CN105267961A

CN105267961A - 一种用细胞系生产鸡传染性喉气管炎活疫苗的方法

Info

Publication number: CN105267961A
Application number: CN201510788499.1A
Authority: CN
Inventors: 毛雅园; 魏丽娟; 刘毅; 郭鸿志; 杨国辉; 王德功; 周岩; 谢艳芳; 孔瑞岗; 魏占勇; 刘欣
Original assignee: HEBEI YUANZHENG PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: HEBEI YUANZHENG PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2015-11-16
Filing date: 2015-11-16
Publication date: 2016-01-27

Abstract

一种用细胞系生产鸡传染性喉气管炎活疫苗的方法，选用细胞系代替鸡胚进行鸡传染性喉气管炎病毒液的增殖，经培养细胞系、克隆纯化、传代、培养、病毒株的克隆、培养、疫苗配制、收获制苗毒液、分装、冻干等工序制成。本发明用传代细胞生产鸡传染性喉气管炎活疫苗，降低了生产成本，减少了疫苗免疫副反应问题，缩小了批间差异性，保证了疫苗质量的稳定，并为实现所述病毒的规模化培养奠定了基础。实验表明，本发明克隆方法仅通过3次克隆便可获得无细胞内杂质、透亮、圆润、轮廓清晰的细胞，而现有方法需要克隆7次，可见本方法缩短了克隆时长，并在克隆中具有高活性及高几率的克隆几率。

Description

一种用细胞系生产鸡传染性喉气管炎活疫苗的方法

技术领域

本发明涉及一种生产活疫苗的方法，尤其是涉及一种用细胞系生产鸡传染性喉气管炎活疫苗的方法，属于兽用生物制品技术领域。

背景技术

鸡传染性喉气管炎(AILT)是一种接触性呼吸道传染病，病原为喉气管炎病毒，可感染不同年龄的鸡。目前发病年龄有提前的趋势，最早可见20日龄的鸡群发病，呈地方流行性，发病率高达90％以上，死亡率10～40％。对养禽业的发展有较严重的危害性。

鸡传染性喉气管炎病毒(AILTV)属于疱疹病毒属α亚科，其生物学特性和基因结构与人的单纯疱疹病毒(HSV)较相似，如基因结构特征、分子量大小、同源特性等特点。AILTV与HSV具有如此多的相似之处，使得较多学者针对HSV本身的特性进行AILTV的生物学方面的探索。

目前，对AILT的防控主要以疫苗的免疫接种为主，其中弱毒疫苗应用的效果最为理想。但在实际应用中，弱毒疫苗所用病毒存在毒力偏强，易于返祖，对鸡易形成潜伏性感染的弊端；在疫苗的实际生产中，主要使用SPF鸡胚进行ILT活疫苗的生产，而自2006年起农业部规定所有的禽用活疫苗及几个猪用活疫苗等全部使用SPF胚后，使得SPF鸡胚接受了较大的挑战，其鸡胚使用量远远超过了其供给能力，SPF胚供应存在豁口；对SPF鸡胚的质量监测方面也存在一定的缺陷，这是因为是通过检测SPF鸡群的微生物结果来判定，但由于检测仍不成熟，使得监测仍存在困难，从而导致SPF胚的纯净性存在一定的问题，无法得到用户的全面认可；另外由于SPF鸡群饲养水平处于发展阶段，SPF鸡群的培育，饲养人员日常操作管理等方面都存在不确定因素，导致SPF胚批间的差异性的存在成为必然。SPF鸡胚存在如此多的缺点，不得不让我们去寻求新的培养方法。

发明内容

本发明为克服现有技术缺陷、提供了一种用细胞系生产鸡传染性喉气管炎活疫苗的方法，它可以解决目前生产鸡传染性喉气管炎活疫苗方面存在的问题，

本发明的目的是通过以下技术方案解决的。

一种用细胞系生产鸡传染性喉气管炎活疫苗的方法，其选用细胞系代替鸡胚进行鸡传染性喉气管炎病毒液的增殖，步骤如下：

(1)筛选鸡传染性喉气管炎病毒培养细胞系：根据鸡传染性喉气管炎病毒生物学特性，选取BHK-21细胞、Vero细胞、DF1细胞、原代鸡胚成纤维细胞(CEF)、鸡胚肝细胞或鸡胚肾细胞，前两种细胞采用DMEM培养液进行培养，后四种细胞使用M199培养液，分别进行所述病毒的培养，得病毒株适应性细胞；

(2)筛选细胞的克隆纯化：对步骤(1)中所得的病毒株适应性细胞用8％胎牛血清培养液进行稀释，稀释浓度为2个细胞/ml，加入48孔细胞板中，0.3ml/孔进行细胞克隆培养，选取细胞生长均一、轮廓清晰、透亮，细胞内无杂质的细胞孔进行消化冻存备用；

(3)制苗细胞的传代、培养：

(4)病毒株的克隆、培养：采用步骤(2)中的克隆细胞进行病毒株的蚀斑克隆培养，共克隆四次，一次克隆分别选取三个最小蚀斑，分别进行后三次的克隆，最终分别繁殖克隆三个毒株，筛选出毒力最弱、免疫原性最强的制苗毒株，并对所述毒株进行适应性培养；

(5)制苗用毒液的制备：用M199培养液对步骤(4)制苗毒株进行稀释，接种于长满单层的制苗细胞中，于培养箱中吸附，待吸附后弃去稀释液，补加细胞维持液，进行病毒的培养，最终收获细胞悬液备用；

(6)疫苗的配制及分装：收获步骤(5)中的制苗毒液，加入保护剂，充分混匀，定量分装；

(7)冻干。

上述用细胞系生产鸡传染性喉气管炎活疫苗的方法，步骤(1)中，所述鸡传染性喉气管炎病毒为K317株。

上述用细胞系生产鸡传染性喉气管炎活疫苗的方法，步骤(2)中，所述细胞生长液为M199，所用血清为8～12％胎牛血清，培养PH为7.0～7.4；所述细胞经3～5次单克隆培养处理，条件为，细胞：细胞孔＝2：1。

上述用细胞系生产鸡传染性喉气管炎活疫苗的方法，步骤(3)中，细胞传10～15代。

上述用细胞系生产鸡传染性喉气管炎活疫苗的方法，步骤(5)中，制苗毒液采用PH值为7.4～7.6的100％M199营养液进行稀释，以1g尿囊膜中加入1ml所述营养液的方式获得ILT病毒原液，最终以0.5～1％接种量接种；病毒吸附的时间为1～2小时；所述制苗细胞维持液为97％M199营养液和3％胎牛血清，PH值为7.4～7.6。

上述用细胞系生产鸡传染性喉气管炎活疫苗的方法，步骤(6)中，所述保护剂为10％～15％的脱脂牛奶蔗糖。

本发明为克服现有AILT活疫苗制备上存在的不足，通过大量的实验研究，成功筛选出ILTV适应性细胞系进行ILT活疫苗的制备，并应用于生产，成功替代现有使用鸡胚的生产方式。与现有技术相比，本发明具有的有益效果如下：

(1)通过有限稀释法和优等细胞筛选法，对筛选的病毒适应性细胞——鸡胚肝细胞进行克隆纯化、传代培养，最终筛选出病毒适应性好，细胞状态优良，并可连续传10～15个代次的传代鸡胚肝细胞；

(2)通过蚀斑纯化技术和有限稀释法的有效结合，筛选出免疫原性好，毒力低，不易返祖并稳定增殖的制苗毒。

(3)用传代细胞生产鸡传染性喉气管炎活疫苗，降低了生产成本，减少了疫苗免疫副反应问题，缩小了批间差异性，保证了疫苗质量的稳定，并为实现所述病毒的规模化培养奠定了基础。

实验表明，本发明克隆方法仅通过3次克隆便可获得无细胞内杂质、透亮、圆润、轮廓清晰的细胞，而现有方法需要克隆7次，可见本方法缩短了克隆时长，并在克隆中具有高活性及高几率的克隆几率。

附图说明

图1是不同细胞系培养鸡传染性喉气管炎病毒的培养细胞图

图2是本发明的技术路线图

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

AILTVK317株由中国兽药监察所提供。

BHK-21、Vero、DF1三种细胞均购自中国兽药监察所。

CEF、鸡胚肝、鸡胚肾三种细胞均由申请人制备。

BHK-21和Vero细胞的培养使用DMEM培养液，CEF、DF1、鸡胚肝、鸡胚肾细胞采用M199培养液，细胞生长液中添加了8％～12％的胎牛血清，细胞维持液中添加了3％～5％的胎牛血清。

实施例1筛选病毒适应性细胞

1细胞的选取

AILTV与HSV同属于疱疹病毒属α亚科，特性有较多的相似之处，据相关报道HSV可在BHK细胞、Vero细胞等多种细胞中生长良好，为筛选AILTV适应性细胞，本发明选择BHK-21和Vero细胞进行AILTV的繁殖。DF1、原代CEF细胞、鸡胚肝和肾细胞的选择主要根据ILTV宿主特异性强的培养特性进行选择。

2细胞的制备及传代

CEF、鸡胚肝、鸡胚肾三种细胞是鸡胚原代细胞，分别用去除眼球的整个鸡胚、剪碎的鸡胚肝、捣碎的鸡胚肾经2.5％胰酶(100单位/ml的双抗，PH为7.5～7.8)消化，加入M199生长液制备；DF1、BHK-21、Vero细胞经0.25％胰酶分散消化传代，分别加入细胞生长液，置于培养箱中培养。

3病毒的适应培养

将AILTV接种于长满单层的CEF、DF1、鸡胚肝、鸡胚肾、BHK-21、Vero细胞瓶中，同时设空白对照，吸附1～2h后补加细胞维持液，置于5％CO2培养箱中培养，每天观察病变情况，培养至第4天，收获细胞培养物，反复冻融，保存备用。采用收获的细胞培养物重复上述步骤进行接种，共传10代。

4观察及测定结果

细胞接种病毒后进行CPE观察，同时采用PCR和免疫荧光法(IFA)跟踪检测，最终对P8～P10代培养物进行滴度测定，结果如表1所示。

表1病毒适应性培养测定及观察结果

注释：“—”为没有测出数值。

5结论

对选择的六种细胞进行病毒适应性筛选，通过细胞的传代培养、CPE的观察、PCR和IFA的检测及病毒滴度的测定，最终筛选出有CPE病变、IFA和PCR检测为阳性，并测得具有稳定病毒滴度的病毒适应性细胞——鸡胚肝细胞。

实施例2克隆鸡胚肝细胞

1鸡胚肝细胞的克隆

1.1鸡胚肝细胞优选

取制备的鸡胚肝细胞，细胞计数后，以300万/ml的细胞数接种于细胞瓶中，摇匀后，放置于5％CO2培养箱中吸附10min后，弃去培养液，补加12％胎牛血清的M199生长液，重置于培养箱中培养至长满单层细胞。

1.2鸡胚肝细胞克隆

将步骤1.1中长满单层的鸡胚肝细胞经胰酶消化、重悬后，添加8％～12％胎牛血清的M199生长液进行稀释，稀释浓度为2个细胞/ml，充分混匀，加入48孔细胞板中，0.5ml/孔，放置于5％CO2培养箱中吸附10min后，弃去培养液，补加1ml生长液/孔，并记录含有继续放置于5％CO2培养箱中培养1～2d，更换新配置的M199细胞生长液1ml/孔，继续培养1～2d，待细胞长满单层后，选取记录单个细胞并状态良好的细胞孔，进行消化、计数后，重复上述操作，进行肝细胞克隆纯化，直至获得无细胞内杂质、透亮、圆润、轮廓清晰的细胞，加入二甲基亚砜冻存于液氮中备用。

2克隆鸡胚肝细胞同原细胞的比较

2.1消化传代次数的比较试验

(1)克隆鸡胚肝细胞的传代

选取步骤1.2中克隆保存的鸡胚肝细胞，复苏后，分别按300万/ml的细胞数量，接种于100ml细胞瓶中，补加细胞生长液，置于培养箱中培养，待长满单层细胞后传代，重复进行细胞传代，最终记录其可传代的次数。

(2)原鸡胚肝细胞的传代

制备四批原代鸡胚肝细胞，分别按300万/ml的细胞数量，接种于100ml细胞瓶中按(1)方法进行细胞培养并传代，记录传代的次数。

2.2病毒培养

选取筛选的克隆鸡胚肝细胞和原代鸡胚肝细胞，待细胞长满单层后接种AILT种毒，吸附完毕后，同时补加等量的M199细胞维持液，置于培养箱中培养，95％以上细胞出现CPE后收获。

3本发明筛选的鸡胚肝细胞同现有细胞的单克隆方法的比较

3.1利用本发明方法克隆鸡胚肝细胞

取制备的鸡胚肝细胞，按照步骤1克隆鸡胚肝细胞。

3.2采用现有细胞单克隆方法克隆鸡胚肝细胞

取制备的鸡胚肝细胞，按现有有限稀释方法克隆鸡胚肝细胞。

3.3克隆细胞活性的比较实验

分别按照上述两种方法进行细胞的克隆纯化，通过美蓝染色的方法,应用活细胞同死细胞在经染色后会激发出不同波长的荧光的特点，利用流速细胞仪对克隆过程中细胞的活性情况进行比较。

4实验结果

4.1鸡胚肝细胞克隆

通过步骤1克隆实验，最终克隆出A、B、C、D四株鸡胚肝细胞克隆细胞。

4.2细胞传代试验

克隆鸡胚肝细胞经连续传代，可传30～35代不等；原代鸡胚肝细胞最多仅能传到第6代，结果如表2。

表2细胞传代结果

4.3病毒效价的测定结果

将用步骤3中所述两种细胞连续培养的三代AILTV病毒通过鸡胚及细胞进行效价测定，结果如下表3所示。

表3AILTV效价测定

注释：“—”为测出数值偏低或不可信。

4.4本发明筛选的鸡胚肝细胞同现有细胞的单克隆方法的比较结果

表4鸡胚肝细胞克隆筛选比较结果

5结论

利用本克隆方法，最终克隆出A、B、C、D四株鸡胚肝细胞克隆细胞，经细胞传代A、B、C、D四株细胞可传30～35代，而原代鸡胚肝细胞最多仅能传6个代次；选择克隆C细胞株进行AILTV的繁殖，并通过细胞及鸡胚检测，结果效价均能达到制苗要求规定以上；在同现有克隆细胞方法相比较中，本发明克隆方法仅通过3次克隆便可获得无细胞内杂质、透亮、圆润、轮廓清晰的细胞，而现有方法需要克隆7次，可见本方法缩短了克隆时长，并在克隆中具有高活性及高几率的克隆几率。

实施例3鸡传染性喉气管炎病毒克隆纯化

1实验材料

琼脂粉，细胞维持液，6孔细胞培养板，AILTVK317株种毒。

2实验方法

2.1病毒稀释倍数选取

取AILTVK317株种毒，使用克隆鸡胚肝细胞进行病毒效价测定，根据效价检测结果将病毒进行10倍系列稀释，稀释至10^-8，取10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8病毒稀释液，分别接种长满单层细胞的6孔细胞板中，每个稀释倍数接种重复的三个细胞孔，于5％CO2培养箱中吸附1.5小时，弃去吸附液，用1×PBS(PH为7.2)冲洗2遍，补加0.5～1％琼脂粉的细胞维持液，倒置于培养箱中培养，4～5d后选取蚀斑数在20～40个范围的稀释孔进行蚀斑计数，记录其蚀斑数及稀释倍数。

2.2有限稀释法纯化AILTV

根据步骤2.1记录的稀释倍数进行病毒的稀释，按所计算的蚀斑数再对病毒进行稀释，使得稀释浓度为0.5ml稀释液中含1个蚀斑数，接种于长满单层细胞的24孔细胞板中，每孔0.5ml，于5％CO2培养箱中吸附1.5小时，弃去吸附液，用1×PBS(PH为7.2)冲洗2遍，补加细胞维持液，培养箱中培养4～5d后，观察并记录CPE，选取出现良好CPE的细胞孔，重复进行三次纯化。

2.3蚀斑克隆纯化

选取步骤2.2中三次纯化的病毒株进行蚀斑的三次纯化，最终获得蚀斑大小均匀的病毒株，分别对克隆蚀斑进行PCR鉴定及TCID₅₀的测定，最终将毒株保存于-20℃备用。

2.4AILTV人工感染实验

首先将1～2周龄易感雏鸡进行分组，包括实验组和对照组；然后用生理盐水将AILT病毒液进行10倍、100倍稀释，分别经口腔滴注0.2ml原倍、10倍、100倍稀释的AILTV液到鸡喉气管内，观察攻毒结果并统计发病和死亡情况。

3实验结果

3.1AILTV检测实验

病毒经有限稀释法及蚀斑克隆纯化，筛选出1、2、3株AILTV，PCR检测结果为AILTV阳性，AILTV蚀斑测定及克隆株效价检测结果如表5所示。

表5AILTV实验结果

注释：“—”为未检测项目或数量无法计算。所选细胞为实施例2中筛选出的C细胞株。

3.2AILTV致病性实验

采用1～2周龄易感雏鸡，经口腔滴注0.2ml原倍、10倍、100倍稀释的原AILTV液、AILT克隆1、2、3株病毒液到鸡喉气管内，观察攻毒后的结果如表6所示。

实施例4鸡传染性喉气管炎活疫苗的制备

1实验材料

制备鸡传染性喉气管炎活疫苗所用的培养细胞是单克隆的鸡胚肝细胞C株，所用AILT毒株是K317克隆3株。

2实验方法

2.1细胞的培养

取冻存的鸡胚肝细胞C株，立即置于37～38℃水浴锅中迅速融化，使用M199培养液(PH为7.1～7.2)进行10～20倍稀释，4000rpm离心10min，使用8％～12％胎牛血清的199细胞培养液重旋沉淀，加入细胞培养瓶中置于37.5℃细胞培养箱中进行扩大培养。

2.2AILT病毒的增殖培养

活化冻存的AILTK317克隆3株，按0.5～1％接种量接种于鸡胚肝细胞中，补加3％胎牛血清M199细胞维持液，置于38℃细胞培养箱中培养，若在培养过程中出现培养液发黄，需要对培养液进行PH调节，使PH为7.2～7.4左右，待细胞95％以上细胞出现CPE，收获细胞培养物，并于-80℃冰箱中冻融1次，保存备用。

2.3配制疫苗

将收获的细胞培养物进行离心、过滤，然后按比例添加10％～15％的脱脂牛奶蔗糖，充分混合，定量分装，冻干。

2.4疫苗样品检验

随机抽取制备的AILTV活疫苗样品6瓶，分别进行厌氧菌、需氧菌、霉菌及腐生菌、支原体、外源病毒检验，并对样品冻干水分进行测定。

3实验结果

3.1无菌检验结果

选择培养基，对随机抽取的6瓶AILTV活疫苗样品进行霉菌、厌氧菌、需氧菌、腐生菌检验测定结果全部合格，如表7所示。

表7无菌检验结果

3.2疫苗支原体、外源病毒检验及冻干水分测定结果

表8检测结果

检测项目	疫苗瓶1	疫苗瓶2	疫苗瓶3	疫苗瓶4	疫苗瓶5	疫苗瓶
							支原体	-	-	-	-	-	-
外源病毒	-	-	-	-	-	-
							水分含量(％)	1.1	1.2	1.1	1.2	1.3	1.1

4结论

使用单克隆的鸡胚肝细胞C株进行AILTK317克隆3株病毒株的培养，并采用培养获得的AILT病毒液制备的AILTV活疫苗产品，通过无菌、支原体、外源病毒、冻干水分的检验，均合格。

实施例5与现有鸡传染性喉气管炎活疫苗产品的效果比较

1实验材料

1.1本发明制备鸡传染性喉气管炎活疫苗

采用本发明克隆的鸡胚肝细胞C株，AILTK317克隆3毒株，制备三批鸡传染性喉气管炎活疫苗，分别为20141206、20141207、20141208。

1.2现有鸡传染性喉气管炎活疫苗制备

将AILTK317毒株接种于鸡胚绒毛尿囊膜，制备三批鸡传染性喉气管炎活疫苗，分别为20141210、20141211、20141212。

2实验方法

2.1安全检验

用3～5周龄健康易感鸡5只，每只滴眼或滴鼻接种0.1ml的疫苗，观察10～14日。

2.2效力检验

2.2.1用鸡胚检验

用灭菌生理盐水对制备的疫苗样品作10倍稀释，取10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-75个稀释度，各绒毛尿囊膜接种10日龄鸡胚，每个稀释度平行接种5个0.2ml/胚，接种后5日，剖检观察感染情况。

2.2.2用细胞检验

将制备的疫苗样品用3％细胞维持液作10倍稀释，取10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-75个稀释度，分别接种长满单层鸡胚肝细胞的96孔细胞板中，每个稀释度接种6个细胞孔100μl/孔，接种后培养4d进行终判，计算TCID₅₀。

2.2.3用鸡检验

选取5～8周龄的易感鸡10只，分成对照组和实验组两组；用PBS或灭菌生理盐水稀释疫苗样品，通过点眼的途径接种5只易感鸡，每只接种剂量为0.06ml，21d后，气管内注射10⁴EID₅₀/0.2ml的鸡传染性喉气管炎病毒强毒，观察10d后计算保护情况。

3实验结果

3.1安全检验

从同一疫苗批次中随机选取1瓶疫苗样品，疫苗批次分别为20141206、20141207、20141208、20141210、20141211、20141212，每瓶疫苗点眼接种3～5周龄健康易感鸡5只，接种剂量为0.1ml/只，观察10～14日，结果如表9所示。

表9安全检验情况

3.2效力检验

3.2.1用鸡胚检验

取10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-75个稀释度，各绒毛尿囊膜接种10日龄鸡胚，每个稀释度平行接种5个0.2ml/胚，接种后5日，剖检观察结果，并计算EID₅₀，如表10所示。

表10鸡胚检验结果

3.2.2用细胞检验

取10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-75个稀释度，分别接种长满单层鸡胚肝细胞的96孔细胞板中100μl/孔，每个稀释度接种8个细胞孔，接种后培养4d进行终判，计算TCID₅₀，如表11所示。

表11细胞检测结果

3.3.3用鸡检验

用PBS稀释疫苗样品，通过点眼的途径接种10只实验易感鸡，每只接种剂量为0.06ml，21d后，对所有的鸡只气管内注射10⁴EID₅₀/0.2ml的鸡传染性喉气管炎病毒强毒，观察10d后，计算保护情况，如表12。

表12用鸡检验结果

4结论

对20141206、20141207、20141208、20141210、20141211、20141212六个批次的疫苗产品进行安全检验及效力检验(包括用鸡胚、细胞、鸡检验)。从结果中可以看出，无论使用哪种方法进行产品的效力检验，此发明方法制备的鸡传染性喉气管炎活疫苗产品效果都优于现有鸡传染性喉气管炎活疫苗产品。

以上仅是本发明的优选实施方式，并不用以限制本发明，对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出的若干改进、润饰、等同替换，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种用细胞系生产鸡传染性喉气管炎活疫苗的方法，其特征在于，其选用细胞系代替鸡胚进行鸡传染性喉气管炎病毒液的增殖，步骤如下：

（1）筛选鸡传染性喉气管炎病毒培养细胞系：根据鸡传染性喉气管炎病毒生物学特性，选取BHK-21细胞、Vero细胞、DF1细胞、原代鸡胚成纤维细胞（CEF）、鸡胚肝细胞、鸡胚肾细胞，前两种细胞采用DMEM培养液进行培养，后四种细胞使用M199培养液，分别进行所述病毒的培养，得病毒株适应性细胞；

（2）筛选细胞的克隆纯化：对步骤（1）中所得的病毒株适应性细胞用8%胎牛血清培养液进行稀释，稀释浓度为2个细胞/ml，加入48孔细胞板中，0.3ml/孔进行细胞克隆培养，选取细胞生长均一、轮廓清晰、透亮，细胞内无杂质的细胞孔进行消化冻存备用；

（3）制苗细胞的传代、培养：

（4）病毒株的克隆、培养：采用步骤（2）中的克隆细胞进行病毒株的蚀斑克隆培养，共克隆四次，一次克隆分别选取三个最小蚀斑，分别进行后三次的克隆，最终分别繁殖克隆三个毒株，筛选出毒力最弱、免疫原性最强的制苗毒株，并对所述毒株进行适应性培养；

（5）制苗用毒液的制备：用M199培养液对步骤（4）制苗毒株进行稀释，接种于长满单层的制苗细胞中，于培养箱中吸附，待吸附后弃去稀释液，补加细胞维持液，进行病毒的培养，最终收获细胞悬液备用；

（6）疫苗的配制及分装：收获步骤（5）中的制苗毒液，加入保护剂，充分混匀，定量分装；

（7）冻干。

2.根据权利要求1所述的一种用细胞系生产鸡传染性喉气管炎活疫苗的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述鸡传染性喉气管炎病毒为K317株。

3.根据权利要求2所述的一种用细胞系生产鸡传染性喉气管炎活疫苗的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述细胞生长液为M199，所用血清为8～12%胎牛血清，培养PH为7.0～7.4；所述细胞经3～5次单克隆培养处理，条件为，细胞：细胞孔=2：1。

4.根据权利要求3所述的一种用细胞系生产鸡传染性喉气管炎活疫苗的方法，其特征在于，步骤（3）中，细胞传10～15代。

5.根据权利要求4所述的一种用细胞系生产鸡传染性喉气管炎活疫苗的方法，其特征在于，步骤（5）中，制苗毒液采用PH值为7.4～7.6的100%M199营养液进行稀释，以1g尿囊膜中加入1ml所述营养液的方式获得ILT病毒原液，最终以0.5～1%接种量接种；病毒吸附的时间为1～2小时；所述制苗细胞维持液为97%M199营养液和3%胎牛血清，PH值为7.4～7.6。

6.根据权利要求5所述的一种用细胞系生产鸡传染性喉气管炎活疫苗的方法，其特征在于，步骤（6）中，所述保护剂为10%～15%的脱脂牛奶蔗糖。