CN114349808A

CN114349808A - 一种大萼香茶菜皂苷a和b单体的分离纯化方法及其应用

Info

Publication number: CN114349808A
Application number: CN202210195343.2A
Authority: CN
Inventors: 李俊; 黄艳; 李健; 关欣兰; 邓胜平
Original assignee: Guangxi Normal University
Current assignee: Guangxi Normal University
Priority date: 2022-03-01
Filing date: 2022-03-01
Publication date: 2022-04-15
Anticipated expiration: 2042-03-01
Also published as: CN114349808B

Abstract

本发明公开了一种大萼香茶菜皂苷A和B单体的分离纯化方法及其应用，所述方法为采用包括弱极性或非极性苯乙烯型大孔吸附树脂吸附等分离手段，然后经过正相硅胶色谱柱层析，最后以备反相硅胶C₁₈色谱柱层析纯化，从大萼香茶菜全植株中分离得到1个二萜苷和1个三萜苷新化合物。本发明通过最适宜的工艺及参数条件的组合，可有效除去大萼香茶菜中的大量杂质，一次性可获取1个萜二苷和1个三萜苷，活性测定实验表明，新化合物具有抗HBV活性，为今后对大萼香茶菜的进一步的药理活性筛选及临床研究开发出疗效确切、毒副作用小的抗HBV药物奠定了物质基础。

Description

一种大萼香茶菜皂苷A和B单体的分离纯化方法及其应用

技术领域

本发明涉及中药活性成分的分离提纯技术领域，具体是一种大萼香茶菜皂苷A和B单体的分离纯化方法及其应用。

背景技术

大萼香茶菜(Isodon macrocalyx)属于唇形科(Lamiaceae)香茶菜属(Isodon)属植物。大萼香茶菜具有清热解毒的功效，民间用该植物治疗头痛发热、汗出恶风、咳嗽胸痛、肺燥干咳无痰等疾病。迄今为止，未见有关对大萼香茶菜的化学成分及其生物活性的研究报道。大萼香茶菜中除含有大萼香茶菜皂苷外，还含有木脂素类、香豆素类、黄酮类、生物碱类、多糖类等的成分，较难实现大萼香茶菜皂苷与其他物质的分离，且大萼香茶菜皂苷的含量低，结构及理化性质很相似，很难通过简单的分离方法一次获得多个大萼香茶菜皂苷的单体。

为了更深入研究大萼香茶菜的成分，开发和利用该植物，寻找一种提取率高、成本低和易于工业化生产大萼香茶菜皂苷A和B分离纯化的工艺，为研究大萼香茶菜的抗HBV活性、构效关系，以及应用开发奠定了基础。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，而提供一种大萼香茶菜皂苷A和B单体的分离纯化方法及其应用。这种方法能有效除去大萼香茶菜中的大量杂质，一次性可获取2个新大萼香茶菜皂苷，从而可为大萼香茶菜皂苷类化合物的抗HBV活性研究和单一成分的新药开发提供物质基础。

实现本发明目的的技术方案是：

一种大萼香茶菜皂苷A和B单体的分离纯化方法，包括如下步骤：

1)将大萼香茶菜全植株用10-15个质量比的50％-75％乙醇水溶液提取，得到大萼香茶菜全植株的提取物，回收提取液的乙醇后，余下的水部分用10倍蒸馏水稀释，得到大萼香茶菜全植株粗提物水溶液；

2)将步骤1)得到的大萼香茶菜全植株粗提物水溶液进行弱极性或非极性苯乙烯型大孔吸附树脂柱层析，充分吸附后，用4-6个柱体积蒸馏水冲洗，去除未被吸附的杂质，再依次各用4-6个柱体积的20％-30％乙醇水溶液洗脱、弃去洗脱液，然后以4-6个柱体积的31％-60％乙醇水溶液洗脱，浓缩洗脱液，得到富含大萼香茶菜皂苷A和B的洗脱部分，其中，大孔吸附树脂为D101或AB-8，优选的大孔树脂吸附量大，洗脱容易，吸附动力学性能良好，对无机酸、盐、蛋白、糖类、小分子亲水性有机物均不吸附，因而可将一般苷类物质与这些物质分离，在较短的时间内取得较好的分离效果。

3)用甲醇溶解步骤2)得到的31％-60％乙醇水溶液洗脱部分样品，然后进行硅胶色谱柱层析，依次各用4-6个柱体积的70％-30％的二氯甲烷与30％-70％的甲醇混合液作为洗脱剂进行洗脱，弃去70％的二氯甲烷与30％的甲醇混合液洗脱液，收集30％的二氯甲烷与70％的甲醇混合液洗脱物；

4)将步骤3)收集的30％的二氯甲烷与70％的甲醇混合液洗脱物进行高效液相色谱C₁₈柱层析，获得大萼香茶菜皂苷A和B，它们都是新化合物、结构式分别如式(I)所示：

步骤1)中所述的大萼香茶菜全植株的提取物由如下方法制得：将大萼香茶菜全植株粉碎、加入全植株10-15倍质量的浓度为50％-75％的乙醇水溶液，加热回流提取2-3次，减压浓缩、干燥，得大萼香茶菜全植株的提取物，这种提取方法可以将大萼香茶菜全植株中的大量杂质去除，确保提取物中主要含有苷类等有机成分。

步骤3)中所述硅胶色谱柱为正相硅胶色谱柱。

步骤3)中所述的纯化过程为：将步骤2)中31％-60％的乙醇水溶液洗脱、富含大萼香茶菜皂苷A和B的样品进行硅胶柱层析，依次用4-6个柱体积的30％-70％的二氯甲烷与60％-30％的甲醇混合液作为洗脱剂进行梯度洗脱。

步骤4)中所述的高效液相色谱的色谱柱为反相十八烷基硅烷键合硅胶(C₁₈)色谱柱，该柱能够在较高的温度和较低的pH条件下使用，固定相不会发生相塌陷现象，可以长时间保持柱效，延长柱寿命。

高效液相色谱的检测条件为：

固定相：十八烷基硅烷基键合硅胶C₁₈为填料的色谱柱；

检测波长：210nm；

流速：2.0-4.0mL/min；

柱温：25℃-35℃；

流动相：水为流动相A为70％-30％，甲醇为流动相B为30％-70％，洗脱，流动相A与流动相B的比例为体积比，在高效液相色谱分离准备过程中，色谱条件的选择非常重要，它直接影响物质色谱峰的保留时间、分离度等；色谱条件主要包括色谱柱(包括填料、柱长、柱温等)、流动相(包括组分、流速等)、检测器及检测波长、柱温等，本技术方案中的色谱条件，可使物质色谱峰的保留时间、峰形、分离度等达到最佳化，实现了大萼香茶菜皂苷单体的高效分离。

步骤4)中所述的将步骤3)中收集的30％的二氯甲烷与70％的甲醇混合液洗脱物进行高效液相色谱C₁₈柱层析纯化过程为：将30％的二氯甲烷与70％的甲醇混合液洗脱物加入反相C₁₈硅胶色谱柱中，用体积浓度为30-70％甲醇水溶液洗脱，分别得到大萼香茶菜皂苷A 和B单体化合物。

上述方法所制备的大萼香茶菜皂苷化合物在制备抗HBV类药物中的应用。

一种药物制剂，包括采用上述方法所制备的大萼香茶菜皂苷类化合物与药学上可接受的载体。

本技术方案中的大萼香茶菜为唇形科香茶菜属植物，药材部位为干燥全植株。

本技术方案中的大萼香茶菜皂苷单体分离纯化的方法，针对大萼香茶菜中存在的各组分的理化性质，能有效除去大萼香茶菜中的大量杂质，获得纯度较高的大萼香茶菜皂苷单体，可以实现大萼香茶菜皂苷的目标制备，一次性可获取2个新大萼香茶菜皂苷，从而可以不断丰富皂苷类化合物的活性研究，为新药开发提供物质基础。

这种方法能有效除去大萼香茶菜中的大量杂质，一次性可获取2个新大萼香茶菜皂苷，从而可为大萼香茶菜皂苷类化合物的抗HBV活性研究和单一成分的新药开发提供物质基础。

附图说明

图1为实施例中大萼香茶菜皂苷A的¹H NMR谱图；

图2为实施例中大萼香茶菜皂苷A的¹³C NMR谱图；

图3为实施例中大萼香茶菜皂苷B的¹H NMR谱图；

图4为实施例中大萼香茶菜皂苷B的¹³C NMR谱图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的内容作进一步的阐述，但不是对本发明的限定。

实施例1：

1)取10kg干燥的大萼香茶菜全植株，加入10倍的原料质量比50％乙醇水溶液(体积比)，依次加热回流提取3次，时间为3小时、2小时、2小时，合并滤液，减压回收乙醇，得浸膏；

2)将步骤1)的浸膏用蒸馏水稀释50倍，经D101大孔吸附树脂色谱柱吸附，用4个柱体积蒸馏水洗冲洗，去除未被吸附的杂质，再用4个柱体积的30％乙醇水溶液洗脱，弃去洗脱液，然后以50％乙醇水溶液洗脱，浓缩洗脱液，得到富含大萼香茶菜皂苷A和B的洗脱部分；

3)取步骤2)中所获得的50％乙醇洗脱物，经正相硅胶柱层析，依次各用4个柱体积的70％的二氯甲烷与30％的甲醇混合液、30％的二氯甲烷与70％的甲醇混合液(体积比)洗脱，弃去70％的二氯甲烷与30％的甲醇混合液(体积比)洗脱液，收集30％的二氯甲烷与70％的甲醇混合液洗脱物；

4)将步骤3)收集30％的二氯甲烷与70％的甲醇混合液洗脱物经过反相C₁₈硅胶柱层析，以水-甲醇(30:70)为洗脱剂进行洗脱，得到第一化合物1(t_R＝30.07min)和第二化合物2(t_R＝67.74min)。

步骤4)中，高效液相色谱进行检测监控的条件为：

固定相：十八烷基硅烷基键合硅胶为填料的色谱柱；

检测器：紫外检测器；

检测波长：210nm；

流速：3.0mL/min；

柱温：25℃；

流动相：水为流动相A为70％，甲醇为流动相B为30％。

采用上述检测条件对得到的第一单体化合物1、第二单体化合物2进行检测，第一单体化合物1的纯度为99.4％，第二单体化合物2的纯度为99.6％。

实施例2:

1)取10kg干燥的大萼香茶菜全植株，加入12倍的60％乙醇水溶液(原料质量比)，依次加热回流提取3次，时间为3小时、2小时、2小时，合并滤液，减压回收乙醇，得浸膏；

2)取浸膏悬浮于50L水中，经D101大孔吸附树脂色谱柱吸附，用水清洗，然后用20％、 60％乙醇洗脱，分别得到20％、60％乙醇洗脱物，60％乙醇洗脱物作为富含大萼香茶菜皂苷A和B的大萼香茶菜全植株提取物；

3)取上述步骤2)中所获得的50％乙醇洗脱物，经正相硅胶柱层析，依次各用4个柱体积的50％的二氯甲烷与50％的甲醇混合液、30％的二氯甲烷与70％的甲醇混合液、(体积比)洗脱，弃去50％的二氯甲烷与50％的甲醇混合液洗脱液，收集30％的二氯甲烷与70％的甲醇混合液洗脱物；

4)将步骤3)收集30％的二氯甲烷与70％的甲醇混合液洗脱物经过反相C₁₈硅胶柱层析，以水-甲醇(70:30)为洗脱剂进行洗脱，到第一化合物1(t_R＝30.05min)和第二化合物2 (t_R＝67.99min)。

步骤4)中，高效液相色谱的检测监控的条件与实施例1相同，不同的是流速为3.5ml/min，柱温为30℃。

采用上述检测条件对得到的第一单体化合物1、第二单体化合物2进行检测，第一单体化合物1的纯度为99.6％，第二单体化合物2的纯度为99.2％。

实施例3：

1)取10kg干燥的大萼香茶菜全植株，加入15倍的75％乙醇水溶液(原料质量比)，依次加热回流提取3次，时间为3小时、2小时、2小时，合并滤液，减压回收乙醇，得浸膏；

2)取步骤1)的浸膏悬浮于50L水中，经D101大孔吸附树脂色谱柱吸附，用水清洗，然后用30％、60％乙醇洗脱，分别得到30％、60％乙醇洗脱物，60％乙醇洗脱物作为富含大萼香茶菜皂苷A和B的大萼香茶菜全植株提取物；

3)取上述步骤2)中所获得的60％乙醇洗脱物，经正相硅胶柱层析，依次各用4个柱体积的60％的二氯甲烷与40％的甲醇混合液、30％的二氯甲烷与70％的甲醇混合液、(体积比)，弃去60％的二氯甲烷与40％的甲醇混合液洗脱液，收集30％的二氯甲烷与70％的甲醇混合液洗脱物；

4)将步骤3)收集的30％的二氯甲烷与70％的甲醇混合液洗脱物经过反相C₁₈硅胶柱层析，以水-甲醇(70:30)为洗脱剂进行洗脱，得到第一化合物1(t_R＝30.14min)和第二化合物2(t_R＝67.90min)。

步骤4)中，高效液相色谱的检测监控的条件与实施例1相同，不同的是流速为4.0ml/min，柱温为35℃。

采用上述检测条件对到第一化合物1和第二化合物2进行检测，第一单体化合物1的纯度为99.0％，第二单体化合物2的纯度为99.6％。

如图1、图2、图3、图4所示，将得到的2个单体化合物即第一化合物1和第二化合物2经红外、质谱、核磁共振谱(¹HNMR、¹³CNMR、DEPT、¹H-¹HCOSY、HSQC、HMBC、ROESY)、质谱(MS)和旋光度等光谱技术，鉴定了到第一化合物1为大萼香茶菜皂苷A，第二化合物 2为大萼香茶菜皂苷B，它们都是新化合物，大萼香茶菜皂苷A和B的理化数据如下所示：

大萼香茶菜皂苷A[macrocalyxoside A]：无色粉末,

(c 0.10,MeOH)； HRESIMS m/z 635.3232([M+Cl]^-(calcd for C₃₁H₅₂ClO₁₁,635.3198)；¹H NMR(600MHz, pyridine-d₅)δ0.83(s,H-1),1.50(m,H-1),1.78(m,H-2),2.07(m,H-2),3.58(dd,J＝7.4,4.4Hz,H-3),1.44(m,H-5,7),1.62(m,H-6),1.42(m,H-6,9), 1.81(dt,J＝12.0,3.0Hz,H-7),2.18(m,H-11),1.38(m,H-11),1.35(m,H-12), 1.19(m,H-13),5.85(dd,J＝18.0,11.0Hz,H-14),4.90(dd,J＝11.0,2.0Hz, H-15),5.03(dd,J＝18.0,2.0Hz,H-15),1.23(s,H-16),0.87(s,H-17),1.33 (s,H-18),0.66(s,H-19),1.25(s,H-20),4.90(d,J＝7.4Hz,H-1'),4.13(m, H-2'),4.27(m,H-3'),4.04(m,H-4'),4.24(m,H-5'),4.23(dd,J＝12.0,3.4 Hz,H-6'),4.75(dd,J＝12.0,3.4Hz,H-6'),4.97(d,J＝7.6Hz,H-1”),4.77(m,H-2”),4.60(d,J＝11.2Hz,H-4”),4.37(d,J＝11.2Hz,H-4”),4.17(m, H-5”)；¹³C NMR(150MHz,pyridine-d₅)δ38.0(C-1),4.5(C-2),85.5(C-3),39.1 (C-4),56.4(C-5),116.8(C-6),44.0(C-7),76.4(C-8),58.9(C-9),37.0(C-10), 35.5(C-11),220.3(C-12),74.0(C-13),148.8(C-14),111.5(C-15),33.6(C-16), 7.3(C-17),29.0(C-18),16.5(C-19),24.7(C-20),103.0(C-1'),75.6(C-2'), 79.2(C-3'),72.5(C-4'),78.3(C-5'),69.3(C-6'),110.3(C-1”),77.7(C-2”), 81.1(C-3”),74.7(C-4”),66.3(C-5”).

大萼香茶菜皂苷B[macrocalyxoside B]：无色粉末,

(c 0.04,CD₃OD)； HRESIMS m/z[M+Cl]^-671.3908(calcdfor C₃₆H₆₀ ClO₉,671.3926)；¹H NMR(600MHz,pyridine-5)δ1.79(1H,m,H-1a),2.99(1H,m,H-1b),2.444(1H,m,H-2a),2.96 (1H,m,H-2b),2.09(1H,dd,H-5),1.33(1H,m,H-6a),1.90(1H,m,H-6b),1.12 (1H,m,H-7a),1.51(1H,m,H-7b),2.11(1H,m,H-9),1.63(1H,m,H-11a),2.98 (1H,m,H-11b),4.42(1H,dt,H-12),2.03(1H,m,H-13),1.10(1H,m,H-15a),1.57 (1H,m,H-15b),1.34(1H,m,H-16a),2.01(1H,m,H-16b),2.08(1H,m,H-17),1.04 (1H,s,H-18),1.24(1H,s,H-19),1.48(1H,s,H-21),1.90(1H,m,H-22a),2.20 (1H,m,H-22b),1.74(1H,m,H-23a),3.02(1H,m,H-23b),4.49(1H,d,H-24),4.99 (1H,br s,H-26a),5.34(1H,br s,H-26b),1.95(1H,s,H-27),4.87(1H,brs, H-28a),4.95(1H,br s,H-28b),1.80(1H,s,H-28),0.96(1H,s,H-30),4.82(1H, d,H-1′,J＝7.4Hz),4.38(1H,m,H-2′),4.05(1H,m,H-3),4.19(1H,m,H-4′), 3.63(1H,m,H-5′a),4.26(1H,m,H-5′b),3.52(3H,s,H₃-COOCH₃)；¹³C NMR(150 MHz,pyridine-5)δ38.1(C-1),30.6(C-2),176.4(C-3),148.9(C-4),52.4(C-5), 25.7(C-6),35.2(C-7),41.3(C-8),41.1(C-9),40.5(C-10),34.2(C-11),75.8 (C-12),45.0(C-13),51.4(C-14),31.0(C-15),26.1(C-16),50.7(C-17),17.1 (C-18),20.8(C-19),74.4(C-20),27.1(C-21),38.0(C-22),31.9(C-23),76.3 (C-24),149.9(C-25),110.6(C-26),18.9(C-27),114.3(C-28),24.2(C-29),17.2 (C-30),101.7(C-1′),73.2(C-2′),75.0(C-3′),70.2(C-4′),67.9(C-5′), 51.7(C-COOCH₃)。

实施例4：

对一种式(I)所示的大萼香茶菜皂苷A和大萼香茶菜皂苷B的抗HBV活性研究，检测大萼香茶菜皂苷A和B对体外培养HepG 2.2.15细胞株上清液中HBsAg、HBeAg和HBV DNA 的抑制效果。

实验方法：体外培养HepG 2.2.15细胞株，定期换液传代，实验前用G418筛选，将对数生长期细胞用0.25％胰蛋白酶消化成单细胞悬液，以每孔10⁵个细胞接种于96孔板中，每孔180μL，放入CO₂培养箱中培养，细胞贴壁后，加入5个不同浓度的化合物药液，每个浓度设3个复孔，每次检测各设1孔阳性(拉米夫定，LA)、阴性(磷酸盐缓冲液，PBS) 和空白对照，分别培养72、144小时，然后收集培养液，于－20℃冻存待检，以MTT法分析细胞增殖情况；收集上清液，采用双抗体夹心ELISA法检测上清液中的HBsAg和HBeAg，计算SI值，另外，根据试剂盒说明，设计HBV DNA引物和探针，扩增，采用荧光定量PCR 法检测上清液中的HBV DNA。

实验结果：对从大萼香茶菜抗HBV活性部位分离得到的大萼香茶菜皂苷A和B进行抑制HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg表达的影响，发现新化合物大萼香茶菜皂苷A和B对乙肝病毒HBsAg和HBeAg表达的抑制率都大于50％。对活性化合物，进一步测试它们对HepG2.2.15细胞HBsAg、HBeAg表达和HBV DNA复制活性的影响，计算IC₅₀值，结果见表1。

从表1可见，大萼香茶菜皂苷A和B抑制HBsAg表达的IC₅₀值分别为69.56μM和57.87μM，抑制HBeAg表达的IC₅₀值分别为98.56μM和79.75μM，它们的抑制乙肝病毒HBsAg、 HBeAg活性以及治疗指数均大于阳性对照拉米夫定；化合物ST-1显示很好的抑制HBV DNA 复制活性，实验表明本例方法制备的化合物具有抗HBV活性，为今后进一步的药理活性筛选及临床研究开发出疗效确切、毒副作用小的抗HBV药物奠定了物质基础。

表1大萼香茶菜皂苷A和B抑制HepG2.2.15细胞HBsAg、HBeAg表达和HBV DNA 复制活性的影响(X±SD，n＝3)

^aHBsAg,乙肝病毒表面抗原。

^bHBeAg,乙肝病毒e抗原。

^cSI＝CC₅₀/IC₅₀，治疗指数(选择性指数)。

^d3TC:Lamivudine,拉米夫定，阳性对照。

Claims

1.一种大萼香茶菜皂苷A和B单体的分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

2)将步骤1)得到的大萼香茶菜全植株粗提物水溶液进行弱极性或非极性苯乙烯型大孔吸附树脂柱层析，充分吸附后，用4-6个柱体积蒸馏水冲洗，去除未被吸附的杂质，再依次各用4-6个柱体积的20％-30％乙醇水溶液洗脱、弃去洗脱液，然后以4-6个柱体积的31％-60％乙醇水溶液洗脱，浓缩洗脱液，得到富含大萼香茶菜皂苷A和B的洗脱部分，其中，大孔吸附树脂为D101或AB-8；

2.根据权利要求1所述的大萼香茶菜皂苷A和B单体的分离纯化方法，其特征在于，步骤1)中所述的大萼香茶菜全植株的提取物由如下方法制得：将大萼香茶菜全植株粉碎、加入全植株10-15倍质量的浓度为50％-75％的乙醇水溶液，加热回流提取2-3次，减压浓缩、干燥，得大萼香茶菜全植株的提取物。

3.根据权利要求1所述的大萼香茶菜皂苷A和B单体的分离纯化方法，其特征在于，步骤3)中所述硅胶色谱柱为正相硅胶色谱柱。

4.根据权利要求1所述的大萼香茶菜皂苷A和B单体的分离纯化方法，其特征在于，步骤3)中所述的纯化过程为：将步骤2)中31％-60％的乙醇水溶液洗脱、富含大萼香茶菜皂苷A和B的样品进行硅胶柱层析，依次用4-6个柱体积的30％-70％的二氯甲烷与60％-30％的甲醇混合液作为洗脱剂进行梯度洗脱。

5.根据权利要求1所述的大萼香茶菜皂苷A和B单体的分离纯化方法，其特征在于，步骤4)中所述的高效液相色谱的色谱柱为反相十八烷基硅烷键合硅胶(C₁₈)色谱柱。

6.根据权利要求1所述的大萼香茶菜皂苷A和B单体的分离纯化方法，其特征在于，步骤4)中所述的将步骤3)中收集的30％的二氯甲烷与70％的甲醇混合液洗脱物进行高效液相色谱C₁₈柱层析纯化过程为：将30％的二氯甲烷与70％的甲醇混合液洗脱物加入反相C₁₈硅胶色谱柱中，用体积浓度为30-70％甲醇水溶液洗脱，分别得到大萼香茶菜皂苷A和B单体化合物。

7.权利要求1所述的大萼香茶菜皂苷类化合物或权利要求2-6任意一项所述方法所制备的大萼香茶菜皂苷化合物在制备抗HBV类药物中的应用。

8.一种药物制剂，其特征在于，包括权利要求1所述方法所制备的大萼香茶菜皂苷类化合物或权利要求2-6任意一项所述方法所制备的大萼香茶菜皂苷类化合物与药学上可接受的载体。