CN102830225A - 一种源于禽流感病毒自然弱毒株的血凝素和免疫抗原 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种来源于禽流感病毒自然弱毒株（CN1株）的血凝素和免疫抗原及其制备方法，以及血凝素在检测血清抗体中的用途、免疫抗原在接种动物用于产生免疫抗体中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及动物疫病预防控制，尤其涉及一种用禽流感病毒自然弱毒株制备的血凝素和免疫抗原。
背景技术
禽流感（Avian influenza，AI）是由A型流感病毒引起的禽类（包括家禽和野禽）的感染和/或感染综合征。鸡、火鸡、鸭、鹅和鹌鹑等家禽、野鸟、水禽和海鸟等均可感染。其疾病形式多样，可表现为无致病性感染，低致病性感染和高致病性禽流感（Highlypathogenic avian influenza，HPAI）。爆发HPAI不仅使当地的养禽业遭受毁灭性打击，而且显著地影响禽类产品的国际贸易，世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须报告疫病，我国将其列为一类动物疫病。
AI的病原为禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV），AIV的亚型众多，其中按血凝素（Haemagglutinin，HA）划分为16种（H1～H16）亚型，历史上所有的高致病性禽流感均是由H5和H7亚型AIV引起的。H5和H7亚型AIV除了对养禽业有重要意义之外，它们还有重要的公共卫生意义，H5和H7亚型AIV均有感染并致死人类的报道。
到目前为止，我国已分离鉴定的高致病性禽流感病毒均为H5亚型病毒，所以此前的研究集中于H5亚型禽流感病毒及其免疫抗原，用于制造H5亚型禽流感疫苗或诊断试剂。发明人在国内首次分离到H7亚型禽流感病毒（CN1株），并进行了一系列研究。发明人在研究中发现，该病毒具有致病力很低的特征，后来又经过多次传代培养，使该病毒更加适应鸡胚培养条件，获得病毒的滴度很高，而病毒致病力仍然很低。将此培养物经过一定工艺灭活，仍能保留血凝素活性；研制成免疫抗原，接种鸡可以产生很好的抗体滴度，抗体能维持6个月以上。因此，这种用H7亚型禽流感病毒自然弱毒株来制造的血凝素和免疫抗原，对于防控H7亚型禽流感具有重要意义，并且这项技术在国内未见报道。
国内现有H7亚型禽流感病毒血凝素及免疫抗原，是用1979年获得的国际标准毒株A/Afri.Star/Eng-Q/983/79/(H7N1)研制的，存在以下技术缺陷：1、禽流感众所周知的特性是病毒变异性高，即使同一种亚型的不同来源毒株，其抗原性也存在一定差异。用1979年的标准毒株制备的血凝素，用来作血凝抑制实验、检测临床血清时，会出现滴度偏低、敏感度下降的问题；2、用标准毒株制成免疫抗原或疫苗来免疫动物，由于标准毒株抗原性与国内流行株抗原性存在差异，会导致保护效果下降。
发明内容
本发明所解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种用国内分离的禽流感病毒自然弱毒株（A/CK/CN/1/2002（H7N2），简称CN1株）制备的血凝素和免疫抗原。CN1株保藏信息如下：
分类命名：禽流感病毒
拉丁文学名：Avian influenza virus，AIV
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所
保藏日期：2012年9月19日
保藏编号：CGMCC No.6602。
本发明是通过以下技术途径实现的：
本发明人从我国鸡群中分离到的H7N2亚型禽流感病毒株（保藏编号：CGMCC No.6602），在鸡胚中连续传代培养，再通过有限稀释法纯化病毒，然后测定病毒血凝素效价；进行本动物接种试验，评价病毒的致病性；用病毒培养物制成灭活的血凝素；用病毒培养物制成矿物油佐剂免疫抗原，接种鸡以后定期测定抗体水平。通过测定CN1株HA、NA和M基因，确定这种血凝素与免疫抗原的分子识别标志。
具体方法为：1、病毒分离培养：将鸡群禽流感监测过程中采集的样品，过滤除菌后，接种10日龄SPF鸡胚尿囊腔，在37℃继续孵育。72小时左右鸡胚死亡，收集尿囊液，用同样方法作传代培养。按GB/T18936-2003规定方法，用1%鸡红细胞测定分离物的血球凝集活性。2、病毒鉴定：对于具有血球凝集活性的培养物，按照《禽流感》（第一版，北京农业大学出版社，1995）介绍的方法，鉴定病毒血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）亚型；3、病毒纯化：将收获的病毒液进行10倍比的系列稀释，接种10日龄鸡胚培养，72小时左右，选择最高稀释度的死亡鸡胚，测定血凝活性，再次进行10倍比的系列稀释后按同样方法传代培养，共传5代，获得纯化的病毒；4、致病性试验：按照《禽流感》（第一版）介绍的方法，将纯化的病毒接种SPF鸡，测定“静脉接种致病指数（IVPI）”；5、制备血凝素：将纯化的CN1株加入终浓度1：5000的β-丙内酯，4℃灭活10小时，测定血凝素效价，按常规方法冻结或冻干保存，用作血凝素；6、将纯化的CN1株按前述方法用β-丙内酯灭活，测定血凝素效价，加矿物油佐剂按常规方法乳化，制成免疫抗原；7、将制成的免疫抗原接种6周龄SPF鸡，定期采集血清，用血凝抑制实验测定抗体水平，实验中采用的是上述CN1株血凝素。8、测定病毒的基因序列：参照国内外已发表的禽流感病毒HA、NA和M基因节段的序列，设计针对HA、NA和M基因节段的扩增引物和反转录引物，按常规方法进行克隆测序，得到CN1病毒株HA、NA和M基因片段的核苷酸序列。
血凝素效价测定表明，CN1株制备的血凝素效价达到1024，具有较高的效价，因此可以用于制备血凝素试剂和免疫抗原。
致病性试验表明，CN1病毒接种SPF鸡后10天，未观察到明显症状。静脉接种指数（IVPI）为0，无致病性，说明病毒传5代后毒力没有增强，是难得的H7亚型自然弱毒株，灭活后用于制造血凝素和免疫抗原是很安全的，具有实际应用价值。
免疫原性试验表明，CN1株制备的免疫抗原接种SPF鸡以后1周（1WPI），即可检出针对H7亚型AIV的HI抗体，接种后第5-8周为抗体水平高峰期，其后缓慢下降，直至第28周仍可检出抗体（HI效价高于16）。
病毒的HA基因序列见SEQ ID NO：1；NA基因序列见SEQ ID NO：2；M基因序列见SEQ ID NO：3。
具体实施方式
实施实例1
病毒分离鉴定
从鸡场采集样品，经过滤除菌后，接种10日龄SPF鸡胚尿囊腔，在37℃继续孵育。72小时左右鸡胚死亡，收集尿囊液，用同样方法作传代培养。按《禽流感》（第一版）的方法，用1%鸡红细胞测定分离物的血球凝集活性。
按《禽流感》（第一版）介绍的方法，用红细胞凝集抑制（HI）试验确定病毒的血凝素亚型。按《禽流感》（第一版）介绍的神经氨酸酶（NA）活性抑制（NI）实验方法，测定病毒NA亚型。
结果：鸡胚在接种CN1株后72小时左右死亡，胚体充血。初代尿囊液血凝价为256，经多次传代后，尿囊液的血凝价为1024。病毒被鉴定为H7N2亚型禽流感病毒。
实施实例2
病毒的致病性测定
按《禽流感》（第一版）介绍的方法进行。将14只SPF鸡随机分二组，在两个负压隔离器中饲养，各组分别为10只和4只。经检验无菌的CN1株鸡胚尿囊液，对1%鸡红血球凝集效价为1024，用生理盐水作1：10稀释，接种一组鸡10只，每只鸡经翅静脉注射0.1ml，另外四只鸡注射生理盐水作为对照。每天观察并记录鸡群情况，至接种后10天，计算静脉接种致病指数（IVPI）。
结果：IVPI值为0。病毒对实验鸡无致病性，是自然弱毒株。可用于研制血凝素和免疫抗原，生产和使用过程可以保证安全，因此具有实际应用价值。将CN1病毒保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.6602。
实施实例3
血凝素制备及效价测定
将纯化的CN1株加入终浓度1：5000的β-丙内酯，4℃灭活10小时，按GB/T18936-2003规定方法，用1%鸡红细胞测定分离物的血球凝集活性，分装后冻结保存，用作血凝素。
结果：灭活病毒制备的血凝素效价为1024。
实施实例4
免疫抗原制备及接种动物产生抗体的测定
将CN1株病毒液，加入终浓度为1：5000的β-丙内酯，4℃灭活10小时，测定血凝素效价，加矿物油佐剂按常规方法乳化，制成免疫抗原，接种6周龄SPF鸡8只，每周采集少量血清一次，按GB/T18936-2003规定方法，用上述CN1株血凝素来做血凝抑制实验，测定血清抗体水平。
结果：以血清抗体HI效价高于16为检测阳性的判界，CN1株制备的免疫抗原接种SPF鸡以后1周，即可检出针对H7亚型AIV的血清抗体，接种后第5-8周为抗体水平高峰期，其后缓慢下降，直至第28周仍可检出抗体，之后出现了部分鸡的抗体水平低于16的情况。这说明，用CN1株制备免疫抗原，接种鸡产生的抗体可以维持半年以上，具有较好的免疫原性。
实施实例5
病毒基因序列测定
参照国内外已发表的禽流感病毒HA、NA、M基因节段的核苷酸序列，设计针对HA、NA、M基因节段的扩增引物（见表1）和反转录通用引物：5′AGCAAAAGCAGG-3′（SEQ IDNO：4）（参考文献：E.Hoffmann,J.Stech,Y.Guan,et al.Universal primer setfor the full-length amplifiction of all influenza A viruses.Archives ofVirology,2001,146:2275-2289.）。提取病毒总RNA，反转录(RT)合成CDNA，经PCR扩增后，凝胶电泳回收各基因节段的PCR产物，分别与pGEM-T Easy载体连接成pGEM-TE-X（“x”代表HA、NA、M基因），构建重组质粒转化感受态细胞，挑选PCR阳性的克隆，测定核苷酸序列。
表1 针对各基因节段的PCR引物
结果：病毒的HA基因序列见SEQ ID NO：1；NA基因序列见SEQ ID NO：2；M基因序列见SEQ ID NO：3。
Claims (6)
1.一种源于禽流感病毒自然弱毒株的血凝素和免疫抗原，其特征在于所述的禽流感病毒自然弱毒株为CN1株。其中所述的CN1病毒株为：保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.6602。
2.权利要求1中所述CN1株的识别特征是同时包含有核苷酸序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的3个基因节段。
3.根据权利要求1所述的免疫抗原，其中还包括药剂学上可以接受的稀释剂、赋形剂或免疫佐剂。
4.根据权利要求1所述的血凝素和免疫抗原的制备方法，包括：将CN1株接种鸡胚培养，收获病毒液加入终浓度1：5000的β-丙内酯，4℃灭活10小时，用作血凝素；加矿物油等佐剂按常规方法乳化，制成免疫抗原。
5.根据权利要求1所述的血凝素在检测血清抗体中的用途。
6.根据权利要求1－3任一项所述的免疫抗原在接种动物用于产生免疫抗体中的用途。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104694554A (zh) * | 2015-02-16 | 2015-06-10 | 武汉思齐源生物科技有限公司 | 一种分离的禽流感病毒h7基因核酸序列 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009151313A1 (en) * | 2008-06-12 | 2009-12-17 | Universiti Putra Malaysia | A novel antiviral peptide against avian influenza virus h9n2 |
| CN101885757A (zh) * | 2009-05-11 | 2010-11-17 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 禽流感病毒血凝素、表位肽和抗它们的单克隆抗体及其应用 |
| CN102012430A (zh) * | 2010-11-05 | 2011-04-13 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 禽流感病毒H5N1亚型Re-5株血凝抑制抗原标准物质及制备方法 |
| TW201132980A (en) * | 2010-03-17 | 2011-10-01 | Univ Nat Taiwan | Monoclonal antibody against hemagglutinin of avian influenza viruses subtype H6N1 and methods of making and using same |
| US20110311578A1 (en) * | 2008-11-19 | 2011-12-22 | Laboratorio Avi-Mex, S.A. De C.V. | Recombinant inactivated viral vector vaccine |
| KR20120024313A (ko) * | 2010-09-06 | 2012-03-14 | 대한민국(관리부서 : 농림수산식품부 농림수산검역검사본부) | 신속 면역크로마토그라피법에 의한 ｈ9형 조류인플루엔자 바이러스 진단 키트 및 이를 이용하여 ｈ9형 조류인플루엔자를 진단하는 방법 |
| CN102399754A (zh) * | 2011-05-27 | 2012-04-04 | 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 | 一株h9n2禽流感病毒疫苗株及其在免疫保护上的应用 |
-
2012
- 2012-09-24 CN CN201210358235.9A patent/CN102830225B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009151313A1 (en) * | 2008-06-12 | 2009-12-17 | Universiti Putra Malaysia | A novel antiviral peptide against avian influenza virus h9n2 |
| US20110311578A1 (en) * | 2008-11-19 | 2011-12-22 | Laboratorio Avi-Mex, S.A. De C.V. | Recombinant inactivated viral vector vaccine |
| CN101885757A (zh) * | 2009-05-11 | 2010-11-17 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 禽流感病毒血凝素、表位肽和抗它们的单克隆抗体及其应用 |
| TW201132980A (en) * | 2010-03-17 | 2011-10-01 | Univ Nat Taiwan | Monoclonal antibody against hemagglutinin of avian influenza viruses subtype H6N1 and methods of making and using same |
| KR20120024313A (ko) * | 2010-09-06 | 2012-03-14 | 대한민국(관리부서 : 농림수산식품부 농림수산검역검사본부) | 신속 면역크로마토그라피법에 의한 ｈ9형 조류인플루엔자 바이러스 진단 키트 및 이를 이용하여 ｈ9형 조류인플루엔자를 진단하는 방법 |
| CN102012430A (zh) * | 2010-11-05 | 2011-04-13 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 禽流感病毒H5N1亚型Re-5株血凝抑制抗原标准物质及制备方法 |
| CN102399754A (zh) * | 2011-05-27 | 2012-04-04 | 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 | 一株h9n2禽流感病毒疫苗株及其在免疫保护上的应用 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| W.F.SHI ET AL: "Genetic analysis of four porcine avian influenza viruses isolated from Shandong, China", 《ARCHIVES OF VIROLOG》 * |
| W.F.SHI ET AL: "Genetic analysis of four porcine avian influenza viruses isolated from Shandong, China", 《ARCHIVES OF VIROLOG》, vol. 153, 31 December 2008 (2008-12-31), pages 211 - 217, XP019592480 * |
| 叶丛华等: "云南边境禽流感H5N1亚型病毒血凝素基因分子结构特征分析", 《中国人兽共患病学报》 * |
| 唐应华等: "禽流感H9亚型血凝素单克隆抗体的研制和初步应用", 《中国免疫学杂志》 * |
| 王文等: "人禽流感病毒H5N1多价重组痘苗病毒(天坛株)疫苗在小鼠中的免疫原性研究", 《中华微生物学和免疫学杂志》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104694554A (zh) * | 2015-02-16 | 2015-06-10 | 武汉思齐源生物科技有限公司 | 一种分离的禽流感病毒h7基因核酸序列 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102830225B (zh) | 2014-06-04 |
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