CN113416225B - 一种多杀霉素提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一多杀霉素提取方法，包括以下步骤：萃取、反萃取、碱结晶萃取、脱色、二次反萃取、二次碱结晶、醇结晶和干燥；采用的工艺取消了传统工艺中板框过滤、菌渣干燥、菌渣浸提等步骤，不仅简化了设备，还缩短了生产周期，同时避免了菌渣浸提过程中对环境造成新的污染；同时给出了最佳的多杀霉素产品量与油酸甲酯的料液比，多杀霉素产品量与柠檬酸或酒石酸溶液的料液比和多杀霉素产品量与乙醇的料液比，在降低油酸甲酯，柠檬酸或酒石酸和乙醇的使用量的同时，提高了多杀菌素的收率，各步骤的多杀霉素提取的收率均＞92%，且多杀霉素的提取总收率≥88％，为实现大规模工业化生产奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属于制药技术领域，具体涉及一种多杀菌素提取方法。
背景技术
多杀霉素是一种由土壤放线菌多刺甘蔗多孢菌在培养介质下经有氧发酵后产生的次级代谢产物，具有对害虫广谱高效，对人、非靶标动物和环境安全，可生物降解等优异特点，并因此获得美国“总统绿色化学品挑战奖”。由于多杀霉素能有效防治多种储粮害虫、用药量极少、安全高效、低残留，因而被认为是一种极具前景的“绿色”储粮防护剂。国内现有工艺研究主要集中在溶媒浸提法和树脂吸附提取法。树脂吸附提取法提取多杀菌素纯度高，但存在处理量小、对设备要求高、耗时长、成本高等缺点，不利于大规模工业化生产。溶媒浸提法目前只停留在实验室小试阶段，存在工业连续化生产设备匹配困难，操作复杂、附属环保问题多等缺点。
通过检索发现如下与本专利相关的专利公开文献：
1、公开号为CN107474088B的专利公开了一种用于多杀菌素工业化大生产的提取工艺，该工艺包括发酵液预处理，板框过滤，闪蒸烘干；甲醇浸泡菌丝；浓缩浸提液，转相水洗；使用酒石酸反萃取；调节PH离心得到多杀菌素粗品；利用甲醇重结晶得到多杀菌素精品。本发明采用菌丝分离烘干后浸提的方式提取多杀菌素，浸取效率高，溶媒使用量小，仅为发酵液直接溶媒萃取的一半，且能耗相对较低，生产周期缩短；另外，板框过滤、闪蒸烘干、浸提、浓缩、水洗、反萃取、精制所需的设备比较普遍，很容易实现工业化生产；所得产品收率高，达到了85％～90％。但该工艺使用了板框过滤、菌渣干燥、菌渣浸提等工艺，生产设备难以匹配，连续运行设备要求高，而且生产周期长，干燥浸提等步骤容易出现新环保问题。
2、公开号为CN111675743A的专利公开了一种从多杀菌素发酵液中提取多杀菌素的方法，包括对多杀菌素发酵液采用内肽酶和尿素的预处理以及之后采用四氢吡喃的提取、固液分离、水洗、溶解、卷式超滤膜过滤、结晶、干燥等过程。采用膜过滤工艺代替现有技术中的萃取、大孔树脂吸附或层析或离子交换工艺，取消了菌渣干燥、萃取和重结晶等工艺，在提取过程中只使用了单一的有机溶剂。但该专利使用了四氢呋喃，属于2B类致癌物，长期接触易对人体造成一定伤害，且化学性质不稳定，易燃烧爆炸，不利用操作人员安全，同时残留于药品不利于用药安全性。
3、公开号CN111171096A专利公开了一种多杀菌素的提取方法，该方法包括以下步骤：1)将发酵液的pH调节至8.5-9.5，得到预处理的发酵液；2)将得到的预处理后的发酵液过滤并收集滤饼；3)将得到的滤饼使用甲醇-水溶液搅拌浸提，过滤得到浸提液；4)将得到的浸提液过强碱性阴离子树脂脱色并浓缩至无甲醇流出，得到脱色浓缩液；5)在得到的脱色浓缩液中加入非水溶性有机溶剂萃取，收集负载有机相；6)向得到的负载有机相中加入酸水反萃取，收集反萃取相；7)搅拌状态下，调节得到的反萃取相至pH为9.0-10.0，使多杀菌素以结晶形式沉淀出来，过滤，烘干，得到多杀菌素粉末。该方法使用树脂脱色和反萃取，但树脂价格昂贵，多杀菌素生产成本高，且操作复杂，不利于规模化生产。
通过对比，本专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种多杀菌素提取方法，工艺简单，操作简便，运行成本低廉，所使用设备均为常规设备，能够有效降低能耗并缩短了生产周期，为大规模工业化生产奠定了基础。
本发明解决技术问题所采用的技术方案是：
一种多杀霉素提取方法，包括以下步骤：
（1）萃取：按照发酵液中多杀霉素产品量与油酸甲酯料液比为10～30:1（g:L）,缓慢加入油酸甲酯，同时不断搅拌，搅拌时间为2～6h，随后静置30～60min，分层后进行有机相和水相分离，将有机相转入反萃取罐；
（2）反萃取：以步骤（1）所得有机相中多杀霉素产品量与柠檬酸或酒石酸溶液的料液比为10～30:1（g:L），向步骤（1）所得的有机相中加入柠檬酸或酒石酸溶液进行反萃取，直到反萃取罐内的pH值为2.0～4.0时，停止加入柠檬酸或酒石酸溶液，随后静置分层或离心分层，控制有机相效价在1g/L以下，将水相收集在碱结晶罐中，结晶后得到粗粉；
（3）碱结晶萃取：向碱结晶罐中缓慢加入碱液，直到pH值为9.0～11.0时，停止加入碱液，随后向碱结晶罐加入有机溶剂，碱结晶罐内多杀霉素产品量与有机溶剂的料液比为15～30：1（g:L），搅拌使得步骤（2）所得粗粉完全溶解，控制水相效价在1g/L以下，随后静置分层或离心分层，将有机相转入脱色罐；
（4）脱色：向脱色罐内加入活性炭，活性炭的加入量为步骤（3）所得有机相中多杀霉素产品量质量的5～15%，搅拌5～20min后进行过滤；
（5）二次反萃取：向步骤（4）所得过滤液加入柠檬酸或酒石酸进行反萃取，步骤（4）所得过滤液中多杀霉素产品量与柠檬酸或酒石酸溶液的料液比为10～30:1（g:L），当pH值为2.0～4.0时，停止加入柠檬酸或酒石酸，随后静置分层或离心分层，控制有机相效价在1g/L以下，将水相收集在二次碱结晶罐中；
（6）二次碱结晶：将1.0～3.0M碱液缓慢加入二次碱结晶罐内进行碱结晶，当pH值为9.0～11.0时停止加入碱液，结晶结束后过滤分离得到湿粉；
（7）醇结晶和干燥：向步骤（6）所得湿粉加入乙醇，控制步骤（6）所得湿粉与乙醇的料液比为80～120：1（g:L），并不断搅拌，同时进行加热使得温度达到50～70℃，当步骤（6）所得湿粉完全溶解后，加入超纯水至溶液变浑浊，停止加水，自然冷却至20～30℃后继续搅拌25～35min，随后过滤，用40%的乙醇对过滤所得物顶洗一次，将收集到的湿晶体在50～70℃进行真空干燥。
而且，步骤（1）-（5）中：所述多杀霉素产品量是由溶液体积（L）与多杀霉素的浓度（g/L）相乘计算所得。
而且，步骤（1）中：多杀霉素产品量与油酸甲酯料液比为15～20:1（g:L），优选料液比为19:1（g:L）；所述搅拌时间为3～4h，优选3.5h；所述静置时间为40min。
而且，步骤（2）中：以步骤（1）所得有机相中多杀霉素产品量与柠檬酸或酒石酸溶液的料液比为15～20:1（g:L），优选料液比为19:1（g:L）；所述柠檬酸或酒石酸溶液的浓度为0.2～0.5M；所述PH值为3.0。
而且，步骤（3）中：所述碱液为氢氧化钠或氨水；所述碱液的浓度为1.0～3.0M；所述有机溶剂为正庚烷或乙酸异丙酯或乙酸丁酯或乙酸乙酯，优选正庚烷或乙酸丁酯；所述pH值为9.5～10.0，优选pH值为9.8。
而且，步骤（4）中：所述活性炭的加入量为步骤（3）所得有机相质量的7～10%，优选8%；所述搅拌时间为10min。
而且，步骤（5）中：所述步骤（4）所得的有机相与柠檬酸或酒石酸溶液的料液比为15～20:1（g:L），优选料液比为19:1（g:L）；所述柠檬酸或酒石酸溶液的浓度为0.2～0.5M，优选0.2M柠檬酸。
而且，步骤（6）中：所述碱液为氢氧化钠或氨水；所述碱液的浓度为1.5～2.0M，优选1.8M；所述PH值为9.5～10.0时停止加入碱液，优选PH值为9.8。
而且，步骤（7）中：所述乙醇浓度为70%～95%；所述步骤（6）所得湿粉与乙醇的料液比为85～100:1（g:L），优选料液比为90：1（g:L）；所述自然冷却至22～25℃后继续搅拌30min，优选冷却至23℃；所述真空控制＜～0.085MPa；所述真空干燥的温度为55～60℃，优选57℃。
本发明的优点和积极效果是：
1、本发明提供一种多杀霉素高效、低成本提取方法，工艺简单，操作简便，能够有效降低运行成本，大大缩短了生产周期，而且所使用设备均为常规设备，能耗低，为实现大规模工业化生产奠定了基础。
2、本发明采用的工艺取消了传统工艺中板框过滤、菌渣干燥、菌渣浸提等步骤，不仅简化了设备，还缩短了生产周期，同时避免了菌渣浸提过程中对环境造成新的污染。
3、本发明给出了最佳的多杀霉素产品量与油酸甲酯的料液比，多杀霉素产品量与柠檬酸或酒石酸溶液的料液比和多杀霉素产品量与乙醇的料液比，在降低油酸甲酯，柠檬酸或酒石酸和乙醇的使用量的同时，提高了多杀菌素的收率，而且本发明所使用的的全部溶媒都可以回收利用，损耗率低，不仅降低了生产成本，还减少了对环境的污染。
4、本发明所使用的溶媒有油酸甲酯、正庚烷（或乙酸异丙酯或乙酸丁酯或乙酸乙酯中的一种）和乙醇，种类少，用量低，对环境的危害低。
5、本发明采用乙醇结晶的方式提纯多杀霉素粗品，在保证了结晶收率的同时提升了多杀霉素的质量，得到产品晶型好且含量＞98.5％。
6、本发明各步骤的多杀霉素提取的收率均＞92%，且多杀霉素的提取总收率≥88％，为工业化生产多杀霉素提供了理论和实践的依据。
具体实施方式
为能进一步了解本发明的内容、特点及功效，例举以下实施例。需要说明的是，本实施例是描述性的，不是限定性的，不能由此限定本发明的保护范围。
下述实施实例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
多杀霉素收率的计算公式如下：
多杀霉素收率=多杀霉素的回收量（g）÷各步骤多杀霉素初始含量（g）×100%。
本发明多杀霉素浓度的测定方法如下：
仪器: 高效液相色谱仪
试剂：无水乙醇或95%乙醇、 色谱纯乙腈、 醋酸铵
色谱条件：
色谱柱：C18 4.6mm×250mm，5μm （或同等品）
检测波长：250nm
流速：1.0mL/min
进样量：20μL
柱温：30℃
流动相：乙腈：甲醇：0.05%醋酸铵水溶液（取醋酸铵0.05g，至100mL容量瓶中，加纯水溶解并稀释至刻度，摇匀。）=45：45：10；
实验过程：
溶液制备
对照液：取多杀霉素对照品两份，每份约50mg，精密称定，置100mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤；
供试液：取多杀霉素供试品两份，每份约50mg，精密称定，置100mL容量瓶中，加入流动相使溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤；
测定方法
对照品溶液1，重复进样2次，对照品溶液2，进样1次，记录色谱图，计算校正因子并计算校正因子RSD值，RSD值应不大于2.0%；主峰的理论塔板数不小于2000；取供试液各20μL注入色谱仪，记录图谱；
计算
多杀霉素A、多杀霉素D含量计算
RF= 
含量（%）=
×AU/Wu×100%
式中：
As—对照品溶液中多杀霉素A或多杀霉素D峰的峰面积
Ws—对照品称样量(mg)
Cs—对照品中多杀霉素A或多杀霉素D含量(%)
Au—供试品溶液中多杀霉素A或多杀霉素D的峰面积
RF—多杀霉素A或多杀霉素D校正因子
Wu—样品称样量(mg)
多杀霉素含量计算：
多杀霉素含量=多杀霉素A含量+多杀霉素D组分含量。
实施例1
一种多杀霉素提取方法，包括以下步骤：
（1）萃取：取含有多杀霉素的发酵液237.5L，多杀霉素的浓度为2.2g/L，按照发酵液中多杀霉素产品量与油酸甲酯料液比为19:1（g:L）,缓慢加入油酸甲酯27L，同时不断搅拌，搅拌时间为4h，随后静置30min，分层后进行有机相和水相分离，有机相体积为27.6L，有机相效价为17.53g/L，收率为92.60%，将有机相转入反萃取罐；
（2）反萃取：以步骤（1）所得有机相中多杀霉素产品量与柠檬酸溶液的料液比为19:1（g:L），向步骤（1）所得的有机相中加入0.2M柠檬酸溶液25L进行反萃取，直到反萃取罐内的pH值为2.34时，停止加入柠檬酸溶液，随后静置分层，控制有机相效价在1g/L以下，水相体积为25L，水相效价为19.06g/L，收率为98.49%，将水相收集在碱结晶罐中，结晶后得到粗粉；
（3）碱结晶萃取：向碱结晶罐中缓慢加入0.2M碱液，直到pH值为9.5时，碱液使用量为8L，停止加入碱液，随后向碱结晶罐加入正庚烷23.8L，碱结晶罐内多杀霉素产品量与有机溶剂的料液比为20：1（g:L），搅拌使得步骤（2）所得粗粉完全溶解，控制水相效价在1g/L以下，随后静置分层，有机相体积为23.8L，有机相效价为19.84g/L，收率为99.10%，将有机相转入脱色罐；
（4）脱色：向脱色罐内加入50g活性炭，搅拌10min后进行过滤；
（5）二次反萃取：向步骤（4）所得过滤液加入0.2M柠檬酸进行反萃取，步骤（4）所得过滤液中多杀霉素产品量与柠檬酸溶液的料液比为20:1（g:L），当pH值为2.32时，停止加入柠檬酸，随后静置分层，控制有机相效价在1g/L以下，将水相收集在二次碱结晶罐中；
（6）二次碱结晶：将2.0M碱液缓慢加入二次碱结晶罐内进行碱结晶，碱液加量为7.6L，当pH值为9.8时停止加入碱液，结晶结束后过滤分离得到湿粉；
（7）醇结晶和干燥：向步骤（6）所得湿粉加入80%乙醇5L，控制步骤（6）所得湿粉与乙醇的料液比为94：1（g:L），并不断搅拌，同时进行加热使得温度达到57℃，当步骤（6）所得湿粉完全溶解后，加入超纯水至溶液变浑浊，停止加水，自然冷却至25℃后继续搅拌30min，随后过滤，用40%的乙醇对过滤所得物顶洗一次，将收集到的湿晶体在58℃进行真空干燥，得到得多杀霉素成品白色结晶粉末460.62g，多杀霉素含量98.5%，总收率88.2%。
本实施中，步骤（1）-（5）中：所述多杀霉素产品量是由溶液体积（L）与多杀霉素的浓度（g/L）相乘计算所得。
本实施中，步骤（2）（6）中：所述碱液为氨水。
本实施中，步骤（7）中：所述真空控制为-0.084MPa。
实施例2
一种多杀霉素提取方法，包括以下步骤：
（1）萃取：取含有多杀霉素的发酵液204L，多杀霉素的浓度为2.25g/L，按照发酵液中多杀霉素产品量与油酸甲酯料液比为15.3:1（g:L）,缓慢加入油酸甲酯30L，同时不断搅拌，搅拌时间为4h，随后静置30min，分层后进行有机相和水相分离，有机相体积为30.6L，有机相效价为13.98g/L，收率为93.20%，将有机相转入反萃取罐；
（2）反萃取：以步骤（1）所得有机相中多杀霉素产品量与柠檬酸溶液的料液比为17:1（g:L），向步骤（1）所得的有机相中加入0.2M柠檬酸溶液25L进行反萃取，直到反萃取罐内的pH值为2.31时，停止加入柠檬酸溶液，随后静置分层，控制有机相效价在1g/L以下，水相体积为25L，水相效价为16.87g/L，收率为98.59%，将水相收集在碱结晶罐中，结晶后得到粗粉；
（3）碱结晶萃取：向碱结晶罐中缓慢加入0.2M碱液，直到pH值为9.6时，碱液使用量为7.8L，停止加入碱液，随后向碱结晶罐加入正庚烷22L，碱结晶罐内多杀霉素产品量与有机溶剂的料液比为19：1（g:L），搅拌使得步骤（2）所得粗粉完全溶解，控制水相效价在1g/L以下，随后静置分层，有机相体积为22L，有机相效价为18.91g/L，收率为98.64%，将有机相转入脱色罐；
（4）脱色：向脱色罐内加入40g活性炭，搅拌10min后进行过滤；
（5）二次反萃取：向步骤（4）所得过滤液加入0.2M柠檬酸21L进行反萃取，步骤（4）所得过滤液中多杀霉素产品量与柠檬酸溶液的料液比为20:1（g:L），当pH值为2.32时，停止加入柠檬酸，随后静置分层，控制有机相效价在1g/L以下，将水相收集在二次碱结晶罐中；
（6）二次碱结晶：将2.0M碱液缓慢加入二次碱结晶罐内进行碱结晶，碱液加量为6.9L，当pH值为9.9时停止加入碱液，结晶结束后过滤分离得到湿粉；
（7）醇结晶和干燥：向步骤（6）所得湿粉加入75%乙醇4L，控制步骤（6）所得湿粉与乙醇的料液比为104：1（g:L），并不断搅拌，同时进行加热使得温度达到58℃，当步骤（6）所得湿粉完全溶解后，加入超纯水至溶液变浑浊，停止加水，自然冷却至25℃后继续搅拌30min，随后过滤，用40%的乙醇对过滤所得物顶洗一次，将收集到的湿晶体在55℃进行真空干燥，得到得多杀霉素成品白色结晶粉末408.6g，多杀霉素含量98.6%，总收率89%。
本实施中，步骤（1）-（5）中：所述多杀霉素产品量是由溶液体积（L）与多杀霉素的浓度（g/L）相乘计算所得。
本实施中，步骤（3）（6）中：所述碱液为氨水。
本实施中，步骤（7）中：所述真空控制为-0.086MPa。
实施例3
一种多杀霉素提取方法，包括以下步骤：
（1）萃取：取含有多杀霉素的发酵液214L，多杀霉素的浓度为2.07g/L，按照发酵液中多杀霉素产品量与油酸甲酯料液比为19.9:1（g:L）,缓慢加入油酸甲酯22.2L，同时不断搅拌，搅拌时间为4h，随后静置30min，分层后进行有机相和水相分离，有机相体积为23.0L，有机相效价为18.10g/L，收率为93.98%，将有机相转入反萃取罐；
（2）反萃取：以步骤（1）所得有机相中多杀霉素产品量与柠檬酸溶液的料液比为20:1（g:L），向步骤（1）所得的有机相中加入0.2M柠檬酸溶液20.8L进行反萃取，直到反萃取罐内的pH值为2.33时，停止加入柠檬酸溶液，随后静置分层，控制有机相效价在1g/L以下，水相体积为20.8L，水相效价为19.72g/L，收率为98.53%，将水相收集在碱结晶罐中，结晶后得到粗粉；
（3）碱结晶萃取：向碱结晶罐中缓慢加入0.2M碱液，直到pH值为9.7时，碱液使用量为6.5L，停止加入碱液，随后向碱结晶罐加入正庚烷20.5L，碱结晶罐内多杀霉素产品量与有机溶剂的料液比为20：1（g:L），搅拌使得步骤（2）所得粗粉完全溶解，控制水相效价在1g/L以下，随后静置分层，有机相体积为20.5L，有机相效价为19.63g/L，收率为98.11%，将有机相转入脱色罐；
（4）脱色：向脱色罐内加入50g活性炭，搅拌10min后进行过滤；
（5）二次反萃取：向步骤（4）所得过滤液加入0.2M柠檬酸20.1L进行反萃取，步骤（4）所得过滤液中多杀霉素产品量与柠檬酸溶液的料液比为20:1（g:L），当pH值为2.36时，停止加入柠檬酸，随后静置分层，控制有机相效价在1g/L以下，将水相收集在二次碱结晶罐中；
（6）二次碱结晶：将2.0M碱液缓慢加入二次碱结晶罐内进行碱结晶，碱液加量为6.4L，当pH值为9.5时停止加入碱液，结晶结束后过滤分离得到湿粉；
（7）醇结晶和干燥：向步骤（6）所得湿粉加入95%乙醇5L，控制步骤（6）所得湿粉与乙醇的料液比为81：1（g:L），并不断搅拌，同时进行加热使得温度达到56℃，当步骤（6）所得湿粉完全溶解后，加入超纯水至溶液变浑浊，停止加水，自然冷却至25℃后继续搅拌30min，随后过滤，用40%的乙醇对过滤所得物顶洗一次，将收集到的湿晶体在52℃进行真空干燥，得到得多杀霉素成品白色结晶粉末392.26g，多杀霉素含量98.9%，总收率88.6%。
本实施中，步骤（1）-（5）中：所述多杀霉素产品量是由溶液体积（L）与多杀霉素的浓度（g/L）相乘计算所得。
本实施中，步骤（3）（6）中：所述碱液为氨水。
本实施中，步骤（7）中：所述真空控制为-0.087MPa。
实施例4
一种多杀霉素提取方法，包括以下步骤：
（1）萃取：取含有多杀霉素的发酵液227L，多杀霉素的浓度为2.15g/L，按照发酵液中多杀霉素产品量与油酸甲酯料液比为22:1（g:L）,缓慢加入油酸甲酯22.2L，同时不断搅拌，搅拌时间为4h，随后静置30min，分层后进行有机相和水相分离，有机相体积为22.7L，有机相效价为20.18g/L，收率为93.86%，将有机相转入反萃取罐；
（2）反萃取：以步骤（1）所得有机相中多杀霉素产品量与酒石酸溶液的料液比为20:1（g:L），向步骤（1）所得的有机相中加入0.2M酒石酸溶液23L进行反萃取，直到反萃取罐内的pH值为2.34时，停止加入柠檬酸溶液，随后静置分层，控制有机相效价在1g/L以下，水相体积为23L，水相效价为19.63g/L，收率为98.55%，将水相收集在碱结晶罐中，结晶后得到粗粉；
（3）碱结晶萃取：向碱结晶罐中缓慢加入0.2M碱液，直到pH值为9.5时，碱液使用量为7.5L，停止加入碱液，随后向碱结晶罐加入乙酸异丙酯22.6L，碱结晶罐内多杀霉素产品量与有机溶剂的料液比为20：1（g:L），搅拌使得步骤（2）所得粗粉完全溶解，控制水相效价在1g/L以下，随后静置分层，有机相体积为23L，有机相效价为19.5g/L，收率为99.33%，将有机相转入脱色罐；
（4）脱色：向脱色罐内加入50g活性炭，搅拌10min后进行过滤；
（5）二次反萃取：向步骤（4）所得过滤液加入0.2M酒石酸进行反萃取，步骤（4）所得过滤液中多杀霉素产品量与酒石酸溶液的料液比为20:1（g:L），当pH值为2.33时，停止加入酒石酸，随后静置分层，控制有机相效价在1g/L以下，将水相收集在二次碱结晶罐中；
（6）二次碱结晶：将2.0M碱液缓慢加入二次碱结晶罐内进行碱结晶，碱液加量为7.7L，当pH值为9.8时停止加入碱液，结晶结束后过滤分离得到湿粉；
（7）醇结晶和干燥：向步骤（6）所得湿粉加入80%乙醇4.5L，控制步骤（6）所得湿粉与乙醇的料液比为100：1（g:L），并不断搅拌，同时进行加热使得温度达到57℃，当步骤（6）所得湿粉完全溶解后，加入超纯水至溶液变浑浊，停止加水，自然冷却至25℃后继续搅拌30min，随后过滤，用40%的乙醇对过滤所得物顶洗一次，将收集到的湿晶体在58℃进行真空干燥，得到得多杀霉素成品白色结晶粉末441.12g，多杀霉素含量98.8%，总收率89.3%。
本实施中，步骤（1）-（5）中：所述多杀霉素产品量是由溶液体积（L）与多杀霉素的浓度（g/L）相乘计算所得。
本实施中，步骤（3）（6）中：所述碱液为氢氧化钠溶液。
本实施中，步骤（7）中：所述真空控制为-0.085MPa。
实施例5
一种多杀霉素提取方法，包括以下步骤：
（1）萃取：取含有多杀霉素的发酵液234.5L，多杀霉素的浓度为2.3g/L，按照发酵液中多杀霉素产品量与油酸甲酯料液比为30:1（g:L）,缓慢加入油酸甲酯18L，同时不断搅拌，搅拌时间为6h，随后静置60min，分层后进行有机相和水相分离，有机相体积为18.5L，有机相效价为27.3g/L，收率为93.60%，将有机相转入反萃取罐；
（2）反萃取：以步骤（1）所得有机相中多杀霉素产品量与酒石酸溶液的料液比为30:1（g:L），向步骤（1）所得的有机相中加入0.2M酒石酸溶液16.9L进行反萃取，直到反萃取罐内的pH值为2.34时，停止加酒石酸溶液，随后静置分层，控制有机相效价在1g/L以下，水相体积为17L，水相效价为29.33g/L，收率为98.73%，将水相收集在碱结晶罐中，结晶后得到粗粉；
（3）碱结晶萃取：向碱结晶罐中缓慢加入0.2M碱液，直到pH值为9.5时，碱液使用量为5L，停止加入碱液，随后向碱结晶罐加入乙酸丁酯16.7L，碱结晶罐内多杀霉素产品量与有机溶剂的料液比为30：1（g:L），搅拌使得步骤（2）所得粗粉完全溶解，控制水相效价在1g/L以下，随后静置分层，有机相体积为16.8L，有机相效价为29.49g/L，收率为99.35%，将有机相转入脱色罐；
（4）脱色：向脱色罐内加入50g活性炭，搅拌10min后进行过滤；
（5）二次反萃取：向步骤（4）所得过滤液加入0.2M酒石酸进行反萃取，步骤（4）所得过滤液中多杀霉素产品量与柠檬酸溶液的料液比为20:1（g:L），当pH值为2.32时，停止加入酒石酸，随后静置分层，控制有机相效价在1g/L以下，将水相收集在二次碱结晶罐中；
（6）二次碱结晶：将2.0M碱液缓慢加入二次碱结晶罐内进行碱结晶，碱液加量为6.3L，当pH值为9.8时停止加入碱液，结晶结束后过滤分离得到湿粉；
（7）醇结晶和干燥：向步骤（6）所得湿粉加入90%乙醇5.8L，控制步骤（6）所得湿粉与乙醇的料液比为85：1（g:L），并不断搅拌，同时进行加热使得温度达到57℃，当步骤（6）所得湿粉完全溶解后，加入超纯水至溶液变浑浊，停止加水，自然冷却至25℃后继续搅拌30min，随后过滤，用40%的乙醇对过滤所得物顶洗一次，将收集到的湿晶体在58℃进行真空干燥，得到得多杀霉素成品白色结晶粉末483.12g，多杀霉素含量98.8%，总收率88.5%。
本实施中，步骤（1）-（5）中：所述多杀霉素产品量是由溶液体积（L）与多杀霉素的浓度（g/L）相乘计算所得。
本实施中，步骤（3）（6）中：所述碱液为氢氧化钠。
本实施中，步骤（7）中：所述真空控制为-0.084MPa。
对比例1
一种多杀霉素提取方法，包括以下步骤：
（1）萃取：含有多杀霉素的发酵液205L，多杀霉素的浓度为2.13g/L，按照发酵液中多杀霉素产品量与油酸甲酯料液比为9:1（g:L）,缓慢加入油酸甲酯48.5L，同时不断搅拌，搅拌时间为1.5h，随后静置25min，分层后进行有机相和水相分离，有机相体积为49.7L，有机相效价为7.82g/L，收率为89%，将有机相转入反萃取罐；
（2）反萃取：以步骤（1）所得有机相中多杀霉素产品量与柠檬酸溶液的料液比为9:1（g:L），向步骤（1）所得的有机相中加入0.2M柠檬酸溶液43.2L进行反萃取，直到反萃取罐内的pH值为2.33时，停止加入柠檬酸溶液，随后静置分层，控制有机相效价在1g/L以下，水相体积为43.2L，水相效价为8.09g/L，收率为90%，将水相收集在碱结晶罐中，结晶后得到粗粉；
（3）碱结晶萃取：向碱结晶罐中缓慢加入0.2M碱液，直到pH值为9.7时，碱液使用量为11.4L，停止加入碱液，随后向碱结晶罐加入正庚烷24.9L，碱结晶罐内多杀霉素产品量与有机溶剂的料液比为14：1（g:L），搅拌使得步骤（2）所得粗粉完全溶解，控制水相效价在1g/L以下，随后静置分层，有机相体积为25L，有机相效价为12.3g/L，收率为88%，将有机相转入脱色罐；
（4）脱色：向脱色罐内加入50g活性炭，搅拌10min后进行过滤；
（5）二次反萃取：向步骤（4）所得过滤液加入0.2M柠檬酸34.2L进行反萃取，步骤（4）所得过滤液中多杀霉素产品量与柠檬酸溶液的料液比为9:1（g:L），当pH值为2.36时，停止加入柠檬酸，随后静置分层，控制有机相效价在1g/L以下，将水相收集在二次碱结晶罐中；
（6）二次碱结晶：将2.0M碱液缓慢加入二次碱结晶罐内进行碱结晶，碱液加量为9.8L，当pH值为9.5时停止加入碱液，结晶结束后过滤分离得到湿粉；
（7）醇结晶和干燥：向步骤（6）所得湿粉加入65%乙醇4.1L，控制步骤（6）所得湿粉与乙醇的料液比为75：1（g:L），并不断搅拌，同时进行加热使得温度达到56℃，当步骤（6）所得湿粉完全溶解后，加入超纯水至溶液变浑浊，停止加水，自然冷却至25℃后继续搅拌30min，随后过滤，用40%的乙醇对过滤所得物顶洗一次，将收集到的湿晶体在52℃进行真空干燥，得到得多杀霉素成品白色结晶粉末304.76g，多杀霉素含量91.2%，总收率63.7%。
本实施中，步骤（1）-（5）中：所述多杀霉素产品量是由溶液体积（L）与多杀霉素的浓度（g/L）相乘计算所得。
本实施中，步骤（3）（6）中：所述碱液为氨水。
本实施中，步骤（7）中：所述真空控制为-0.087MPa。
对比例2
一种多杀霉素提取方法，包括以下步骤：
（1）萃取：含有多杀霉素的发酵液205L，多杀霉素的浓度为2.23g/L，按照发酵液中多杀霉素产品量与油酸甲酯料液比为32:1（g:L）,缓慢加入油酸甲酯14.3L，同时不断搅拌，搅拌时间为5h，随后静置65min，分层后进行有机相和水相分离，有机相体积为15.2L，有机相效价为22.56g/L，收率为75%，将有机相转入反萃取罐；
（2）反萃取：以步骤（1）所得有机相中多杀霉素产品量与柠檬酸溶液的料液比为32:1（g:L），向步骤（1）所得的有机相中加入0.2M柠檬酸溶液10.7L进行反萃取，直到反萃取罐内的pH值为2.33时，停止加入柠檬酸溶液，随后静置分层，控制有机相效价在1g/L以下，水相体积为10.9L，水相效价为26.22g/L，收率为83.35%，将水相收集在碱结晶罐中，结晶后得到粗粉；
（3）碱结晶萃取：向碱结晶罐中缓慢加入0.2M碱液，直到pH值为9.7时，碱液使用量为4.7L，停止加入碱液，随后向碱结晶罐加入正庚烷8.93L，碱结晶罐内多杀霉素产品量与有机溶剂的料液比为32：1（g:L），搅拌使得步骤（2）所得粗粉完全溶解，控制水相效价在1g/L以下，随后静置分层，有机相体积为9.01L，有机相效价为26.74g/L，收率为84.31%，将有机相转入脱色罐；
（4）脱色：向脱色罐内加入50g活性炭，搅拌10min后进行过滤；
（5）二次反萃取：向步骤（4）所得过滤液加入0.2M柠檬酸8.93L进行反萃取，步骤（4）所得过滤液中多杀霉素产品量与柠檬酸溶液的料液比为32:1（g:L），当pH值为2.36时，停止加入柠檬酸，随后静置分层，控制有机相效价在1g/L以下，将水相收集在二次碱结晶罐中；
（6）二次碱结晶：将2.0M碱液缓慢加入二次碱结晶罐内进行碱结晶，碱液加量为4.4L，当pH值为9.5时停止加入碱液，结晶结束后过滤分离得到湿粉；
（7）醇结晶和干燥：向步骤（6）所得湿粉加入100%乙醇2.34L，控制步骤（6）所得湿粉与乙醇的料液比为122：1（g:L），并不断搅拌，同时进行加热使得温度达到56℃，当步骤（6）所得湿粉完全溶解后，加入超纯水至溶液变浑浊，停止加水，自然冷却至25℃后继续搅拌30min，随后过滤，用40%的乙醇对过滤所得物顶洗一次，将收集到的湿晶体在52℃进行真空干燥，得到得多杀霉素成品白色结晶粉末288.79g，多杀霉素含量88.76%，总收率56.1%。
本实施中，步骤（1）-（5）中：所述多杀霉素产品量是由溶液体积（L）与多杀霉素的浓度（g/L）相乘计算所得。
本实施中，步骤（3）（6）中：所述碱液为氨水。
本实施中，步骤（7）中：所述真空控制为-0.087MPa。
对比例3
一种多杀菌素提取方法，具体步骤如下：
(1)10m3预处理罐接入4.95m3的发酵液(1201u/ml)，加入99kg珍珠岩，24.75kg黄血盐，49.5kg硫酸锌，直通蒸汽升温到90℃，保温搅拌2小时。
(2)将预处理好的发酵液利用板框压滤机过滤，压滤完后，收集滤饼，湿滤饼重量592kg。
(3)使用闪蒸烘干将湿滤饼烘干，闪蒸进风温度控制在80℃～100℃，烘干的多杀菌丝水份控制在8.1％，菌素干粉重量305kg，效价19277u/mg，收率为98.9％。
(4)将烘干后的多杀菌素菌丝体305kg，效价19277u/mg投入到浸提柱中，用1.5m3甲醇浸泡1～2小时，然后从浸提柱顶端通入氮气，将浸提液压入到收集罐，然后以每小时0.3～0.5m3的流速从顶端加入甲醇洗脱，从底端收集料液到甲醇套用罐，检测料液效价100u/ml时停止，然后从浸提柱顶端通入氮气将剩余的料液压出，本步收率为96.5％。
(5)将浸提浓液通过真空浓缩除去甲醇，浓缩至油膏状，油膏重量约为100kg，加入500L乙酸正丁酯，升温至50℃搅拌溶解，得到多杀菌素转相液，然后水洗，本步收率为98.5％。
(6)向有机相中加入150L 0.2mol/L酸水进行反萃取，搅拌30分钟后静置分层，酸水相收集到收集罐中，有机相回收重复利用。
(7)利用空气反吹法，除去酸水中的有机溶剂，用氢氧化钠水溶液调节ph＝9.0～11.0，使多杀菌素以结晶的形式沉淀，过滤得到多杀菌素粗结晶,本步收率为96.3％。
(8)将多杀菌素粗粉加入结晶溶剂，按照粗粉重量：有机溶剂体积＝1:8，升温溶解后过滤除去不溶性杂质，收集滤液，真空浓缩滤液至粗粉重量的2倍，缓慢滴加饱和结晶液0.1倍体积的纯化水，程序降温至5～10℃，养晶2小时后，离心，真空烘干后，得到多杀菌素精粉5.28kg，含量97.5％，总收率为86.6％。
实施例1-5与对比例1相比，使用的油酸甲酯、柠檬酸溶液、氨水和正庚烷的用量少于对比例1，而实施例1-5多杀霉素的每一步骤的收率均高于92%，实施例1中多杀霉素成品白色结晶粉末460.62g，多杀霉素含量98.5%，总收率88.2%；实施例2多杀霉素成品白色结晶粉末408.6g，多杀霉素含量98.6%，总收率89%；实施例3多杀霉素成品白色结晶粉末392.26g，多杀霉素含量98.9%，总收率88.6%，实施例4多杀霉素成品白色结晶粉末392.26g，多杀霉素含量98.9%，总收率88.6%，实施例5多杀霉素成品白色结晶粉末483.12g，多杀霉素含量98.8%，总收率88.5%，对比例1多杀霉素成品白色结晶粉末304.76g，多杀霉素含量91.2%，总收率63.7%，实施例1-5所得多杀霉素结晶量、多杀霉素含量和总收率远高于对比例1，说明本发明给出了最佳的多杀霉素产品量与油酸甲酯的料液比，多杀霉素产品量与柠檬酸或酒石酸溶液的料液比，多杀霉素产品量与乙醇的料液比和多杀霉素产品量与正庚烷的料液比，当料液比低于本发明保护的范围时，各步骤多杀霉素收率低，结晶纯度差，溶媒用量高，而本发明减少溶媒使用量的同时，提高了多杀霉素的产量，为大规模工业化生产奠定了基础。
实施例1-5与对比例2相比，实施例1-5多杀霉素的每一步骤的收率均高于92%，明显高于对比例2，实施例1中多杀霉素成品白色结晶粉末460.62g，多杀霉素含量98.5%，总收率88.2%；实施例2多杀霉素成品白色结晶粉末408.6g，多杀霉素含量98.6%，总收率89%；实施例3多杀霉素成品白色结晶粉末392.26g，多杀霉素含量98.9%，总收率88.6%，实施例4多杀霉素成品白色结晶粉末392.26g，多杀霉素含量98.9%，总收率88.6%，实施例5多杀霉素成品白色结晶粉末483.12g，多杀霉素含量98.8%，总收率88.5%，对比例2多杀霉素成品白色结晶粉末288.79g，多杀霉素含量88.76%，总收率56.1%，对比例2虽然使用溶媒量少于实施例1-5，但因有机溶剂使用量少而对多杀霉素提取不充分，导致所得多杀霉素结晶量少，且含量低。本发明提供的一种多杀霉素提取方法给出了最佳的多杀霉素产品量与油酸甲酯的料液比，多杀霉素产品量与柠檬酸或酒石酸溶液的料液比和多杀霉素产品量与乙醇的料液比，当料液比高于本发明保护的范围时，溶媒使用量过低导致多杀霉素提取不充分，提取效率低，所得结晶纯度差，所以过高或过低的溶媒使用量，都不能有效提取多杀霉素。本发明所使用的的全部溶媒都可以回收利用，损耗率低，降低了生产成本，同时还减少了对环境的污染。
实施例1-5与对比例3相比，实施例1-5避免了板框过滤、菌渣干燥、菌渣浸提等工艺，步骤简单，操作方便，使用的设备均为常规设备，解决了设备难匹配，生产周期长，干燥浸提等工艺出现的新环保问题，且所得多杀霉素产品质量高、收率均在92以上,含量达到98.5％以上，为工业化生产多杀霉素提供了理论依据和实践基础。
Claims (10)
1.一种多杀霉素提取方法，其特征在于，包括以下步骤：（ 1 ） 萃取：按照发酵液中多杀霉素产品量与油酸甲酯料液比为15～20:1g:L，缓慢加入油酸甲酯，同时不断搅拌，搅拌时间为2～6h，随后静置30～60min，分层后进行有机相和水相分离，将有机相转入反萃取罐；（ 2 ） 反萃取：以步骤（1）所得有机相中多杀霉素产品量与柠檬酸或酒石酸溶液的料液比为15～20:1g:L，向步骤（1）所得的有机相中加入柠檬酸或酒石酸溶液进行反萃取，直到反萃取罐内的pH值为2.0～4.0时，停止加入柠檬酸或酒石酸溶液，随后静置分层或离心分层，控制有机相效价在1g/L以下，将水相收集在碱结晶罐中，结晶后得到粗粉；
（ 3 ） 碱结晶萃取：向碱结晶罐中缓慢加入碱液，直到pH值为9.0～11.0时，停止加入碱液，随后向碱结晶罐加入有机溶剂，碱结晶罐内多杀霉素产品量与有机溶剂的料液比为15～30：1g:L，搅拌使得步骤（2）所得粗粉完全溶解，控制水相效价在1g/L以下，随后静置分层或离心分层，将有机相转入脱色罐；（ 4 ） 脱色：向脱色罐内加入活性炭，活性炭的加入量为步骤（3）所得有机相中多杀霉素产品量质量的5～15%，搅拌5～20min后进行过滤；（ 5） 二次反萃取：向步骤（4）所得过滤液加入柠檬酸或酒石酸进行反萃取，步骤（4）所得过滤液中多杀霉素产品量与柠檬酸或酒石酸溶液的料液比为15～20:1g:L，当pH值为2.0～4.0时，停止加入柠檬酸或酒石酸，随后静置分层或离心分层，控制有机相效价在1g/L以下，将水相收集在二次碱结晶罐中；（ 6 ） 二次碱结晶：将1.0～3.0M碱液缓慢加入二次碱结晶罐内进行碱结晶，当pH值为9.0～11.0时停止加入碱液，结晶结束后过滤分离得到湿粉；（ 7 ）醇结晶和干燥：向步骤（6）所得湿粉加入乙醇，控制步骤（6）所得湿粉与乙醇的料液比为80～120：1g:L，并不断搅拌，同时进行加热使得温度达到50～70℃，当步骤（6）所得湿粉完全溶解后，加入超纯水至溶液变浑浊，停止加水，自然冷却至20～30℃后继续搅拌25～35min，随后过滤，用40%的乙醇对过滤所得物顶洗一次，将收集到的湿晶体在50～70℃进行真空干燥。
2.根据权利要求1所述的一种多杀霉素提取方法，其特征在于：所述步骤（1）-（5）中：所述多杀霉素产品量是由溶液体积L与多杀霉素的浓度g/L相乘计算所得。
3.根据权利要求1或2所述的一种多杀霉素提取方法，其特征在于：所述步骤（1）中：所述搅拌时间为3～4h；所述静置时间为40min。
4.根据权利要求1～3任一项所述的一种多杀霉素提取方法，其特征在于：所述步骤（2）中：以步骤（1）所得有机相中多杀霉素产品量与柠檬酸或酒石酸溶液的料液比为19:1g:L；所述柠檬酸或酒石酸溶液的浓度为0.2～0.5M；所述pH值为3.0。
5.根据权利要求1～4任一项所述的一种多杀霉素提取方法，其特征在于：所述步骤（3）中：所述碱液为氢氧化钠或氨水；所述碱液的浓度为1.0～3.0M；所述有机溶剂为正庚烷或乙酸异丙酯或乙酸丁酯或乙酸乙酯；所述pH值为9.5～10.0。
6.根据权利要求1～5任一项所述的一种多杀霉素提取方法，其特征在于：所述步骤（4）中：所述活性炭的加入量为步骤（3）所得有机相质量的7～10%；所述搅拌时间为10min。
7.根据权利要求1～6任一项所述的一种多杀霉素提取方法，其特征在于：所述步骤（5）中：所述步骤（4）所得的有机相与柠檬酸或酒石酸溶液的料液比为19:1g:L；所述柠檬酸或酒石酸溶液的浓度为0.2～0.5M。
8.根据权利要求1～7任一项所述的一种多杀霉素提取方法，其特征在于：所述步骤（6）中：所述碱液为氢氧化钠或氨水；所述碱液的浓度为1.5～2.0M；所述pH值为9.5～10.0时停止加入碱液。
9.根据权利要求1～8任一项所述的一种多杀霉素提取方法，其特征在于：所述步骤（7）中：所述乙醇浓度为70%～95%；所述步骤（6）所得湿粉与乙醇的料液比为85～100:1g:L；所述自然冷却至22～25℃后继续搅拌30min。
10.根据权利要求1～9任一项所述的一种多杀霉素提取方法，其特征在于：所述步骤（7）中：所述真空控制＜-0.085MPa；所述真空干燥的温度为55～60℃。
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| GR01 | Patent grant | ||
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