JPH02291271A - 発現伝播体を有する組成物 - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/30—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Mycoplasmatales, e.g. Pleuropneumonia-like organisms [PPLO]
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利川分野〕
この発明は、発現伝播体を有する組成物、例えば、肺炎
病原体の抗原等に関し、特に肺炎マイコプラズマ用のＭ
１換え形抗原に関する。さらに詳しくは、この発明は、
マイコブラズマ性肺炎、特に豚のマイコブラズマ性肺炎
を予防するためのワクチンに関する。
病原体の抗原等に関し、特に肺炎マイコプラズマ用のＭ
１換え形抗原に関する。さらに詳しくは、この発明は、
マイコブラズマ性肺炎、特に豚のマイコブラズマ性肺炎
を予防するためのワクチンに関する。
肺炎マイコブラズマに起因する疾病は，世界中に発生し
ており，特にそれが豚の体内に発生する場合は、豚の頭
数の損失と深く係り合うことになる。一旦この病気にか
かった動物は、能力低下、発育不良および病体となって
しまうのみならず、日和見微生物による二次感染を受け
る傾向が少なくない。
ており，特にそれが豚の体内に発生する場合は、豚の頭
数の損失と深く係り合うことになる。一旦この病気にか
かった動物は、能力低下、発育不良および病体となって
しまうのみならず、日和見微生物による二次感染を受け
る傾向が少なくない。
豚のマイコブラズマ性肺炎を予防するためのワクチンを
開発する試みは、数多く行われて来たわが、こわらのワ
クチンは何れも不成功に終っている状況である。
開発する試みは、数多く行われて来たわが、こわらのワ
クチンは何れも不成功に終っている状況である。
例えば、米国獣医額研究集報（Ａｍ．Ｊ．ＶｅｌＲｅｓ
．）第４２号（１９８１）の第７８４頁に掲載されたと
おり、クリステンセンおよびその共同者は、肺炎マイク
ロプラズマの細胞を熱によって非活性化し、これを豚に
冫−Ｙ射したが、マイコフ゛ラズマ性肺炎に対ずる予防
効果がなかったことを認めている。
．）第４２号（１９８１）の第７８４頁に掲載されたと
おり、クリステンセンおよびその共同者は、肺炎マイク
ロプラズマの細胞を熱によって非活性化し、これを豚に
冫−Ｙ射したが、マイコフ゛ラズマ性肺炎に対ずる予防
効果がなかったことを認めている。
またエセリッシ（ＥＬｈｅｒｉｄｇｅ）およびその共同
者による、獣医学研究９１ （Ｒｃｓ．Ｖｅｔ．Ｓｃｉ
．）第３３湯（１９８２）の第１種８頁の記載によれば
、生ワクチンか静脈内，皮ｒ、あるいは腹腔内に注入さ
わた場合に、ＪｋＦ炎病原マイコブラズマによる定着を
完全に防止することは不可能であることが認められてい
る。
者による、獣医学研究９１ （Ｒｃｓ．Ｖｅｔ．Ｓｃｉ
．）第３３湯（１９８２）の第１種８頁の記載によれば
、生ワクチンか静脈内，皮ｒ、あるいは腹腔内に注入さ
わた場合に、ＪｋＦ炎病原マイコブラズマによる定着を
完全に防止することは不可能であることが認められてい
る。
さらにロス（Ｒｏｓｓ）およびその共同者は、米国獣医
学研究集報（Ａｆｆｌ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．）第４５
号（１９８４）の第１種９９頁において、凍結法によっ
て調製された肺炎マイコプラズマのυＦ出物は、その予
防作用が必ずしも一定しておらず、時によると、むしろ
病巣を拡大させることがあると述べている。さらに、ロ
ス氏等の説明等によると、そのようなワクチンを畜豚に
注射した場合、菌株■ＰＰ−１１を含有する病患の１１
５臓の１０％懸濁液から採取した上澄液の４ｍｌＩｌｆ
ｌと、同一の菌株の１５乃至２０分割を２４時間培養し
たのもの１ｍｌ２とを組合せて成る気管内抗原投与に対
しては、或る程度の予防効果を与えたと説明されている
。
学研究集報（Ａｆｆｌ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．）第４５
号（１９８４）の第１種９９頁において、凍結法によっ
て調製された肺炎マイコプラズマのυＦ出物は、その予
防作用が必ずしも一定しておらず、時によると、むしろ
病巣を拡大させることがあると述べている。さらに、ロ
ス氏等の説明等によると、そのようなワクチンを畜豚に
注射した場合、菌株■ＰＰ−１１を含有する病患の１１
５臓の１０％懸濁液から採取した上澄液の４ｍｌＩｌｆ
ｌと、同一の菌株の１５乃至２０分割を２４時間培養し
たのもの１ｍｌ２とを組合せて成る気管内抗原投与に対
しては、或る程度の予防効果を与えたと説明されている
。
前記のとおり、従来の肺炎病原体ワクチンでは、なお多
くの欠点が，あったので、この発明は、これらの欠点を
除去して、免疫性の高い接種を行うための抗原を含む組
成物を得ることを目的とする。
くの欠点が，あったので、この発明は、これらの欠点を
除去して、免疫性の高い接種を行うための抗原を含む組
成物を得ることを目的とする。
この発明の１つの特徴としては、少なくとも！種の肺炎
マイコブラズマ抗原のエピトープを認識する抗体を誘発
する機能を有する少なくとも１種のタンパク質に暗号付
与するＤＮＡ （デオキシリボ核酸》配列を含むところ
の、組換え形ＤＮＡ分子、あるいは発現伝播体またはク
ロー・ン化、伝播体くベクターまたはブラスミド）を提
供する。
マイコブラズマ抗原のエピトープを認識する抗体を誘発
する機能を有する少なくとも１種のタンパク質に暗号付
与するＤＮＡ （デオキシリボ核酸》配列を含むところ
の、組換え形ＤＮＡ分子、あるいは発現伝播体またはク
ロー・ン化、伝播体くベクターまたはブラスミド）を提
供する。
また、この発明は、少なくとも１種のタンパク買を発現
する機能を有するような発現伝播体によって形質転換さ
れるところの宿主を提供する。
する機能を有するような発現伝播体によって形質転換さ
れるところの宿主を提供する。
さらに、Ｈ記宿主によフて発現ざれる少なくともＩ Ｍ
Ｋのタンパク質を含有するワクチンを提供する。
Ｋのタンパク質を含有するワクチンを提供する。
要するに、前記のＤＮＡ配列は、少なくとも１種の肺炎
マイコプラズムマ抗原の工どトープを認識する１種の抗
体を銹発する機能を有するところの、少なくとも１種の
タンパク質に対して遺伝暗号化するものである。好まし
くは、この肺炎マイコプラズマ抗原は、次気の肺炎マイ
コプラズマ抗原、ｕＵチ、７４，５、３６、４１、９６
、７４．５の突然変異体、但し７４．５のｒ１１６突然
変異体には限定されない、および、前記抗原を暗号化す
るＤＮＡ配列の少なくとも１つのフトンが突然変異化さ
ねたところの７４．５突然変異体、および分子［４１”
キロダルトン（以下ｋＤａとする）の肺炎マイコンプラ
ズマ病原体抗原である。
マイコプラズムマ抗原の工どトープを認識する１種の抗
体を銹発する機能を有するところの、少なくとも１種の
タンパク質に対して遺伝暗号化するものである。好まし
くは、この肺炎マイコプラズマ抗原は、次気の肺炎マイ
コプラズマ抗原、ｕＵチ、７４，５、３６、４１、９６
、７４．５の突然変異体、但し７４．５のｒ１１６突然
変異体には限定されない、および、前記抗原を暗号化す
るＤＮＡ配列の少なくとも１つのフトンが突然変異化さ
ねたところの７４．５突然変異体、および分子［４１”
キロダルトン（以下ｋＤａとする）の肺炎マイコンプラ
ズマ病原体抗原である。
このＤＮＡ配列から生成さわるタンパク質が、肺炎病原
体抗原のエピトープを認識する１つの抗体を誘発する機
能を有すると仮定すれば、このＤＮＡ配列は、全体とし
て単一の抗原であるタンパク質に対して暗号付与ができ
るのみらなす、その抗原の断片または誘導体のタンパク
質、あるいは抗原または断片と、他のタンパク質との融
合生成物であっても、それに対して遺伝暗号付与ができ
るのである。従って例えば、分子量７４．５ｋＤａ （
キロダルトン）の抗原の段片が７４．５ｋＤａの抗原の
エピトープ（抗原の構造を決定する決定基、１個または
複数個）を認識する抗体を誘発する機能を有するらなば
、前記ＤＮＡ配列は、この７４．５ｋＤａの抗原の断片
てある１種のタンパク質（即ち、４３ｋＤａ （キロ・
ダルトン）の分子量を有し、かつ７４．５ｋＤａの抗原
ベブチド配列の部分を有するタンパク質）に対して遺伝
暗号付与ができるのである。
体抗原のエピトープを認識する１つの抗体を誘発する機
能を有すると仮定すれば、このＤＮＡ配列は、全体とし
て単一の抗原であるタンパク質に対して暗号付与ができ
るのみらなす、その抗原の断片または誘導体のタンパク
質、あるいは抗原または断片と、他のタンパク質との融
合生成物であっても、それに対して遺伝暗号付与ができ
るのである。従って例えば、分子量７４．５ｋＤａ （
キロダルトン）の抗原の段片が７４．５ｋＤａの抗原の
エピトープ（抗原の構造を決定する決定基、１個または
複数個）を認識する抗体を誘発する機能を有するらなば
、前記ＤＮＡ配列は、この７４．５ｋＤａの抗原の断片
てある１種のタンパク質（即ち、４３ｋＤａ （キロ・
ダルトン）の分子量を有し、かつ７４．５ｋＤａの抗原
ベブチド配列の部分を有するタンパク質）に対して遺伝
暗号付与ができるのである。
同様に、抗原の誘導体が、例えば、ベブチド鎖内の１個
または２個以上のアミノ酸の突然変異体であって、その
誘導体が、上記の肺炎病原体の抗原のエピトープを認識
する抗体を誘発させる機能を有する限りにおいては、そ
のような誘導体であるタンパク質に対して、上記のＤＮ
Ａ配列が暗号付与を行うことができるのである。
または２個以上のアミノ酸の突然変異体であって、その
誘導体が、上記の肺炎病原体の抗原のエピトープを認識
する抗体を誘発させる機能を有する限りにおいては、そ
のような誘導体であるタンパク質に対して、上記のＤＮ
Ａ配列が暗号付与を行うことができるのである。
つぎに、（ｉ）前記の肺炎病原体抗原のエピトープを認
識する抗体を話発させる機能を有する１種のタンパク質
と、（ｉ ｉ）それ以外の１種のタンパク質との融合生
成物のタンパク質に対しても、前記ＤＮＡ配列が暗号付
与を行うことができる。
識する抗体を話発させる機能を有する１種のタンパク質
と、（ｉ ｉ）それ以外の１種のタンパク質との融合生
成物のタンパク質に対しても、前記ＤＮＡ配列が暗号付
与を行うことができる。
要するに、「特に肺炎病原体用と指定された抗原のエピ
トーブを認識するところの抗体を誘発させる機能を存す
るところの、１種のタンパク質に対する遺伝暗号を作成
するＤＮＡの配列」という用語の意味は、ＤＮＡの種々
の配列が、形質転換された細胞内において、種々のタン
パク質に対する遺伝暗号を付与し、要すれば発現するこ
とを意味し、そのタンパク買は適切な抗原であることは
勿論、その断片または誘導体であってもよく、あるいは
、この抗原とその断片または話導体と、その他のタンパ
ク質との融合生成物であってもよいということである。
トーブを認識するところの抗体を誘発させる機能を存す
るところの、１種のタンパク質に対する遺伝暗号を作成
するＤＮＡの配列」という用語の意味は、ＤＮＡの種々
の配列が、形質転換された細胞内において、種々のタン
パク質に対する遺伝暗号を付与し、要すれば発現するこ
とを意味し、そのタンパク買は適切な抗原であることは
勿論、その断片または誘導体であってもよく、あるいは
、この抗原とその断片または話導体と、その他のタンパ
ク質との融合生成物であってもよいということである。
また、１つの細胞内にベクターか導入された場合、その
ベクター内に存在するＤＮＡ配列は、その配列によって
暗号化されているタンパク質の一部分のみを発現するこ
とができるものであるが、そのようなＤＮＡ配列もまた
、発現されたタンパク質の一部が、肺炎病原体抗原の１
種または２柿以上の抗原のエピトープを認識する抗体を
誘発することかできるならば、そのＤＮＡ配列も前記の
用語の範囲に含まれるものとする。
ベクター内に存在するＤＮＡ配列は、その配列によって
暗号化されているタンパク質の一部分のみを発現するこ
とができるものであるが、そのようなＤＮＡ配列もまた
、発現されたタンパク質の一部が、肺炎病原体抗原の１
種または２柿以上の抗原のエピトープを認識する抗体を
誘発することかできるならば、そのＤＮＡ配列も前記の
用語の範囲に含まれるものとする。
例えば、このＤＮＡ配列は、すべての抗原に対して暗号
を付与することができるが、発現さわるタンパク質は、
その抗原の断片である。また、クローン化された伝播体
が、２種以上の肺炎病原体抗原または断片に対して暗号
化するＤＮＡを含み１１ナることも理解できる。
を付与することができるが、発現さわるタンパク質は、
その抗原の断片である。また、クローン化された伝播体
が、２種以上の肺炎病原体抗原または断片に対して暗号
化するＤＮＡを含み１１ナることも理解できる。
適切なＤＮＡ配列であれば、広く種々のヘクターあるい
はブラスミドの何れにも含まれることかできる。このよ
うなベクターは、染色体および非染色体の、および合成
のＤＮＡ配列を含み、例えば、ＳＶ４０の誘導体、，ｉ
ｌｌ菌プラスミド、ファージＤＮＡ、酵ＩＪ菌ブラスミ
ド、あるいは、ブラスミトと、ファーシＤＮＡ、ウィル
スのＤＮＡ （例えば牛痘、アデノウィルス、家禽痘、
ウィルス、偽似狂大病なと）との組合せから求めらわだ
ヘクター、などである。
はブラスミドの何れにも含まれることかできる。このよ
うなベクターは、染色体および非染色体の、および合成
のＤＮＡ配列を含み、例えば、ＳＶ４０の誘導体、，ｉ
ｌｌ菌プラスミド、ファージＤＮＡ、酵ＩＪ菌ブラスミ
ド、あるいは、ブラスミトと、ファーシＤＮＡ、ウィル
スのＤＮＡ （例えば牛痘、アデノウィルス、家禽痘、
ウィルス、偽似狂大病なと）との組合せから求めらわだ
ヘクター、などである。
この適切なＤＮＡ配列は、種々の方法でヘクター中に挿
入することかできる。一般に、このＤＮＡ配列は、従来
周知の方法により、適切な制限酵素の位置に挿入さわる
。これらの手法はいすねも、周知の範囲の技術と兄なさ
わる。
入することかできる。一般に、このＤＮＡ配列は、従来
周知の方法により、適切な制限酵素の位置に挿入さわる
。これらの手法はいすねも、周知の範囲の技術と兄なさ
わる。
ベクター内におけるＤＮＡ配列は、或る適切な発現制御
配列（ブロモータ）と有効に連けいされて、メッセンジ
ャーＲＮＡ合成を支配する。かかるブロ千一夕の代表的
な例としては、次の各々を挙げることができる。即ち、
ＬＴＲまたはＳｖ４０ブロモータ、大腸閑（Ｅ．ｃｏｆ
ｆｉ）のＪｌａｃ （ラクトース）ブロモータ、ｔｒｐ
（｝リブトファン），ファージラムダＰＬブロモータ、
および、原核ｉ胞および真核細胞またはそれらのウィル
ス内の遺伝子の発現を制御するために知らわている他の
プロモータである。発現ベクターは、翻訳開始と転写終
了のためのリボンーム結合位置をも含む。さらにベクタ
ーは、発現を増幅するための適切な配列を含むこともで
きる。
配列（ブロモータ）と有効に連けいされて、メッセンジ
ャーＲＮＡ合成を支配する。かかるブロ千一夕の代表的
な例としては、次の各々を挙げることができる。即ち、
ＬＴＲまたはＳｖ４０ブロモータ、大腸閑（Ｅ．ｃｏｆ
ｆｉ）のＪｌａｃ （ラクトース）ブロモータ、ｔｒｐ
（｝リブトファン），ファージラムダＰＬブロモータ、
および、原核ｉ胞および真核細胞またはそれらのウィル
ス内の遺伝子の発現を制御するために知らわている他の
プロモータである。発現ベクターは、翻訳開始と転写終
了のためのリボンーム結合位置をも含む。さらにベクタ
ーは、発現を増幅するための適切な配列を含むこともで
きる。
さらに、好ましくは発現ベクターは、真核細鞄培養用の
ジヒドロ葉酸塩還元酵素またはネオマイシン耐性の如き
、あるいは、大腸菌内のテトラサイクリンまたはアンビ
シリン耐性の如き、形質転換された宿主細胞を選択する
ための表現形質を与える遺伝子を含むことが望ましい。
ジヒドロ葉酸塩還元酵素またはネオマイシン耐性の如き
、あるいは、大腸菌内のテトラサイクリンまたはアンビ
シリン耐性の如き、形質転換された宿主細胞を選択する
ための表現形質を与える遺伝子を含むことが望ましい。
前述のとおり適切なＤＮＡ配列ならびに適切なブロモー
タあるいは制御配列を含むベクターを使用すれば、或る
適切な宿主の形質を転換させ、その宿主がタンパク質を
発現するようにさせることができる．Ａ切な宿主の代表
的な実施を列挙すれば、大腸菌、ねずみチフス菌等の細
菌細胞、酵母菌等のカビ細ｊｒｉ＆ ； Ｃ Ｈ Ｏま
たはバウス（ＢｏｗｅＳ）のＨ，ｌ−色腫等の動物細胞
：および植物細胞、その他である。適切な宿主の選択は
、この分野に鯖通ずる者にとっては容易になし得ること
てある。
タあるいは制御配列を含むベクターを使用すれば、或る
適切な宿主の形質を転換させ、その宿主がタンパク質を
発現するようにさせることができる．Ａ切な宿主の代表
的な実施を列挙すれば、大腸菌、ねずみチフス菌等の細
菌細胞、酵母菌等のカビ細ｊｒｉ＆ ； Ｃ Ｈ Ｏま
たはバウス（ＢｏｗｅＳ）のＨ，ｌ−色腫等の動物細胞
：および植物細胞、その他である。適切な宿主の選択は
、この分野に鯖通ずる者にとっては容易になし得ること
てある。
而述のとおり、選択さわた部位に挿入された適切なＤＮ
Ａ配列を含む発現伝播体は、今問題の肺炎病原体抗原の
エピトープを認識する抗体を話発し得るタンパク質に対
して暗号付けをする遺伝子の一部ではないところの、Ｄ
ＮＡ配列または遺伝子配列を含むものでもよい。例えば
、所望のＤＮＡ配列は、発現の助長、純粋化の改ぷ、あ
るいは適切なタンパク質の発現を可能にしたり、免疫原
性を改善するようなＤＮＡ配列に対して、同一の解読枠
内において、融合させたものでもよい。
Ａ配列を含む発現伝播体は、今問題の肺炎病原体抗原の
エピトープを認識する抗体を話発し得るタンパク質に対
して暗号付けをする遺伝子の一部ではないところの、Ｄ
ＮＡ配列または遺伝子配列を含むものでもよい。例えば
、所望のＤＮＡ配列は、発現の助長、純粋化の改ぷ、あ
るいは適切なタンパク質の発現を可能にしたり、免疫原
性を改善するようなＤＮＡ配列に対して、同一の解読枠
内において、融合させたものでもよい。
つぎに、ワクチンを開発しようとする場合、中和化抗体
または感染防御抗体を、天然抗原の不連続で立体構造依
存性のエピトープに向って狙いを定めることもできよう
。それゆえ、組換え形発現系から得られたタンパク質は
、自然環境においての、もとのタンパク質分子の３次元
構造（立体構造）とは可成り異なりだ立体構造を有する
可能性かあることを考慮に入れておかねばならない。か
くして遊離されたタンパク質の原免疫性に依存して再生
させて、適切な分子的立体構造を回復させることが必要
となり得る。タンパク質の再生の方法は、科学文献中に
多数見出されるが、その方法は１）アルカリ、カオトロ
パー、有機溶媒、およびイオン式界面活性剤等の試薬を
使用して、不正規にからみ合ったタンパク質を変性（ほ
どく）シたのち、希釈、透析、またはｐＨ調整によって
再生して、変性を除去し、２）タンパク質を脂質２重層
即ちリポソームに再構成し、原免疫性タンパク質の環境
のような膜を再構成するのである。
または感染防御抗体を、天然抗原の不連続で立体構造依
存性のエピトープに向って狙いを定めることもできよう
。それゆえ、組換え形発現系から得られたタンパク質は
、自然環境においての、もとのタンパク質分子の３次元
構造（立体構造）とは可成り異なりだ立体構造を有する
可能性かあることを考慮に入れておかねばならない。か
くして遊離されたタンパク質の原免疫性に依存して再生
させて、適切な分子的立体構造を回復させることが必要
となり得る。タンパク質の再生の方法は、科学文献中に
多数見出されるが、その方法は１）アルカリ、カオトロ
パー、有機溶媒、およびイオン式界面活性剤等の試薬を
使用して、不正規にからみ合ったタンパク質を変性（ほ
どく）シたのち、希釈、透析、またはｐＨ調整によって
再生して、変性を除去し、２）タンパク質を脂質２重層
即ちリポソームに再構成し、原免疫性タンパク質の環境
のような膜を再構成するのである。
訂述のとおり、或る場合には、クローン化伝播体に含ま
れるＤＮＡ配列が、或る特定の抗原に対して暗号づけを
するとはいえ、発現されたタンパク質は、その抗原の断
片のみであるかも知れない。例えば、宿主成分として大
腸菌を使用した場合、コドンＴＧＡは、大腸菌にとクて
は終止コドンであるから、クローン化伝播体内のＤＮＡ
配列が、アミノ酸トリプトファンに対するコドン、即ち
ＴＧＡを含むならば、大腸菌はこのコドンを終止コドン
と解釈するので、必ずしもすべての抗原が発現されると
は限らないわけである。
れるＤＮＡ配列が、或る特定の抗原に対して暗号づけを
するとはいえ、発現されたタンパク質は、その抗原の断
片のみであるかも知れない。例えば、宿主成分として大
腸菌を使用した場合、コドンＴＧＡは、大腸菌にとクて
は終止コドンであるから、クローン化伝播体内のＤＮＡ
配列が、アミノ酸トリプトファンに対するコドン、即ち
ＴＧＡを含むならば、大腸菌はこのコドンを終止コドン
と解釈するので、必ずしもすべての抗原が発現されると
は限らないわけである。
この発明は、２練のＤＮＡ配列から成る発現伝播体を提
供するものであり、その一方（ａ）１種のマイコブラズ
マタンパク買に対する少くとも１種のＤＮＡ配列で、発
現伝播体によって形質転換されるべき宿主によって、終
止コドンと認識されるようなタンパク質の１つのアミノ
酸に対する少くとも１つのコドンを有するものであり、
他方はくｂ）１種の転換ＲＮＡ （ｔ−ＲＮＡ）を暗号
づけして、そのｔ−ＲＮＡが、形質転換せらるべき宿主
生物内の終止コドンに１種のアミノ酸を結合させ、その
アミノ酸を活性マイコブラズマタンパク質内に挿入する
ようにさせるＤＮＡ配列である。これによって、タンパ
ク質合成が早目に終了することが防止される。
供するものであり、その一方（ａ）１種のマイコブラズ
マタンパク買に対する少くとも１種のＤＮＡ配列で、発
現伝播体によって形質転換されるべき宿主によって、終
止コドンと認識されるようなタンパク質の１つのアミノ
酸に対する少くとも１つのコドンを有するものであり、
他方はくｂ）１種の転換ＲＮＡ （ｔ−ＲＮＡ）を暗号
づけして、そのｔ−ＲＮＡが、形質転換せらるべき宿主
生物内の終止コドンに１種のアミノ酸を結合させ、その
アミノ酸を活性マイコブラズマタンパク質内に挿入する
ようにさせるＤＮＡ配列である。これによって、タンパ
ク質合成が早目に終了することが防止される。
このｔ−ＲＮＡは、１つの発現伝播体内に含まれている
ＤＮＡ配列を有し、このｔ−ＲＮＡは、問題のコドンに
よって暗号づけされた同じアミノ酸をマイコブラズマ中
に挿入するところのｔ−ＲＮＡであっても、または、他
の異なる１種のアミノ酸を挿入するｔ−ＲＮＡであって
もよい。
ＤＮＡ配列を有し、このｔ−ＲＮＡは、問題のコドンに
よって暗号づけされた同じアミノ酸をマイコブラズマ中
に挿入するところのｔ−ＲＮＡであっても、または、他
の異なる１種のアミノ酸を挿入するｔ−ＲＮＡであって
もよい。
かくして例えば、追加のＤＮＡ配列が、１つのｔ−ＲＮ
Ａトリプトファンを暗号づけしてもよい。このｔ−ＲＮ
Ａは、形質転換された宿主内の終止コドンに対して結合
させ、アミノ酸トリプトファンを、合成されつつあるマ
イクロプラズマタンパク質内に挿入するものである。
Ａトリプトファンを暗号づけしてもよい。このｔ−ＲＮ
Ａは、形質転換された宿主内の終止コドンに対して結合
させ、アミノ酸トリプトファンを、合成されつつあるマ
イクロプラズマタンパク質内に挿入するものである。
あるいは、この追加のＤＮＡ配列が１つのｔ一ＲＮＡを
暗号づけし、このｔ−ＲＮＡが形質転換された宿主内の
終止コドンに対して結合させ、発現されたタンパク質内
のアミノ酸トリプトファンの代りに、異なるアミノ酸、
例えばチロシン、フェニルアラニン、またはイソロイシ
ンを採用してもよい。
暗号づけし、このｔ−ＲＮＡが形質転換された宿主内の
終止コドンに対して結合させ、発現されたタンパク質内
のアミノ酸トリプトファンの代りに、異なるアミノ酸、
例えばチロシン、フェニルアラニン、またはイソロイシ
ンを採用してもよい。
かくして例えば、発現伝播体中に追加のＤＮＡを使用す
ることは、ＴＧＡの終止コドンに結合するｔ−ＲＮＡト
リプトファンを宿主生物内で暗号づけするところの、例
えばトリプトファン（ｔｒｐ）１７６またはｔｒｐ１７
８等のｔｒｐ遺伝子を暗号付けするものであって、これ
によってトリプトファンを挿入し、それによって、コド
ンＴＧＡ （これはマイコブラズマ内のアミノ酸トリプ
トファンに対して暗号づけする）を含むところのマイコ
プラズマタンパク質の合成が早目に終了しないようにす
るものである。かつ、発現された組換え形マイコブラズ
マタンパク質は，上記のＴＧＡコドンによって暗号付け
されたトリプトファンを含むものである。
ることは、ＴＧＡの終止コドンに結合するｔ−ＲＮＡト
リプトファンを宿主生物内で暗号づけするところの、例
えばトリプトファン（ｔｒｐ）１７６またはｔｒｐ１７
８等のｔｒｐ遺伝子を暗号付けするものであって、これ
によってトリプトファンを挿入し、それによって、コド
ンＴＧＡ （これはマイコブラズマ内のアミノ酸トリプ
トファンに対して暗号づけする）を含むところのマイコ
プラズマタンパク質の合成が早目に終了しないようにす
るものである。かつ、発現された組換え形マイコブラズ
マタンパク質は，上記のＴＧＡコドンによって暗号付け
されたトリプトファンを含むものである。
上記の追加のＤＮＡが、トリプトファン以外の或るアミ
ノ酸に対するｔ−ＲＮＡの１つの変異体に対して暗号付
けするならば、つまり例えば、ＴＧＡコドンに対して結
合して、チロシン、イソロイシン、あるいはフエニルア
ラニンのいずれかを挿入させるところの、トリプトファ
ンｔ−ＲＮＡ遺伝子またはイソロイシンｔ−ＲＮＡ遺伝
子あるいはフェニルアラニンＴ遺伝子に対して暗号つけ
するならば、発現されたマイコブラズマタンバク質内で
、マイコブラズマ中で合成さわるタンパク質中に普通に
存在するトリプトファンの代りに、追加のＤＮＡによっ
て暗号づれさゎるｔ一ＲＮＡに相当する１つのアミノ酸
が採用されるわけである。
ノ酸に対するｔ−ＲＮＡの１つの変異体に対して暗号付
けするならば、つまり例えば、ＴＧＡコドンに対して結
合して、チロシン、イソロイシン、あるいはフエニルア
ラニンのいずれかを挿入させるところの、トリプトファ
ンｔ−ＲＮＡ遺伝子またはイソロイシンｔ−ＲＮＡ遺伝
子あるいはフェニルアラニンＴ遺伝子に対して暗号つけ
するならば、発現されたマイコブラズマタンバク質内で
、マイコブラズマ中で合成さわるタンパク質中に普通に
存在するトリプトファンの代りに、追加のＤＮＡによっ
て暗号づれさゎるｔ一ＲＮＡに相当する１つのアミノ酸
が採用されるわけである。
１つの実例としては、コドンＴＧＡを終止コドンとして
認識する生物（例えば大腸菌）を形質転換させるために
使用されるクローン化伝播体は、ＤＮＡ配列の一部とし
て１つのＴＧＡコドンを存する所望の肺炎病原体タンパ
ク質に対して暗号付けするところのＤＮＡ配列も含まれ
ること勿論である。なおその他に、宿主生体内でコドン
ＴＧＡに対して結合されて、形質転換される生体内で生
成される肺炎病原体のタンパク貿連鎖の内部へ、トリプ
トファンを挿入するところのｔ−ＲＮＡに対して暗ぢ付
けをするような、１つのＤＮＡ配列を追加して包含させ
ることができる。例えば、ｔｒｐＴｆ７６遺伝子に対し
て暗号付けする１つのＤＮＡ配列を１つのＴＧＡコドン
を有するＤＮＡ配列を有するクローン化伝播体中へ挿入
することもできる。このＤＮＡ配列は、所望の肺炎病原
体タンパク質に対して暗号付けし、大腸菌内でクローン
化伝播体を使用して、トリプトファンを含む所望のＩｊ
ｔｉ炎病原体タンパク質を発現させるものである。かく
して例えば後述の第３の実施例に示すとおり、分子１７
４．５ｋＤａの肺炎病原体抗原に対して暗号付けするＤ
ＮＡ配列と、ｔｒｐＴ１７６遺伝子を暗号付けするＤＮ
Ａ配列とを含有するクローン化伝播体によって、大腸菌
を形質転換すれば、７４．５ｋＤａのＩｊｌｉ炎病原体
抗原を、大腸菌内で発現させることができる。また第１
の実施例のように、７４．５ｋＤａの病原体抗原に対し
て暗号付けするＤＮＡ配列を含イＴするが、ｔｒｐＴ１
７６遺伝子に対して昭５３付けずるＤＮＡ配列は含有し
ないところのクローン化伝播体を使用して、大腸菌を形
質転換すると、７４．５ｋＤａの肺炎病原体抗原の断片
を発現させることになる。
認識する生物（例えば大腸菌）を形質転換させるために
使用されるクローン化伝播体は、ＤＮＡ配列の一部とし
て１つのＴＧＡコドンを存する所望の肺炎病原体タンパ
ク質に対して暗号付けするところのＤＮＡ配列も含まれ
ること勿論である。なおその他に、宿主生体内でコドン
ＴＧＡに対して結合されて、形質転換される生体内で生
成される肺炎病原体のタンパク貿連鎖の内部へ、トリプ
トファンを挿入するところのｔ−ＲＮＡに対して暗ぢ付
けをするような、１つのＤＮＡ配列を追加して包含させ
ることができる。例えば、ｔｒｐＴｆ７６遺伝子に対し
て暗号付けする１つのＤＮＡ配列を１つのＴＧＡコドン
を有するＤＮＡ配列を有するクローン化伝播体中へ挿入
することもできる。このＤＮＡ配列は、所望の肺炎病原
体タンパク質に対して暗号付けし、大腸菌内でクローン
化伝播体を使用して、トリプトファンを含む所望のＩｊ
ｔｉ炎病原体タンパク質を発現させるものである。かく
して例えば後述の第３の実施例に示すとおり、分子１７
４．５ｋＤａの肺炎病原体抗原に対して暗号付けするＤ
ＮＡ配列と、ｔｒｐＴ１７６遺伝子を暗号付けするＤＮ
Ａ配列とを含有するクローン化伝播体によって、大腸菌
を形質転換すれば、７４．５ｋＤａのＩｊｌｉ炎病原体
抗原を、大腸菌内で発現させることができる。また第１
の実施例のように、７４．５ｋＤａの病原体抗原に対し
て暗号付けするＤＮＡ配列を含イＴするが、ｔｒｐＴ１
７６遺伝子に対して昭５３付けずるＤＮＡ配列は含有し
ないところのクローン化伝播体を使用して、大腸菌を形
質転換すると、７４．５ｋＤａの肺炎病原体抗原の断片
を発現させることになる。
また、この発明によれば、１種のマイコプラズマタンパ
ク貿に対する少くとも１つのＤＮＡ配列を含む発現伝播
体を提供する。この少くとも１種のＤＮＡ配列は、発現
伝播体によって形質転換されるべき宿主生体によって、
終止コドンであると認識されるようなタンパク質の１種
のアミノ酸に対する少くとも１梯のコドンを含む、１種
のマイコブラズマタンパク質に対する、少くとも１種の
ＤＮＡ配列から形成されたものである。さらに、この少
くとも１種類の終止コドンは、前記アミノ酸に対して暗
号付けする他の１つのコードに突然変異されており、こ
の変異されたコドンは、宿主生体によって終止コドンと
して認識されないものである。このように１つのコドン
から、終止コドンとして認識されないコドンに変換され
ることにより、タンパク質合成が早目に終結することを
防止することができる。
ク貿に対する少くとも１つのＤＮＡ配列を含む発現伝播
体を提供する。この少くとも１種のＤＮＡ配列は、発現
伝播体によって形質転換されるべき宿主生体によって、
終止コドンであると認識されるようなタンパク質の１種
のアミノ酸に対する少くとも１梯のコドンを含む、１種
のマイコブラズマタンパク質に対する、少くとも１種の
ＤＮＡ配列から形成されたものである。さらに、この少
くとも１種類の終止コドンは、前記アミノ酸に対して暗
号付けする他の１つのコードに突然変異されており、こ
の変異されたコドンは、宿主生体によって終止コドンと
して認識されないものである。このように１つのコドン
から、終止コドンとして認識されないコドンに変換され
ることにより、タンパク質合成が早目に終結することを
防止することができる。
例えば、７４．５ｋＤａ抗原の２１１位置にあるアミノ
酸は、ＴＧＡと暗号付けされていて、通常これはトリプ
トファンに対する暗号であると共に、大腸菌はこれを終
止コドンと認識する。
酸は、ＴＧＡと暗号付けされていて、通常これはトリプ
トファンに対する暗号であると共に、大腸菌はこれを終
止コドンと認識する。
ＴＧＡコドンを含むオリゴヌクレオチドは、例えば部位
指向変異体などの突然変異によって変異するので、ＴＧ
ＡコドンはＴＧＧコドンに変換され、このＴＧＧもトリ
プトファンに対する暗号である。つぎにこのアリゴヌク
レオチド配列が置換さねて、対応するＴＧＡコドンを含
む７４．５ｋＤａ抗原の遺伝子のＤＮＡ配列の一部とな
る。
指向変異体などの突然変異によって変異するので、ＴＧ
ＡコドンはＴＧＧコドンに変換され、このＴＧＧもトリ
プトファンに対する暗号である。つぎにこのアリゴヌク
レオチド配列が置換さねて、対応するＴＧＡコドンを含
む７４．５ｋＤａ抗原の遺伝子のＤＮＡ配列の一部とな
る。
かくして、宿主生体内のＴＧＡコドンに対して適合する
ｔ−ＲＮＡに対して暗号付けするような追加のＤＮＡ配
列を必要としないで、７４．５ｋＤａ抗原の全長を発現
するところの、発現伝播体を生成することができる。
ｔ−ＲＮＡに対して暗号付けするような追加のＤＮＡ配
列を必要としないで、７４．５ｋＤａ抗原の全長を発現
するところの、発現伝播体を生成することができる。
この発明は、さらに、少くとも１種のマイコブラズマタ
ンパク質について暗号付けする少くとも１種のＤＮＡ配
列を含む発現伝播体を提供し、タンパク質合成の終結を
防止する。この少くとも１柚のＤＮＡ配列は、マイコブ
ラズマタンパク質の第１のアミノ酸を暗号付けする少く
とも１つのコドンを有する少くとも１つのＤＮＡ配列か
ら形成されたものである。この少くとも１つのコドンは
、第１のアミノ酸とは異なる１種または２種以上のアミ
ノ酸を暗号付けする、少くとも１つのコドンヘ突然変異
されたものである。或る１つの発現伝播体のＤＮＡ配列
には、１種のアミノ酸に対する１個以上のコドンを変異
させることによって形成された１個または複数個のコド
ンを包含させることができるが、前者のコドンは、宿主
生体によって終止コドンとして認識されるものであり、
これが変異されて新しいアミノ酸に対するコドンとして
、終止コドンとして認識されない別のコドンとなる。あ
るいは、１つの発現伝播体には、前記の少くとも１種の
ＤＮＡ配列に追加して、形質転換されるべき宿主生体内
の終止コドンに対して結合するところの１つのｔ−ＲＮ
Ａを暗号付けする、少くとも１種のＤＮＡ配列を包含さ
せることができる。このような終止コドンが存在し、活
性マイコブラズマタンパク質内へ１種のアミノ酸を挿入
するならば、タンパク質合成の早期中断は防止される。
ンパク質について暗号付けする少くとも１種のＤＮＡ配
列を含む発現伝播体を提供し、タンパク質合成の終結を
防止する。この少くとも１柚のＤＮＡ配列は、マイコブ
ラズマタンパク質の第１のアミノ酸を暗号付けする少く
とも１つのコドンを有する少くとも１つのＤＮＡ配列か
ら形成されたものである。この少くとも１つのコドンは
、第１のアミノ酸とは異なる１種または２種以上のアミ
ノ酸を暗号付けする、少くとも１つのコドンヘ突然変異
されたものである。或る１つの発現伝播体のＤＮＡ配列
には、１種のアミノ酸に対する１個以上のコドンを変異
させることによって形成された１個または複数個のコド
ンを包含させることができるが、前者のコドンは、宿主
生体によって終止コドンとして認識されるものであり、
これが変異されて新しいアミノ酸に対するコドンとして
、終止コドンとして認識されない別のコドンとなる。あ
るいは、１つの発現伝播体には、前記の少くとも１種の
ＤＮＡ配列に追加して、形質転換されるべき宿主生体内
の終止コドンに対して結合するところの１つのｔ−ＲＮ
Ａを暗号付けする、少くとも１種のＤＮＡ配列を包含さ
せることができる。このような終止コドンが存在し、活
性マイコブラズマタンパク質内へ１種のアミノ酸を挿入
するならば、タンパク質合成の早期中断は防止される。
このような組換え変成の実例は、７４，５ｋＤａ抗原の
ｒ１１６変成であり、以下に述べるように大腸菌によっ
て実現される。
ｒ１１６変成であり、以下に述べるように大腸菌によっ
て実現される。
７４．５ｋＤａ抗原と大腸菌ｄｎａＫタンパク質との間
には、可成りの配列相同が見られた。特に指摘されるア
ミノ酸中の相違点は、７４．５ｋＤａの肺炎病原体抗原
の１７と２７位置におけるバリン残査が、大腸菌ｄｎａ
Ｋタンパク質と比較して、抗原のこれらの区域における
予測されたＴ細胞認識特性を著しく低減させる点である
。このようなタンパク質分域は、免疫系に対する抗原の
有効な表出と深い関連性が見られる。部位指向形突然変
異誘発を使用すれば、１７と２７の位置におけるバリン
は、それぞれシステインとアルギニンによって置換させ
ることができる。この２つの変化で、大腸菌ｄｎａＫタ
ンパク質中に存在すると予測される柱状ラセン構造の２
つの区城を再生させる。この２種のアミノ酸残査置換を
含む誘導体に対する１個または複数の遺伝子は、大腸菌
発現ベクター中へ移行させることができる。発現された
組換え形タンパク質の実例は、７４．５ｋＤａの大腸菌
抗原のｒ１１６変異体として既知であり、後述する。
には、可成りの配列相同が見られた。特に指摘されるア
ミノ酸中の相違点は、７４．５ｋＤａの肺炎病原体抗原
の１７と２７位置におけるバリン残査が、大腸菌ｄｎａ
Ｋタンパク質と比較して、抗原のこれらの区域における
予測されたＴ細胞認識特性を著しく低減させる点である
。このようなタンパク質分域は、免疫系に対する抗原の
有効な表出と深い関連性が見られる。部位指向形突然変
異誘発を使用すれば、１７と２７の位置におけるバリン
は、それぞれシステインとアルギニンによって置換させ
ることができる。この２つの変化で、大腸菌ｄｎａＫタ
ンパク質中に存在すると予測される柱状ラセン構造の２
つの区城を再生させる。この２種のアミノ酸残査置換を
含む誘導体に対する１個または複数の遺伝子は、大腸菌
発現ベクター中へ移行させることができる。発現された
組換え形タンパク質の実例は、７４．５ｋＤａの大腸菌
抗原のｒ１１６変異体として既知であり、後述する。
この発明によれば、前記説明の形式のクローン化伝播体
によって形質転換された宿主がら生成されるタンパク質
を、生理学的に許容しつる伝播体と関連させることによ
り、家豚の肺炎病原体釘対する予防が可能となる。前記
の指摘のとおり、このようなタンパク質は、前記肺炎病
原体の１種または複数種の抗原のエピトープを認識する
抗体を誘発する機能を有する。このような発現されたタ
ンパク質は、以下の説明中では「組換え形病原体抗原」
と称することもあるが、前述のとおり、タンパク質が同
時に断片や誘導体または融合生成物として含まれるよう
な肺炎病原体抗原と同一のタンパク質ではない。「組換
え形病原体抗原」という用語は、断片、誘導体あるいは
融合生成物をも包含するものである。
によって形質転換された宿主がら生成されるタンパク質
を、生理学的に許容しつる伝播体と関連させることによ
り、家豚の肺炎病原体釘対する予防が可能となる。前記
の指摘のとおり、このようなタンパク質は、前記肺炎病
原体の１種または複数種の抗原のエピトープを認識する
抗体を誘発する機能を有する。このような発現されたタ
ンパク質は、以下の説明中では「組換え形病原体抗原」
と称することもあるが、前述のとおり、タンパク質が同
時に断片や誘導体または融合生成物として含まれるよう
な肺炎病原体抗原と同一のタンパク質ではない。「組換
え形病原体抗原」という用語は、断片、誘導体あるいは
融合生成物をも包含するものである。
組換え形肺炎病原体抗原は、肺炎病原体に対する予防効
果を達成する量においてワクチン内に混入される。一般
にワクチンの１回処方量は、少くとも５マイクログラム
の組換え形肺炎病原体抗原（以下、「病原体抗原」とす
る）を含有する必要があるが、好ましくは１００マイク
ログラムの病原体抗原を含有する方がよい。多くの場合
、２０ミリグラム以上の量のワクチン中でも、前記の必
要量の病原体抗原を含有していないのが通例である。
果を達成する量においてワクチン内に混入される。一般
にワクチンの１回処方量は、少くとも５マイクログラム
の組換え形肺炎病原体抗原（以下、「病原体抗原」とす
る）を含有する必要があるが、好ましくは１００マイク
ログラムの病原体抗原を含有する方がよい。多くの場合
、２０ミリグラム以上の量のワクチン中でも、前記の必
要量の病原体抗原を含有していないのが通例である。
肺炎病原体に対するワクチンに対して、「予防」または
「予防する」という用語を使用する場合、それは、ワク
チンが、家豚の肺炎病原体を駆逐すること、あるいはそ
の肺炎症状の重症を軽減することを意味する場合と、そ
の両者を含める意味にも使用する。
「予防する」という用語を使用する場合、それは、ワク
チンが、家豚の肺炎病原体を駆逐すること、あるいはそ
の肺炎症状の重症を軽減することを意味する場合と、そ
の両者を含める意味にも使用する。
複数の処方が行われるときは、一般に８週間の間に３種
以上の処方を行ってはならない。
以上の処方を行ってはならない。
組換え形肺炎病原体抗原仁の関連において使用される伝
播体は、種々の伝播体のうちの何れか１種が使用される
。適切な担持体の各実例としては、ワクチン用の鉱物油
、明ばん、合成高分子等の相持体が周知であり、適切な
担持体の選択は、当業者にとって容易である。その選択
は、ワタチンの投与の方式によっても左Ｉテされる。ワ
クヂンは、注射用の処方でもよく、または筋肉下、静脈
内、鼻腔内、あるいは皮下注射によっても行われる。ま
たは、 ワクチンは、食物または水と混合しての経口投
与、または錠剤形とする等も可能である。
播体は、種々の伝播体のうちの何れか１種が使用される
。適切な担持体の各実例としては、ワクチン用の鉱物油
、明ばん、合成高分子等の相持体が周知であり、適切な
担持体の選択は、当業者にとって容易である。その選択
は、ワタチンの投与の方式によっても左Ｉテされる。ワ
クヂンは、注射用の処方でもよく、または筋肉下、静脈
内、鼻腔内、あるいは皮下注射によっても行われる。ま
たは、 ワクチンは、食物または水と混合しての経口投
与、または錠剤形とする等も可能である。
その他種々の投与方式が考えられるが、この発明におい
ては、特定の投与力式に限定さねない。
ては、特定の投与力式に限定さねない。
またワクチンには、病原体抗原のまたはその断片の他に
、活性成分その他の補助剤が添加されることは、前述の
とおりである。
、活性成分その他の補助剤が添加されることは、前述の
とおりである。
またこの発明によれば、ｍｌ記説明の形の肺炎病原体タ
ンパク質抗原の１種を、特殊な結合体として使用するこ
とにより、肺病病原体抗原に対抗する抗体を検出し、判
定することが可能となる。
ンパク質抗原の１種を、特殊な結合体として使用するこ
とにより、肺病病原体抗原に対抗する抗体を検出し、判
定することが可能となる。
換Ｊすれば、肺炎病原体抗体用の免疫検定法であって、
その検定法中には、病原体抗原が結合体として使用さわ
、特定的に病原体抗体を結合させるようにする方法であ
る。
その検定法中には、病原体抗原が結合体として使用さわ
、特定的に病原体抗体を結合させるようにする方法であ
る。
この検定法では、サンドインチ形の検定器を使川するの
かよく、病原体抗原がバインタとして固体支持体に支持
され、試料内にある病原体の特定の抗体と、結合された
抗体とを結合させ、適切なトレーサで判定さわるもので
ある。
かよく、病原体抗原がバインタとして固体支持体に支持
され、試料内にある病原体の特定の抗体と、結合された
抗体とを結合させ、適切なトレーサで判定さわるもので
ある。
このトレーサは、着脱可能なラベルを付着したりガンド
より成る。リガントは、病原体抗体によって免疫学的に
結合さわた形のリガンドで、このリガントは既知の方法
でラベル付けすることができる。
より成る。リガントは、病原体抗体によって免疫学的に
結合さわた形のリガンドで、このリガントは既知の方法
でラベル付けすることができる。
固体支持器上の病原体抗原に対して結合される病原体抗
体は、例えば、１つの適切な着脱可能なラベルで表示さ
れた病原体抗体用の１つの抗体を使用することによって
判別される。
体は、例えば、１つの適切な着脱可能なラベルで表示さ
れた病原体抗体用の１つの抗体を使用することによって
判別される。
このサンドイッチ式検定法では、病原体抗体に対してラ
ベル付された抗体、乍一クローン化抗体でも、多クロー
ン化抗体でもよい。例えば多クローン化抗体は、家豚対
向のグロプリンＩｇＧでもよく、または特に肺炎病原体
に対して用意された１つの抗体であればよく、これは通
常の手法て生成されたものでよい。例えば、肺炎病原体
抗体を適切な動物に注射して得られる。
ベル付された抗体、乍一クローン化抗体でも、多クロー
ン化抗体でもよい。例えば多クローン化抗体は、家豚対
向のグロプリンＩｇＧでもよく、または特に肺炎病原体
に対して用意された１つの抗体であればよく、これは通
常の手法て生成されたものでよい。例えば、肺炎病原体
抗体を適切な動物に注射して得られる。
着脱形ラヘルは、酵素、放射性ラベル、色原体（ケイ光
染料または吸光染料でもよい）その他の内から適宜に選
択できる。ラベルの選定は周知の技術に属する。
染料または吸光染料でもよい）その他の内から適宜に選
択できる。ラベルの選定は周知の技術に属する。
抗体の固体保持器も、種々のｊＮ体保持器の中がら適宜
選択でき、その選定も周知の技術と見なされる。例えば
マイクロ滴定板、管、粒子等があるが、この発明ではい
ずれにも限定はしない。抗原は通常の方法で支持され、
例えばコーティング、共有結合体等である。その選定も
通常の技術と見なされる。
選択でき、その選定も周知の技術と見なされる。例えば
マイクロ滴定板、管、粒子等があるが、この発明ではい
ずれにも限定はしない。抗原は通常の方法で支持され、
例えばコーティング、共有結合体等である。その選定も
通常の技術と見なされる。
サントイッチ形検定器は、種々の方法で遂行でき，例え
ば「前進」、「後進」または「同時」があるが、前進法
が最適である。
ば「前進」、「後進」または「同時」があるが、前進法
が最適である。
代表的な手法では、固体支持器に支持された病原体抗原
を、まず病原体抗体を含むと想定されるサンプルに接触
させて、サンプル中に存在するいずれか特定の抗体を、
支持体上の抗原に結合させる。
を、まず病原体抗体を含むと想定されるサンプルに接触
させて、サンプル中に存在するいずれか特定の抗体を、
支持体上の抗原に結合させる。
固定支持器を洗浄したのち、病原体抗体に結合するトレ
ーサに支持器を接触させる。抗体かサンプル中に存在す
れば、トレーサは、固体支持器上の抗原に結合された抗
体に結合されるようになり、支持器上のトレーサの存在
が、サンプル中に病原体抗体が存在することを示す。ト
レーサの存在は、周知の手順で着脱形ラベルの存在を判
別することによってｆリ断される。
ーサに支持器を接触させる。抗体かサンプル中に存在す
れば、トレーサは、固体支持器上の抗原に結合された抗
体に結合されるようになり、支持器上のトレーサの存在
が、サンプル中に病原体抗体が存在することを示す。ト
レーサの存在は、周知の手順で着脱形ラベルの存在を判
別することによってｆリ断される。
サンドイッチ形検定法が最適ではあるが、病原体抗原の
検定は他の方法もある。例えば、膠着検定法では、抗原
がラテックス粒子などの固体粒子上において使用される
。
検定は他の方法もある。例えば、膠着検定法では、抗原
がラテックス粒子などの固体粒子上において使用される
。
また、この発明は、病原体抗体はｍｌ記と同線に支持し
て、トレーサがリガンド（配位子）と着脱ラベルより成
る検定法、即ち１組の試薬キットとした検定法を提供す
る。トレーサのりカントは、病原体に結合されている。
て、トレーサがリガンド（配位子）と着脱ラベルより成
る検定法、即ち１組の試薬キットとした検定法を提供す
る。トレーサのりカントは、病原体に結合されている。
試薬は、適宜なキット即ち試験パッケージに収納され、
さらに緩衝剤等の他の成分を含ませることかできる。病
原体抗原は、固体支持器に支持させる方がよい。
さらに緩衝剤等の他の成分を含ませることかできる。病
原体抗原は、固体支持器に支持させる方がよい。
この発明の発現伝播体のＤＮＡ配列により、少くとも１
種のタンパク質に対して遺伝暗号を付与し、このタンパ
ク質が・病原体抗原のエピトープを認識する抗体を誘発
する効果を生ずる。
種のタンパク質に対して遺伝暗号を付与し、このタンパ
ク質が・病原体抗原のエピトープを認識する抗体を誘発
する効果を生ずる。
またこの発現伝播体により、宿主生物の形質転換を可能
とする。
とする。
さらに、前記宿主によって発現される少くとも１種のタ
ンパク質を含有する予防ワクチンの実現を可能ならしめ
る効果がある。
ンパク質を含有する予防ワクチンの実現を可能ならしめ
る効果がある。
以下、この発明の害施例を図面を参照して説明する。下
記の各実施例においては、特に規定しない限り、精製、
培養、および連結活性化は、マニアティス他によりコー
ルドスプリングハーバー研究所発行の「分子クローニン
グ法と研究室手引」（１９８２）中に記載の方法による
。また、形質転換は、コーエン他によるＰＮＡＳ６旦
２１１０（１９７３）中に記載の方法による。
記の各実施例においては、特に規定しない限り、精製、
培養、および連結活性化は、マニアティス他によりコー
ルドスプリングハーバー研究所発行の「分子クローニン
グ法と研究室手引」（１９８２）中に記載の方法による
。また、形質転換は、コーエン他によるＰＮＡＳ６旦
２１１０（１９７３）中に記載の方法による。
また、特に規定しない限り、下記実施例中で使川される
肺炎病原体（肺炎バイオマイコブラズマ）抗原は、１９
８８年９月２８日発行のヨーロッパ特許出願７ｊＩＪ２
８３，８４０号明細書中に記載の肺炎病原体から得られ
たものである。
肺炎病原体（肺炎バイオマイコブラズマ）抗原は、１９
８８年９月２８日発行のヨーロッパ特許出願７ｊＩＪ２
８３，８４０号明細書中に記載の肺炎病原体から得られ
たものである。
（実施例１）
菌株Ｐ−５７２２３ （バーデュ大学チャールズアーム
ストロング博士より人手）を、１ｋのフリース媒質中で
育成し、ｌｍｌ１当りの変色単位で約１０９〜１０Ｉ０
の密度となった。細胞は遠心分離によって採取され、全
容積３．２５ｍｆｔを与える２ｍＪ２のリン酸で緩衝し
た食塩水中に再懸濁された。この懸濁液を、１９．７５
ｍβ１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０１ｍＭのＥＤ
ＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）中に溶解した２４．５
３ｇの塩化セシウムより成る溶液と混合し、これに１０
ｍｇ／ｍｊ２の臭化エチジウムを添加した。これを２．
１５ｍＲの１０ｍＭ ＴｒｉｓｐＨ８．Ｏと、１ｍｌ
ｌのＥＤＴＡと、８，９％のザルコシルに溶解した３．
８７ｇの塩化セシウムより成る溶液中に混合した，生成
された懸濁液を６５℃で１０分間培養して細胞を完全に
溶解させた。ソーバルＴＶ８５０ロータを使用して４３
．０００ｒｐｍで１種時間の平衡浮遊密度式遠心分離に
よってＤＮＡを分離し、これを１種ゲージ二一ドルで引
伸した。このＤＮＡを、ソーバルＴＶ８６５ロータを使
用して５５，ＯＯＯｒｐｍで，それぞれ７時間と１種時
間の浮遊密度式遠心分離をさらに２回行い、各回に遺伝
子ＤＮＡの帯を１種ゲージ二一ドルによって取出した。
ストロング博士より人手）を、１ｋのフリース媒質中で
育成し、ｌｍｌ１当りの変色単位で約１０９〜１０Ｉ０
の密度となった。細胞は遠心分離によって採取され、全
容積３．２５ｍｆｔを与える２ｍＪ２のリン酸で緩衝し
た食塩水中に再懸濁された。この懸濁液を、１９．７５
ｍβ１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０１ｍＭのＥＤ
ＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）中に溶解した２４．５
３ｇの塩化セシウムより成る溶液と混合し、これに１０
ｍｇ／ｍｊ２の臭化エチジウムを添加した。これを２．
１５ｍＲの１０ｍＭ ＴｒｉｓｐＨ８．Ｏと、１ｍｌ
ｌのＥＤＴＡと、８，９％のザルコシルに溶解した３．
８７ｇの塩化セシウムより成る溶液中に混合した，生成
された懸濁液を６５℃で１０分間培養して細胞を完全に
溶解させた。ソーバルＴＶ８５０ロータを使用して４３
．０００ｒｐｍで１種時間の平衡浮遊密度式遠心分離に
よってＤＮＡを分離し、これを１種ゲージ二一ドルで引
伸した。このＤＮＡを、ソーバルＴＶ８６５ロータを使
用して５５，ＯＯＯｒｐｍで，それぞれ７時間と１種時
間の浮遊密度式遠心分離をさらに２回行い、各回に遺伝
子ＤＮＡの帯を１種ゲージ二一ドルによって取出した。
得られたＤＮＡ溶液を塩化セシウムで飽和させたイソブ
バノールで抽出して臭化エチジウムを除去し、次いで１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０の１ｍＭＥＤＴＡに
対して十分に透析分離し、イソプロバノールと塩化セシ
ウムとを除去した。
バノールで抽出して臭化エチジウムを除去し、次いで１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０の１ｍＭＥＤＴＡに
対して十分に透析分離し、イソプロバノールと塩化セシ
ウムとを除去した。
゛ − −イブ−１−の ゜
胛炎病原体Ｐ−５７２２３の２００μｇの遺伝子ＤＮＡ
の予備熟成を、１ｍ１当り２００単位の制限酸素Ｅｃｏ
Ｒ１を使用して行い、６分後、２５分後、４２分後、お
よび６３分後において、２５０μ１の部分標本を採取し
た。
の予備熟成を、１ｍ１当り２００単位の制限酸素Ｅｃｏ
Ｒ１を使用して行い、６分後、２５分後、４２分後、お
よび６３分後において、２５０μ１の部分標本を採取し
た。
これらの部分的に熟成された病原体ＤＮＡの４種の試料
を、混合して（２００μｇ）、指数関数式シヨ糖勾配法
で処理した。この勾配液を、ソーバルＡＨ６２７ロータ
を使用して２６，０００ｒｐｍで１５℃で２１時間遠心
分離させた。
を、混合して（２００μｇ）、指数関数式シヨ糖勾配法
で処理した。この勾配液を、ソーバルＡＨ６２７ロータ
を使用して２６，０００ｒｐｍで１５℃で２１時間遠心
分離させた。
この勾配液を、１５滴分画することにより、器底から徐
々に分液した（総計９０分画量）。各分画量の２０μ１
ずつを、前記のとおり、１％の寒天ゲル中に分散させた
。１種ｋｂＰ （キロベースベア、塩基対１０００個を
ｌｋｂｐとする）よりは小さ＜ １ ５ｋｂｐよりは大
きいＤＮＡの断片を含む分画液を採取し（３２〜４０分
画ｉ）．ＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｊ２
ｐＨ７．５に１ｍＭ ＥＤＴＡを添加してｐｔ−ｔｓ
．Ｏとしたもの）に対して透析して、シヨ糖分を除去し
た。つぎにＤＮＡ （３．５ｍｌ２）を、エタノールで
沈殿させ、約１５μＵまで懸濁させて（ｌｍｇ／ｍｕ）
．−２０℃で保管した。
々に分液した（総計９０分画量）。各分画量の２０μ１
ずつを、前記のとおり、１％の寒天ゲル中に分散させた
。１種ｋｂＰ （キロベースベア、塩基対１０００個を
ｌｋｂｐとする）よりは小さ＜ １ ５ｋｂｐよりは大
きいＤＮＡの断片を含む分画液を採取し（３２〜４０分
画ｉ）．ＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｊ２
ｐＨ７．５に１ｍＭ ＥＤＴＡを添加してｐｔ−ｔｓ
．Ｏとしたもの）に対して透析して、シヨ糖分を除去し
た。つぎにＤＮＡ （３．５ｍｌ２）を、エタノールで
沈殿させ、約１５μＵまで懸濁させて（ｌｍｇ／ｍｕ）
．−２０℃で保管した。
バクテリオファージ・ラムダタツシュのＥｃｏＲｌ（制
限酵素）の腕が、ヘクタークローン化装置（ストラーダ
ジン社製）によって得られ、このＥｅｏＲ１腕は、濃度
１００単位／ ｍ ＩｔにおいてＴ４リカーセ（連結活
性剤、ベーリング一〇ｍｂＨ社製）を使用して、全容積
１０μ１中に２５μｇ ／ ｍ Ｈの濃度にあるマイコ
ブラズマ標的ＤＮＡに対して、２００μｇ ／ ｍ ｆ
ｌの濃度で連結処理した。この連結反応を、常温で２時
間熟成させた。熟成済の４μＮを、試験管内封入形キッ
ト「ギガバック」 （ストラーダジン社製）を使用して
、ラムダ粒子内へ封入した。次にこのファージを、大腸
菌の菌株Ｐ２３９２ （ストレイタジン社製）」二に滴
定し、７．７５Ｘ１０’ ｐｆｕ／ｍＩＬの量（ラムダ
ダッシュの３． Ｉ Ｘ １ ０５ρｆｕ／ｍｇに相
当する）が定量された。
限酵素）の腕が、ヘクタークローン化装置（ストラーダ
ジン社製）によって得られ、このＥｅｏＲ１腕は、濃度
１００単位／ ｍ ＩｔにおいてＴ４リカーセ（連結活
性剤、ベーリング一〇ｍｂＨ社製）を使用して、全容積
１０μ１中に２５μｇ ／ ｍ Ｈの濃度にあるマイコ
ブラズマ標的ＤＮＡに対して、２００μｇ ／ ｍ ｆ
ｌの濃度で連結処理した。この連結反応を、常温で２時
間熟成させた。熟成済の４μＮを、試験管内封入形キッ
ト「ギガバック」 （ストラーダジン社製）を使用して
、ラムダ粒子内へ封入した。次にこのファージを、大腸
菌の菌株Ｐ２３９２ （ストレイタジン社製）」二に滴
定し、７．７５Ｘ１０’ ｐｆｕ／ｍＩＬの量（ラムダ
ダッシュの３． Ｉ Ｘ １ ０５ρｆｕ／ｍｇに相
当する）が定量された。
灸旌皇請
１．免立免疫店文。ニュージーランド産白色種兎を、完
全フロイント補薬（セントルイス市シグマ社製）中で、
肺炎病原体菌種Ｊ （ＡＴＣＣ ２５９３４）の約１
０１変色単位量を使用して免疫性を付与した。第１回の
注射の２週間後に、完全フロイント補薬（シグマ社）中
に混入した同じ抗原の補助注射を行った。過剰免疫性血
清が、３０種以上のマイコプラズマタンパク質に対して
反応することが、１−Ｄゲルウエスタン着斑分析によっ
て判明し、２−Ｄウエスタン着斑分析によれば、分子量
約７４．５ｋＤａ （キロ・ダルトン）の２種のタンパ
ク質に対して反応することか判明した。
全フロイント補薬（セントルイス市シグマ社製）中で、
肺炎病原体菌種Ｊ （ＡＴＣＣ ２５９３４）の約１
０１変色単位量を使用して免疫性を付与した。第１回の
注射の２週間後に、完全フロイント補薬（シグマ社）中
に混入した同じ抗原の補助注射を行った。過剰免疫性血
清が、３０種以上のマイコプラズマタンパク質に対して
反応することが、１−Ｄゲルウエスタン着斑分析によっ
て判明し、２−Ｄウエスタン着斑分析によれば、分子量
約７４．５ｋＤａ （キロ・ダルトン）の２種のタンパ
ク質に対して反応することか判明した。
２．マ スのイ１１７ｔ血゛１
前記と同様な方法で、単一種の血清を調製したが、下記
の点では相違する。即ち、閑株Ｐ−５７２２３（パーデ
ュ大学Ｃ，アームストロング博士提供）から電気泳動法
による約１０μｇの分子量７４．５ｋＤａ （キロダル
トン）の純良抗原によって、Ｄ Ｂ Ａ ／ ｚのマウ
ス（はつかねずみ）に免疫付！ヂし、さらに同一投与量
で補助免疫を行った。１９８８年９月２８日発行の日本
国特願昭６３−２５８４２７号記載の方法により、７４
、５ｋＤａの抗原を採取した。１−Ｄウェスタン法プロ
ット分析によれば、単一のマイコブラズマ７４．５ｋＤ
ａタンパク貿帯に反応する過剰免疫性血清と、また２−
Ｄゲルウエスタン・プロット分析によれば、２種のタン
パク質に反応する過剰免疫性血清が認められた。この７
４．５ｋＤａ抗原は、日本国特願昭６３−２５８４７号
に記載された方法によって調製され、この特願昭を、現
出願の一部として引用するものとする。
の点では相違する。即ち、閑株Ｐ−５７２２３（パーデ
ュ大学Ｃ，アームストロング博士提供）から電気泳動法
による約１０μｇの分子量７４．５ｋＤａ （キロダル
トン）の純良抗原によって、Ｄ Ｂ Ａ ／ ｚのマウ
ス（はつかねずみ）に免疫付！ヂし、さらに同一投与量
で補助免疫を行った。１９８８年９月２８日発行の日本
国特願昭６３−２５８４２７号記載の方法により、７４
、５ｋＤａの抗原を採取した。１−Ｄウェスタン法プロ
ット分析によれば、単一のマイコブラズマ７４．５ｋＤ
ａタンパク貿帯に反応する過剰免疫性血清と、また２−
Ｄゲルウエスタン・プロット分析によれば、２種のタン
パク質に反応する過剰免疫性血清が認められた。この７
４．５ｋＤａ抗原は、日本国特願昭６３−２５８４７号
に記載された方法によって調製され、この特願昭を、現
出願の一部として引用するものとする。
３．１臣囚免役崖菫
バーデューの小形家豚に、完全フロイント補薬中に混入
させた、１００μｇの電気泳動純化７４．５ｋＤａ抗原
によって、免疫性を付与した。第１図の注射から２週間
後に、同一の注射を行った。！−Ｄおよび２−Ｄゲルウ
エスタン・プロット分析により、単一のマイコブラズマ
の７４．５ｋＤａのタンパク質に反応する過剰免疫性血
清が認められた。このタンパク質は、過剰免疫性のマウ
ス血清によって認識される２種の内の方のものと同一の
タンパク質である。これらの家豚は、ワクチン投与によ
るマイコプラズマ性肺炎からの予防の一つの目安となっ
た。
させた、１００μｇの電気泳動純化７４．５ｋＤａ抗原
によって、免疫性を付与した。第１図の注射から２週間
後に、同一の注射を行った。！−Ｄおよび２−Ｄゲルウ
エスタン・プロット分析により、単一のマイコブラズマ
の７４．５ｋＤａのタンパク質に反応する過剰免疫性血
清が認められた。このタンパク質は、過剰免疫性のマウ
ス血清によって認識される２種の内の方のものと同一の
タンパク質である。これらの家豚は、ワクチン投与によ
るマイコプラズマ性肺炎からの予防の一つの目安となっ
た。
ブー１−のスク１−ニング
ライブラリーは、兎の対肺炎病原体（これは、他のマイ
コブラズマ表面タンパク質の他の分子量７４．５ｋＤａ
の抗原をも免疫学的に認識する）によって送りわけられ
た。約２００種の遺伝子組換え体が、兎の免疫血清に対
して免疫学的に反応したので、これら約２００種が第１
次選別によって選択された。これらの組換え体は、電気
泳動法によって鯖製された抗原に対して生成された、マ
ウスの対７４．５ｋＤａタンパク質によってさらに選別
された。１０種の組換え体が、大腸菌内で単一種の血清
と免疫学的に交差反応する物質を生成することが認めら
れ、この１０種の組換え体が選択された。
コブラズマ表面タンパク質の他の分子量７４．５ｋＤａ
の抗原をも免疫学的に認識する）によって送りわけられ
た。約２００種の遺伝子組換え体が、兎の免疫血清に対
して免疫学的に反応したので、これら約２００種が第１
次選別によって選択された。これらの組換え体は、電気
泳動法によって鯖製された抗原に対して生成された、マ
ウスの対７４．５ｋＤａタンパク質によってさらに選別
された。１０種の組換え体が、大腸菌内で単一種の血清
と免疫学的に交差反応する物質を生成することが認めら
れ、この１０種の組換え体が選択された。
量７４．５ｋＤａ にす の
肋舅
７４．５ｋＤａ抗原の部分的アミノ酸配列に基づき、下
記の構造のＣＯＤ５５８と５５９のオリゴヌクレオチド
族を合成した。なお、各アミノ酸の記号は、ＡＪＺａ
（アラニン）、Ｌｙｓ （リジン）．Ｇｌｕ （グルタ
ミン酸）、ＩＪ２ｅ（イソ口イシン）、Ｌｅｕ（ロイシ
ン），Ｇｊ２ｙ（グリシン）．Ａｓｐ （アスパラギン
酸），Ｓｅｒ（セリン），Ｖａｎ！（パリン）．Ａｓｎ
（アスパラギン）． Ｇｆｉｎ （グルタミン），Ｐ
ｒｏ（プロリン）である。塩基は、Ａ（アデニン）、Ｇ
（グアニン）、Ｔ（チミン）、Ｃ（シトシン）を示し、
他の実施例においても同様とする。
記の構造のＣＯＤ５５８と５５９のオリゴヌクレオチド
族を合成した。なお、各アミノ酸の記号は、ＡＪＺａ
（アラニン）、Ｌｙｓ （リジン）．Ｇｌｕ （グルタ
ミン酸）、ＩＪ２ｅ（イソ口イシン）、Ｌｅｕ（ロイシ
ン），Ｇｊ２ｙ（グリシン）．Ａｓｐ （アスパラギン
酸），Ｓｅｒ（セリン），Ｖａｎ！（パリン）．Ａｓｎ
（アスパラギン）． Ｇｆｉｎ （グルタミン），Ｐ
ｒｏ（プロリン）である。塩基は、Ａ（アデニン）、Ｇ
（グアニン）、Ｔ（チミン）、Ｃ（シトシン）を示し、
他の実施例においても同様とする。
ＣＯＤ ５５８
Ａ Ｉａ−−Ｌｙｓ−−Ｇ Ｉｕ−−１ １ｅ−−１
１ｅ−−Ｌｅｕ−−Ｇ Ｉｙ−−１ １ｅ−−Ａｓｐ−
−Ｌｅｕ−−Ａ八＾ ＧＡＡ ＡＴＡ 八Ｔ
Ａ ＴＴＧ ＧＧＧ Ｇ （：
ＯＣＡＴ 丁 Ｔ Ｃ ＣＯＤ ５５９ Ｓｅｒ−−Ｖａｌ−−Ｖａｌ−−Ｌｅｕ−Ｉ ｌｅ−＾
ｓｐ−Ｇｌｕ−＾ｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−ＰｒｏＧＴＧ
（：ＴＧ ＡＴＡ ＧＡＧ ＧＡＡ ＡＡ
ＡＴＣＴＧ Ｔ Ｔ Ｃ 免疫能動性のこの１０種の遺伝子組換え体からＤＮＡを
調整し、大腸菌によって培養し、ゲル電気泳動法によっ
て分析された結果、各々が、若干個の制限酵素ＥｃｏＲ
１の断片より成る肺炎病原体の染色体の各部分より成る
ことが認められた。
１ｅ−−Ｌｅｕ−−Ｇ Ｉｙ−−１ １ｅ−−Ａｓｐ−
−Ｌｅｕ−−Ａ八＾ ＧＡＡ ＡＴＡ 八Ｔ
Ａ ＴＴＧ ＧＧＧ Ｇ （：
ＯＣＡＴ 丁 Ｔ Ｃ ＣＯＤ ５５９ Ｓｅｒ−−Ｖａｌ−−Ｖａｌ−−Ｌｅｕ−Ｉ ｌｅ−＾
ｓｐ−Ｇｌｕ−＾ｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−ＰｒｏＧＴＧ
（：ＴＧ ＡＴＡ ＧＡＧ ＧＡＡ ＡＡ
ＡＴＣＴＧ Ｔ Ｔ Ｃ 免疫能動性のこの１０種の遺伝子組換え体からＤＮＡを
調整し、大腸菌によって培養し、ゲル電気泳動法によっ
て分析された結果、各々が、若干個の制限酵素ＥｃｏＲ
１の断片より成る肺炎病原体の染色体の各部分より成る
ことが認められた。
この異種交配条件は下記のとおりである。
異種交配法
６Ｘ ＮＥＴ
５ｘ デンハルツ
２Ｘ １０６ｃｐｍキナーゼ・ブローブ３７℃
１種時間
洗浄６Ｘ ＮＥＴ
０．１％ＳＤＳ （ラウリル硫酸ナトリウム）常温にお
いて３Ｘ ３７℃において２ｘ ６Ｘ ＮＥＴ １モルＮａＣＩｔ ９０ミリモルＴｒｉｓ ｐＨ７．６ ６ミリモルＥＤＴＡ サザン・プロット分析により、ＣＯＤ５５ＢとＣＯＤ
５ ５ ９は共に，異種交配により、１０種の組換え体
のうちの６種に存在する、大きさ７，８００塩基対（ｂ
ｐ）（長さは７．８キロベース（ｋｂ））のＥｃｏＲ１
制限酵素断片になるものと認められた。この断片を二次
増殖させるために、長さ７．８ｋｂ断片（他の隣接する
断片に加えて）を含む転換体をラムダ５−５−５９と呼
称し，そのＤＮＡを調製して、酵素ＥｃｏＲ１によって
育成させ、ＥｃｏＲ１で育成されたベクターｐＷＨＡ１
４８に接合させて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の菌株ＪＭ
８３に形質転換させた。形質転換体の１つをｐＭＹｃｏ
１ ６と命名した。そのＤＮＡは、調製されたのち、種
々の制限酵素（内部核酸分解酵素》によって育成させて
、第５図中の制限マップを引出すようにしたものである
。なお以下において、１，０００個のヌクレオチド対を
１キロベース（ｋｂ）とし、ＤＮＡ部分の長さを表わす
。
いて３Ｘ ３７℃において２ｘ ６Ｘ ＮＥＴ １モルＮａＣＩｔ ９０ミリモルＴｒｉｓ ｐＨ７．６ ６ミリモルＥＤＴＡ サザン・プロット分析により、ＣＯＤ５５ＢとＣＯＤ
５ ５ ９は共に，異種交配により、１０種の組換え体
のうちの６種に存在する、大きさ７，８００塩基対（ｂ
ｐ）（長さは７．８キロベース（ｋｂ））のＥｃｏＲ１
制限酵素断片になるものと認められた。この断片を二次
増殖させるために、長さ７．８ｋｂ断片（他の隣接する
断片に加えて）を含む転換体をラムダ５−５−５９と呼
称し，そのＤＮＡを調製して、酵素ＥｃｏＲ１によって
育成させ、ＥｃｏＲ１で育成されたベクターｐＷＨＡ１
４８に接合させて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の菌株ＪＭ
８３に形質転換させた。形質転換体の１つをｐＭＹｃｏ
１ ６と命名した。そのＤＮＡは、調製されたのち、種
々の制限酵素（内部核酸分解酵素》によって育成させて
、第５図中の制限マップを引出すようにしたものである
。なお以下において、１，０００個のヌクレオチド対を
１キロベース（ｋｂ）とし、ＤＮＡ部分の長さを表わす
。
ベクターｐＷＨＡ１４８は、合成オリゴヌクレオチドな
、ｐＬＪｃ ｔ ａのＨ ｉ ｎｄｌＩＩの部位に挿入
することによって生成さわる。Ｂ−ガラクトシダーゼの
Ｘ相補形ベブチドのアミノ酸端末暗号付け配列は、第７
図のとおり−で、親のｐＵｃ１種上に、追加の８個の制
限部位を含む。ｐＵｃ１種へのオリゴヌクレオチドは、
第７図のように．ＳｐｈｌとＨ ｉ ｎｄＩＩＩの部位
の間に挿入される。この第７図は、プラスミドｐＷＨＡ
１４８内に生成されたＢ−ガラクトシダーゼ融合タンパ
ク質のｐＵＣ１種の配列と、付加された終点と、予想さ
れるアミノ酸配列を示す。下段の文字は、ｐＵＣ １
８のヌクレオチド配列の部分で、上段の文字は、ＰＷＨ
Ａ １ ４ ８の合成オリゴヌクレオチド付加のヌクレ
オチト配列を示す。数字は、予想されるアミノ酸配列の
順序を示す。
、ｐＬＪｃ ｔ ａのＨ ｉ ｎｄｌＩＩの部位に挿入
することによって生成さわる。Ｂ−ガラクトシダーゼの
Ｘ相補形ベブチドのアミノ酸端末暗号付け配列は、第７
図のとおり−で、親のｐＵｃ１種上に、追加の８個の制
限部位を含む。ｐＵｃ１種へのオリゴヌクレオチドは、
第７図のように．ＳｐｈｌとＨ ｉ ｎｄＩＩＩの部位
の間に挿入される。この第７図は、プラスミドｐＷＨＡ
１４８内に生成されたＢ−ガラクトシダーゼ融合タンパ
ク質のｐＵＣ１種の配列と、付加された終点と、予想さ
れるアミノ酸配列を示す。下段の文字は、ｐＵＣ １
８のヌクレオチド配列の部分で、上段の文字は、ＰＷＨ
Ａ １ ４ ８の合成オリゴヌクレオチド付加のヌクレ
オチト配列を示す。数字は、予想されるアミノ酸配列の
順序を示す。
ＣＯＤ５５８と５５９は、サザン法分析によれば、ｐＭ
Ｙｃｏ １ ６の長さ０．６ｋｂ（キロヘース）Ａｃｃ
ｌ−Ａｓｕ制限断片に異種交配された。０．６ｋｂ断片
のＤＮＡ配列分析によれば、１）ＣＯＤ５５８とＣＯＤ
５５９との類似性の範四を包含し、２）断片のＤＮＡ配
列によって予測さわたアミノ酸の３種を除いてその他は
、下記のとおり、分子ｆｉｔ７４．５ｋＤａに対して判
別されるタンパク質配列に適合している。前記以外のア
ミノ酸の記号は、Ｍｅｔ（メチオニン）とＴｈｒ（トレ
オニン）である。
Ｙｃｏ １ ６の長さ０．６ｋｂ（キロヘース）Ａｃｃ
ｌ−Ａｓｕ制限断片に異種交配された。０．６ｋｂ断片
のＤＮＡ配列分析によれば、１）ＣＯＤ５５８とＣＯＤ
５５９との類似性の範四を包含し、２）断片のＤＮＡ配
列によって予測さわたアミノ酸の３種を除いてその他は
、下記のとおり、分子ｆｉｔ７４．５ｋＤａに対して判
別されるタンパク質配列に適合している。前記以外のア
ミノ酸の記号は、Ｍｅｔ（メチオニン）とＴｈｒ（トレ
オニン）である。
第５図中、ｐＭｙｃｏ １ ６の制限マップ中では、遺
伝子は、長さ０．６ｋｂのＡｃｃｌ−Ａｓｕ Ｉ＋制限
断片内で開始し、０。４ｋｂのＮ互ｕ ＩＩＣｆＬａ
Ｉ、１．２ｋｂ ＣｕａＩ−Ｃｆｆａｌ、および１．
４ｋｂ Ｃｆｆｉａｌ−ＨｉｎｄＩＩＩの各断片内を
時計方向に延長して、Ｈ ｉ ｎｄｍの部位の短部で終
了する。
伝子は、長さ０．６ｋｂのＡｃｃｌ−Ａｓｕ Ｉ＋制限
断片内で開始し、０。４ｋｂのＮ互ｕ ＩＩＣｆＬａ
Ｉ、１．２ｋｂ ＣｕａＩ−Ｃｆｆａｌ、および１．
４ｋｂ Ｃｆｆｉａｌ−ＨｉｎｄＩＩＩの各断片内を
時計方向に延長して、Ｈ ｉ ｎｄｍの部位の短部で終
了する。
配列
実際のアミノ酸配列をさらに再分割した結果、３個の不
適合は、アミノ酸の特定が不明確だったためと考えらわ
る。
適合は、アミノ酸の特定が不明確だったためと考えらわ
る。
ρＭＹＣＯ ｌ ６からのＤＮＡは、大腸菌株ＣＹ１
５０００に形質転換さわた。転換体の１つを選択し、Ｏ
Ｄ，，。＝２へ３７℃でＬ肉汁中で生長させ、細胞は遠
心分離法によって採取された。細胞をＭ９緩衝溶液中で
再懸濁させ、汚染媒質成分のないように洗浄させ、再び
遠心分離して採取した。得らわた細胞ベレットを、０．
５ｍｇ／ｍｆｆｉの鶏卵白リゾチームの２５ｍＭＴｒｉ
ｓ ｐ ８８．０の１０ｍＭ ＥＤＴＡへの溶液
中で、原始培養体積の１５分の１で再懸濁させた。２５
℃で１０分間培養し、４℃で１５秒間超音波処理させた
。得られた溶解物の一部をポリアクリルアミトケルで電
気泳動させると、新たに４３ｋＤａのタンパク買か特定
された。
５０００に形質転換さわた。転換体の１つを選択し、Ｏ
Ｄ，，。＝２へ３７℃でＬ肉汁中で生長させ、細胞は遠
心分離法によって採取された。細胞をＭ９緩衝溶液中で
再懸濁させ、汚染媒質成分のないように洗浄させ、再び
遠心分離して採取した。得らわた細胞ベレットを、０．
５ｍｇ／ｍｆｆｉの鶏卵白リゾチームの２５ｍＭＴｒｉ
ｓ ｐ ８８．０の１０ｍＭ ＥＤＴＡへの溶液
中で、原始培養体積の１５分の１で再懸濁させた。２５
℃で１０分間培養し、４℃で１５秒間超音波処理させた
。得られた溶解物の一部をポリアクリルアミトケルで電
気泳動させると、新たに４３ｋＤａのタンパク買か特定
された。
このｐＭＹｃｏ １ ６の４３ｋＤａ発現生成物は、ウ
ェスタン・プロット分析によわば、７４．５ ｋ Ｄ
ａ ７ｋ５炎病原体抗原に対して培養されたマウス而清
に対して反応することが認められた。
ェスタン・プロット分析によわば、７４．５ ｋ Ｄ
ａ ７ｋ５炎病原体抗原に対して培養されたマウス而清
に対して反応することが認められた。
このｐＭＹｃｏ１ ６の４３ｋＤａの発現生成物は、ウ
ェスタン・プロット分析によれば、７４．５ｋＤａｌ｝
ｔｉ炎病原体抗体に対向して生起される家豚免疫血清に
対して反応することが認められた。
ェスタン・プロット分析によれば、７４．５ｋＤａｌ｝
ｔｉ炎病原体抗体に対向して生起される家豚免疫血清に
対して反応することが認められた。
大腸菌株ｃｙｉｓｏｏｏ形質転換体の１つを選び、１リ
ットルの培養汁中で３７℃で外径ＯＤ，，。＝２となる
まで生長させ、遠心分離によって細胞を採取した。Ｍ９
＆１衝液中で再懸濁させることにより、細胞を汚染培養
成分のないように洗浄し、再び遠心分離によって採取す
る。得られた細胞ベレットを、０．５ｍｇ／ｍｆｆｉの
鶏卵白リゾチーム（細菌溶解酵素）を２５ｍＭ Ｔｒ
ｉｓｐＨ８．０の１０ｍＭ ＥＤＴＡに溶解した溶液
の２０ｍｆｌ中に再懸濁させ、２５℃で１ｏ分間培養し
、２部分に分割し、各々を０℃で６０秒間振とうさせた
。１：？られた液体を、４℃で１０分間ｆ３，０００ｘ
ｇで遠心分離して、不溶の固形分を分離した。十分なｌ
（４．５２ｇ）の硫酸アンモニウムを加えて４０％上澄
液を５０％飽和まで到らしめ、遠心分離によって不溶の
タンパク質を採取し、ポリアクリルアミドケルを加えて
電気泳動させた。ウェスタン・プロット分析（前記の小
形家豚血清を使用する）によれば、４３ｋＤａのｐＭＹ
ｃＯ１６の発現生成物を含むことが認められた。濃縮し
た抗原分液を、ワクチンとしての使用前に、ＰＢＳに対
して透析した。
ットルの培養汁中で３７℃で外径ＯＤ，，。＝２となる
まで生長させ、遠心分離によって細胞を採取した。Ｍ９
＆１衝液中で再懸濁させることにより、細胞を汚染培養
成分のないように洗浄し、再び遠心分離によって採取す
る。得られた細胞ベレットを、０．５ｍｇ／ｍｆｆｉの
鶏卵白リゾチーム（細菌溶解酵素）を２５ｍＭ Ｔｒ
ｉｓｐＨ８．０の１０ｍＭ ＥＤＴＡに溶解した溶液
の２０ｍｆｌ中に再懸濁させ、２５℃で１ｏ分間培養し
、２部分に分割し、各々を０℃で６０秒間振とうさせた
。１：？られた液体を、４℃で１０分間ｆ３，０００ｘ
ｇで遠心分離して、不溶の固形分を分離した。十分なｌ
（４．５２ｇ）の硫酸アンモニウムを加えて４０％上澄
液を５０％飽和まで到らしめ、遠心分離によって不溶の
タンパク質を採取し、ポリアクリルアミドケルを加えて
電気泳動させた。ウェスタン・プロット分析（前記の小
形家豚血清を使用する）によれば、４３ｋＤａのｐＭＹ
ｃＯ１６の発現生成物を含むことが認められた。濃縮し
た抗原分液を、ワクチンとしての使用前に、ＰＢＳに対
して透析した。
（実Ｍｉ例２） ４１ｋＤａ
バタテリオファーシ・ラムダダッシュのＥｃｏＲ１κ制
限酵素）の腕が、ベクタークローン化装置（ストレイタ
ジン社製）によクて得られ、これを、濃度１００単位／
ｍＩ！．にあるＴ４リガーゼ（ＢＭＢ）を使用して、全
容積１０μ１中に２５μｇ ／ ｍ ｎの濃度にあるマ
イコブラズマの目標のＤＮＡに対して、２００μｇ ／
ｍ ｊ！の濃度で連結された。この連結反応は、常温
で２時間熟成された。連結体の４μ！を、ストレイタジ
ン社製の試験管内封入形キットｒギガバック」を使用し
て、ラムダ粒子内へ封入した。次にこのファージを、大
腸菌の菌株Ｐ２３９２ （ストレイタジン社製）上に滴
定し、７．７５ｘ１０５ｐｆｕ／ｍＪ２の量（ラムダダ
ッシュの３．ｔｘｔｏ５ｐｆｕ／μｇに相当する）が定
量された。
限酵素）の腕が、ベクタークローン化装置（ストレイタ
ジン社製）によクて得られ、これを、濃度１００単位／
ｍＩ！．にあるＴ４リガーゼ（ＢＭＢ）を使用して、全
容積１０μ１中に２５μｇ ／ ｍ ｎの濃度にあるマ
イコブラズマの目標のＤＮＡに対して、２００μｇ ／
ｍ ｊ！の濃度で連結された。この連結反応は、常温
で２時間熟成された。連結体の４μ！を、ストレイタジ
ン社製の試験管内封入形キットｒギガバック」を使用し
て、ラムダ粒子内へ封入した。次にこのファージを、大
腸菌の菌株Ｐ２３９２ （ストレイタジン社製）上に滴
定し、７．７５ｘ１０５ｐｆｕ／ｍＪ２の量（ラムダダ
ッシュの３．ｔｘｔｏ５ｐｆｕ／μｇに相当する）が定
量された。
オ１ゴヌクレオ ドプローブの
４１ｋＤａ肺炎病原体の既知の部分的アミノ酸配列を暗
号付けできるような、すべきの可能なＤＮＡ配列が確認
された。１７塩基対（ｂｐ）から成る２個所の配列も特
定された。２種の混成配列オリゴヌクレオチドブローブ
が、ＣＯＤ４４７とＣＯＤ４５５として合成された。下
表は、分子量４１キロダルトルの抗原遺伝子のスクリー
ニングライブラリーを示す。
号付けできるような、すべきの可能なＤＮＡ配列が確認
された。１７塩基対（ｂｐ）から成る２個所の配列も特
定された。２種の混成配列オリゴヌクレオチドブローブ
が、ＣＯＤ４４７とＣＯＤ４５５として合成された。下
表は、分子量４１キロダルトルの抗原遺伝子のスクリー
ニングライブラリーを示す。
−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−ＶａＩ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｎ−Ｉ Ｉｅ−Ｍｅｔ−八Ｉａ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−
Ｃｏｄ ４５５ Ｃｏｄ ４４
７Ｇ Ｇ ＧＴＴＴＡＴ
ＡＴ Ｔ１’Ｇｃ Ｔ八Ｃ Ｇ
ＴＡ ＡＡＧ （：ＧＡ ＧＧ ＣＡＧ
八Ｔｃ Ｇ（：八 八ＡＡ ＴＧＣ Ｃ
ＡＣＧアミノ酸および塩基の記号
は前記のものと同様である。
Ｇｌｎ−Ｉ Ｉｅ−Ｍｅｔ−八Ｉａ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−
Ｃｏｄ ４５５ Ｃｏｄ ４４
７Ｇ Ｇ ＧＴＴＴＡＴ
ＡＴ Ｔ１’Ｇｃ Ｔ八Ｃ Ｇ
ＴＡ ＡＡＧ （：ＧＡ ＧＧ ＣＡＧ
八Ｔｃ Ｇ（：八 八ＡＡ ＴＧＣ Ｃ
ＡＣＧアミノ酸および塩基の記号
は前記のものと同様である。
前記実施例１のライブラリーを、５枚のベトリ板上にあ
って、１３５ｍＭベトリ板当り２０００ｐｆｕの濃度の
大腸菌株ＬＥ３９２の上に載置した。各ベトリ板から２
個のニトロセルロースフィルタを持上げ、Ｗ．Ｄ．ベン
トンおよびＲ．Ｗ．デービス（ｉ工玉２ヌ誌、１９７７
年１９６ １種０に記載）の方法によって処理した。
って、１３５ｍＭベトリ板当り２０００ｐｆｕの濃度の
大腸菌株ＬＥ３９２の上に載置した。各ベトリ板から２
個のニトロセルロースフィルタを持上げ、Ｗ．Ｄ．ベン
トンおよびＲ．Ｗ．デービス（ｉ工玉２ヌ誌、１９７７
年１９６ １種０に記載）の方法によって処理した。
フィルタをＩ２燥したのち、０．９ＭＮａｃｕ、９０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｆｔ，ｐＨ７．５の６ｍＭ Ｅ
ＤＴＡより成る溶液中で再び湿潤させた。
Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｆｔ，ｐＨ７．５の６ｍＭ Ｅ
ＤＴＡより成る溶液中で再び湿潤させた。
これらのフィルタを袋に納め、２．５ｍｕの予備異種交
配用溶液フィルタを追加した。
配用溶液フィルタを追加した。
この予備交配用／異種交配用溶液の組成は、（ｍＭはミ
リモル） ６ＸＮＥＴ ５ｘデンハルッ ０．１ｍＭ ｒＡＴＰ（アデノシンミリン酸）１．
０ｍＭ ＮａＰＰｉ １０．０ｍＭでｐＨ７．５の硫酸ナトリウム０．２％
ＳＤＳ ０．１ｍｇ／ｍｊ２の超音波処理した鮭精液のＤＮＡ ２ ５ ０ ｕ ｇ ／ ｍ ＩＩ．の大腸菌の転移
ＲＮＡ異種交配の予備操作は、３７℃で２局時間行った
。次に予備交配用溶液を、袋から流下させ、各袋毎に３
ｍｌｌの第２の予備交配用溶液を添加した。第２の溶液
は、第１の溶液と同一成分の他に、１００ｍｇ／ｍｆＬ
のラムダｇｔｌｌ ＤＮＡの１ｍｆｔと、３６２μｇ
／ｍＪ２の大腸菌ＤＮＡの５ｍＩｌとを、５０ｍｊ２当
りに追加したものである。両方のＤＮＡを、大きさ５０
０ｂｐ以下になるまで超音波処理し、１０分間煮沸し、
使用直前に急冷した。フィルタを、この溶液中で３７℃
で２％時間予備処理を行った。
リモル） ６ＸＮＥＴ ５ｘデンハルッ ０．１ｍＭ ｒＡＴＰ（アデノシンミリン酸）１．
０ｍＭ ＮａＰＰｉ １０．０ｍＭでｐＨ７．５の硫酸ナトリウム０．２％
ＳＤＳ ０．１ｍｇ／ｍｊ２の超音波処理した鮭精液のＤＮＡ ２ ５ ０ ｕ ｇ ／ ｍ ＩＩ．の大腸菌の転移
ＲＮＡ異種交配の予備操作は、３７℃で２局時間行った
。次に予備交配用溶液を、袋から流下させ、各袋毎に３
ｍｌｌの第２の予備交配用溶液を添加した。第２の溶液
は、第１の溶液と同一成分の他に、１００ｍｇ／ｍｆＬ
のラムダｇｔｌｌ ＤＮＡの１ｍｆｔと、３６２μｇ
／ｍＪ２の大腸菌ＤＮＡの５ｍＩｌとを、５０ｍｊ２当
りに追加したものである。両方のＤＮＡを、大きさ５０
０ｂｐ以下になるまで超音波処理し、１０分間煮沸し、
使用直前に急冷した。フィルタを、この溶液中で３７℃
で２％時間予備処理を行った。
ブローブを下記によって活性化した。即ち、１種．５μ
Ｉｌ（マイクロリットル）の”ｐ−ＡＴＰ（７０００Ｃ
ｉ／ｍＭｏｊ２ｅ）を使用した２．４μｕのＣＯＤ４４
７ （２．０００／ｍｌ１）が、あルイは４９．Ｏμｆ
（７）ｐ−ＡＴＰ （７０００Ｃｉ／ｍＭｏｕｅ）を使
用した６．５μｕのＣＯＤ４５５（２、Ｏ Ｏ Ｄ ／
ｍ ４２を含む）を、２０単位のＴ４付活素（ベーリ
ンガー社製）を含有する８０μ１の反応混成液中に混入
させた。
Ｉｌ（マイクロリットル）の”ｐ−ＡＴＰ（７０００Ｃ
ｉ／ｍＭｏｊ２ｅ）を使用した２．４μｕのＣＯＤ４４
７ （２．０００／ｍｌ１）が、あルイは４９．Ｏμｆ
（７）ｐ−ＡＴＰ （７０００Ｃｉ／ｍＭｏｕｅ）を使
用した６．５μｕのＣＯＤ４５５（２、Ｏ Ｏ Ｄ ／
ｍ ４２を含む）を、２０単位のＴ４付活素（ベーリ
ンガー社製）を含有する８０μ１の反応混成液中に混入
させた。
付活性化した各ブローブに、１ ０ｍｊ２の予備交配用
溶液を添加した。袋から予備交配溶液を流下除去し、ブ
ローブを含む交配用溶液を、各フィルタ当りに約２ｍｌ
ｌ’ｆ３加した。これらを１晩（約１６時間）３７℃で
培養させた。
溶液を添加した。袋から予備交配溶液を流下除去し、ブ
ローブを含む交配用溶液を、各フィルタ当りに約２ｍｌ
ｌ’ｆ３加した。これらを１晩（約１６時間）３７℃で
培養させた。
各フィルタを１リットル６Ｘ ＳＳＣ中で１０分間ず
つ室温で４回洗浄したのち、１００＋ｎｌ２の３Ｍ塩化
４メチルアンモニウムと、５０ｍＭトリスＨｃ２でｐＨ
８．０とし、２ｍＭのＥＤＴＡと、１ ｍ ｇ ／ ｍ
ｆｌのＳＤＳ （ＴＭＡＣ）（ＤＮＡ誌、８２、１５
８５〜１５８８頁による）とを添加した混液中で室温で
１０分間ずつ４回洗浄した。次に各フィルタを、４００
ｒｒ＋４２ＴＭＡＣ中で、５０℃で１０分間洗浄した。
つ室温で４回洗浄したのち、１００＋ｎｌ２の３Ｍ塩化
４メチルアンモニウムと、５０ｍＭトリスＨｃ２でｐＨ
８．０とし、２ｍＭのＥＤＴＡと、１ ｍ ｇ ／ ｍ
ｆｌのＳＤＳ （ＴＭＡＣ）（ＤＮＡ誌、８２、１５
８５〜１５８８頁による）とを添加した混液中で室温で
１０分間ずつ４回洗浄した。次に各フィルタを、４００
ｒｒ＋４２ＴＭＡＣ中で、５０℃で１０分間洗浄した。
フィルタをサランラップで包み（最初はフィルタを乾燥
させないため）．−ＳＯ℃で２重強化スクリーンによっ
て１晩コダックＸＡＲ５に露出させた。ＣＯＤ４５５と
ＣＯＤ４４７の両者に対して異種交配を示す適切な溶菌
斑を摘出し、ＤＮＡを調製した。このＤＮＡを酵素Ｅｃ
ｏＲ１で培養し、２個の１％寒天ゲル上で電気泳動処理
を行った。このゲルをサザン式プロット法で検出した。
させないため）．−ＳＯ℃で２重強化スクリーンによっ
て１晩コダックＸＡＲ５に露出させた。ＣＯＤ４５５と
ＣＯＤ４４７の両者に対して異種交配を示す適切な溶菌
斑を摘出し、ＤＮＡを調製した。このＤＮＡを酵素Ｅｃ
ｏＲ１で培養し、２個の１％寒天ゲル上で電気泳動処理
を行った。このゲルをサザン式プロット法で検出した。
このサザン・プロットは、ＣＯＤ４４７またはＣＯＤ４
５ ５に対して異種交配された。こねによって、２種
のファージが、ＣＯＤ４４７とＣＯＤ４５５の両者に対
して交配した２．５ｋｂρ（キロ塩基対）の酵素Ｅｃｏ
Ｒ１の断片を含むことが確認さわた。
５ ５に対して異種交配された。こねによって、２種
のファージが、ＣＯＤ４４７とＣＯＤ４５５の両者に対
して交配した２．５ｋｂρ（キロ塩基対）の酵素Ｅｃｏ
Ｒ１の断片を含むことが確認さわた。
これらのファージを、ラムダマイコ１とラムダマイコ２
と命名した。
と命名した。
ラムダマイコ１とラムダマイコ２の大形ＤＮＡの調製は
、山本、Ｋ．Ｒ．他による文献（１９７０年１Ｌ土λヱ
ｊｊ４０の７３４頁）によって行った。ラムダヱニＣ三
」エからのＤＮＡを酵素葺ｏＲ１て培養し、ＥｃｏＲｌ
で培養したベクターｐＵｃ９に連結させ、大腸菌株ＪＭ
８３に転換させた。形質転換体の１種をｐＭＹｃＯ１
（第１図）と命名し、そのＤＮＡを調製して、種々の制
限酵素によって培養させて、第１図の制限マップが得ら
ねた。ラムダ′：ＬＬ２１とｐＭＹｃＯ１との制限マッ
プを比較することにより、ｐＭＹｃｏ ｌ中のマイコブ
ラズマの付加された、長さ１．０ｋｂのＥｃｏＲ１酵素
の断片は、実際は、ケノム内の長さ２．５ｋｂのＥｃｏ
Ｒ１酵素の断片の近傍にはないことが判明した。
、山本、Ｋ．Ｒ．他による文献（１９７０年１Ｌ土λヱ
ｊｊ４０の７３４頁）によって行った。ラムダヱニＣ三
」エからのＤＮＡを酵素葺ｏＲ１て培養し、ＥｃｏＲｌ
で培養したベクターｐＵｃ９に連結させ、大腸菌株ＪＭ
８３に転換させた。形質転換体の１種をｐＭＹｃＯ１
（第１図）と命名し、そのＤＮＡを調製して、種々の制
限酵素によって培養させて、第１図の制限マップが得ら
ねた。ラムダ′：ＬＬ２１とｐＭＹｃＯ１との制限マッ
プを比較することにより、ｐＭＹｃｏ ｌ中のマイコブ
ラズマの付加された、長さ１．０ｋｂのＥｃｏＲ１酵素
の断片は、実際は、ケノム内の長さ２．５ｋｂのＥｃｏ
Ｒ１酵素の断片の近傍にはないことが判明した。
ＣＯＤ４５５とＣＯＤ４４７は、サザン式プロット分析
により、ρＭＹＣＯＩの長さ０．２ｋｂの酵素Ｘｈｏ
Ｉ −Ｈ ｉ ｎｄＩＩｌの制限断片へ異種連結された
ことか判明した。ＤＮＡ配列分析に対して、長さ０．２
ｋｂの酵素瓦立且■一焦工１ｄＩ［Ｉを２次分甥増殖さ
せるために、ｐＭＹｃｏ１からのＤＮＡをＸｈｏ Ｉと
Ｈ ｉ ｎｄｌＩ［で培養し、長さ０．２ｋｂの断片を
鯖製し、ＸｈｏｌとＨｉｎｄｎＴで培養されたヘクター
ｐＷＨ１４８に連結させて、大１揚菌株ＪＭ８３に形質
転換させた。転換体の１種をｐＭＹｃＯ４ （第２図）
と命名し、そのＤＮＡを調製して、ＸｈｏｌとＨ ｉ
ｎｄＩＩＩで培養し、第２図の制限マップが得られた。
により、ρＭＹＣＯＩの長さ０．２ｋｂの酵素Ｘｈｏ
Ｉ −Ｈ ｉ ｎｄＩＩｌの制限断片へ異種連結された
ことか判明した。ＤＮＡ配列分析に対して、長さ０．２
ｋｂの酵素瓦立且■一焦工１ｄＩ［Ｉを２次分甥増殖さ
せるために、ｐＭＹｃｏ１からのＤＮＡをＸｈｏ Ｉと
Ｈ ｉ ｎｄｌＩ［で培養し、長さ０．２ｋｂの断片を
鯖製し、ＸｈｏｌとＨｉｎｄｎＴで培養されたヘクター
ｐＷＨ１４８に連結させて、大１揚菌株ＪＭ８３に形質
転換させた。転換体の１種をｐＭＹｃＯ４ （第２図）
と命名し、そのＤＮＡを調製して、ＸｈｏｌとＨ ｉ
ｎｄＩＩＩで培養し、第２図の制限マップが得られた。
長さ０．２ｋｂの断片のＤＮＡ配列を分析して、それが
１）ＣＯＤ４５５とＣＯＤ４４７と相同性のある部分を
含むこと、および２）このＤＮＡ配列から予ｉ１＋１さ
れるアミノ酸は，その３種を除いた他のすへてが、４１
ｋＤａ抗原に対して認められるタンパク質配列に一致す
ることが判明した。これを下記に示す。
１）ＣＯＤ４５５とＣＯＤ４４７と相同性のある部分を
含むこと、および２）このＤＮＡ配列から予ｉ１＋１さ
れるアミノ酸は，その３種を除いた他のすへてが、４１
ｋＤａ抗原に対して認められるタンパク質配列に一致す
ることが判明した。これを下記に示す。
実際のアミノ酸配列を改めて分析して分ったことは、３
個所に不適合があり、これはアミノ酸の特定が不明確な
ためと推定された。
個所に不適合があり、これはアミノ酸の特定が不明確な
ためと推定された。
ラムダマイコ−１の制限マップ（図示せず）の部分を分
析した結果、長さ０．２ｋｂのＸｈｏ１ −Ｈ ｉ ｎ
ｄｍの断片が、マイコブラズマＤＮＡラムダベクターの
接続点の１つから約１．５ｋｂの位置にあることが分フ
た。すべての遣伝子を分離増殖するために、ラムダ立Ｌ
ユニュＤ Ｎ ＡをＸ九且■とＫ上１Ｉによって培養し
、Ｘｈｏｌとムｈｎｌで増殖されたベクターｐＷＨＡ１
４８に接合して、大腸菌株ＪＭ８３に形質転換させた。
析した結果、長さ０．２ｋｂのＸｈｏ１ −Ｈ ｉ ｎ
ｄｍの断片が、マイコブラズマＤＮＡラムダベクターの
接続点の１つから約１．５ｋｂの位置にあることが分フ
た。すべての遣伝子を分離増殖するために、ラムダ立Ｌ
ユニュＤ Ｎ ＡをＸ九且■とＫ上１Ｉによって培養し
、Ｘｈｏｌとムｈｎｌで増殖されたベクターｐＷＨＡ１
４８に接合して、大腸菌株ＪＭ８３に形質転換させた。
その１種をｐＭＹｃＯ１ ５ （第３図）と命名し、そ
のＤＮＡを調製して、若干の異なる制限酵素で培五し、
第３図の制限マップか得られた。
のＤＮＡを調製して、若干の異なる制限酵素で培五し、
第３図の制限マップか得られた。
転換体ｐＭＹｃ０１５のマイコブラズマＤＮＡの部分の
ＤＮＡ配列を分析した結果，全長４１ｋＤａの抗原遺伝
子が含まれることが分った。
ＤＮＡ配列を分析した結果，全長４１ｋＤａの抗原遺伝
子が含まれることが分った。
ｐＭＹｃＯ１５の制限マップ上で、遺伝子は、長さ０、
２ｋｂのＸｈｏｌ−Ｈｉｎｄｍの断片内に始まって、時
計方向に０．５ｋｂのＨｉｎｄＩ［Ｉ−ＥｃｏＲ１と１
．２ｋｂのＥｃｏＲＩの各断片内をまわり、ＥｃｏＲ１
部位の０．８ｋｂ手前で終っている。遺伝子のＤＮＡ配
列から求められたアミノ酸配列は、第１４図のとおりで
ある。
２ｋｂのＸｈｏｌ−Ｈｉｎｄｍの断片内に始まって、時
計方向に０．５ｋｂのＨｉｎｄＩ［Ｉ−ＥｃｏＲ１と１
．２ｋｂのＥｃｏＲＩの各断片内をまわり、ＥｃｏＲ１
部位の０．８ｋｂ手前で終っている。遺伝子のＤＮＡ配
列から求められたアミノ酸配列は、第１４図のとおりで
ある。
分子量４ １ ｋＤａ抗原のＤＮＡ配列は、暗号付け配
列内に１４個のＴＧＡコドンが存在することを示した。
列内に１４個のＴＧＡコドンが存在することを示した。
ＴＧＡコドンは、マイコブラズマ中のアミノ酸トリプト
ファンを特定するが、通常、大１！！菌内のタンパク貿
釦の伸長を終了させ、従って大腸菌内における４１ｋＤ
ａ抗原の発現の結果、遺伝子で暗号付けされたべブチド
から、第ｌのＴＧＡで暗号付与されたトリプトファンま
でを発原することが判明している。この４１ｋＤａ抗原
の断片の発現を増大させるために、ｐＭＹｃＯ１（第１
図）を、酵素ＨｉｎｄＩＩ［で培養し、長さ１．３ｋｂ
のＨ ｉ ｎｄｌｌ＋の断片を精製して、旦ｉエｎｄｌ
Ｉｌで培養させたｐＭＹｃＯ４ （第２図）に接合させ
、大腸菌株ＪＭ８３に転換させた。転換体の１種をρＭ
ＹＣＯ８ （第４図）と命名し、そのＤＮＡを調製して
、若干の酵素で培養し、第４図の制限マップが得られた
。
ファンを特定するが、通常、大１！！菌内のタンパク貿
釦の伸長を終了させ、従って大腸菌内における４１ｋＤ
ａ抗原の発現の結果、遺伝子で暗号付けされたべブチド
から、第ｌのＴＧＡで暗号付与されたトリプトファンま
でを発原することが判明している。この４１ｋＤａ抗原
の断片の発現を増大させるために、ｐＭＹｃＯ１（第１
図）を、酵素ＨｉｎｄＩＩ［で培養し、長さ１．３ｋｂ
のＨ ｉ ｎｄｌｌ＋の断片を精製して、旦ｉエｎｄｌ
Ｉｌで培養させたｐＭＹｃＯ４ （第２図）に接合させ
、大腸菌株ＪＭ８３に転換させた。転換体の１種をρＭ
ＹＣＯ８ （第４図）と命名し、そのＤＮＡを調製して
、若干の酵素で培養し、第４図の制限マップが得られた
。
長さ０．２ｋｂのＸｈｏ Ｉ−Ｈ ｉ ｎｄＩ［［断片
内にある、４１ｋＤａ開始メチオニンは、ベクターｐＷ
ＨＡ １ ４８内にある１久Σニスブロモータから約０
．２ｋｂの距趙にある。ＴＧＡ終止コドンは、長さ０．
５ｋｂのＨｉｎｄｍ−ＥｃｏＲ１断片内に存在する。
内にある、４１ｋＤａ開始メチオニンは、ベクターｐＷ
ＨＡ １ ４８内にある１久Σニスブロモータから約０
．２ｋｂの距趙にある。ＴＧＡ終止コドンは、長さ０．
５ｋｂのＨｉｎｄｍ−ＥｃｏＲ１断片内に存在する。
ｐＭＹｃＯ８からのＤＮＡは、大腸菌株ＣＹ１ ５００
０に形質転換された。転換体の１種を選択し、Ｌ一肉汁
中で３７℃でＯ Ｄ ５ｓｏ ＝ ２となるまで成長さ
せ、遠心分離によって細胞を採取した。Ｍ９緩衝液中で
再懸濁させることにより、汚染物質のないように細胞を
洗浄し、再び遠心分離して採取した。０．５ｍｇ／ｍｌ
の鶏卵白リゾチームを、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ
８．０とした１０ｍＭのＥＤＴＡ液中に溶解した溶液中
に、採取された転換体のセルペレットを、最初の培養体
積のｌ５分の１で再懸濁させ、４℃で１５秒間超音波処
理する。得られた液体を、ポリアクリルアミドゲルの電
気泳動で処理し、新たに１４ｋＤａのタンパク質が確認
された。このタンパク質は、第１のＴＧＡコドンまでの
遺伝子で暗号付けされたベプチドから成る４１ｋＤａの
抗原の断片についての予測された分子量を有するもので
ある。
０に形質転換された。転換体の１種を選択し、Ｌ一肉汁
中で３７℃でＯ Ｄ ５ｓｏ ＝ ２となるまで成長さ
せ、遠心分離によって細胞を採取した。Ｍ９緩衝液中で
再懸濁させることにより、汚染物質のないように細胞を
洗浄し、再び遠心分離して採取した。０．５ｍｇ／ｍｌ
の鶏卵白リゾチームを、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ
８．０とした１０ｍＭのＥＤＴＡ液中に溶解した溶液中
に、採取された転換体のセルペレットを、最初の培養体
積のｌ５分の１で再懸濁させ、４℃で１５秒間超音波処
理する。得られた液体を、ポリアクリルアミドゲルの電
気泳動で処理し、新たに１４ｋＤａのタンパク質が確認
された。このタンパク質は、第１のＴＧＡコドンまでの
遺伝子で暗号付けされたベプチドから成る４１ｋＤａの
抗原の断片についての予測された分子量を有するもので
ある。
ＤＢＡ／２のマウスを、肺炎病原体から分離された、２
０マイクログラムの電気泳動で精製した４１ｋＤａの抗
原を完全フロイント免疫助成剤に入れたもので、免疫性
を付与した。
０マイクログラムの電気泳動で精製した４１ｋＤａの抗
原を完全フロイント免疫助成剤に入れたもので、免疫性
を付与した。
最初の注射の２週間後に、完全フロイント免疫助成剤中
で、補助注射を行った。肺炎病原体の全タンパク質のウ
ェスタン法プロット分析により、免疫血清が、１００分
の１希釈において、特異的に４１ｋＤａ抗原と反応する
ことが判明した。この転換体ｐＭＹｃＯ８の１４ｋＤａ
発現生成物は、ウェスタン法プロット分析により、４１
ｋＤａＪｉｉ炎マイコプラズマ抗原に対して作成された
マウス免疫血清と反応することが判明した。
で、補助注射を行った。肺炎病原体の全タンパク質のウ
ェスタン法プロット分析により、免疫血清が、１００分
の１希釈において、特異的に４１ｋＤａ抗原と反応する
ことが判明した。この転換体ｐＭＹｃＯ８の１４ｋＤａ
発現生成物は、ウェスタン法プロット分析により、４１
ｋＤａＪｉｉ炎マイコプラズマ抗原に対して作成された
マウス免疫血清と反応することが判明した。
（実施例３）
以下、肺炎病原体の全長が分子量で７４．５ｋＤａの抗
原の大腸菌内における発現について説明する。
原の大腸菌内における発現について説明する。
第５図のｐＭＹｃｏ１ ６ＤＮＡは、酵素戊立且１で培
養され、豆科の植物の核酸分解酵素で処理して、単一鎖
構造のＡｃｃｌ尾端を除去し、リカーセ処理して、７４
．５ｋＤａ抗原遺伝子の前面にある長さ１．９ｋｂのＡ
ＣＣＩ断片を除去して、大腸菌株ＪＭ８３の内部に形質
転換させたものである。この転換体の１種をｐＭＹｃＯ
２９と命名し、そのＤＮＡを、多数の制限酵素で培養し
て、第８図の制限マップが得られた。
養され、豆科の植物の核酸分解酵素で処理して、単一鎖
構造のＡｃｃｌ尾端を除去し、リカーセ処理して、７４
．５ｋＤａ抗原遺伝子の前面にある長さ１．９ｋｂのＡ
ＣＣＩ断片を除去して、大腸菌株ＪＭ８３の内部に形質
転換させたものである。この転換体の１種をｐＭＹｃＯ
２９と命名し、そのＤＮＡを、多数の制限酵素で培養し
て、第８図の制限マップが得られた。
このｐＭＹｃＯ２９のＤＮＡ配列を分析した結果によれ
ば、自然的欠失が、リガーゼ接合部位に存在し、２個の
塩基が欠失さわており、Ｐｓｔ■部位は保持され、下記
のとおりである。但し、５′から３′までのｊｎ状構造
のみを図示した。
ば、自然的欠失が、リガーゼ接合部位に存在し、２個の
塩基が欠失さわており、Ｐｓｔ■部位は保持され、下記
のとおりである。但し、５′から３′までのｊｎ状構造
のみを図示した。
配列
Ｐｓｔｌ
観測された ＴＴＧＣＡＴＧ（；ＣＴＧＣＡＧＧＣＴＴ
ＴＣＴＴＴＴＧＴＣＴ配列 Ｐｓｔｌ ｐＭＹｃＯ２９のマイコブラズマ挿入は、ｐＷＨＡｉ４
８のラク１−−ス（Ｌａｃ）ブａモータがら遠い位置に
あるので、遺伝子を他の発現ヘクターであるＰＵＣ９に
挿入することか必要と考えらわた。２個の塩基の欠失に
よって、分子量７４．５ｋＤａの抗原に対する遺伝子は
、大腸菌のヘクターｐＵＣ９のベータガラクトシダーセ
遺伝子と同様な読取り粋に置かせることが可能となった
。
ＴＣＴＴＴＴＧＴＣＴ配列 Ｐｓｔｌ ｐＭＹｃＯ２９のマイコブラズマ挿入は、ｐＷＨＡｉ４
８のラク１−−ス（Ｌａｃ）ブａモータがら遠い位置に
あるので、遺伝子を他の発現ヘクターであるＰＵＣ９に
挿入することか必要と考えらわた。２個の塩基の欠失に
よって、分子量７４．５ｋＤａの抗原に対する遺伝子は
、大腸菌のヘクターｐＵＣ９のベータガラクトシダーセ
遺伝子と同様な読取り粋に置かせることが可能となった
。
この構造を完成するために、ｐＭＹｃＯ２９のＤＮＡを
、ＰｓｔｌとＥｃｏＲ１で培養し、７４．５ｋＤａの全
体の暗号配列を含むＰｓｔｌＥｃｏＲ１断片を精製し、
ＰｓｔｌとＥｃｏＲ１で培養さわたヘクターｐＵｃ９に
接合させて、大腸菌株ＪＭ８３へ形質転換させた。この
転換体の１種をｐＭＹｃＯ３ １と命名し，そのＤＮＡ
を調製したのち、実施例１の転換手法により、大腸菌株
ＣＹ１５０００中へ形質転換させた。
、ＰｓｔｌとＥｃｏＲ１で培養し、７４．５ｋＤａの全
体の暗号配列を含むＰｓｔｌＥｃｏＲ１断片を精製し、
ＰｓｔｌとＥｃｏＲ１で培養さわたヘクターｐＵｃ９に
接合させて、大腸菌株ＪＭ８３へ形質転換させた。この
転換体の１種をｐＭＹｃＯ３ １と命名し，そのＤＮＡ
を調製したのち、実施例１の転換手法により、大腸菌株
ＣＹ１５０００中へ形質転換させた。
ブラスミト ＭＹＣＯ３２の
ブラスミトｐｃＡＭ１０１を、コロラト州ボウルダのコ
ロラト大学のジェームス・カラン氏から購入した。これ
は、第１０図に示すとおり、トリプトファンＴ１７６遺
伝子の好適な根源として利用できる，ｐｃＡＭ１０ｊか
らのＤＮＡを、酵素ＥｃｏＲ１で培養し、トリプトファ
ンＴ１７６遺伝子を含む長さ０．３ｋｂのＥｃｏＲ１断
片を錆製し、ＥｃｏＲ１で培養したｐＭＹｃＯ３ １に
接合させて、大腸菌株ＣＹ１５０００中へ形質転換させ
た。この転換体の１種をブラスミドｐＭＹＣ０３２と命
名し、その制限マップを第１１図に示す。
ロラト大学のジェームス・カラン氏から購入した。これ
は、第１０図に示すとおり、トリプトファンＴ１７６遺
伝子の好適な根源として利用できる，ｐｃＡＭ１０ｊか
らのＤＮＡを、酵素ＥｃｏＲ１で培養し、トリプトファ
ンＴ１７６遺伝子を含む長さ０．３ｋｂのＥｃｏＲ１断
片を錆製し、ＥｃｏＲ１で培養したｐＭＹｃＯ３ １に
接合させて、大腸菌株ＣＹ１５０００中へ形質転換させ
た。この転換体の１種をブラスミドｐＭＹＣ０３２と命
名し、その制限マップを第１１図に示す。
ＣＹＩ ５０００ （ｐＭＹｃＯ３２）形質転換体の１
８ｉを選択し、し−肉汁で成長させ、前記同様に液体
資料を調製して、その一部をベリアクリルアミドゲル中
で電気泳動処理を行った。ゲル７Ｅ気泳動分別により、
新たに分子量７５ｋＤａと４３ｋ． Ｄ ａのタンパク
質が特定されそれぞれが犬腸菌タンパク質の約５％およ
び０．１％であった。ｐＭＹＣＯ３２の７５ｋＤａタン
パク貿は、ウエスタン法プロット分析により、前述の７
４．５ｋＤａ肺炎病原体抗原に対して作成さわた家豚の
免疫血清に対して反応することが認められた。
８ｉを選択し、し−肉汁で成長させ、前記同様に液体
資料を調製して、その一部をベリアクリルアミドゲル中
で電気泳動処理を行った。ゲル７Ｅ気泳動分別により、
新たに分子量７５ｋＤａと４３ｋ． Ｄ ａのタンパク
質が特定されそれぞれが犬腸菌タンパク質の約５％およ
び０．１％であった。ｐＭＹＣＯ３２の７５ｋＤａタン
パク貿は、ウエスタン法プロット分析により、前述の７
４．５ｋＤａ肺炎病原体抗原に対して作成さわた家豚の
免疫血清に対して反応することが認められた。
（実施例４）
以下、１ｋｊ炎マイコブラズマの分子ｒｉｔ７４．５ｋ
Ｄａの抗原のワクチンとしての使用について説明する。
Ｄａの抗原のワクチンとしての使用について説明する。
ＣＹＩ ５０００ （ｐＭＹｃＯ３２）形質転換体の１
種を実施例３から選択し、１４リットルのシェマップ培
養器内のＭ−９緩衝液の最少”ｑｌ− ４＋で、細胞密
度か１１００．Ｄ．となるので成長させた。遠心分離に
より、５００ｒｒ＋Ｉｌから、６００ｇおよび１２０ｇ
（湿潤重量）の細胞を採取した。１ ２ｍＭのＥＤＴＡ
と０．５ｍｇ／ｍｆｆのりゾチームを含むＰＢＳの１０
ｍ！当りに、２．３ｇの細迦より成る懸濁液を作成した
。懸濁液を２５℃で１５分間熟成させ、３０秒バースト
して２分間氷−トで超音波処理し、４℃において１０分
間１３，０００，ｇの加速度で遠心分離させ、溶液分画
を生成分として得た。生成物の一部をポリアクリルアミ
ドゲル中で電気泳動処理した。町溶性タンパク質の約２
５％から作成された遺伝子組換え形の７４．５ｋＤａ抗
原と、生成物中の７４．５ｋＤａ抗原の量に基づく投与
薬を、ＰＢＳ中で１投与量当り２００μｇと１０００Ａ
ｔｇを作成し、家豚に投与する直前に、フロイント社の
未完成助成剤（シグマ社製）の等容積で氷上で乳化させ
た。
種を実施例３から選択し、１４リットルのシェマップ培
養器内のＭ−９緩衝液の最少”ｑｌ− ４＋で、細胞密
度か１１００．Ｄ．となるので成長させた。遠心分離に
より、５００ｒｒ＋Ｉｌから、６００ｇおよび１２０ｇ
（湿潤重量）の細胞を採取した。１ ２ｍＭのＥＤＴＡ
と０．５ｍｇ／ｍｆｆのりゾチームを含むＰＢＳの１０
ｍ！当りに、２．３ｇの細迦より成る懸濁液を作成した
。懸濁液を２５℃で１５分間熟成させ、３０秒バースト
して２分間氷−トで超音波処理し、４℃において１０分
間１３，０００，ｇの加速度で遠心分離させ、溶液分画
を生成分として得た。生成物の一部をポリアクリルアミ
ドゲル中で電気泳動処理した。町溶性タンパク質の約２
５％から作成された遺伝子組換え形の７４．５ｋＤａ抗
原と、生成物中の７４．５ｋＤａ抗原の量に基づく投与
薬を、ＰＢＳ中で１投与量当り２００μｇと１０００Ａ
ｔｇを作成し、家豚に投与する直前に、フロイント社の
未完成助成剤（シグマ社製）の等容積で氷上で乳化させ
た。
ワクチン試験
第０週 ハンブシャイア種、ハンプシャイアＸデュロッ
クの混種およびヨーク種の３腹の仔豚（無菌飼育区より
入手） 第１週 ランダムに７群の投薬群に分割し、各群毎に足
の皮下にワクチン接種 第３週 上記同様で、反対側の脚に補助ワクチン接種 第８週 １０６ＣＣＵの肺炎マイコプラズマ病原体の経
気管注射により抗原投与 第１２週 供試仔豚の解剖検査の感染制御結果は下記の
とおりであった。
クの混種およびヨーク種の３腹の仔豚（無菌飼育区より
入手） 第１週 ランダムに７群の投薬群に分割し、各群毎に足
の皮下にワクチン接種 第３週 上記同様で、反対側の脚に補助ワクチン接種 第８週 １０６ＣＣＵの肺炎マイコプラズマ病原体の経
気管注射により抗原投与 第１２週 供試仔豚の解剖検査の感染制御結果は下記の
とおりであった。
グル〜ブ 発生＊ 軽重度＊＊制御
５／５ １２．４±４．７１００μｇ ７４．５
ｋＤａ抗原 １／４ ４．２±４．９２００μ
ｇ組換え形 ２／６ ９．７±１１．７７
４．５ｋＤａ抗原 １０００μｇ組換え形 ４／４ ２５．Ｏ
ｆ： ６．１７４．５ｋＤａ抗原 ＊５％以上の肺部病巣のある仔豚の数 ＊＊損傷を受けた師の表面（平均士標準偏差）（実施例
５） Ｉｊ［ｉ炎マイコブラズマ病原体の分子ｉ ３ ６ ｋ
Ｄ ａの抗体の大腸菌内における発現について説明す
る。
５／５ １２．４±４．７１００μｇ ７４．５
ｋＤａ抗原 １／４ ４．２±４．９２００μ
ｇ組換え形 ２／６ ９．７±１１．７７
４．５ｋＤａ抗原 １０００μｇ組換え形 ４／４ ２５．Ｏ
ｆ： ６．１７４．５ｋＤａ抗原 ＊５％以上の肺部病巣のある仔豚の数 ＊＊損傷を受けた師の表面（平均士標準偏差）（実施例
５） Ｉｊ［ｉ炎マイコブラズマ病原体の分子ｉ ３ ６ ｋ
Ｄ ａの抗体の大腸菌内における発現について説明す
る。
ラムダマイコ−１（実施例２）から得られた副コロニー
のＤＮＡ配列の分析の結果、長さ１．２ｋｂのＥｃｏＲ
１−ＥＣＯＲＩの断片は、３６ｋＤａ抗原の暗号配列の
位置部分に相当する開いた読取り粋を含んでいる。肺炎
病原体から精製された真正の３６ｋＤａ抗原に対して得
られたアミノ酸配列と、この開いた読取り枠から推論さ
れるアミノ酸配列とを比較して次の表か得られた。
のＤＮＡ配列の分析の結果、長さ１．２ｋｂのＥｃｏＲ
１−ＥＣＯＲＩの断片は、３６ｋＤａ抗原の暗号配列の
位置部分に相当する開いた読取り粋を含んでいる。肺炎
病原体から精製された真正の３６ｋＤａ抗原に対して得
られたアミノ酸配列と、この開いた読取り枠から推論さ
れるアミノ酸配列とを比較して次の表か得られた。
すへての遺伝子を分離増殖するために、第３図のｐＭＹ
ｃｏ １ ５をＬ互上ＩとＨｉｎｄｌＩ［で培養し、Ｈ
ｉｎｄｌＩＩとＳｍａ Ｉで培養されたベクターのｐＵ
ｃ９ （ＴＧＡサンブレッサを欠くベクター）とｐＷＨ
Ａ １ ６０ （ＴＧＡサンプレッサを有するベクター
）に接合して、大腸菌株ＪＭ８３中へ形質転換させた。
ｃｏ １ ５をＬ互上ＩとＨｉｎｄｌＩ［で培養し、Ｈ
ｉｎｄｌＩＩとＳｍａ Ｉで培養されたベクターのｐＵ
ｃ９ （ＴＧＡサンブレッサを欠くベクター）とｐＷＨ
Ａ １ ６０ （ＴＧＡサンプレッサを有するベクター
）に接合して、大腸菌株ＪＭ８３中へ形質転換させた。
ｐＵＣ９の転換体の１種をｐＭＹｃＯ３９と命名し、ｐ
ＷＨＡ１６０の転換体の１ａをｐＭＹｃＯ４０と命名し
た。そわらのＤＮＡを調製し、若干種の制限酵素で培養
して、第１２図と第１３図の制限マップを作成した。
ＷＨＡ１６０の転換体の１ａをｐＭＹｃＯ４０と命名し
た。そわらのＤＮＡを調製し、若干種の制限酵素で培養
して、第１２図と第１３図の制限マップを作成した。
ベクターｐＷＨＡ１６０は、ベクターｐＵＣ９のＥｃｏ
Ｒ１部位に挿入されたブラスミドｐＣＡＭ１０１からの
トリプトファンＴ１７６Ｊ伝子を含む２５６対の塩基対
のＥｃｏ′Ｒ１断片より成るもので、ラクトースブロモ
ータから翻訳される筈のものであった。
Ｒ１部位に挿入されたブラスミドｐＣＡＭ１０１からの
トリプトファンＴ１７６Ｊ伝子を含む２５６対の塩基対
のＥｃｏ′Ｒ１断片より成るもので、ラクトースブロモ
ータから翻訳される筈のものであった。
ブラスミドｐＭＹｃＯ３９とｐ Ｍ Ｙ Ｃ Ｏ ４
０ ７５）らのＤＮＡは、大腸菌のＣＹ１５０００株に
形質転換された。各転換体を選択し、Ｌ一肉汁中で３７
℃でＯＤｓｓｏ”２になるまで増殖させ、遠心分離によ
って細胞を採取した。Ｍ９緩衝液中で再懸濁させて、細
胞群を媒質がらの汚染のないように洗浄し、再び遠心分
離によって採取した。得られた細胞ベレットを、０．５
ｍｇ／ｍＪ２の鶏卵白のりゾチームを、２５ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ ｐＨ８．０の１０ｍＭ ＥＤＴＡに溶解し
た溶液中で、最初の培養容積の１５分の１で再懸濁させ
、２５℃で１０分間熟成させ、４℃で１５秒間超音波処
理した。採取溶菌液の被膜と、可溶分と細胞部分を、ポ
リアクリルアミドゲル電気律動法で処理し、ブラスミｌ
’ ｐ Ｍ Ｙ Ｃ Ｏ ３ ９とｐＭＹｃＯ４０の細
胞部と被１１Ｉ２部の各々中に、それぞれ新たに分子！
ｉ’ｔ ２ ９ ｋ Ｄ ａと３６ｋＤａのタンパク質
か確認さわた。この２９ｋＤａと３６ｋＤａの組換え形
タンパク質が、全体の抗原を含むものとｆｆｉ定される
。
０ ７５）らのＤＮＡは、大腸菌のＣＹ１５０００株に
形質転換された。各転換体を選択し、Ｌ一肉汁中で３７
℃でＯＤｓｓｏ”２になるまで増殖させ、遠心分離によ
って細胞を採取した。Ｍ９緩衝液中で再懸濁させて、細
胞群を媒質がらの汚染のないように洗浄し、再び遠心分
離によって採取した。得られた細胞ベレットを、０．５
ｍｇ／ｍＪ２の鶏卵白のりゾチームを、２５ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ ｐＨ８．０の１０ｍＭ ＥＤＴＡに溶解し
た溶液中で、最初の培養容積の１５分の１で再懸濁させ
、２５℃で１０分間熟成させ、４℃で１５秒間超音波処
理した。採取溶菌液の被膜と、可溶分と細胞部分を、ポ
リアクリルアミドゲル電気律動法で処理し、ブラスミｌ
’ ｐ Ｍ Ｙ Ｃ Ｏ ３ ９とｐＭＹｃＯ４０の細
胞部と被１１Ｉ２部の各々中に、それぞれ新たに分子！
ｉ’ｔ ２ ９ ｋ Ｄ ａと３６ｋＤａのタンパク質
か確認さわた。この２９ｋＤａと３６ｋＤａの組換え形
タンパク質が、全体の抗原を含むものとｆｆｉ定される
。
免玉Ｕ岨清
無菌飼育で、初乳を与えない家豚を、実験的に肺炎病原
体に感染させ、回復期の期間に血清を採取した。肺炎病
原体タンパク質のウェスタン法プロット分析によれば、
分子量３６ｋＤａの抗原を含む多神のマイコブラズマタ
ンパク質の５０分の１の濃度に対して，免疫血清か反応
することが判明した。ブラスミドｐＭＹｃＯ３９の２９
ｋＤａタンパク質およびｐＭＹｃＯ４０の３６ｋＤａタ
ンパク質は、ウェスタン法プロット分析により、回復期
の家豚血清に対して反応することが判明した。
体に感染させ、回復期の期間に血清を採取した。肺炎病
原体タンパク質のウェスタン法プロット分析によれば、
分子量３６ｋＤａの抗原を含む多神のマイコブラズマタ
ンパク質の５０分の１の濃度に対して，免疫血清か反応
することが判明した。ブラスミドｐＭＹｃＯ３９の２９
ｋＤａタンパク質およびｐＭＹｃＯ４０の３６ｋＤａタ
ンパク質は、ウェスタン法プロット分析により、回復期
の家豚血清に対して反応することが判明した。
ＤＢＡ／２のマウスを、完全免疫助成剤中で、電気泳動
法で精製した分子量３６ｋＤａ抗体く肺炎病原体から分
離した）の１０マイクログラムによって免疫性を付与し
た。第１回接種２週間後に、不完全フロイント助成剤中
で、補助接種を行い、マウスを１週間技に採血した。肺
炎病原体タンパク質の全部をウェスタン法プロット分析
して、免疫血清が、１００分の１希釈において、特定的
に３６ｋＤａ抗原と反応することが認められた。ブラス
ミドｐＭＹｃＯ３９の２ ９ ｋ Ｄ ａタンパク質お
よびｐＭＹｃＯ４０の３６ｋＤａタンパク質は、ウェス
タン法分析により、病原体抗原に対して作成さわたマウ
スの免疫血清に対して反応することが認められた。
法で精製した分子量３６ｋＤａ抗体く肺炎病原体から分
離した）の１０マイクログラムによって免疫性を付与し
た。第１回接種２週間後に、不完全フロイント助成剤中
で、補助接種を行い、マウスを１週間技に採血した。肺
炎病原体タンパク質の全部をウェスタン法プロット分析
して、免疫血清が、１００分の１希釈において、特定的
に３６ｋＤａ抗原と反応することが認められた。ブラス
ミドｐＭＹｃＯ３９の２ ９ ｋ Ｄ ａタンパク質お
よびｐＭＹｃＯ４０の３６ｋＤａタンパク質は、ウェス
タン法分析により、病原体抗原に対して作成さわたマウ
スの免疫血清に対して反応することが認められた。
また、ＤＢＡ／２のマウスを、完全免疫助成剤中の、電
気泳動法て鯖製した３６ｋＤａタンパク′ｉ１（ｐＭＹ
ｃＯ４０を含む大腸菌より分離したもの）の１０マイク
ロダラムによって免疫処理した。第１回接種２週間後に
、不完全フロイント助成剤中で、補助接種を行い、１週
間接にマウスから採種した。肺炎病原体タンパク質全体
をウエスタン法プロット分析して、この血清が１００分
の１の希釈において、特定的に３６ｋＤａ抗原と反応す
ることが認められた。
気泳動法て鯖製した３６ｋＤａタンパク′ｉ１（ｐＭＹ
ｃＯ４０を含む大腸菌より分離したもの）の１０マイク
ロダラムによって免疫処理した。第１回接種２週間後に
、不完全フロイント助成剤中で、補助接種を行い、１週
間接にマウスから採種した。肺炎病原体タンパク質全体
をウエスタン法プロット分析して、この血清が１００分
の１の希釈において、特定的に３６ｋＤａ抗原と反応す
ることが認められた。
これらの結果の示すことは、ブラスミドｐＭＹＣＯ４０
から生成された３６ｋＤａタンパク質は、肺炎病原体３
６ｋＤａ抗原の遺伝子組換え形複製体であるということ
である。
から生成された３６ｋＤａタンパク質は、肺炎病原体３
６ｋＤａ抗原の遺伝子組換え形複製体であるということ
である。
組換え形の３６ｋＤａ抗原から、被膜タンパク質の約１
０％か生成さわ、試料中の３６ｋＤａ抗体の量に基いて
、各投与■が、１ｍ４２当り５０マイクログラムの濃度
でＰＢＳ （リン酸緩衝化食塩水）中に作成され、家豚
に投与する直前に、等容積のフロイント未完成助成剤（
シグマ社製）を加えて氷上で乳化させた。
０％か生成さわ、試料中の３６ｋＤａ抗体の量に基いて
、各投与■が、１ｍ４２当り５０マイクログラムの濃度
でＰＢＳ （リン酸緩衝化食塩水）中に作成され、家豚
に投与する直前に、等容積のフロイント未完成助成剤（
シグマ社製）を加えて氷上で乳化させた。
ブラスミト ＭＹＣＯ５０の
ブラスミドｐＭＹｃＯ４０のラクトースブロモータは、
分子ｉ１３６ｋＤａ抗原遺伝子の出発点から１０００対
以上の塩基対である。１つの遺伝子とそのブロモータと
の間の距離を増加すると、多くの場合、組換え形タンパ
ク質の発現を促進させることが多い。組換え形３６ｋＤ
ａ抗原の発現レヘルを高める意図に基き、ｐＭＹｃＯ４
０から調製されたＤＮＡは、酵素ｆ｛ ｉ ｎ ｄ １
１で培養し、ざらにＴ４リガーセを作用させて、大腸菌
のＪＭ８３株に形質転換させた。転換体のその１種を第
１５図のブラスミドｐＭＹｃＯ５０と命名し、そのＤＮ
Ａを：Ａ製し、制限酵素によって培養して、第１５図の
■１限マップを作成した。ｐＭＹＣ０５０のラクトース
ブロモータは、約８００塩基対の位置に、ｐＭ，ＹＣＯ
４０中におけるよりも、３６ｋＤａ抗原遺伝子の出発点
に近い所にある。
分子ｉ１３６ｋＤａ抗原遺伝子の出発点から１０００対
以上の塩基対である。１つの遺伝子とそのブロモータと
の間の距離を増加すると、多くの場合、組換え形タンパ
ク質の発現を促進させることが多い。組換え形３６ｋＤ
ａ抗原の発現レヘルを高める意図に基き、ｐＭＹｃＯ４
０から調製されたＤＮＡは、酵素ｆ｛ ｉ ｎ ｄ １
１で培養し、ざらにＴ４リガーセを作用させて、大腸菌
のＪＭ８３株に形質転換させた。転換体のその１種を第
１５図のブラスミドｐＭＹｃＯ５０と命名し、そのＤＮ
Ａを：Ａ製し、制限酵素によって培養して、第１５図の
■１限マップを作成した。ｐＭＹＣ０５０のラクトース
ブロモータは、約８００塩基対の位置に、ｐＭ，ＹＣＯ
４０中におけるよりも、３６ｋＤａ抗原遺伝子の出発点
に近い所にある。
プラスミドｐＭＹｃＯ５０からのＤＮＡを大腸菌のＣＹ
１５０００株に転換させた。数種の転換体を選択し、Ｌ
一肉汁中で３７℃でＯＤＳＳＯ＝２なるまで増殖させ、
全菌液およびトライトン可溶分画液を前記同様に調製し
た。なお、この分子量３６ｋＤａのタンパク質の発現は
、ｐＭＹｃＯ５０内のＴＧＡサブレッサによって左右さ
れる。こわは、ｐＭＹｃＯ３９には、Ｈ ｉ ｎ ｄ
ＩＩによって生じる同じ＜８００塩基対の欠失かあるた
めにそわを発現できないからである。
１５０００株に転換させた。数種の転換体を選択し、Ｌ
一肉汁中で３７℃でＯＤＳＳＯ＝２なるまで増殖させ、
全菌液およびトライトン可溶分画液を前記同様に調製し
た。なお、この分子量３６ｋＤａのタンパク質の発現は
、ｐＭＹｃＯ５０内のＴＧＡサブレッサによって左右さ
れる。こわは、ｐＭＹｃＯ３９には、Ｈ ｉ ｎ ｄ
ＩＩによって生じる同じ＜８００塩基対の欠失かあるた
めにそわを発現できないからである。
商用飼育された家豚に、ｐＭＹｃＯ５０から得た組換え
形３６ｋＤａタンパク質の約１００マイクログラムを、
アンフィゲン（商品名）で助成したものによって免疫性
を付与させた。第１回接袖２週間後に補助接種を施して
、１週間後にこの豚から採血した。肺炎病原体の全量を
ウェスタン法プロット分析して、この免疫血清が、３６
ｋＤａ抗原を特定的に認識することが認められた。これ
らの結果は、ブラスミドｐＭＹｃＯ５０によって生成さ
れる３６ｋＤａタンパク質は、肺炎病原体３６ｋＤａ抗
原の組換え形複製体であることを指示するものである。
形３６ｋＤａタンパク質の約１００マイクログラムを、
アンフィゲン（商品名）で助成したものによって免疫性
を付与させた。第１回接袖２週間後に補助接種を施して
、１週間後にこの豚から採血した。肺炎病原体の全量を
ウェスタン法プロット分析して、この免疫血清が、３６
ｋＤａ抗原を特定的に認識することが認められた。これ
らの結果は、ブラスミドｐＭＹｃＯ５０によって生成さ
れる３６ｋＤａタンパク質は、肺炎病原体３６ｋＤａ抗
原の組換え形複製体であることを指示するものである。
ブラスミドｐＭＹｃＯ５０のトライトン可溶分を萌記同
様に調製した。この可溶分は、組換え形の分子１３６ｋ
Ｄａの抗原が、全体の約８０％を構成するところのタン
パク質を、ｌｍＩ１当り１．８マイクログラム含有した
ものである。０．３５ｍｊ２のトライトン可溶分と、４
．１５ｍｆｆｉのＰＢＳと５．０ｍｊ２のフロイント不
完全助成剤とが、各５処方分に相当する乳化ワクチンを
調製した。
様に調製した。この可溶分は、組換え形の分子１３６ｋ
Ｄａの抗原が、全体の約８０％を構成するところのタン
パク質を、ｌｍＩ１当り１．８マイクログラム含有した
ものである。０．３５ｍｊ２のトライトン可溶分と、４
．１５ｍｆｆｉのＰＢＳと５．０ｍｊ２のフロイント不
完全助成剤とが、各５処方分に相当する乳化ワクチンを
調製した。
ネブラスカ大学において、無菌飼育室から提供さオ１、
初乳なしで飼育された仔豚を、隔離室に収納して、ワク
チン供与／抗原投与試験を実行した。家豚のマイコブラ
ズマ性肺炎（ＭＰＳ）に対する予防用の、組換え形３６
ｋＤａ抗原を評価するだめの試験法規定は下記の通りで
ある。
初乳なしで飼育された仔豚を、隔離室に収納して、ワク
チン供与／抗原投与試験を実行した。家豚のマイコブラ
ズマ性肺炎（ＭＰＳ）に対する予防用の、組換え形３６
ｋＤａ抗原を評価するだめの試験法規定は下記の通りで
ある。
ワク ン と４
供試豚年令 要 領
３週齢 第１回接種、１００マイクログラムの組換え
形３６ｋＤａ抗原を、不完 全フロイント助成剤混入で使用す る。
形３６ｋＤａ抗原を、不完 全フロイント助成剤混入で使用す る。
６週齢 上記と同要領で第２回接種
９週齢 ＋ｏ６ｃｃｕの１紐炎病原体株Ｐ−５７７２
〜３により抗原供与、気管内供与 １３週齢 削検、肺炎病巣の検討 ６頭の供試豚制御グループに、７．３％の肺部病巣の回
復、３頭の試験グループには、３．８％の肺部病巣の回
復が認められた。
〜３により抗原供与、気管内供与 １３週齢 削検、肺炎病巣の検討 ６頭の供試豚制御グループに、７．３％の肺部病巣の回
復、３頭の試験グループには、３．８％の肺部病巣の回
復が認められた。
形質転換体Ｍ１３ＭＹＣＯ１０２の構成プラスミドｐＭ
ＹｃＯ３１を分子量７４．５ｋＤａの抗原遺伝子（実施
例３と第９図参照）の源泉として使用した。Ｍ１３ｍｐ
ｌ８ＲＦ ＤＮＡ（ベセスダ研究所製）は、７２５３
塩基対ファーシベクター（第１６図）であって、これを
酵素｝｛ｉｎｄＩＩＩ（マンハイムのベーリンガー社製
）とＰｓ↓■（ベセスダ研究所製）で培養し、Ｔ４リガ
ーゼ（ベーリンガー社製）を使用してＨｉｎｄ■とＰｓ
ｔｌで培養したプラスミドＰＭＹＣＯ３１に作用させて
、大腸菌ＪＭ１０３菌株に転換させた。その転換体の１
種を変種Ｍｌ３ＭＹＣＯ１０２とし、これを種々の制限
酵素で培養することによって、第１７図の制限マップが
求められた。
ＹｃＯ３１を分子量７４．５ｋＤａの抗原遺伝子（実施
例３と第９図参照）の源泉として使用した。Ｍ１３ｍｐ
ｌ８ＲＦ ＤＮＡ（ベセスダ研究所製）は、７２５３
塩基対ファーシベクター（第１６図）であって、これを
酵素｝｛ｉｎｄＩＩＩ（マンハイムのベーリンガー社製
）とＰｓ↓■（ベセスダ研究所製）で培養し、Ｔ４リガ
ーゼ（ベーリンガー社製）を使用してＨｉｎｄ■とＰｓ
ｔｌで培養したプラスミドＰＭＹＣＯ３１に作用させて
、大腸菌ＪＭ１０３菌株に転換させた。その転換体の１
種を変種Ｍｌ３ＭＹＣＯ１０２とし、これを種々の制限
酵素で培養することによって、第１７図の制限マップが
求められた。
Ｍ１３ＭＹＣＯ１０７の
分子量７４．５ｋＤａ抗原遺伝子のＤＮＡ配列を基幹と
して、９６塩基長さの合成オリゴヌクレオチド、即ち下
記のＣＯＤ６３９を転換して、２個のアミノ酸を生成さ
せるようにした。
して、９６塩基長さの合成オリゴヌクレオチド、即ち下
記のＣＯＤ６３９を転換して、２個のアミノ酸を生成さ
せるようにした。
ＣＯＤ ６３９
Ｉ、Ｉｌｌ−ＧＬＹ−ＴｌＩｎ−Ｔｌｌｌ１−八ＳＮ−
ＳＥＲ−Ｖ八Ｌ−ＶＡＬ−ＡＬＡ−ＩＬＥ−ＩＬＥ−Ｇ
ＬＵＡＳＮ−ＧＬＮ−ＬＹＳ−ＰＲＯ−Ｖ八Ｌ−ＶＡＬ
−ＬＥＵ−ＧＬＵ−ＡＳＮ−ＰＩＩＯ−ＡＳＮ−ＧＬＹ
Ａ八Ｔ−ＣＡ八一Ａ八Ａ＝ＣＣＴ−ＧＴＣ−ＧＴＴ−１
；Ｔ（：−ＧＡＡ−ＡＡＴ−ＣＣＣ−Ａ八（：−ＧＧＡ
ＴＴ八−ＧＴＴ−ＴＴＴ−ＧＧＡ−ＧＣＧ−（：八Ａ−
ＧＡＧ−ＣＴＴ−’ｒＴ即ち、「核酸研究報告」１３の
８７４９〜８７６４頁および、同じく１３の８７６４〜
８７８５に掲載のテーラー他による２種の方法に基づく
突然変異法により、抗体のＮ一末端にある２個のアミノ
酸に変化させるものである。このＣＯＤ６３９に伴う突
然変異によって、Ｖａｌ”（バリン１７）をＣｙｓ１７
（シスチン）に変化させて、Ｄｄｅ １部位を破壊させ
、Ｖａｌ”をＡ ， ｇ２７（アルキニン）に変化させ
て、Ｔｈａｉ部位を新たに生成させる。これらの変化は
、＋’ｉ７ｒ記の大腸菌ｄｎａκのタンパク質内にある
ｐ想された両性らせん性の２つの区域を＋ＩＴ生させる
ものである。
ＳＥＲ−Ｖ八Ｌ−ＶＡＬ−ＡＬＡ−ＩＬＥ−ＩＬＥ−Ｇ
ＬＵＡＳＮ−ＧＬＮ−ＬＹＳ−ＰＲＯ−Ｖ八Ｌ−ＶＡＬ
−ＬＥＵ−ＧＬＵ−ＡＳＮ−ＰＩＩＯ−ＡＳＮ−ＧＬＹ
Ａ八Ｔ−ＣＡ八一Ａ八Ａ＝ＣＣＴ−ＧＴＣ−ＧＴＴ−１
；Ｔ（：−ＧＡＡ−ＡＡＴ−ＣＣＣ−Ａ八（：−ＧＧＡ
ＴＴ八−ＧＴＴ−ＴＴＴ−ＧＧＡ−ＧＣＧ−（：八Ａ−
ＧＡＧ−ＣＴＴ−’ｒＴ即ち、「核酸研究報告」１３の
８７４９〜８７６４頁および、同じく１３の８７６４〜
８７８５に掲載のテーラー他による２種の方法に基づく
突然変異法により、抗体のＮ一末端にある２個のアミノ
酸に変化させるものである。このＣＯＤ６３９に伴う突
然変異によって、Ｖａｌ”（バリン１７）をＣｙｓ１７
（シスチン）に変化させて、Ｄｄｅ １部位を破壊させ
、Ｖａｌ”をＡ ， ｇ２７（アルキニン）に変化させ
て、Ｔｈａｉ部位を新たに生成させる。これらの変化は
、＋’ｉ７ｒ記の大腸菌ｄｎａκのタンパク質内にある
ｐ想された両性らせん性の２つの区域を＋ＩＴ生させる
ものである。
「核酸研究報告」１４の９６７９〜９６９８頁（１９８
６）のκ、中面とＦ エクスタインのｈ法によって作成
した、Ｍｌ ３ＭＹＣＯ１ ０２の単ｊＪ’ｌ Ｄ Ｎ
Ａ ヲ、Ｍ １ ３ ＭＹ Ｃ Ｏ １ ０ ７ ト
命名サｔＬる！ＩＩ換え体候補物を生成′１−るのに使
用された、第１種図の各ステップ中での鋳型として使用
した。このＤＮＡは調￥Ｊ後に、突然変穴による変化の
１つを検証するために、酵素Ｔｈａ Ｔで培五した。ｆ
想通りに、第１９図のＭ１３ＭＹＣＯ１０７は、長さ２
ｋｂの断片を０．４と１。６ｋｂの２個の断片に変換さ
せるＴｈａ１部位を追加してηずるものである。Ｍｌ
３ＭＹＣＯ１ ０７のＤＮＡ配列を分析し、Ｍ１３ＭＹ
ＣＯ１０２のそれと比較することによって、これらの変
化はいすわも確認され、ＣＯＤ６３９のいすわれ側にお
いても７ ０ ４Ｑ Ｊ，Ｃ対内には、何ら変化か起こ
らないことをボした。
６）のκ、中面とＦ エクスタインのｈ法によって作成
した、Ｍｌ ３ＭＹＣＯ１ ０２の単ｊＪ’ｌ Ｄ Ｎ
Ａ ヲ、Ｍ １ ３ ＭＹ Ｃ Ｏ １ ０ ７ ト
命名サｔＬる！ＩＩ換え体候補物を生成′１−るのに使
用された、第１種図の各ステップ中での鋳型として使用
した。このＤＮＡは調￥Ｊ後に、突然変穴による変化の
１つを検証するために、酵素Ｔｈａ Ｔで培五した。ｆ
想通りに、第１９図のＭ１３ＭＹＣＯ１０７は、長さ２
ｋｂの断片を０．４と１。６ｋｂの２個の断片に変換さ
せるＴｈａ１部位を追加してηずるものである。Ｍｌ
３ＭＹＣＯ１ ０７のＤＮＡ配列を分析し、Ｍ１３ＭＹ
ＣＯ１０２のそれと比較することによって、これらの変
化はいすわも確認され、ＣＯＤ６３９のいすわれ側にお
いても７ ０ ４Ｑ Ｊ，Ｃ対内には、何ら変化か起こ
らないことをボした。
ブラスミＦ’ ＭＹＣＯ１１６の
実ｈｌ！ｉ例３，第１１図のブラスミドｐＭＹｃＯ３２
を精製し、これを酵素Ｐｆｆｆｍｌ （ニューイングラ
ントバイオラブス製）て培禿し、仔牛の腸内酵素フォス
ファターセ（ＣＩＰ、ヘーリンガ−社製）で処理し、Ｐ
ｓｔＩ （酵素、ブロメカハイ才テク製）とＡｓｕｌ１
（ニューヨーク、バイオラブス製）で培養し、１１［び
ＣｒＰてフオスファターセ処理して、大腸菌ＪＭ８３菌
株に転換させた。その１柿をブラスミトｐ Ｍ Ｙ Ｃ
Ｏ １ １ ６と命名し、そのＤＮＡを粒製しＨｉｎ
ｄＩＩ１で培養して、長さ２．２ｋｂの挿入部位を検１
征した。精製した第２０図のｐＭＹｃｏ １ １ ６の
ＤＮＡを、大腸菌のＣＹｌ５０００株の転換に使用した
。精製したコロニーの１つを、１００μｇ／ ｍ ｆｌ
のアンビシリンを含むＬ肉汁中で増殖させた。通常の遠
心分離で！ＩＩＩ胞を採取し、８％のしょ糖、０．５％
のトライトンＸ−１００、５０ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍ
ＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．３、および０．６６ｍ ｇ
／ ｍ Ｉｔの鶏卵白リゾ゛チーム（ＨＥＬ、シクマ社
製）より成る混液中で、再懸濁させ、１００℃まで短時
間加熱した。−Ｌｔｑみ液からのブラスミトＤＮＡを、
Ｈ ｉ ｎｄｌで培養し、正規の挿入を検誹した６Ｔｈ
ａＩとＤｄｅ Ｉの培養が、新しいＴｈ ａ． Ｉ部位
の存在と、０．２６と０．７６ｋｂの２つの断片をｍ−
の１．Ｏｋｂ断片に変換させるＤｄｅ １部位の欠陥と
を検証した。
を精製し、これを酵素Ｐｆｆｆｍｌ （ニューイングラ
ントバイオラブス製）て培禿し、仔牛の腸内酵素フォス
ファターセ（ＣＩＰ、ヘーリンガ−社製）で処理し、Ｐ
ｓｔＩ （酵素、ブロメカハイ才テク製）とＡｓｕｌ１
（ニューヨーク、バイオラブス製）で培養し、１１［び
ＣｒＰてフオスファターセ処理して、大腸菌ＪＭ８３菌
株に転換させた。その１柿をブラスミトｐ Ｍ Ｙ Ｃ
Ｏ １ １ ６と命名し、そのＤＮＡを粒製しＨｉｎ
ｄＩＩ１で培養して、長さ２．２ｋｂの挿入部位を検１
征した。精製した第２０図のｐＭＹｃｏ １ １ ６の
ＤＮＡを、大腸菌のＣＹｌ５０００株の転換に使用した
。精製したコロニーの１つを、１００μｇ／ ｍ ｆｌ
のアンビシリンを含むＬ肉汁中で増殖させた。通常の遠
心分離で！ＩＩＩ胞を採取し、８％のしょ糖、０．５％
のトライトンＸ−１００、５０ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍ
ＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．３、および０．６６ｍ ｇ
／ ｍ Ｉｔの鶏卵白リゾ゛チーム（ＨＥＬ、シクマ社
製）より成る混液中で、再懸濁させ、１００℃まで短時
間加熱した。−Ｌｔｑみ液からのブラスミトＤＮＡを、
Ｈ ｉ ｎｄｌで培養し、正規の挿入を検誹した６Ｔｈ
ａＩとＤｄｅ Ｉの培養が、新しいＴｈ ａ． Ｉ部位
の存在と、０．２６と０．７６ｋｂの２つの断片をｍ−
の１．Ｏｋｂ断片に変換させるＤｄｅ １部位の欠陥と
を検証した。
ブラスミト ＭＹＣＯ１１６ のＣＹｌ５０００
の細胞（ｐＭＹｃｏ ＋ １ ６）を採取し、洗ａノシ
、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８０の１０ｍＭ Ｅ
ＤＴＡと、０．５ｍｇ／ｍｆｆの鶏卵白リゾチームとの
混液中で１５分間超音波処理した。上７ｑみ液（可溶分
）の２マイクロリ・ントルを、１２％ボリアクリノレア
ミトゲノレ−１二で．，ｌｉｊ気？永動処理した。ブラ
スミトｐＭＹｃｏ １ １ ６が、町溶タンパク質の約
１０％を占める分子！Ｉ１７４．５ｋＤａのタンパク質
を生成し、これはブラスミトρＭＹＣＯ３２によって生
成されるものと同等の大きさてある。
の細胞（ｐＭＹｃｏ ＋ １ ６）を採取し、洗ａノシ
、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８０の１０ｍＭ Ｅ
ＤＴＡと、０．５ｍｇ／ｍｆｆの鶏卵白リゾチームとの
混液中で１５分間超音波処理した。上７ｑみ液（可溶分
）の２マイクロリ・ントルを、１２％ボリアクリノレア
ミトゲノレ−１二で．，ｌｉｊ気？永動処理した。ブラ
スミトｐＭＹｃｏ １ １ ６が、町溶タンパク質の約
１０％を占める分子！Ｉ１７４．５ｋＤａのタンパク質
を生成し、これはブラスミトρＭＹＣＯ３２によって生
成されるものと同等の大きさてある。
１ ２５ｍｆｌの培養液のＩＩＴ溶分を前記同様にＡ？
し、分子ｊｉ１７４．５ｋＤａの生成物を′Ｉ．ｊＥ気
詠動によって錆製した。３１のアミノ端未残分のアミノ
酸配列を分析した結果により、操作されたタンパク質が
確認さわ、ハリンＶａｉｌ１７かシスチンＣｙｓ １７
に変換さわることを裏付けるに足りる。しかしなからシ
スチンは、信号か弱いためにタンパク質配列の分析では
直接に検証することはできない。バリンＶａｆｆｉ”か
らアルギニンＡ ， ｇ２７への変換は、残部２７にお
いてパリンの代りにアルキニンを検出することによって
確認された。
し、分子ｊｉ１７４．５ｋＤａの生成物を′Ｉ．ｊＥ気
詠動によって錆製した。３１のアミノ端未残分のアミノ
酸配列を分析した結果により、操作されたタンパク質が
確認さわ、ハリンＶａｉｌ１７かシスチンＣｙｓ １７
に変換さわることを裏付けるに足りる。しかしなからシ
スチンは、信号か弱いためにタンパク質配列の分析では
直接に検証することはできない。バリンＶａｆｆｉ”か
らアルギニンＡ ， ｇ２７への変換は、残部２７にお
いてパリンの代りにアルキニンを検出することによって
確認された。
ＣＹ１５０００の細胞（ρＭＹＣＯＩ １ ６）を２
１４リットルのシェマップ増殖器中の、リン酸ナトリウ
ム縁衝化少量媒剤中て、８４外径６００の細胞密度とな
るまで成長させた。湿潤１−『量３６０ｇの細胞が、４
．２リットルから採取された。１００ｇの細胞を、１２
ｍＭのＥＤＴＡを含有する３００ｍｕのＰＢＳ中に懸濁
させた。
１４リットルのシェマップ増殖器中の、リン酸ナトリウ
ム縁衝化少量媒剤中て、８４外径６００の細胞密度とな
るまで成長させた。湿潤１−『量３６０ｇの細胞が、４
．２リットルから採取された。１００ｇの細胞を、１２
ｍＭのＥＤＴＡを含有する３００ｍｕのＰＢＳ中に懸濁
させた。
５〜Ｂ，ＯＯＯｐｓｉ （ボンド／平方インチ）の供給
圧で作動ずるメントン・ゴーリン製ホモジナイザで、細
胞分裂を完成させた。１リットルの採取量に対して１０
モルまでのＥＤＴＡを添加することにより均質化を促進
させた。均質化させた液質を微細濾過により透明化した
。炉液の５０ｍｊ２を、１００ｍｊ２の径流ＤＥＡＥ力
ラムに供給し、試料およびカラムを、５０ｍＭリン酸ナ
トリウムてｐＨ７．０とし、２ｍＭのＥＤＴＡを加えた
液て平衡させ、結合しない部分は生成物として保持され
た。この試料を無菌濾過させる。使用の直前に、１００
μｇ ／ ｍ １のＰＢＳを添加して乳化させてワクチ
ンとして使用する。１回の投与晴は、１００μｇの精製
成分と等価である。
圧で作動ずるメントン・ゴーリン製ホモジナイザで、細
胞分裂を完成させた。１リットルの採取量に対して１０
モルまでのＥＤＴＡを添加することにより均質化を促進
させた。均質化させた液質を微細濾過により透明化した
。炉液の５０ｍｊ２を、１００ｍｊ２の径流ＤＥＡＥ力
ラムに供給し、試料およびカラムを、５０ｍＭリン酸ナ
トリウムてｐＨ７．０とし、２ｍＭのＥＤＴＡを加えた
液て平衡させ、結合しない部分は生成物として保持され
た。この試料を無菌濾過させる。使用の直前に、１００
μｇ ／ ｍ １のＰＢＳを添加して乳化させてワクチ
ンとして使用する。１回の投与晴は、１００μｇの精製
成分と等価である。
ワクチンとして する の ＭＹＣＯ１１６の粒３シ
大腸菌株ＣＹＩ ５０００ （ｐＭＹｃＯ１ １ ６）
を、リン酸ナトリウム緩衝化した少量の媒剤中て、１４
リットルのシェマップ増殖器中で、８４外径６００の細
胞密度となるまで成長させた。湿潤重ｊ．ｌ ３ ６
０ ｇの細胞か４．２リットルから採取さわた。ｌ Ｏ
Ｏｇの細胞を、１２ｍＭ ＥＤＴＡと０．５ｍｇ／ｍ
Ｊ２の鶏卵白リゾチームを含む３００ｍｊ２のＰＢＳ中
に懸潤させ、２５でて１５分間熟成させ、氷上で２分間
、３０秒間バーストして超ｔ′ｆ波処理し、回転加速度
１３，０００ｇで１０分間４℃で遠心分離した。可溶分
を保持した。ポリアクリルアミトケル電気泳動法によっ
て、分子量７４．５ｋＤａの抗原が、約１０％のｉｉＪ
溶成分、即ち発酵培養体１リットルに約２．５ｇの生成
物を含むことが知られた。可溶分５０ｍｌを１００ｒｒ
＋Ｊ２の径流ＤＥＡＥ力ラムに供給し、試料およびカラ
ムを、５０ｍＭのリン酸ナトリウムでｐＨ７．０とし、
２ｍＭのＥＤＴＡを加えた液で平衡させ、結合しない部
分は生成物として保持された。使用の直館に、１００ｍ
ｇ／ｍｌのＰＢＳを添加して乳化させ、ワクチンとして
使用する。１回の投与量は、１００μｇの鯖製成分と等
価である。
を、リン酸ナトリウム緩衝化した少量の媒剤中て、１４
リットルのシェマップ増殖器中で、８４外径６００の細
胞密度となるまで成長させた。湿潤重ｊ．ｌ ３ ６
０ ｇの細胞か４．２リットルから採取さわた。ｌ Ｏ
Ｏｇの細胞を、１２ｍＭ ＥＤＴＡと０．５ｍｇ／ｍ
Ｊ２の鶏卵白リゾチームを含む３００ｍｊ２のＰＢＳ中
に懸潤させ、２５でて１５分間熟成させ、氷上で２分間
、３０秒間バーストして超ｔ′ｆ波処理し、回転加速度
１３，０００ｇで１０分間４℃で遠心分離した。可溶分
を保持した。ポリアクリルアミトケル電気泳動法によっ
て、分子量７４．５ｋＤａの抗原が、約１０％のｉｉＪ
溶成分、即ち発酵培養体１リットルに約２．５ｇの生成
物を含むことが知られた。可溶分５０ｍｌを１００ｒｒ
＋Ｊ２の径流ＤＥＡＥ力ラムに供給し、試料およびカラ
ムを、５０ｍＭのリン酸ナトリウムでｐＨ７．０とし、
２ｍＭのＥＤＴＡを加えた液で平衡させ、結合しない部
分は生成物として保持された。使用の直館に、１００ｍ
ｇ／ｍｌのＰＢＳを添加して乳化させ、ワクチンとして
使用する。１回の投与量は、１００μｇの鯖製成分と等
価である。
６梯のワクチンの処方を、６群の仔豚に投与するために
規定した。下記ワクチンについて説明すると、“”ｒ７
４．５ｋＤａ”は、遺伝子組換え法によって形成した肺
炎病原体の７４．５ｋＤａ抗原て、 ｒｌｌ６”は、
７４．５ｋＤａタンパク質から遺伝子的に操作した変種
であり、その中では、２種のアミノ酸の変化、即ち前述
の変化が７４．５ｋＤａ抗原内で起されたものである。
規定した。下記ワクチンについて説明すると、“”ｒ７
４．５ｋＤａ”は、遺伝子組換え法によって形成した肺
炎病原体の７４．５ｋＤａ抗原て、 ｒｌｌ６”は、
７４．５ｋＤａタンパク質から遺伝子的に操作した変種
であり、その中では、２種のアミノ酸の変化、即ち前述
の変化が７４．５ｋＤａ抗原内で起されたものである。
すべての組換え形７４．５ｋＤａ抗原の処方には、少く
とも純度９５％の抗原を使用した。「アンフィゲン」と
は、ＭＲＫＳマーケッテイングサービスＩｎｃ（ネブラ
スカ州エルクホーン）で開発された含油水性の免疫助成
剤である。「アルヒドロゲル」は、３％水酸化アルミニ
ウムである。
とも純度９５％の抗原を使用した。「アンフィゲン」と
は、ＭＲＫＳマーケッテイングサービスＩｎｃ（ネブラ
スカ州エルクホーン）で開発された含油水性の免疫助成
剤である。「アルヒドロゲル」は、３％水酸化アルミニ
ウムである。
「タイルＡ」は、樹木のキラヤ ポー盲アの樹皮から抽
出して得られた、半鯖製グリコシトである。このグリコ
シドは、被ＩＩ５！タンパク質を結合させる機能かある
。ワクチンＡ．Ｂ．Ｃ．Ｄは、ノーザンラホラトリーズ
社で制定され、ｌｏｏｐｐｍのメルチオレートを含有す
る。ワクチンＥとＦは、コ１・ン社（南サンフランシス
コ）で制定された。
出して得られた、半鯖製グリコシトである。このグリコ
シドは、被ＩＩ５！タンパク質を結合させる機能かある
。ワクチンＡ．Ｂ．Ｃ．Ｄは、ノーザンラホラトリーズ
社で制定され、ｌｏｏｐｐｍのメルチオレートを含有す
る。ワクチンＥとＦは、コ１・ン社（南サンフランシス
コ）で制定された。
ワクチンＡ，Ｂ，Ｃ．ＤとＥは、１接種に２ｍｆｌを臀
部の皮下に注射し、１頭１回当り、１００μｇの量の抗
原に相当した。補助注射は、臀部の他側に行った。
部の皮下に注射し、１頭１回当り、１００μｇの量の抗
原に相当した。補助注射は、臀部の他側に行った。
ワクチンＦは、各鼻孔内に１．０ｍｊ２の量を投与し、
１頭１注射につき１００μｇの抗原に相当した。ワクチ
ンの処方は下記のとおりである。
１頭１注射につき１００μｇの抗原に相当した。ワクチ
ンの処方は下記のとおりである。
Ａ）ＰＢＳ＋アンフィゲン
Ｃ）ｒ７４．５ｋＤａ＋リポゾーム／クイルＡＥ）ｒｌ
ｌ６＋アンフィケン（５％Ｖ／Ｖ ）Ｆ）ｒ７４．５ｋ
Ｄａ十ＰＢＳ ４２頭の仔豚を７頭ずつの６群に分割した。ＡからＦま
での６群の各々は、ワクチンＡ．Ｂ、Ｃ．Ｄ．Ｅ，Ｆの
何れが１柿を接種した。仔＋１′￥を各群に生後１４日
において割当てた。この時点て全頭から３ｍ．Ｎずつ採
血し、社晴し、ワクチンＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ．Ｆの何れ
か１種の２ｍｆｔで、各仔ＪＮの割あてられた群に従っ
て、ワクチンを作成した。
ｌ６＋アンフィケン（５％Ｖ／Ｖ ）Ｆ）ｒ７４．５ｋ
Ｄａ十ＰＢＳ ４２頭の仔豚を７頭ずつの６群に分割した。ＡからＦま
での６群の各々は、ワクチンＡ．Ｂ、Ｃ．Ｄ．Ｅ，Ｆの
何れが１柿を接種した。仔＋１′￥を各群に生後１４日
において割当てた。この時点て全頭から３ｍ．Ｎずつ採
血し、社晴し、ワクチンＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ．Ｆの何れ
か１種の２ｍｆｔで、各仔ＪＮの割あてられた群に従っ
て、ワクチンを作成した。
各仔豚は、生後２８日齢において離乳させ、３５１Ｊ齢
において２回ワクチン投与した。第２回投与前に、全仔
豚から３ｍＪＺずつ採血した。
において２回ワクチン投与した。第２回投与前に、全仔
豚から３ｍＪＺずつ採血した。
４２日齢に達した時、面以て清掃哨毒した独立室に各仔
豚を収納した。生後４９日に、全仔豚から採血し、秤量
し、肺炎病原体菌株Ｐ−５７２２−３の１ ０８ＣＣＵ
の２ｍｌを気管内注射した。
豚を収納した。生後４９日に、全仔豚から採血し、秤量
し、肺炎病原体菌株Ｐ−５７２２−３の１ ０８ＣＣＵ
の２ｍｌを気管内注射した。
生後６３日と７７日に再び採血、拝量し、１．４から２
．３ｍｇ／ｋｇのスリタールで不動状態とし、電撃死さ
せて除血させた。肺を取出して、病巣の回復度を検定し
た。予備抗原投与時と検屍時における、各仔豚の体重増
加データを集成した。肺部病巣回復指数と休市増加デー
タを、表１と２として各々集成した。
．３ｍｇ／ｋｇのスリタールで不動状態とし、電撃死さ
せて除血させた。肺を取出して、病巣の回復度を検定し
た。予備抗原投与時と検屍時における、各仔豚の体重増
加データを集成した。肺部病巣回復指数と休市増加デー
タを、表１と２として各々集成した。
乳一上−Ｌ
肺部の快癒率（％）
Ａ群：ＰＢＳ＋アンフィケン使用
下記
家畜番ｔ３ 固着病巣
１ １６．２
２ ３．０
３ ３１１．４
４２．８
６ ８．４
７ ５．２
・Ｐ一均値 目．５ナ／−１２．７
斑点病巣 合計
２４．７ ４０．９
６．５ ４４．９
３８．ｇ イｊ７
２５．５ ３２．７
０．０ Ｂ．４
０．０ ！ｉ，２
１９ ９ナ／−！ＬＯ ：］Ｉ．５＋／−１７ ．
１Ｂ 群 ： ｒ ７ ４ ． ５ ｋ
Ｄ ａ 抗原＋助成印１アル七トロゲル家畜番号
固７１病巣 ］７３ ：１ １０．２ ５ １４．６ ６ ０．０ ・ト均値 ８．７＋／−９．１ 斑点病巣 ９．９ ３０．５ ０．０ ３．４ ６．３÷／−１１．３ 合計 ３４．２ １４．６ ０，０ ３．１ １５．０＋／−１２．０ Ｃ ＲＴ ：ｒ７４． ５ｋＤａ 抗原＋助成斉１
１リポゾーム／クイルＡ家畜番号 固着病巣 １１，０ ２５．６ ３ ０．０ ４１１。３ ５１，２ ６５．４ ７ １１．３ ゛ト均値 ５．４÷／−４．６ 斑点病巣 ３９．２ ２２．４ ２．７ ０．０ ３．１ ９．６◆／−１５．３ 合計 ２８．０ ２．７ １１．３ ３，２ ５．４ １４．４ １５．０＋／一目．２ Ｄ群 ｒ７４．５ｋＤａ抗原＋助成剤アン７イゲン固着
病巣 １１．３ ０．７ ２１．０ ０．６ １，２ １種．１ ５４／−８．６ 斑点病巣 ３８．７ ３１．２ １４．３ ｌ４，３ ■４．４ ９．７ ７．２ １種．５＋／−１１．７ 合計 ５０．０ ３１．９ ３５．３ １４．９ １０．９ ２５．３ ２８．０◆／−１：１．０ Ｅ群：Ｅ１ｆ６＋アンフィゲン（助成剤）家畜番号 固
着病巣 １０．２ ２ ３０．０ ：１ ６ ． ０ ５ ４．９ ７ １．８ ゛ビ均値 ７．６＋／−１０．２ 斑点病巣 ３３．２ ２８．４ ２．１ ＋３．２ ０．０ １３ ． ｌ＋／− １４ ． ０ Ｆ ［Ｔ： ｒ ７４．５ｋ Ｄ ａ ｊＡ．原＋ＰＢ
Ｓ家畜番号 固着病巣 １４．０ ２３．８ ５ｂ．１ ６６，４ ７３，５ ゛Ｐ−均値 ３．８＋／−２．２ 斑点病巣 １種．０ ０．０ ０．０ ０．０ ０．０ ２．６＋／６．８ 合、−１ ３；｛４ ：Ｉ ｌ ． ６ １５．４ ２０．７＋／−１２．７ （昂１ｒク内没’ｊ） 合；；１ ２．７ １３．１ ；１，５ ６．４＋／づ２ 第 ２ 表 体重増加率，ワクチン投与から剖検までＡ群：ＰＢＳ＋
助成剤アンフィゲン Ｃａｌ： ｒ７４． ５ｋＤａ ＋助成斉１１
リボゾーム／クイルＡワクチン予備投与時 剖検時
増加量２６．３＋／−２．８ Ｄ群： ｒ７４． ５ｋＤａ抗原＋助成剤アンプイゲンＢ群：
ｒ７４． ５ｋＤａ抗原＋アルヒドロゲル Ｅ群： ｒ１１６抗原十アンフィゲン Ｆ群： ｒ ７４．５ｋ Ｄ ａ抗原＋ＰＢＳ （鼻腔内投与） 第６図は、分子量７４．５ｋＤａの抗原遺伝子の形質転
換を示す。この７４．５ｋＤａ遺伝子の２１１位置にお
けるアミノ酸トリプトファンは、ＴＧＡの暗号が付与さ
れている。ブラスミドｐＭＹｃＯ３ １とｐＭＹｃＯ３
２によって生成されるタンパク質を検討して分ったこと
は、ＴＧＡコドンは、ｔｒｐＴ１７６サンプレッサがな
い場合は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｊ２ｉ）内のべブチド鎖の
伸長を終止させることである。試験管内での突然変異に
よって、コドンＴＧＡをＴＧＧに変化させれば、ｔｒｐ
Ｔ１７６サンプレッサがなくても、２１１位置における
ベプチド鎖の伸長を可能ならしめると想定した。
１Ｂ 群 ： ｒ ７ ４ ． ５ ｋ
Ｄ ａ 抗原＋助成印１アル七トロゲル家畜番号
固７１病巣 ］７３ ：１ １０．２ ５ １４．６ ６ ０．０ ・ト均値 ８．７＋／−９．１ 斑点病巣 ９．９ ３０．５ ０．０ ３．４ ６．３÷／−１１．３ 合計 ３４．２ １４．６ ０，０ ３．１ １５．０＋／−１２．０ Ｃ ＲＴ ：ｒ７４． ５ｋＤａ 抗原＋助成斉１
１リポゾーム／クイルＡ家畜番号 固着病巣 １１，０ ２５．６ ３ ０．０ ４１１。３ ５１，２ ６５．４ ７ １１．３ ゛ト均値 ５．４÷／−４．６ 斑点病巣 ３９．２ ２２．４ ２．７ ０．０ ３．１ ９．６◆／−１５．３ 合計 ２８．０ ２．７ １１．３ ３，２ ５．４ １４．４ １５．０＋／一目．２ Ｄ群 ｒ７４．５ｋＤａ抗原＋助成剤アン７イゲン固着
病巣 １１．３ ０．７ ２１．０ ０．６ １，２ １種．１ ５４／−８．６ 斑点病巣 ３８．７ ３１．２ １４．３ ｌ４，３ ■４．４ ９．７ ７．２ １種．５＋／−１１．７ 合計 ５０．０ ３１．９ ３５．３ １４．９ １０．９ ２５．３ ２８．０◆／−１：１．０ Ｅ群：Ｅ１ｆ６＋アンフィゲン（助成剤）家畜番号 固
着病巣 １０．２ ２ ３０．０ ：１ ６ ． ０ ５ ４．９ ７ １．８ ゛ビ均値 ７．６＋／−１０．２ 斑点病巣 ３３．２ ２８．４ ２．１ ＋３．２ ０．０ １３ ． ｌ＋／− １４ ． ０ Ｆ ［Ｔ： ｒ ７４．５ｋ Ｄ ａ ｊＡ．原＋ＰＢ
Ｓ家畜番号 固着病巣 １４．０ ２３．８ ５ｂ．１ ６６，４ ７３，５ ゛Ｐ−均値 ３．８＋／−２．２ 斑点病巣 １種．０ ０．０ ０．０ ０．０ ０．０ ２．６＋／６．８ 合、−１ ３；｛４ ：Ｉ ｌ ． ６ １５．４ ２０．７＋／−１２．７ （昂１ｒク内没’ｊ） 合；；１ ２．７ １３．１ ；１，５ ６．４＋／づ２ 第 ２ 表 体重増加率，ワクチン投与から剖検までＡ群：ＰＢＳ＋
助成剤アンフィゲン Ｃａｌ： ｒ７４． ５ｋＤａ ＋助成斉１１
リボゾーム／クイルＡワクチン予備投与時 剖検時
増加量２６．３＋／−２．８ Ｄ群： ｒ７４． ５ｋＤａ抗原＋助成剤アンプイゲンＢ群：
ｒ７４． ５ｋＤａ抗原＋アルヒドロゲル Ｅ群： ｒ１１６抗原十アンフィゲン Ｆ群： ｒ ７４．５ｋ Ｄ ａ抗原＋ＰＢＳ （鼻腔内投与） 第６図は、分子量７４．５ｋＤａの抗原遺伝子の形質転
換を示す。この７４．５ｋＤａ遺伝子の２１１位置にお
けるアミノ酸トリプトファンは、ＴＧＡの暗号が付与さ
れている。ブラスミドｐＭＹｃＯ３ １とｐＭＹｃＯ３
２によって生成されるタンパク質を検討して分ったこと
は、ＴＧＡコドンは、ｔｒｐＴ１７６サンプレッサがな
い場合は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｊ２ｉ）内のべブチド鎖の
伸長を終止させることである。試験管内での突然変異に
よって、コドンＴＧＡをＴＧＧに変化させれば、ｔｒｐ
Ｔ１７６サンプレッサがなくても、２１１位置における
ベプチド鎖の伸長を可能ならしめると想定した。
ブラＸミドｐＭＹｃＯ３２を、酵素Ｈｉｎｄ［［［で培
養し、７４．５ｋＤａ抗原遺伝子を含む長さ２．２ｋｂ
の断片を、Ｔ４リガーゼを使用して、Ｈ ｉ ｎｄｌｌ
＋で培養されたベクターｐＵＣ９に作用させて、大腸菌
のＪＭ８３ｉ’１株に形質転換させた。その１種をブラ
スミドｐＭＹｃＯ５６と命名し、その制限マップは第２
１図のようになる。予想の通り、ｐＭＹｃ０５６は、７
４ｋＤａ抗原の早目に終止した断片を生成する。
養し、７４．５ｋＤａ抗原遺伝子を含む長さ２．２ｋｂ
の断片を、Ｔ４リガーゼを使用して、Ｈ ｉ ｎｄｌｌ
＋で培養されたベクターｐＵＣ９に作用させて、大腸菌
のＪＭ８３ｉ’１株に形質転換させた。その１種をブラ
スミドｐＭＹｃＯ５６と命名し、その制限マップは第２
１図のようになる。予想の通り、ｐＭＹｃ０５６は、７
４ｋＤａ抗原の早目に終止した断片を生成する。
第１６図のＭ１３ｍｐｌ８ ＲＦ ＤＮＡは、７２
５３のｊ３コエ対のファーシヘクターで、こゎをＨ ｉ
ｎｄｍとＰｓｔｌで培養し、Ｔ４リガーゼを使用して
、｝｛ｉｎｄｆＩＩとＬ且ユｒで培養さわたｐＭＹＣＯ
３１に作用させて大腸菌のＪＭ１０３菌株に転換された
。転換体の１柚のＭ．１３ＭＹＣＯ１０２（第１７図）
からのＤＮＡを、種々の制限酵素で培養させて、第１７
図の制限マップか得られた。
５３のｊ３コエ対のファーシヘクターで、こゎをＨ ｉ
ｎｄｍとＰｓｔｌで培養し、Ｔ４リガーゼを使用して
、｝｛ｉｎｄｆＩＩとＬ且ユｒで培養さわたｐＭＹＣＯ
３１に作用させて大腸菌のＪＭ１０３菌株に転換された
。転換体の１柚のＭ．１３ＭＹＣＯ１０２（第１７図）
からのＤＮＡを、種々の制限酵素で培養させて、第１７
図の制限マップか得られた。
７４．５ｋＤａ抗原遺伝子のＤＮＡ配列を基幹として、
３６塩基長の合成オリゴヌクレ才チト、即ち下記のＣＯ
Ｄ ６ ３ ９を、ＴＧＡを変化させるように設計した
。その方法は、「核酸研究報」１３巻の８７４９〜８７
６４頁と８７６４〜８７８６頁のテーラー他の方法によ
り、部位指向突然変異を利用する方法である。
３６塩基長の合成オリゴヌクレ才チト、即ち下記のＣＯ
Ｄ ６ ３ ９を、ＴＧＡを変化させるように設計した
。その方法は、「核酸研究報」１３巻の８７４９〜８７
６４頁と８７６４〜８７８６頁のテーラー他の方法によ
り、部位指向突然変異を利用する方法である。
２０４ ＴＲＰ ＡＳＰ 八ＳＮ ＧＬＵ
ＩＬＥ ＶＡＬ ＡＳＮ ＴＲＰ ＬＥ［Ｉ
ＶＡＬ１．ＹＳＬＹＳ ｒＬＥ Ｌ’ｌ’Ｓ ＴＧＧ
ＧＡＴ ＡＡＴ Ｇ＾＾ＡＴＴ ＧＴＡＡＡＴ ＴＧ
Ａ （：ＴＴ ＧＴＴ ＡＡＡ 八ＡＡ Ａ
Ｔ（： ＡＡＡ ＣＣ ＣＴ八ＴＴＡ （；
ＴＴ Ｔ八Ａ ＣＡＴ ＴＴＡ ＡＣＣ Ｇ
ＡＡ Ｃ＾Ａ ＴＴＴ ＴＴＴＴ 「核酸研修報」の第１４巻、９６７９〜９６９８頁（１
９８６）記載のＫ４中１１汀とＰ．エクスタインの方法
によって凋製したＭｌ ３ＭＹＣＯ１ ０２の単ｊｎ
Ｄ Ｎ Ａを、第１種図の各ステンブにおけるＳｌ’ｌ
として使用した。但ｌノ、オリゴヌクレオヂ］・のＣＯ
Ｄ６９３が、１個所だけ突然変異を含むという点で異っ
ている。
ＩＬＥ ＶＡＬ ＡＳＮ ＴＲＰ ＬＥ［Ｉ
ＶＡＬ１．ＹＳＬＹＳ ｒＬＥ Ｌ’ｌ’Ｓ ＴＧＧ
ＧＡＴ ＡＡＴ Ｇ＾＾ＡＴＴ ＧＴＡＡＡＴ ＴＧ
Ａ （：ＴＴ ＧＴＴ ＡＡＡ 八ＡＡ Ａ
Ｔ（： ＡＡＡ ＣＣ ＣＴ八ＴＴＡ （；
ＴＴ Ｔ八Ａ ＣＡＴ ＴＴＡ ＡＣＣ Ｇ
ＡＡ Ｃ＾Ａ ＴＴＴ ＴＴＴＴ 「核酸研修報」の第１４巻、９６７９〜９６９８頁（１
９８６）記載のＫ４中１１汀とＰ．エクスタインの方法
によって凋製したＭｌ ３ＭＹＣＯ１ ０２の単ｊｎ
Ｄ Ｎ Ａを、第１種図の各ステンブにおけるＳｌ’ｌ
として使用した。但ｌノ、オリゴヌクレオヂ］・のＣＯ
Ｄ６９３が、１個所だけ突然変異を含むという点で異っ
ている。
４個の溶菌斑を選び、それらのＤＮＡを取出し、ＤＮＡ
配列を分析した結果、いずれの溶菌斑も所望のＴＧＡか
らＴＧＧへの変更が成さねたてることが判った。ＴＧＡ
コドンと同様に、このＴＧＧコ１・ンは、トリプトファ
ンに対して暗号付けする。但しＴＧＡと異る点は、ＴＧ
Ｇは、大腸菌によって終止コドンとは認識されない点で
ある。４個の溶菌斑のすべてからのＲｆＤＮＡをプール
してＭ１３ＭＹＣＯ７９と命名し、その１６Ｉ１限マッ
プは、Ｍｌ ３ＭＹＣＯ１ ０２と同様であることかわ
かった。
配列を分析した結果、いずれの溶菌斑も所望のＴＧＡか
らＴＧＧへの変更が成さねたてることが判った。ＴＧＡ
コドンと同様に、このＴＧＧコ１・ンは、トリプトファ
ンに対して暗号付けする。但しＴＧＡと異る点は、ＴＧ
Ｇは、大腸菌によって終止コドンとは認識されない点で
ある。４個の溶菌斑のすべてからのＲｆＤＮＡをプール
してＭ１３ＭＹＣＯ７９と命名し、その１６Ｉ１限マッ
プは、Ｍｌ ３ＭＹＣＯ１ ０２と同様であることかわ
かった。
通常の７４．５ｋＤａ抗原遺伝子を、ＴＧＧコドンの複
製体に置きかえるためには、プラスミトρＭＹＣＯ５６
のＤＮＡを酵素Σ圭２１で培養し、−ｆ牛の腸内酵素の
フ才スファターセで処理し、Ｔ４リガーゼを使用して、
Σ↓ヱ■で培養さオ１たＭ１３ＭＹＣＯ７９に作用させ
て、大腸菌のＣＹ１５０００菌株に転換させた。その１
種をブラスミトＰＭＹＣＯ８７と命名し、その制限マッ
プは、ブラスミトｐＭＹｃｏ ５ ６と同一と判明した
。７４．５ｋＤａ抗原と同様に、ブラスミドｐＭＹｃＯ
８７で、２ｉ１位置におけるベブチド鎖の伸長は可能と
なり、約７４ｋＤａのタンパク質が生成される。
製体に置きかえるためには、プラスミトρＭＹＣＯ５６
のＤＮＡを酵素Σ圭２１で培養し、−ｆ牛の腸内酵素の
フ才スファターセで処理し、Ｔ４リガーゼを使用して、
Σ↓ヱ■で培養さオ１たＭ１３ＭＹＣＯ７９に作用させ
て、大腸菌のＣＹ１５０００菌株に転換させた。その１
種をブラスミトＰＭＹＣＯ８７と命名し、その制限マッ
プは、ブラスミトｐＭＹｃｏ ５ ６と同一と判明した
。７４．５ｋＤａ抗原と同様に、ブラスミドｐＭＹｃＯ
８７で、２ｉ１位置におけるベブチド鎖の伸長は可能と
なり、約７４ｋＤａのタンパク質が生成される。
ｐＭＹｃＯ８７のアンビシリン耐性をテトラサイクソン
耐性に変換させるために、ｐＭＹｃＯ８７のＤＮＡを酵
素戊工１ｍと旦且旦ＲＩによって培養し、リガーゼＴ４
を使用して、テトラサイクリン耐性クローニングベクタ
ーｐＢＲ３２２の２．５ｋｂ（７）ＡｆｎｔｌｌとＥｃ
ｏＲＩ（７）断片に作用させて、大腸菌のＭＨＩ菌株に
形質転換させた。
耐性に変換させるために、ｐＭＹｃＯ８７のＤＮＡを酵
素戊工１ｍと旦且旦ＲＩによって培養し、リガーゼＴ４
を使用して、テトラサイクリン耐性クローニングベクタ
ーｐＢＲ３２２の２．５ｋｂ（７）ＡｆｎｔｌｌとＥｃ
ｏＲＩ（７）断片に作用させて、大腸菌のＭＨＩ菌株に
形質転換させた。
転換体の１種をブラスミドｐＭＹｃＯ９１（第２２図）
と命名し、そのＤＮＡを拳ク々の畷ｊ限酵素で培養して
、図示のマップを得た。ｆ想とおり、このＰＭＹＣＯ９
１は、約７４ｋＤａのタンクパク質を生成する。このｐ
ＭＹ Ｃ Ｏ ９ １ （Ｄａ能区域は、第２３図中
に表示されている。
と命名し、そのＤＮＡを拳ク々の畷ｊ限酵素で培養して
、図示のマップを得た。ｆ想とおり、このＰＭＹＣＯ９
１は、約７４ｋＤａのタンクパク質を生成する。このｐ
ＭＹ Ｃ Ｏ ９ １ （Ｄａ能区域は、第２３図中
に表示されている。
なお、プラスミドｐＭＹｃＯ８７とｐＭＹｃｏ９１は、
共に、ＴＧＡサンブレッサがない状態て、７４．５ｋＤ
ａの抗原に対してＩｔｓ号付けをする。
共に、ＴＧＡサンブレッサがない状態て、７４．５ｋＤ
ａの抗原に対してＩｔｓ号付けをする。
さきに実施例１に記載したラムダ５−５−５９から引出
された再分離増殖体のＤＮＡ配列の分析によれば、長さ
６．８ｋｂの断片は、仮想的なマイコブラズマタンパク
質４１″に相当する開いた読み取り枠を有することが示
さわた。この予知されたアミノ酸配列は、大腸菌のｄｎ
ａＪ菌株のものと５８％まで同一であった。このｄｎａ
ｊと４１＠どの各配列の一部分の比較は下記のとおりで
ある。
された再分離増殖体のＤＮＡ配列の分析によれば、長さ
６．８ｋｂの断片は、仮想的なマイコブラズマタンパク
質４１″に相当する開いた読み取り枠を有することが示
さわた。この予知されたアミノ酸配列は、大腸菌のｄｎ
ａＪ菌株のものと５８％まで同一であった。このｄｎａ
ｊと４１＠どの各配列の一部分の比較は下記のとおりで
ある。
ｄｎａＪ （配列） ：’Ｍｅｔ Ａｌａ ｌｙｓ Ｇ
ｌｎ 八ｓｐ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｉｌｃ Ｌｅ
ｕ４１” （配列） ： ｍｅｔ ａｌａ Ｉｙｓ
ｇｉｎ ａｓｐ ｐｈｅ ｔｙｒ Ｉｙｓ ｔｙｒ Ｉ
ｙｓｄｎａＪ （配列） ： ”Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｓｅ
ｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｒｇ
Ｇｌｕ４１責配列） ： ｇｌｙｖａｌ ｇ１ｕｌ
ｙｓｓｅｒａ１ａｓｅｒ１ｅｕｔｈｒｇｌｕｄｎａＪ
（配列） ：”Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｔｙ
ｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｍｅｔ旧責配列
）： Ｉｌｅ Ｉｙｓ ｌｙｓａｌａ Ｌｙｒａｒｇ
ａｓｎ ｌｅｕｖａｌ ａｓｎｄｎａＪ （配列） ：
”Ｌｙｓ Ｔｙｒ ｌｌｉｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｒｇ
Ａｓｎ Ｇｌｎ ＧｌｙΔｓｐ４１’ （配列） ：
ｉｌｅ ｔｙｒ ｈｉｓ ｐｒｏ ａｓｐ Ｉｙｓ
ａｓｎ ｔｈｒ Ｉｙｓ Ｉｙｓこの４１１内でのア
ミノ酸配列は，その５０％以上かｄｎａＪのアミノ酸配
列と同一であると共に、４１１抗原がｄｎａＪの同族体
であることが、下記の事実から支持された。即ち（ａ）
大腸菌ｄｎａＪの遺伝子は、大腸菌ｄｎａκの遺伝子か
らの流れをくむものであること、（２）大腸菌の株ｄｎ
ａＫとｄｎａＪとの間には、ＡＡＵＵＵループを持った
１６対の塩基対基幹を形成する潜在力を有する逆位反復
部が存在すること。この２種のＩＲ造は、いずれも肺炎
病原体内に保有されている。
ｌｎ 八ｓｐ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｉｌｃ Ｌｅ
ｕ４１” （配列） ： ｍｅｔ ａｌａ Ｉｙｓ
ｇｉｎ ａｓｐ ｐｈｅ ｔｙｒ Ｉｙｓ ｔｙｒ Ｉ
ｙｓｄｎａＪ （配列） ： ”Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｓｅ
ｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｒｇ
Ｇｌｕ４１責配列） ： ｇｌｙｖａｌ ｇ１ｕｌ
ｙｓｓｅｒａ１ａｓｅｒ１ｅｕｔｈｒｇｌｕｄｎａＪ
（配列） ：”Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｔｙ
ｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｍｅｔ旧責配列
）： Ｉｌｅ Ｉｙｓ ｌｙｓａｌａ Ｌｙｒａｒｇ
ａｓｎ ｌｅｕｖａｌ ａｓｎｄｎａＪ （配列） ：
”Ｌｙｓ Ｔｙｒ ｌｌｉｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｒｇ
Ａｓｎ Ｇｌｎ ＧｌｙΔｓｐ４１’ （配列） ：
ｉｌｅ ｔｙｒ ｈｉｓ ｐｒｏ ａｓｐ Ｉｙｓ
ａｓｎ ｔｈｒ Ｉｙｓ Ｉｙｓこの４１１内でのア
ミノ酸配列は，その５０％以上かｄｎａＪのアミノ酸配
列と同一であると共に、４１１抗原がｄｎａＪの同族体
であることが、下記の事実から支持された。即ち（ａ）
大腸菌ｄｎａＪの遺伝子は、大腸菌ｄｎａκの遺伝子か
らの流れをくむものであること、（２）大腸菌の株ｄｎ
ａＫとｄｎａＪとの間には、ＡＡＵＵＵループを持った
１６対の塩基対基幹を形成する潜在力を有する逆位反復
部が存在すること。この２種のＩＲ造は、いずれも肺炎
病原体内に保有されている。
プースミド ＭＹＣＯ８０（７）
第１１図、第２５図のブラスミＦｐＭＹＣＯ３２を、分
子Ｄｋ４１＊ｋＤａ抗原遺伝子の源泉として、種々の発
現ブラスミドの開発に使用した。
子Ｄｋ４１＊ｋＤａ抗原遺伝子の源泉として、種々の発
現ブラスミドの開発に使用した。
７４．５ｋＤａと４１１の抗原遺伝子は、プラスミドｐ
ＭＹｃＯ３２中に含まれている。７４．５ｋＤａ抗原の
遺伝子を除去するために、ｐＭＹＣＯ３２を調製して酵
素ＨｉｎｄＩＩＩで培養し、Ｔ４リガーゼをと作用させ
て、大腸菌株ＪＭ８３に形質変換させた。その内の１種
をｐＭＹｃＯ７３と命名し、そのＤＮＡを取出して、種
々の制限酵素で培養して、第２４図の制限マップを得た
。
ＭＹｃＯ３２中に含まれている。７４．５ｋＤａ抗原の
遺伝子を除去するために、ｐＭＹＣＯ３２を調製して酵
素ＨｉｎｄＩＩＩで培養し、Ｔ４リガーゼをと作用させ
て、大腸菌株ＪＭ８３に形質変換させた。その内の１種
をｐＭＹｃＯ７３と命名し、そのＤＮＡを取出して、種
々の制限酵素で培養して、第２４図の制限マップを得た
。
ＤＮＡ配列を分析して、ブラスミドｐＭＹｃＯ７３は、
４１１抗原の場合にはそのアミノ酸終端を暗号付けして
いる抗原遺伝子の部分が欠失していることが分った。こ
の欠失部を補うために、ｐＭＹＣＯ３２を酵素Ｂｃｌｌ
ｌとＰ ｖ ｕ ＩＩで培養し、１９８番目の塩基対断
片（第２５図で、塩基対４２５８と４４５７との間にあ
る）を蹟製し、Ｔ４ソガーゼを使用してｌ且旦Ｈｌと主
！ＡＩで培養されたベクターＰＵＣ９に作用させて、大
腸菌株ＪＭ８３に転換させた。その１種をプラスミドｐ
ＭＹＣＯ７４と命名し、そのＤＮＡを調製し、Ｈｉ ｎ
ｄＩ［Ｉて培養し、１６５番目の塩基対Ｈｉｎｄｍ−Ｈ
ｉｎｄｌＩｌの断片を１＃製し、Ｔ４リガーゼを使用し
て、ＨｉｎｄｌＩｌで培養されたｐＭＹｃＯ７３に作用
させて、大腸菌株ＪＭ８３に転換させた。その１種をプ
ラスミドｐＭＹｃＯ８０と命名し、その制限マップは第
２６図である。
４１１抗原の場合にはそのアミノ酸終端を暗号付けして
いる抗原遺伝子の部分が欠失していることが分った。こ
の欠失部を補うために、ｐＭＹＣＯ３２を酵素Ｂｃｌｌ
ｌとＰ ｖ ｕ ＩＩで培養し、１９８番目の塩基対断
片（第２５図で、塩基対４２５８と４４５７との間にあ
る）を蹟製し、Ｔ４ソガーゼを使用してｌ且旦Ｈｌと主
！ＡＩで培養されたベクターＰＵＣ９に作用させて、大
腸菌株ＪＭ８３に転換させた。その１種をプラスミドｐ
ＭＹＣＯ７４と命名し、そのＤＮＡを調製し、Ｈｉ ｎ
ｄＩ［Ｉて培養し、１６５番目の塩基対Ｈｉｎｄｍ−Ｈ
ｉｎｄｌＩｌの断片を１＃製し、Ｔ４リガーゼを使用し
て、ＨｉｎｄｌＩｌで培養されたｐＭＹｃＯ７３に作用
させて、大腸菌株ＪＭ８３に転換させた。その１種をプ
ラスミドｐＭＹｃＯ８０と命名し、その制限マップは第
２６図である。
こ（７）ｐＭＹｃＯ８０から（７）ＤＮＡを大腸菌株Ｃ
Ｙ１５０００に転換させた。いくつかの転換体を選択し
てＬ肉汁中３７℃で、外径ＯＤｓｓｏ＝２となるまで成
長させ、遠心分離により細胞を採取した。細胞を、媒質
成分による汚染を除くためにＭ９緩衝液に再懸濁させて
洗浄し、再び遠心法で分離採取した。得られた細胞ベレ
ットを、０． ５ｍ ｇ ／ ｍ Ｊｌの鶏卵白リゾチ
ームを２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐ８８．０の１０ｍＭ
ＥＤＴＡに溶解した液中に、始めの培養体積の１５
分の１において再懸濁させ、２５℃でｉｏ分間熟成させ
、４℃１５分間超音波処理した。得られた全溶菌液を遠
心加速度１３．ＯＯＯｇで１ｏ分間４℃において遠心分
埋し、その上澄み液を可溶性タンパク質分として保有し
た。沈殿は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０７７
）ＥＤＴＡと２％トライトンＸ−１００より成る溶液中
で２時間溶解させた。分液して得られた各部分を、ＳＤ
Ｓボリアクリルアミドゲル電気詠動法で分別し、クーマ
ジ青でタンパク質着色試験を行った。新たに、４１ｋＤ
ａのタンパク質が、溶菌液およびブラスミトｐＭＹｃＯ
８０のトライトン可溶化分液中に確認された。ウェスタ
ン法プロット分析により、このタンパク質は、回復期の
家豚の血清と反応することが示された。
Ｙ１５０００に転換させた。いくつかの転換体を選択し
てＬ肉汁中３７℃で、外径ＯＤｓｓｏ＝２となるまで成
長させ、遠心分離により細胞を採取した。細胞を、媒質
成分による汚染を除くためにＭ９緩衝液に再懸濁させて
洗浄し、再び遠心法で分離採取した。得られた細胞ベレ
ットを、０． ５ｍ ｇ ／ ｍ Ｊｌの鶏卵白リゾチ
ームを２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐ８８．０の１０ｍＭ
ＥＤＴＡに溶解した液中に、始めの培養体積の１５
分の１において再懸濁させ、２５℃でｉｏ分間熟成させ
、４℃１５分間超音波処理した。得られた全溶菌液を遠
心加速度１３．ＯＯＯｇで１ｏ分間４℃において遠心分
埋し、その上澄み液を可溶性タンパク質分として保有し
た。沈殿は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０７７
）ＥＤＴＡと２％トライトンＸ−１００より成る溶液中
で２時間溶解させた。分液して得られた各部分を、ＳＤ
Ｓボリアクリルアミドゲル電気詠動法で分別し、クーマ
ジ青でタンパク質着色試験を行った。新たに、４１ｋＤ
ａのタンパク質が、溶菌液およびブラスミトｐＭＹｃＯ
８０のトライトン可溶化分液中に確認された。ウェスタ
ン法プロット分析により、このタンパク質は、回復期の
家豚の血清と反応することが示された。
（実施例１ｆ）ｊ′．ｆ′Ｌ の９６ｋＤａＬＦ．分子
ｆｉｌ ９ ６ ｋ Ｄ ａ抗原の部分的アミノ酸配列
に基いて、下記のオリゴヌクレオチド族（ＣＯＤ８２９
およびＣＯＤ８３０）を合成した。
ｆｉｌ ９ ６ ｋ Ｄ ａ抗原の部分的アミノ酸配列
に基いて、下記のオリゴヌクレオチド族（ＣＯＤ８２９
およびＣＯＤ８３０）を合成した。
９６ｋＤａアミノ
の一
ＣＯＤ ８２９
八１ａ−八ｓｐ−Ｇ ｌｕ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−
Ｘｘｘ−ＧＩｎ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−ＳｅｒＧＣ
Ｘ ＧＡＴ ＧＡＡ ＡＡＡ ＡＧＸ ＡＧＣＧＧＴＣ ＣＯＤ ８３０ Ｔｈｒ Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−１１ｃ−Ａｓｐ−Ｐ
ｈｅ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｈ
ｒＡＴＡ ＧＡＴ ＴＴＴ ＣＡＡ ＴＡＴ ＧＡ丁
ＣＣＧＣ Ｃ 肺炎病原体遺伝子ＤＮＡを、創限酵素で培養し、アロガ
ースゲル電気泳動で分子量の差に応じて分離させ、サザ
ン法プロット分析を行った。
Ｘｘｘ−ＧＩｎ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−ＳｅｒＧＣ
Ｘ ＧＡＴ ＧＡＡ ＡＡＡ ＡＧＸ ＡＧＣＧＧＴＣ ＣＯＤ ８３０ Ｔｈｒ Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−１１ｃ−Ａｓｐ−Ｐ
ｈｅ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｈ
ｒＡＴＡ ＧＡＴ ＴＴＴ ＣＡＡ ＴＡＴ ＧＡ丁
ＣＣＧＣ Ｃ 肺炎病原体遺伝子ＤＮＡを、創限酵素で培養し、アロガ
ースゲル電気泳動で分子量の差に応じて分離させ、サザ
ン法プロット分析を行った。
ＣＯＤ８２９、ＣＯＤ８３０は共に、大きさ１４００塩
基対（長さｌ ４ｉｃｂ）のＨｉｎｄｌ１７制限断片、
および３，３００塩基対（３．３ｋｂ）のＥｃｏＲ１制
限断片に変柚形成されていることが認められた。
基対（長さｌ ４ｉｃｂ）のＨｉｎｄｌ１７制限断片、
および３，３００塩基対（３．３ｋｂ）のＥｃｏＲ１制
限断片に変柚形成されていることが認められた。
肺炎病原体遺伝子ＤＮＡを、Ｈｉｎｄｍで培養し，ポリ
アクリルアミトゲル電気泳動によって分別し、約１．４
ｋｂ長さの断片を電気的に溶離させ、Ｈｉ工ｄｍで培養
したベクターｐ Ｕ Ｃ ９ ニ作用させて、大きさ選
択用の遺伝子ライブラリーを作成した。９６ｋＤａの抗
原に特有のクローンを見分けるために、複数個のライブ
ラリ番号がらプラスミドＤＮＡを調製し、ＨｉｎｄｌＩ
Ｉで培養し、ニトロセルロース中に移行させて、サザン
法プロット分析に供し、ＣＯＤ８３０によってブローブ
レた。２種のクローン（分想増殖体）ｐＭＹＣ０９２（
第２７図〉とｐＭＹｃＯ９４は、ｃｏＤ８３０に異種結
合する１．４ｋｂのＨｉｎｄｌＩＩ挿入部位を含むもの
であった。
アクリルアミトゲル電気泳動によって分別し、約１．４
ｋｂ長さの断片を電気的に溶離させ、Ｈｉ工ｄｍで培養
したベクターｐ Ｕ Ｃ ９ ニ作用させて、大きさ選
択用の遺伝子ライブラリーを作成した。９６ｋＤａの抗
原に特有のクローンを見分けるために、複数個のライブ
ラリ番号がらプラスミドＤＮＡを調製し、ＨｉｎｄｌＩ
Ｉで培養し、ニトロセルロース中に移行させて、サザン
法プロット分析に供し、ＣＯＤ８３０によってブローブ
レた。２種のクローン（分想増殖体）ｐＭＹＣ０９２（
第２７図〉とｐＭＹｃＯ９４は、ｃｏＤ８３０に異種結
合する１．４ｋｂのＨｉｎｄｌＩＩ挿入部位を含むもの
であった。
このｐＭＹｃＯ９２の挿入個所のＤＮＡ配列を分析シテ
、（１）それが、ｃｏＤ８２９とｃｏＤ８３０と類似の
区域を有すること、および（２）すべてのアミノ酸が，
その１種を除き、下記に示す９６ｋＤａ抗原に対して決
定されるアミノ酸配列に適合するＤＮＡ配列から予見で
きることがｆ１１明した。
、（１）それが、ｃｏＤ８２９とｃｏＤ８３０と類似の
区域を有すること、および（２）すべてのアミノ酸が，
その１種を除き、下記に示す９６ｋＤａ抗原に対して決
定されるアミノ酸配列に適合するＤＮＡ配列から予見で
きることがｆ１１明した。
配列
配列
配列
さらにアミノ酸配列を再分析した結果では、明確に特定
されていないアミノ酸による不適合が考えられる。９６
ｋＤａの抗原に対して求めらねたアミノ酸配列は、内部
のクローン配列に合致しており、分析とも矛盾しない結
果が、タンパク質分解亀裂によって引出される断片につ
いても適用できることが分った。２種のクローンのｐＭ
Ｙｃｏ９２とｐＭＹｃＯ９４を制限酵素で分析すると、
それらの挿入部位が、一見同一であるが、ρＵＣ９ベク
ターに対して、互いに反対向きであることが判明した。
されていないアミノ酸による不適合が考えられる。９６
ｋＤａの抗原に対して求めらねたアミノ酸配列は、内部
のクローン配列に合致しており、分析とも矛盾しない結
果が、タンパク質分解亀裂によって引出される断片につ
いても適用できることが分った。２種のクローンのｐＭ
Ｙｃｏ９２とｐＭＹｃＯ９４を制限酵素で分析すると、
それらの挿入部位が、一見同一であるが、ρＵＣ９ベク
ターに対して、互いに反対向きであることが判明した。
ｐＭＹｃ０９２は、ＣＯＤ８２９、ＣＯＤ８３０の何わ
かに対しても異種接合する予期の大きざの挿入部を有す
ると共に、９６ｋＤａの抗原のアミノ酸配列に適合する
ようなＤＮＡ配列を有するので、長さ１．４ｋｂ Ｈ
ｉｎｄｌＩＩの挿入部が、３．３ｋｂのＥｃｏＲＩ断片
をクローンするためのブローブとして利川できる可能性
があった。肺炎病原体ＤＮＡを、ＥｃｏＲＩで部分的に
培養し、指数的アロガース勾配分析法によって分子−（
迂に応じて分別し、プールされた１５，０００から１種
，０００対の塩基対断片を、バクテリオファージラムダ
ベクター（ラムダダッシュ）ｐＭＹＣＯ９２にクローン
させ、ランダムに挿入されたＤＮＡラベリングキット（
ヘーリンガー社製）を使用して、放射性によるラベル付
けを行い、約５００個の組換え体溶菌斑の中から、５個
の、ρＭＹＣＯ９２に異梯交配された溶菌斑が判別され
た。
かに対しても異種接合する予期の大きざの挿入部を有す
ると共に、９６ｋＤａの抗原のアミノ酸配列に適合する
ようなＤＮＡ配列を有するので、長さ１．４ｋｂ Ｈ
ｉｎｄｌＩＩの挿入部が、３．３ｋｂのＥｃｏＲＩ断片
をクローンするためのブローブとして利川できる可能性
があった。肺炎病原体ＤＮＡを、ＥｃｏＲＩで部分的に
培養し、指数的アロガース勾配分析法によって分子−（
迂に応じて分別し、プールされた１５，０００から１種
，０００対の塩基対断片を、バクテリオファージラムダ
ベクター（ラムダダッシュ）ｐＭＹＣＯ９２にクローン
させ、ランダムに挿入されたＤＮＡラベリングキット（
ヘーリンガー社製）を使用して、放射性によるラベル付
けを行い、約５００個の組換え体溶菌斑の中から、５個
の、ρＭＹＣＯ９２に異梯交配された溶菌斑が判別され
た。
ＤＮＡは、５種のファージから調製され、ＥｃｏＲＩで
培養され、ゲル電気泳動法によって分析されて、各溶菌
斑は、前述の断片（他の断片の他に）を含むものであっ
た。ＤＮＡを、ＭＹＣＯ５と命名した他の組換え体から
調製し、制限酵素によって培養し、得られた制限マップ
は第２８図である。
培養され、ゲル電気泳動法によって分析されて、各溶菌
斑は、前述の断片（他の断片の他に）を含むものであっ
た。ＤＮＡを、ＭＹＣＯ５と命名した他の組換え体から
調製し、制限酵素によって培養し、得られた制限マップ
は第２８図である。
長さ３．３ｋｂのＥｃｏＲＩ断片をサブクローンさせる
ために、ラムダＭＹＣＯ５を、ＥｃｏＲ！で培養し、Ｅ
ｃｏＲＩで培養したベクターｐＵＣ９に作用させて、大
腸菌κ１２のＪＭ８３菌株に転換させた。３．３ｋｂ長
さのＥｃｏＲＩ断片を含む２種の転換体ｐＭＹｃＯ９５
とｐＭＹｃｏ９６を分離し、それらのＤＮＡを調製し、
制限酵素分析を行ったところ、それらの挿入部は、一見
同一であるが、その方向は、ｐＵＣ９ベクターに対して
正反対であった。このｐＭＹｃＯ９５の制限マップは第
２９図のとおりである。長さ１．４ｋｂのＨｉｎｄｌＩ
Ｉ断片のＤＮＡ配列分析と、ラムダＭＭＣＯ５の制限マ
ツプデータによれば、３．３ｋｂ長さのＥｃｏＲＩ断片
は、分子ｆｉ９６ｋＤａの抗原遺伝子の全体を含んでは
いないことが分った。
ために、ラムダＭＹＣＯ５を、ＥｃｏＲ！で培養し、Ｅ
ｃｏＲＩで培養したベクターｐＵＣ９に作用させて、大
腸菌κ１２のＪＭ８３菌株に転換させた。３．３ｋｂ長
さのＥｃｏＲＩ断片を含む２種の転換体ｐＭＹｃＯ９５
とｐＭＹｃｏ９６を分離し、それらのＤＮＡを調製し、
制限酵素分析を行ったところ、それらの挿入部は、一見
同一であるが、その方向は、ｐＵＣ９ベクターに対して
正反対であった。このｐＭＹｃＯ９５の制限マップは第
２９図のとおりである。長さ１．４ｋｂのＨｉｎｄｌＩ
Ｉ断片のＤＮＡ配列分析と、ラムダＭＭＣＯ５の制限マ
ツプデータによれば、３．３ｋｂ長さのＥｃｏＲＩ断片
は、分子ｆｉ９６ｋＤａの抗原遺伝子の全体を含んでは
いないことが分った。
ラムダＭＹＣＯ５の制限分析によれば、２．２ｋｂのＥ
ｃｏＲＩ断片は、３．３ｋｂのＥｃｏＲＩ断片の近傍に
あり、その位置が正しいとすれば、これら２種の断片は
、９６ｋＤａの抗原遺伝子全体を含む程十分に長い。こ
の区域をサブクローンするために、ラムダＭＹＣＯ５を
、ｌ｛１■とΣ見ｕＩで培養し、ｌ五１■とＳａＩｌ．
Ｉで培養されたｐＷＨＡ１４８に作用させて、大腸菌κ
ｌ２のＪＭ８３株に転換させた。その１種を第３０図の
ｐＭＹｃ０ １ １ ８と命名し、これは、予期された
長さ（３．Ｏｋｂ）のμｗｎ一鎚ＩＩの断片を含むもの
である。このＤＮＡを調製し、種々の制限酵素で培養し
て、第３０図の制限マップが得られた。
ｃｏＲＩ断片は、３．３ｋｂのＥｃｏＲＩ断片の近傍に
あり、その位置が正しいとすれば、これら２種の断片は
、９６ｋＤａの抗原遺伝子全体を含む程十分に長い。こ
の区域をサブクローンするために、ラムダＭＹＣＯ５を
、ｌ｛１■とΣ見ｕＩで培養し、ｌ五１■とＳａＩｌ．
Ｉで培養されたｐＷＨＡ１４８に作用させて、大腸菌κ
ｌ２のＪＭ８３株に転換させた。その１種を第３０図の
ｐＭＹｃ０ １ １ ８と命名し、これは、予期された
長さ（３．Ｏｋｂ）のμｗｎ一鎚ＩＩの断片を含むもの
である。このＤＮＡを調製し、種々の制限酵素で培養し
て、第３０図の制限マップが得られた。
長さ３．３および２．２ｋｂの旦且旦Ｒｌ断片の遺伝情
報的位置が、ＭＹＣＯＳ内と同一であることを示すため
に、肺炎病原体をサザン法プロット分析に供した。ＰＭ
ＹＣ０ １ １ ８の３．０ｋｂのＢｇｊｌＩＩ−Ｓａ
ｉｔＩ断片（何れもＥｃｏＲＩ断片を含む）が、ｐＭＹ
ｃＯ９５の長さ０．９ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩ［
Ｉ断片（長い方の断片のみを含む）によって認識される
ところの、肺炎病原体の長さ２０ｋｂのＨｉｎｄｍ断片
に異種接合されていることが分った。この３．３および
２．２ｋｂのＥｃｏＲＩ断片が、ＭＹＣＯＳ中に存在す
る断片と異なるとすれば、ｐＭＹｃＯ１１種の長さ３．
ＯｋｂのＢｇＩｔＨ−Ｓａｉ工の断片が、他のＨｉｎｄ
ｍ断片に異種接合されている可能性は十分に予測される
。
報的位置が、ＭＹＣＯＳ内と同一であることを示すため
に、肺炎病原体をサザン法プロット分析に供した。ＰＭ
ＹＣ０ １ １ ８の３．０ｋｂのＢｇｊｌＩＩ−Ｓａ
ｉｔＩ断片（何れもＥｃｏＲＩ断片を含む）が、ｐＭＹ
ｃＯ９５の長さ０．９ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩ［
Ｉ断片（長い方の断片のみを含む）によって認識される
ところの、肺炎病原体の長さ２０ｋｂのＨｉｎｄｍ断片
に異種接合されていることが分った。この３．３および
２．２ｋｂのＥｃｏＲＩ断片が、ＭＹＣＯＳ中に存在す
る断片と異なるとすれば、ｐＭＹｃＯ１１種の長さ３．
ＯｋｂのＢｇＩｔＨ−Ｓａｉ工の断片が、他のＨｉｎｄ
ｍ断片に異種接合されている可能性は十分に予測される
。
前記のｐＭＹＣ０１ １ ８を、酵素ｌ工１■とＳａＪ
２Ｉで培養し、ｌ■１Ｉ１とΣ且１工で培養されたｐＭ
ＹｃＯ９６ （これは、ベクターに関して反対方向であ
る点以外はｐＭＹｃＯ９５と同一である）に、リガーゼ
を使用して作用させて、大腸菌κ１２のＪＭ８３菌株に
転換させた。その１種をｐＭＹｃｏ １ １ ９と命名
し、そのＤＮＡを調製し、種々の制限酵素で培養するこ
とにより、第３１図の制限マップを作成した。９６ｋＤ
ａの抗原遺伝子の大体の位置が記入されている。
２Ｉで培養し、ｌ■１Ｉ１とΣ且１工で培養されたｐＭ
ＹｃＯ９６ （これは、ベクターに関して反対方向であ
る点以外はｐＭＹｃＯ９５と同一である）に、リガーゼ
を使用して作用させて、大腸菌κ１２のＪＭ８３菌株に
転換させた。その１種をｐＭＹｃｏ １ １ ９と命名
し、そのＤＮＡを調製し、種々の制限酵素で培養するこ
とにより、第３１図の制限マップを作成した。９６ｋＤ
ａの抗原遺伝子の大体の位置が記入されている。
ブラスミドｐＭＹｃｏ １ １ ９は、前記実施例１に
記載の方法により，大腸菌（Ｅ．ｃｏＪ２ｉ）の菌株Ｃ
Ｙ１５０００に転換され、９６ｋＤａの肺炎病原体抗原
のエピトーブを認識する抗体を誘発させる機能のある１
種のタンパク質を発現することができる。
記載の方法により，大腸菌（Ｅ．ｃｏＪ２ｉ）の菌株Ｃ
Ｙ１５０００に転換され、９６ｋＤａの肺炎病原体抗原
のエピトーブを認識する抗体を誘発させる機能のある１
種のタンパク質を発現することができる。
以上、この発明の、特にワクチンを生成するために発現
されるタンパク質の使用に関して説明したが、発現され
る種々のタンパク質は、胛炎マイコプラズマ病原体の抗
体を判別するための診断用としても使用できる。さらに
、発現されるタンパク質は、抗体を銹発させるために使
用できると共に、誘発された抗体をワクチンとして使用
することも可能である。
されるタンパク質の使用に関して説明したが、発現され
る種々のタンパク質は、胛炎マイコプラズマ病原体の抗
体を判別するための診断用としても使用できる。さらに
、発現されるタンパク質は、抗体を銹発させるために使
用できると共に、誘発された抗体をワクチンとして使用
することも可能である。
この発明は前記各々の実施例の他に、さらに多くの変形
および改良が可能であり、これらもこの発明の特許請求
の範囲に属することは勿論である。
および改良が可能であり、これらもこの発明の特許請求
の範囲に属することは勿論である。
この発明による組成物中の発現伝播体、例えば１ル炎病
原体の抗原は、病原体抗原のエピトープを認識する抗体
を誘起させる機能のあるタンパク質を発現させることが
できる。
原体の抗原は、病原体抗原のエピトープを認識する抗体
を誘起させる機能のあるタンパク質を発現させることが
できる。
またこの発明によれば、適切なブラスミドを使用して大
腸菌等を形質転換すれば、病原体抗原を発現させ、これ
を利用して病患づ予防接種用に応用することが可能とな
る。
腸菌等を形質転換すれば、病原体抗原を発現させ、これ
を利用して病患づ予防接種用に応用することが可能とな
る。
ｌの制限マップ、第２図は、転換体ｐＭＹｃＯ４の制限
マップ、第３図は、転換体ｐＭＹｃｏ １ ５の制限マ
ップ、第４図は、転換体ｐＭＹｃＯ８の制限マップ、第
５図は、転換体ｐＭＹｃＯ１６の制限マップ、第６図は
、７４．５ｋＤａ遺伝子の形質転換を示す図、第７図は
、Ｂ−ガラクトシダーゼのアミノ酸端末配列図、第８図
は、ブラスミドρＭＹＣＯ’２９の制限マップ、第９図
は、ブラスミトｐＭＹｃＯ３ １の制限マップ、第１０
図は、ブラスミトｐｃＡＭ１０１の制限マップ、第１１
図は、ブラスミトｐ Ｍ Ｙ Ｃ Ｏ ３ ２の制限マ
ップ、第１２図は、形質転換体ｐＭＹｃＯ３９の制限マ
ップ、第１３図は、形質転換体ｐＭＹＣ０４０の制限マ
ップ、第１４図は、４１ｋＤａ遺伝子の翻訳を示す配列
図、第１５図は、転換体ＰＭＶＣＯ５０の制限マップ、
第１６図は、ベクターＭ１３ｍｐｌ８の制限マップ、第
１７図は、転換体ｍｌ３ＭＹｃＯ１０２の制限マップ、
第１種図は、Ｍ１３ＭＹＣＯ１０２から翻訳するステッ
プを示す説明図、第１９図は、転換体ｍ１３ＭＹＣＯ１
０７の制限マップ、第２０図は、転換体ρＭＹＣＯ１１
６の制限マップ、第２１図は、転換体ｐ Ｍ Ｙ Ｃ
０ ５ ６の制限マップ、第２２図は、転換体ｐＭＹｃ
Ｏ９ １の制限マップ、第２３図は、転換体ｐＭＹｃＯ
９ １の他の実施例の制限マップ、第２４図は、転換体
ｐＭＹｃＯ７３の制限マップ、第２５図は、ブラスミド
ｐＭＹＣ０３２の制限マップ、第２６図は、プラスミ｝
”ｐＭＹｃＯ８０ ４６３９ｂｐの制限マップ、第２
７図は、ブラスミドｐＭＹｃＯ９２の制限マップ、第２
８図は、ファージから調製されたＤＮＡの制限マップ、
第２９図は、λＭＹＣＯ５からの転換体ｐＭＹｃＯ９５
の制限マップ、第３０図は、λＭＹＣＯ５からの転換体
ｐＭＹＣ０１１種の制限マップ、第３１図は、ｐＭＹｃ
ｏ１１種からの転換体ｐＭＹｃｏ１ １ ９の制限マッ
プ、第３２図は、分子Ｐｉ ３ ６ ｋ Ｄ ａのＤＮ
Ａの制限マップ、第３３図は、分子量４１” ｋＤａ遺
伝ｒの翻訳説明図、第３４図は、分子量９５．６ｋＤａ
のＤＮＡの制限マップである。
マップ、第３図は、転換体ｐＭＹｃｏ １ ５の制限マ
ップ、第４図は、転換体ｐＭＹｃＯ８の制限マップ、第
５図は、転換体ｐＭＹｃＯ１６の制限マップ、第６図は
、７４．５ｋＤａ遺伝子の形質転換を示す図、第７図は
、Ｂ−ガラクトシダーゼのアミノ酸端末配列図、第８図
は、ブラスミドρＭＹＣＯ’２９の制限マップ、第９図
は、ブラスミトｐＭＹｃＯ３ １の制限マップ、第１０
図は、ブラスミトｐｃＡＭ１０１の制限マップ、第１１
図は、ブラスミトｐ Ｍ Ｙ Ｃ Ｏ ３ ２の制限マ
ップ、第１２図は、形質転換体ｐＭＹｃＯ３９の制限マ
ップ、第１３図は、形質転換体ｐＭＹＣ０４０の制限マ
ップ、第１４図は、４１ｋＤａ遺伝子の翻訳を示す配列
図、第１５図は、転換体ＰＭＶＣＯ５０の制限マップ、
第１６図は、ベクターＭ１３ｍｐｌ８の制限マップ、第
１７図は、転換体ｍｌ３ＭＹｃＯ１０２の制限マップ、
第１種図は、Ｍ１３ＭＹＣＯ１０２から翻訳するステッ
プを示す説明図、第１９図は、転換体ｍ１３ＭＹＣＯ１
０７の制限マップ、第２０図は、転換体ρＭＹＣＯ１１
６の制限マップ、第２１図は、転換体ｐ Ｍ Ｙ Ｃ
０ ５ ６の制限マップ、第２２図は、転換体ｐＭＹｃ
Ｏ９ １の制限マップ、第２３図は、転換体ｐＭＹｃＯ
９ １の他の実施例の制限マップ、第２４図は、転換体
ｐＭＹｃＯ７３の制限マップ、第２５図は、ブラスミド
ｐＭＹＣ０３２の制限マップ、第２６図は、プラスミ｝
”ｐＭＹｃＯ８０ ４６３９ｂｐの制限マップ、第２
７図は、ブラスミドｐＭＹｃＯ９２の制限マップ、第２
８図は、ファージから調製されたＤＮＡの制限マップ、
第２９図は、λＭＹＣＯ５からの転換体ｐＭＹｃＯ９５
の制限マップ、第３０図は、λＭＹＣＯ５からの転換体
ｐＭＹＣ０１１種の制限マップ、第３１図は、ｐＭＹｃ
ｏ１１種からの転換体ｐＭＹｃｏ１ １ ９の制限マッ
プ、第３２図は、分子Ｐｉ ３ ６ ｋ Ｄ ａのＤＮ
Ａの制限マップ、第３３図は、分子量４１” ｋＤａ遺
伝ｒの翻訳説明図、第３４図は、分子量９５．６ｋＤａ
のＤＮＡの制限マップである。
（以下の各々は制限酵素を表わす）Ｈ・・Ｈ ｉ ｎｄ
ｍ ， Ｒ ， Ｒ １ ＝ − Ｅ ｃ ｏ
Ｒ Ｉ、Ｘ−・−＝ Ｘ ｈ ｏ■、Ｆ・・Ｆ・ｓ ｐ
Ｉ ． Ａ ｃ・ＡｃｃＩ、Ａ，Ａｓ ・ ・ Ａ
ｓ ｕ ＩＩ、Ｃ・・Ｃ １１ ａ Ｉ、Ｂ ・ ・
Ｂ ｇ ＲＩＩ ， Ｐ − −＝ Ｐ ｓ ｔ Ｉ
， Ｐ ｆ − −＝ Ｐ ｆ Ｉｔ ｍ ｌ、Ａ
ｆ・・Ａｆｊ！４２１１、Ｓ・．・Ｓ ｔ ｙＩ、Ｒ
ｖ ＝・・ＥｃｏＲＶ、Ｔ−＝−Ｔ ｈ ａ Ｉ。
ｍ ， Ｒ ， Ｒ １ ＝ − Ｅ ｃ ｏ
Ｒ Ｉ、Ｘ−・−＝ Ｘ ｈ ｏ■、Ｆ・・Ｆ・ｓ ｐ
Ｉ ． Ａ ｃ・ＡｃｃＩ、Ａ，Ａｓ ・ ・ Ａ
ｓ ｕ ＩＩ、Ｃ・・Ｃ １１ ａ Ｉ、Ｂ ・ ・
Ｂ ｇ ＲＩＩ ， Ｐ − −＝ Ｐ ｓ ｔ Ｉ
， Ｐ ｆ − −＝ Ｐ ｆ Ｉｔ ｍ ｌ、Ａ
ｆ・・Ａｆｊ！４２１１、Ｓ・．・Ｓ ｔ ｙＩ、Ｒ
ｖ ＝・・ＥｃｏＲＶ、Ｔ−＝−Ｔ ｈ ａ Ｉ。
第３図
第４図
第
図
第
図
第
図
図面の浄吉
図面の浄辺
図面の浄書
〔 旬Ｖ −
旬 いｔＪｌ
≧ ≧ど ：ち．
く り０ −
第１０図
第
図
図面の浄Ｘ
第
図
第
】３
図
図面の浄１｝
Ｉ− 勺Ｉ− 為く ーり
図面の浄書
ＨＩＮ＋−１１１ ｌｌｊづ
図面の．７｝吉
一
５日
図面の浄ｇ
Ｌｅｇｓ間
一入−ｄａコｈ
第
図
第
２８図
図面の浄書
第
制Ｆａｌｌ１！＃ Ｈｉｎｄ ｍ − Ｐｓｉ １ロ
マイフ７ラス゛７ 口 ベクターｐＵｃ９ 第 ２２図 ロ マイコ７゛ラス゛マ 区 ■口 第２９ ■ マイコアラス゛７ 口八ククーｐＵｃ９ 第 図 ■ マイコ７゜ラ又一マ 口ベククーρＷＨＡ＋４８ 図面の浄書 第 ３３図 ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ ＯＦ ４１’ ＧＥＮＥ Ｓ
ＥＱＵＥＮＣＥ ＯＢＴＡｒｌｌＥＤ Ｔｏ ＯＡＴε
ｊｌｅ ｔｙｒ ｈｉｓ ｐｒｏ ａｓｐ Ｔｙｓ ａ
ｓｎ ｔｈｒ ｌｙｓ ｌｙｓ ｓｅｒ ａｌａ ｇｌ
ｕ ｇｌｕ ｇｌｎＡＴ丁 ＴＡ丁 ＣＡＴ ＣＣＴ
ＧＡＴ ＡＡＡ ＡＡＴ ＡＣＡ ＡＡＡ
ＡＡＡ ＴＣＡ ＧＣＴ ＧＡＡ ＧＡＡ
ＣＡＡｊｌｅ Ｔｅｕ ｓｅｒ ａｓｐ
ｇｌｕ ｔｈｒ ］ｙｓ ａｒｇ ｌｙｓ
ｇｌｎ ｔｙｒ ａｓｐ ｌｙｓ ｐｈｅ
ｇｌｙＡＴＴ ＴＴＡ ＴＣＴ ＧＡＴ ＧＡＡ ＡＣ
Ａ ＡＡＧ ＣＧＡ ＡＡＡ ＣＡＧ ＴＡＣ ＧＡＴ
ＡＡＡ ＴＴＣ ＧＧＴｓｅｒ ｇａｙ ｐｈｅ
ａｓｐ ｐｈｅ ｇｌｙ ａｓｐ ｉＴｅ ｐｈｅ ｓ
ｅｒ ｓｔｙｒ ｐｈｅ ｔｈｒ ｓｅｒ ｇａｙＴＣ
Ａ ＧＧＡ Ｔ丁Ｔ ＧＡＴ ＴＴＴ ＧＧ
Ｃ ＧＡＴ ＡＴＴ 丁ＴＴ ＴＣＡ ＡＧ
Ｔ 丁ＴＴ ＡＣＣ ＴＣＴ ＧＧＴ図面の浄
書 図面の浄書 図面の浄書 層争書 図面のゼ争１ 図面の浄書 図面の浄書 図面の浄書 図面の浄書 図面の浄書
マイフ７ラス゛７ 口 ベクターｐＵｃ９ 第 ２２図 ロ マイコ７゛ラス゛マ 区 ■口 第２９ ■ マイコアラス゛７ 口八ククーｐＵｃ９ 第 図 ■ マイコ７゜ラ又一マ 口ベククーρＷＨＡ＋４８ 図面の浄書 第 ３３図 ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ ＯＦ ４１’ ＧＥＮＥ Ｓ
ＥＱＵＥＮＣＥ ＯＢＴＡｒｌｌＥＤ Ｔｏ ＯＡＴε
ｊｌｅ ｔｙｒ ｈｉｓ ｐｒｏ ａｓｐ Ｔｙｓ ａ
ｓｎ ｔｈｒ ｌｙｓ ｌｙｓ ｓｅｒ ａｌａ ｇｌ
ｕ ｇｌｕ ｇｌｎＡＴ丁 ＴＡ丁 ＣＡＴ ＣＣＴ
ＧＡＴ ＡＡＡ ＡＡＴ ＡＣＡ ＡＡＡ
ＡＡＡ ＴＣＡ ＧＣＴ ＧＡＡ ＧＡＡ
ＣＡＡｊｌｅ Ｔｅｕ ｓｅｒ ａｓｐ
ｇｌｕ ｔｈｒ ］ｙｓ ａｒｇ ｌｙｓ
ｇｌｎ ｔｙｒ ａｓｐ ｌｙｓ ｐｈｅ
ｇｌｙＡＴＴ ＴＴＡ ＴＣＴ ＧＡＴ ＧＡＡ ＡＣ
Ａ ＡＡＧ ＣＧＡ ＡＡＡ ＣＡＧ ＴＡＣ ＧＡＴ
ＡＡＡ ＴＴＣ ＧＧＴｓｅｒ ｇａｙ ｐｈｅ
ａｓｐ ｐｈｅ ｇｌｙ ａｓｐ ｉＴｅ ｐｈｅ ｓ
ｅｒ ｓｔｙｒ ｐｈｅ ｔｈｒ ｓｅｒ ｇａｙＴＣ
Ａ ＧＧＡ Ｔ丁Ｔ ＧＡＴ ＴＴＴ ＧＧ
Ｃ ＧＡＴ ＡＴＴ 丁ＴＴ ＴＣＡ ＡＧ
Ｔ 丁ＴＴ ＡＣＣ ＴＣＴ ＧＧＴ図面の浄
書 図面の浄書 図面の浄書 層争書 図面のゼ争１ 図面の浄書 図面の浄書 図面の浄書 図面の浄書 図面の浄書
Claims (11)
- （１）１種の発現伝播体より成る組成物であって、この
発現伝播体が、少なくとも１種のタンパク質に対して遺
伝暗号付与を行う１種のＤＮＡ配列より成ると共に、前
記タンパク質が、肺炎病原体抗原のエピトープを認識す
る抗体を誘発する機能を備えることを特徴とする発現伝
播体を有する組成物。 - （２）発現伝播体が、少くとも１種のタンパク質に対し
て遺伝暗号付与を行う１種のＤＮＡ配列により成ると共
に、前記タンパク質が、肺炎病原体の７４．５ｋＤａ抗
原、肺炎病原体の４１ｋＤａ抗原、肺炎病原体の３６ｋ
Ｄａ抗原、肺炎病原体の９６ｋＤａ抗原、および肺炎病
原体の４１＾＊ｋＤａ抗原のうちのいずれか１種の抗原
のエピトープを認識する抗体を誘発する機能を備えるこ
とを特徴とする請求項１記載の発現伝播体を有する組成
物。 - （３）発現伝播体が、少なくとも１種のタンパク質に対
して遺伝暗号付与を行う１種のＤＮＡ配列より成るとと
もに、前記タンパク質が、肺炎病原体の７４．５ｋＤａ
抗原のエピトープを認識する抗原を誘発する機能を備え
ることを特徴とする請求項１または２記載の発現伝播体
を有する組成物。 - （４）発現伝播体が、肺炎病原体７４．５ｋＤａ抗原に
対するＤＮＡ配列の少なくとも一部分を包含すると共に
、このＤＮＡ配列が、アミノ酸配列を有する前記７４．
５ｋＤａ抗原の少なくとも一部分のアミノ酸残物をＶａ
ｌ＾１＾７からＣｙｓ＾１＾７に変化させ、アミノ酸残
物をＶａｌ＾２＾７からＡｒｇ＾２＾７に変化させる突
然変異を含むことを特徴とする請求項１から３までのい
ずれかに記載の発現伝播体を有する組成物。 - （５）発現伝播体が、肺炎病原体の７４．５ｋＤａ抗原
に対するＤＮＡ配列の少なくとも一部分を包含すると共
に、このＤＮＡ配列が突然変異を含み、アミノ酸残部Ｔ
ｒｐ＾２＾１＾１に対するコドンＴＧＡが、アミノ酸配
列を有する前記７４．５ｋＤａの少くとも一部において
、ＴＧＧコドンに変換され、このＴＧＧコドンもアミノ
酸残部Ｔｒｐ＾２＾１＾１に対する遺伝暗号であること
を特徴とする請求項１から３までのいずれかに記載の発
現伝播体を有する組成物。 - （６）発現伝播体が、肺炎病原体の７４．５にＤａ抗原
に対するＤＮＡ配列の少なくとも一部分を包含すると共
に、その発現伝播体が、トリプトファンＴ１７６遺伝子
に遺伝暗号付与する少なくともさらに１組のＤＮＡ配列
を有することを特徴とする請求項１から３までのいずれ
かに記載の発現伝播体を有する組成物。 - （７）ＤＮＡ配列内において、そのＣｙｓ＾１＾７がＶ
ａｌ＾１＾７によって置換され、Ａｒｇ＾２＾７がＶａ
ｌ＾２＾７によって置換されることを特徴とする請求項
１から６までのいずれかに記載の発現伝播体を有する組
成物。 - （８）発現伝播体が、少なくとも１種のタンパク質に対
して遺伝暗号付与を行う１種のＤＮＡ配列より成ると共
に、前記タンパク質が、肺炎病原体３６ｋＤａ抗原のエ
ピトープを認識する抗体を誘発する機能を備えることを
特徴とする請求項１または２記載の発現伝播体を有する
組成物。 - （９）肺炎病原体抗原のエピトープを認識する抗体が、
生物の体内において誘発されることを特徴とする請求項
１記載の発現伝播体を有する組成物。 - （１０）前記タンパク質が、生成体によって発現される
ことを特徴とする請求項１記載の発現伝播体を有する組
成物。 - （１１）肺炎病原抗原が、予防接種薬剤の成分として使
用されることを特徴とする請求項１記載の発現伝播体を
有する組成物。
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| US341,968 | 1989-04-21 |
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