CN102892428A - 表达兔出血热病毒的vp60主要衣壳蛋白的副痘病毒 - Google Patents
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Abstract
本发明描述了一种能够在兔中治疗和/或预防兔出血热病毒感染的治疗剂,即,一种重组副痘病毒,其特征在于由外来核酸表达来自兔出血热病毒(RHDV)的VP60主要衣壳蛋白。
Description
描述
本发明涉及一种能够在兔中治疗和/或预防兔出血热病毒感染的治疗剂,即,一种重组副痘病毒,其特征在于由外来核酸表达来自兔出血热病毒(RHDV)的VP60主要衣壳蛋白。
背景技术
兔出血热病毒(RHDV)是野兔和家兔(如欧洲野兔种(Oryctolagus cuniculus))中的一种高度接触性疾病,它首次在1984年于中华人民共和国报道。RHDV随后在1987年至1989年期间传播遍及欧洲。感染的成年兔通常在感染后48至72小时内死于坏死性肝炎和出血性综合征。群体中的发病率和死亡率可以高达90-100%。
本疾病是商品兔生产中严重经济损失以及野兔中高死亡率的原因。遍及世界的商品兔生产是一项重要产业,尤其在其中小规模兔养殖业良好建立的亚洲和中欧。RHDV的高度接触性和致命性质已经产生遍及许多国家的重大经济影响。在多个国家如新西兰和澳大利亚,额外的保护方面如兔子数量的控制已经导致理解和控制本疾病的明显国际性努力。
许多实验室中的工作导致将RHD病毒基于衣壳形态、核酸类型和其他物理特征表征为一种杯状病毒。病毒粒子由无包膜的二十面体的直径35-40nm的衣壳组成,所述衣壳主要由60kDa主要多肽种类组成。该病毒由大约7.4kb的正义单链RNA基因组编码并且组织为编码主要60kDa(VP60)衣壳蛋白、12kDa推定蛋白和3种非结构蛋白(包括RNA聚合酶和蛋白酶)的两个可读框。病毒衣壳因大约180拷贝的单个VP60蛋白的多聚化产生。
已经做出许多努力以产生在兔群体中治疗和预防RHDV感染的疫苗,大部分所述疫苗依赖于VP60衣壳蛋白的施用。VP60衣壳蛋白已经在多种表达系统中产生,如酵母(Boga等人,Journal of General Virology(1997),78,2315-2318)、杆状病毒/细胞培养系统(Laurent等人,Journal of Virology,1994年10月,6794-6798,Marin等人,Virus Research 39(1995)119-128)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(O.Farnos等人,Antiviral Research 81(2009)25-36)。重组产生的VP60蛋白已经随后作为有效的疫苗应用。然而重组蛋白的生产伴随诸多难题,如形成结构上不规则的蛋白质聚集物、费时和复杂的蛋白质纯化系统,和难以产生足够质量和数量用于商业生产。
还已经在马铃薯植物中产生重组VP60并且随后将其作为叶提取物中的疫苗应用(Castanon等人,Journal of Virology,1999年5月,第4452-4455页)。虽然有效在接种的兔中产生针对VP60的抗体,但是从植物产生提取物与细胞培养物中产生病毒相比是比较慢的。必须培育、收获和加工转基因植物,因此使产量限于不适于商业应用的规模。类似地,豌豆衍生的重组VP60可以导致不良产率并因此限制商业应用(Mikschofsky H等人,Plant Biotechnol J.2009年8月;7(6):537-549)。相似的复杂情况在通过植物中的表达产生VP60抗原的相关尝试中是明显的。在胡萝卜中的表达导致相对于有效免疫而言不充分的表达水平(Mikschofsky,H.等人,2009,Journal of Agricultural Science 147,43-49,Mikschofsky,H.等人,2009,In Vitro Cell.Dev.Biol.Plant 45,740-749)。使用霍乱毒素B作为功能性佐剂的烟草植物表达也表明,除与植物表达系统中的生产相关的其他复杂性之外,VP60的表达水平是次最佳的(Mikschofsky,H.等人,2009,Plant Sci.doi:10.1016/j.plantsci.2009.03.010(Cholera toxin B as a functionaladjuvant in tobacco plants(烟草植物中作为功能性佐剂的霍乱毒素B))。
使用病毒作为RHDV疫苗为重组VP60蛋白的施用提供了一个有前景的替代。基于疫苗的痘苗病毒已经应用于RHDV(Bertagnoli等人,Vaccine,第14卷,第6期,第506-510页,1996),虽然由痘苗病毒诱导的长期免疫可以导致再接种不成功或针对痘苗病毒编码的外来抗原的保护作用减弱。
在目前,归咎于不能在细胞培养系统中培养RHDV(因此阻碍病毒疫苗生产),现有疫苗涉及感染和处死动物,以便提取可以随后分离出RHDV的肝脏。这导致借助感染和处死而获得的灭活或死病毒疫苗,这是一项就动物保护和财务局限性而言行为具有明显缺点的行为。从感染动物获得的RHDV(在现有技术的疫苗中)随后在应用于接种之前灭活。与本发明的优选活的副痘-VP60病毒相比,这导致活性显著降低。在其制造期间还需要额外的病毒灭活产物并且在应用之前经常需要额外的佐剂,以便增加接种后产生的免疫应答。
副痘病毒(PPV)是痘病毒科(Poxviridae)的一个属,具有模式种PPV绵羊病毒(羊口疮病毒,ORFV),它为用作疫苗载体提供几个潜在优点载体(Rziha等人,Journal of Biotechnology 73(1999)235-242)。有利于ORFV疫苗载体的证据包括有限的宿主范围(绵羊和山羊)、其嗜性限于皮肤、无全身性感染、短期载体特异性保护性免疫和在感染部位出人意料强烈地刺激快速固有细胞免疫机制(Buttner,M.和H.J.Rziha.2002.J.Vet.Med.B Infect.Dis.Vet.PublicHealth 49:7-16.)。
已经成功地施用ORFV重组体作为针对多种病毒感染的疫苗,如针对猪中(Dory等人,Vaccine 24(2006)6256-6263,和van Rooij等人,Vaccine 28(2010)1808-1813)或小鼠中(Fischer等人,Journal of Virology,2003年9月,第9312-9323页)的伪狂犬病毒以及针对大鼠中的博尔纳病毒(Henkel等人,J.ofVirology 2005,第314-325页)。
然而ORFV未曾在兔中应用或用作针对RHDV的疫苗。尽管近来在针对RHDV的疫苗方面取得进展,但是仍迫切需要强用于控制野生兔群和商品兔群中RHDV感染的新方法。
发明内容
根据现有技术,作为本发明基础的技术问题是提供能够在兔中治疗和/或预防兔出血热病毒感染的有效治疗剂。
这个问题由独立权利要求的特征解决。本发明的优选实施方案由从属权利要求提供。
本发明因此涉及一种重组副痘病毒,其包含来自兔出血热病毒(RHDV)的VP60主要衣壳蛋白。羊口疮病毒提供有限的宿主范围(绵羊和山羊)和嗜性,并且因此是相对安全的病毒载体。
在一个实施方案中,本发明副痘病毒的特征在于来自兔出血热病毒(RHDV)的VP60主要衣壳蛋白由外来核酸序列表达。从重组副痘病毒表达的RHDV的VP60蛋白发挥作用以在治疗的动物中诱导抗原特异性免疫,这提供了免遭RHDV感染的有效保护。
在一个实施方案中,本发明副痘病毒的特征在于副痘病毒是羊口疮病毒(ORFV)、优选地是ORFV株D1701,更优选地是D1701-V-VP60n。
在一个实施方案中,本发明副痘病毒的特征在于外来核酸序列是整合至副痘病毒基因组中的DNA序列。
在一个实施方案中,本发明副痘病毒的特征在于VP60主要衣壳蛋白由包含根据SEQ ID No.1或SEQ ID No.2的序列的DNA序列编码。
在一个实施方案中,本发明副痘病毒的特征在于VP60主要衣壳蛋白包含根据SEQ ID No.3的氨基酸序列。
本发明的又一个方面涉及作为药物使用的如本文所述的副痘病毒。
本发明的又一个方面涉及作为疫苗用于治疗性和/或预防性治疗受试者中的RHDV感染的如本文所述的副痘病毒。
本发明的又一个方面涉及一种药物组合物,其包含本发明的副痘病毒、根据SEQ ID No.1或SEQ ID No.2编码VP60蛋白的核酸分子和/或包含根据SEQ ID No.3的序列的VP60蛋白、以及可药用载体。
本发明的又一个方面涉及如本文所述的副痘病毒作为疫苗在治疗性和/或预防性治疗受试者中RHDV感染中的用途。
本发明的又一个方面涉及包含如本文所述的副痘病毒的疫苗,因而副痘病毒优选地是活的。优选活的减毒病毒。在一个实施方案中,如本文所述的疫苗可以特征在于存在用于增强疫苗功能的额外药剂,如佐剂或免疫刺激剂。在又一个实施方案中,如本文所述的疫苗可以特征在于该疫苗是联合疫苗,包含用于额外疾病的疫苗-药剂。
本发明的又一个方面涉及治疗性和/或预防性治疗兔中RHDV感染的方法,其特征在于将治疗有效量的本发明副痘病毒、本发明的药物组合物或如本文所述的疫苗施用至受试者。
本发明的又一个方面涉及编码兔出血热病毒(RHDV)蛋白VP60的核酸分子,其包含根据SEQ ID No.1或SEQ ID No.2的序列。在一个实施方案中,编码VP60的核酸分子意图用于生产如本文所述的重组副痘病毒。
本发明的又一个方面涉及兔出血热病毒(RHDV)的VP60主要衣壳蛋白,其包含根据SEQ ID No.3的序列。
本发明的又一个方面涉及编码VP60的核酸分子和/或VP60主要衣壳蛋白在制造用于治疗性和/或预防性治疗兔中RHDV感染的药物、优选疫苗中的用途。
本发明的受试者是指兔。将“兔”理解为兔形目(Lagomorpha)兔科(Leporidae)中的哺乳动物。野生兔和家养兔是本发明的预期受试者。在分类为兔的这个科中存在8个不同属,包括欧洲兔(Oryctolagus cuniculus)和棉尾兔(棉尾兔属(Sylvilagus)),除许多其他兔物种之外,还包括野兔。
发明详述
在一个方面,本发明涉及一种重组副痘病毒,其含有编码RHDV VP60主要衣壳蛋白的DNA序列。根据本发明,这种重组副痘病毒表达VP60基因的基因产物。将VP60的特定可读框插入副痘病毒载体中,并且使用所得到的重组病毒来免疫动物。VP60基因产物的表达在治疗动物中导致特异性指向VP60的免疫应答。因此,本发明的重组病毒可以用于免疫学组合物或疫苗中以提供诱导免疫应答的手段,所述的免疫应答可以是,但不需要是保护性的。所述免疫应答可以在其效果方面是治疗性或预防性的。
VP60与副痘病毒的组合使含有VP60的病毒能够在细胞培养中产生,这是直至现在未成功地实现的事情。本发明因此能够在无需(如目前在现有技术中所实施那样)处死感染动物的情况下生产VP60-疫苗。本文所述的副痘病毒在Vero细胞(猴肾细胞系)中有效增殖。
VP60基因是在整合于副痘病毒基因组中的早期副痘病毒启动子控制下表达。VP60基因产物因此在细胞感染后由副痘病毒表达,从而VP60基因在宿主细胞中既转录又翻译。然而,这种表达不导致感染性病毒的产生。
重组整合的基因产物在感染后的有效表达代表痘病毒的一般原理并且取决于活的疫苗。然而,考虑VP60蛋白在应用之前表达并且导致VP60抗原产生,本发明的重组病毒可以作为活病毒或死病毒应用。宿主细胞中应答于VP60抗原的抗体产生在对应于施加活病毒或死病毒时。在一个优选实施方案中,将本发明的重组病毒作为活疫苗施加至受试者,此时VP60表达在感染后继续进行。
本发明的一个明显和出乎意料的优点在于,用本发明病毒疫苗感染(治疗或接种)的受试者不产生病毒粒子,所述病毒粒子则不能从治疗的受试者释放。出于许多原因,这代表一个明显优点。首先,感染(接种)限于起初所治疗的那些受试者,而不造成失控的病毒增殖。这种病毒因此可以也不传播至其他宿主,这是一个潜在顾虑,即便副痘病毒的宿主范围有限。其次,因为这种病毒在本质上是重组的(基因修饰的),所以一般公众和农业管理机关突出强调基因修饰产物不能够传播或被释放环境中。本发明的重组病毒疫苗不从感染的受试者中释放的事实因此代表本发明的一个令人惊讶和有利的方面,这不能根据现有技术预测到。
本发明涉及作为用于重组VP60基因的载体的全部副痘病毒。在一个优选实施方案中,本发明副痘病毒的特征在于副痘病毒是羊口疮病毒(ORFV)、优选地是ORFV株D1701,更优选地是D1701-V-VP60n株。ORFV株D1701的衍生物也落入本发明的范围。D1701株代表最初从绵羊分离的高度减毒病毒。在连续细胞培养传代后,所得到无毒力D1701株成功地在开发活疫苗中使用(Mayr,A.等人,1981,Tbl.Vet.Med.B.28,535-552)。D1701株已经进一步表征并且检验其作为疫苗载体的性能(Cottone,R.等人,1998,Virus Research 56,53-67,Rziha,H.-J.等人,2000,Journal of Biotechnology 83,137-145,EP0,886,679B1)。在Mayr等人(1981),Cottone等人(1998),Rziha等人(2000)中和在EP 0 886 679 B1中描述的毒株意图作为优选的副痘病毒载体用于如本文所述的VP60基因。这些毒株是高度减毒的、无致病性并且不能在兔中复制。
本发明的重组副痘病毒的又一个优点是在治疗受试者期间出现的免疫刺激作用。副痘病毒增强这种免疫刺激作用,从而病毒载体本身充当VP-60应用的佐剂。副痘病毒与VP60基因的这种独特和创造性组合导致协同效应,因而副痘病毒的免疫刺激性能以协同方式与VP60抗原组合,这还诱导免疫应答(即抗原特异性免疫应答),从而提供针对VP60抗原的强烈免疫应答。这种组合的因素最终导致有效疫苗的产生。直至现在,尝试施用多种形式的VP60的如现有技术中所述的方法从未引起足够免疫应答以便提供针对病毒的有效保护。然而,副痘病毒和VP60的独特组合为RHDV疫苗的迫切需求提供有效的解决方案。如已经在现有技术中显示,单独应用副痘病毒或VP60抗原没有特殊的作用。所述组合引起令人惊讶的有效性,因而独立的病毒和VP60一起产生的效果大于它们作用的总和,从而产生针对RHDV提供持久保护的免疫应答。
用于本发明的重组病毒或其表达产物、本发明组合物如免疫组合物、抗原组合物或疫苗组合物或治疗性组合物的施用方法可以通过肠胃外途径施用,如皮内、肌内或皮下施加方法。这种施用使全身性免疫应答或体液免疫应答或细胞介导免疫应答成为可能。本发明的疫苗也可以掺入动物饲料中,从而能够进行大群体的简单和有效免疫。
优选的施加方法涉及皮下施加或肌内施加,优选地是通过注射。
更一般地,本发明的VP60副痘病毒重组性、抗原性、免疫性或疫苗副痘病毒-VP60(D1701-V-VP60n)组合物或治疗性组合物可以根据药学或兽医领域技术人员熟知的标准技术制备。
可以考虑此类因素如年龄、性别、重量、物种和具体受试者的状况以及施用途径,按照医学或兽医领域技术人员熟知的剂量并通过其熟知的技术施用治疗有效量的此类组合物。这些组合物可以单独施用,或可以联合或随后连同组合物(例如,连同“其他”免疫性、抗原性或疫苗或治疗性组合物)一起施用,从而提供本发明的多价或“鸡尾酒式”或联合组合物和使用它们的方法。再次地,可以考虑此类因素如年龄、性别、重量、物种和具体受试者的状况以及施用途径来决定成分和施用方式(依次或共施用)以及剂量。
本发明组合物的实例包括用于孔洞施用(例如,口服、经鼻、肛门的、阴道、经口(peroral)、胃内施用等)的液体制品,如混悬剂、糖浆剂或酏剂;和用于肠胃外、皮下、皮内、肌内或静脉内施用(例如,注射施用)的制品,如无菌混悬剂或乳剂。
在此类组合物中,重组副痘病毒可以与可药用的载体、稀释剂或赋形剂如无菌水、生理盐水、葡萄糖等混合。也可以冻干这些组合物。组合物可以含有辅助物质,如润湿或乳化剂、pH缓冲剂、佐剂、胶化或粘度增强添加物、防腐剂、矫味剂、色料等,这取决于施用途径和所需的制品。
表1:本发明的序列
附图和图注
附图简述:
图1:质粒pMK-RQ示意图,由Mr.Gene公司合成并从其获得。
图2:合成产生的基因VP60的核苷酸序列(SEQ ID.NO.2)
图3:借助PCR的重组病毒选择
图4:针对VP60表达的感染细胞的免疫染色
图5:VP60基因整合至D1701-V基因组中
图6:重组病毒中VP60转录的分析
图7:重组病毒中VP60蛋白表达的分析
图8:免疫荧光分析
图9:研究ORF-RHDV-VP60重组病毒(D1701-VP60)免疫原性的动物实验
图10:研究治疗剂量的动物实验
图11:用不同的病毒制备物处理后小鼠血清中的细胞因子式应答
图12:在腹内施加后Balb/C小鼠血清中的细胞因子和趋化因子表达
附图详细描述
图1:pMK-RQ示意图。提供含有VP60基因的pMK-RQ载体的示意图。合成性VP60基因从Mr.Gene(Regensburg,FRG)订购并且作为质粒-新vp60pMK-RQ获得。显示相关限制性酶切割位点和序列位置(核苷酸编号)。新VP60的可读框两侧分布有Hind III(#371)和EcoRI位点(#2127),所述位点已经用于将该基因克隆至转移质粒pdV-Red中。将沉默突变导入VP60基因以除去痘病毒转录物终止基序T5NT(其中N代表任何核苷酸)。显示了可读框和限制性酶位点。
图2:合成产生的基因VP60的核苷酸序列(SEQ ID.NO.2)。提供VP60基因的新核苷酸序列。在这些区域中,与本领域已知的VP-60基因序列相比,已经作出变化,先前的碱基已经在新序列下方平行地插入。在VP60的可读框中导入的全部碱基变化是沉默性的并且不改变氨基酸序列。已经将核苷酸6和7从T变成G并且从G变成C,以便获得Hind III克隆位点AAGCTT(加双下划线显示)。在位置10处的翻译起始密码子ATG以粗体放大显示。已经将核苷酸#225和228分别从T变成C,以便除去痘病毒早期转录终止基序TTTTTAT(T5NT),出于相同目的,也已经在位置1545、1611和1614导入T→C变化。紧邻原始翻译终止密码子TGA(位置1747-1749)之后添加第二终止基序,随后导入ORFV早期转录所需要的新T5NT基序。在基因序列的末端导入EcoRI克隆位点(GAATTC)。
图3:借助PCR的重组病毒选择。通过PCR对29独立蚀斑分离株检验VP60基因的存在(上半小图)。还检验LacZ基因的不存在,以便排除含有掺杂性亲本D1701-VrV病毒的蚀斑(下半小图)。PCR分析表明,多个独立蚀斑含有VP60基因但是不含杂质亲本LacZ基因。作为对照,使用以下样品:ni代表未感染的细胞,C-代表水对照,C+代表50ng的pdV-VP60n质粒DNA(对于VP60而言)或50ng含有LacZ基因的质粒(对于LacZ而言)。
图4:针对VP60表达的感染细胞的免疫染色。在用3个重组蚀斑分离株(3.3.4、4.1.9和2.2.6)感染后,将Vero细胞固定48小时并且随后用VP60特异性抗血清(由波兰格但斯克大学Dr.B.Szewczykby提供)染色。
图5:VP60基因整合至D1701-V基因组中。来自3个蚀斑分离株的DNA用限制性酶消化(如本图中所示)和随后用放射性VP60特异性探针探测。在Hind III或Hind III加Eco RI限制酶切消化后,杂交产生了来自D1701-Vvp60重组体的预期3.4kbp和1.7kbp DNA片段。该图的后续部分显示5.5kbpHindIII DNA片段的放大示意图,所述DNA片段含有插入的RHDV的VP60基因(箭头)。
图6:通过RNA印迹杂交(northern blot hybridization)分析VP60转录。从感染后2、4、6、10、24和32小时以及在胞阿糖胞苷(AraC)或环己酰胺(CHX)存在下24小时后的细胞分离总RNA。等量的RNA(6μg)由水平凝胶电泳分离。使用未感染的细胞作为阴性对照(ni)。上半部分显示1.7kb大小的VP60特异性mRNA。下半部分显示28S和18S细胞rRNA,表明可比较量的RNA加载到每条凝胶泳道上。
图7:通过蛋白质印迹分析法(Western blot analysis)分析3个不同重组蚀斑病毒分离株的VP60蛋白表达。泳道OrfK含有来自被亲本病毒D1701-VrV所感染的细胞的裂解物作为对照。细胞裂解物在感染后24或48小时提取并且由标准PAGE分离。用单克隆抗体C1和1G8或多克隆兔抗血清(Gdansk)特异性地检测到VP-60。
图8:使用VP60特异性mAB 1G8对VP60表达的免疫荧光分析(绿色着染的小点,由箭头指示)。小图A和小图B代表用重组D1701-V-vp60n感染24小时的细胞,小图C显示未感染的细胞作为对照。灰色着染(明亮着染,由箭头指示)表示细胞β-肌动蛋白,细胞核由DAPI染成蓝色(圆形模糊着染,由箭头指示)。
图9:研究D1701-V-vp60n免疫原性的兔实验。对于每个动物组,显示由RHDV-抗体-ELISA试验测试的血清结果。每周在所示的日取得血清。白色箭头标注引发免疫、第一次加强免疫和第二次加强免疫的时间点,红色箭头指示用强毒RHDV攻毒感染的时间。通过OD(492nm)测定法测量抗体浓度。从表1中公开的数据在每个组4只动物范围内计算平均值。
图10:研究治疗剂量的动物实验。用D1701-V-vp60n免疫后的血清抗体反应(RHDV-ELISA)。将兔如所述肌内施加的方式用ORFV-重组体处理1次、2次或3次(V1、V2、V3)。全部动物随后终末免疫后3周后受到攻毒感染。
图11:用不同的病毒制备物处理后小鼠血清中的细胞因子反应。11-12周龄Balb/C小鼠用每只动物5×106PFU以腹内施加的方式处理。用作阴性对照的动物用PBS溶液处理。从处理后的动物中制备血清并且通过多重ELISA确定细胞因子和趋化因子表达。显示引发免疫后12小时的结果。
图12:腹内施加后在所示的小时下的Balb/C小鼠血清中存在的细胞因子和趋化因子。注释:+=超过PBS增加直至3倍,++=超过PBS增加多于3倍,+++=超过PBS增加多于6倍,缩写:IFN:干扰素,IL:白介素,MCP:单核细胞趋化蛋白,MPI:巨噬细胞炎性蛋白,MIG:干扰素-γ诱导单核细胞因子,G-CSF:粒细胞集落刺激因子,KC:角质形成细胞趋化剂。
实施例
实施例1:VP60 DNA序列
为了产生表达RHDV(兔出血热病毒)VP60蛋白的重组ORF病毒,完整VP60基因(SEQ ID.NO.1)由“Mr.Gene”公司(雷根斯堡,德国)合成。为了确保重组VP60的正确表达,将基因的DNA序列优化以除去早期痘病毒转录终止基序。在载体pMK-RQ中提供VP60基因,如图1中显示。通过Hind III-EcoRI限制酶切消化从pMK-RQ质粒分离VP60基因并且随后将其连接至转移质粒pDV-Rec1中。所得的质粒命名为pdV-VP60n。通过DNA测序证实VP60片段的正确插入。对于VP60DNA序列的描述,见图1和图2。
实施例2:重组病毒选择策略
Vero细胞用表达β-半乳糖苷酶(LacZ-基因阳性)的ORFV株D1701-VrV感染并且随后借助核转染法用pdV-VP60n质粒转染。在成功的DNA重组后,用RHDV的VP60基因交换β-半乳糖苷酶基因以产生可以与蓝色亲本D1701-VrV株区分的白色重组病毒蚀斑。
可以因此在根据颜色选择后使用蚀斑-PCR鉴定VP60基因阳性蚀斑(图3,vp60)。在蚀斑已经纯化3次后,可以获得含有所需VP60基因的LacZ PCR阴性重组病毒(图3,LacZ)。选择由图3中方框标出的3个重组病毒(3.3.4、4.1.9、2.2.6)进一步测试。
实施例3:针对VP60表达的感染细胞的免疫染色
在增殖3个蚀斑分离株3.3.4、4.1.9和2.2.6后,实施感染细胞的免疫染色以检验VP60蛋白的表达。感染或未感染的细胞用VP60特异性兔抗血清染色(图4,ni代表未感染的细胞)。与未感染的细胞(ni)相比,全部3个分离株均显示可比较的明显和特异性病毒蚀斑染色。
实施例4:VP60基因整合至D1701-V基因组中
使用全部3个重组体,通过限制性酶消化和DNA印迹杂交(Southern blothybridisation)分析VP60基因向ORFV D1701-V基因组的正确插入。在图5中显示结果。VP60特异性内部探针用于杂交。在图5中显示VP60特异性片段的大小。在下半小图中提供VP60基因至ORFV基因组中的插入位点的示意图。
实验结果显示D1701-V-VP60的全部3蚀斑分离株中与LacZ基因交换后RHDV VP60基因正确插入。进一步对照杂交证实正确的基因插入。
实施例5:重组病毒中VP60转录的分析
在感染后的多个时间点(2至32小时)分离RNA。使用RNA印迹杂交和VP60特异性探针,检测到VP60特异性RNA(图6,1.7kb,上半小图)。VP60转录在感染早期阶段是可检测的。重组病毒的复制对于VP60基因表达不是重要的,如阿糖胞苷(AraC:抑制病毒DNA复制)或环己酰胺处理(CHX:仅立即早期基因表达)后获得的结果所展示。本实验结果表明,被重组病毒感染的细胞显示VP60mRNA的早期表达。
实施例6:重组病毒中VP60蛋白表达的分析
使用多种特异性抗体来通过蛋白质印迹分析(来自Dr.G.Meyers教授,FLI图宾根市的多克隆兔抗VP60抗血清C1,来自格但斯克大学教授B.Szewczyk的多克隆单特异性兔抗血清,来自Dr.H.Schirrmeier,FLI Riems的单克隆抗体mAb1G8)检验VP60(60kDa)的蛋白质表达。在不同时间点(感染后24和48小时)收获裂解物。除D1701-V感染的细胞之外,使用来自未感染细胞的裂解物作为阴性对照(ni)。细胞以MOI 1.0感染。
使用全部3种抗体,7图中所示的结果显示在正确分子量处的蛋白质条带(约60kDa),这清楚地表明VP60在感染后24和48小时均正确地翻译。
实施例7:免疫荧光分析
使用VP60蛋白特异性抗体的免疫荧光分析在重组病毒感染的细胞中展示球样的VP60表达(图8)。如可以在小图A和小图B中见到,VP60蛋白的亮点在感染细胞的细胞质中积累。
实施例8:研究ORFV重组体D1701-V-vp60n的免疫原性的动物实验
免疫实验用16只4月龄兔(chinchilla bastard)实施,并且这些兔源自Riems岛的弗里德里希-吕弗勒研究所(Friedrich-Loeffer-Institut(FLI),Island of Riems)的动物机构。实验设计是:使用4组动物,每组含有4只兔。
组1以引发免疫肌内(IM)处理,包括施用1×107pfu/剂量(1ml体积)的重组病毒。随后实施加强处理,第一次加强在接种后28日进行,第二次加强在接种后42日进行。
组2以引发免疫肌内(IM)处理,包括施用1×106pfu/剂量(1ml体积)的重组病毒,不过其他与组1的处理完全相同地实施。
组3以使用对照物质1ID RicaVacc的引发免疫处理。不施加加强处理。
组4是对照组,不施加处理。
连续血清样品在免疫之前以及在接种后7、14、21、28、35、42、49和57日获得。
用强毒RHDV实施攻毒感染以检验施用的重组病毒的免疫原性。使用1ml强毒RHDV“Eisenhuttenstadt”株(1045LD50/ml)在接种后57日肌内接种(IM)兔。
使用以下测量实施诊断性研究:
1.使用RHDV-抗体-ELISA试验检验血清。
2.攻毒后进行动物的临床检验和病理形态学检验。
血清学结果:在接种后57日范围内以每周间隔提取血清直至攻毒。使用RHDV-抗体-ELISA试验根据标准操作方案测量针对VP60抗原的抗体的水平(图9)。RicaVacc接种的全部动物在接种后第14日均显示血清转换(组3)。组2和组3的兔(ORF-RHDV重组体)在第一次加强后显示抗体水平轻微增加,另外在第二次加强后显示明显的血清转换(第三次免疫)(表2和图8)。
表2:使用RHDV-抗体-ELISA试验的血清学检验结果
攻毒结果:组4的4只动物(对照)在强毒RHDV感染后48小时内死亡。组1、组2和组3的全部动物幸免于攻毒感染。组1、组2和组3的免疫动物均没有展示RHDV感染的任何临床症状。对组4的罹难动物的病理形态学分析揭示了与RHDV感染相关的症状(出血性败血症和肝损伤)。
这些结果表明,本发明的重组病毒能够刺激抗VP60抗体的产生,并且更重要地,能够介导免遭致命性RHDV感染的保护作用。
还表明,动物可以在不存在可检测抗VP60血清抗体的情况下通过用D1701-V-VP60n接种受到保护。
实施例9:研究治疗剂量的动物实验
第二组动物实验设计成检验D1701-V-vp60n的免疫次数和接种剂量,这是在兔中针对攻毒感染提供有效保护而必需的。将兔(n=4)用107、106或105PFU的ORFV-重组体免疫1次、2次或3次,之后用强毒RHDV攻毒感染(图10)。
结果表明,D1701-V-vp60n免疫的全部动物均受到彻底保护免遭RHDV感染。还显示,实际上用ORFV重组体加强免疫需要血清中存在特异性抗体的明确证据(图10)。
本文所述的动物实验提供以下证据:用所测试的ORF重组体D1701-V-VP60n最低剂量(105PFU)单次肌内免疫提供了针对强毒RHDV攻毒感染的有效保护。保护作用是与采用市售RHD的免疫可比较的,所述RHD从灭活后的RHDV感染的肝脏材料获得。这些实施例因此显示要求保护的表达重组VP60的重组病毒的保护作用。
实施例10:D1701的免疫刺激作用
为了检验病毒制备物的免疫调节性能,11-12周龄Balb/C小鼠用每只动物5×106PFU以腹内免疫方式处理。用作阴性对照的动物用PBS溶液处理。
分离来自处理动物的6、12或24小时血液后,提取血清并且使用ELISA试剂盒检验细胞因子和趋化因子表达。另外,分离每只测试动物的脾用于淋巴细胞增殖试验中测试NK(天然杀伤)细胞的活化。
使用多重ELISA系统(BioRad,德国)测量34种细胞因子和趋化因子。在图11和图12中汇总这项分析的结果。
结果显示,免疫后12小时,所测量细胞因子的最大表达出现并且在24小时后下降。组A、组B和组C代表D1701病毒不同制备物,而组D代表来自现有技术的疫苗。组C包括两种不同病毒制备物的混合物。
如图12中所示,用A、C和D免疫引起由细胞因子IL-1a、IL-1b、IL-6和G-CSF表达定义的炎性免疫应答。还观察到1型干扰素表达、尤其干扰素-α的表达增强。这些结果显示由所施加的ORFV制备物介导的免疫刺激作用。
还测试了从脾分离的NK-细胞的活性。使用铬释放测定法和通过测量脾细胞的细胞增殖,测试NK细胞。铬释放测定法显示,施加病毒制备物后12小时,可以观察到组C和组D的NK细胞的溶细胞能力明显增加。在免疫后24小时,溶细胞活性进一步增加。
为了测试脾细胞增殖,采用了使用BrdU-ELISA检验的细胞增殖试验。在刺激细胞增殖之前,将脾细胞在37°C和5%CO2培养3日。在免疫后6小时,细胞增殖不存在明显增加。然而,在12小时后,组A和组C显示明显增加的增殖水平。
这些免疫刺激试验一起表明,在免疫后的12至24小时之间观察到处理后的动物的先天免疫的活性。这些结果进一步表明,本发明的痘病毒载体被用作疫苗时提供辅助的效果。
Claims (18)
1.重组副痘病毒,包含来自兔出血热病毒(RHDV)的VP60主要衣壳蛋白。
2.根据前述权利要求所述的副痘病毒,其特征在于,来自兔出血热病毒(RHDV)的VP60主要衣壳蛋白由外来核酸序列表达。
3.根据权利要求1所述的副痘病毒,其特征在于,副痘病毒是羊口疮病毒(ORFV),优选是ORFV株D1701,更优选是D1701-V-VP60n。
4.根据前述权利要求中至少一项所述的副痘病毒,其特征在于,外来核酸序列是整合至副痘病毒基因组中的DNA序列。
5.根据前述权利要求中至少一项所述的副痘病毒,其特征在于,VP60主要衣壳蛋白由包含根据SEQ ID No.1或SEQ ID No.2的序列的DNA序列编码。
6.根据前述权利要求中至少一项所述的副痘病毒,其特征在于,VP60主要衣壳蛋白包含根据SEQ ID No.3的氨基酸序列。
7.根据前述权利要求中至少一项所述的副痘病毒,用作药物。
8.根据前述权利要求中至少一项所述的副痘病毒,用作治疗性和/或预防性治疗受试者中RHDV感染的疫苗。
9.一种药物组合物,包含根据前述权利要求中至少一项所述的副痘病毒、根据SEQ ID No.1或SEQ ID No.2编码VP60蛋白的核酸分子和/或包含根据SEQ ID No.3的序列的VP60蛋白、以及可药用载体。
10.权利要求1至8中至少一项所述的副痘病毒,作为治疗性和/或预防性治疗受试者中RHDV感染的疫苗的用途。
11.一种疫苗,包含权利要求1至8中至少一项所述的副痘病毒,所述副痘病毒优选地是活的。
12.根据前述权利要求所述的疫苗,其特征在于,存在用于增强疫苗功能的添加剂,如佐剂或免疫刺激剂。
13.根据权利要求11或12中任一项所述的疫苗,其特征在于,所述疫苗是联合疫苗,包含用于额外疾病的疫苗制剂。
14.治疗性和/或预防性治疗兔中RHDV感染的方法,其特征在于,将治疗有效量的权利要求1至8中至少一项所述的副痘病毒、权利要求9所述的药物组合物或权利要求11至13所述的疫苗施用至受试者。
15.核酸分子,其编码兔出血热病毒(RHDV)蛋白VP60,包含根据SEQ IDNo.1或SEQ ID No.2的序列。
16.根据前述权利要求所述的核酸分子,用于产生权利要求1至8中任一项所述的重组副痘病毒。
17.兔出血热病毒(RHDV)的VP60主要衣壳蛋白,其包含根据SEQ ID No.3的序列。
18.权利要求15或16所述的核酸分子和/或权利要求17所述的VP60主要衣壳蛋白在制造用于治疗性和/或预防性治疗兔中RHDV感染的药物、优选疫苗中的用途。
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