JP2017060519A - 発現ベクター構成、新規の産生細胞生成法、およびポリペプチドの組換え産生のためのそれらの使用 - Google Patents

Abstract

【課題】新規のベクター構成、新規のトランスフェクション法または選択法のような産生細胞株の生成のための新規の方法、ならびに関心対象のポリペプチドの組換え産生のためのこれらの発現ベクターおよび産生細胞株の提供。【解決手段】抗体軽鎖発現カセット、抗体重鎖発現カセット、及び、選択マーカー発現カセットを含み、発現カセットが一方向に配置されており、かつ発現カセットが、5'から3'へ、抗体重鎖発現カセット、抗体軽鎖発現カセット、及び選択マーカー発現カセットの順に配置されている発現ベクター。【選択図】図９

Description

新規のベクター構成、新規のトランスフェクション法または選択法のような産生細胞株の生成のための新規の方法、ならびに関心対象のポリペプチドの組換え産生のためのこれらの発現ベクターおよび産生細胞株の使用が、本明細書に報告される。

発明の背景
遺伝子の転写レベルは、その発現レベルに対して強い影響を及ぼすことができ、従って、細胞の産生能を決定する。それは、主として、3種のベクター要素：プロモーター、ポリAシグナル配列、および（存在する場合）転写ターミネーターによって影響を受ける。

抗体重鎖をコードする核酸は、一般に、タンパク質の成熟によって除去されるリーダー配列（シグナル配列）（およそ57bp/19aa）、可変領域VH（およそ350bp/115aa）、および定常領域CH（およそ990bp/330aa）を含む。抗体軽鎖をコードする核酸は、一般に、タンパク質の成熟によって除去されるリーダー配列（およそ66bp/22aa）、可変領域VKまたはVL（およそ350bp/115aa）、および定常領域CKまたはCL（およそ321bp/107aa）から構成される。

真核細胞における抗体の組換え産生は、発現システムの作出を含む（McCafferty,J.,et al.,(eds.),Antibody Engineering,A Practical Approach.,IRL Press(1997)（非特許文献1）を参照のこと）。抗体発現システムの開発のためには、プロモーターおよびポリアデニル化（ポリA）領域が隣接した、軽鎖をコードする核酸を含む発現カセットが、作出される。プロモーターおよびポリA領域が隣接した、重鎖をコードする核酸を含む重鎖発現カセットも、作出される。重鎖の発現カセットは、重鎖発現カセットおよび軽鎖発現カセットの両方を含有している単一のベクターにおいて軽鎖発現カセットと組み合わせられてもよいし、または2種の別々のベクターに組込まれてもよい。

免疫グロブリンDNAカセット分子、モノボディ（monobody）構築物、それらの産生法および使用法は、米国特許第7,053,202号（特許文献1）に報告されている。米国特許第5,168,062号（特許文献2）には、ヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーター制御DNA配列を含有しているトランスファーベクターおよび微生物が報告されている。ヒトポリペプチド鎖伸長因子1αのためのプロモーター領域を含有しているDNA断片、その塩基配列、および高い発現能力での広範囲の宿主細胞への高い適用可能性を有する、DNA断片を含有している発現プラスミドは、米国特許第5,225,348号（特許文献3）に報告されている。米国特許第5,266,491号（特許文献4）には、SV40複製起点およびヒトポリペプチド鎖伸長因子1α遺伝子のためのプロモーター領域を有するDNA断片を含有している発現プラスミドが、報告されている。組換えDNA化合物およびtPAのようなポリペプチドの発現は、米国特許第5,122,458号（特許文献5）に報告されている。米国特許第7,422,874号（特許文献6）には、動物細胞のための発現ベクターが報告されている。

Kim,D.らは、転写終結領域を操作することによって改善された哺乳動物細胞発現システムを報告している（Biotechnol.Prog.19(2003)1620-1622（非特許文献2））。細胞mRNAの9ntセグメントが、内部リボソーム進入部位（IRES）として機能し、連結された複数のコピーの中に存在する時、IRES活性を大いに増強し得ることは、Chappell,S.A.ら（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(2000)1536-1541（非特許文献3））によって報告されている。Corish,P.およびTyler-Smith,C.は、哺乳動物細胞における緑色蛍光タンパク質半減期の減弱を報告している（Prot.Eng.12(1999)1035-1040（非特許文献4））。トランスフェクトされた哺乳動物細胞におけるエンハンサー要素の単離および分析のために設計された新規のGFPneoベクターは、Primig,M.ら（Gene 215(1998)181-189（非特許文献5））によって報告されている。Ng,S.K.らは、CHO-DG44における組換えタンパク質産生能の改善のための、選択マーカー上の不安定化配列の適用を報告している（Metabol.Eng.9(2007)304-316（非特許文献6））。

Sanna Pietro,P.は、哺乳動物細胞における抗体Fab断片および免疫グロブリン全体の発現を報告している（Meth.Mol.Biol.178(2002)389-395（非特許文献7））。B型肝炎表面抗原に対するヒト抗体の可変領域の遺伝子クローニングのための細胞ディスプレイライブラリーは、Higuchi,K.らによって報告されている（J.Immunol.Meth.202(1997)193-204（非特許文献8））。Kim,D.らは、転写終結領域を操作することによって改善された哺乳動物発現システムを報告している（Biotechnol.Progress 19(2003)1620-1622（非特許文献2））。モノクローナル抗体産生のための細胞工学についてのガイドラインは、Costa,R.A.らによって報告されている（Eur.J.Pharmaceut.Biopharmaceut.74(2010)127-138（非特許文献9））。Kim,D.W.らは、多用途の効率的な発現システムとしてヒト伸長因子1αプロモーターの使用を報告している（Gene 91(1990)217-223（非特許文献10））。イントロン依存性遺伝子発現とイントロン非依存性遺伝子発現との比較は、Buchman,A.R.らによって報告されている（Mol.Cell.Biol.8(1988)4395-4405（非特許文献11））。Wang,F.らは、哺乳動物細胞における抗体発現を報告している（Therapeutic monoclonal antibodies-From bench to clinic,Wiley(2009)pages 557-572（非特許文献12））。組換えIgG抗体の哺乳動物発現のための異なるベクター設計の比較研究は、Liらによって報告されている（J.Immunol.Meth.318(2007)113-124（非特許文献13））。Ho,S.C.L.らは、モノクローナル抗体を高発現するCHO細胞株の生成を増強するためのIRESによって媒介されるトリシストロンベクターを報告している（J.Biotechnol.157(2011)130-139（非特許文献14））。組換え動物細胞による抗CD2キメラ抗体の産生は、Hotta,A.らによって報告されている（J.Biosci.Bioeng.98(2004)298-303（非特許文献15））。Lee,J-C.らは、エンテロウイルス71内部リボソーム進入によって媒介される高効率タンパク質発現を報告している（Biotechnol.Bioeng.90(2005)656-662（非特許文献16））。WO2008/142124（特許文献7）には、Avian EBX（登録商標）細胞における組換えタンパク質産生が報告されている。

米国特許第7,053,202号 米国特許第5,168,062号 米国特許第5,225,348号 米国特許第5,266,491号 米国特許第5,122,458号 米国特許第7,422,874号 WO2008/142124

McCafferty,J.,et al.,(eds.),Antibody Engineering,A Practical Approach.,IRL Press(1997) Biotechnol.Prog.19(2003)1620-1622 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(2000)1536-1541 Prot.Eng.12(1999)1035-1040 Gene 215(1998)181-189 Metabol.Eng.9(2007)304-316 Meth.Mol.Biol.178(2002)389-395 J.Immunol.Meth.202(1997)193-204 Eur.J.Pharmaceut.Biopharmaceut.74(2010)127-138 Gene 91(1990)217-223 Mol.Cell.Biol.8(1988)4395-4405 Therapeutic monoclonal antibodies-From bench to clinic,Wiley(2009)pages 557-572 J.Immunol.Meth.318(2007)113-124 J.Biotechnol.157(2011)130-139 J.Biosci.Bioeng.98(2004)298-303 Biotechnol.Bioeng.90(2005)656-662

抗体の組換え産生のためには、軽鎖発現カセットの前への重鎖発現カセットの位置付け（HC-LC(5'-3')）が、逆の順序（LC-HC(5'-3')）と比較して良好な発現結果を提供することが見出された。さらに、両方の抗体発現カセットの後への選択マーカーの位置付け（HC-LC-SM(5'-3')）が、最初の抗体鎖の前への双方向性の位置付け（SM(3'-5')-HC-LC(5'-3')）と比較して、良好な発現結果を提供することが見出された。

安定トランスフェクションのためには、（1）抗体重鎖、（2）抗体軽鎖、および（3）選択マーカーの一列配置が最適であることが見出された。しかし、hEF1αプロモーターは、安定プールにおいてはhCMVより明白に優れているが、単一クローンレベルでは反対の効果が見られた。ここで、ヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーター／エンハンサー（hCMV）が、最も高い産生能を有するクローンを生成した。さらに、産生能および発現の安定性の両方を増加させる、bGHポリAシグナルおよびヒトガストリン遺伝子のターミネーター配列（hGT）と組み合わせることによって、その性能をさらに改善することができる。

プロモーター、構造遺伝子、およびポリAシグナル配列を各々含み、任意で、ターミネーター配列を含む、抗体重鎖のための発現カセットおよび抗体軽鎖のための発現カセットを含む発現ベクターの使用は、（1）プロモーターがヒトサイトメガロウイルスプロモーター（hCMV）であり、ポリAシグナル配列がウシ成長ホルモンポリAシグナル配列（bGHポリA）であり、かつターミネーター配列がヒトガストリン遺伝子転写ターミネーター配列（hGT）であるか、または（2）プロモーターがヒト伸長因子1αプロモーター（EF1α）であり、ポリAシグナル配列がウシ成長ホルモンポリAシグナル配列（bGHポリA）であり、かつターミネーター配列が存在しない場合、トランスフェクション後に、より多数の抗体産生／分泌細胞クローンをもたらすことが見出された。

上述のような発現ベクターを使用することによって、トランスフェクション後に、より多数の抗体産生／分泌細胞を入手することができ、従って、大規模組換え抗体産生のために適当な高産生細胞を同定するために必要とされる労力が、軽減される。

本明細書に報告される一つの局面は、
−抗体軽鎖発現カセット、
−抗体重鎖発現カセット、および
−選択マーカー発現カセット
を含み、発現カセットが一方向に配置されており、かつ
発現カセットが、5'から3'へ、抗体重鎖発現カセット、抗体軽鎖発現カセット、および選択マーカー発現カセットの順に配置されている、発現ベクターである。

一つの態様において、抗体軽鎖発現カセットおよび／または抗体重鎖発現カセットおよび／または選択マーカーカセットは、ヒト伸長因子1αプロモーター、ヒトCMVプロモーター、およびSV40プロモーターから選択されるプロモーターを相互に独立に含む。

一つの態様において、1種、2種、または3種全ての発現カセットが、ヒト伸長因子1αプロモーターを含む。一つの態様において、抗体軽鎖発現カセットおよび／または抗体重鎖発現カセットおよび／または選択マーカーカセットは、ヒト伸長因子1αプロモーターを相互に独立に含む。一つの態様において、発現カセットは、ターミネーター配列を含まない、即ち、発現カセットには、ターミネーター配列が含まれない。一つの態様において、ターミネーター配列は、ヒトガストリン遺伝子転写ターミネーター配列（hGT）である。

一つの態様において、1種、2種、または3種全ての発現カセットが、ヒトCMVプロモーターを含む。一つの態様において、抗体軽鎖発現カセットおよび／または抗体重鎖発現カセットおよび／または選択マーカーカセットは、ヒトCMVプロモーターを相互に独立に含む。

一つの態様において、1種、2種、または3種全ての発現カセットが、ウシ成長ホルモンポリAシグナル配列を含む。一つの態様において、抗体軽鎖発現カセットおよび／または抗体重鎖発現カセットおよび／または選択マーカーカセットは、ウシ成長ホルモンポリAシグナル配列を相互に独立に含む。

一つの態様において、抗体軽鎖発現カセットおよび／または抗体重鎖発現カセットおよび／または選択マーカーカセットは、ウシ成長ホルモンポリAシグナル配列およびSV40ポリAシグナル配列から選択されるポリAシグナル配列を相互に独立に含む。

一つの態様において、1種、2種、または3種全ての発現カセットが、ヒト伸長因子1αプロモーターを含まないことを条件として、ポリAシグナル配列の後にヒトガストリンターミネーター配列を含む。一つの態様において、抗体軽鎖発現カセットおよび／または抗体重鎖発現カセットおよび／または選択マーカーカセットは、ポリAシグナル配列の後にヒトガストリンターミネーター配列を相互に独立に含む。

一つの態様において、抗体軽鎖発現カセットおよび／または抗体重鎖発現カセットおよび／または選択マーカーカセットは、ヒト伸長因子1αプロモーターを含まないことを条件として、5'から3'への方向に、ウシ成長ホルモンポリAシグナル配列およびヒトガストリンターミネーター配列を相互に独立に含む。

一つの態様において、1種、2種、または3種全ての発現カセットのプロモーターが、イントロンAを含む。

一つの態様において、1種、2種、または3種全ての発現カセットが、SV40ポリAシグナル配列を含む。

一つの態様において、1種、2種、または3種全ての発現カセットが、SV40プロモーターを含む。

一つの態様において、抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸は、少なくとも1個のイントロンを含む。

一つの態様において、抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸は、cDNAである。

本明細書に報告される一つの局面は、抗体の組換え産生のための、本明細書に報告される発現ベクターの使用である。

本明細書に報告される一つの局面は、安定細胞株の生成のための、本明細書に報告される発現ベクターの使用である。

本明細書に報告される一つの局面は、産生細胞株の生成のための、本明細書に報告される発現ベクターの使用である。

本明細書に報告される一つの局面は、安定細胞株の生成のための、ヒト伸長因子1αプロモーターを含む少なくとも1種の発現カセットを含む本明細書に報告される発現ベクターの使用である。

本明細書に報告される一つの局面は、産生細胞株の生成のための、ヒト伸長因子1αプロモーターを含む少なくとも1種の発現カセットを含む本明細書に報告される発現ベクターの使用である。

本明細書に報告される一つの局面は、抗体の組換え産生のための、ヒト伸長因子1αプロモーターを含む少なくとも1種の発現カセットを含む本明細書に報告される発現ベクターの使用である。

本明細書に報告される一つの局面は、産生細胞株の生成のための、ヒトCMVプロモーターを含む少なくとも1種の発現カセットを含む本明細書に報告される発現ベクターの使用である。

本明細書に報告される一つの局面は、安定細胞株の生成のための、ヒトCMVプロモーターを含む少なくとも1種の発現カセットを含む本明細書に報告される発現ベクターの使用である。

本明細書に報告される一つの局面は、抗体の産生のための、ヒトCMVプロモーターを含む少なくとも1種の発現カセットを含む本明細書に報告される発現ベクターの使用である。

本明細書に報告される一つの局面は、発現ベクターが、原核生物複製起点における切断によって、トランスフェクションの前に直鎖化されることを特徴とする、発現ベクターによる真核細胞のトランスフェクションの方法である。

一つの態様において、原核生物複製起点は、一つの抗体軽鎖発現カセットと一つの抗体重鎖発現カセットとの間にある。

本明細書に報告される一つの局面は、抗体の組換え産生のための真核細胞の生成のための、本明細書に報告される方法の使用である。

本明細書に報告される一つの局面は、トランスフェクションの約24時間後に初めて培養培地へ選択剤が添加されることを特徴とする、抗体をコードする核酸を含む真核細胞の選択の方法である。

本明細書に報告される一つの局面は、抗体の組換え産生のための真核細胞の生成のための、本明細書に報告される方法の使用である。

本明細書に報告される一つの局面は、抗体の組換え産生のための、本明細書に報告される方法によって選択された細胞の使用である。

本明細書に報告される一つの局面は、以下の工程を含む、抗体の産生の方法である：
−本明細書に報告される発現ベクターを含む真核細胞を培養する工程、および
−細胞または培養培地から抗体を回収する工程。

本明細書に報告される一つの局面は、以下の工程を含む、抗体の産生の方法である：
−原核生物複製起点における切断によってトランスフェクションの前に直鎖化された発現ベクターによるトランスフェクションによって入手された真核細胞を培養する工程、および
−細胞または培養培地から抗体を回収する工程。

本明細書に報告される一つの局面は、以下の工程を含む、抗体の産生の方法である：
−トランスフェクションの約24時間後の培養物への選択剤の添加によって選択された真核細胞を培養する工程、および
−細胞または培養培地から抗体を回収する工程。

本明細書に報告される一つの局面は、原核生物核酸配列が、発現ベクターによる真核細胞のトランスフェクションの前に発現ベクターから除去されることを特徴とする、原核生物核酸配列および真核生物核酸配列を含む発現ベクターによる真核細胞のトランスフェクションの方法である。

本明細書に報告される一つの局面は、真核細胞のトランスフェクションのための、原核生物核酸配列を含まない直鎖化された発現ベクターの使用である。

本明細書に報告される一つの局面は、抗体の組換え産生のための真核細胞の生成のための、真核生物核酸配列のみを含む発現ベクターの使用である。

本明細書に報告される全ての局面の一つの態様において、抗体は二特異性抗体である。

一つの態様において、二特異性抗体は、第一の抗原または抗原上の第一のエピトープに特異的に結合する第一の結合特異性または結合部位を有し、かつ第二の抗原または抗原上の第二のエピトープに特異的に結合する第二の結合特異性または結合部位を有する。

一つの態様において、発現ベクターは、
−5'から3'への方向に、プロモーター、第一の抗体軽鎖をコードする核酸、ポリAシグナル配列を含み、任意で、ターミネーター配列を含む第一の発現カセット、
−5'から3'への方向に、プロモーター、第二の抗体軽鎖をコードする核酸、ポリAシグナル配列を含み、任意で、ターミネーター配列を含む第二の発現カセット、
−5'から3'への方向に、プロモーター、第一の抗体重鎖をコードする核酸、ポリAシグナル配列を含み、任意で、ターミネーター配列を含む第三の発現カセット、
−5'から3'への方向に、プロモーター、第二の抗体重鎖をコードする核酸、ポリAシグナル配列を含み、任意で、ターミネーター配列を含む第四の発現カセット
または
−5'から3'への方向に、プロモーター、抗体軽鎖をコードする核酸、ポリAシグナル配列を含み、任意で、ターミネーター配列を含む第一の発現カセット、ここで、抗体軽鎖が両方の抗体重鎖に共通の軽鎖である、第一の発現カセット
−5'から3'への方向に、プロモーター、第一の抗体重鎖をコードする核酸、ポリAシグナル配列を含み、任意で、ターミネーター配列を含む第二の発現カセット、および
−5'から3'への方向に、プロモーター、第二の抗体重鎖をコードする核酸、ポリAシグナル配列を含み、任意で、ターミネーター配列を含む第三の発現カセット
のいずれかを含む。

本明細書に報告される全ての局面の一つの態様において、発現ベクターは、
−抗体軽鎖発現カセット、
−第一の抗体重鎖発現カセット、
−第二の抗体重鎖発現カセット、および
−選択マーカー発現カセット
を含み、抗体重鎖発現カセットの少なくとも一方、抗体軽鎖発現カセット、および選択マーカー発現カセットが、一方向に配置されており、
一方向の発現カセットが、5'から3'へ、抗体重鎖発現カセット、抗体軽鎖発現カセット、および選択マーカー発現カセットの順に配置されている。

本明細書に報告される全ての局面の一つの態様において、発現ベクターは、
−第一の抗体軽鎖発現カセット、
−第二の抗体軽鎖発現カセット、
−第一の抗体重鎖発現カセット、
−第二の抗体重鎖発現カセット、および
−選択マーカー発現カセット
を含み、抗体重鎖発現カセットの少なくとも一方、抗体軽鎖発現カセットの少なくとも一方、および選択マーカー発現カセットが、一方向に配置されており、
一方向の発現カセットが、5'から3'へ、抗体重鎖発現カセット、抗体軽鎖発現カセット、および選択マーカー発現カセットの順に配置されている。

一つの態様において、抗体重鎖発現カセットの一方は、ホール変異を含む抗体重鎖をコードする。

一つの態様において、抗体重鎖発現カセットの一方は、ノブ変異を含む抗体重鎖をコードする。

一つの態様において、抗体軽鎖発現カセットの一方は、抗体軽鎖可変ドメインおよび定常ドメインとしての抗体重鎖CH1ドメインを含む抗体軽鎖をコードし、かつ／または抗体軽鎖発現カセットの一方は、抗体軽鎖可変ドメインおよび定常ドメインとしての抗体軽鎖CLドメインを含む抗体軽鎖をコードする。

一つの態様において、抗体重鎖発現カセットの一方は、第一定常ドメインとして抗体軽鎖定常ドメイン（CL）を含む抗体重鎖をコードし、かつ／または抗体重鎖発現カセットの一方は、第一定常ドメインとして抗体重鎖CH1ドメインを含む抗体重鎖をコードする。

一つの態様において、hCMVプロモーターは、SEQ ID NO:01の配列を有する。これは、イントロンAを含まず5'UTRを含まないhCMVプロモーターである。

一つの態様において、hCMVプロモーターは、SEQ ID NO:02の配列を有する。これは、イントロンAを含まず5'UTRを含むhCMVプロモーターである。

一つの態様において、hCMVプロモーターは、SEQ ID NO:03の配列を有する。これは、イントロンAを含む全長hCMVプロモーターである。

一つの態様において、ヒト伸長因子1αプロモーターは、SEQ ID NO:04の配列を有する。これは、イントロンAを含まないhEF1αプロモーターである。

一つの態様において、ヒト伸長因子1αプロモーターは、SEQ ID NO:05の配列を有する。これは、イントロンAを含むhEF1αプロモーターである。

一つの態様において、ヒト伸長因子1αプロモーターは、SEQ ID NO:06の配列を有する。これは、イントロンAを含み5'UTRを含む短いhEF1αプロモーターである。

一つの態様において、ラットCMVプロモーターは、SEQ ID NO:07の配列を有する。

一つの態様において、SV40ポリAシグナル配列は、SEQ ID NO:08の配列を有する。

一つの態様において、ウシ成長ホルモンポリAシグナル配列は、配列SEQ ID NO:09を有する。

一つの態様において、ヒトガストリンターミネーターは、SEQ ID NO:10の配列を有する。

一つの態様において、SV40プロモーターは、SEQ ID NO:11の配列を有する。

一つの態様において、オルニチンデカルボキシラーゼのPEST配列は、SEQ ID NO:12の配列によってコードされる。

一つの態様において、GFP配列は、SEQ ID NO:13の配列によってコードされる。

一つの態様において、ネオマイシン選択マーカーは、SEQ ID NO:14の配列を有する。

一つの態様において、GFP-PEST-NEO融合ポリペプチドは、SEQ ID NO:15の配列によってコードされる。

一つの態様において、EMCV-IRESは、SEQ ID NO:16の配列を有する。

一つの態様において、EV71-IRESは、SEQ ID NO:17の配列を有する。

発明の詳細な説明
I. 一般的な局面
当業者に公知であるように、組換えDNAテクノロジーの使用は、核酸および／またはポリペプチドの多数の誘導体の産生を可能にする。そのような誘導体は、例えば、置換、変更、交換、欠失、または挿入によって1個または数個の位置において改変されていてよい。改変または誘導体化は、例えば、部位特異的変異誘発によって実施され得る。そのような改変は、当業者によって容易に実施され得る（例えば、Sambrook,J.,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,USA(1999)を参照のこと）。組換えテクノロジーの使用によって、当業者は、様々な宿主細胞を異種核酸によって形質転換することが可能となる。異なる細胞の転写および翻訳、即ち、発現の機構は、同一の要素を使用するが、異なる種に属する細胞は、とりわけ、異なるいわゆるコドン使用頻度を有する場合がある。それによって、（アミノ酸配列に関して）同一のポリペプチドが、異なる核酸によってコードされ得る。また、遺伝暗号の縮重によって、異なる核酸が同一のポリペプチドをコードし得る。

組換えDNAテクノロジーの使用は、核酸および／またはポリペプチドの多数の誘導体の産生を可能にする。そのような誘導体は、例えば、置換、変更、交換、欠失、または挿入によって1個または数個の位置において改変されていてよい。改変または誘導体化は、例えば、部位特異的変異誘発によって実施され得る。そのような改変は、当業者によって容易に実施され得る（例えば、Sambrook,J.,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,USA(1999)；Hames,B.D.and Higgins,S.J.,Nucleic acid hybridization-a practical approach,IRL Press,Oxford,England(1985)を参照のこと）。

組換えテクノロジーの使用によって、様々な宿主細胞の異種核酸による形質転換が可能となる。異なる細胞の転写および翻訳、即ち、発現の機構は、同一の要素を使用するが、異なる種に属する細胞は、とりわけ、異なるいわゆるコドン使用頻度を有する場合がある。それによって、（アミノ酸配列に関して）同一のポリペプチドが、異なる核酸によってコードされ得る。また、遺伝暗号の縮重によって、異なる核酸が同一のポリペプチドをコードし得る。

定義
「親和性成熟」抗体とは、そのような変更を保有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす、1個以上の超可変領域（HVR）における1個以上の変更を有する抗体をさす。

「抗体」という用語は、本明細書において、最も広義に使用され、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば、二特異性抗体）、および抗体断片を含むが、これらに限定されない、様々な抗体構造を包含する。

「抗体断片」とは、完全抗体が結合する抗原に結合する完全抗体の一部分を含む、完全抗体以外の分子をさす。抗体断片の例には、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')₂；ダイアボディ（diabodies）；直鎖抗体；単鎖抗体分子（例えば、scFv）；および抗体断片から形成された多特異性抗体が含まれるが、これらに限定されない。

「キメラ」抗体という用語は、重鎖および／または軽鎖の一部分が特定の起源または種に由来し、重鎖および／または軽鎖の残りの部分が異なる起源または種に由来する抗体をさす。

抗体の「クラス」とは、その重鎖が保有している定常ドメインまたは定常領域の型をさす。抗体の五つの主要なクラス：IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMが存在し、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ)、例えば、IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁、およびIgA₂へさらに分類され得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。

「発現」という用語は、本明細書において使用されるように、細胞内で起こる転写および／または翻訳の過程をさす。細胞における関心対象の核酸配列の転写のレベルは、細胞に存在する対応するmRNAの量に基づき決定され得る。例えば、関心対象の配列から転写されたmRNAを、RT-PCRまたはノーザンハイブリダイゼーションによって定量化することができる（Sambrook et al.,1999（前記）を参照のこと）。関心対象の核酸によってコードされたポリペプチドは、様々な方法によって、例えば、ELISAによって、ポリペプチドの生物学的活性をアッセイすることによって、またはポリペプチドを認識し結合する免疫グロブリンを使用したウエスタンブロットもしくはラジオイムノアッセイのような、そのような活性に依存しないアッセイを利用することによって定量化され得る（Sambrook et al.,1999（前記）を参照のこと）。

「発現カセット」とは、少なくとも細胞に含有されている核酸の発現のために必要な、プロモーターおよびポリアデニル化部位のような制御要素を含有している構築物をさす。

「発現ベクター」とは、宿主細胞に含まれる構造遺伝子の発現のために必要とされる全ての要素を提供する核酸である。典型的には、発現プラスミドは、複製起点を含む原核生物プラスミド繁殖単位、例えば、大腸菌（E.coli）のもの、ならびに選択可能マーカー、真核生物選択マーカー、ならびにプロモーター、構造遺伝子、およびポリアデニル化シグナルを含む転写ターミネーターを各々含む関心対象の構造遺伝子の発現のための1個以上の発現カセットを含む。遺伝子発現は、一般的には、プロモーターの調節下に置かれ、そのような構造遺伝子はプロモーターに「機能的に連結」されていると言われる。同様に、制御要素がコアプロモーターの活性をモジュレートする場合、それらの制御要素およびコアプロモーターは機能的に連結されている。

「Fc領域」という用語は、本明細書において、定常領域の少なくとも一部分を含有している免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために使用される。その用語には、ネイティブ配列Fc領域およびバリアントFc領域が含まれる。一つの態様において、ヒトIgG重鎖Fc領域は、重鎖のCys226またはPro230からカルボキシル末端にまで及ぶ。しかしながら、Fc領域のC末端リジン（Lys447）は、存在してもよいしまたは存在しなくてもよい。本明細書中に他に特記されない限り、Fc領域または定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Kabat,E.A.,et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91-3242に記載されているような、EUインデックスと呼ばれるEU番号付けシステムに従う。

「Fc領域」とは、周知の用語であり、抗体重鎖のパパイン切断に基づき定義される。本明細書に報告される複合体は、一つの態様において、抗体重鎖ヒンジ領域ポリペプチドとして、ヒトFc領域またはヒト起源に由来するFc領域を含み得る。さらなる態様において、Fc領域は、サブクラスIgG4のヒト抗体のFc領域、またはFcγ受容体（例えば、FcγRIIIa)結合および／もしくはC1q結合が検出され得ないよう改変されたサブクラスIgG1、IgG2、もしくはIgG3のヒト抗体のFc領域のいずれかである。一つの態様において、Fc領域は、ヒトFc領域であり、特に、ヒトIgG4サブクラスに由来するか、またはヒトIgG1サブクラスに由来する変異型Fc領域のいずれかである。一つの態様において、Fc領域は、変異L234AおよびL235Aを有するヒトIgG1サブクラスに由来する。IgG4は、低下したFcγ受容体（FcγRIIIa）結合を示し、その他のIgGサブクラスの抗体は、強い結合を示す。しかしながら、Pro238、Asp265、Asp270、Asn297（Fc炭水化物の欠損）、Pro329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434、または／およびHis435は、変更された場合、低下したFcγ受容体結合を提供する残基である（Shields,R.L.,et al.,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604；Lund,J.,et al.,FASEB J.9(1995)115-119；Morgan,A.,et al.,Immunology 86(1995)319-324；EP 0 307 434）。一つの態様において、本明細書に報告される局面において、発現される抗体は、Fcγ受容体結合に関して、IgG4サブクラスのものであるか、またはL234、L235、および／もしくはD265に変異を有するIgG1サブクラスもしくはIgG2サブクラスのものであり、かつ／またはPVA236変異を含有する。一つの態様において、変異は、S228P、L234A、L235A、L235E、および／またはPVA236（PVA236とは、IgG1のアミノ酸位置233〜236からのアミノ酸配列ELLG（1文字アミノ酸コードで与えられる）もしくはIgG4のEFLGが、PVAに置換されていることを意味する）である。一つの態様において、変異は、IgG4のS228P、ならびにIgG1のL234AおよびL235Aである。抗体のFc領域は、ADCC（抗体依存性細胞傷害）およびCDC（補体依存性細胞傷害）に直接関与する。Fcγ受容体および／または補体因子C1qに結合しない複合体は、抗体依存細胞傷害（ADCC）および／または補体依存性細胞傷害（CDC）を誘発しない。ノブ改変とは、抗体のCH3ドメインにおける変異T366Wを意味する（Kabatによる番号付け）。ホール改変とは、抗体のCH3ドメインにおける変異T366S、L368A、およびY407Vを意味する。ノブ改変およびホール改変に加えて、一方のCH3ドメインに変異S354Cが存在し、かつ他方のCH3ドメインに変異Y349Cが存在してもよい。

「フレームワーク」または「FR」とは、超可変領域（HVR）残基以外の可変ドメイン残基をさす。可変ドメインのFRは、一般に、4個のFRドメイン：FR1、FR2、FR3、およびFR4からなる。従って、VH（またはVL）において、HVRおよびFRの配列は、一般に、以下の順に現われる：FR1-H1（L1）-FR2-H2（L2）-FR3-H3（L3）-FR4。

「全長抗体」、「完全抗体」、および「抗体全体」という用語は、ネイティブ抗体構造に実質的に類似している構造を有するか、または本明細書において定義されるFc領域を含有している重鎖を有する抗体をさすため、本明細書において交換可能に使用される。

「遺伝子」とは、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の発現に影響することができるセグメント、例えば、染色体上またはプラスミド上のセグメントである核酸を意味する。コード領域、即ち、構造遺伝子に加えて、遺伝子は、その他の機能要素、例えば、シグナル配列、プロモーター、イントロン、および／またはターミネーターを含む。

「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」という用語は、交換可能に使用され、外来性の核酸が導入された細胞（そのような細胞の子孫を含む）をさす。宿主細胞には、「形質転換体」および「形質転換細胞」が含まれ、それらには、初代形質転換細胞、および継代回数に関わらないそれに由来する子孫が含まれる。子孫は、親細胞と核酸含量が完全に同一でなくてもよく、変異を含有していてもよい。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされたかまたは選択されたのと同一の機能または生物学的活性を有する変異体子孫が、本明細書に含まれる。

「ヒト抗体」とは、ヒトもしくはヒト細胞によって産生された抗体、またはヒト抗体レパートリーもしくはその他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト起源に由来する抗体のものに相当するアミノ酸配列を保有するものである。非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体は、ヒト抗体のこの定義から特に除外される。

「ヒト化」抗体とは、非ヒトHVRに由来するアミノ酸残基とヒトFRに由来するアミノ酸残基とを含むキメラ抗体をさす。ある種の態様において、ヒト化抗体は、HVR（例えば、CDR)の全部または実質的に全部が非ヒト抗体のものに相当し、FRの全部または実質的に全部がヒト抗体のものに相当する、少なくとも1個、典型的には、2個の可変ドメインの実質的に全部を含むであろう。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含んでいてもよい。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化型」とは、ヒト化を受けた抗体をさす。

「超可変領域」または「HVR」という用語は、本明細書において使用されるように、配列が超可変性であり、かつ／または構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの領域の各々をさす。一般に、ネイティブの4本鎖抗体は、6個のHVR；VH内の3個（H1、H2、H3）およびVL内の3個（L1、L2、L3)を含む。HVRは、一般に、最も高い配列可変性を有しかつ／または抗原認識に関与している、超可変ループおよび／または「相補性決定領域」（CDR)に由来するアミノ酸残基を含む。例示的な超可変ループは、アミノ酸残基26〜32（L1）、50〜52（L2）、91〜96（L3）、26〜32（H1）、53〜55（H2）、および96〜101（H3）に存在する（Chothia,C.and Lesk,A.M.,J.Mol.Biol.196(1987)901-917）。例示的なCDR（CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3）は、L1のアミノ酸残基24〜34、L2の50〜56、L3の89〜97、H1の31〜35B、H2の50〜65、およびH3の95〜102に存在する（Kabat,E.A.,et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91-3242）。VH内のCDR1を例外として、CDRは、一般に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。CDRは、抗原と接触する残基である「特異性決定残基」または「SDR」も含む。SDRは、短縮型（abbreviated）CDRまたはa-CDRと呼ばれるCDRの領域に含有されている。例示的なa-CDR（a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2、およびa-CDR-H3）は、L1のアミノ酸残基31〜34、L2の50〜55、L3の89〜96、H1の31〜35B、H2の50〜58、およびH3の95〜102に存在する（Almagro,J.C.and Fransson,J.,Front.Biosci.13(2008)1619-1633）。他に示されない限り、可変ドメイン内のHVR残基およびその他の残基（例えば、FR残基）は、本明細書において、Kabat et al.（前記）に従い、番号付けされる。

「内部リボソーム進入部位」または「IRES」とは、IRESの5'の遺伝子とは無関係の翻訳開始を機能的に促進し、動物細胞において単一の転写物から2個のシストロン（オープンリーディングフレーム）が翻訳されることを可能にする配列を表す。IRESは、その直ぐ下流（下流とは3'と交換可能に本明細書において使用される）のオープンリーディングフレームの翻訳のための独立のリボソーム進入部位を提供する。多シストロン性であり得る、即ち、mRNAから逐次的に翻訳される数種の異なるポリペプチドをコードし得る細菌mRNAと異なり、動物細胞の大部分のmRNAは、単シストロン性であり、1種のタンパク質の合成のみをコードする。真核細胞における多シストロン性転写物では、翻訳が、最も5'の翻訳開始部位から開始し、最初の終止コドンで終結し、転写物がリボソームから放出され、mRNA内に最初にコードされたポリペプチドの翻訳のみがもたらされるであろう。真核細胞において、転写物内の第二のまたはそれ以降のオープンリーディングフレームに機能的に連結されたIRESを有する多シストロン性転写物は、同一の転写物によってコードされた2種以上のポリペプチドを産生するため、下流のオープンリーディングフレームの逐次的な翻訳を可能にする。ベクター構築におけるIRES要素の使用は、以前に記載されており、例えば、Pelletier,J.,et al.,Nature 334(1988)320-325；Jang,S.K.,et al.,J.Virol.63(1989)1651-1660；Davies,M.V.,et al.,J.Virol.66(1992)1924-1932；Adam,M.A.,et al.,J.Virol.65(1991)4985-4990；Morgan,R.A.,et al.Nucl.Acids Res.20(1992)1293-1299；Sugimoto,Y,et al.,Biotechnology 12(1994)694-698；Ramesh,N.,et al.,Nucl.Acids Res.24(1996)2697-2700；およびMosser,D.D.,et al.,BioTechniques 22(1997)150-152)を参照のこと。

「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書において使用されるように、実質的に均質の抗体の集団から入手される抗体をさし、即ち、例えば、天然に存在する変異を含有しているか、またはモノクローナル抗体調製物の産生の間に発生する、可能性のあるバリアント抗体（そのようなバリアントは一般に微量に存在する）を除き、集団を構成する個々の抗体が、同一でありかつ／または同一のエピトープに結合する。典型的には、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。従って、「モノクローナル」という修飾語は、抗体の実質的に均質の集団から入手されるような抗体の形質を示し、特定の方法による抗体の産生を必要とするものと解釈されてはならない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含有しているトランスジェニック動物を利用する方法、ならびに本明細書に記載されるモノクローナル抗体を作成するためのそのような方法およびその他の例示的な方法を含むが、これらに限定されない、多様な技術によって作成され得る。

「核酸」とは、本明細書において使用されるように、個々の（塩基とも呼ばれる）ヌクレオチドa、c、g、およびt（またはRNAにおいてはu）からなる重合体分子、例えば、DNA、RNA、またはそれらの改変体をさす。このポリヌクレオチド分子は、天然に存在するポリヌクレオチド分子、または合成ポリヌクレオチド分子、または1種以上の天然に存在するポリヌクレオチド分子と1種以上の合成ポリヌクレオチド分子との組み合わせであり得る。1個以上のヌクレオチドが（例えば、変異誘発によって）変化しているか、欠失しているか、または付加されている天然に存在するポリヌクレオチド分子も、この定義に包含される。核酸は、単離されていてもよいし、またはもう一つの核酸、例えば、発現カセット、プラスミド、もしくは宿主細胞の染色体に組込まれていてもよい。核酸は、個々のヌクレオチドからなるその核酸配列によっても同様に特徴決定される。

アミノ酸配列、例えば、ポリペプチドのアミノ酸配列を、このアミノ酸配列をコードする対応する核酸配列へ変換する手法および方法は、当業者に周知である。従って、核酸は、個々のヌクレオチドからなるその核酸配列によって特徴決定され、それによってコードされたポリペプチドのアミノ酸配列によっても同様に特徴決定される。

「核酸」とは、本明細書において使用されるように、組換え産生され得る、ポリペプチドをコードする、天然に存在するかまたは部分的にもしくは完全に天然には存在しない核酸もさす。核酸は、単離されたまたは化学的手段によって合成されたDNA断片から構築されてもよい。核酸は、もう一つの核酸、例えば、発現プラスミドまたは真核宿主細胞のゲノム／染色体へ組込まれていてもよい。プラスミドには、シャトルプラスミドおよび発現プラスミドが含まれる。典型的には、プラスミドは、複製起点（例えば、ColE1複製起点）を含む原核生物繁殖単位、ならびに原核生物におけるプラスミドの複製および選択のためのそれぞれの選択可能マーカー（例えば、アンピシリン耐性遺伝子またはテトラサイクリン耐性遺伝子）を含むであろう。

「機能的に連結された」とは、そのように記載された成分が、意図された様式で機能することを可能にする関係にある、2種以上の成分の並置をさす。例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサーは、連結された配列の転写を調節するかまたはモジュレートするためにシスに作用する場合、コード配列に機能的に連結されている。必ずしもそうではないが、一般に、「機能的に連結された」DNA配列は、連続しており、分泌リーダーおよびポリペプチドのような2種のタンパク質をコードする領域を接合する必要がある場合には、連続しかつ（リーディング）フレーム内にある。しかしながら、機能的に連結されたプロモーターは、一般に、コード配列の上流に位置するが、必ずしも連続していない。エンハンサーは連続している必要はない。エンハンサーは、コード配列の転写を増加させる場合、コード配列に機能的に連結されている。機能的に連結されたエンハンサーは、コード配列の上流、内部、または下流に位置していてよく、プロモーターから相当の距離に位置していてもよい。ポリアデニル化部位は、転写がコード配列を通りポリアデニル化配列へ進むよう、コード配列の下流末端に位置している場合、コード配列に機能的に連結されている。翻訳終止コドンは、翻訳がコード配列を通り終止コドンへ進み、そこで終結するよう、コード配列の下流末端（3'末端）に位置している場合、エクソン核酸配列に機能的に連結されている。連結は、当技術分野において公知の組換え法によって、例えば、PCR方法論を使用して、かつ／または便利な制限部位でのライゲーションによって達成される。便利な制限部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが慣習的な実務に従い使用される。

「多シストロン性転写単位」とは、複数の構造遺伝子が同一プロモーターの調節下にある転写単位である。

「ポリアデニル化シグナル」（ポリAシグナル）という用語は、本願において使用されるように、特定の核酸配列セグメントの一次転写物の切断およびポリアデニル化を誘導するために使用される核酸配列を意味する。ポリアデニル化シグナルを含む3'非翻訳領域は、SV40、ウシ成長ホルモン（bGH）のための遺伝子、免疫グロブリン遺伝子、およびチミジンキナーゼ遺伝子（tk、例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼポリアデニル化シグナル）に由来するポリアデニル化シグナルを含む3'非翻訳領域からなる群より選択され得る。

「プロモーター」とは、それが機能的に連結された遺伝子／構造遺伝子または核酸配列の転写を調節するポリヌクレオチド配列をさす。プロモーターは、RNAポリメラーゼ結合および転写開始のためのシグナルを含む。使用されるプロモーターは、選択された配列の発現が企図される宿主細胞の細胞型において機能性のものであろう。多様な異なる起源に由来する構成型プロモーター、誘導型プロモーター、および抑制型プロモーターを含む、多数のプロモーターが、当技術分野において周知であり（GenBankのようなデータベースにおいて同定されており）、（例えば、ATCCのような寄託機関およびその他の商業的なまたは個人的な起源から）クローニングされたポリヌクレオチドとして、またはクローニングされたポリヌクレオチドの中に入手可能である。

「プロモーター」は、構造遺伝子の転写を指図するヌクレオチド配列を含む。典型的には、プロモーターは、構造遺伝子の転写開始部位の近位の、遺伝子の5'非コード領域または非翻訳領域に位置している。転写の開始において機能するプロモーター内の配列要素は、しばしば、コンセンサスヌクレオチド配列によって特徴決定される。これらのプロモーター要素には、RNAポリメラーゼ結合部位、TATA配列、CAAT配列、分化特異的要素（DSE；McGehee,R.E.,et al.,Mol.Endocrinol.7(1993)551）、サイクリックAMP応答要素（CRE）、血清応答要素（SRE；Treisman,R.,Seminars in Cancer Biol.1(1990)47）、グルココルチコイド応答要素（GRE）、ならびにCRE/ATF（O'Reilly,M.A.,et al.,J.Biol.Chem.267(1992)19938）、AP2（Ye,J.,et al.,J.Biol.Chem.269(1994)25728）、SP1、cAMP応答要素結合タンパク質（CREB；Loeken,M.R.,Gene Expr.3(1993)253）、およびオクタマー因子（一般に、Watson,et al.,(eds.),Molecular Biology of the Gene,4th ed.(The Benjamin/Cummings Publishing Company,Inc.(1987))およびLemaigre,F.P.and Rousseau,G.G.,Biochem.J.303(1994)1-14を参照のこと）のようなその他の転写因子のための結合部位が含まれる。プロモーターが誘導型プロモーターである場合、転写の速度は、誘導剤に応答して増加する。対照的に、プロモーターが構成型プロモーターである場合、転写の速度は、誘導剤によって制御されない。抑制型プロモーターも公知である。例えば、c-fosプロモーターは、細胞表面上の受容体に成長ホルモンが結合することによって特異的に活性化される。テトラサイクリン（tet）によって制御される発現は、例えば、CMVプロモーターとそれに続く2個のTetオペレーター部位からなる人工ハイブリッドプロモーターによって達成され得る。Tetリプレッサーが、2個のTetオペレーター部位に結合し、転写を阻止する。誘導剤テトラサイクリンが添加されると、TetリプレッサーがTetオペレーター部位から放出され、転写が進む（Gossen,M.and Bujard,H.,PNAS 89(1992)5547-5551）。メタロチオネインおよび熱ショックプロモーターを含むその他の誘導型プロモーターについては、例えば、Sambrook et al.（前記）およびGossen et al.,Curr.Opin.Biotech.5(1994)516-520を参照のこと。高レベル発現のための強力なプロモーターとして同定されている真核生物プロモーターには、SV40初期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、マウスメタロチオネインIプロモーター、ラウス肉腫ウイルス末端反復配列、チャイニーズハムスター伸長因子1α（CHEF-1、例えば、米国特許第5,888,809号を参照のこと）、ヒトEF-1α、ユビキチン、およびヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーター（CMV IE）が含まれる。

「プロモーター」は、構成型または誘導型であり得る。エンハンサー（即ち、転写を増加させるためにプロモーターに作用するシス作用性のDNA要素）は、プロモーター単独によって入手される発現のレベルを増加させるためプロモーターと共に機能するよう必要であり得、転写制御要素として含まれ得る。しばしば、プロモーターを含有するポリヌクレオチドセグメントは、エンハンサー配列（例えば、CMVまたはSV40）も含むであろう。

「安定的に形質転換された」、「安定トランスフェクトされた」、または「安定」という用語は、本願において使用されるように、宿主細胞ゲノム／染色体への外来性の核酸の遺伝可能な安定的な組込みを意味する。安定トランスフェクトされた細胞は、選択培養条件の下で、即ち、1種以上の選択マーカーの存在下で、細胞選択過程の後に入手される。

「構造遺伝子」とは、シグナル配列を含まない遺伝子の領域、即ち、コード領域を意味する。

「転写ターミネーター」という用語は、mRNA合成の終結のためのシグナルをRNAポリメラーゼに与える、50〜750塩基対長のDNA配列を意味する。特に、強力なプロモーターを使用する時には、RNAポリメラーゼのリードスルーを防止するため、発現カセットの3'末端に、極めて効率的な（強力な）ターミネーターが存在することが望ましい。非効率的な転写ターミネーターは、不要な、例えば、プラスミドによってコードされた遺伝子の発現の理由となり得るオペロン様mRNAの形成をもたらす場合がある。

本発明の範囲内で、当技術分野において公知の実質的に任意の種類のトランスフェクション法によって、トランスフェクトされた細胞を入手することができる。例えば、電気穿孔または微量注入によって、核酸を細胞へ導入することができる。あるいは、FuGENE 6（Roche Diagnostics GmbH,Germany）、X-tremeGENE（Roche Diagnostics GmbH,Germany）、およびLipofectAmine（Invitrogen Corp.,USA）のようなリポフェクション試薬を使用してもよい。あるいは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスに基づく適切なウイルスベクターシステムによって、核酸を細胞へ導入することもできる（Singer,O.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(2004)5313-5314）。

「一過性トランスフェクション」という用語は、本願において使用されるように、細胞へ導入された核酸が、その細胞のゲノムまたは染色体DNAへ組込まれない過程を示す。それは、実際、染色体外要素として、例えば、エピソームとして、細胞内に維持される。エピソームの核酸の転写過程は影響を受けず、例えば、エピソームの核酸によってコードされたタンパク質が産生される。一過性トランスフェクションは「一過性トランスフェクトされた」細胞をもたらす。

「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体の抗原への結合に関与する、抗体の重鎖または軽鎖のドメインをさす。ネイティブ抗体の重鎖および軽鎖（それぞれVHおよびVL）の可変ドメインは、一般に、類似した構造を有し、各ドメインが、4個の保存されたフレームワーク領域（FR）および3個の超可変領域（HVR）を含む（例えば、Kindt,T.J.,et al.,Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,N.Y.(2007),page 91を参照のこと）。単一のVHドメインまたはVLドメインが、抗原結合特異性を付与するのに十分である場合もある。さらに、相補的なVLドメインまたはVHドメインのライブラリーをスクリーニングするため、それぞれ、抗原に結合する抗体に由来するVHドメインまたはVLドメインを使用して、特定の抗原に結合する抗体を単離することができる（例えば、Portolano,S.,et al.,J.Immunol.150(1993)880-887；Clackson,T.,et al.,Nature 352(1991)624-628を参照のこと）。

「ベクター」という用語は、本明細書において使用されるように、それが連結されたもう一つの核酸を繁殖させることができる核酸分子をさす。その用語には、自己複製性核酸構造としてのベクターも含まれるし、導入された宿主細胞のゲノムに取り込まれたベクターも含まれる。ある種のベクターは、機能的に連結された核酸の発現を指図することができる。そのようなベクターは、本明細書において、「発現ベクター」と呼ばれる。

抗体
本明細書において提供される方法および組成物は、組換えモノクローナル抗体の産生のためのものである。抗体は、以下に限定されないが、単特異性抗体、多特異性抗体（例えば、二特異性抗体）、抗体断片、一価抗体、多価抗体（例えば、二価抗体）のような様々な構造のものであり得る。

ある種の態様において、抗体は抗体断片である。抗体断片には、Fab断片、Fab'断片、Fab'-SH断片、F(ab')₂断片、Fv断片、およびscFv断片、ならびに下記のその他の断片が含まれるが、これらに限定されない。ある種の抗体断片の概説については、Hudson,P.J.,et al.,Nat.Med.9(2003)129-134を参照のこと。scFv断片の概説については、例えば、Plueckthun,A.,In:The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,Vol.113,Rosenburg and Moore(eds.),Springer-Verlag,New York(1994),pp.269-315を参照し；WO 1993/16185；ならびに米国特許第5,571,894号および米国特許第5,587,458号も参照すること。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、増加したインビボ半減期を有するFab断片およびF(ab')₂断片の考察については、米国特許第5,869,046号を参照のこと。

ダイアボディとは、二価または二特異性であり得る、2個の抗原結合部位を有する抗体断片である（例えば、EP 0 404 097；WO 1993/01161；Hudson,P.J.,et al.,Nat.Med.9(2003)129-134；およびHolliger,P.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448を参照のこと）。トリアボディ（triabodies）およびテトラボディ（tetrabodies）も、Hudson,P.J.,et al.,Nat.Med.9(2003)129-134に記載されている。

シングルドメイン抗体とは、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部または軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部を含む抗体断片である。ある種の態様において、シングルドメイン抗体は、ヒトシングルドメイン抗体である（Domantis,Inc.,Waltham,MA；例えば、米国特許第6,248,516号を参照のこと）。

本明細書に記載されるように、完全抗体のタンパク質消化および組換え宿主細胞（例えば、大腸菌またはファージ）による産生を含むが、これらに限定されない、様々な技術によって、抗体断片を作成することができる。

ある種の態様において、抗体はキメラ抗体である。ある種のキメラ抗体は、例えば、米国特許第4,816,567号；およびMorrison,S.L.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984)6851-6855に記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサルのような非ヒト霊長類に由来する可変領域）と、ヒト定常領域とを含む。さらなる例において、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のものから変化させられた「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体には、それらの抗原結合断片が含まれる。

ある種の態様において、キメラ抗体はヒト化抗体である。典型的には、親非ヒト抗体の特異性および親和性を保持しつつ、ヒトに対する免疫原性を低下させるため、非ヒト抗体がヒト化される。一般に、ヒト化抗体は、HVR、例えば、CDR（またはその一部分）が非ヒト抗体に由来し、FR（またはその一部分）がヒト抗体配列に由来する、1個以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、任意で、ヒト定常領域の少なくとも一部分も含むであろう。いくつかの態様において、ヒト化抗体におけるいくつかのFR残基は、例えば、抗体の特異性または親和性を回復するかまたは改善するため、非ヒト抗体（例えば、HVR残基が由来した抗体）に由来する対応する残基に置換される。

ヒト化抗体およびそれらを作成する方法は、例えば、Almagro,J.C.and Fransson,J.,Front.Biosci.13(2008)1619-1633に概説されており、例えば、Riechmann,I.,et al.,Nature 332(1988)323-329；Queen,C.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)10029-10033；米国特許第5,821,337号、米国特許第7,527,791号、米国特許第6,982,321号、および米国特許第7,087,409号；（SDR（a-CDR）グラフティングを記載している）Kashmiri,S.V.,et al.,Methods 36(2005)25-34；（「リサーフェイシング（resurfacing）」を記載している）Padlan,E.A.,Mol.Immunol.28(1991)489-498；（「FRシャフリング（shuffling）」を記載している）Dall'Acqua,W.F.,et al.,Methods 36(2005)43-60；ならびに（FRシャフリングのための「ガイデッドセレクション（guided selection）アプローチ」を記載している）Osbourn,J.,et al.,Methods 36(2005)61-68およびKlimka,A.,et al.,Br.J.Cancer 83(2000)252-260にさらに記載されている。

ヒト化のために使用され得るヒトフレームワーク領域には、以下のものが含まれるが、これらに限定されない：「ベストフィット（best-fit）」法を使用して選択されたフレームワーク領域（例えば、Sims,M.J.,et al.,J.Immunol.151(1993)2296-2308を参照のこと）；軽鎖または重鎖の可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Carter,P.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289；およびPresta,L.G.,et al.,J.Immunol.151(1993)2623-2632を参照のこと）；ヒト成熟（体細胞変異を受けた）フレームワーク領域またはヒト生殖系列フレームワーク領域（例えば、Almagro,J.C.and Fransson,J.,Front.Biosci.13(2008)1619-1633を参照のこと）；ならびにFRライブラリーのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Baca,M.,et al.,J.Biol.Chem.272(1997)10678-10684およびRosok,M.J.,et al.,J.Biol.Chem.271(19969 22611-22618を参照のこと）。

ある種の態様において、抗体はヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野において公知の様々な技術を使用して産生され得る。ヒト抗体は、van Dijk,M.A.and van de Winkel,J.G.,Curr.Opin.Pharmacol.5(2001)368-374およびLonberg,N.,Curr.Opin.Immunol.20(2008)450-459に一般に記載されている。

ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答して、完全ヒト抗体またはヒト可変領域を有する完全抗体を産生するよう改変されたトランスジェニック動物へ、免疫原を投与することによって調製され得る。そのような動物は、典型的には、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含有しており、それらは、内在性免疫グロブリン遺伝子座に取って代わっているか、または染色体外に存在するかもしくは動物の染色体へランダムに組込まれている。そのようなトランスジェニックマウスにおいて、内在性免疫グロブリン遺伝子座は、一般に、不活化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を入手する方法の概説については、Lonberg,N.,Nat.Biotech.23(2005)1117-1125を参照し、例えば、XENOMOUSE（商標）テクノロジーを記載している米国特許第6,075,181号および米国特許第6,150,584号；HUMAB（登録商標）テクノロジーを記載している米国特許第5,770,429号；K-M MOUSE（登録商標）テクノロジーを記載している米国特許第7,041,870号、ならびにVELOCIMOUSE（登録商標）テクノロジーを記載しているUS2007/0061900も参照すること。そのような動物によって生成された完全抗体に由来するヒト可変領域を、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによって、さらに改変してもよい。

ハイブリドーマに基づく方法によって、ヒト抗体を作成することもできる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫細胞株およびマウス-ヒトヘテロミエローマ細胞株が記載されている（例えば、Kozbor,D.,J.Immunol.133(1984)3001-3005；Brodeur,B.R.,et al.,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,Marcel Dekker,Inc.,New York(1987),pp.51-63；およびBoerner,P.,et al.,J.Immunol.147(1991)86-95を参照のこと）。ヒトB細胞ハイブリドーマテクノロジーを介して生成されたヒト抗体も、Li,J.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103(2006)3557-3562に記載されている。付加的な方法には、例えば、（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトIgM抗体の産生を記載している）米国特許第7,189,826号および（ヒト-ヒトハイブリドーマを記載している）Ni,J.,Xiandai Mianyixue 26(2006)265-268に記載されたものが含まれる。ヒトハイブリドーマテクノロジー（トリオーマテクノロジー）も、Vollmers,H.P.and Brandlein,S.,Histology and Histopathology 20(2005)927-937およびVollmers,H.P.and Brandlein,S.,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27(2005)185-191に記載されている。

ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されたFvクローン可変ドメイン配列を単離することによっても、ヒト抗体を生成することができる。次いで、そのような可変ドメイン配列を、所望のヒト定常ドメインと組み合わせることができる。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術は、以下に記載される。

所望の活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって、抗体を単離することができる。例えば、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特徴を保有する抗体についてそのようなライブラリーをスクリーニングするための多様な方法が、当技術分野において公知である。そのような方法は、例えば、Hoogenboom,H.R.,et al.,Methods in Molecular Biology 178(2001)1-37に概説され、例えば、McCafferty,J.,et al.,Nature 348(1990)552-554；Clackson,T.,et al.,Nature 352(1991)624-628；Marks,J.D.,et al.,J.Mol.Biol.222(1992)581-597；Marks,J.D.and Bradbury,A.,Methods in Molecular Biology 248(2003)161-175；Sidhu,S.S.,et al.,J.Mol.Biol.338(2004)299-310；Lee,C.V.,et al.,J.Mol.Biol.340(2004)1073-1093；Fellouse,F.A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(2004)12467-12472；およびLee,C.V.,et al.,J.Immunol.Methods 284(2004)119-132にさらに記載されている。

ある種のファージディスプレイ法において、Winter,G.,et al.,Ann.Rev.Immunol.12(1994)433-455に記載されるように、VH遺伝子およびVL遺伝子のレパートリーを、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって別々にクローニングし、ファージライブラリーにおいてランダムに組換え、次いで、それを抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、典型的には、単鎖Fv（scFv）断片としてまたはFab断片として抗体断片をディスプレイする。免疫感作された起源に由来するライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要なしに、免疫原に対する高親和性抗体を提供する。あるいは、Griffiths,A.D.,et al.,EMBO J.12(1993)725-734によって記載されるように、免疫感作なしに、広範囲の非自己抗原および自己抗原に対する抗体の単一の起源を提供するため、（例えば、ヒトから）未感作レパートリーをクローニングすることができる。最後に、Hoogenboom,H.R.and Winter,G.,J.Mol.Biol.227(1992)381-388によって記載されるように、高度に可変性のCDR3領域をコードし、インビトロで再編成を達成するため、再編成されていないV遺伝子セグメントを幹細胞からクローニングし、ランダム配列を含有しているPCRプライマーを使用することによって、未感作ライブラリーを合成的に作成することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーを記載している特許刊行物には、例えば、米国特許第5,750,373号、ならびにUS 2005/0079574、US 2005/0119455、US 2005/0266000、US 2007/0117126、US 2007/0160598、US 2007/0237764、US 2007/0292936、およびUS 2009/0002360が含まれる。

ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または抗体断片は、本明細書において、ヒト抗体またはヒト抗体断片と見なされる。

ある種の態様において、抗体は、多特異性抗体、例えば、二特異性抗体である。多特異性抗体は、少なくとも2種の異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある種の態様において、結合特異性の一方は第一の抗原に対するものであり、他方は異なる第二の抗原に対するものである。ある種の態様において、二特異性抗体は、同一抗原の2種の異なるエピトープに結合してもよい。二特異性抗体は、抗原を発現する細胞へ細胞毒性剤を局在化するために使用されてもよい。二特異性抗体は、全長抗体または抗体断片として調製され得る。

多特異性抗体を作成するための技術には、異なる特異性を有する2種の免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の組換え共発現（Milstein,C.and Cuello,A.C.,Nature 305(1983)537-540、WO 93/08829、およびTraunecker,A.,et al.,EMBO J.10(1991)3655-3659を参照のこと）ならびに「ノブ・ホール（knob-in-hole）」工学（例えば、米国特許第5,731,168号を参照のこと）が含まれるが、これらに限定されない。抗体Fcヘテロ二量体分子を作成するための静電的ステアリング（electrostatic steering）効果の工作（WO 2009/089004）；2種以上の抗体または断片の架橋（例えば、米国特許第4,676,980号およびBrennan,M.,et al.,Science 229(1985)81-83を参照のこと）；二特異性抗体を産生するためのロイシンジッパーの使用（例えば、Kostelny,S.A.,et al.,J.Immunol.148(1992)1547-1553を参照のこと）；二特異性抗体断片を作成するための「ダイアボディ」テクノロジーの使用（例えば、Holliger,P.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448を参照のこと）；ならびに単鎖Fv（sFv）二量体の使用（例えば、Gruber,M .,et al.,J.Immunol.152(1994)5368-5374を参照のこと）；ならびに、例えば、Tutt,A.,et al.,J.Immunol.147(1991)60-69に記載されたような三特異性抗体の調製によっても、多特異性抗体を作成することができる。

「オクトパス（Octopus）抗体」を含む、3種以上の機能性の抗原結合部位を有するよう工作された抗体も、本明細書に含まれる（例えば、US 2006/0025576を参照のこと）。

抗体は、第一の抗原に結合し、かつもう1種の異なる抗原にも結合する抗原結合部位を含む「二重作用性Fab（Dual Acting Fab）」または「DAF」であってもよい(例えば、US 2008/0069820を参照のこと）。

抗体または断片は、WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254、WO 2010/112193、WO 2010/115589、WO 2010/136172、WO 2010/145792、またはWO 2010/145793に記載されているような多特異性抗体であってもよい。

方法
ある種の態様において、本明細書に提供される方法は、抗体がグリコシル化される程度を変更するため、即ち、増加させるかまたは減少させるため、使用される。

抗体がFc領域を含む場合、それに付着した炭水化物を変更することができる。哺乳動物細胞によって産生されたネイティブ抗体は、典型的には、一般に、N結合によってFc領域のCH2ドメインのAsn297に付着している、分枝を有する二分岐オリゴ糖を含む（例えば、Wright,A.and Morrison,S.L.,TIBTECH 15(1997)26-32を参照のこと）。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、マンノース、N-アセチルグルコサミン（GlcNAc）、ガラクトース、およびシアル酸を含み、二分岐オリゴ糖構造の「ステム」においてGlcNAcに付着したフコースも含む。いくつかの態様において、ある種の改善された特性を有する抗体バリアントを作出するため、本発明の抗体においてオリゴ糖の改変を行うことができる。

一つの態様において、提供された方法は、Fc領域に（直接または間接的に）付着したフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体の産生をもたらす。例えば、そのような抗体におけるフコースの量は、1％〜80％、1％〜65％、5％〜65％、または20％〜40％であり得る。フコースの量は、例えば、WO 2008/077546に記載されるように、MALDI-TOF質量分析によって測定されるような、Asn297に付着した全ての糖鎖構造（例えば、複合型構造、混合型構造、および高マンノース型構造）の合計に対する、Asn297における糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって、決定される。Asn297とは、Fc領域内の約297位（Fc領域残基のKabatによるEU番号付け）に位置するアスパラギン残基をさす；しかしながら、Asn297は、抗体における軽微な配列変動によって、297位の±3アミノ酸上流または下流、即ち、294位〜300位に位置する場合もある。そのようなフコシル化バリアントは、改善されたADCC機能を有し得る（例えば、US 2003/0157108；US 2004/0093621を参照のこと）。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体バリアントに関する刊行物の例には、以下のものが含まれる：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki,A.,et al.,J.Mol.Biol.336(2004)1239-1249；Yamane-Ohnuki,N.,et al.,Biotech.Bioeng.87(2004)614-622。脱フコシル化抗体を産生することができる細胞株の例には、タンパク質フコシル化が欠損しているLec13 CHO細胞（Ripka,J.,et al.,Arch.Biochem.Biophys.249(1986)533-545；US 2003/0157108；およびWO 2004/056312、特に、実施例11）、ならびにα-1,6-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子（FUT8）ノックアウトCHO細胞のようなノックアウト細胞株（例えば、Yamane-Ohnuki,N.,et al.,Biotech.Bioeng.87(2004)614-622；Kanda,Y.,et al.,Biotechnol.Bioeng.94(2006)680-688；およびWO 2003/085107を参照のこと）が含まれる。

ある種の態様において、提供された方法は、二分（bisected）オリゴ糖を有する抗体、例えば、抗体のFc領域に付着した二分岐オリゴ糖がGlcNAcにより二分される抗体を産生するために使用され得る。そのような抗体バリアントは、低下したフコシル化および／または改善されたADCC機能を有し得る。そのような抗体バリアントの例は、例えば、WO 2003/011878；米国特許第6,602,684号；およびUS 2005/0123546に記載されている。Fc領域に付着したオリゴ糖の中に少なくとも1個のガラクトース残基を有する抗体バリアントを産生することもできる。そのような抗体バリアントは、改善されたCDC機能を有し得る。そのような抗体バリアントは、例えば、WO 1997/30087；WO 1998/58964；およびWO 1999/22764に記載されている。

例えば、米国特許第4,816,567号に記載されるような組換え法および組成物を使用して、抗体を産生してもよい。核酸は、抗体のVLを含むアミノ酸配列および／またはVHを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖および／または重鎖）をコードし得る。さらなる態様において、そのような核酸を含む1種以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。さらなる態様において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。一つのそのような態様において、宿主細胞は、（1）抗体のVLを含むアミノ酸配列および抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または（2）抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一のベクターおよび抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第二のベクターを含む（例えば、によって形質転換されている）。一つの態様において、宿主細胞は、真核細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞またはリンパ球系細胞（例えば、Y0、NS0、Sp2/0）である。一つの態様において、抗体の発現のために適当な条件の下で、上に提供されるような、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養する工程を含み、任意で、宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から抗体を回収する工程を含む、抗体を作成する方法が提供される。

抗体の組換え産生のためには、抗体をコードする核酸を単離し、宿主細胞におけるさらなるクローニングおよび／または発現のため、1種以上のベクターに挿入する。そのような核酸は、従来の手法を使用して（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離され配列決定され得る。

抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現のための適当な宿主細胞には、本明細書に記載された原核細胞または真核細胞が含まれる。例えば、特に、グリコシル化およびFc領域エフェクター機能が必要でない時、細菌において抗体を産生することができる。細菌における抗体断片およびポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第5,648,237号、米国特許第5,789,199号、および米国特許第5,840,523号を参照し；大腸菌における抗体断片の発現を記載しているCharlton,K.A.,In:Methods in Molecular Biology,Vol.248,Lo,B.K.C.(ed.),Humana Press,Totowa,NJ(2003),pp.245-254も参照すること。発現の後、可溶性画分内の細菌細胞ペーストから抗体を単離することができ、さらに精製してもよい。

原核生物に加えて、部分的にまたは完全にヒトグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす、「ヒト化」されたグリコシル化経路を有する真菌および酵母の株を含む、糸状菌または酵母のような真核微生物も、抗体をコードするベクターのための適当なクローニング宿主または発現宿主である（Gerngross,T.U.,Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；およびLi,H.,et al.,Nat.Biotech.24(2006)210-215を参照のこと）。

グリコシル化抗体の発現のための適当な宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物および脊椎動物）に由来してもよい。無脊椎動物細胞の例には、植物および昆虫の細胞が含まれる。昆虫細胞と共に、特に、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞のトランスフェクションのために使用され得る、多数のバキュロウイルス株が同定されている。

植物細胞培養物も宿主として利用することができる（例えば、（トランスジェニック植物において抗体を産生するためのPLANTIBODIES（商標）テクノロジーを記載している）米国特許第5,959,177号、米国特許第6,040,498号、米国特許第6,420,548号、米国特許第7,125,978号、および米国特許第6,417,429号を参照のこと）。

脊椎動物細胞も宿主として利用することができる。例えば、懸濁培養に順応した哺乳動物細胞株が有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株（COS-7）；ヒト胎児腎臓株（例えば、Graham,F.L.,et al.,J.Gen Virol.36(1977)59-74に記載されているような293または293細胞）；ベビーハムスター腎細胞（BHK）；マウスセルトリ細胞（例えば、Mather,J.P.,Biol.Reprod.23(1980)243-252に記載されているようなTM4細胞）；サル腎細胞（CV1）；アフリカミドリザル腎細胞（VERO-76）；ヒト子宮頚癌細胞（HELA）；イヌ腎細胞（MDCK）；バッファローラット肝細胞（BRL 3A）；ヒト肺細胞（W138）；ヒト肝細胞（Hep G2）；マウス乳癌（MMT 060562）；例えば、Mather,J.P.,et al.,Annals N.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68に記載されているようなTRI細胞；MRC 5細胞；およびFS4細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、DHFR陰性（DHFR-）CHO細胞（Urlaub,G.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216-4220）を含むチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞；ならびにY0、NS0、およびSp2/0のような骨髄腫細胞株が含まれる。抗体産生のために適当なある種の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、Yazaki,P.and Wu,A.M.,Methods in Molecular Biology,Vol.248,Lo,B.K.C.(ed.),Humana Press,Totowa,NJ(2004),pp.255-268を参照のこと。

II. 発明の具体的な局面
ベクター構成に依存して、発現ベクターの性能が、ベクター設計に依存して安定トランスフェクションにおいて異なることが見出された。

この理論によって拘束はされないが、安定トランスフェクションのためのベクター構成の性能に、いくつかの点が寄与する可能性がある：（1）それぞれのベクター設計に依存しかつ特異的であり、一過性のシステムには存在しない、宿主ゲノムに組込まれたベクターコピーの間の転写干渉現象、（2）それぞれのベクター構成に依存し、安定的なシステムにおいては重要な役割を果たす、選択過程および選択ストリンジェンシーの影響、ならびに（3)最適なLC/HCポリペプチド比。

しかしながら、安定トランスフェクションについては、LCおよびHCの双方向発現は、一列構成HC-LC-SMより悪いことが見出された。この理論によって拘束はされないが、（1）LC、HC、およびSMのための発現カセットの収束性の構成は、組込まれたベクターコピーの間の転写干渉現象を低下させる可能性があり、（2）LCの上流にHCが存在することによって、安定トランスフェクションのために（より）最適であるLC/HCポリペプチド比が明確に容易になり、（3）選択マーカーの下流への位置付けによって、選択のストリンジェンシーが明確に増加する。さらに、IgG産生細胞の割合および細胞株の産生能が増加していることが見出された。抗体発現カセットの双方向に上流に選択マーカーを含有しているベクターについては、選択圧の濃度の増加によって、選択のストリンジェンシーは明白に増加したが、安定プールまたは安定クローンの産生能は増加しなかった（示されないデータ）。

hEF1αプロモーターは、多数の高産生クローン、および極めて少数の非産生クローンまたは低産生クローンを生成することが見出された。しかしながら、フェドバッチ分析において、hEF1αプロモーターの最良の個々のクローンについての産物力価は、hCMVプロモーターのクローンより低かった。しかし、hCMVプロモーターについての上位クローンの全体数は比較的低く、それらの同定は一般的に高度のスクリーニング努力を必要とする。

hGTの使用は、安定トランスフェクションにおいて、SV40またはbGHのポリAシグナルと組み合わせられた時、hCMVプロモーターを含有しているベクターについて、産生能を有意に増加させることが見出された。しかしながら、hEf1αプロモーターを含有するベクターについて、産物力価に対するその効果は、bGHポリAシグナルと組み合わせられた時、無視し得る程度であった。従って、ベクター性能に対するhGTの影響は、使用されるプロモーターに依存することが見出された。

完全に調節された大規模発酵における最終評価のための適切なクローンの選別は、一般的に、振とうフラスコにおけるバッチ分析またはフェドバッチ分析に基づく。バッチ分析とフェドバッチ分析との間に、いくつかの発現ベクターまたは要素の性能および順位の差が存在することが見出された。SV40をbGHポリAシグナルに交換することによって、バッチ分析においては、hCMVプロモーターを含有しているベクターについての産生能が増加したが、フェドバッチ分析においてはそうでなかった。hGTは、バッチ分析においては、クローンの産物力価に対して有意な影響を及ぼさなかったが、フェドバッチ分析においてはそうでなかった。ベクター性能の絶対的な違いはバッチとフェドバッチとの間で部分的に異なっていた。選択マーカーの位置またはプロモーター（hEf1αプロモーターであるかhCMVプロモーターであるか）が異なるベクターの間の違いは、バッチ分析においては中程度に明白であったが、フェドバッチ分析においては強く明確であった。発現レベルおよび比産生速度は、バッチモードよりフェドバッチモードの方が高い。

大部分のクローンについて、絶対産物力価のレベルにおいてのみならず、順位においても、異なるベクターおよびクローンの間に、フェドバッチ分析および2L発酵の性能における良好な相関が見出された。

選択マーカーの下流への位置付けは、抗体発現カセットの上流への選択マーカーの双方向性の位置付けと比較して、産生能の損失をわずかに低下させることが見出された。理論によって拘束はされないが、これは、増加した選択ストリンジェンシー、従って、より高いmRNAレベルによるか、または改善されたLC/HC mRNA比もしくはポリペプチド比による可能性がある。両方の要因が、産生能の変化に対するより高い抵抗性をもたらした可能性がある。

bGHポリAシグナルは、SV40ポリAシグナルと比較して、クローンにおける抗体発現の安定性を有意に減少させた。しかしながら、bGHポリAシグナルの下流へのhGTの挿入は、発現の安定性を明白に増加させた。安定性に対するhGTの正の効果は、選択圧の非存在下で最も明白であった。安定プールの安定性分析は、細胞が、hCMVによって生成された時には産生能を急速に失うが、hEf1αプロモーターによって生成された時にはそうでないことを明らかにした。著しくは、hGTは、hEf1αプロモーターを含有しているベクターについて、クローンの産生能を減少させたが、安定性をわずかに増加させた。

クローンの極一部分のみが、選択過程の後に抗体を有意に産生した。しかしながら、構成および／または要素についてのベクター改変は、IgG非産生クローンに対するIgG産生クローンの比を有意に増加させた。異なるベクター構成、従って、選択のストリンジェンシーを決定する選択マーカーの異なる発現レベルも、IgG産生細胞の割合に明白に影響する。スクリーニング過程のデータに基づく統計的シミュレーションは、いくつかの発現ベクターが、スクリーニング過程における作業量を相当に減少させる可能性も保持することを証明した。この事実は、バイオ医薬品企業のコストに対して多大な影響を及ぼす。

発現カセット構成
抗体の軽鎖および重鎖ならびに／または選択マーカーの変動する位置付けを有する4種の異なるベクターを、産生能について試験した（詳細については、図1を参照のこと）。

ベクターp5137、p5156、p5158、およびp5159を、一過性トランスフェクションおよび安定プールのバッチ分析において試験した。ベクターp5137およびp5156を、安定単一クローンのバッチ分析においても試験した。

ベクターp5137、p5156、p5158、およびp5159を、CHO-K1細胞へ一過性トランスフェクトし、トランスフェクション後5日目にELISAによって産生能を決定した（図2）。

一過性トランスフェクションについては、抗体の軽鎖の前への重鎖の位置付けが、逆の順序と比較して良好な発現結果を提供することが見出された。従って、より高い産生能が入手され得た：ベクターp5137−11.6μg/ml；ベクターp5156−7.1μg/ml；ベクターp5159−8.0μg/ml；ベクターp5158−4.2μg/ml。

両方の抗体鎖の後への選択マーカーの位置付けが、最初の抗体鎖の前への双方向性の位置付けと比較して、良好な発現結果を提供することが見出された。従って、より高い産生能が入手され得た。

ベクターp5137、p5156、p5158、およびp5159を、ヌクレオフェクションによってCHO-K1細胞へトランスフェクトし、安定プールを選択した。安定プールの産生能を、バッチ分析において決定した。

両方の抗体鎖の後への選択マーカーの位置付け（5'-3'方向）が、最初の抗体鎖の前への双方向性の位置付け（3'-5'方向）と比較して、良好な発現結果を提供することが見出された。従って、より高い産生能が入手され得た：ベクターp5156−18.0μg/ml；ベクターp5158−9.1μg/ml；ベクターp5137−15.6μg/ml；ベクターp5159−5.7μg/ml（図3）。

ベクターp5137およびp5156を、ヌクレオフェクションによってCHO-K1細胞へトランスフェクトした。安定トランスフェクトされた細胞を選択し、最良の15個のクローンの産生能を、バッチ分析において試験した。

ベクターp5137およびベクターp5156によって生成された最良の15個のクローンの平均産生能は、それぞれ、ベクターp5137については159μg/ml、ベクターp5156については141μg/mlであった。バッチ分析における各ベクターの最良の15個のクローンの産生能分布は、極めて類似していた。バッチ分析におけるクローンの産生能は、約50μg/mlから300μg/mlまで変動した（一つの例外：ベクターp5137によって生成された最良のクローンは＞450μg/mlの産生能に達した）。

両方の抗体鎖の後への選択マーカーの位置付け（5'-3'方向）は、一過性トランスフェクションにおいても、安定プールのバッチ分析においても、最初の抗体鎖の前への双方向性の3'-5'位置付けより有意に高い産生能をもたらした。

抗体軽鎖の前への抗体重鎖の位置付け（いずれも5'-3'方向）は、一過性トランスフェクションにおいて、逆の順序と比較して良好な発現を提供することが見出された。

抗体の軽鎖および重鎖の位置／順序は、安定プールおよび単一クローンの産生能に対して有意な影響を及ぼさないことが見出された。わずかに過剰の軽鎖が発現されることが確実にされなければならない。従って、抗体鎖発現カセットの配列は、この要件が満たされるよう配置される。

抗体鎖発現カセット（任意の順序）が選択マーカー発現カセットの前にあること（全て5'-3'方向）が、特に好適であることが見出された。

2種の遺伝子が直接逐次発現される時、第二の遺伝子は一般により低い速度で発現される。RNAポリメラーゼによる第二の転写単位のリードスルーは、第二の転写単位のプロモーターにおける転写開始に負の影響を与える。

ベクターpx6068において、抗体の軽鎖および重鎖の発現カセットを双方向性に配置した（図4）。

プロモーターの競合または干渉（2個のプロモーターの近接による非効率的な転写開始、即ち、転写因子およびRNAポリメラーゼのプロモーターへの接近の立体障害、転写機構の資源の利用可能性の低下）を防止するため、抗体の軽鎖および重鎖の発現を駆動する2個の短いhCMVプロモーターを（puc複製起点により）領域的に分離した。

ベクターp5068およびpx6068を、ヌクレオフェクションによってCHO-K1細胞へ一過性トランスフェクトした。

ベクターpx6068は、一過性トランスフェクションにおいて、発現ベクターp5068と比較して増加した産生能を示した：px6068については9.0μg/ml、p5068については4.5μg/ml（図5）。

抗体の軽鎖および重鎖の双方向性の分離された位置付けは、一過性トランスフェクションにおいて、軽鎖および重鎖のバックトゥバック位置付けと比較して、改善された抗体発現を提供することが見出された。

ベクターp5068およびpx6068を、ヌクレオフェクションによってCHO-K1細胞へ一過性トランスフェクトし、安定プールを選択した。安定プールの産生能をバッチ分析において決定した。

安定プールのバッチ分析は、安定プールにおけるベクターp5068およびpx6068の産生能が類似していることを示した：p5068については12.5μg/ml、px6068については12.5μg/ml。

トランスフェクションプロトコル
安定トランスフェクションのため、発現ベクターの骨格を切断する酵素による制限消化によってベクターを直鎖化する。ベクターpx6068の場合には、2個の可能な制限部位が可能である：
（1）軽鎖の転写単位と選択マーカーとの間（SgrAI）；
（2）軽鎖および重鎖のhCMVプロモーターの間のpuc起点の中（BssHII）。

SgrAIまたはBssHIIによる制限消化によって直鎖化されたベクターpx6068を、ヌクレオフェクションによってCHO-K1細胞へトランスフェクトし、安定プールを選択した。安定プールの産生能をバッチ分析において決定した。

発現ベクター内の直鎖化部位の位置が、安定プールのバッチ分析におけるベクターの産生能に対して明らかに影響を及ぼすことが見出された。

制限酵素BssHIIによって直鎖化されたベクターpx6068によって生成されたプールは、制限酵素SgrAIによって直鎖化されたベクターpx6068によって生成された安定プールと比較して高い産生能を示す：1回目の実験：制限酵素BssHIIによって直鎖化されたベクターpx6068については6.4μg/ml、制限酵素SgrAIによって直鎖化されたベクターpx6068については2.8μg/ml；2回目の実験：制限酵素BssHIIによって直鎖化されたベクターpx6068については12.5μg/ml、制限酵素SgrAIによって直鎖化されたベクターpx6068については9.6μg/ml（図6を参照のこと）。

選択圧の開始の時点
安定細胞クローンの生成のため、トランスフェクション後の異なる時点、即ち、0時間目、4時間目、8時間目、24時間目、および48時間目に選択圧をかけた。

トランスフェクション後24時間目の選択圧の添加により、選択剤の濃度とは無関係に、培養上清中に最も高い抗体力価がもたらされることが見出された（図7を参照のこと）。

細胞株の性能に対するベクター骨格の影響
一般に、発現ベクターは、真核細胞へのトランスフェクションの前に直鎖化される。さらに、発現ベクターは、原核細胞における発現ベクターの増幅のために必要とされる原核生物配列を含む。

真核細胞へのトランスフェクションの前に直鎖化された発現ベクターから原核生物要素を除去することによって、
−安定細胞クローンの生成のために必要とされる選択時間の短縮（図8a）、
−プール（図8b）および単一クローン（図8c）の産生能の増強、
−回復の加速（図8d）、ならびに
−細胞増殖の改善（図8e）
がもたらされることが見出された。

ベクター要素および発現カセット方向
数種の異なる転写関連遺伝要素およびそれらの組み合わせを、参照遺伝要素組み合わせと比較した。比較一過性実験に基づき、以下の結果が入手された（下記表を参照のこと。双方向性ベクター構成、SM(3'-5')-LC-HC(5'-3')）。

異なるプロモーターを、bGHポリAシグナルおよびhGT転写ターミネーターと組み合わせた（下記表を参照のこと）。

使用されたベクター：

本明細書に報告されるベクター要素／要素組み合わせを使用して、増加した発現（産生能）を達成し得ることが見出された：
−イントロンAを含まないヒトCMV：100％（参照）
−イントロンAを含むヒトCMV：一過性234％、プール123％、クローン38％
−イントロンAを含むラットCMV：一過性50％、プール60％
−イントロンAを含むヒトEF1α：一過性153％、プール564％、単一クローン：84％（SV40ポリA）、およそ100％（bGHおよびhGT）
−イントロンAおよび最適化された5'UTRを含むヒトEF1α：+40％（ヒトEF1αに対して）
−MPSV：29％
−bGHポリA：一過性146％、プール+38％、安定クローン92％
−hGT：一過性131％、安定プール137％、単一クローン123％
−bGHポリAおよびhGT：一過性158％、安定プール163％、単一クローン140％

ヒトCMVプロモーター：
Xu et al.,J.Control.Release,81(2002)155-163.
Xia et al.,Prot.Expr.Purif.45(2006)115-124.
ラットCMVプロモーター：
Xia et al.,Prot.Expr.Purif.45(2006)115-124.
ヒトEF1αプロモーター：
Teschendorf et al.,Anticancer Res.22(2002)3325-3330.
Li et al.,J.Immunol.Methods 318(2007)113-124.
MPSVプロモーター：
Xia et al.,Prot.Expr.Purif.45(2006)115-124.
Artelt et al.,Gene 68(1988)213-219.
Stocking et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82(1985)5746-5750.
Lin et al.,Gene 147(1994)287-292.
MPSV-CMVハイブリッドプロモーター：
Liu et al.,Anal.Biochem.246(1996)150-152.

選択マーカーの発現のため、IRESによって連結された発現カセットを使用することによって、高選択性かつ高ストリンジェンシーの選択過程を提供することができる：
−抗体発現に対する選択圧は、高い選択性をもたらす。
−抗体および選択マーカーの連結された発現は、高い選択性をもたらす。
−弱い活性を有するIRES要素の使用は、高いストリンジェンシー、即ち、高い抗体産生および低い選択マーカー産生をもたらすことが見出された。
−IRES要素による抗体および選択マーカーの発現の連結。
−IgG発現をわずかに改変する弱い活性を有するIRES要素（EMCV/Gtx）の同定。
−選択マーカーとしてもスクリーニングマーカーとしても機能する融合タンパク質の使用。
−二機能性GFP-ネオマイシン融合タンパク質。
−オルニチンデカルボキシラーゼのPEST配列は、強力なタンパク質分解シグナル配列であり、タンパク質の低下した半減期を付与する。
−融合タンパク質のIRESによって連結された発現は、高い選択性をもたらす。
−タンパク質分解シグナル配列による短い半減期は、高いストリンジェンシーをもたらす。
−融合タンパク質の弱い発現および短い半減期のため、強力な発現が必要とされる。
−FACSによる高産生体の迅速な同定（高GFP発現クローンのソートが高産生体の選択を提供する）。

異なるIRES要素によって抗体重鎖に連結された選択マーカー
−px5068（IRESなし）：100％抗体発現（参照）
−Gtx-IRES：20〜27％
−EMCV-IRES 81〜94％
−EV71-IRES 20〜36％
−ELF4G-IRES 3〜17％
−Gtx-IRES（合成）88％

異なるIRES要素によって抗体重鎖に連結されたGFP-Neo融合タンパク質

Gtx-IRES：
Komuro et al.,EMBO J.12(1993)1387-1401.
EMCV-IRES：
Mountford et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(1991)4303-4307.
EV71-IRES：
Lee et al.,Biotechnol.Bioeng.90(2005)656-662.
ELF4G-IRES：
Wong et al.,Gene Ther.9(2002)337-344.
Gtx（合成）-IRES：
Chappell et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA97(2000)1536-1541.

EV71-IRES要素による重鎖発現カセットへの軽鎖発現カセットの連結を使用して、増加した発現（産生能）を達成し得ることが見出された：
−IRESなしのpx5068：100％抗体発現（参照）
−Gtx-IRES（合成）：3％
−EV71-IRES：82％
−ELF4G-IRES：5％
−EMCV-IRES：7％

ベクター構成と組み合わせられたベクター要素
以下のベクターを、一過性トランスフェクション、安定プール、および単一クローンレベルで、CHO-K1宿主細胞株において試験した。

数種の転写関連遺伝要素およびそれらの組み合わせを、参照ベクター（px9001、ベクター構成SM（3'-5'方向）-LC-HC（5'-3'方向））と比較した。比較実験に基づき、軽鎖および重鎖のための発現カセット（軽鎖発現カセットが重鎖発現カセットの上流）ならびに選択マーカーのための発現カセットを同一方向に含む一方向ベクター構成について、参照ベクター（px9001、双方向ベクター構成SM（3'-5')-LC-HC(5'-3')）と比較して、以下の結果が入手された（下記表を参照のこと）。

一過性トランスフェクションにおける異なるベクターの性能を、CHO-K1細胞へのヌクレオフェクションの後に試験した（図9を参照のこと）。

（ベクター構成LC-HC-SMに基づき）ヒト伸長因子1αプロモーター（hEF1α）を含有しているベクターは、hCMVプロモーターの使用と比較して、使用されたポリAシグナル配列に依存して、それぞれ、約+34％（px9003対px9002；SV40ポリAシグナル配列）および+30％（px9006対px9004；bGHポリAシグナル配列）の増加した産生能を有する。

hCMVを含有しているベクターについて、bGHポリAシグナル配列へのヒトガストリンターミネーター（hGT）の付加は、産生能に対して正の効果を及ぼす（px9005対px9004；+13％）。

抗体の軽鎖および重鎖の双方向発現に基づく発現ベクターは、改善された性能を示す。産物力価が、対照ベクターpx9001と比較して、使用されたプロモーター（hEF1αであるかhCMVであるか）および使用されたポリAシグナル配列（SV40ポリAシグナル配列であるかbGHポリAシグナル配列であるか）に依存して、約2.7〜3.4倍増加する。

ヒト伸長因子1αプロモーターおよびbGHポリAシグナル配列の使用は、ベクター構成LC-HC-SMにおいては、産生能に対して正の効果を及ぼすが（+50％；px9006およびpx9002を比較すること）、ベクター構成LC(3'-5')-HC-SMにおいては、そうでないことが見出された（-28％；px9010およびpx9011を比較すること）。

発現ベクターpx9002の産生能を、ベクターpx9003〜9007と比較するため、ベクターをヌクレオフェクションによってCHO-K1細胞へトランスフェクトし、安定プールを選択した。プールの産生能をバッチ分析において分析した（図10を参照のこと）。

安定プールのバッチ分析は、ヒト伸長因子1αプロモーターを含有しているベクター（px9003、px9006、px9007）によってトランスフェクトされたプールからの抗体力価が、短縮hCMVプロモーターを含有する参照ベクター（ベクターpx9002）によってトランスフェクトされた細胞よりおよそ7〜8倍高いことを示した（ベクターpx9003、px9006、およびpx9007についての97.5μg/ml、112.5μg/ml、および95.6μg/mlを、ベクターpx9002についての14.0μg/mlと比較すること）。

ベクターpx9001、px9002、およびpx9004〜px9007を、ヌクレオフェクションによってCHO-K1細胞へトランスフェクトし、最良の単一クローンを古典的なスクリーニング過程によって同定した。各ベクターの最良の36個のクローンの産生能をバッチ分析において分析し、バッチ分析における最良の15個のクローンをフェドバッチ分析において試験した。

ベクターpx9001によって生成された最良の36個の単一クローンのバッチ分析における平均産生能は、356μg/mlである。ベクターpx9002、または（SV40ポリAシグナルの代わりに（単独でもしくはHGTと組み合わせて）BGHポリAシグナルをさらに含有している）ベクターpx9004および9005によって生成されたクローンは、対照ベクターpx9001と比較して、それぞれ37％（px9002）、61％（px9004）、53％（px9005）の産生能の増加を示す。ベクターpx9006およびpx9007のクローンは、それぞれ約19％および7％の産生能の増加を示す。

フェドバッチ実験において、バッチ分析において各ベクターによって入手された最良の15個のクローンを、14日間のフェドバッチ分析において試験した。

（ベクターpx9001によって生成された）インハウスの最良の15個の単一クローンのフェドバッチ分析における平均産生能は、1345μg/mlである。ベクターpx9002、または（SV40ポリAシグナル配列の代わりに（単独でもしくはhGTと組み合わせて）bGHポリAシグナル配列をさらに含有している）ベクターpx9004およびpx9005によって生成されたクローンは、対照ベクターpx9001と比較して、それぞれ80％（px9002）、58％（px9004）、92％（px9005）の産生能の増加を示す。

平均産生能の増加（上記参照）に加え、上位クローンの性能も強く改善される。ベクターpx9002、px9004、およびpx9005は、上位5個のクローンの産生能に関して、対照ベクターpx9001と比較して、約64％（px9002）、50％（px9004）、および88％（px9005）の増加を示す。

以下において、異なるベクターの各々についての産生細胞と非産生細胞のそれぞれの割合を直接比較した。ベクターpx9001によって生成されたクローンの14.2％が、抗体を産生し、耐性クローンの残りにおいては、抗体発現がサイレンシングされているかまたはクローンがその他の欠陥を有している。

ベクターpx9002のベクター構成は、産生細胞の割合を（26.0％に）ほぼ2倍にした。SV40ポリAシグナル配列の代わりに、単独で（ベクターpx9004）またはhGTと組み合わせて（ベクターpx9005）bGHポリAシグナル配列をさらに含有しているベクターは、産生細胞の割合のおよそ3倍の増加を示す（それぞれ39％および43％）。

hCMVプロモーターの代わりにヒト伸長因子1αプロモーターを使用することによって、産生細胞の数が5倍にまで増加した（選択過程後に入手されたクローンの70％超が実際に抗体を産生する）。

（フェドバッチ結果に基づく）ベクターpx9001〜9007によるトランスフェクションによって入手された最良の15個のクローンを、15回の継代（＝およそ60世代）の間、ハイグロマイシンBの存在下および非存在下で培養した。15回の継代の後のバッチ分析におけるクローンの産物力価を、安定性試験の開始時のバッチにおけるクローンの産物力価と比較した。

選択圧の存在下で、15回の継代の後の、各ベクターの15個のクローンの産物力価の変化は、ベクターpx9007についての-14.7％からベクターpx9002についての+0.2％まで変動する。

選択圧の非存在下で、産物力価の減少は、ベクターpx9004についての25.5％からベクターpx9005についての5.9％まで変動する。

選択マーカーの存在下でも非存在下でも、出発点（G0）における値と比較したバッチ分析における産物力価の＞80％のような定義された安定性基準を満たすクローンの数は、4〜10まで変動する。ベクターpx9005、px9007、およびpx9002は、選択圧／選択マーカーの存在下および非存在下で、同様に、最も多数の安定クローンをもたらす（px9005：10；px9007：7；px9002：6）。

従って、ベクターpx9005の構成は、特に、選択圧の非存在下で、安定性に対して正の効果を示し、安定クローンの数を増加させることが見出された。

bGHポリAとhGTとの組み合わせは、使用されるプロモーターと無関係に、転写ターミネーター（hGT）を含まないSV40ポリAと比較して、安定クローンの産生能を明白に増加させることが見出された。

一過性トランスフェクション：
−（イントロンAを含む）ヒト伸長因子1αプロモーターの使用は、（LC-HC-SM構成において）増強された産生能を提供する。
−ウシ成長ホルモンポリAシグナル配列の使用は、SV40ポリAシグナル配列の使用と比較して増強された産生能を提供する。
−bGHポリAシグナル配列へのHGTの付加は、hCMVプロモーターを含有しているベクターにおいて、増加した産生能をもたらす。
−ベクター構成LC(3'-5')-HC-SMは改善された発現をもたらす。

安定プール
−hEF1αプロモーターを含有しているベクターで生成されたプールは、バッチ分析において増強された産生能を示す。
−hEF1αプロモーターを含有しているベクターで生成されたクローンは、低下した数の低産生クローンを示す。
−hEF1αプロモーターを含有しているベクターで生成されたクローンは、IgG発現のより高い安定性を示す。

単一クローン
−選択マーカーが下流に位置付けられたベクター構成（LC-HC-SM）は、単一クローンの産生能に対して正の効果を及ぼす。
−bGHポリAシグナル配列およびhGTを含有しているベクターで生成されたクローンは、より高い産生能および安定性を有している。

以下の実施例、図面、および配列は、本発明についての理解を補助するために提供され、その真の範囲は添付の特許請求の範囲に示される。本発明の本旨を逸脱することなく、示された手法を改変し得ることが理解される。

配列
SEQ ID NO:01 イントロンAを含まない短いヒトCMVプロモーター
SEQ ID NO:02 イントロンAを含まず5'UTRを含む短いヒトCMVプロモーター
SEQ ID NO:03 イントロンAを含む全長ヒトCMVプロモーター
SEQ ID NO:04 イントロンAを含まない全長ヒトEF1αプロモーター
SEQ ID NO:05 イントロンAを含む全長ヒトEF1αプロモーター
SEQ ID NO:06 イントロンAを含み5'UTRを含む短いヒトEF1αプロモーター
SEQ ID NO:07 イントロンAを含む全長ラットCMVプロモーター
SEQ ID NO:08 SV40ポリAシグナル配列
SEQ ID NO:09 bGHポリAシグナル配列
SEQ ID NO:10 hGTターミネーター配列
SEQ ID NO:11 SV40プロモーター
SEQ ID NO:12 オルニチンデカルボキシラーゼのPEST配列
SEQ ID NO:13 GFPをコードする核酸配列
SEQ ID NO:14 ネオマイシン選択マーカー
SEQ ID NO:15 GFP-PEST-NEO融合ポリペプチドをコードする核酸
SEQ ID NO:16 EMCV-IRES
SEQ ID NO:17 EV71-IRES

一過性トランスフェクション、安定プール、および単一クローンレベルで試験された異なるベクター設計の概略図。ベクターp5158、p5137、p5156、およびp5159は、軽鎖（LC）および重鎖（HC）のそれぞれの位置ならびに／または選択マーカー（SM）の位置について変動している。 一過性トランスフェクトされたCHO-K1宿主細胞株におけるベクターp5137、p5156、p5158、およびp5159の産生能。ELISAによって測定された、トランスフェクション後5日目の各ベクターの8回の独立のトランスフェクションの平均産生能が示される。 バッチ分析におけるベクターp5137、p5156、p5158、およびp5159によって生成された安定プールの産生能。7日目の各ベクターの3つのプールの平均産生能が示される。 発現ベクターp5068のベクター設計およびベクターpx6068のベクター設計の概略図。LC（軽鎖）、HC（重鎖）、SM（（SV40によって駆動される）選択マーカー）、およびori（複製起点）が示される。 一過性トランスフェクトされたCHO-K1細胞におけるベクターp5068およびpx6068の産生能。ELISAによって測定された、トランスフェクション後7日目の各ベクターの8回の独立のトランスフェクションの平均産生能が示される。 制限酵素SgrAIまたは制限酵素BssHIIのいずれかによって直鎖化されたベクターpx6068によって生成された安定プールの産生能。7日目のバッチ分析における各ベクターの2つのプールの平均産生能が示される。 トランスフェクション後の選択の開始の時点に対する安定細胞プールのIgG力価の依存性。 （A）安定細胞クローンの生成のための選択時間；ベクター調製物A−直鎖化されたベクター全体、ベクター調製物B−原核生物ベクター要素の切り出し、ベクター調製物C−原核生物ベクター要素の切り出しおよび除去。 （B）プールの産生能；ベクター調製物A−直鎖化されたベクター全体、ベクター調製物B−原核生物ベクター要素の切り出し、ベクター調製物C−原核生物ベクター要素の切り出しおよび除去。 （C）単一クローンの産生能；ベクター調製物A−直鎖化されたベクター全体、ベクター調製物B−原核生物ベクター要素の切り出し、ベクター調製物C−原核生物ベクター要素の切り出しおよび除去。 （D）生細胞密度回復の時間経過；ベクター調製物A−直鎖化されたベクター全体、ベクター調製物B−原核生物ベクター要素の切り出し、ベクター調製物C−原核生物ベクター要素の切り出しおよび除去。 （E）4日間、7日間、および10日間の培養の後の生細胞密度；ベクター調製物A−直鎖化されたベクター全体、ベクター調製物B−原核生物ベクター要素の切り出し、ベクター調製物C−原核生物ベクター要素の切り出しおよび除去。 ヌクレオフェクションを使用した一過性トランスフェクションにおけるベクターpx9001〜px9011の産生能：トランスフェクション後6日目の各ベクターの8回の独立のトランスフェクションの平均産生能が示される；値は、参照px9001の値（100％に設定）に対して標準化されている。 10日目のバッチ分析におけるベクターpx9001〜px9007によって生成された安定クローンの産物力価の概要。各ベクターの2回（px9001およびpx9002）〜3回の独立のトランスフェクションの平均が示される。

発現ベクターp5068およびp5069
発現プラスミドp5068およびp5069は、WO 2005/100402に報告されるような抗P-セレクチン抗体の発現のための発現カセット（エクソン-イントロン構成が保持されているゲノム的に構成された発現カセット）を含む。

抗P-セレクチンHuMabの軽鎖および重鎖をコードする遺伝子を、哺乳動物細胞発現ベクターにおいて別々に組み立てた。

それによって、抗P-セレクチンHuMabの軽鎖可変領域（VL）およびヒトκ軽鎖定常領域（CL）をコードする遺伝子セグメントを接合し、抗P-セレクチンHuMabの重鎖可変領域（VH）およびヒトγ1重鎖定常領域またはヒトγ4重鎖定常領域（CH1-ヒンジ-CH2-CH3）のための遺伝子セグメントも同様に接合した。

コドン使用頻度を推定することができるヒト軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は、Kabat,E.A.,et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication No 91-3242に与えられている。

抗P-セレクチンHuMabκ軽鎖の転写単位は、以下の要素から構成されている：
−ヒトサイトメガロウイルス（hCMV）由来の前初期エンハンサーおよびプロモーター、
−コザック配列を含む合成5'-UT、
−シグナル配列イントロンを含むマウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−独特のBsmI制限部位が5'末端に、スプライスドナー部位および独特のNotI制限部位が3'末端に配置された、クローニングされた抗P-セレクチンHuMab可変軽鎖cDNA、
−イントロン2マウスIg-κエンハンサーを含むゲノムヒトκ遺伝子定常領域（Picard,D.,and Schaffner,W.Nature 307(1984)80-82）、ならびに
−ヒト免疫グロブリンκポリアデニル化（「ポリA」）シグナル配列。

抗P-セレクチンHuMabγ1重鎖の転写単位は、以下の要素から構成されている：
−ヒトサイトメガロウイルス（hCMV）由来の前初期エンハンサーおよびプロモーター、
−コザック配列を含む合成5'-UT、
−シグナル配列イントロンを含む改変されたマウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−独特のBsmI制限部位が5'末端に、スプライスドナー部位および独特のNotI制限部位が3'末端に配置された、クローニングされた抗P-セレクチンHuMab可変重鎖cDNA、
−マウスIgμ-エンハンサーを含むゲノムヒトγ1重鎖遺伝子定常領域（Neuberger,M.S.,EMBO J.2(1983)1373-1378）、ならびに
−ヒトγ1免疫グロブリンポリアデニル化（「ポリA」）シグナル配列。

抗P-セレクチンHuMabのκ軽鎖またはγ1重鎖の発現カセットに加え、これらのプラスミドは、
−ハイグロマイシン耐性遺伝子、
−エプスタイン・バー（Epstein-Barr）ウイルス（EBV）の複製起点oriP
−大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にするベクターpUC18由来の複製起点、および
−大腸菌におけるアンピシリン耐性を付与するβラクタマーゼ遺伝子
を含有している。

組換えDNA技術
Sambrook et al.,1999（前記）に記載されるような標準的なクローニング技術を使用して、クローニングを実施した。（他に示されない限り）全ての分子生物学的試薬が、市販されているものであり、製造業者の説明書に従って使用された。

核酸合成
異なる遺伝要素のDNAは、Geneart AG（Regensburg）によって合成された。

核酸配列決定
DNA配列は、SequiServe（SequiServe GmbH,Germany）において実施された二本鎖配列決定によって決定された。

DNAおよびタンパク質の配列分析および配列データ管理
Vector NTI Advanceスイートバージョン9.0を、配列の生成、マッピング、分析、アノテーション、および図解のために使用した。

細胞培養技術
CHO-K1細胞を、1×HTサプリメント（Invitrogen Corp.,Gibco（登録商標）、カタログ番号11067-030）が補足されたCD-CHO培地（Invitrogen Corp.,Gibco（登録商標）、カタログ番号10743-011）において培養した。

安定トランスフェクトされたCHO-K1プール／細胞株の選択のため、400〜800μg/ml G418または200〜400μg/mlハイグロマイシンを添加した（Roche Diagnostics GmbH,Roche Applied Sciences,Germany、カタログ番号：843555）。

全ての細胞株を、120〜140rpm/分で絶えず攪拌しながら5％CO₂を含む37℃の加湿されたインキュベーターにおいて維持した。3〜4日毎に、細胞を新鮮な培地へ分割した。培養物の密度および生存能を、Casey TTまたはCedex Hiresセルカウンター（Roche innovates AG,Bielefeld）を使用して決定した。細胞のトランスフェクションを、Amaxaヌクレオフェクションテクノロジー（Lonza GmbH,Germany）によって実施した。

Bonifacino,J.S.,et al.,(eds.),Current Protocols in Cell Biology,John Wiley and Sons,Inc.(2000)に記載されるような標準的な細胞培養技術をさらに適用した。

細胞計数および細胞生存能の決定
（a）電場細胞計数システム（CASY）
CASY（登録商標）Technology Cell Counter、モデルTT（Roche Innovatis AG,Bielefeld）は、細胞計数のために電流を使用する。細胞が低電圧フィールド内の測定孔を通過する時に作出されるシグナルから情報を得るため、パルスエリア解析が使用された。細胞膜の構造的完全性は、細胞生存能の程度である。従って、生存能の決定のために、トリパンブルーのような色素は必要とされない。

（b）自動トリパンブルー排除法（Cedex）
Cedex HiResシステム（Roche Innovatis AG,Bielefeld）を、プール選択における細胞生存能の決定、および自動細胞計数のために使用した。

トリパンブルーは、完全細胞膜を通って細胞に侵入することができない色素である。傷害を受けた細胞膜を有する細胞のみが染色され、死細胞としてマークされる。染色過程、細胞計数、および結果のグラフィカル分析を、デジタル画像認識によって、Cedexシステムによって自動的に実施した。その他の測定パラメータは、細胞サイズ、形態学、および凝集速度である。マルチサンプラーによって、20もの試料を連続的に測定した。

トランスフェクションにおけるプラスミドの正確な比較のためのプラスミド調製および品質チェック
トランスフェクション効率、従って、産生能は、DNAの量および品質のような数種の因子によって強く影響される。各ベクターについての等しい出発条件を保証するため、全てのベクターのDNAの量および品質を、トランスフェクション前に入念にチェックした。

−発現ベクターの同時調製
全てのベクターを、製造業者の説明書に従って、High Speed Maxiプラスミド単離キット（Qiagen GMBH,Hilden）によって同時に調製した。

−フェノール／クロロホルム精製およびエタノール沈殿
全てのベクターを、フェノール／クロロホルム精製によって同時に精製した。各々500μgの直鎖化されたプラスミドDNAを、200μlのトリス緩衝50％(v/v)フェノール、48％(v/v)クロロホルム、2％(v/v)イソアミルアルコール溶液と混合し、13,000rpmで1分間遠心分離した。次いで、上方の水相を新しいチューブへ移し、200μlの96％(v/v)クロロホルム、4％(v/v)イソアミルアルコールと混合し、13,000rpmで1分間遠心分離した。上相を、新しいチューブへ再び移し、1/10（全容積）の3M酢酸ナトリウム（pH5.2）および2.5倍（全容積）の100％エタノールと混合した。反応物を混合し、室温で5分間インキュベートした後、DNAをペレット化するため、混合物を13,000rpmで5分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを900μlの70％(v/v)エタノールによって洗浄し、室温で5分間インキュベートした。5分間の最大スピードでの最後の遠心分離工程の後、上清を廃棄し、ペレットを乾燥させ、滅菌H₂Oに再懸濁させた。

−DNA決定
各ベクターのDNA量を、BioPhotometer（Eppendorf；Hamburg）を使用して決定した。DNA測定は、常に、トリス（pH8.0）での1:20希釈を使用することによって、トリプリケートに実施された。

−アガロースゲル
各プラスミドのDNAの品質を、0.8％アガロースゲル上でチェックした。DNA分解、ベクターコンフォメーション、およびDNA濃度を決定した。比較可能な量および品質（DNA分解なし、類似したスーパーコイル（ccc）型、ゲル上の類似したDNA量）を示すベクターを、一過性トランスフェクションおよび安定トランスフェクションに使用した。

一過性トランスフェクション
全てのベクターを、製造業者の説明書に従って、Amaxa 96ウェルシャトルシステム（Lonza GmbH,Germany）によってCHO-K1細胞にトランスフェクトした。各ベクターを8リプリケートでトランスフェクトした。トランスフェクトされたベクターのDNA量を、1μｇの参照発現プラスミド（p5068またはp5069）により等モル量／コピー数に標準化した。トランスフェクション後4〜7日目に、産生能を決定するため、ワンステップユニバーサルELISA（Dianova）によって、無細胞細胞培養上清をIgG力価について分析した。

Amaxa 96ウェルシャトルシステム：
スピナフラスコにおいて培養したCHO-K1細胞を、850rpmでの5分間の遠心分離によってペレット化し、培養培地に再懸濁させた。環状プラスミドを、1μgの参照発現ベクターp5068またはp5069により等モル濃度で96ウェルヌクレオフェクションプレートに播種した。次いで、細胞を、1ウェル当たり4×10⁵細胞の濃度でプレートへ添加した。トランスフェクションをAmaxaプログラムDN-137によって実施した。細胞をトランスフェクション後10分間インキュベートし、次いで、200μl培養培地を含有している96ウェル平底インキュベーションプレートへ移した。次いで、細胞を静置培養した。トランスフェクション後4〜6日目に、ワンステップユニバーサルELISAを使用して、IgGレベルを決定した。

安定トランスフェクションおよび組換えCHO細胞株の生成
安定トランスフェクションを、製造業者の説明書に従って、ヌクレオフェクションテクノロジー（Amaxa Biosystems,Lonza cologne AG）によって実施した。トランスフェクション前に、プラスミドを制限酵素SgrA Iによって直鎖化した。各プラスミドをデュプリケートまたはトリプリケートにトランスフェクトした。5×10⁶個の細胞および1.2pmolの直鎖化プラスミドを1回のトランスフェクションに使用した（Nucleofector Kit T、AmaxaプログラムA33）。

トランスフェクションのため、細胞をNucleofector溶液Tに再懸濁させ、2mlチューブに等分した。プラスミドの添加の後、パルスを適用することによってトランスフェクションを実施した。次いで、細胞を、余熱された4mlの新鮮培地および4mlの条件培地を含有しているT25組織培養フラスコへ移した。トランスフェクションの24時間後に、250μg/mlハイグロマイシンBを添加することによって選択圧をかけた。

安定プールの生成
ベクターをAmaxaヌクレオフェクションテクノロジーによってCHO-K1細胞へトランスフェクトし、選択剤としてハイグロマイシンBまたはG418を使用して、安定プールを選択した。各トランスフェクションをトリプリケートに実施した。安定プールの生成のため、全てのプラスミドを、SgrA Iによる制限消化によって均一に直鎖化した。AmaxaによるNucleofector Kit Tを、安定トランスフェクションを実施するために使用し、各プラスミドをトリプリケートにトランスフェクトした。

安定プールを以下のように確立した：5×10⁶個の細胞および1.2pmolの直鎖化されたプラスミドを、各トランスフェクションのために使用した。細胞を、溶液Tに再懸濁させ、2mlチューブへ等分した。プラスミドの添加の後、パルスを適用することによってトランスフェクションを実施した（AmaxaプログラムA33）。トランスフェクトされた細胞プールを、余熱された4mlの新鮮培地および4mlの条件培地を含有しているT25組織培養フラスコにおいて静置培養した。

トランスフェクションの24時間後に、選択圧をかけた：細胞を800rpmで5分間遠心分離し、300μg/mlハイグロマイシンBを含有している3mlの培養培地に再懸濁させた。トランスフェクションの3日後に、細胞を平底6ウェルプレートへ移した。次いで、細胞生存能が最低になり、再び99％を超えて上昇するまで、細胞を2週間培養した。細胞の数および生存能をCedex HiResシステム（Innovatis,Bielefeld）によって絶えず決定した。培養中、細胞片を遠心分離によって除去し、細胞を常に3mlの新鮮培地に再懸濁させた。

Caliperロボットシステムを使用した安定クローンの生成
ベクターを上記のようにCHO-K1細胞へトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に、選択圧をかけ（ハイグロマイシンBまたはG418）、自動ハイスループットクローン単離システム（Sciclone ALH 3000 workstation,Caliper Life Sciences GmbH,Mainz）を使用して、1ウェル当たり350〜700細胞の濃度で384ウェル平底プレートへ細胞を播種した。

10〜14日後、ELISAに基づくウルトラハイスループットスクリーニング（ELSIA uHTS）を使用して、384ウェルプレートをIgGレベルについてスクリーニングした。一次スクリーニングから、最良の産生クローンを選び、平底96ウェルプレートへ移した。3〜6日後、細胞をIgGレベルについて二次スクリーニングした。再び、最良の産生クローンを選び、平底24ウェルプレートへ手動で移した。さらなるELISAに基づくスクリーニング工程の後、最良のクローンを選び、平底6ウェルプレートに移した。振とうされた6ウェルプレートにおけるバッチ培養のための最終的な最良のクローンを同定するため、6ウェルプレートにおけるIgGレベルを、ProtA測定によって決定した。

プール／単一クローンのバッチ分析
産生能および安定性の差を検出するため、Caseyセルカウンターを使用してクローン／プールの細胞数を計数し、3×10⁵細胞/mlの濃度および3.0mlの全容積で平底6ウェルプレートに均一に播種した。全てのバッチ培養物を12日間培養し、4日目、7日目、9日目、11日目、または12日目に、細胞培養上清をヒトIgGレベルについてスクリーニングした。

IgG定量化
一過性実験およびスクリーニングフォーマット（384ウェル〜24ウェル）におけるIgG力価を、ワンステップユニバーサルELISAを使用することによって決定した。バッチ実験における安定プールおよび安定単一クローンの産生能を、プロテインA HPLCによって決定した。

ワンステップユニバーサルELISA
ワンステップユニバーサルELISA（Dianova）を、細胞培養上清からのヒトIgGレベルを決定するために使用した。希釈緩衝液（PBS＋5％(w/v)RPLA1）を使用した、0.3125〜20ng/mlの範囲の抗P-セレクチン抗体（F.Hoffmann-La Roche AG,Basle,Switzerland）の段階希釈を使用して、標準曲線を調製した。0.5μg/mlビオチン化F(ab')₂-抗ヒトFc抗体（Jackson laboratories）および0.1μg/mlペルオキシダーゼ標識F(ab')₂-抗ヒトFcγ抗体（Jackson laboratories；Suffolk）を含有している95μlの抗体ミックスを、ストレプトアビジンによってコーティングされた96ウェルMTP（StreptaWell,Roche Diagnostics GmbH）へ添加した。1:20,000希釈の細胞培養上清5μlを、プレートへ添加し、1時間インキュベートした。抗体によってコーティングされたプレートを、200μlの洗浄緩衝液（PBS＋0.05％(v/v)Tween²⁰）によって3回洗浄した。100μlのABTS（Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany）をプレートへ添加し、492nmの参照波長で、405nmにおいて吸光度を測定した。

ProtA測定
バッチ分析のIgG力価は、ワンステップユニバーサルELISAと組み合わせられたHPLCに基づくクロマトグラフィを使用して、プロテインAによって決定された。

FACS
安定トランスフェクトまたは一過性トランスフェクトされた細胞の（GFP発現細胞に基づく）トランスフェクション効率またはGFP発現レベルを決定するため、蛍光標示式細胞ソートを使用した。一般に、各クローンまたは各プールの5×10⁶個の細胞を、FACSCalibur Flow Cytometer（BD Biosciences,San Diego,CA）を使用して測定した。前方散乱および側方散乱のデータを、細胞サイズ、生存能、および細胞形態学を決定するために使用した。

一つの態様において、EV71-IRESは、SEQ ID NO:17の配列を有する。
[本発明1001]
−抗体軽鎖発現カセット、
−抗体重鎖発現カセット、および
−選択マーカー発現カセット
を含み、発現カセットが一方向に配置されており、かつ発現カセットが、5'から3'へ、抗体重鎖発現カセット、抗体軽鎖発現カセット、および選択マーカー発現カセットの順に配置されている、発現ベクター。
[本発明1002]
抗体軽鎖発現カセットおよび／または抗体重鎖発現カセットおよび／または選択マーカー発現カセットが、ヒト伸長因子1αプロモーター、ヒトCMVプロモーター、およびSV40プロモーターから選択されるプロモーターを相互に独立に含むことを特徴とする、本発明1001に記載の発現ベクター。
[本発明1003]
1種、2種、または3種全ての発現カセットが、ヒト伸長因子1αプロモーターを含むことを特徴とする、本発明1001または本発明1002に記載の発現ベクター。
[本発明1004]
抗体軽鎖発現カセットおよび／または抗体重鎖発現カセットおよび／または選択マーカー発現カセットが、ヒト伸長因子1αプロモーターを相互に独立に含むことを特徴とする、本発明1001〜1003のいずれかに記載の発現ベクター。
[本発明1005]
発現カセットが、ターミネーター配列を含まないことを特徴とする、本発明1001〜1004のいずれかに記載の発現ベクター。
[本発明1006]
ターミネーター配列が、ヒトガストリン遺伝子転写ターミネーター配列（hGT）であることを特徴とする、本発明1005に記載の発現ベクター。
[本発明1007]
1種、2種、または3種全ての発現カセットが、ヒトCMVプロモーターを含むことを特徴とする、本発明1001〜1002のいずれかに記載の発現ベクター。
[本発明1008]
抗体軽鎖発現カセットおよび／または抗体重鎖発現カセットおよび／または選択マーカー発現カセットが、ヒトCMVプロモーターを相互に独立に含むことを特徴とする、本発明1001、1002、および1007のいずれかに記載の発現ベクター。
[本発明1009]
1種、2種、または3種の発現カセットが、ウシ成長ホルモンポリAシグナル配列を含むことを特徴とする、本発明1001〜1004および1007〜1008のいずれかに記載の発現ベクター。
[本発明1010]
抗体軽鎖発現カセットおよび／または抗体重鎖発現カセットおよび／または選択マーカー発現カセットが、ウシ成長ホルモンポリAシグナル配列を相互に独立に含むことを特徴とする、本発明1001〜1004および1007〜1009のいずれかに記載の発現ベクター。
[本発明1011]
抗体軽鎖発現カセットおよび／または抗体重鎖発現カセットおよび／または選択マーカー発現カセットが、ウシ成長ホルモンポリAシグナル配列およびSV40ポリAシグナル配列から選択されるポリAシグナル配列を相互に独立に含むことを特徴とする、本発明1001〜1004および1007〜1010のいずれかに記載の発現ベクター。
[本発明1012]
1種、2種、または3種全ての発現カセットが、ポリAシグナル配列の後にヒトガストリンターミネーター配列を含むことを特徴とする、本発明1001および1007〜1011のいずれかに記載の発現ベクター。
[本発明1013]
抗体軽鎖発現カセットおよび／または抗体重鎖発現カセットおよび／または選択マーカー発現カセットが、ポリAシグナル配列の後にヒトガストリンターミネーター配列を相互に独立に含むことを特徴とする、本発明1001および1007〜1012のいずれかに記載の発現ベクター。
[本発明1014]
抗体軽鎖発現カセットおよび／または抗体重鎖発現カセットおよび／または選択マーカー発現カセットが、5'から3'への方向に、ウシ成長ホルモンポリAシグナル配列およびヒトガストリンターミネーター配列を相互に独立に含むことを特徴とする、本発明1001および1007〜1013のいずれかに記載の発現ベクター。
[本発明1015]
1種、2種、または3種全ての発現カセットのプロモーターが、イントロンAを含むことを特徴とする、本発明1001〜1014のいずれかに記載の発現ベクター。
[本発明1016]
1種、2種、または3種全ての発現カセットが、SV40ポリAシグナル配列を含むことを特徴とする、本発明1001〜1008および1012〜1013のいずれかに記載の発現ベクター。
[本発明1017]
1種、2種、または3種全ての発現カセットが、SV40プロモーターを含むことを特徴とする、本発明1016に記載の発現ベクター。
[本発明1018]
抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸が、少なくとも1個のイントロンを含むことを特徴とする、本発明1001〜1017のいずれかに記載の発現ベクター。
[本発明1019]
抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸が、cDNAであることを特徴とする、本発明1001〜1018のいずれかに記載の発現ベクター。
[本発明1020]
抗体の組換え産生のための、本発明1001〜1019のいずれかに記載の発現ベクターの使用。
[本発明1021]
安定細胞株の生成のための、本発明1001〜1019のいずれかに記載の発現ベクターの使用。
[本発明1022]
産生細胞株の生成のための、本発明1001〜1019のいずれかに記載の発現ベクターの使用。
[本発明1023]
安定細胞株の生成のための、ヒト伸長因子1αプロモーターを含む少なくとも1種の発現カセットを含む本発明1001〜1019のいずれかに記載の発現ベクターの使用。
[本発明1024]
産生細胞株の生成のための、ヒト伸長因子1αプロモーターを含む少なくとも1種の発現カセットを含む本発明1001〜1019のいずれかに記載の発現ベクターの使用。
[本発明1025]
抗体の組換え産生のための、ヒト伸長因子1αプロモーターを含む少なくとも1種の発現カセットを含む本発明1001〜1019のいずれかに記載の発現ベクターの使用。
[本発明1026]
産生細胞株の生成のための、ヒトCMVプロモーターを含む少なくとも1種の発現カセットを含む本発明1001〜1019のいずれかに記載の発現ベクターの使用。
[本発明1027]
安定細胞株の生成のための、ヒトCMVプロモーターを含む少なくとも1種の発現カセットを含む本発明1001〜1019のいずれかに記載の発現ベクターの使用。
[本発明1028]
抗体の産生のための、ヒトCMVプロモーターを含む少なくとも1種の発現カセットを含む本発明1001〜1019のいずれか一項に記載の発現ベクターの使用。
[本発明1029]
発現ベクターが、原核生物複製起点における切断によって、トランスフェクションの前に直鎖化されることを特徴とする、発現ベクターによる真核細胞のトランスフェクションの方法。
[本発明1030]
原核生物複製起点が、抗体軽鎖発現カセットと抗体重鎖発現カセットとの間にあることを特徴とする、本発明1029に記載の方法。
[本発明1031]
発現ベクターが、本発明1001〜1019のいずれかに記載の発現ベクターであることを特徴とする、本発明1029〜1030のいずれかに記載の方法。
[本発明1032]
トランスフェクションの約24時間後に初めて培養培地へ選択剤が添加されることを特徴とする、抗体をコードする核酸を含む真核細胞の選択の方法。
[本発明1033]
抗体をコードする核酸が、本発明1001〜1019のいずれかに記載の発現ベクターに含まれていることを特徴とする、本発明1032に記載の方法。
[本発明1034]
抗体の組換え産生のための真核細胞の生成のための、本発明1032〜1033のいずれかに記載の方法の使用。
[本発明1035]
抗体の組換え産生のための、本発明1032〜1033のいずれかに記載の方法によって選択された細胞の使用。
[本発明1036]
以下の工程を含む、抗体の産生の方法：
−本発明1001〜1019のいずれかに記載の発現ベクターによってトランスフェクトされた真核細胞を培養する工程、および
−細胞または培養培地から抗体を回収する工程。
[本発明1037]
以下の工程を含む、抗体の産生の方法：
−原核生物複製起点における切断によってトランスフェクションの前に直鎖化された抗体をコードする発現ベクターによるトランスフェクションによって入手された真核細胞を培養する工程、および
−細胞または培養培地から抗体を回収する工程。
[本発明1038]
以下の工程を含む、抗体の産生の方法：
−トランスフェクションの約24時間後の培養物への選択剤の添加によって選択された抗体をコードする発現ベクターによってトランスフェクトされた真核細胞を培養する工程、および
−細胞または培養培地から抗体を回収する工程。
[本発明1039]
原核生物核酸配列および真核生物核酸配列を含む、抗体をコードする発現ベクターによる真核細胞のトランスフェクションの方法であって、原核生物核酸配列が、発現ベクターによる真核細胞のトランスフェクションの前に発現ベクターから除去されることを特徴とする、方法。
[本発明1040]
抗体をコードする発現ベクターが、本発明1001〜1019のいずれかに記載の発現ベクターであることを特徴とする、本発明1037〜1039のいずれかに記載の方法。
[本発明1041]
真核細胞のトランスフェクションのための、原核生物核酸配列を含まない抗体をコードする直鎖化された発現ベクターの使用。
[本発明1042]
抗体の組換え産生のための真核細胞の生成のための、真核生物核酸配列のみを含む抗体をコードする発現ベクターの使用。
[本発明1043]
抗体をコードする発現ベクターが、本発明1001〜1019のいずれかに記載の発現ベクターであることを特徴とする、本発明1035、1041、1042のいずれかに記載の使用。
[本発明1044]
二特異性抗体をコードすることを特徴とする、本発明1001〜1019のいずれかに記載の発現ベクター。
[本発明1045]
二特異性抗体が、第一の抗原または第一の抗原上の第一のエピトープに特異的に結合する第一の結合特異性または結合部位を有し、かつ第二の抗原または第二の抗原上の第二のエピトープに特異的に結合する第二の結合特異性または結合部位を有することを特徴とする、本発明1044に記載の発現ベクター。
[本発明1046]
発現ベクターが、
−5'から3'への方向に、プロモーター、第一の抗体軽鎖をコードする核酸、ポリAシグナル配列を含み、かつ任意で、ターミネーター配列を含む第一の発現カセット、
−5'から3'への方向に、プロモーター、第二の抗体軽鎖をコードする核酸、ポリAシグナル配列を含み、かつ任意で、ターミネーター配列を含む第二の発現カセット、
−5'から3'への方向に、プロモーター、第一の抗体重鎖をコードする核酸、ポリAシグナル配列を含み、かつ任意で、ターミネーター配列を含む第三の発現カセット、
−5'から3'への方向に、プロモーター、第二の抗体重鎖をコードする核酸、ポリAシグナル配列を含み、かつ任意で、ターミネーター配列を含む第四の発現カセット
または
−5'から3'への方向に、プロモーター、抗体軽鎖をコードする核酸、ポリAシグナル配列を含み、かつ任意で、ターミネーター配列を含む第一の発現カセットであって、ここで抗体軽鎖が両方の抗体重鎖に共通の軽鎖である、第一の発現カセット、
−5'から3'への方向に、プロモーター、第一の抗体重鎖をコードする核酸、ポリAシグナル配列を含み、かつ任意で、ターミネーター配列を含む第二の発現カセット、および
−5'から3'への方向に、プロモーター、第二の抗体重鎖をコードする核酸、ポリAシグナル配列を含み、かつ任意で、ターミネーター配列を含む第三の発現カセット
のいずれかを含むことを特徴とする、本発明1001〜1019および1044〜1045のいずれかに記載の発現ベクター。
[本発明1047]
−抗体軽鎖発現カセット、
−第一の抗体重鎖発現カセット、
−第二の抗体重鎖発現カセット、および
−選択マーカー発現カセット
を含み、抗体重鎖発現カセットの少なくとも一方および抗体軽鎖発現カセットおよび選択マーカー発現カセットが、一方向に配置されており、かつ
一方向の発現カセットが、5'から3'へ、抗体重鎖発現カセット、抗体軽鎖発現カセット、および選択マーカー発現カセットの順に配置されていることを特徴とする、本発明1001〜1019および1044〜1046のいずれかに記載の発現ベクター。
[本発明1048]
−第一の抗体軽鎖発現カセット、
−第二の抗体軽鎖発現カセット、
−第一の抗体重鎖発現カセット、
−第二の抗体重鎖発現カセット、および
−選択マーカー発現カセット
を含み、抗体重鎖発現カセットの一方および抗体軽鎖発現カセットの一方および選択マーカー発現カセットが、一方向に配置されており、かつ
一方向の発現カセットが、5'から3'へ、抗体重鎖発現カセット、抗体軽鎖発現カセット、および選択マーカー発現カセットの順に配置されていることを特徴とする、本発明1001〜1019および1044〜1046のいずれかに記載の発現ベクター。
[本発明1049]
抗体重鎖発現カセットの一方が、ホール変異を含む抗体重鎖をコードすることを特徴とする、本発明1044〜1048のいずれかに記載の発現ベクター。
[本発明1050]
抗体重鎖発現カセットの一方が、ノブ変異を含む抗体重鎖をコードすることを特徴とする、本発明1044〜1049のいずれかに記載の発現ベクター。
[本発明1051]
抗体軽鎖発現カセットの一方が、抗体軽鎖可変ドメインおよび定常ドメインとしての抗体重鎖CH1ドメインを含む抗体軽鎖バリアントをコードし、かつ／または抗体軽鎖発現カセットの一方が、抗体軽鎖可変ドメインおよび定常ドメインとしての抗体軽鎖CLドメインを含む抗体軽鎖をコードすることを特徴とする、本発明1044〜1050のいずれかに記載の発現ベクター。
[本発明1052]
抗体重鎖発現カセットの一方が、第一定常ドメインとして抗体軽鎖定常ドメイン（CL）を含む抗体重鎖バリアントをコードし、かつ／または抗体重鎖発現カセットの一方が、第一定常ドメインとして抗体重鎖CH1ドメインを含む抗体重鎖をコードすることを特徴とする、本発明1044〜1051のいずれかに記載の発現ベクター。

Claims (52)

1. −抗体軽鎖発現カセット、
   −抗体重鎖発現カセット、および
   −選択マーカー発現カセット
   を含み、発現カセットが一方向に配置されており、かつ発現カセットが、5'から3'へ、抗体重鎖発現カセット、抗体軽鎖発現カセット、および選択マーカー発現カセットの順に配置されている、発現ベクター。
2. 抗体軽鎖発現カセットおよび／または抗体重鎖発現カセットおよび／または選択マーカー発現カセットが、ヒト伸長因子1αプロモーター、ヒトCMVプロモーター、およびSV40プロモーターから選択されるプロモーターを相互に独立に含むことを特徴とする、請求項1に記載の発現ベクター。
3. 1種、2種、または3種全ての発現カセットが、ヒト伸長因子1αプロモーターを含むことを特徴とする、請求項1または2に記載の発現ベクター。
4. 抗体軽鎖発現カセットおよび／または抗体重鎖発現カセットおよび／または選択マーカー発現カセットが、ヒト伸長因子1αプロモーターを相互に独立に含むことを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の発現ベクター。
5. 発現カセットが、ターミネーター配列を含まないことを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載の発現ベクター。
6. ターミネーター配列が、ヒトガストリン遺伝子転写ターミネーター配列（hGT）であることを特徴とする、請求項5に記載の発現ベクター。
7. 1種、2種、または3種全ての発現カセットが、ヒトCMVプロモーターを含むことを特徴とする、請求項1〜2のいずれかに記載の発現ベクター。
8. 抗体軽鎖発現カセットおよび／または抗体重鎖発現カセットおよび／または選択マーカー発現カセットが、ヒトCMVプロモーターを相互に独立に含むことを特徴とする、請求項1、2、および7のいずれか一項に記載の発現ベクター。
9. 1種、2種、または3種の発現カセットが、ウシ成長ホルモンポリAシグナル配列を含むことを特徴とする、請求項1〜4および7〜8のいずれか一項に記載の発現ベクター。
10. 抗体軽鎖発現カセットおよび／または抗体重鎖発現カセットおよび／または選択マーカー発現カセットが、ウシ成長ホルモンポリAシグナル配列を相互に独立に含むことを特徴とする、請求項1〜4および7〜9のいずれか一項に記載の発現ベクター。
11. 抗体軽鎖発現カセットおよび／または抗体重鎖発現カセットおよび／または選択マーカー発現カセットが、ウシ成長ホルモンポリAシグナル配列およびSV40ポリAシグナル配列から選択されるポリAシグナル配列を相互に独立に含むことを特徴とする、請求項1〜4および7〜10のいずれか一項に記載の発現ベクター。
12. 1種、2種、または3種全ての発現カセットが、ポリAシグナル配列の後にヒトガストリンターミネーター配列を含むことを特徴とする、請求項1および7〜11のいずれか一項に記載の発現ベクター。
13. 抗体軽鎖発現カセットおよび／または抗体重鎖発現カセットおよび／または選択マーカー発現カセットが、ポリAシグナル配列の後にヒトガストリンターミネーター配列を相互に独立に含むことを特徴とする、請求項1および7〜12のいずれか一項に記載の発現ベクター。
14. 抗体軽鎖発現カセットおよび／または抗体重鎖発現カセットおよび／または選択マーカー発現カセットが、5'から3'への方向に、ウシ成長ホルモンポリAシグナル配列およびヒトガストリンターミネーター配列を相互に独立に含むことを特徴とする、請求項1および7〜13のいずれか一項に記載の発現ベクター。
15. 1種、2種、または3種全ての発現カセットのプロモーターが、イントロンAを含むことを特徴とする、請求項1〜14のいずれか一項に記載の発現ベクター。
16. 1種、2種、または3種全ての発現カセットが、SV40ポリAシグナル配列を含むことを特徴とする、請求項1〜8および12〜13のいずれか一項に記載の発現ベクター。
17. 1種、2種、または3種全ての発現カセットが、SV40プロモーターを含むことを特徴とする、請求項16に記載の発現ベクター。
18. 抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸が、少なくとも1個のイントロンを含むことを特徴とする、請求項1〜17のいずれか一項に記載の発現ベクター。
19. 抗体軽鎖をコードする核酸および／または抗体重鎖をコードする核酸が、cDNAであることを特徴とする、請求項1〜18のいずれか一項に記載の発現ベクター。
20. 抗体の組換え産生のための、請求項1〜19のいずれか一項に記載の発現ベクターの使用。
21. 安定細胞株の生成のための、請求項1〜19のいずれか一項に記載の発現ベクターの使用。
22. 産生細胞株の生成のための、請求項1〜19のいずれか一項に記載の発現ベクターの使用。
23. 安定細胞株の生成のための、ヒト伸長因子1αプロモーターを含む少なくとも1種の発現カセットを含む請求項1〜19のいずれか一項に記載の発現ベクターの使用。
24. 産生細胞株の生成のための、ヒト伸長因子1αプロモーターを含む少なくとも1種の発現カセットを含む請求項1〜19のいずれか一項に記載の発現ベクターの使用。
25. 抗体の組換え産生のための、ヒト伸長因子1αプロモーターを含む少なくとも1種の発現カセットを含む請求項1〜19のいずれか一項に記載の発現ベクターの使用。
26. 産生細胞株の生成のための、ヒトCMVプロモーターを含む少なくとも1種の発現カセットを含む請求項1〜19のいずれか一項に記載の発現ベクターの使用。
27. 安定細胞株の生成のための、ヒトCMVプロモーターを含む少なくとも1種の発現カセットを含む請求項1〜19のいずれか一項に記載の発現ベクターの使用。
28. 抗体の産生のための、ヒトCMVプロモーターを含む少なくとも1種の発現カセットを含む請求項1〜19のいずれか一項に記載の発現ベクターの使用。
29. 発現ベクターが、原核生物複製起点における切断によって、トランスフェクションの前に直鎖化されることを特徴とする、発現ベクターによる真核細胞のトランスフェクションの方法。
30. 原核生物複製起点が、抗体軽鎖発現カセットと抗体重鎖発現カセットとの間にあることを特徴とする、請求項29に記載の方法。
31. 発現ベクターが、請求項1〜19のいずれか一項に記載の発現ベクターであることを特徴とする、請求項29〜30のいずれかに記載の方法。
32. トランスフェクションの約24時間後に初めて培養培地へ選択剤が添加されることを特徴とする、抗体をコードする核酸を含む真核細胞の選択の方法。
33. 抗体をコードする核酸が、請求項1〜19のいずれか一項に記載の発現ベクターに含まれていることを特徴とする、請求項32に記載の方法。
34. 抗体の組換え産生のための真核細胞の生成のための、請求項32〜33のいずれかに記載の方法の使用。
35. 抗体の組換え産生のための、請求項32〜33のいずれかに記載の方法によって選択された細胞の使用。
36. 以下の工程を含む、抗体の産生の方法：
    −請求項1〜19のいずれか一項に記載の発現ベクターによってトランスフェクトされた真核細胞を培養する工程、および
    −細胞または培養培地から抗体を回収する工程。
37. 以下の工程を含む、抗体の産生の方法：
    −原核生物複製起点における切断によってトランスフェクションの前に直鎖化された抗体をコードする発現ベクターによるトランスフェクションによって入手された真核細胞を培養する工程、および
    −細胞または培養培地から抗体を回収する工程。
38. 以下の工程を含む、抗体の産生の方法：
    −トランスフェクションの約24時間後の培養物への選択剤の添加によって選択された抗体をコードする発現ベクターによってトランスフェクトされた真核細胞を培養する工程、および
    −細胞または培養培地から抗体を回収する工程。
39. 原核生物核酸配列および真核生物核酸配列を含む、抗体をコードする発現ベクターによる真核細胞のトランスフェクションの方法であって、原核生物核酸配列が、発現ベクターによる真核細胞のトランスフェクションの前に発現ベクターから除去されることを特徴とする、方法。
40. 抗体をコードする発現ベクターが、請求項1〜19のいずれか一項に記載の発現ベクターであることを特徴とする、請求項37〜39のいずれか一項に記載の方法。
41. 真核細胞のトランスフェクションのための、原核生物核酸配列を含まない抗体をコードする直鎖化された発現ベクターの使用。
42. 抗体の組換え産生のための真核細胞の生成のための、真核生物核酸配列のみを含む抗体をコードする発現ベクターの使用。
43. 抗体をコードする発現ベクターが、請求項1〜19のいずれか一項に記載の発現ベクターであることを特徴とする、請求項35、41、42のいずれか一項に記載の使用。
44. 二特異性抗体をコードすることを特徴とする、請求項1〜19のいずれか一項に記載の発現ベクター。
45. 二特異性抗体が、第一の抗原または第一の抗原上の第一のエピトープに特異的に結合する第一の結合特異性または結合部位を有し、かつ第二の抗原または第二の抗原上の第二のエピトープに特異的に結合する第二の結合特異性または結合部位を有することを特徴とする、請求項44に記載の発現ベクター。
46. 発現ベクターが、
    −5'から3'への方向に、プロモーター、第一の抗体軽鎖をコードする核酸、ポリAシグナル配列を含み、かつ任意で、ターミネーター配列を含む第一の発現カセット、
    −5'から3'への方向に、プロモーター、第二の抗体軽鎖をコードする核酸、ポリAシグナル配列を含み、かつ任意で、ターミネーター配列を含む第二の発現カセット、
    −5'から3'への方向に、プロモーター、第一の抗体重鎖をコードする核酸、ポリAシグナル配列を含み、かつ任意で、ターミネーター配列を含む第三の発現カセット、
    −5'から3'への方向に、プロモーター、第二の抗体重鎖をコードする核酸、ポリAシグナル配列を含み、かつ任意で、ターミネーター配列を含む第四の発現カセット
    または
    −5'から3'への方向に、プロモーター、抗体軽鎖をコードする核酸、ポリAシグナル配列を含み、かつ任意で、ターミネーター配列を含む第一の発現カセットであって、ここで抗体軽鎖が両方の抗体重鎖に共通の軽鎖である、第一の発現カセット、
    −5'から3'への方向に、プロモーター、第一の抗体重鎖をコードする核酸、ポリAシグナル配列を含み、かつ任意で、ターミネーター配列を含む第二の発現カセット、および
    −5'から3'への方向に、プロモーター、第二の抗体重鎖をコードする核酸、ポリAシグナル配列を含み、かつ任意で、ターミネーター配列を含む第三の発現カセット
    のいずれかを含むことを特徴とする、請求項1〜19および44〜45のいずれか一項に記載の発現ベクター。
47. −抗体軽鎖発現カセット、
    −第一の抗体重鎖発現カセット、
    −第二の抗体重鎖発現カセット、および
    −選択マーカー発現カセット
    を含み、抗体重鎖発現カセットの少なくとも一方および抗体軽鎖発現カセットおよび選択マーカー発現カセットが、一方向に配置されており、かつ
    一方向の発現カセットが、5'から3'へ、抗体重鎖発現カセット、抗体軽鎖発現カセット、および選択マーカー発現カセットの順に配置されていることを特徴とする、請求項1〜19および44〜46のいずれか一項に記載の発現ベクター。
48. −第一の抗体軽鎖発現カセット、
    −第二の抗体軽鎖発現カセット、
    −第一の抗体重鎖発現カセット、
    −第二の抗体重鎖発現カセット、および
    −選択マーカー発現カセット
    を含み、抗体重鎖発現カセットの一方および抗体軽鎖発現カセットの一方および選択マーカー発現カセットが、一方向に配置されており、かつ
    一方向の発現カセットが、5'から3'へ、抗体重鎖発現カセット、抗体軽鎖発現カセット、および選択マーカー発現カセットの順に配置されていることを特徴とする、請求項1〜19および44〜46のいずれか一項に記載の発現ベクター。
49. 抗体重鎖発現カセットの一方が、ホール変異を含む抗体重鎖をコードすることを特徴とする、請求項44〜48のいずれか一項に記載の発現ベクター。
50. 抗体重鎖発現カセットの一方が、ノブ変異を含む抗体重鎖をコードすることを特徴とする、請求項44〜49のいずれか一項に記載の発現ベクター。
51. 抗体軽鎖発現カセットの一方が、抗体軽鎖可変ドメインおよび定常ドメインとしての抗体重鎖CH1ドメインを含む抗体軽鎖バリアントをコードし、かつ／または抗体軽鎖発現カセットの一方が、抗体軽鎖可変ドメインおよび定常ドメインとしての抗体軽鎖CLドメインを含む抗体軽鎖をコードすることを特徴とする、請求項44〜50のいずれか一項に記載の発現ベクター。
52. 抗体重鎖発現カセットの一方が、第一定常ドメインとして抗体軽鎖定常ドメイン（CL）を含む抗体重鎖バリアントをコードし、かつ／または抗体重鎖発現カセットの一方が、第一定常ドメインとして抗体重鎖CH1ドメインを含む抗体重鎖をコードすることを特徴とする、請求項44〜51のいずれか一項に記載の発現ベクター。

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