人胚肺成纤维细胞乙型脑炎疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物工程领域,具体地是涉及由人胚肺成纤维细胞制备的乙型脑炎灭活疫苗和减毒活疫苗,及其制备工艺。
背景技术
乙型脑炎是一种由中枢神经系统急性病毒感染导致的传染性疾病,简称乙脑,由乙脑病毒引起,其发病年龄以10岁以下儿童为主。乙脑传染源是被感染的人或动物,再通过蚊虫的叮咬进而传播给其他人或动物,猪与蚊被认为是该病毒的主要长期储存宿主和扩散宿主。乙脑在流行地区年发病率高达10~100/10万,近30亿人口生活在乙型脑炎流行区,主要包括东南亚及西太平洋地区,此地区每年新生儿超过7000万。乙脑在亚洲每年至少引起50000临床病例和10000例病死,约85%病例发生在15岁以下儿童,10岁以下儿童易产生严重后遗症,如:失语、瘫痪、精神异常、痴呆、肢体弯曲畸形、扭转痉挛等。最近几十年中,乙型脑炎的数起暴发流行越来越向曾经是非流行的地区扩大,同时伴随很高的病死率和严重的持久性神经系统后遗症,因而在亚洲很多国家和地区,乙脑成为严重的公共健康问题。中国乙型脑炎的流行具有明显的季节性特点,多发于夏、秋季节,90%病例发生于7、8、9三个月。
流行性乙型脑炎病毒(Japanese B Encephalitis Virus,JEV)简称乙脑病毒,属黄病毒科黄病毒属。病毒颗粒呈二十面体对称结构,直径45-50nm,病毒颗粒由核心、包膜和刺突组成。基因为正链单股RNA,RNA包被于多肽的衣壳C中,组成病毒颗粒的核心。其包膜中有糖基化蛋白E和非糖基化蛋白prM/M。
目前还没有治疗乙型脑炎的特效药物,从环境方面控制其传播的效果不理想。乙型脑炎疫苗的免疫接种是控制乙型脑炎疾病最为经济有效地措施。预防乙型脑炎对于保护儿童健康更是显得极为重要。我国规定15岁以下未成年人可免费接种乙脑疫苗,接种乙脑疫苗后,人群的保护率可达90%以上。
由于乙型脑炎疫苗基础免疫始于6月龄的健康婴幼儿,对疫苗的首要要求就是要保证疫苗有足够的安全性。目前世界上应用较多的主要有三种乙脑疫苗,第一种是以日本为代表的用感染乙脑病毒的小白鼠脑组织制备的纯化乙脑灭活疫苗以及中国生产的原代地鼠肾细胞培养的乙脑灭活疫苗,这类灭活疫苗免疫原性弱,需多次接种,造成疫苗中残存的动物组织外源物质不可避免地带入人体,是多见过敏反应的重要原因,例如,经鼠脑组织培养的灭活疫苗以疼痛、发红、肿胀的局部副反应约为20%,包括头疼、发热、肌痛、不适和胃肠道症状的全身性反应为10~30%,而由原代地鼠肾细胞培养的灭活疫苗超过38℃的发热高达12%,在减少牛血清残留量后,超过38℃的发热减至6%;第二种是原代地鼠肾乙脑减毒疫苗,疫苗的细胞基质也来源于普通级动物,无法保证不携带外源因子。减毒活疫苗虽然可以减少多次接种引发的过敏反应,但有报道称减毒疫苗病毒在有免疫功能障碍的动物体内可增殖,并引起死亡,在接种免疫功能障碍者时,有可能造成安全性问题。其次,活疫苗因存在诸多问题而尚未得到WHO的认可,因其有可能导致严重的潜在病毒污染问题;第三种是北京生物制品研究所以Vero细胞为培养基质生产的冻干乙脑纯化灭活疫苗,这种疫苗已在中国境内投入使用,虽避免了上述疫苗缺陷,在安全性上有显著提高,但Vero细胞超过232代次后在裸鼠体内有致瘤现象,因此,美国FDA要求用Vero细胞生产的疫苗,生产过程中要有去除细胞的工艺,必须要保证成品中无残余细胞成分。
现正在开发研究的新型乙脑疫苗有美国和韩国合作的狗肾减毒活疫苗,这种疫苗仍使用动物细胞系,也不能避免带入动物组织外源物质,仍存在安全性问题。
源于人体组织的人胚肺成纤维细胞来源清楚,包括捐献者的年龄、性别、种族、地域、体能及健康状况、细胞直接来源的组织或器官、细胞世代数等。人胚肺成纤维细胞系经过数十年研究,其生长特性、遗传稳定的特性、外源因子(细菌、真菌、支原体及病毒)污染检查、致肿瘤阴性等特征被充分验证。更为重要的是人胚肺成纤维细胞本身源于人体细胞,当用于疫苗制造时人胚肺成纤维细胞的残余成分不会成为超敏反应原,基本不会引起接种者超敏反应。因此,从质量控制以及安全性角度看,相较于鼠脑组织、原代地鼠肾细胞和Vero细胞系等外源细胞系,人胚肺成纤维细胞没有潜在的不安全隐患,是制备疫苗理想的细胞系。现在已经有越来越多利用人胚肺成纤维细胞制备的疫苗面市,例如用MRC-5或WI-38细胞系制备的风疹病毒疫苗、用MRC-5细胞系制备的甲肝病毒疫苗、用FrhL-2细胞系制备的轮状病毒疫苗、用MRC-5细胞制备的水痘病毒疫苗,还有就是国际上公认的金标准狂犬病疫苗就是用人胚肺成纤维细胞培养的疫苗。因此,用人胚肺成纤维细胞制备乙脑疫苗能够显著的提高现行乙型脑炎病毒疫苗的质量,有利于质量控制。
但常用的乙型脑炎毒株P3株、SA14-14-2株和Nakayama株等对人胚肺成纤维细胞不敏感,因此,乙脑疫苗长期以来都无法使用人胚肺成纤维细胞生产。目前还未见关于系统的利用人胚肺成纤维细胞生产乙型脑炎疫苗的报道。如何进一步增强乙脑疫苗免疫效果,提高使用安全性,就成为现有技术中急需解决的技术难题。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足,而提供一种抗原纯度高、免疫效果好、安全性高的人胚肺成纤维细胞乙型脑炎疫苗。
本发明的另一个目的是提供了一种适合大规模工业化生产且可满足国内外市场对乙脑疫苗需求的人胚肺成纤维细胞乙型脑炎疫苗及其制备方法。
为实现本发明的第一个目的,本发明的技术方案是该人胚肺成纤维细胞乙型脑炎疫苗在制备过程中病毒培养所用的细胞系是人胚肺成纤维细胞。公知,源于人体组织的人胚肺成纤维细胞来源清楚,包括捐献者的年龄、性别、种族、地域、体能及健康状况、细胞直接来源的组织或器官、细胞世代数等。人胚肺成纤维细胞系经过数十年研究,其生长特性、遗传稳定的特性、外源因子(细菌、真菌、支原体及病毒)污染检查、致肿瘤阴性等特征被充分验证。更为重要的是人胚肺成纤维细胞本身源于人体细胞,当用于疫苗制造时人胚肺成纤维细胞的残余成分不会成为超敏反应原,基本不会引起接种者超敏反应。因此,从质量控制以及安全性角度看,相较于鼠脑组织、原代地鼠肾细胞和Vero细胞系等外源细胞系,人胚肺成纤维细胞没有潜在的不安全隐患,是制备疫苗理想的细胞系。本发明通过采用因此人胚肺成纤维细胞作为疫苗制备的病毒培养所用的细胞系,显著的提高现行乙型脑炎病毒疫苗的质量和安全性,有利于质量控制。
进一步设置是所述的人胚肺成纤维细胞乙型脑炎疫苗为乙型脑炎灭活病毒疫苗或乙型脑炎减毒活疫苗。
进一步设置是所述人胚肺成纤维细胞乙型脑炎疫苗在制备过程中病毒培养所用的人胚肺成纤维细胞包括但不仅限于人胚肺成纤维细胞系WI-38、KMB17、IMR-90、MRC-5和2BS。首先建立人胚肺成纤维细胞种子库和工作库,并对细胞库细胞进行系统检定。在制备疫苗之前,需先进行细胞的复苏、培养和扩增,使细胞量达到生产需要。细胞复苏、培养和扩增所使用的细胞培养液可选择199培养液或MEM培养液,MEM培养液的使用效果比较理想。细胞培养液中所含小牛血清的体积分数比为8%-10%,使用碳酸氢钠调细胞培养液PH到7.0~8.0之间,同时在细胞培养液中加入适量庆大霉素,以防止细菌污染。在35℃-37℃下对细胞进行培养扩增。由于本发明中人胚肺成纤维细胞为附着依赖性细胞,细胞在培养过程需附着一定载体生长,则本发明中细胞的培养方式可以采用转瓶培养,也可以使用微载体反应器培养。人胚肺成纤维细胞在微载体反应器中培养时,微载体使用量为2~7g/L,转速为30~55转/分钟,可选择的微载体有GE公司的Cytodex1、2、3型,经试验证明Cytodex2效果较满意。在细胞培养过程中,细胞的分种率可以按照生产量需要调整,一般为1∶2~1∶10。
进一步设置是本发明中接种于人胚肺成纤维细胞的乙型脑炎病毒包括用于制备乙脑灭活疫苗的P3株和Nakayama株、以及用于制备乙脑减毒活疫苗的SA14-14-2株。分别对不同毒株建立毒种库,分为主种子库和工作种子库,并进行检定。毒种制备均采用接种病毒于人胚肺成纤维细胞的方法。本发明中在生长成片的人胚肺成纤维细胞上接种乙脑病毒(包括P3株、Nakayama株和SA14-14-2株)前,应先用平衡盐溶液如Earle氏液等冲洗细胞表面,去除残留牛血清后,在已生长成片的人胚肺成纤维细胞上接种乙脑病毒及加入细胞维持液,维持液中加入0.2%~0.5%的人血白蛋白对病毒生长有利。其中病毒接种率MOI范围在0.1~0.0001之间均可,实验表明,接种率在0.001时,相同培养时间内病毒滴度最高,效果较好。经3~4天培养后,即可收获病毒液。乙脑病毒在人胚肺成纤维细胞上的生长繁殖可维持较长时间,因此病毒收获可采取多次收取方式,一般2~3天可收获一次。对收获的病毒液需及时测定病毒滴度,要求每批所获病毒滴度均应在107.0pfu/ml以上,只有高滴度的病毒液才能保证疫苗效力。病毒滴定方法最好采用公知的蚀斑法。
为实现本发明的第二个目的,本发明的技术方案是包括以下步骤:
(1)采用人胚肺成纤维细胞作为疫苗制备的病毒培养所用的细胞系;
(2)人胚肺成纤维细胞的复苏、培养、扩增;
(3)在人胚肺成纤维细胞上接种乙脑病毒毒种;
(4)收获病毒液;
(5)澄清超滤浓缩;
(6)疫苗纯化;
(7)稀释分装并加入保护剂后冻干制成纯化疫苗。
上述步骤(1)与步骤(2)中人胚肺成纤维细胞的复苏和培养扩增所使用的细胞培养液为199培养液或MEM培养液,细胞培养液中牛血清含量的体积分数比8%-10%,且该细胞的培养方式采用转瓶培养或使用微载体反应器培养。
以人胚肺成纤维细胞制备的生物制品安全性的关键指标是残余牛血清含量。按中国药典2005版有关生物制品的规程要求,疫苗的牛血清残留量必须小于50ng/ml。经反复实验研究,本发明中提出的疫苗纯化是通过柱层析方法来实现的。纯化疫苗过程是首先将浓缩疫苗经离子交换柱层析除去部分杂蛋白,再经凝胶过滤柱层析进一步去除残留杂质。本发明的纯化工艺中优选的离子交换柱有DEAE-Sepharose FF等,选择性的吸附浓缩疫苗疫苗液中的杂蛋白;而凝胶过滤层析是层析技术中最简单,条件最温和,对保持生物大分子活性最有利的方法,适合分离分子量悬殊的物质,乙脑病毒的分子量在400万以上,与疫苗中的杂蛋白分子量相差较大,故使用凝胶柱层析可以非常方便有效地去除浓缩疫苗中残留的小分子杂质,该凝胶过滤柱可以是Sepharose CL-6B、Sepharose 4FF、Sphacryl S-500HR柱或其他凝胶,检测结果表明,经两步层析柱纯化后,疫苗总蛋白含量减少约99%以上,牛血清残余量也符合中国药典2005版有关生物制品的规程要求。层析后的疫苗纯化液再经过超滤浓缩,使最终纯化疫苗与粗疫苗相比浓缩倍数达到40~80倍即可。以上所述乙脑纯化疫苗方法均包括由P3株、SA14-14-2株和Nakayama株生产的乙脑灭活疫苗和乙脑减毒活疫苗。
进一步设置是所述的步骤(4)与步骤(5)之间还进行了病毒液灭活操作以制备乙脑灭活疫苗。经过病毒液灭活操作可以制的人胚肺成纤维细胞乙型脑炎灭活疫苗,用于制备乙脑灭活疫苗的乙脑病毒收获病毒液的灭活采用β-丙内酯为灭活剂,所述的灭活后的粗疫苗需要进行浓缩提纯制备成为纯疫苗制品,本发明中选用超滤浓缩的方法对得到的粗疫苗进行浓缩,一般是用截留10万~30万分子量的超滤器浓缩疫苗,浓缩至20倍以上,然后对浓缩液进行纯化,而制备乙脑减毒活疫苗的乙脑病毒收获病毒液即为减毒活疫苗粗疫苗。
进一步设置是所述的步骤(1)病毒培养所用的人胚肺成纤维细胞包括但不仅限于细胞系WI-38、KMB17、IMR-90、MRC-5和2BS。
进一步设置是疫苗的纯化通过柱层析法来实现。
制备工艺中所涉及的灭活疫苗包括但不仅限于由乙型脑炎病毒P3株制备,减毒活疫苗包括但不仅限于由乙型脑炎病毒SA14-14-2株制备。
以人胚肺成纤维细胞制备的生物制品安全性的关键指标是残余牛血清含量。按中国药典2005版有关生物制品的规程要求,疫苗的牛血清残留量必须小于50ng/ml。经反复实验研究,本发明中提出的疫苗纯化是通过柱层析方法来实现的。纯化疫苗过程是首先将浓缩疫苗经离子交换柱层析除去部分杂蛋白,再经凝胶过滤柱层析进一步去除残留杂质。本发明的纯化工艺中优选的离子交换柱有DEAE-Sepharose FF等,选择性的吸附浓缩疫苗疫苗液中的杂蛋白;而凝胶过滤层析是层析技术中最简单,条件最温和,对保持生物大分子活性最有利的方法,适合分离分子量悬殊的物质,乙脑病毒的分子量在400万以上,与疫苗中的杂蛋白分子量相差较大,故使用凝胶柱层析可以非常方便有效地去除浓缩疫苗中残留的小分子杂质,该凝胶过滤柱可以是Sepharose CL-6B、Sepharose 4FF、Sphacryl S-500HR柱或其他凝胶,检测结果表明,经两步层析柱纯化后,疫苗总蛋白含量减少约99%以上,牛血清残余量也符合中国药典2005版有关生物制品的规程要求。层析后的疫苗纯化液再经过超滤浓缩,使最终纯化疫苗与粗疫苗相比浓缩倍数达到40~80倍即可。以上所述乙脑纯化疫苗方法均包括由P3株和Nakayama株生产的乙脑灭活疫苗、以及SA14-14-2株生产的乙脑减毒活疫苗。
纯化疫苗在最终冻干制成成品之前,需加入保护剂,该保护剂可以有多种选择,如人白蛋白保护剂与麦芽糖、人白蛋白保护剂与蔗糖等。
本发明与现有技术相比,具有以下优势:
(1)人源胚肺成纤维细胞已被证明不含任何污染因子和致瘤性,作为疫苗生产基质,显著优于现行疫苗使用的地鼠肾细胞和Vero细胞。人胚肺成纤维细胞在疫苗生产中已成功使用,并已有多种疫苗产品面市,足以证明其安全有效性。与原代细胞相比,人胚肺成纤维细胞能够充分鉴定和标准化,可实现细胞种子库系统,建立的细胞库可用于多年生产,有利于质量控制。
(2)本发明制备工艺中所使用的乙脑疫苗毒种为利用人胚肺成纤维细胞培养的毒种,从根本上更新了以往乙脑疫苗生产中使用鼠脑组织培养毒种的方法,从而彻底避免外源因子的污染,也保证了所生产乙脑疫苗的安全性。
(3)疫苗经本发明所述工艺中的纯化步骤提纯纯化后,抗原活性明显提高,可获得杂蛋白减少99%以上的精制品,是具备免疫原性的安全有效的乙脑灭活疫苗。
(4)本发明所提供的制备方法科学合理,产量高,安全有效,能够满足国内外乙脑疫苗市场的需要。
下面结合说明书附图和具体实施方式,对本发明做进一步介绍。
附图说明
图1本发明具体具体实施方式工艺流程图。
具体实施方式
下面参照附图1,对本发明的人胚肺成纤维细胞乙型脑炎疫苗及其制备方法做进一步阐述。
实施例1
使用复苏的人胚肺成纤维细胞WI-38,细胞营养液为MEM培养液,其中含有8-10%小牛血清和24-32U/ml的庆大霉素,调PH至7.0-7.2,之后用15L转瓶37℃培养成致密单层后按照1∶8分种率扩增,扩增到生产批量时,经过6天后,细胞长成致密单层,弃去细胞营养液,用PH7.0-7.4的Earle氏液冲洗细胞面,接种人胚肺成纤维细胞乙脑病毒强毒株P3毒种,使用P3株在WI-38细胞上传代的第3代工作毒种(P3V3),毒种浓度MOI 0.001,细胞维持液为含0.2%(w/w)人白蛋白的MEM液其PH为7.4-7.6,33℃下培养,24h后换以新鲜细胞维持液继续培养48-72h,开始收获病毒,收获病毒液取样进行病毒滴度和无菌试验,要求收获病毒液的病毒滴度达到107.0pfu/ml以上;合并病毒液加入β-丙内酯(终浓度为1∶4000)后,置于2-8℃,24-48h灭活病毒,之后37℃水解2h,得疫苗原液,用截留30万分子量的超滤器浓缩成20倍浓缩疫苗液。浓缩疫苗过离子交换柱DEAE-Sepharose FF和凝胶过滤柱Sepharose 4FF,经二步骤柱层析后,得到纯化灭活疫苗,加入保护剂后冻干制成纯化疫苗成品,经检定疫苗效力超过中国乙脑疫苗参考品和日本乙脑疫苗参考品,其它各项检定均符合WHO有关该疫苗要求。
实施例2
使用复苏的人胚肺成纤维细胞MRC-5,细胞浓度为106个/ml,使用5g/L的Cytodex 2在50L的生物反应器内培养,工作体积40L,转速40~45转/分钟,溶氧25~50%。细胞营养液使用含8%-10%小牛血清和24-32U/ml庆大霉素的MEM培养液,PH7.0-7.2,培养温度37℃。随时观察细胞生长情况,根据细胞生长情况反应器自动补液调整培养液PH,连续培养6天,直到细胞密度达到107个/ml时,用Earle氏液洗涤2次后,加入不含小牛血清、含0.2%(w/w)人白蛋白的MEM液,PH7.4-7.6。之后接种人胚肺成纤维细胞乙脑病毒弱毒株SA14-14-2毒种,使用SA14-14-2株在MRC-5细胞上传代的第3代工作毒种,毒种浓度MOI 0.001,病毒培养温度33-35℃。24h(时间)后换以新鲜的细胞维持液,并于种毒后72-96h开始收获病毒,其病毒滴度可达107.0pfu/ml,收获后的病毒合并液即为疫苗原液。用截留30万分子量的超滤器浓缩成20倍浓缩疫苗液,浓缩疫苗过离子交换柱DEAE-Sepharose FF和凝胶过滤柱Sepharose 4FF,经二步骤柱层析后,得到纯化减毒活疫苗,加入保护剂后冻干制成纯化疫苗成品,其各项检定均符合WHO有关该疫苗要求。
乙脑疫苗免疫原性试验
取体重10-12g清洁级昆明种小鼠,将按实施例1和实施例2方法制备的的人胚肺成纤维细胞乙型脑炎灭活疫苗、人胚肺成纤维细胞乙型脑炎减毒活疫苗、以及常规的地鼠肾细胞灭活疫苗、地鼠肾细胞减毒活疫苗和Vero细胞灭活疫苗进行皮下免疫0.1ml,或腹腔0.5ml,活疫苗免疫1次,死疫苗免疫2次,间隔7天,首次免疫后14天分别以适当稀释的P3或Nak株脑内或腹腔攻击,脑内攻击注射病毒液0.03ml;腹腔攻击注射0.3ml,同时以稀释液脑内注射0.03ml攻击的病毒感染量于相同体重健康小鼠脑内接种,测定病毒滴度(LD50),攻击后小鼠观察14天,根据动物死亡数计算保护力。
表1不同疫苗免疫小鼠对腹腔攻击的保护效果
注:存活动物数/试验动物数
从表1可看出,以皮下途径免疫后,活苗对P3和Nak株均获得完全保护,而死苗对P3和Nak株的保护效力分别达到60%~70%和50%;而以腹腔途径免疫后,活苗仍能够使小鼠对P3和Nak株获得完全保护,而死苗对P3和Nak株的保护效力较皮下接种略有升高,其对P3株的保护效力为80%~90%,对Nak株的保护效力为60%~80%。
表2不同疫苗免疫小鼠对脑内攻击的保护效果
表2的数据显示,经皮下途径免疫后,活苗对P3株的保护率为80%,对Nak株的保护率为40%~60%,而死苗对两种毒株基本没有保护效力;以腹腔注射免疫后,活苗对P3株的保护率为70%~80%,对Nak株为50%~60%,死苗对P3株仅有轻度保护力,对Nak株无保护效力。
试验结果初步表明,按本发明方法制备的人胚肺细胞灭活乙脑疫苗和减毒活疫苗免疫原性等同或略高于其他方法生产的乙脑疫苗。
中和试验
从乙脑疫苗免疫原性试验中各免疫组小鼠于攻击前任取5只从眼眶取血混合分离血清,每份血清分别用P3或Nak株在BHK-21细胞上加甲基纤维素营养覆盖物作空斑减少中和试验,中和抗体滴度按减少50%空斑数的血清最高稀释度2倍计算(中和试验时各血清稀释度均加等量病毒液)。
表3不同疫苗免疫后攻击前体内血清中和抗体与攻击后保护力的关系
从表3中可看出,用活苗免疫小鼠,无论是皮下或腹腔途径都表现出较好的抗体应答,滴度均有1∶10~1∶40,一般免疫小鼠达到1∶10的抗体滴度即被认为有保护效力。而灭活苗的抗体滴度只能达到1∶5~1∶10,明显低于活苗免疫的效力。活疫苗的中和抗体滴度虽然不高,但与死苗相比有很强的抗乙脑强毒感染保护作用,对小鼠不致死,对豚鼠不产生病毒血症,这些都与乙脑活疫苗免疫后引发细胞免疫作用有重要关系,因此乙脑或疫苗免疫效果不能单以中和抗体水平为依据。实验结果表明,按本发明说明书制备的人胚肺细胞灭活疫苗和减毒活疫苗的中和抗体滴度和保护效力与现在国内市场上流行使用的乙脑疫苗相比没有差别,但本发明所述的乙脑疫苗由于采用无外源因子过敏原的人胚肺成纤维细胞生产,与其他乙脑疫苗相比在安全性上有明显优势。