anticuerpos anti-tnf-alfa altamente galactosilados y sus usos.
BR112015019348A2 (pt) 2013-02-13 2017-08-22 Lab Francais Du Fractionnement Métodos para produção de proteína com glicosilação modificada e com sialilação aumentada, para aumentar a atividade de sialil transferase na glândula mamária e para produzir sialil transferase, proteína com glicosilação modificada ou proteína com sialilação aumentada, composição, sialil transferase, mamífero transgênico, e, célula epitelial mamária
EP2956484B1 (en) * 2013-02-13 2018-11-14 Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies Cetuximab with modified glycosylation and uses thereof
WO2014143205A1 (en) 2013-03-12 2014-09-18 Abbvie Inc. Human antibodies that bind human tnf-alpha and methods of preparing the same
US9017687B1 (en) 2013-10-18 2015-04-28 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography
EP2968526A4 (en) 2013-03-14 2016-11-09 Abbott Lab ANTIGEN-ANTIBODY COMBINATION ASSAY OF HEPATITIS C VIRUS AND METHODS AND COMPOSITIONS FOR USE THEREWITH
CN113549148A (zh) 2013-03-14 2021-10-26 雅培制药有限公司 Hcv核心脂质结合结构域单克隆抗体
CN105209616A (zh) 2013-03-14 2015-12-30 雅培制药有限公司 用于改进的抗体检测的hcv ns3重组抗原及其突变体
WO2014151878A2 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Abbvie Inc. Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosacharides
US9217168B2 (en) 2013-03-14 2015-12-22 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods of cell culture
EP3754012A1 (en) * 2013-03-15 2020-12-23 Alder Biopharmaceuticals, Inc. Antibody purification and purity monitoring
BR112015025955A2 (pt) 2013-04-22 2017-10-17 Glycotope Gmbh tratamentos anticancerosos com anticorpos anti-egfr apresentando uma baixa fucosilação
US10208125B2 (en) 2013-07-15 2019-02-19 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Anti-mucin 1 binding agents and uses thereof
EP3052640A2 (en) 2013-10-04 2016-08-10 AbbVie Inc. Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins
US9181337B2 (en) 2013-10-18 2015-11-10 Abbvie, Inc. Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same
US9085618B2 (en) 2013-10-18 2015-07-21 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same
WO2015073884A2 (en) * 2013-11-15 2015-05-21 Abbvie, Inc. Glycoengineered binding protein compositions
NZ720736A (en) 2013-12-23 2020-08-28 Bayer Pharma AG Antibody drug conjugates (adcs) with kinesin spindel protein (ksp)
WO2015134696A1 (en) * 2014-03-05 2015-09-11 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Sialylated glycoprotein compositions and uses thereof
US20150307546A1 (en) * 2014-04-29 2015-10-29 Georgia Tech Research Corporation Thermo-responsive lectin-elp fusion binding ligands for glycoprotein purification by affinity precipitation
CN105820248A (zh) * 2015-01-07 2016-08-03 上海张江生物技术有限公司 一种新型抗egfr单克隆抗体的制备方法及应用
LU92659B1 (en) * 2015-02-23 2016-08-24 Glycotope Gmbh Glycooptimized antibody drug conjugates
LT3277807T (lt) 2015-03-31 2020-01-10 Glycotope Gmbh Eukariotiniai ekspresijos vektoriai, apimantys globino genų klasterių reguliavimo elementus
FR3034420A1 (fr) 2015-03-31 2016-10-07 Lab Francais Du Fractionnement Anticorps monoclonaux anti-cd303
WO2016198499A1 (en) 2015-06-09 2016-12-15 Glycotope Gmbh IMPROVED METHOD FOR PRODUCTION OF γ-CARBOXYLATED POLYPEPTIDES
CN108025084A (zh) 2015-06-22 2018-05-11 拜耳医药股份有限公司 具有酶可裂解基团的抗体药物缀合物（adc）和抗体前药缀合物（apdc）
PE20180452A1 (es) 2015-06-23 2018-03-05 Bayer Pharma AG Conjugados homogeneos especificos de sitio con inhibidores de ksp
WO2016207328A1 (en) 2015-06-24 2016-12-29 Glycotope Gmbh PROCESS FOR THE PURIFICATION OF γ-CARBOXYLATED POLYPEPTIDES
WO2017060322A2 (en) 2015-10-10 2017-04-13 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Ptefb-inhibitor-adc
WO2017070460A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 Massachusetts Institute Of Technology Vegf-a-binding proteins and her2-binding proteins with enhanced stability against aggregation
WO2017162733A1 (en) * 2016-03-22 2017-09-28 Glycotope Gmbh Iga antibodies with enhanced stability
WO2017162663A1 (de) 2016-03-24 2017-09-28 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Prodrugs von cytotoxischen wirkstoffen mit enzymatisch spaltbaren gruppen
JP7022707B2 (ja) 2016-06-15 2022-02-18 バイエル・ファルマ・アクティエンゲゼルシャフト Ｋｓｐ阻害剤および抗ｃｄ１２３抗体を含む特異的抗体－薬物－コンジュゲート（ａｄｃ）
WO2017220527A1 (en) 2016-06-20 2017-12-28 Glycotope Gmbh Means and methods for modifying multiple alleles
FR3060394B1 (fr) 2016-12-16 2019-05-24 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Combinaison d'anticorps anti-cd303 et anti-amhrii
FR3060395B1 (fr) 2016-12-16 2019-05-24 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Combinaison d'anticorps anti-cd303 et anti-her2
CN110072556B (zh) 2016-12-21 2023-05-02 拜耳制药股份公司 具有ksp抑制剂的特异性抗体药物缀合物(adc)
KR102583006B1 (ko) 2016-12-21 2023-09-27 바이엘 파마 악티엔게젤샤프트 효소적으로 절단가능한 기를 갖는 항체 약물 접합체 (adc)
WO2018114798A1 (de) 2016-12-21 2018-06-28 Bayer Aktiengesellschaft Prodrugs von cytotoxischen wirkstoffen mit enzymatisch spaltbaren gruppen
CA3050039A1 (en) 2017-01-27 2018-08-02 Glycotope Gmbh Anti-cancer treatments with an anti-muc1 antibody and an erbb inhibitor
JP6829357B2 (ja) * 2017-03-17 2021-02-10 住友ベークライト株式会社 抗体の糖鎖検出法
EP3601357A1 (en) 2017-03-29 2020-02-05 Glycotope GmbH Multispecific antibody constructs binding to muc1 and cd3
EP3601348A1 (en) 2017-03-29 2020-02-05 Glycotope GmbH Humanized anti-cd40 antibodies
CA3057758A1 (en) * 2017-03-29 2018-10-04 Glycotope Gmbh Pd-l1 and ta-muc1 antibodies
KR20200044955A (ko) * 2017-09-06 2020-04-29 에어웨이 테라퓨틱스, 아이엔씨. 계면활성제 단백질 d (sp-d)를 제조하는 방법 및 조성물
EP3678682A4 (en) 2017-09-06 2021-06-09 Airway Therapeutics, Inc. METHOD, COMPOSITIONS AND CELLS FOR MANUFACTURING SURFACTANT PROTEIN D (SP-D)
JP2021514625A (ja) 2018-03-01 2021-06-17 グリコトープ ゲーエムベーハー 抗ｍｕｃ１抗体およびｉｌ−１５を含む融合タンパク質構築物
US20210187118A1 (en) 2018-05-18 2021-06-24 Daiichi Sankyo Co., Ltd. Anti-muc1 antibody-drug conjugate
SG11202110968VA (en) 2019-12-06 2021-10-28 Regeneron Pharma Anti-vegf protein compositions and methods for producing the same
WO2022002887A1 (en) 2020-06-30 2022-01-06 Glycotope Gmbh Humanized antibodies against lewis y
WO2023175117A1 (en) 2022-03-16 2023-09-21 Glycotope Gmbh Antibodies against lypd3

Family Cites Families (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4966843A (en) * 1982-11-01 1990-10-30 Cetus Corporation Expression of interferon genes in Chinese hamster ovary cells
AU2353384A (en) * 1983-01-19 1984-07-26 Genentech Inc. Amplification in eukaryotic host cells
KR850004274A (ko) 1983-12-13 1985-07-11 원본미기재 에리트로포이에틴의 제조방법
US4931275A (en) 1985-12-02 1990-06-05 Yeda Research & Development Co., Ltd. Anti-tumor vaccines and their preparation
US5683674A (en) 1987-01-07 1997-11-04 Imperial Cancer Research Technology Ltd. Antibody against human mucin core protein and method of preparing and using same
JPH06508985A (ja) 1991-02-27 1994-10-13 クリエイティブ　バイオモレキュルズ　インコーポレイテッド 富セリンペプチドリンカー
AU683413B2 (en) 1992-04-13 1997-11-13 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Antibodies specific for carcinoma-associated antigens
US5804187A (en) 1992-11-16 1998-09-08 Cancer Research Fund Of Contra Costa Modified antibodies with human milk fat globule specificity
WO1994029469A2 (en) 1993-06-07 1994-12-22 Vical Incorporated Plasmids suitable for gene therapy
DE4329004A1 (de) 1993-08-28 1995-03-09 Max Delbrueck Centrum Monoklonale Antikörper gegen das Thomsen-Friedenreich-Antigen, ihre Herstellung und ihre Verwendung zum Tumornachweis
AU7965694A (en) * 1993-10-15 1995-05-04 Curators Of The University Of Missouri, The Dna encoding the human p2u receptor and null cells expressing p2u receptors
US5997873A (en) 1994-01-13 1999-12-07 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Method of preparation of heat shock protein 70-peptide complexes
US5961979A (en) 1994-03-16 1999-10-05 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Stress protein-peptide complexes as prophylactic and therapeutic vaccines against intracellular pathogens
US5888773A (en) * 1994-08-17 1999-03-30 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of producing single-chain Fv molecules
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
JPH11509088A (ja) 1995-06-23 1999-08-17 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 血管内皮増殖因子受容体をコードする遺伝子の転写調節
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
EP0906444A1 (de) 1996-04-19 1999-04-07 Gabriele Pecher Gentransfizierte humane dendritische zellen, ihre herstellung und ihre verwendung, bevorzugt als vakzine
JP2001523480A (ja) 1997-11-20 2001-11-27 バイカル インコーポレイテッド サイトカイン発現ポリヌクレオチドおよびそれらの組成物を用いた癌の処置
US5948646A (en) 1997-12-11 1999-09-07 Fordham University Methods for preparation of vaccines against cancer comprising heat shock protein-peptide complexes
WO1999054342A1 (en) 1998-04-20 1999-10-28 Pablo Umana Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
AUPP816899A0 (en) 1999-01-14 1999-02-11 Food Technology Innovations Pty Limited Improved microbial products
AU3508300A (en) 1999-03-02 2000-09-21 Human Genome Sciences, Inc. Engineering intracellular sialylation pathways
JP4488579B2 (ja) * 1999-03-30 2010-06-23 日本たばこ産業株式会社 モノクローナル抗体の製造方法
EP1167537B1 (en) * 1999-03-30 2008-07-23 Japan Tobacco Inc. Process for producing monoclonal antibody
ES2568899T3 (es) 1999-04-09 2016-05-05 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional
US7147850B2 (en) 1999-08-18 2006-12-12 Altarex Medical Corp. Therapeutic binding agents against MUC-1 antigen and methods for their use
ATE290879T1 (de) 1999-08-18 2005-04-15 Altarex Medical Corp Therapeutische antikörper gegen das muc-1 antigen und verfahren zu deren verwendung
WO2001023421A2 (en) 1999-09-30 2001-04-05 Corixa Corporation Stress protein compositions and methods for prevention and treatment of cancer and infectious disease
FR2809312B1 (fr) 2000-05-25 2002-07-12 Gervais Danone Sa Utilisation de l. casei dans des compositions immunostimulantes
CA2424977C (en) * 2000-10-06 2008-03-18 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
GB0029360D0 (en) 2000-12-01 2001-01-17 Univ Nottingham Humanised antibodies and uses thereof
WO2002061118A1 (fr) 2001-02-01 2002-08-08 Kabushiki Kaisha Yakult Honsha Methode d'evaluation de l'acces a l'intestin d'une bacterie bifidus contenue dans un aliment ou une boisson a base de lait fermente
US20050042714A1 (en) 2001-08-17 2005-02-24 Michael Pawlita Glycoconjugates of sialic acid derivates, methods for their production and use thereof
DE10139428A1 (de) 2001-08-17 2003-03-27 Nemod Immuntherapie Ag Herstellung und Verwendung von humanen CD124 und CD116 positiven Tumorzelllinien zur Herstellung von allogenen oder semi-allogenen Immuntherapeutika
AU2002340562B2 (en) * 2001-10-22 2008-10-23 Merck Serono Sa Compositions of FSH with high sialylation degree and their use for the preparation of medicaments
GB0125473D0 (en) 2001-10-24 2001-12-12 Syngenta Ltd Chemical process
KR100506766B1 (ko) 2001-11-20 2005-08-05 (주)에이티젠 환경 스트레스에 내성을 부여하는 신규한 펩타이드 및이를 포함하는 융합단백질
DK1529060T3 (en) 2002-07-22 2014-12-15 Glycotope Gmbh PROCEDURE FOR PREPARING AN IMMUNSTIMULATORY MUCIN (MUC1)
ATE482720T1 (de) 2002-08-16 2010-10-15 Glycotope Gmbh Verfahren zur herstellung von temperaturinduzierten tumorzell-lysaten zur verwendung als immunogene verbindungen
DE10256900A1 (de) 2002-11-29 2004-06-24 Nemod Immuntherapie Ag Tumorspezifische Erkennungsmoleküle
DE10303664A1 (de) 2003-01-23 2004-08-12 Nemod Immuntherapie Ag Erkennungsmoleküle zur Behandlung und Detektion von Tumoren
WO2005019258A2 (en) 2003-08-11 2005-03-03 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
US8017388B2 (en) 2003-08-18 2011-09-13 Glycotope Gmbh Tumour cell lines and uses thereof
FR2861080B1 (fr) 2003-10-20 2006-02-17 Lab Francais Du Fractionnement Anticorps presentant un taux de fucose et de galactose optimise
US20050203010A1 (en) 2003-11-14 2005-09-15 Atgen Co., Ltd. Novel peptides conferring environmental stress resistance and fusion proteins including said peptides
EP1725673A1 (en) 2004-02-13 2006-11-29 Glycotope Gmbh Sialytated glycoproteins-process conditions and an efficient method for their production
JP4904266B2 (ja) 2004-07-26 2012-03-28 ザ リサーチ ファウンデイション オブ ステイト ユニバーシティー オブ ニューヨーク 抗−ｔｆ−抗原抗体の治療的使用
US20090046556A1 (en) 2006-02-14 2009-02-19 Koninklijke Philips Electronics N.V. Bit detection for optical disc reading
WO2007124992A1 (en) 2006-04-28 2007-11-08 Unilever N.V. Method of manufacturing a cultured edible product comprising omega-3 polyunsaturated fatty acids
EP1900750A1 (en) 2006-09-18 2008-03-19 Glycotope Gmbh Fully human high yield production system for improved antibodies
BRPI0716997B8 (pt) 2006-09-10 2021-05-25 Glycotope Gmbh proteína ou composição de moléculas de proteína, métodos para produção e uso da mesma
EP1911766A1 (en) 2006-10-13 2008-04-16 Glycotope Gmbh Use of human cells of myeloid leukaemia origin for expression of antibodies
EP1920781B1 (en) 2006-11-10 2015-03-04 Glycotope GmbH Compositions comprising a core-1 positive microorganism and their use for the treatment or prophylaxis of tumors
WO2009138220A1 (en) 2008-05-13 2009-11-19 Glycotope Gmbh Fermentation process
EP2420515A4 (en) 2009-04-16 2013-08-28 Univ Tokyo DIAGNOSIS AND TREATMENT OF CANCER USING ANTI-TMPRSS11E ANTIBODY
EP2281844A1 (en) 2009-07-31 2011-02-09 Glycotope GmbH MUC 1 antibodies
EP2945964A2 (en) 2013-01-18 2015-11-25 Glycotope GmbH Fusion peptides for enhancing protein expression
JP2015138634A (ja) 2014-01-22 2015-07-30 株式会社オートネットワーク技術研究所 端子金具付き電線及びその製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP2017123879A (ja) 2017-07-20
EP2428224A2 (en) 2012-03-14
DK2428224T3 (en) 2017-03-27
EP3539981A1 (en) 2019-09-18
ES2533964T3 (es) 2015-04-16
EA017622B1 (ru) 2013-01-30
EA200970263A1 (ru) 2009-08-28
AU2007294122B2 (en) 2013-03-07
BRPI0716997A2 (pt) 2013-10-15
BRPI0716997A8 (pt) 2019-02-05
FI2073842T4 (fi) 2024-01-15
KR20150126730A (ko) 2015-11-12
JP5767779B2 (ja) 2015-08-19
PT2073842E (pt) 2015-04-07
CN103436574B (zh) 2016-08-10
EP2073842B1 (en) 2014-12-31
US20150368363A1 (en) 2015-12-24
BRPI0716997B8 (pt) 2021-05-25
EP2428223A2 (en) 2012-03-14
DK2073842T3 (da) 2015-04-13
EP2428224B1 (en) 2016-12-21
JP6166303B2 (ja) 2017-07-19
ES2620261T3 (es) 2017-06-28
KR101603632B1 (ko) 2016-03-16
IL197459A (en) 2015-08-31
JP2015146819A (ja) 2015-08-20
CA2662226C (en) 2020-08-04
AU2007294122A1 (en) 2008-03-13
JP2010502204A (ja) 2010-01-28
US20190359731A1 (en) 2019-11-28
KR20090077911A (ko) 2009-07-16
CA2662226A1 (en) 2008-03-13
CU23791A3 (es) 2012-03-15
CY1116279T1 (el) 2017-02-08
SI2073842T1 (sl) 2015-05-29
IL197459A0 (en) 2011-08-01
KR20170021375A (ko) 2017-02-27
NZ575974A (en) 2012-03-30
SG174792A1 (en) 2011-10-28
PL2073842T3 (pl) 2015-06-30
US9051356B2 (en) 2015-06-09
EP2428223A3 (en) 2012-05-16
CN103436574A (zh) 2013-12-11
HRP20150307T1 (hr) 2015-04-24
EP2073842B2 (en) 2023-10-18
EP2073842A2 (en) 2009-07-01
DK2073842T4 (da) 2024-01-15
US20100028947A1 (en) 2010-02-04
WO2008028686A2 (en) 2008-03-13
EP2428224A3 (en) 2012-05-09
RS53861B1 (en) 2015-08-31
US10280230B2 (en) 2019-05-07
ES2533964T5 (es) 2024-05-09
WO2008028686A3 (en) 2008-06-12
EP2428225A3 (en) 2012-05-09
ZA201001903B (en) 2010-11-24
EP2428225A2 (en) 2012-03-14
MX2009002388A (es) 2009-06-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BRPI0716997B1 (pt) Proteína ou composição de moléculas de proteína, métodos para produção e uso da mesma
JP5078990B2 (ja) グリコシル化抗体
EP1911766A1 (en) Use of human cells of myeloid leukaemia origin for expression of antibodies
EP1900750A1 (en) Fully human high yield production system for improved antibodies
JP2010514448A (ja) アシアリル化免疫グロブリンを生成するための方法およびベクター
US20200131275A1 (en) Multispecific antibody constructs binding to muc1 and cd3
CN101588817B (zh) 骨髓白血病来源的细胞在抗体表达中的用途
AU2013203482B2 (en) Fully human high yield production system for improved antibodies and proteins

Legal Events

Date Code Title Description
B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]
B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette]
B07E Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette]

Free format text: NOTIFICACAO DE ANUENCIA RELACIONADA COM O ART 229 DA LPI

B06T Formal requirements before examination [chapter 6.20 patent gazette]
B07A Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette]
B07A Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 10 (DEZ) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 02/06/2020, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS.

B16C Correction of notification of the grant [chapter 16.3 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 10/09/2007 OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF