CN103781902A - 变异狂犬病毒及疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种安全性高、有效且廉价的狂犬病疫苗。本发明提供了一种变异狂犬病毒及含有此变异狂犬病毒的狂犬病疫苗制剂，所述变异狂犬病毒在其狂犬病毒结构蛋白中，至少N蛋白的273位为苯丙氨酸以外的其他氨基酸、N蛋白的394位为酪氨酸以外的其他氨基酸、G蛋白的333位为精氨酸和赖氨酸以外的其他氨基酸(例如，图2中的ERA-N273/394-G333株)。除了能够通过G蛋白333位氨基酸的变异导入来使狂犬病毒的毒性降低以外，还能够通过对N蛋白273位和394位氨基酸进行变异导入来使免疫原性和安全性提高。此外，通过对N蛋白273位和394位氨基酸进行变异导入，即使G蛋白194位变异为赖氨酸的情况下也能够防止病毒毒性加强，能够降低因突变引起病原性恢复的可能性，可以使安全性进一步提高。

Description

变异狂犬病毒及疫苗
技术领域
本发明涉及一种变异狂犬病毒、含有此病毒的狂犬病疫苗制剂、狂犬病的预防和治疗方法、狂犬病疫苗制造方法以及用于狂犬病疫苗制剂制造的使用等，所述变异狂犬病毒在狂犬病毒结构蛋白中至少是N蛋白的273位为苯丙氨酸（phenylalanine）以外的其他氨基酸（aminoacid），N蛋白的394位为酪氨酸（tyrosine）以外的其他氨基酸，G蛋白的333位为精氨酸（arginine）或赖氨酸（lysine）以外的其他氨基酸。
背景技术
狂犬病是一种来自咬伤等所致的感染狂犬病毒而引起的一种人畜共患感染性疾病。治疗方法尚未明确，发病时伴有重度神经症状，几乎100%死亡。
狂犬病毒具有非常广的宿主范围，可以使包括人在内的所有哺乳类动物感染。在发展中国家，主要感染源是犬，在发达国家，主要感染源是狐狸、浣熊、臭鼬、蝙蝠等野生动物。据推测，即使现在，每年也有50000人以上死于狂犬病。
狂犬病可以通过接种疫苗来预防，目前灭活狂犬病疫苗已广泛使用。但是，使用灭活疫苗时，为了得到理想效果，需要大量的抗原，疫苗成本增加。另一方面，虽然弱毒活疫苗与灭活疫苗相比能够更加廉价地制作，但存在安全性隐患。因此，特别是在发展中国家，疫苗尚未充分普及。
狂犬病毒属于弹状病毒科狂犬病毒属。病毒粒子具有宽60nm至110nm、长130nm至250nm的弹丸状的形态，由5个结构蛋白即G蛋白、M蛋白、N蛋白、P蛋白、L蛋白组成。病毒基因组全长约12000个碱基，负链为单链RNA，含有自上游(3’末端侧)开始依次为编码N、P、M、G、L的五个结构蛋白的基因序列。
近年来，随着狂犬病毒的病原性决定因子的研究等的进展，已知能够通过将G蛋白的333位的氨基酸置换为精氨酸和赖氨酸以外的其他氨基酸来使病毒的毒性减弱(参考非专利文献1等)。另外，将G蛋白的333位氨基酸置换成弱毒型后所得的病毒作为野生动物的口服免疫用的弱毒活疫苗的情况，在欧洲已得到实际应用(参考专利文献1等)。
据报道，这种弱毒变异型病毒即使G蛋白333位变异成弱毒型，也可通过突变将G蛋白194位突变为赖氨酸而使其毒性增强(参考非专利文献2)。因此，存在因G蛋白194位的突变而导致病原性恢复的担忧，仅G蛋白333位弱毒变异型病毒的安全性未必可靠。
本发明人公开了以下情况：就狂犬病弱毒株Ni-CE株而言，狂犬病N蛋白273位和394位氨基酸对于通过维甲酸诱导基因-I（Retinoic acid-inducible gene I，RIG-I）介导的抗病毒应答及病原性是重要的(参考非专利文献3)。
其他，非专利文献4及非专利文献5是关于后述的基于反向遗传法的人工合成狂犬病毒变异株的文献。
专利文献1：US2011/0064764A1
非专利文献1：Dietzschold B et al,“Characterization of an antigenic determinantof the glycoprotein that correlates with pathogenicity of rabies virus.”Proc.Natl.Acad.Sci.USA.80:70-74,1983
非专利文献2：Milosz Faber et al,“A single amino acid change in rabies virusglycoprotein increases virus spread and enhances virus pathogenicity.”Journal ofVirology,vol.79,No.22p14141-14148.2005
非专利文献3：Tatsunori Masatani et al,“Amino acids at position273and394in rabies virus nucleoprotein are important for both evasion of host RIG-I-mediatedantiviral response and pathogenicity.”Virus Research155(2011)168-174.
非专利文献4：Naoto Ito et al,“Rescue of rabies virus from cloned cDNA andidentification of the pathogenicity-related gene:Glycoprotein gene is associatedwith virulence for adult mice.”Journal of Virology Vol.75,No.19p9121-91282001.
非专利文献5：Naoto Ito et al,“Improved recovery of rabies virus from clonedcDNA using a vaccinia virus-free reverse genetics system.”Microbiol Immunol.2003;47(8):613-7.
附图说明
图1是表示实施例3中，以ERA-N273/394-G333株对小鼠进行免疫时的小鼠血清的中和抗体效价的图表。
图2是表示实施例4中的ERA-N273/394-G333株的ED50(半数有效量)的图表。
图3A是表示实施例5中的脑内接种ERA-G194/333株的存活率的图表。
图3B是表示实施例5中的脑内接种ERA-N273/394-G194/333株的存活率的图表。
发明内容
<发明要解决的课题>
如上所述，虽然狂犬病的弱毒活疫苗较灭活疫苗可以更低廉地制作，但是具有病原性恢复等安全隐患。因此，本发明的目的在于提供一种安全性高、有效且廉价的狂犬病疫苗。
<用于解决课题的手段>
本发明人对于将狂犬病毒的结构蛋白中的G蛋白的333位氨基酸置换后所得的弱毒性狂犬病毒，除了G蛋白的333位，还对N蛋白的273位及394位进行了变异导入，由此能够使免疫原性及安全性提高，且即使在G蛋白的194位变异为赖氨酸的情况下，病毒毒性也不会增强。
因此，在本发明中提供了一种变异狂犬病毒及含有此变异狂犬病毒的狂犬病疫苗制剂，其特征在于，在所述变异狂犬病毒的结构蛋白中至少N蛋白的273位为苯丙氨酸以外的其他氨基酸、N蛋白的394位为酪氨酸以外的其他氨基酸、G蛋白的333位为精氨酸和赖氨酸以外的其他氨基酸。
能够在通过对G蛋白的333位的氨基酸进行变异导入使毒性减弱的同时，通过对N蛋白273位及394位氨基酸进行变异导入来提高免疫原性。另外，除了G蛋白的333位，还对N蛋白273位以及394位进行变异导入，由此，与只对G蛋白的333位施加变异的情况相比，由于以少量的接种量实现了充分的免疫效果，因此能够使接种量减少，能够进一步提高安全性。
另外，通过对N蛋白273位及394位氨基酸进行变异导入，即使在G蛋白194位变异为赖氨酸后也能够防止毒性增强，因此能够降低因突变导致病原性恢复的可能性，能够进一步提高安全性。
因此，本发明的含有变异狂犬病毒的疫苗制剂是有效的，通过使用本疫苗制剂，能够有效地预防和治疗狂犬病。
另外，由于这种重组病毒能够采用培养细胞进行人工合成，因此具有以下方面的优势：例如在作为弱毒活疫苗使用时，可以比较廉价地制造狂犬病疫苗制剂。
<发明的效果>
本发明提供了一种免疫原性高、突变导致恢复病原性等安全性问题少、有效且廉价的狂犬病疫苗。
具体实施方式
<关于本发明的变异狂犬病毒>
本发明包括所有这样的狂犬病毒：在狂犬病毒结构蛋白中，至少N蛋白的273位为苯丙氨酸以外的其他氨基酸、N蛋白的394位为酪氨酸以外的其他氨基酸、G蛋白的333位为精氨酸和赖氨酸以外的其他氨基酸的变异狂犬病毒。即，本发明对病毒的制备方法等不作狭义限制，可进行广泛选择，包括例如采用鸡胚以及/或培养细胞等进行传代所得的变异病毒、采用克隆cDNA等来进行人工合成所得的变异病毒等。
本发明能够通过在狂犬病毒结构蛋白中至少分别将N蛋白273位的苯丙氨酸置换成其他氨基酸、将N蛋白394位的酪氨酸置换成其他氨基酸、将G蛋白333位的精氨酸和赖氨酸置换成其他氨基酸，由此使狂犬病毒毒性减弱，且能够提高免疫原性和安全性，并能够降低因突变而引起的病原性恢复等的危险性。
除N蛋白273位、N蛋白394位、G蛋白333位之外的其他氨基酸序列，只要与已知狂犬病毒株的序列实质性一致即可，并不作特别限定。以氨基酸序列作为公知的狂犬病毒株，可举出例如CVS株、ERA株、西原株、HEP-Flury株、LEP-Flury株、SAD Bern株、SAD B19株等。另外，所谓“实质性一致”是指在该领域的氨基酸序列具有80%至100%的同源性、较优选具有90%至100%的同源性。
N蛋白273位的氨基酸只要是苯丙氨酸（phenylalanine）之外的其他氨基酸即可，不作特别限定。优选例如甘氨酸（glycine）、丙氨酸（alanine）、缬氨酸（valine）、亮氨酸（leucine）、异亮氨酸（isoleucine）、丝氨酸（serine）、苏氨酸（threonine）、半胱胺酸（cystein）、蛋氨酸（methionine）、天冬酰胺（Asparagine）、谷酰胺（glutamine）、脯氨酸（proline）、酪氨酸（tyrosine）、色氨酸（tryptophane）、天冬氨酸（asparagic acid）、谷氨酸（glutamicacid）、精氨酸（arginine）、赖氨酸（lysine）、组氨酸（histidine）中的任一种，更优选的是缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸中的任一种，最优选亮氨酸。
N蛋白394位的氨基酸只要是酪氨酸（tyrosine）之外的其他氨基酸即可，不作特别限定。优选例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱胺酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸中的任一种，更优选的是精氨酸、赖氨酸、组氨酸中的任一种，最优选组氨酸。
G蛋白333位的氨基酸只要是精氨酸和赖氨酸之外的其他氨基酸即可，不作特别限定。优选例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱胺酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸中的任一种，更优选甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、谷氨酸，最优选谷氨酸。
作为N蛋白273位为亮氨酸、N蛋白394位为组氨酸、G蛋白333位为谷氨酸的变异狂犬病毒，可举出例如以含有序列编号1所示的氨基酸序列的N蛋白以及含有序列编号2所示的氨基酸序列的G蛋白作为结构蛋白的变异狂犬病毒。
<关于本发明的狂犬病疫苗制剂>
本发明包括全部至少含有上述变异狂犬病毒的狂犬病疫苗制剂。
本发明的变异狂犬病毒也可以适用于弱毒活疫苗和灭活疫苗中的任一种，然而如上所述，从可以较廉价地制造狂犬病疫苗制剂且作为疫苗的效果也好这些方面出发，优选弱毒活疫苗。
也可以根据目的和用途，在疫苗中适当地添加缓冲剂、等张调节剂、止痛剂、防腐剂、抗氧化剂等。
作为缓冲剂的优选例，可以使用例如磷酸盐、醋酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐等缓冲液。
作为等张调节剂的优选例，可以使用例如氯化钠、甘油（glycerine）、D-甘露醇（D-manitol）等。
作为止痛剂的优选例，可以使用例如苯甲醇（benzil alcohol）等。
作为以防腐为目的的药剂的优选例，可以使用例如硫汞撒（timerosal）、对羟基苯甲酸酯（para-Hydroxy）类、苯氧乙醇、氯丁醇（Chlorobutanol）、苯甲醇、苯乙醇、脱氢乙酸、山梨酸及其他各种防腐剂、抗生素、合成抗菌剂等。
作为抗氧化剂的优选例，可以使用例如亚硫酸盐、抗坏血酸等。
另外，在本制剂中还可含有辅助成分，例如作为保存、功效的辅助剂的光吸收色素(核黄素、腺嘌呤、腺苷等)、发挥稳定作用的螯合剂、还原剂(维生素C、柠檬酸等)、碳水化合物(山梨糖醇、乳糖、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖等)、酪蛋白水解物、各种维生素等。
关于疫苗制剂的剂型等，可以采用公知的剂型，并无特别限定。例如可以作为液体制剂来使用，也可以在口服使用中经冷冻干燥等处理后混入食饵等之中。
另外，在作为灭活疫苗制剂使用的情况下，可以通过公知的方法来进行，例如对培养液进行物理处理(紫外线照射、X射线照射、热处理、超声波处理等)、化学处理(基于福尔马林、氯仿等有机溶剂的处理，基于醋酸等弱酸的处理，基于乙醇、氯、水银等的处理)等。
例如，向培养液中以体积浓度为0.001%至2.0％、优选0.01%至1.0％添加福尔马林，能够通过将培养液置于4℃至30℃下进行1至3天的日光反应来进行基于福尔马林的灭活化。可以用缓冲液将灭活处理病毒洗净，去除福尔马林等灭活剂，且向灭活处理病毒中添加中和剂来进行中和。另外，可以通过膜过滤分离、离心分离等方法回收灭活处理病毒。
灭活疫苗中包含的灭活病毒的含量虽无特别限定，但优选的是，灭活前的病毒含量为103FFU至1011FFU的范围，更优选的是为104FFU至1011FFU的范围。
作为灭活疫苗制剂使用时，可加入公知的佐剂。作为公知的佐剂，可列举出：例如含有动物油(鲨烯等)及其硬化油、植物油(棕榈油、蓖麻油等)及其硬化油、失水甘露醇油酸酯、液状石蜡、聚丁烯、辛酸、油酸、高级脂肪酸酯等的油性佐剂；含有PCPP、皂苷、葡萄糖酸锰、葡萄糖酸钙、甘油磷酸锰、可溶性醋酸铝、水杨酸铝、丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸共聚物、无水马来酸酐共聚物、烯烃衍生聚合物、水包油型乳液、季铵盐阳离子脂质体等的水溶性佐剂；含有氢氧化铝(明矾)、氢氧化钠等的沉降性佐剂；霍乱毒素、致热型大肠菌毒素等微生物毒素等的来自微生物的毒素成分；膨润土、罗莫肽、白介素等其他佐剂。另外，也可将上述佐剂混合使用。
此外，本发明的疫苗制剂也可以是与针对其他疾病的一种或多种疫苗的混合疫苗制剂。
<关于本发明的狂犬病疫苗制剂的制备方法>
本发明的狂犬病疫苗制剂的制备方法，包括全部采用培养细胞来进行人工合成变异狂犬病毒的工序的狂犬病疫苗制剂制造方法。
所述变异狂犬病毒能够通过反向遗传法，采用培养细胞来进行人工合成，因此，能够比较廉价且批次差异小地制造疫苗制剂。
首先制备重组狂犬病毒的基因组-质粒。
在狂犬病毒的亲株中能够使用例如上述狂犬病毒的基因组-质粒。在狂犬病毒亲本株的基因组全链cDNA中，对编码为N蛋白273位和394位、以及G蛋白333位的这三个氨基酸的碱基序列进行变异导入。变异导入可以采用重叠延伸PCR法等公知的点突变方法来进行。
将变异导入后的cDNA片段经限制性酶切和酶连接等处理，插入到质粒载体的多克隆位点。在这种情况下，例如通过将T7启动子序列配置于cDNA片段的上游区域(3’末端侧)、将用于对D型肝炎病毒核酶编码的碱基序列配置于下游(5’末端)，能够使由T7RNA聚合酶所转录的人工正链基因组RNA的3’末端具有与原来的病毒相同的序列。
质粒载体可以采用公知的载体，并未特别限定。
接下来，将上述重组狂犬病毒的基因组-质粒转染至培养细胞，在培养上清中表达重组病毒。转染可以采用公知的方法，并无特别限定。另外，培养细胞也可以广泛地使用BHK细胞等公知的培养细胞，但在通过T7RNA聚合酶表达病毒的情况下，可以使用由T7RNA聚合酶稳定表达的细胞。
在转染重组狂犬病毒的基因组-质粒时，作为辅助质粒，通过同时地转染表达狂犬病毒N蛋白的质粒、同样地表达P蛋白的质粒、同样地表达L蛋白的质粒，可以高效地合成变异狂犬病毒。
接下来，将培养上清中表达的重组狂犬病毒加入至培养细胞中，大量地表达重组病毒。对于此时所使用的培养细胞，可以使用例如来自小鼠神经母细胞瘤的NA细胞、Vero细胞等。
病毒的回收可以采用离心分离、膜过滤分离等公知的方法来进行。另外，将回收的病毒进一步添加到培养细胞中，由此能够实现重组病毒的扩增，进行大量生产。
在将重组病毒作为弱毒活疫苗使用时，在回收后的病毒中适当地添加缓冲剂、等张调节剂、止痛剂、防腐剂以及抗氧化剂等来进行制品化。在将重组病毒作为灭活疫苗使用时，也可以在采用公知的方法将病毒灭活之后，适当地添加缓冲剂、等张调节剂、止痛剂、防腐剂以及抗氧化剂等来进行制品化。
<关于用于制造本发明的狂犬病疫苗制剂的病毒的使用>
本发明包括全部将上述变异狂犬病毒的用于制造狂犬病疫苗制剂的使用。
为了制造狂犬病疫苗制剂，能够通过使用上述变异狂犬病毒，减少病原性恢复等安全隐患，能够比较廉价且大量地制造疫苗效果好的狂犬病疫苗。
<关于本发明的狂犬病预防和治疗方法>
本发明包括全部这样的狂犬病的预防和治疗方法：至少包含使用至少含有上述变异狂犬病毒的狂犬病疫苗制剂的狂犬病预防和治疗方法。
本发明可以适用于能感染狂犬病的动物，例如人、以及犬、猫、狐狸、浣熊、臭鼬、蝙蝠、鼠等非人的动物。
通过例如对于健康个体使用上述的狂犬病疫苗制剂来免疫，可以预防罹患狂犬病，或者在因咬伤带来的狂犬病毒显现后立即集中地使用所述狂犬病疫苗制剂，也可以引发免疫反应来治疗狂犬病。
该狂犬病疫苗制剂可以通过皮下注射、皮内注射、肌肉注射等方式来应用液体制剂，在为野生动物的情况下，也可以将其混入食饵中口服使用。在使用弱毒活疫苗制剂的情况下，通过皮下注射、皮内注射、肌肉注射等方式，例如每次给药103FFU至1011FFU；在口服给药的情况下，例如每次给药104FFU至1011FFU。在使用灭活疫苗制剂的情况下，在进行皮下注射、皮内注射、肌肉注射等时，每次以病毒数为103至1011个来给药；在口服给药时，每次以病毒数为104至1011个来给药。给药次数无特别限定，优选1次或以1周至3个月的间隔进行数次。另外，优选1年使用1次以上。
实施例1
在实施例1中，通过反向遗传法来进行重组狂犬病毒的人工合成。
将在作为狂犬病毒的强毒固定株之一的ERA株基因组全链cDNA的上游区域(3’末端一侧)配置了T7启动子序列、以及在下游(5’末端)配置了用于编码D型肝炎病毒核酶的碱基序列的重组cDNA片段通过PCR法进行扩增。另外，插入D型肝炎病毒核酶的编码序列是为了将由T7RNA聚合酶转录的人工正链基因组RNA的3’末端具有与原病毒相同的序列。
通过限制性酶切和酶连接，将前述cDNA片段插入至质粒载体pUC19的多克隆位点。按上述步骤，制得了保有ERA株基因组全链cDNA的基因组-质粒(以下称为“ERA株基因组-质粒”)。
接下来，以将ERA株基因组全链中的N蛋白273位和394位，以及G蛋白333位这三处的氨基酸分别置换为亮氨酸、组氨酸、谷氨酸的方式，将碱基序列变异后的cDNA片段以ERA株基因组-质粒作为模板，通过重叠延伸PCR法进行扩增(参考非专利文献4)。
通过限制性酶切和酶连接，将ERA株基因组-质粒上的基因组全链cDNA编码区域置换为变异后的基因组全链cDNA片段。按上述步骤，制作了保有将ERA株基因组全链中的三处氨基酸序列变异后得到的变异株(ERA-N273/394-G333株)的基因组全链cDNA的基因组-质粒(以下称为“ERA-N273/394-G333株基因组-质粒”)(关于ERA-N273/394-G333株基因组的碱基序列，参考序列编号3)。
除此之外，也可以采用同样步骤，制作保有将ERA株的基因组全链中的G蛋白333位氨基酸置换为谷氨酸后得到的变异株(ERA-G333株)的基因组全链cDNA的基因组-质粒(以下称为“ERA-G333株基因组-质粒”)。
序列解析结果表明，目标变异存在于各基因组-质粒上。
接下来，利用上述基因组-质粒来尝试各种重组病毒的人工合成。
首先，作为辅助质粒，准备了表达狂犬病毒的N蛋白的质粒、同样地表达P蛋白的质粒和表达L蛋白的质粒(参考非专利文献5)。
前一日，将T7RNA聚合酶稳定表达BHK细胞(以下称为“BHK/T7-9细胞”)播种于24孔组织培养板。当日，将基因组-质粒(2μg/孔)及3种辅助质粒(分别为0.4μg/孔、0.1μg/孔、0.2μg/孔)共转染于BHK/T7-9细胞，培养4至5日，将培养上清回收，以-80℃进行保存。
另外，在将转染后的BHK/T7-9细胞固定以后，以抗狂犬病毒N蛋白单克隆抗体来进行荧光染色。并且，以荧光信号的增大作为指标来确认病毒变异株的存在。
接着，试制作重组病毒库。
添加回收的培养上清来培养来自小鼠神经母细胞瘤的NA细胞，在利用细胞变异效果达到约50%的细胞脱落的时间点，进行培养上清的回收。将此培养上清进行离心分离，以此上清作为病毒变异株库，以-80℃进行保存。
对于按上述步骤进行人工合成后的重组病毒，测量病毒效价。
将稀释了10倍的各病毒液以100μL/孔向24孔组织培养板上的NA细胞中接种。在37℃下静置1小时，待病毒感染细胞后，洗净细胞。将含0.5%甲基纤维素的培养液添加入细胞，以37℃培养2日。在固定了感染细胞后，以抗狂犬病毒N蛋白单克隆抗体进行荧光染色，计算每个孔的荧光点数。作为病毒效价，基于在相同稀释倍数的3个孔中出现的平均荧光点数，计算荧光点形成单位(FFU；Focus forming unit)/mL。
实施例2
在实施例2中，对于重组病毒(ERA-N273/394-G333株)的增殖性进行讨论。
T-25培养瓶中包埋Vero细胞，在复合感染度=0.01条件下，接种ERA株和/或ERA-N273/394-G333株。以37℃静置1小时，待病毒吸附于细胞后，将细胞洗净。以每瓶7mL的培养液加入细胞，以37℃进行培养。分别于感染第3、5、7、9、11日采集100μL培养液，以与实施例1相同的步骤来测量病毒效价。
其结果，感染Vero细胞的ERA-N273/394-G333株病毒效价在感染第7日达到1×106FFU/mL以上，感染第11日达到1×108FFU/mL以上，与ERA株病毒效价基本相同。由该结果显示，虽然狂犬病毒的结构蛋白中的N蛋白273位和394位，以及G蛋白333位三处的氨基酸同时发生变异，但是病毒增殖能力并未受到影响。
实施例3
在实施例3中，对于重组病毒(ERA-N273/394-G333株)的免疫原性进行讨论。
对于每组5只ddY小鼠(鼠龄6周，雌性)分别肌肉内接种104FFU的ERA-G333株和ERA-N273/394-G333株，由此进行免疫。
接种后第2周对免疫小鼠采血，将血清稀释2倍后，以56℃灭活30分钟，再将稀释2倍的血清(25μL)与相当于50%组织培养感染量200倍的CVS株病毒液(25μL)混和。将此混合液于4℃反应一晚，由此使稀释血清中的中和抗体与病毒反应。
在96孔组织培养板上播种NA细胞悬浮液(3×105个/mL、0.1mL/孔)，接种血清-病毒混合液。将细胞在37℃下培养3日。在将感染细胞固定后，以抗狂犬病毒N蛋白单克隆抗体进行荧光染色，以Reed and Munch法计算病毒中和抗体效价。同时，关于来自世界动物卫生组织(OIE)的标准血清(0.5国际单位[IU/mL])，也按同样方法进行测量，将中和抗体效价换算为国际单位[IU/mL]。
结果如图1所示。图1是表示以ERA-N273/394-G333株对小鼠进行免疫的情况下小鼠血清的中和抗体效价图。图1中，横轴的“ERA-G333”为以ERA-G333株对小鼠进行免疫时的结果，“ERA-N273/394-G333”为以ERA-N273/394-G333株对小鼠进行免疫时的结果；纵轴为小鼠血清的中和抗体效价(单位：IU/mL)。
如图1所示那样，以104FFU的重组狂犬病毒进行肌肉内接种来免疫时，就ERA-N273/394-G333株而言，对于全部的个体来讲，小鼠血清的中和抗体效价均在0.5IU/mL以上，与ERA-G333株的情况相比，为较高的数值。由结果所示，ERA-N273/394-G333株与ERA-G333株的情况相比，具有较高的免疫原性。
实施例4
在实施例4中，对于重组病毒(ERA-N273/394-G333株)的ED50(半数有效量)进行讨论。
通过对每组5只ddY小鼠(鼠龄6周，雌性)分别肌肉内接种102FFU至105FFU的ERA-G333株和ERA-N273/394-G333株来进行免疫。接种后第6周，将50%致死量的25倍的疫苗检查用标准攻击株(CVS株)接种于免疫小鼠脑内。观察各小鼠14日，从小鼠存活率计算各株的ED50(半数有效量)。
结果如图2所示。图2为表示ERA-N273/394-G333株的ED50(半数有效量)的图。图2中，横轴的“ERA-G333”表示ERA-G333株的结果，“ERA-N273/394-G333”表示ERA-N273/394-G333株的结果；纵轴表示ED50(半数有效量，单位FFU)。
如图2所示，ERA-N273/394-G333株的ED50(半数有效量)为5,000FFU以下，与ERA-G333株相比，若产生与ERA-G333株等同的效果，只需ERA-G333株约1/3的量。
上述结果表明，就对于G蛋白333位与N蛋白273位和394位施加了变异的株而言，与仅对G蛋白333位施加变异的情况相比，免疫原性提高。另外，通过免疫原性提高使接种量变少，也能够实现相同的免疫效果，因此，通过使接种量变少，其结果是能够进一步提高安全性。
如上述实施例3和实施例4结果所示，ERA-N273/394-G333株具有高的免疫原性和安全性，即作为弱毒活疫苗对狂犬病是有效的。
实施例5
如上所述，已知：即使在对G蛋白333位氨基酸施加变异而使狂犬病毒毒性减弱的情况下，当以突变的方式对G蛋白194位氨基酸进行置换时，也会使病毒的毒性增强，病原性恢复。因此，在实施例5中，对于在ERA-N273/394-G333株的G蛋白194位变化为赖氨酸的情况下是否导致病毒的毒性增强进行讨论。
以与实施例1相同的方法，以将G蛋白194位的氨基酸置换为赖氨酸的方式，对于ERA-N273/394-G333株基因组-质粒及ERA-G333株基因组-质粒进行变异导入。以与实施例1相同的方法，使用上述基因组-质粒，人工合成使ERA株基因组中的三处氨基酸序列和G蛋白194位变异所得的变异病毒(ERA-N273/394-G194/333株)、以及使G蛋白333位以及194位的氨基酸变异所得的变异病毒(ERA-G194/333株)。
对每组5只ddY小鼠(鼠龄6周，雌性)分别脑内接种102FFU至104FFU的ERA-N273/394-G194/333株和ERA-G194/333株。观察各小鼠18日，考察小鼠的存活率的规律。
结果如图3A和图3B所示。图3A是表示脑内接种ERA-G194/333株的存活率的图表；图3B是表示脑内接种ERA-N273/394-G194/333株的存活率的图表。在两图中，横轴表示小鼠接种后天数，纵轴表示存活率(%)，各图表分别表示小鼠未接种(非感染)及接种了102FFU至104FFU时的结果。
在脑内接种了ERA-G194/333株的情况下，如图3A所示，在接种了102FFU情况下17日后的存活率为20%，在接种了103FFU情况下17日后的存活率为40%，病毒出现强毒性，相对于此，在脑内接种了ERA-N273/394-G194/333株的情况下，如图3B所示，任意浓度时存活率均为100%，未观察到病毒的强毒性。
如该结果所示，就ERA-N273/394-G333株而言，即使G蛋白194位氨基酸以突变的方式被置换为赖氨酸，病毒也未毒性增强，通过变异导入G蛋白333位、N蛋白273位以及394位的氨基酸，即使将G蛋白194位置换为赖氨酸也不再出现强毒性，也即由突变引起的病原性恢复的危险性降低。

Claims (8)

1.一种变异狂犬病毒，其特征在于，在所述变异狂犬病毒的结构蛋白中，至少N蛋白的273位为苯丙氨酸以外的其他氨基酸，N蛋白的394位为酪氨酸以外的其他氨基酸，G蛋白的333位为精氨酸和赖氨酸以外的其他氨基酸。
2.根据权利要求1所述的变异狂犬病毒，其特征在于，所述变异狂犬病毒是采用培养细胞进行人工合成所制成。
3.根据权利要求1所述的变异狂犬病毒，其特征在于，所述N蛋白的273位为亮氨酸、所述N蛋白的394位为组氨酸、所述的G蛋白的333位为谷氨酸。
4.根据权利要求1所述的变异狂犬病毒，其特征在于，在所述变异狂犬病毒的结构蛋白中含有序列编号1所示的氨基酸序列的N蛋白及序列编号2所示的氨基酸序列的G蛋白。
5.一种狂犬病疫苗制剂，其特征在于，含有权利要求1所述的变异狂犬病毒。
6.一种狂犬病预防和治疗的方法，其特征在于，使用权利要求5所述的狂犬病疫苗制剂。
7.一种狂犬病疫苗制剂的制造方法，其特征在于，包括人工合成工序：采用培养细胞来合成至少N蛋白的273位为苯丙氨酸以外的其他氨基酸、N蛋白的394位为酪氨酸以外的其他氨基酸、G蛋白的333位为精氨酸和赖氨酸以外的其他氨基酸的变异狂犬病毒。
8.一种用于变异狂犬病毒的狂犬病疫苗制剂制造的使用，其特征在于，所述变异狂犬病毒是至少N蛋白273位为苯丙氨酸以外的其他氨基酸、N蛋白394位为酪氨酸以外的其他氨基酸、G蛋白333位为精氨酸和赖氨酸以外的其他氨基酸的变异狂犬病毒。
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