CN101565438B - 一种泰乐菌素纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种泰乐菌素纯化方法。本发明描述了用三氯甲烷从发酵滤液中萃取泰乐菌素时，其萃取液的后处理即纯化方法。方法要点如下：将萃取液浓缩至基本除净三氯甲烷；然后用酸水溶解浓缩物；加入乙酸丁酯或甲苯或4-甲基-2-戊酮；用碱液调pH7.5～9.5，萃取，分相；向酯相加入酒石酸水溶液或磷酸水溶液反萃取，得反萃取液喷雾干燥；或将反萃取液调pH7.5～10.5，压滤或离心，得泰乐菌素。
Description
技术领域
本发明涉及抗生素提炼技术。具体涉及泰乐菌素的提炼技术，是一种纯化泰乐菌素的方法。
背景技术
泰乐菌素为畜禽专用抗生素，该抗生素是弗氏链霉菌的发酵产物。目前国内外均采用液体深层发酵，发酵液加入絮凝剂(如硫酸铝或氯化铝)处理后，经固液分离，得发酵滤液，发酵滤液用乙酸丁酯进行液液萃取，得酯相液，酯相液经反萃取、浓缩和喷雾干燥等过程即可获得酒石酸或磷酸泰乐菌素。
用乙酸丁酯从发酵滤液中萃取泰乐菌素，其不足之处为以下两点：
1、乙酸丁酯(以下简称BA)用量大，一般为发酵滤液体积的60～80％(两次萃取的用量)，BA回收率一般为96％左右，按此计算年产千吨泰乐菌素的工厂，每天BA周转量约为500m3，净损耗7m3左右，价值人民币9万元左右；按年生产300天计算，一年BA消耗量折成人民币计算约2000万元。
2、按用60％的BA分两遍从发酵滤液中萃取泰乐菌素，第二遍萃取后所得的酯相液套用。一般第一遍泰乐菌素萃取率仅为77～84％，两遍总萃取率最高可达94％，另外约6％残留在水相中，随废水被排放掉。按此计算年产千吨泰乐菌素工厂，每年随废水排放掉的泰乐菌素多达60吨左右，价值1800万元左右。
我们的实验表明：用三氯甲烷或二氯甲烷从发酵滤液中萃取泰乐菌素时，其萃取能力极强，用相当于发酵滤液体积1/30～1/20量的三氯甲烷来萃取泰乐菌素，一遍萃取率可达到94％，经二遍萃取总萃取率可达99％；与用乙酸丁酯萃取泰乐菌素比较，可节省溶剂4/5以上。但是，用三氯甲烷或二氯甲烷从发酵滤液中萃取泰乐菌素时，杂质萃取率也极高，可萃取出大量的红色素及其它杂质。该色素的去除较为困难，有人试图先用活性碳脱色，然后在大量的石油醚中使泰乐菌素析出。该方法不足之处是，石油醚用量大，成本高，并且去杂不彻底，还需进一步纯化。因此，该方法至今没有用于生产。我们经过研究建立了一套新的完整的泰乐菌素提炼工艺。
本提炼工艺是采用如下步骤来纯化泰乐菌素的：
a、将萃取液脱水后调或不调pH6.0～7.0，然后蒸馏，去除溶剂，得浓缩物。
b、用酸水将浓缩物中的泰乐菌素溶除(这步已达到了部分纯化的目的)。
c、加入极少量的乙酸丁酯或其它疏水性溶剂(仅为发酵滤液量的2～4％)，然后调pH 7.5～9.5，将泰乐菌素萃取到有机相，得含TL的有机相。
d、向有机相中再加入酸水进行反萃取，得含泰乐盐的水溶液。
经以上几步纯化过程，即可除去水溶性差的，或不能成盐的，或不溶于丁酯中的，或可溶于丁酯中但不能成盐而转移到水相中的杂质，从而达到纯化的目的。
用本发明技术来去除三氯甲烷或二氯甲烷萃取物中的杂质时，产品纯度高，收率高、收率可达92％以上，并且溶剂用量很少，优于专利中公开的技术和现在生产中应用的技术。
发明内容
本发明是一种泰乐菌素提取液的纯化方法，本方法特征在于：泰乐菌素发酵滤液在用三氯甲烷或二氯甲烷萃取后，所获得的含泰乐菌素的二氯甲烷或三氯甲烷萃取液采用如下步骤进一步纯化：
1、将含泰乐菌素的二氯甲烷或三氯甲烷萃取液，经常压或减压蒸馏，或用酸水调pH5.0～7.5后蒸馏，除净或除去大部分三氯甲烷或二氯甲烷，得含泰乐菌素的浓缩物，该浓缩物可以是油状粘稠液体或膏状或固体状态。
2、用酸水溶解浓缩物，得含泰乐菌素盐的水溶液；酸水可以是磷酸水溶液或硫酸水溶液或盐酸水溶液或酒石酸水溶液或草酸水溶液或柠檬酸水溶液。
3、向上述含泰乐菌素盐的水溶液中加入乙酸丁酯或乙酸乙酯或甲苯或4-甲基-2-戊酮，在搅拌条件下，用碱液调pH 7.5～11.5，充分混合，萃取，静置分相或离心分相，得含泰乐菌素的酯相液。
4、向酯相液中加入酒石酸水溶液或磷酸水溶液，进行反萃取，分相得反萃取液，即得含酒石酸泰乐菌素或磷酸泰乐菌素的水溶液。
5、含酒石酸泰乐菌素或磷酸泰乐菌素的反萃取液可按如下方法进一步分离纯化：
方法(1)：反萃取液可以用活性碳脱色也可以不用活性碳脱色，然后喷雾干燥，得酒石酸泰乐菌素或磷酸泰乐菌素。
方法(2)：用碱液调反萃取液的pH值为7.5～11.5，压滤或离心分离，得泰乐菌素湿结晶和结晶母液，湿结晶进一步干燥，得含水量小于25％的泰乐菌素碱。母液中还有泰乐菌素碱存在，可以用三氯甲烷萃取回收，或用盐析法进一步回收母液中的泰乐菌素，即向母液中加入NaCl或Na2SO4至饱和状态，使泰乐菌素析出，经固液分离即可将泰乐菌素从母液中分离出来。
6、上述泰乐菌素碱可用甲醇溶解，并加入酒石酸或磷酸，成盐后蒸馏或喷雾干燥，除净甲醇，得酒石酸泰乐菌素或磷酸泰乐菌素。
本发明优化的纯化方法如下：
1、将含泰乐菌素的二氯甲烷或三氯甲烷萃取液用酸水调pH6.5～6.9后，在50～90℃，常压或负压条件下蒸馏，除去有机溶剂，得浓缩物。
2、用相当于泰乐菌素重量/体积比为2～10倍量的酸水溶解浓缩物中的泰乐菌素，得含泰乐菌素盐的水溶液。
3、向水溶液中加入相当于泰乐菌素重量/体积比为1.2～10倍量的乙酸丁酯或甲苯或4-甲基-2-戊酮，然后用碱液调pH7.5～11.5，充分混合萃取，分相，得含泰乐菌素的第一遍萃取液和水相液，水相液用相当于泰乐菌素重量/体积比为1.2～10倍量的乙酸丁酯或甲苯或4-甲基-2-戊酮进行第二遍萃取，分相，得第二遍萃取液。
4、合并上述第一遍萃取液和第二遍萃取液，加入相当于萃取液1/2～2倍体积的酒石酸水溶液或磷酸水溶液，充分混合，进行反萃取，分相后得含酒石酸泰乐菌素或磷酸泰乐菌素的反萃取液。
5、将反萃取液于150～180℃喷雾干燥，得酒石酸泰乐菌素或磷酸泰乐菌素。
6、或将反萃取液用碱液调pH 7.5～10.5，压滤或离心，得湿泰乐菌素和母液，湿泰乐菌素干燥，母液中残留的泰乐菌素可用三氯甲烷或二氯甲烷萃取回收或用盐析法回收；
7、以上获得的泰乐菌素用甲醇溶解，并加入酒石酸或磷酸调pH 5.0～7.0，蒸馏或喷雾干燥，除去甲醇，得酒石酸泰乐菌素或磷酸泰乐菌素；
以上所述的用酸水溶解浓缩物，所得的含泰乐菌素盐的水溶液还可以用0.5～20％(重量/体积比)的活性碳脱色，过滤，得脱色液；脱色液用下述三种中任意一种方法处理都可以获得合格的产品：
方法(1)、脱色液喷雾干燥，得泰乐菌素盐；
方法(2)、脱色液用碱液调pH 7.5～10.5，压滤或离心，得泰乐菌素碱；
方法(3)、向脱色液中加入乙酸丁酯或甲苯或4-甲基-2-戊酮，并用碱液调pH 7.5～10.5，充分混合萃取，分相，得含泰乐菌素的酯相液。向酯相液中加入酒石酸水溶
液或磷酸水溶液进行反萃取，得含酒石酸泰乐菌素或磷酸泰乐菌素的反萃取液；用喷雾干燥的方法处理反萃取液，可以得到酒石酸泰乐菌素或磷酸泰乐菌素，也可以用碱液调反萃取液pH 7.5～10.5，压滤或离心，得泰乐菌素碱。用第3种方法处理，所得到的产品质量最好。
含泰乐菌素的三氯甲烷或二氯甲烷萃取液经蒸馏浓缩后，所得的浓缩物还可进行如下处理：
向没有除净二氯甲烷或三氯甲烷的浓缩物中加入乙酸丁酯或甲苯或4-甲基-2-戊酮，然后继续在50～65℃减压蒸馏，除净浓缩物中的三氯甲烷或二氯甲烷，然后加入或不加入酸水，充分搅拌，溶解浓缩物，调pH7.5～11.5，将泰乐菌素转入酯相，弃水相，再用酸水反萃取，即可达到纯化的目的。
具体实施方式
实例一、用三氯甲烷从发酵滤液中提取泰乐菌素(TL)
1、发酵滤液精滤：用0.2～1μm过滤器精滤。
2、调pH：用40％NaOH调精滤液pH 8.5(在20～25℃)。
3、萃取：用三氯甲烷(TT)分二次萃取TL。
3.1第一遍萃取
3.1.1三氯甲烷用量：精滤液∶三氯甲烷＝100∶4～6
3.1.2萃取条件：20～25℃，pH 7.8～8.5，充分搅拌下萃取20～30分钟。
3.1.3分相：
第一遍萃取完成后，将液体完全压入分相罐中，静置分相，待分相完成后，分别用离心机进一步离心下层三氯甲烷相和上层水相，得第一遍萃取液和第一遍萃取后水相液。
3.2第二次萃取：
向第一遍萃取后水相液中再加入与第一遍萃取相同量的三氯甲烷，进行第二次萃取、分相，条件同第一遍萃取，得第二次萃取液(三氯甲烷相)和第二遍水相液；水相液经蒸馏回收三氯甲烷后弃之；第二遍三氯甲烷相套用。
4、第一遍萃取液进一步纯化、分离TL：
有以下几种方法：
方法1：a、萃取液用硫酸钠脱水后加入2～3％(w/v)的活性碳脱色；
b、脱色液加入相当于TL1/2摩尔的酒石酸(或不加入酒石酸)，然后用外循环蒸发器，于58℃-0.1mPa下蒸馏，浓缩到TL∶三氯甲烷＝1∶1.5左右，得浓缩液；
c、浓缩液采用双滚筒干燥机，进一步除去三氯甲烷，得酒石酸泰乐或泰乐碱；
d、泰乐碱成盐：将泰乐碱用1.5～2倍甲醇溶解，加入相当TL 1/2摩尔的酒石酸，溶解后用双滚筒干燥器干燥，得酒石酸泰乐菌素。
方法2：a、将萃取液用无水硫酸钠脱水，之后于58℃、-0.8～0.1mPa蒸馏，浓缩到三氯甲烷∶TL＝1∶1时，萃取液中加入1/2量的水，然后用酒石酸调pH 6.5～6.9，于58℃-0.1mPa蒸馏，除净三氯甲烷。
b、加入酒石酸和等量的水，搅拌调pH 3.8。
c、加入相当TL2～3倍量的BA分二次萃取TL，方法是：在加入BA后调pH 8.5，进行第一次萃取。离心分相，水相再加入BA进行第二次萃取，第二次萃取时可向水相中加入NaCl或Na2SO4到饱和状态，离心或静置分相。
d、合并两次萃取液，加入1/2量的纯净水，加入酒石酸调pH3.8，反萃取，得反萃取液(水相液)。
e、反萃取液用石灰水调pH5.5后，喷雾干燥；或将反萃取液用Na2CO3调pH8.5，用高压板框压滤，得滤液和泰乐碱；滤液加入NaCl后进一步盐析以分离残余的泰乐碱，或用少量三氯甲烷萃取残留的TL碱，TL碱可采用方法1“d”中的方法成盐。
方法3：a、萃取液用硫酸钠脱水后，于55℃-0.1mPa蒸馏，浓缩到1/2体积时，进一步经双滚筒干燥机除去三氯甲烷，得TL碱。
b、用pH 3.8，相当于TL2～3倍量的酒石酸水溶液溶解TL，然后加入相当于TL1.5倍量的BA，用20％NaOH调pH8.5，搅拌萃取，静置或离心分相，水相再用1.5倍量BA进行二次萃取(在水相中加NaCl至饱和)。
c、合并两次BA萃取液，向萃取液中分两次加入等量的水，并用酒石酸调pH3.5～3.8，进行反萃取，得水相液。
d、水相液喷雾干燥得酒石酸泰乐菌素。
水相液也可用饱和Na2CO3调pH8.5，用高压板框压滤得TL碱和滤液，滤液可用少量三氯甲烷萃取残留的TL，萃取液套用。
方法4：a、萃取液脱水
b、脱水液蒸馏浓缩到1/2体积时，加入2倍量的水，并用酒石酸调pH6.5～6.7。
c、进一步在55℃、-0.1mPa下蒸馏，除净三氯甲烷。
d、用酒石酸调pH4.0～4.5(即按摩尔比计算酒石酸加入量略多干TL的1/2量)。
e、加入2～4％活性碳并加少量硅藻土脱色，用三合一压滤得滤液并回收活性碳；活性碳用酸水洗涤，回收吸附的TL，集中精制。
f、滤液可采用如下两种方法进一步处理。
(1)调pH值后，喷雾干燥得酒石酸泰乐菌素。
(2)用Na2SO3调pH8.5，压滤，得滤液和TL碱；滤液用相当TL 2倍量的三氯甲烷萃取，回收其中的TL(萃取时可加Na2SO4到饱和状态以提高萃取率)，将TL/三氯甲烷液蒸馏回收三氯甲烷和TL碱；TL碱可采用在水相或甲醇中(干燥的TL碱)成盐，在双滚筒干燥器中除去溶剂得酒石酸泰乐。
在上述几种方法中，方法2、方法3较好，收率高，产品质量好。
实例二、用二氯甲烷从发酵滤液中萃取泰乐菌素(TL)
1、发酵滤液精滤：用1～0.2μm过滤器过滤，得精滤液。
2、萃取TL：
2.1精滤液pH：精滤液用饱和Na2CO3溶液或用20％NaOH溶液调pH8.0～8.5(在20～25℃搅拌下调pH)。
2.2二氯甲烷用量：精滤液∶二氯甲烷＝100∶4
2.3第一次萃取：
在20～25℃、充分混合条件下，用二氯甲烷萃取TL约20～30分钟。
注：最好在结构合理的专用萃取罐中进行萃取。
2.4分离第一次萃取液：
经20～30分钟萃取后，将液体压入专用的分相罐中，静置30～60分钟后，离心分相，得第一次萃取后水相液和第一次萃取液(含TL的二氯甲烷相)。
2.5第二次萃取：
向第一次萃取后的水相中按100(水相)∶4(二氯甲烷)的比例再加入二氯甲烷，进行第二次萃取，操作同上，得第二次萃取液和第二次萃取后水相，第二次萃取液套用，即作为下一批滤液的第一次萃取溶剂。
第二次萃取后的水相液于80～100℃蒸馏，回收其中残留的二氯甲烷后，去环保处理。
3、第一次萃取液蒸馏：
于55～58℃、负压为-0.08～-0.1mPa，冷却水温为0～5℃的条件下，搅拌蒸馏，除去二氯甲烷，得含TL的浓缩物。
4、浓缩物进一步纯化：
4.1纯化方法(1)：
4.1.1加入相当于TL3～4倍量的水，然后加入酒石酸调pH 3.3～3.8，搅拌使浓缩物全部溶解；
4.1.2加入相当于TL1.5倍量的BA，用饱和Na2CO3调pH8.5，搅拌2～3分钟，静置或离心分相，得酯相(A)和水相；
4.1.3向水相再加入1.5倍量的BA，并加入等量的在32℃饱和的Na2SO溶液，充分混合后静置分相或离心分相，得水相和酯相(B)，水相弃之；
4.1.4合并酯相(A)和(B)，用等量的酒石酸水溶液分两次反萃取，得反萃取液；
4.1.5反萃取液可采用喷雾干燥法制备酒石酸TL；
4.1.6反萃取液也可用Na2CO3调pH8.5，并加入NaCl至饱和后压滤，得TL碱；
4.1.7泰乐菌素碱成盐：
TL碱干燥后可进一步用甲醇溶解成盐，方法如下：将干燥的TL碱用2倍量的甲醇溶解，之后加入1/2摩尔量的酒石酸，成盐后用双滚筒干燥机除去甲醇，得酒石酸泰乐菌素，经粉碎，过筛，得产品。
4.2纯化方法(2)：
4.2.1用相当于TL2～4倍量的酒石酸酸水溶液溶解浓缩物；
4.2.2用Na2CO3调pH8.5；
4.2.3压滤，得母液(a)和TL碱。
4.2.4母液(a)和TL碱的进一步处理方法：
(1)母液(a)：加入相当于TL 2倍量的BA，加入NaCl至饱和状态，充分混合，离心，得BA相和析出物及水相，保留BA相；
(2)BA相用等量的酒石酸水溶液反萃取，进而将反萃取液用Na2CO3调pH8.5，压滤，得TL碱和母液(b)；
(3)集中以上各步经压滤获得的泰乐碱，水洗涤后压滤，得母液(c)和TL碱；TL碱干燥至含水小于15％。
(4)合并母液(b)和母液(c)，用相当于TL 2倍量的二氯甲烷萃取，水相弃之，萃取液于58℃、-0.08～-0.1mPa，蒸馏至干，回收TL。
4.3TL碱成盐：
将干燥的TL碱用2倍量的甲醇溶解，之后加入1/2摩尔量的酒石酸，成盐后用双滚筒干燥机除去甲醇，得酒石酸泰乐菌素，经粉碎，过筛，得产品。
实例三、实验室小试实验
1、取3000ml效价8700μg/ml(A组分、HPLC法测定)的发酵滤液，用饱和Na2CO3调pH8.2。
2、加入120ml三氯甲烷，搅拌(254rpm)萃取30分钟。
3、离心(3000rpm)分相，分取下层三氯甲烷相；向上层水相在加入120ml三氯甲烷，进行第二遍萃取，离心，分相，得第二遍萃取液。
注：大生产第二次萃取液套用
4、合并第一次和第二次萃取液，用无水硫酸钠脱水，然后于55～58℃、-0.08～-0.1mPa条件下蒸馏，除净三氯甲烷，得浓缩物约10～11g。
5、用60ml磷酸水溶液(pH3.3)溶解浓缩物，得含磷酸泰乐菌素的水溶液。
6、向上述水溶液中加入30ml乙酸丁酯，然后在搅拌条件下缓缓滴加40％NaOH溶液，调pH8.6，充分混合后离心分相，得水相液和酯相液(A)；向水相液中再加入30ml乙酸丁酯，同时加入33～35℃的过饱和硫酸钠水溶液90～100ml，充分混合后，离心分相，得酯相(B)和水相，水相弃之。
7、合并酯相(A)和(B)，加无水硫酸钠脱水，然后分二次加入60ml酒石酸水溶液(pH3.8)进行反萃取，得反萃取液约96ml。
8、将反萃取液等分三份，采用以下三种不同方法提取其中的泰乐菌素。
方法(1)：取32ml反萃取液，加入20ml二氯甲烷，在搅拌条件下加入NaCl至饱和状态，静置分相，得水相和二氯甲烷相。
a、水相：取0.5ml水相，加4.5ml水，进样20μl，HPLC分析(280nm)结果水相残留效价(A组)37.5μg/ml。
b、酯相：于50℃蒸干，得酒石酸泰乐菌素9.6g，A组分含量86.5％。
以A组份计：回收率为95.4％。
方法(2)：取32ml反萃取液，用饱和Na2CO3调pH8.5，充分搅匀后，抽滤，得泰乐菌素碱和母液；泰乐碱用2∶1的水洗涤3次，抽滤，得泰乐碱和洗涤液，将经洗涤的泰乐碱减压干燥(逐渐升温，从50～75℃、-0.1mPa)得8.7g泰乐碱，HPLC分析，A组分含量88.2％，A组份回收率：7.67/8.7×100＝88.2％。合并母液和洗涤液，加入NaCl至饱和状态，离心分离得固体物，干燥后为0.63g，A组份含量为80.9％，含A组份计0.51g，以上两项合计，A组份总回收率为94.0％(0.51+7.67/8.7×100)。
方法(3)：取32ml反萃取液，加适量甲醇于72℃，-0.1mPa条件下共沸蒸馏，得产品9.28g，A组份含量85.76％，A组份回收率为91.48％。
Claims (2)
1.一种泰乐菌素提取液纯化方法，其特征在于：在用三氯甲烷或二氯甲烷从发酵滤液中萃取泰乐菌素时，所获得的含泰乐菌素的二氯甲烷或三氯甲烷萃取液采取如下步骤进一步纯化：
a、将萃取液蒸馏浓缩，除净或除去大部分三氯甲烷或二氯甲烷后，得浓缩物；
b、用酸水溶解浓缩物，得水溶液；
c、向水溶液中加入乙酸丁酯或乙酸乙酯或4-甲基-2-戊酮，用碱液调pH 7.5～11.5，充分混合，萃取，分相，得含泰乐菌素的有机相液；
d、向有机相液中加入酒石酸水溶液或磷酸水溶液，进行反萃取，分相得反萃取液，即含酒石酸泰乐菌素或磷酸泰乐菌素的水溶液；
e、上述d步骤中获得的含泰乐菌素的反萃取液进一步纯化方法如下：
方法a：反萃取液用或不用活性碳脱色，然后喷雾干燥，得酒石酸泰乐菌素或磷酸泰乐菌素；
方法b：用碱液调反萃取液的pH 7.5～11.5，压滤或离心分离，得泰乐菌素湿结晶和结晶母液，湿结晶进一步干燥，得含水量小于25％的泰乐菌素碱；
f、上步骤获得的泰乐菌素碱用甲醇溶解，并加入酒石酸或磷酸，成盐后蒸馏或减压干燥，除净甲醇，得酒石酸泰乐菌素或磷酸泰乐菌素。
2.按权利要求1中所述的纯化方法，其特征在于采用如下步骤从发酵滤液中分离纯化泰乐菌素：
a、用相当于发酵滤液体积的2～20％量的三氯甲烷或二氯甲烷从发酵滤液中萃取泰乐菌素，得萃取液；
b、将二氯甲烷或三氯甲烷萃取液在50～90℃，常压或负压条件下蒸馏，除去溶剂，得浓缩物；
c、用相当于泰乐菌素重量/体积比为2～10倍量的酸水溶解浓缩物中的泰乐菌素，得含泰乐菌素盐的水溶液；
d、向水溶液中加入相当于泰乐菌素重量/体积比为1.2～10倍量的乙酸丁酯或4-甲基-2-戊酮，然后用碱液调pH 7.5～11.5，充分混合萃取，分相，得含泰乐菌素的第一遍萃取液和水相液，水相液用相当于泰乐菌素重量/体积比为1.2～10倍量的乙酸丁酯或4-甲基-2-戊酮进行第二遍萃取，分相，得第二遍萃取液；
e、合并上述第一遍萃取液和第二遍萃取液，加入相当于萃取液1/2~2倍体积的酒石酸水溶 液或磷酸水溶液，充分混合，进行反萃取，分相后得含酒石酸泰乐菌素或磷酸泰乐菌素的反萃取液；
f、将反萃取液于150～180℃喷雾干燥，得酒石酸泰乐菌素或磷酸泰乐菌素；
g、或将反萃取液用碱液调pH 7.5～11.5，压滤或离心，得泰乐菌素湿结晶和结晶母液，结晶母液中残留少量的泰乐菌素，用三氯甲烷或二氯甲烷萃取回收或用盐析法回收。
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