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Description
下記の実施例では、本発明をより詳細に説明する。以下の調製物および実施例は、当業者が本発明をより明瞭に理解し、実行できるようにするために与えられる。しかしながら、本発明は、例示される態様によって範囲を限定されず、これらの態様は本発明の個別の局面の例証として意図されるにすぎず、機能的に等価である方法は本発明の範囲内にある。実際、本明細書において説明するもの以外の本発明の様々な改変法が、前述の説明および添付図から当業者には明らかになると考えられる。このような改変法は、添付の特許請求の範囲に含まれると意図される。この後の説明のために、図面の凡例について以下に言及する。
[請求項1001]
細胞において関心対象の組換えタンパク質の発現を引き起こすことができるプロモーター配列に機能的に連結された、該タンパク質をコードする核酸配列を含む少なくとも1つの発現カセットを含む少なくとも1つの発現ベクターをトランスフェクトされた、トリEBx(登録商標)細胞。
[請求項1002]
発現ベクターが、宿主細胞において選択マーカーの発現を引き起こすことができるプロモーター配列に機能的に連結された、該選択マーカーをコードする少なくとも1つの核酸配列を含む少なくとも1つの発現カセットをさらに含む、請求項1001記載のEBx(登録商標)細胞。
[請求項1003]
選択マーカーが、グルタミン合成酵素、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ピューロマイシン、ハイグロマイシンB、ネオマイシン遺伝子、およびジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)より選択される、請求項1001および1002のいずれか一項記載のEBx(登録商標)細胞。
[請求項1004]
プロモーター配列が、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、サルウイルス40(SV40)初期プロモーター、単純ヘルペスウイルス(HSV)チミジンキナーゼプロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、マウスホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、eIF4αプロモーター、キメラEF1α/HTLVプロモーター、CAGプロモーター、β-アクチンプロモーターより選択される、請求項1003記載のEBx(登録商標)細胞。
[請求項1005]
発現カセットが、転写開始配列、エンハンサー配列、イントロン配列、ポリアデニル化配列、終結配列、クロマチンインスレーターエレメントからなる群より選択される、1つまたは複数の制御エレメントまたは調節配列をさらに含む、請求項1001および1004のいずれか一項記載のEBx(登録商標)細胞。
[請求項1006]
クロマチンインスレーターエレメントが、バウンダリーエレメント(BE)、マトリックス結合領域(MAR)、遺伝子座調節領域(LCR)、普遍的クロマチンオープニングエレメント(UCOE)より選択される、請求項1005記載のEBx(登録商標)細胞。
[請求項1007]
発現ベクターが少なくとも以下を含む、請求項1001〜1006のいずれか一項記載のEBx(登録商標)細胞:
次のDNA配列を次の順序で含む第1の発現カセット:配列番号1のCMVプロモーター配列、イントロン配列、関心対象の組換えタンパク質をコードするcDNA配列、ポリアデニル化配列、および
次のDNA配列を次の順序で含む第2の発現カセット:SV40プロモーター、ネオマイシン遺伝子、ポリアデニル化配列。
[請求項1008]
発現ベクターが少なくとも以下を含む、請求項1001〜1006のいずれか一項記載のEBx(登録商標)細胞:
次のDNA配列を次の順序で含む第1の発現カセット:配列番号2のキメラEF1α/HTLVプロモーター配列、イントロン配列、関心対象の組換えタンパク質をコードするcDNA配列、ポリアデニル化配列、および
次のDNA配列を次の順序で含む第2の発現カセット:SV40プロモーター、ネオマイシン遺伝子、ポリアデニル化配列。
[請求項1009]
発現ベクターが少なくとも以下を次の順序で含む、請求項1001〜1006のいずれか一項記載のEBx(登録商標)細胞:
次のDNA配列を次の順序で含む第1の発現カセット:配列番号1のCMVプロモーター、イントロン配列、抗体の重鎖またはその断片をコードするcDNA配列、ポリアデニル化配列;
次のDNA配列を次の順序で含む第2の発現カセット:配列番号1のCMVプロモーター、イントロン配列、抗体の軽鎖またはその断片をコードするcDNA配列、ポリアデニル化配列;
次のDNA配列を次の順序で含む第3の発現カセット:SV40プロモーター、ネオマイシン遺伝子、ポリアデニル化配列。
[請求項1010]
発現ベクターが少なくとも以下を次の順序で含む、請求項1001〜1006のいずれか一項記載のEBx(登録商標)細胞:
次のDNA配列を次の順序で含む第1の発現カセット:配列番号2のキメラEF1α/HTLVプロモーター、イントロン配列、抗体の重鎖またはその断片をコードするcDNA配列、ポリアデニル化配列;
次のDNA配列を次の順序で含む第2の発現カセット:配列番号2のキメラEF1α/HTLVプロモーター、イントロン配列、抗体の軽鎖またはその断片をコードするcDNA配列、ポリアデニル化配列;
次のDNA配列を次の順序で含む第3の発現カセット:SV40プロモーター、ネオマイシン遺伝子、ポリアデニル化配列。
[請求項1011]
細胞において抗アポトーシスタンパク質の発現を引き起こすことができるプロモーター配列に機能的に連結された、該抗アポトーシスタンパク質をコードするDNA配列を含む少なくとも1つの発現カセットを含む発現ベクターをさらに含む、請求項1001〜1010のいずれか一項記載のEBx(登録商標)細胞。
[請求項1012]
抗アポトーシスタンパク質が、ニワトリNR13タンパク質である、請求項1011記載のEBx(登録商標)細胞。
[請求項1013]
細胞の染色体DNAに発現ベクターが安定に組み込まれる、請求項1001〜1012のいずれか一項記載のEBx(登録商標)細胞。
[請求項1014]
EB14細胞およびEBv13細胞より選択されるニワトリEBx(登録商標)細胞であり、かつEB24、EB24-12、EB26、およびEB66より選択されるアヒルEBx細胞である、請求項1001〜1013のいずれか一項記載のEBx(登録商標)細胞。
[請求項1015]
無血清培地に順応させた浮遊EBx(登録商標)細胞である、請求項1014記載のEBx(登録商標)細胞。
[請求項1016]
無血清培地に順応させた接着EBx(登録商標)細胞である、請求項1014記載のEBx(登録商標)細胞。
[請求項1017]
以下の段階を含む、トリEBx(登録商標)細胞において少なくとも1種の関心対象の生物学的産物を産生させるための方法:
(a)少なくとも1つの発現ベクターをトランスフェクションすることによって、請求項1001〜1016のいずれか一項記載のEBx(登録商標)細胞を調製する段階;
(b)該EBx(登録商標)細胞を、適切な条件下で、かつ適切な培地中で培養する段階;および
(c)該EBx(登録商標)細胞、該適切な培地、または該EBx(登録商標)細胞および該培地の両方から、関心対象の生物学的産物を回収する段階。
[請求項1018]
エレクトロポレーションにより、無血清培地中での接着培養において少なくとも1つの発現ベクターをEBx(登録商標)細胞にトランスフェクトする、請求項1017記載の方法。
[請求項1019]
リポソームを介したトランスフェクションにより、無血清培地中での浮遊培養において少なくとも1つの発現ベクターをEBx(登録商標)細胞にトランスフェクトする、請求項1017記載の方法。
[請求項1020]
関心対象の生物学的産物が、抗体分子、抗体断片、または免疫グロブリンのFc領域に等価な領域を含む融合タンパク質であり、Fcを介した増加した細胞毒性を有する、請求項1017〜1019のいずれか一項記載の方法。
[請求項1021]
ニワトリEBx(登録商標)グリコシル化またはアヒルEBx(登録商標)グリコシル化を有する、関心対象の生物学的産物。
[請求項1022]
EBx(登録商標)細胞において産生され、かつEBx(登録商標)グリコシル化を有する抗体集団であって、該抗体集団またはその断片が、末端GlcNacを有し、高度にガラクトシル化された長鎖を含み、かつ強いADCC活性を該抗体に与える共通の2分岐型N結合型フコシル化オリゴ糖構造体を有する抗体を高比率で含むFc領域を含む、抗体集団。
[請求項1023]
EBx(登録商標)細胞において産生され、かつハイブリドーマ細胞またはCHO細胞において産生された同じ抗体と比べて増加したADCC活性を有する、IgG1サブタイプまたはIgG3サブタイプの請求項1022記載の抗体。
[請求項1024]
薬剤としての、請求項1021記載の関心対象の生物学的産物。
[請求項1025]
薬剤としての、請求項1022および1023のいずれか一項記載の抗体またはその断片。
[請求項1026]
ヒトおよび動物の疾患を予防または治療するための薬学的組成物の調製のための、請求項1024記載の生物学的産物または請求項1025記載の抗体もしくはその断片の使用。
[請求項1027]
請求項1024記載の生物学的産物または請求項1025記載の抗体もしくはその断片、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
[請求項1001]
細胞において関心対象の組換えタンパク質の発現を引き起こすことができるプロモーター配列に機能的に連結された、該タンパク質をコードする核酸配列を含む少なくとも1つの発現カセットを含む少なくとも1つの発現ベクターをトランスフェクトされた、トリEBx(登録商標)細胞。
[請求項1002]
発現ベクターが、宿主細胞において選択マーカーの発現を引き起こすことができるプロモーター配列に機能的に連結された、該選択マーカーをコードする少なくとも1つの核酸配列を含む少なくとも1つの発現カセットをさらに含む、請求項1001記載のEBx(登録商標)細胞。
[請求項1003]
選択マーカーが、グルタミン合成酵素、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ピューロマイシン、ハイグロマイシンB、ネオマイシン遺伝子、およびジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)より選択される、請求項1001および1002のいずれか一項記載のEBx(登録商標)細胞。
[請求項1004]
プロモーター配列が、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、サルウイルス40(SV40)初期プロモーター、単純ヘルペスウイルス(HSV)チミジンキナーゼプロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、マウスホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、eIF4αプロモーター、キメラEF1α/HTLVプロモーター、CAGプロモーター、β-アクチンプロモーターより選択される、請求項1003記載のEBx(登録商標)細胞。
[請求項1005]
発現カセットが、転写開始配列、エンハンサー配列、イントロン配列、ポリアデニル化配列、終結配列、クロマチンインスレーターエレメントからなる群より選択される、1つまたは複数の制御エレメントまたは調節配列をさらに含む、請求項1001および1004のいずれか一項記載のEBx(登録商標)細胞。
[請求項1006]
クロマチンインスレーターエレメントが、バウンダリーエレメント(BE)、マトリックス結合領域(MAR)、遺伝子座調節領域(LCR)、普遍的クロマチンオープニングエレメント(UCOE)より選択される、請求項1005記載のEBx(登録商標)細胞。
[請求項1007]
発現ベクターが少なくとも以下を含む、請求項1001〜1006のいずれか一項記載のEBx(登録商標)細胞:
次のDNA配列を次の順序で含む第1の発現カセット:配列番号1のCMVプロモーター配列、イントロン配列、関心対象の組換えタンパク質をコードするcDNA配列、ポリアデニル化配列、および
次のDNA配列を次の順序で含む第2の発現カセット:SV40プロモーター、ネオマイシン遺伝子、ポリアデニル化配列。
[請求項1008]
発現ベクターが少なくとも以下を含む、請求項1001〜1006のいずれか一項記載のEBx(登録商標)細胞:
次のDNA配列を次の順序で含む第1の発現カセット:配列番号2のキメラEF1α/HTLVプロモーター配列、イントロン配列、関心対象の組換えタンパク質をコードするcDNA配列、ポリアデニル化配列、および
次のDNA配列を次の順序で含む第2の発現カセット:SV40プロモーター、ネオマイシン遺伝子、ポリアデニル化配列。
[請求項1009]
発現ベクターが少なくとも以下を次の順序で含む、請求項1001〜1006のいずれか一項記載のEBx(登録商標)細胞:
次のDNA配列を次の順序で含む第1の発現カセット:配列番号1のCMVプロモーター、イントロン配列、抗体の重鎖またはその断片をコードするcDNA配列、ポリアデニル化配列;
次のDNA配列を次の順序で含む第2の発現カセット:配列番号1のCMVプロモーター、イントロン配列、抗体の軽鎖またはその断片をコードするcDNA配列、ポリアデニル化配列;
次のDNA配列を次の順序で含む第3の発現カセット:SV40プロモーター、ネオマイシン遺伝子、ポリアデニル化配列。
[請求項1010]
発現ベクターが少なくとも以下を次の順序で含む、請求項1001〜1006のいずれか一項記載のEBx(登録商標)細胞:
次のDNA配列を次の順序で含む第1の発現カセット:配列番号2のキメラEF1α/HTLVプロモーター、イントロン配列、抗体の重鎖またはその断片をコードするcDNA配列、ポリアデニル化配列;
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次のDNA配列を次の順序で含む第3の発現カセット:SV40プロモーター、ネオマイシン遺伝子、ポリアデニル化配列。
[請求項1011]
細胞において抗アポトーシスタンパク質の発現を引き起こすことができるプロモーター配列に機能的に連結された、該抗アポトーシスタンパク質をコードするDNA配列を含む少なくとも1つの発現カセットを含む発現ベクターをさらに含む、請求項1001〜1010のいずれか一項記載のEBx(登録商標)細胞。
[請求項1012]
抗アポトーシスタンパク質が、ニワトリNR13タンパク質である、請求項1011記載のEBx(登録商標)細胞。
[請求項1013]
細胞の染色体DNAに発現ベクターが安定に組み込まれる、請求項1001〜1012のいずれか一項記載のEBx(登録商標)細胞。
[請求項1014]
EB14細胞およびEBv13細胞より選択されるニワトリEBx(登録商標)細胞であり、かつEB24、EB24-12、EB26、およびEB66より選択されるアヒルEBx細胞である、請求項1001〜1013のいずれか一項記載のEBx(登録商標)細胞。
[請求項1015]
無血清培地に順応させた浮遊EBx(登録商標)細胞である、請求項1014記載のEBx(登録商標)細胞。
[請求項1016]
無血清培地に順応させた接着EBx(登録商標)細胞である、請求項1014記載のEBx(登録商標)細胞。
[請求項1017]
以下の段階を含む、トリEBx(登録商標)細胞において少なくとも1種の関心対象の生物学的産物を産生させるための方法:
(a)少なくとも1つの発現ベクターをトランスフェクションすることによって、請求項1001〜1016のいずれか一項記載のEBx(登録商標)細胞を調製する段階;
(b)該EBx(登録商標)細胞を、適切な条件下で、かつ適切な培地中で培養する段階;および
(c)該EBx(登録商標)細胞、該適切な培地、または該EBx(登録商標)細胞および該培地の両方から、関心対象の生物学的産物を回収する段階。
[請求項1018]
エレクトロポレーションにより、無血清培地中での接着培養において少なくとも1つの発現ベクターをEBx(登録商標)細胞にトランスフェクトする、請求項1017記載の方法。
[請求項1019]
リポソームを介したトランスフェクションにより、無血清培地中での浮遊培養において少なくとも1つの発現ベクターをEBx(登録商標)細胞にトランスフェクトする、請求項1017記載の方法。
[請求項1020]
関心対象の生物学的産物が、抗体分子、抗体断片、または免疫グロブリンのFc領域に等価な領域を含む融合タンパク質であり、Fcを介した増加した細胞毒性を有する、請求項1017〜1019のいずれか一項記載の方法。
[請求項1021]
ニワトリEBx(登録商標)グリコシル化またはアヒルEBx(登録商標)グリコシル化を有する、関心対象の生物学的産物。
[請求項1022]
EBx(登録商標)細胞において産生され、かつEBx(登録商標)グリコシル化を有する抗体集団であって、該抗体集団またはその断片が、末端GlcNacを有し、高度にガラクトシル化された長鎖を含み、かつ強いADCC活性を該抗体に与える共通の2分岐型N結合型フコシル化オリゴ糖構造体を有する抗体を高比率で含むFc領域を含む、抗体集団。
[請求項1023]
EBx(登録商標)細胞において産生され、かつハイブリドーマ細胞またはCHO細胞において産生された同じ抗体と比べて増加したADCC活性を有する、IgG1サブタイプまたはIgG3サブタイプの請求項1022記載の抗体。
[請求項1024]
薬剤としての、請求項1021記載の関心対象の生物学的産物。
[請求項1025]
薬剤としての、請求項1022および1023のいずれか一項記載の抗体またはその断片。
[請求項1026]
ヒトおよび動物の疾患を予防または治療するための薬学的組成物の調製のための、請求項1024記載の生物学的産物または請求項1025記載の抗体もしくはその断片の使用。
[請求項1027]
請求項1024記載の生物学的産物または請求項1025記載の抗体もしくはその断片、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
Claims (15)
- 以下の段階を含む、トリ細胞において少なくとも1種の関心対象の生物学的産物を産生させるための方法:
(a)該関心対象の生物学的産物を発現する少なくとも1つの発現ベクターをトランスフェクションすることによって、該トリ細胞を調製する段階;
(b)該細胞を、適切な条件下で、かつ適切な培地中で培養する段階;および
(c)該トリ細胞、該適切な培地、または該トリ細胞および該培地の両方から、該関心対象の生物学的産物を回収する段階であって、
トリ胚性幹細胞のインビトロ培養および増殖、それに続く細胞培養培地からの血清、フィーダー細胞、および増殖因子の漸進的除去、ならびに浮遊培養液への細胞の順応によって得られる該トリ細胞が、安定で持続的な、接着細胞株または浮遊細胞株に由来し、かつ
該関心対象の生物学的産物が、抗体分子、抗体断片、または免疫グロブリンのFc領域に等価な領域を含む融合タンパク質であり、Fcを介した増加した細胞毒性を有する、段階。 - 発現ベクターが、宿主細胞において選択マーカーの発現を引き起こすことができるプロモーター配列に機能的に連結された、該選択マーカーをコードする少なくとも1つの核酸配列を含む少なくとも1つの発現カセットをさらに含む、請求項1記載の方法。
- 選択マーカーが、グルタミン合成酵素、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ピューロマイシン、ハイグロマイシンB、ネオマイシン遺伝子、およびジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)より選択される、請求項2記載の方法。
- プロモーター配列が、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、サルウイルス40(SV40)初期プロモーター、単純ヘルペスウイルス(HSV)チミジンキナーゼプロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、マウスホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、eIF4αプロモーター、キメラEF1α/HTLVプロモーター、CAGプロモーター、β-アクチンプロモーターより選択される、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
- 発現カセットが、転写開始配列、エンハンサー配列、イントロン配列、ポリアデニル化配列、終結配列、クロマチンインスレーターエレメントからなる群より選択される、1つまたは複数の制御エレメントまたは調節配列をさらに含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
- クロマチンインスレーターエレメントが、バウンダリーエレメント(BE)、マトリックス結合領域(MAR)、遺伝子座調節領域(LCR)、普遍的クロマチンオープニングエレメント(UCOE)より選択される、請求項5記載の方法。
- 細胞が、細胞において抗アポトーシスタンパク質の発現を引き起こすことができるプロモーター配列に機能的に連結された該抗アポトーシスタンパク質をコードするDNA配列を含む少なくとも1つの発現カセットを含む発現ベクターをさらに含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
- 細胞の染色体DNAに発現ベクターが安定に組み込まれる、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
- トリ細胞が、ニワトリ細胞またはアヒル細胞である、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
- トリ細胞が、無血清培地に順応させた浮遊細胞である、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
- トリ細胞が、無血清培地に順応させた接着細胞である、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
- エレクトロポレーションにより、無血清培地中での接着培養において少なくとも1つの発現ベクターをトリ細胞にトランスフェクトする、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
- リポソームを介したトランスフェクションにより、無血清培地中での浮遊培養において少なくとも1つの発現ベクターをトリ細胞にトランスフェクトする、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
- ヒトおよび動物の疾患を予防または治療するための薬学的組成物の調製のための、請求項1〜13のいずれか一項記載の方法によって得られる生物学的産物の使用。
- 請求項1〜13のいずれか一項記載の方法によって得られる生物学的産物、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
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