JPS6360941A - １７−１ａ抗原に対するモノクロ−ナル抗体による腫瘍の免疫療法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 技術背景 ねずみのモノクローナル抗体１７−１Ａの殺腫瘍活性は
裸のねずみおよびヒトを特徴としている。

例えば、ディ、ｌ＼ルリン（Ｄ、　Ｈｅｒｌｙｎ）およ
びエッチ、コブロウスキイ（Ｈ，Ｋｏｐｒｏｖｓｋｉ）
の”Ｉ　ｇＧ２ａモノクローナル抗体のエフェクター細
胞との相互作用によるヒト腫瘍生長の抑制”、プロシー
ディング　オブ　ナショナル　アカデミ−サイエンス、
　ＬＩＳＡ　　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、
　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）７９巻４７６１−４７６５頁参照
。ＭＡｂ１７−１Ａの投与が、結腸直腸または膵臓がん
の部分的または完全な退化を生じた多数の事例が、報告
されている。エッチ、エフ、シアース（Ｉｌ、　Ｆ、　
５ｃａｒｓ）等の“胃腸腺がんをもつ患者に関するモノ
クローナル抗体免疫療法の効果”、ジャーナル　オブ　
バイオロジカル　レスポンプント　モデル（Ｊ、　Ｂｉ
ｏｌ、　Ｒｅ５ｐ。

Ｍｏｄ、　３巻１３８−１５０頁；エッチ、エフ、シア
ース等の“胃腸腺がんに対するねずみモノクローナル抗
体チトチキシック（ｃｙｔｏｔｉｘｉｃ）のフェース■
臨床試験”　（１９８５年）、キャンサー　リサーチ（
Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｃｓ、）　　４５巻　５９１０−５９
１３頁参照。一般に、抗体は５００μｇ以下の単一投与
として投与されている。

発明の要約 本発明は胃腸腫瘍に関連した抗原１７−１Ａに対するね
ずみモノクローナル抗体の複数回、高投与量を使用する
胃腸腫瘍の免疫療法の方法に関するものである。この方
法は胃腸腫瘍に悩む患者に抗原１７−１Ａに対してねず
みモノクローナル抗体を約０．１〜約５ｇの総合投与量
を約１００ｍｇ以上多数回、連続投与量で投与すること
からなる。ねずみ抗体の各投与量は循環する抗体の“連
続的“高水準を達成、かつ維持するため１〜３０間隔に
週間隔まで投与できる。２以上のねずみ抗−１７−１Ａ
抗体の混合物が投与できる。多数回、高投与量療法は化
学療法、放射線療法または外科に対しアジュバント療法
として実施できる。

高投与量のねずみ抗体療法は患者に十分耐えられる。更
に、処置したヒトに一般に発現する抗−ねずみ抗体反応
は驚くべきことに反覆投与中にねずみ抗体のプラズマ半
減期を著しく変えることはない。従って、抗体の高血液
水準が、高投与量の連続注射により達成でき血管内空間
から腫瘍床に抗体の移行を増進し、従って高濃度の治療
抗体を作用位置に供給する。

発明の詳細な説明 本発明は多くの胃腸腫瘍に関連した１７−１Ａ抗原に対
し反覆、高投与量のねずみ抗体による胃腸腫瘍の療法に
関するものである。本治療研究法は多数の知見に基づい
ている。多段、高投与量で投与したねずみ抗−１７−１
Ａ抗体は一般に患者に十分耐えられる、多くの共通側面
効果は緩和な胃腸である。然しなから、アレルギー反応
が若干の患者には反覆療法を制限する。更に、ヒトの抗
−ねずみ抗体反応が、ねずみ抗体により一般に引き起こ
されるが、この反応は投与したねずみ抗体の薬理動力学
に著しくは影響しない。これは連続的、高投与量の抗体
が、提供されて抗体の連続的高プラズマ水準を達成かつ
維持できることを示す。

抗体の高循環水準の維持は静脈内区域から腫瘍への抗体
の移行を最適にし、従って、−層効果的な抗−腫瘍作用
のため抗体の腫瘍への接近を増進する。更に、維持され
た高血液水準により腫瘍細胞の細胞溶解を伝えた更に有
効な抗体従属細胞に対し作用位置で抗体の延長された高
濃度に導かれる。

本発明の方法に依れば、１７−ｉＡ抗原に対するねずみ
抗体が胃腸腫瘍を有する患者に約０．１〜５ｇ、好まし
くは１〜５ｇの全投与量、及び約１００　ｍｇ以上、好
ましくは４００ｍｇ〜１ｇの反覆投与量で投与される。

抗体は非経口的に、好ましくは静脈点滴により投与され
る。抗体は一般に生理学的に容認された賦形薬例えば通
常の食塩水中に懸濁して投与される。抗体の投与量は１
〜３日の間隔ないし約１週間の間隔に亘って与えられる
。

個々の患者に対する投薬歯の処方は特に患者の臨床状態
および有害なアレルギー症またはアナフラキシー如何に
よる。本目的は療法過程に亘り抗体の維持された高プラ
ズマ水準を与え腫瘍部位に抗体の増進された接近を与え
る断片的投与量で抗体を提供することである。

１７−１Ａに対するねずみの抗体は個々にまたは２つ以
上のねずみ抗−１７−１Ａ抗体の混合物（カクテル）で
投与できる。好ましくは、１７−１Ａに対する異なるエ
ピトープ特性を持つ抗−１７−１Ａ抗体は添加剤または
相乗効果的に抗腫瘍活性を増加するため組合せで使用さ
れる。ねずみ抗体は原型の１７−１Ａ抗体または以下に
記載されるＭ７２゜Ｍ７４．　Ｍ７７およびＭ７９抗体
の如き１７−１Ａ抗原の類似または異なるエピトープと
認められる他のねずみ抗体から選択できる。

１７−１Ａ抗原に対するねずみ抗体は１７−１Ａ抗原が
関連する胃腸系の腫瘍の受動的免疫療法に使用できる。

実例は胃腸の腺がん、結腸直腸がんおよび膵臓がんであ
る。ねずみ抗体の処置は化学療法、放射線療法および／
または外科的処置を含め他の形態の療法にアジュバント
となる。特に、ねずみ抗体療法は外科的排除のできない
ミクロまたは小型転位に向けられるアジュバント療法と
じて有用である。

本発明を更に次の例証により説明する。

試験例 試験を２０人の患者に実施して１７−１Ａの反覆、高投
与量に対する患者の耐性を調査し、反覆投与に関するそ
の薬理動力学を調査し、このねずみの免疫グロブリンに
対するヒトの免疫反応（抗体）の特徴を与えた。

患者集団 胃腸の悪性腫瘍をもつ２０人の患者（結腸１７、背部２
、膵臓部１）を、患者が小中腫瘍の重荷即ち７０％（カ
ルノフスキー比率）以上の性能状態および客観的に測定
し得る病症の転位症を持つことをベースにして選択した
。研究は個々の患者の腫瘍標本により１７−１Ａ反応性
を証明するために実施した。２０人の患者のうち７人は
従前に化学療法を受けたが、１３／２０は転位症に対す
る従前の治療を受けなかった。

処置プロトコール 研究はバーミンガムのアラバマ大学、総合がんセンター
の臨床研究単位を実施した。通常の食塩水２５０ｍ１に
希釈した１７−１Ａの全投与ｆｉｔ　４００ＩＩ１ｇを
利用した全抗体点滴を生命徴候を注意深くモニターしつ
１３０分に亘り注入した。全ての点滴液は全投与量の点
滴液の投与に先立って０．７ａ＋ｇの静脈内試験投与量
で先行し次いで３０分のモニターを行った。プロトコー
ルには累進的に増加する数の週間点滴を受ける５患者個
々の４群の増加が包含される。即ち１群−５患者−単一
点滴；２群−２点滴による５患者−１日および８日；３
群−３点滴による５患者−１日、８日および１５日；４
群−４点滴による５患者−１日、８日、１５日及び２２
日。

３群の患者に毒性が示されたため、４点滴を受けた患者
はないが、これらの５患者は２群に加えられ２点滴の治
療を与えた（１日および８日）。全患者は６週間続けら
れ、それらの最終点滴に続いて１週間尿検査、肝臓およ
び腎臓機能、血液数および臨床評価のモニターを行った
。

薬理動力学 薬理動力学的分析を第１の５人の患者についてその単一
点滴の時期に実施しく１７−１Ａの先行接触はない）、
２点滴を受けた１０人の患者はその第２点滴の時期に研
究しく１人は１７−１Ａの先行接触）および３群の患者
はその第３点滴の時期に研究した（２人が、１７−１Ａ
の先行接触）。薬理動力学のため、血液試料を点滴以前
、点滴完了に際して直ちにおよびｌ／２　、　１．　２
．４．１２．２４゜４８、７２時間および８６時間に採
取した。ねずみ免疫グロブリン消失の一般的模型を確認
するために、全薬理動力学研究を受けぬ点滴に関してス
ポット試料を治療前、治療後１，２４および４８時間に
採取した。１７−１Ａのプラズマ水準をうさぎの抗−マ
ウスガンマグロブリンおよび放射線標識した（１２５Ｉ
）親和力精製やぎ抗−マウスＩｇＧ。

Ｆ　（ａｂ’　）　２で被覆したラテックスビーズを利
用する固相ラジオメーターサンドイッチ検定を使用して
定量した。プラズマ中の１７−１Ａの濃度は通常のプラ
ズマに希釈した１７−１Ａの既知濃度の標準曲線と比較
した放射線標識した抗−マウスＩ　ｇＧ、　Ｆ　（ａｂ
’　）　２のラテックス粒子結合量により定量した。こ
の検定の感度はり、Ｏｎｇ／ｍｌであった。

ヒト抗−マウス抗体（ＨＡ　Ｍ　Ａ　’）反応各血清試
料は各患者について各点滴以前および、次いで週×６採
取した。ヒトの抗−１７−１Ａの存在を定量するために
使した検定はラテックスビーズ被覆１７−１Ａ、放射線
標識した（　　　Ｉ）１７−１ＡＩμｇ試験プラズマ１
００μｌ　（３００〜４００ｃｐｍ／ｎｇの比活性）の
同時培養を使用する“二重抗原”系〔ジ、アジソン（Ｇ
、　Ａｄｄｉｓｏｎ）およびシー、ヘール（Ｃ，Ｈａｔ
ｅ）、　ＨｏｒＩｌ、　ｍｅｔａｂ。

Ｒｅｓ、　３巻、　５９−６０頁（１９７１年）〕であ
った。試料は室温で９０分培養し、ビーズで会合した放
射能を前記のパーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）によるビー
ズの遠心分離により定量した〔ニー、ロブグリオ（Ａ、
　Ｌｏｂｕｇｌｉｏ）等、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、
　Ｍｅｄ、、　３０９巻４５９−４６３頁（１９８３年
）〕。プラズマによりビーズに結合した　　Ｉ　　１７
−１ＡのＣｐＩ！ｌは既知の１２５＋　−１７−１Ａの
比活性を使用してプラズマの１７−１Ａ／ｍｌのｎｇに
変換された。この検定は明らかに１７−　１Ａ　（Ｉ　
ｇＧおよびＩｇＭ）に対する１以上の結合位置をもつい
ずれの分子をも検出する。

正常な個人およびがん患者の検定結果は１７−１Ａ接触
以前は５±４ｎｇ／ｍｌのプラズマ（ｎ＝５４）であっ
てこの数値は０〜１６ｎｇ／＋ｎｌの範囲にあった。

２０ｎｇ／ｍ１以上の値が抗体反応として分類された。

１７−１Ａモノクローナル抗体 モノクローナル抗体はセントコ−社（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ
　。

Ｉｎｃ、）により通常の食塩水中１０ｍｇ／ｍｌの精製
懸濁液として提供された。それは使用前は４℃で保存さ
れた。プロトコールはセントコールスポサーＩＮＤ（第
２１６８番）で実施された。

毒　　性 １７’ｌＡ投与の逆効果を第１表に要約した。

第　１　表　　１７−１Ａ点滴に関連した毒性１、　１
回投薬量（４００ｍｇ）　　−５患者３１５−なし ２１５　−　Ｇ、１．徴候 ■、毎週２投薬量（４００＋ｎｇ）　　−１０患者４／
１０−なし ５／１０−　Ｇ、１．徴候 １／１〇−紅潮／頻拍 ■、毎週３投薬量（４００ｍｇ）　−５患者３１５−な
し ２１５　−　　Ｇ、１．徴候およびアナフラキシー（第
３服用） ２点滴液を受けた４患者および３点滴液を受けた３患者
を包含する２０患者中１０患者が逆効果がなかった。最
も屡々観察された副作用は胃腸（９／　２０）で吐き気
および嘔吐（４患者）または腹痛があったり無かった下
痢（７患者）を伴った。徴候は通常点滴の１時間以内に
始まり、２４時間以内続いた。

それらは適度−中位の厳しさで容易に抗−下痢薬の抗−
吐剤により調整された。胃腸の徴候の頻度は１７−１Ａ
点滴の数には関係なかった。１患者が、第２点滴の最中
に紅潮および頻拍の１回があったが、これは点滴速度を
単に遅くすることにより消失した。この患者は点滴中に
も先行点滴にも他の副作用は無かった。

２患者が著しい副作用があった。両患者ともその第１お
よび第２点滴（１０および８日）に関連した吐き気およ
び嘔吐があった。彼等は１５０に１７−１Ａの試験投薬
量に耐え３０分に亘る観察に副作用が無かった。治療点
滴を次に開始したが両者はアナフラキシーと判断される
呼吸困難、頻拍および低血圧を現わした。両点滴を直ち
に停止（与えられた投薬量の１０％以下−）し、患者は
コルチコステロイド、エビネフヒリンおよび抗ヒスタミ
ンによる治療に十分反応した。研究中の患者は検尿、完
全な血液数、腎臓または肝臓機能の異常性を示さなかっ
た。

薬理動力学 各患者について連続プラズマ１７−１Ａ水準を分析しプ
ラズマ消失の１区分のモデルに適合することを見出した
。曲線によるピークのプラズマ濃度、プラズマ半減期お
よび面積を第２表に要約した。

第　　　２　　　表 ヒトにおける１７−　Ｉ　Ａ　（４００ｍｇ）薬理動力
学ピーク濃度　半減期　　ＡＵＧ 従来の抗体　（μｇ／ｍｌ）　　　（ＩＩ）　　　（Ｉ
ｔｉｆｌ−ｘｇ／ｍｌ）なしくｎ＝５）　　　１３９±
８　１５±２　３０１３±１７５１回（ｎ−１０）　　
１４１±５　　１４±１　２８２８±９３２回（ｎ−３
）　　　１０ｇ±２２４±２　３７７１±８１数値は平
均士平均の標準誤差を表わす。ＡＵＧアナフラキシ−（
過敏症反応）を持つ２患者は１７−１Ａの全第３投薬量
を受は入れず、従って、薬理動力学の研究が無かった。

従って、３患者のみが、１７−１Ａに２先行抗体の接触
を持つ群を形成した。結果は全３群の患者に類似した。

第３点滴に関する３患者の研究は単一または第２点滴に
よる患者の群より１７−１Ａのや＼低い血清濃度および
や＼艮い平均プラズマ半減期があった。差異が余り大き
くなく、かつ、群が少数の患者で形成されたため、解釈
は限定される。

ヒトの抗−マウス抗体（ＨＡＷＡ）反応治療に先行した
患者の血清は１２５１−１７−　Ｌ　Ａの被覆したビー
ズを結合する能力は殆んどまたは検出できなかった第３
表に要約した如く、殆んど全ての患者は第１の１７−１
Ａ接触の２５０以内にＨＡＭＡを示した（１７／２０）
。多数（１１／２０）が８０までにＨＡＮＡを持ち８／
１１が１１００ｎ／ｍ１以上の値を持ち、２／１１がｌ
ｏ００ｎｇ／ｍ１以上の値を持った。ピークの値は一般
に１５日または２２日に示され、値は２９日までおよび
越えて降下した。１７−１Ａに１，２または３回の接触
を受けた患者は第４表に示す如（ＨＡＭＡ反応により同
程度であった。

前−治療−０／２０が抗体（範囲０−１５日ｇ／ｍｌ）
を持った ８０−１１／２０が抗体（ｉｌ　−３６−１ｌ１０８ｎ
／　ｍｌ）を持った １５日　　−１５／２０が抗体（範囲一２７−５５９８
ｎｇ／　ｍｌ　）を持った ２２０　−１４／２０が抗体（範囲一６０−５０４６ｎ
ｇ／　ｍｌ　）を持った ２９日　　−１５／２０が抗体（範囲一２３−４９００
ｎｇ／　ｍｌ　）を持った 抗体なし−３／２０ ＊　抗体活性はプラズマｍ１当り　　Ｉ　　１７−１Ａ
のｎｇで表わした。

接触　　非常に高い　中　程　度　低い／無しく＞１０
００）　　　　（４０−９９）　　　　（＜　　４０）
１回３（６０％）１（２０％）１（２０％）２回４（４
０％）４（４０％）２（２０％）３回２（４０％）２（
４０％）１（２０％）＊　プラズマｍ１当り結合した１
７−１Ａのｎｇで過敏症の２患者に興味があった。彼等
は８日１こ１０５５および２８４ｎｇ／　ｒｎｌ、１５
日１こ１７１Ｂおよび３７４５ｎｇ／ｍｌのＨＡＭＡ水
準を有した。彼等は吐き気および嘔吐（１日の点滴に存
したものに類似）を除いて逆作用なしに８日の点滴に耐
性を持ったが、１５日にその第３点滴の時期に過敏症反
応を呈した。副作用のない５人、胃腸徴候の３人、紅潮
／頻拍の１人、および過敏症の２人によってＨＡＭＡ水
準が２０日ｇ／ｍ１以上であった（高めた）時１１の点
滴全てを患者に投与した。患者で熱、たんばく尿または
腎臓障害を示したものはない。

また、これらの１１の点滴中９個に適当なプラズマ試料
が、１７−１Ａ抗体のピークのプラズマ濃度およびプラ
ズマ半減期の定量に利用できたことは興味深い。これら
の値は検出できるＨＡＭＡのない点滴以上に実質的に差
異は無かった。

検　　　討 １７−１Ａモノクローナル抗体４００　ｌｒｌｇの反覆
投与のこのＩ／Ｉｆ相の研究は多数の観察を提供してい
る。一般に、抗体の投与は第１または第２の点滴を受け
た患者の場合十分に許容された。軽い胃腸の症状は明ら
かに抗体の点滴に関係があり、著しい臨床上の問題では
なかった。これらの症状の病因は不明であるが、これら
は第３の点滴に比較して患者の第１の点滴中全く屡々生
じたためアレルギー反応に関連するとは考えられない。

これらは正常な胃腸の粘膜に対するこの抗体の結合の能
力に関係する〔エッチ、シアース（Ｉｌ、　５ｅａｒｓ
）等。

Ｓｕｒｇ、　Ｒｅｓ、　３１巻１４５−１５０頁（１９
８１年）〕。毎週３点滴を受けた患者５名中２名は過敏
症反応があった。潜在的に生命に恐威となるアレルギー
反応の頻度により我々の試験の４−投与予定は阻止され
１５日に抗体投与を必要とする処置予定を中止された。

薬理動力学研究は抗体のこの投薬量がかなり低い投薬量
で投与された他のマウスモノクローナル抗体（放射線標
識した）による観察〔エム。

プリム（Ｍ、　Ｐｒｉｍｍ）等、　Ｊ、　Ｎｕｃｌ、　
Ｍａｄ、　２６巻。

１０１１−１０２５　（１９８５年）およびエム、ロー
ゼンブルム（Ｍ、　Ｒｏｓｃｎｂｌｕｍ）等、　Ｃａｎ
ｃｅｒ　Ｒｃｓ、　４５巻装２９８２−２３８６頁（１
９８５年）〕に近似したプラズマ消失曲線により１００
〜２００μｚ　／　ｍｌのプラズマ濃度を達成できるこ
とを示している。このプラズマ半減期は８日までに１μ
ｇ／ｍ１以下のプラズマ濃度を与えた。従って、１７−
１Ａの実質的なプラズマ濃度の維持は週１回より屡々多
い投与を必要とする。先行研究〔エム、プリム等、　Ｊ
、　Ｎｕｃｌ、　Ｍｅｄ。

２６巻１０１１−１０２３頁（１９８５年）およびニス
、ラーソン（Ｓ、　Ｌａｒｓｏｎ）等、　Ｊ、　Ｎｕｃ
ｌ、　Ｍｅｄ、　２４巻、　１２３−１２９頁（１９８
３年）〕はＨＡＭＡ反応の出現はマウスＩｇの循環水準
の烈しい変化に関連することを示唆している。この現象
の観察の発明者の不足は若干意外である。然しなから、
本発明者等の測定はプラズマｍ１当り結合１７−１Ａμ
ｇに関して循環中に１００〜２００μｚ　／　ｍｌの濃
度を容易に達成する１７−１Ａの点滴により表わされる
ことは注目すべきである。本発明者らは最近発明者らの
ＨＡＭＡ検定を改良し全循環ＨＡＭＡの定量を可能にし
ている。これにより患者の全循環ＨＡＭＡが、１７−１
Ａのこの大循環投薬量のわずかな少留分に結合すること
ができるか否かが明白にされるであろう。

発明者らは他者により報告された〔アール。

シュロツフ（Ｒ，５ｃｈｒｏｆｆ）等、　Ｃａｎｃｅｒ
　Ｒｅｓ、　４５巻。

８７９−８８５頁（１９８５）　）ような抗体点滴に先
行して以前に存在するヒトの抗−マウス抗体の証拠を見
出せなかった。発明者らは放射線を標識したモノクロー
ナルマウス抗−ヒトＦｃ抗体を使用した１７−１Ａ被被
覆ビーズに結合したヒト免疫グロブリンを検出した検定
を使用しヒト抗−マウス抗体の検定を当初試みた。発明
者らはモノクローナル抗体点滴に先行して正常な人およ
びがん患者が、１７−１Ａ被覆ビーズに非特定的に結合
した異なる世のヒト免疫グロブリンを有することを見出
した。

この結合は可溶性抗原により代表的な競争的な抑制を有
せず非−特定的現象でかつ抗体ではないと判断された。

対照として、１７−１Ａ被覆ビーズに結合した後期−予
防注射のプラズマ免疫グロブリンは容易に可溶性抗原に
より抑制された。従って、本研究に使用した二重抗原検
定方式は１７−１Ａに対し一層明白に免疫反応を反映す
ると考えられる。１７−１Ａの１以上の大投薬量の投与
にも拘わらず、このタンパク質に対するヒトの抗体反応
は８０までに屡々探知できる抗体と１５日および２２日
までに得られたかなりの水準の抗体により刺激された。

更に、研究は免疫グロブリンの亜綱および抗−特異型に
関してこの抗体反応を特徴づける途中にある。

１７−１Ａ抗原の生化学的およびエピトープの生産 ヒトの結腸がん細胞系ＤＬＤ−１およびＷ　ｉ　Ｄ　ｒ
はロックフィル、ＭＤのアメリカンタイプ　カルチャー
　コレクションから得られた。結腸がん系ＨＴ−２９は
ジエ、フオフ博士（Ｊ、　Ｆｏｇｈ）。

スローン　ケッタリング　インスチチュートフォア　キ
ャンサー　リーサ、ＮＹ、から提供を受けた。ヒトの組
織は手術除去直後に液体窒素−冷却イソペンクン中で瞬
間冷却した。

放射線標識および免疫沈殿 細胞（５ｘｌｏ　　）は前述の　　■を使用したラクト
パーオキシダーゼ−介在の沃素化により表面〜標識した
。ジエ、アール、エル、ピンク（Ｊ、　Ｒ，Ｌ、　Ｐｉ
ｎｋ）およびニー、チーグラー（Ａ、　Ｔｉｅｇｌｅｒ
）　（１９７９年）、　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　ｉｎｉｍｍｕｎｏＩｏｇｙ、アカデミツク出版社
、ＮＹｏＭＡｂｓをタンパク質Ａ−セファロース（シグ
マ社。

セントルイス、　ｍｏ）に混合した免疫ソルベント（Ｉ
ｎ＋ｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔｓ）は標識した細胞リセー
ト（１ｙｓａｔｅｓ）に４℃で２時間添加した。混合し
た材料は試料緩衝液中で沸騰して溶出し、レムリ−（Ｌ
ａｃａｍ　ｌ　１　）による５ＤＳ−ポリアクリラミド
ゲル電気泳動（ＳＤＳ　−ＰＡＧＥ）により分析した。

Ｕ、　Ｋ、　Ｌａｃｍｍｌｆ、　Ｎａｔｕｒｅ、　２２
７巻、　６８０−８８５頁（１９７０年）。

ＭＡｂの選択 結腸がん組織は単一転位のため肝臓のロボトミーを受け
た５１才の老女性患者より得た。

１７−１Ａの陽性の腫瘍組織を注意深く分離し、ミンチ
し、均質化し、プラズマ膜をトウスター（Ｔｏｕｓｔｅ
ｒ）らにより記載された（ｆ、　Ｃｅ１１．　Ｂｆｏｌ
。

４７巻、　８０４−６１８頁　（１９７０年）如く精製
した。

（Ｃ５７ＢＬ／６Ｘ　Ｂａ１ｂ／　ｃ）　Ｆ　Ｉ牝マウ
スからの背髄細胞Ｐ　ｓ　ｘ　６３Ａ　ｇ８．６５３融
解は標準方法〔ガルフル（Ｇａｌｆｒｅ）ら、　Ｎａｔ
ｕｒ、　２６６巻、　５５０−５５２頁〕を使用してボ
ルデテーラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）百日咳アジュバン
トと共にタンパク質３ｍｇに相等する結腸がんプラズマ
膜製剤の単一１．ｐ、注射後３日に実施した。

融解及細胞はマウス腹膜マクロファージを含む９６個の
ミクロタイターのプレート中のＨＡＴ選択媒体（ヒポキ
サンチン、アミノプテリン、チミジン）中に加えた。バ
イブリドの上澄液は予防注射のため採取した肝臓転位を
起した冷凍組織部分のイムノパーオキシダーゼ汚染によ
り選別した。転位の結腸がん細胞および隣接する肝臓中
の胆汁管と反応し肝臓細胞と反応しない抗体は更に第５
表に列記した非−悪性上皮組織のパネルについて試験し
た。この関係中１７−１Ａ−類似の着色形態を示す抗体
は限定した希釈により少なくとも２倍のクローンを生じ
た。

第　　　５　　　表 正常の上皮組織■における１７−１Ａ抗原の分布組　織
　試験数／陽性数　　　　備　　考結　腸　　　１４／
　１４　　　　粘膜の強い汚染中　腸　　　５１５　　
　　粘膜の強い汚染胃　　　　６／９　　　限定区域の
時折り弱い汚染 胆　嚢　　　１／１　　　粘膜の強い汚染膵１１１ａ　
　　　ｌ／１　　　　ランゲルハンスの腺房導管、小島
の強い汚染 肝　臓　　　６／６　　　　胆汁管の強い汚染；肝臓細
胞陰性 腎　臓　　　２／２　　　　ヘンル環中程度汚染；末梢
管強く汚染；近接 管、腎皮球体、陽性 肺　　　　２／２　　　　気管支の強い汚染；肺胞中程
度汚染 甲状腺　　　４／４　　　ン戸胞性上皮の強い汚染第　
　　　５　　　表　　（続き） 組　織　試験数／陽性数　　　　備　　考乳　腺　　　
３／３　　　小葉および導管の強い汚染 胸腺　０／１ 皮　膚　　　２／２　　　汗腺の強い汚染；表皮陰性 ■　試験した正常組織の全てに一致した汚染の型を示し
たＭＡｂｓ　１７−　Ｉ　Ａ、　Ｍ７２．　Ｍ７４゜Ｍ
７７およびＭ２Ｓによる免疫組織化学的汚染により確認
した。

免疫吸取 免疫沈降物はＳＤＳ　−ＰＡＧＥにより分離し、トウビ
ン（Ｔｏｗｂｉｎ）ら（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ
ａｄ、　Ｓｃｉ。

ＬＩＳＡ、　７６巻、　４３５０−４３５４頁（１９７
９年）により、ニトロセルロース膜〔シュライヒエル（
ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ）およびシュル（Ｓｃｈｕｌｌ）
　、ダッセル、ＦＲＧ）に電気泳動的に移動され、かつ
移動した抗原は間接的イムノパーオキシダーゼ技術〔ビ
、ホルツマン（Ｂ、　Ｉｌｏｌｚｍａｎｎ）ら、　Ｊ、
　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６１巻、　３６Ｂ−３７７頁
（１９８５年）〕により視覚化した。

流動サイトメーター分析 ＨＴ−２９細胞は氷上で未濃縮、１０×または５０×濃
縮−上澄液のＭＡｂｓ、　Ｍ７２．　Ｍ７４．　Ｍ７７
またはＭ２Ｓにより予備培養し、次いでビオチン化した
１７−１Ａ抗体（１０μｇ　／　ｍｌ　）およびアビデ
ィン−フィコエリスリン〔ベクトンーディキンソン（Ｂ
ｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、　　？ランテンビラ
、　ＣＡ）　）により培養した。蛍光像をＥＰＩＣ３−
Ｖ　　Ｃクールター　エレクトロニクス（Ｃｏｕｌｔｅ
ｒ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、バイアリーン。

ＰＬ、’））−により分析した。

免疫組織化学 凍結した組繊細片を調製し、本質的には他に記載された
間接的免疫パーオキシダーゼ技術により着色した。ゲッ
トリンガ−（Ｇｏｔ　ｔ　ｌ　ｉ　ｎｇｅｒ）ら。

Ｉｎ５ｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　３５巻、　１９９−
２０５頁（１９８５年）。

簡単に述べると、風乾した細片（７μｍ）をアセトン中
に１０分間固定し、Ｍ　Ａ　ｂ　（１０μｇ　／　ｍｌ
または未希釈上澄液）で３０分間培養し、ＰＢＳ中で洗
θし、ヒト血清２０％を含有するＰＢＳ中に希釈したパ
ーオキシダーゼ−共軛うさぎ抗−ツウ２１面抗而清〔シ
アツバ（Ｄｉａｎｏｖａ）　、ハンブルグ。

ＦＲＧＩに３０分間接触した。細片はＰＢＳ中で洗浄し
た後、０．００１％Ｈ７９２を含有するｐＨ７，４の０
　、０２　Ｍの緩衝液中の０．００４％３−アミノ−９
−エチルカルバゾール中で２０分培養し、続いてマイヤ
ーのヘマリウム（Ｈｅｍａｌｕｍ）により逆着色した。

結　　　果 １７−１Ａ　　Ａｇの生化学分析 １７−１Ａ　　Ａｇの当初の生化学分析は一つのヒト腫
瘍細胞系（ＨＴ−２９）に対してのみ行われるので、発
明者らは表面ヨウ素化により二つの付加的ヒト結腸がん
系に関して示された１７−１ＡＡｇの性質を調査した。

ＭＡｂ１７−１Ａによる沈殿は３者の細胞系、ＤＬＯ−
１，ＷｉＤｒおよびＨＴ−２９において同一の単一タン
パク質バンドを示し、これは３７ＫＤの見掛の分子量を
もって５ＤＳ−ＰＡＧＥ系に移動した。蛍光圏強度から
判断されるように、３細胞系から沈殿可能の抗原量は全
く可変的で、結腸系ＤＬＤ−１は最高量の放射線標識抗
原を与えた。電気泳動に先行して２−メルカプトエタノ
ールが沈殿に添加された還元条件下では３３ＫＤの明白
なバンドが、３細胞系の全てから得られた。更に、約４
０ＫＤ成分の主要成分もまたＨＴ−２９リセート中に時
々見出された。

このバンドは明らかに不在かまたはＷ　ｉ　Ｄ　ｒ細胞
から沈殿されなかった。

チュニカマイシン（２μｇ　／　ｍｌ　）によるＨＴ−
２９細胞の２４時間培養は非還元条件で３０ＫＤ、還元
条件で２６ＫＤの新バンドの出現を与え、１７−１ＡＡ
ｇが２個の結合したグリコジル化の位置を示した。１７
−１Ａの糖タンパク質の性質は更にニュラミニダーゼに
よる１７−１Ａの沈殿の処理により実証され、これは見
掛は分子量の軽微な然も明白な還元を与えた。

新ＭＡｂによる１７−１Ａのエピトープ分析１７−　ａ
Ａ　Ａｇ　（Ｍ７２．　Ｍ７４．　Ｍ７７、　Ｍ２Ｓ）
に対し向けられた新規の４ＭＡｂｓが凍結した組繊細片
について１７−１Ａ−類似の反応性に対し結腸がん転位
からの膜製剤により免疫したねずみから発生したハイブ
リドーマの上澄液を選別することにより得られた。４抗
体の全ては当初の１７−１Ａ抗体に見られる同一分子量
のタンパク質を沈殿する。新規のＭＡｂｓにより確認さ
れた抗原の同一性を確認するため、広範な免疫吸取分析
を実施し、それにより１７−１Ａ免疫沈殿が５ＤＳ−Ｐ
ＡＧＥによる分離後にニトロセルロースに移行し新規の
４試薬により試験した。前文に示した如く、３７ＫＤタ
ンパク質に結合した新規の４抗体はアイソタイプの配合
した対照ＭＡｂｓでは得られなかった。新規の４ＭＡｂ
ｓのエピトープ特異性を分析するためクロス−阻害試験
を実施した。流動血球計算分析においてビオチニル化し
た１７−１Ａ抗体のＨＴ−２９細胞への結合は完全にＭ
ＡｂｓＭ７２およびＭ７４（第６表）による腫瘍細胞の
予備培養により阻害された。対象としてＭＡｂｓＭ７７
およびＭ７９は試験した全ての濃度においてビオチニル
化した１７−１Ａ抗体の著しい阻害活性を示さなかった
。

発明者らは更にエピトープ特異性が抗体のイディオタイ
プに関係があるかどうかを分析した。全ＭＡｂｓはやぎ
の１７−１Ａ抗体に対し発生した抗−アイディオタイプ
の抗血清〔ウィスター研究所。

フィラデルフィアのドロシイ　バーリン（Ｄｏｒｏｔｈ
ｙｌｌｅｒｌｙｎ）傅士により提供された〕との反応性
を分析した。抗−アイディオタイプの抗血清は交叉−阻
害する２ＭＡｂｓ　（Ｍ７２およびＭ７４）と強く反応
したが、ＭＡｂｓ　　Ｍ７７およびＭ７９とは完全に反
応しなかった。これらのデータはＭＡｂｓ　　１？　−
Ｉ　Ａ。

Ｍ７２およびＭ７４は３７ＫＤ糖タンパク質に関して同
一または密接に関係したエピトープを認めているが、Ｍ
Ａｂｓ　　Ｍ７７およびＭ７９はこの抗原に対し付加的
エピトープを限定することを示している。

第　　　６　　　表 交叉阻害活性 １７−１Ａ　　Ｍ７２　　Ｍ７４　　Ｍ７７　　Ｍ７９
やぎ抗− ダーゼにより示された。

十：光学密度（ＯＤ）　＞０．８ ＋＋：ＯＤ＞１．６ −　：　ＯＤ＜０．０５ ＋：＞２５％ ＋＋：＞８０％ 一：＜１０％ １７−１Ａ　　Ａｇの組織分布 直接免疫パーオキシダーゼ技術を用いることによって、
種々の正常ヒト器官及び種々のヒトがん中に１７−１Ａ
　　Ａｇが同定された。同時に、新しい４つのＭＡｂが
平行組織部位に分析された。

結腸組織における１７−１Ａの発現については、正常な
粘膜が試験された１４名の結腸がん組織と同程度に染色
されることが見出された。また１７−１ＡＡｇは小腸の
上皮内面、胆嚢、気管及び甲状腺、乳腺、汗腺、及び外
分泌及び内分泌１■臓を含む種々の線構造上に明らかに
検出された。更に、１７−１Ａ　　Ａｇは腎臓の細管末
端およびヘンレ（Ｉｌｅｎｌｅ）のループに、及び肝臓
の胆管（肝細胞でなく）によって発現することが見出さ
れた。

胃においては、正常粘膜は普通、限定された区域に弱い
染色が見出された。しかしながら、種々の程度の小腸化
生（胃粘膜中に小島状に存在する）５人の患者について
、これらの領域はＭＡｂ１７−１Ａ及び４つの新しいＭ
Ａｂによって強力に染色された。１７−１Ａ　　Ａｇも
また、試験された９個の胃がんの全てに明らかに発現さ
れた。

検　　　討 我々は１７−１Ａ　　Ａｇが非還元条件下でのＳＤＳ　
−ＰＡＧＥにおいて３７ＫＤの見掛分子量であるように
移動する糖タンパクであることを示した。

３種の異なる結腸がん細胞ラインとの比較分析では、非
還元条件が用いられる場合、１７−１ＡＡｇの異種性を
示さなかった。１７−１Ａ沈殿を２−メルカプトエタノ
ールで還元し、ＳＤＳ　−ＰＡＧＥによる分離では、３
３ＫＤのバンドが表われた。これは試験した全ての細胞
ラインについて見出された。更に、４０ＫＤバンドは、
ＤＬＤ−１細胞溶解物中には主成分の１つとして、また
ＨＴ−２９細胞溶解物中により低い水準で表われた。

この４０ＫＤバンドはしたがってＷ　ｉ　Ｄ　ｒ細胞か
らの溶解物には存在しなかった。ＤＬＤ−１またはＨＴ
−２９細胞からの沈殿物を１回の実験で処理し、迎元下
または非還元下で並行した条件で分析した場合、２−メ
ルカプトエタノールの存在下では３３及び４０ＫＤの２
つのバンドが、その不存在下では３７ＫＤの１本のバン
ドが生じた。したがって、１７−１Ａ　　Ａｇの還元で
は異なる電気泳動の移動度を有する２種の新しい分子が
生じている。分子内ジスルフィド結合の存在によって、
この特異な泳動の状態を説明できるであろう。

別法として、１７−１Ａ　　Ａｇは、非還元条件下では
同一の泳動挙動を示すタンパクの二量体として実際には
存在しているものと考えられる。

Ｗ　ｉ　Ｄ　ｒ溶解物中に４０ＫＤの分子が存在しない
ということは、異なる細胞ライン中のラクトパーオキシ
ダーゼ介在ヨウ素化に関するこのタンパク質の異なる親
和性によって説明できるであろう。

代謝標識および架橋化学を用いる更に別の分析が、上記
の問題を解決するのに必要であろう。ロス（Ｒｏｓｓ）
等は、３０Ｋ　Ｄ及び４０ＫＤサブユニツトから成るＭ
Ａｂ　ＧＡ７３３によって定義されるがん関連表血糖タ
ンパクについて最近記述している。

彼等は、１７−１Ａ抗体は同じ抗原を認識するが、ＭＡ
ｂ　ＧＡ７３３と異なる抗原決定基に結合することを示
唆している。ここで記述した抗体との直接の比較により
、これらの複数の抗原の関連性が明らかになるであろう
。

我々が得た４種の新規な抗１７−１Ａ　　ＡｇＭＡｂは
正常器官および腫瘍において、元の１７−１Ａ抗体に匹
敵する組織反応性を示した。これまでのところ、試験さ
れた種々の組織において異なる抗原決定基発現は見られ
ていない。これらＭＡｂのうちの２つ（Ｍ７２及びＭ７
４）は、交差ブロッキング実験によって判断されるよう
に、ＭＡｂ１７−１Ａ検出されるものと緊密に関連した
決定基を認識する。一方、ＭＡｂ−Ｍ７７及び−Ｍ７９
は少なくとも１つの他の抗原決定基を明らかに定義する
。何故ならば、これらはビオチニル化１７〜１Ａ抗体の
結合を阻害しないからである。興味あることに、これら
ＭＡｂの抗原決定基特異性はヤギ抗イデイオタイプ抗血
清との反応性と相関される。これらＭＡｂは元の１７−
１Ａ抗体と関連する生物学的活性を分析するのにａ用で
あろう。

１７、−１Ａ　　Ａｇは非悪性上皮器官内で広く発現し
、かつ１７−１Ａ陽性組織由来の大部分のがん中にも存
在する。正常組織及び悪性組織間の発現の量的差異は、
同一患者由来の直結腸がんと正常粘膜の比較組織化学分
析においては証明されなかった。しかしながら、この正
常細胞及び悪性細胞」二のこの上皮性抗原の構造上の異
質性は、この分析では決定できなかった。

当業者であれば通常の実験以外を用いることなく、本明
細書に記述した具体的態様に対する多くの均等技術を認
識し、または確立できるであろう。

そのような均等物は本発明に含まれるものとする。

（外４名） 手続補正書 昭和６２年　９月７２０ 特許庁長官　　小　川　邦　夫　　殿 ２、発明の名称 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所 名　称　　セントコ−・インコーホレーテッド４、代理
人 住　所　　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手
町ビル　２０６号室 ５、補正の対象

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）特異的に１７−１Ａ抗原のエピトープに結合する
   ねずみモノクローナル抗体（またはかゝる抗体の少なく
   とも２つの混合物）の少なくとも１００ｍｇを包含し、
   該抗体（または抗体の混合物）が例えば通常の食塩溶液
   中に懸濁されることを特徴とする非経口投与に適した投
   与単位の形態の薬剤。
2. （２）胃腸腫瘍例えば胃腸腺がん、結腸直腸または膵臓
   がんの治療に使用するための特許請求の範囲第１項記載
   の医薬。
3. （３）特異的に１７−１Ａ抗原のエピトープに結合する
   ねずみモノクローナル抗体（またはかゝる抗体の少なく
   とも２つの混合物）であって、１回の投薬当り少なくと
   も１００ｍｇの多数回投与量で非経口的投与のため包装
   または供与される時、該抗体（または抗体の混合物）が
   例えば通常の食塩溶液中に懸濁される抗体。
4. （４）胃腸腫瘍例えば胃腸腺がん、結腸直腸または膵臓
   がんの治療に使用するための特許請求の範囲第３項記載
   の抗体（または抗体の混合物）。
5. （５）１７−１Ａに特異的なそれぞれ異なるエピトープ
   を持つ１７−１Ａ抗原の１つのエピトープに特異的に結
   合する少なくとも２つのねずみモノクローナル抗体の混
   合物であって、該抗体の混合物が例えば通常の食塩溶液
   中に懸濁される抗体混合物。
6. （６）ねずみモノクローナル抗体Ｍ７２、Ｍ７４、Ｍ７
   ７およびＭ７９のいずれかを包含することを特徴とする
   特許請求の範囲第５項記載の混合物。
7. （７）例えば、胃腸腫瘍例えば胃腸腺がん、結腸直腸ま
   たは膵臓がんの治療に使用のための特許請求の範囲第５
   項または特許請求の範囲第６項に記載の混合物。
8. （８）ねずみモノクローナル抗体Ｍ７２、Ｍ７４、Ｍ７
   ７及びＭ７９のいずれかのモノクローナル抗体。