CN113293144A - 一种重组f基因型腮腺炎病毒活载体麻疹疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种重组F基因型腮腺炎病毒活载体麻疹疫苗。具体地，本发明提供了一种重组F基因型腮腺炎病毒株，所述病毒株是保藏号为CCTCCNo:V202102的重组F基因型腮腺炎病毒株，且基因组中整合有麻疹病毒H基因。本发明还提供了包含所述重组F基因型腮腺炎病毒株作为活性成分的疫苗组合物及其制备方法。本发明的疫苗能够更加匹配中国地区优势流行的F型腮腺炎病毒，同时预防腮腺炎和麻疹，且与当前的疫苗株在生长特性、免疫原性等方面的水平相当。此外，本发明的疫苗在制备时只需一种病毒株，生产简单，容易质控。

Description

一种重组F基因型腮腺炎病毒活载体麻疹疫苗

技术领域

本发明涉及生物医药领域,具体地涉及一种重组F基因型腮腺炎病毒活载体麻疹疫苗。

背景技术

麻疹是由麻疹病毒(Measles Virus，MV)感染引起的急性全身发疹性传染病，主要的传播途径是呼吸道分泌物飞沫传播。在麻疹疫苗出现之前，绝大多数人在儿童时期会患上麻疹，故曾被冠上最厉害的“儿童杀手”称号；成人也有麻疹，成人麻疹病状通常较重。随着麻疹减毒活疫苗的广泛使用，全球的麻疹发病率被极大的控制；但是近十几年，在全球疫苗接种率超过70％的条件下，欧洲和亚洲却反复出现麻疹的局地暴发，该现象引起了各国政府和科学家的关注，疫苗接种强度不够和接种率下降是造成麻疹疫情反复的关键因素之一。

MV属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒属(Morbillivirus)，其病毒粒子呈球型，直径约120nm～250nm，包括单股负链RNA和核衣壳 (nucleocapsid)结构。其基因组RNA能编码6个结构蛋白，分别是N蛋白、P蛋白、M蛋白、H蛋白、F蛋白和L蛋白。核衣壳外有脂质双分子层包膜，H蛋白和 F蛋白以其分子的一部分锚定在包膜内，而另一部分像突出物一样伸展在囊膜表面上形似刺突，包膜上无神经氨酸酶。其中圆锥型的H蛋白可使病毒结合到宿主细胞表面，而哑铃型的F蛋白使病毒进入细胞。H蛋白是一种糖蛋白，含有 5个糖基化位点，是MV最重要的免疫原蛋白。该蛋白单独表达或者插入到其它载体中，可以在动物体内诱导针对MV的特异性免疫反应。

流行性腮腺炎是由腮腺炎病毒(Mumps virus，MuV)引起的急性传染病，是儿童和青少年期常见的呼吸道传染病。通常会引起急性或全身性感染，以腮腺肿痛为主要特征，有时亦可累及唾液腺。

MuV是副粘病毒科腮腺炎病毒属，包膜RNA病毒，是引起流行性腮腺炎的主要病原体之一。其基因组为不分节段的单股负链RNA组成，编码7种蛋白，分别是NP、P、M、F、SH、HN和L。

现有研究表明，造成腮腺炎疫情加剧的主要原因包括两个：第一、腮腺炎疫苗的免疫覆盖率和强度还不够；第二、当前各国流行的MuV毒株的基因型和疫苗株的基因型不匹配，血清学上的交叉保护不完全。尽管腮腺炎病毒都只有一个血清型，但是越来越多的研究结果证实，不同基因型腮腺炎病毒之间保护率达不到100％。当人体的腮腺炎中和抗体滴度过低时，面对其它基因型毒株的攻击时，就可能被再次感染。而目前现有的腮腺炎疫苗几乎都是A基因型，而我国流行的腮腺炎病毒以F基因型为主。

并且，为了减轻接种负担，接种疫苗时通常使用联合疫苗，现有的同时预防麻疹和腮腺炎的联合疫苗主要为麻风腮联合减毒活疫苗(MMR)。该疫苗是分别将三种病毒株培养出来以后混合在一起制备的；分别生产三种疫苗比较复杂，且将三种病毒混合后，不同病毒会造成干扰，影响疫苗效果。

因此本领域亟待开发新的符合当地流行基因型的，且能同时预防麻疹和腮腺炎的疫苗株。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够同时针对麻疹病毒和腮腺炎病毒的疫苗株。

本发明的第一方面，提供了一种重组F基因型腮腺炎病毒株，所述病毒株是保藏号为CCTCC No:V202102的重组F基因型腮腺炎病毒株麻疹病毒 rMuV-MV-H。

在另一优选例中，所述病毒株的基因组中含有如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述病毒株的基因组中含有以下核苷酸序列：

(i)在如SEQ ID NO：1所示的F基因型腮腺炎病毒的野生型基因组的F基因序列和HN基因序列中间插入如SEQ ID NO：2所示的含有麻疹病毒H基因的序列；和

(ii)与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的序列同一性≥85％，较佳地≥90％，更佳地≥95％。

在另一优选例中，所述病毒株的基因组中含有以下核苷酸序列：

(i)在如SEQ ID NO：1所示的F基因型腮腺炎病毒的野生型基因组的F基因序列和HN基因序列中间插入如SEQ ID NO：2所示的麻疹病毒H基因序列。

(ii)与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的序列同一性≥85％、≥86％、≥ 87％、≥88％、≥89％、≥90％、≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％、≥ 96％、≥97％、≥98％或≥99％。

在另一优选例中，所述病毒株的基因组中含有如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

本发明的第二方面，提供了一种疫苗组合物，所述组合物包括：

(a)如本发明第一方面所述的重组F基因型腮腺炎病毒株；和

(b)疫苗上可接受的载体。

在另一优选例中，所述载体是药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述药学上可接受的载体含有液体，较佳地为水、盐水或缓冲液。

在另一优选例中，所述载体还含有辅助性的物质，较佳地为填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。

在另一优选例中，所述载体中还含有细胞转染试剂。

在另一优选例中，所述疫苗组合物为二联疫苗或多联疫苗。

在另一优选例中，所述疫苗组合物为二联疫苗。

在另一优选例中，所述疫苗组合物为预防麻疹病毒和腮腺炎病毒的二联疫苗。

在另一优选例中，所述麻疹病毒为A基因型麻疹病毒。

在另一优选例中，所述腮腺炎病毒为F基因型腮腺炎病毒。

在另一优选例中，所述疫苗组合物还含有源自一种或多种选自下组的病原体的疫苗组分：风疹、乙型脑炎、甲型肝炎、水痘、脊髓灰质炎、或其组合。

在另一优选例中，所述的疫苗组分包括灭活株、减毒株、或蛋白、核酸等。

在另一优选例中，所述的疫苗组合物还含有佐剂。

在另一优选例中，所述佐剂包括：颗粒型和非颗粒型佐剂。

在另一优选例中，所述颗粒型佐剂选自下组：铝盐、油包水乳剂、水包油乳剂、纳米颗粒、微小颗粒、脂质体、免疫刺激复合物，或其组合；

另一优选例中，所述非颗粒型佐剂选自下组：胞壁酰二肽及其衍生物、皂苷、脂质A、细胞因子、衍生多糖、细菌毒素，微生物及其产物如分枝杆菌(结核杆菌、卡介苗)、短小杆菌、百日咳杆菌、蜂胶、或其组合。

在另一优选例中，所述疫苗组合物每剂量中病毒至少为4.0lgCCID₅₀。

在另一优选例中，所述的疫苗组合物为注射剂型。

本发明的第三方面，提供了一种制备重组F基因型腮腺炎病毒株的方法，所述方法包括步骤：

(S1)构建在F基因序列和HN基因序列中插入麻疹病毒H基因序列的重组F 基因型腮腺炎病毒的全长重组质粒；

(S2)分别获得包含腮腺炎病毒中的N基因、P基因和L基因的三种辅助质粒；和

(S3)分别将(S1)中获得的全长重组质粒与(S2)所述的三种辅助质粒共转染宿主细胞，培养3天后，将细胞裂解，离心细胞裂解液后，得到上清液，即获得所述重组F基因型腮腺炎病毒株。

在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：BSR-T7细胞、293T细胞、Vero 细胞、Slam/Vero细胞，或其组合。

本发明的第四方面，提供了一种如本发明第一方面所述的重组F基因型腮腺炎病毒株的用途，用于制备一种疫苗组合物，所述疫苗组合物用于预防腮腺炎和/或麻疹。

在另一优选例中，所述腮腺炎为F基因型腮腺炎。

本发明的第五方面，提供了一种制备疫苗组合物的方法，包括步骤：

(S1)对保藏号为CCTCC No:V202102的重组F基因型腮腺炎病毒株麻疹病毒rMuV-MV-H进行传代或培养，从而制得减毒疫苗株；

(S2)将步骤(S1)中制备的所述减毒疫苗株与免疫上可接受的载体混合，从而制得疫苗组合物。

本发明的第六方面，提供了一种预防腮腺炎和麻疹的接种方法，包括步骤：给需要的对象接种如本发明第一方面所述的重组F基因型腮腺炎病毒株，或如本发明第二方面所述的疫苗组合物。

在另一优选例中，所述的对象为8月龄以上的腮腺炎和/或麻疹易感者。

在另一优选例中，所述接种的方式为皮下注射接种。

在另一优选例中，所述接种的剂量不低于4.0lgCCID₅₀。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了pMuV质粒图谱

图2显示了rMuV-MV-H重组病毒基因组架构模式图。

图3显示了通过琼脂糖凝胶电泳对重组病毒的全长重组质粒的鉴定。其中 (A)显示了构建得到的pMuV-MV-H的质粒图谱，图中标注了KpnI的酶切位点； (B)显示了经KpnI酶切后的琼脂糖凝胶电泳结果。

图4显示了全长质粒基因插入位置的测序结果。

图5显示了重组病毒rMuV-MV-H表达情况鉴定(IFA)。

图6显示了重组病毒rMuV-MV-H的多步生长曲线。

图7显示了小鼠的免疫程序。

图8显示了重组病毒免疫后的腮腺炎病毒和麻疹病毒特异性中和抗体滴度。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地开发了一种同时针对麻疹病毒和腮腺炎病毒的二联疫苗株。具体地，本发明人在F基因型的腮腺炎病毒株中，利用反向遗传操作系统，在其基因组的F基因和HN基因中间插入麻疹病毒的H基因序列，可获得基因组中整合有麻疹病毒H基因的重组F基因型腮腺炎病毒株。实验证明，获得的重组F基因型腮腺炎病毒株疫苗能够更加匹配中国地区优势流行的F型腮腺炎病毒，同时预防腮腺炎和麻疹，且与当前的疫苗株在生长特性、免疫原性等方面的水平相当。并且，在对其的制备过程中，使用本发明的制备方法，相比于传统的麻疹腮腺炎联合疫苗，只需一种病毒株，生产简单，容易质控；并且生产周期更短，生产效率更高。

在此基础上，完成了本发明。

术语

腮腺炎病毒及F基因型腮腺炎病毒现状

腮腺炎病毒是副粘病毒科腮腺炎病毒属的成员，基因组为不分节段的单股负链RNA，长为15384bp，整个基因组按照3’-N-P-M-F-SH-HN-L-5’的顺序编码 7种病毒蛋白。其中N蛋白、P蛋白和L蛋白组成RNA复制酶复合体，参与病毒的转录和复制。F和HN是重要的跨膜糖蛋白和重要的免疫原，SH蛋白含有57个氨基酸，是病毒复制非必需蛋白，与TNF-α介导的细胞凋亡有关。

研究表明，SH蛋白通过抑制L929细胞的NF-κB信号通路防止细胞凋亡；一旦将SH基因缺失，病毒就容易被宿主先天性免疫反应所清除而表现为毒力下降。

特别值得注意的是，本发明人从血清学方向对腮腺炎疫情反复的原因做了系统研究，结果如下：

(1)F基因型病毒是我国流行的腮腺炎病毒的绝对优势群体。

2015年，本发明人联合6家省级CDC从国内采集了大量患者的样本，并成功分离到29株病毒，生物信息学分析表明，这些病毒株全部为F基因型，且进化关系较近。

(2)A基因型腮腺炎疫苗的交叉保护能力有限。

基于人、豚鼠和小鼠三种免疫模型，本发明人进行了大量血清学交叉中和实验。实验结果表明，A基因型腮腺炎减毒活疫苗(Jeryl Lynn株)产生的中和抗体对F基因型的流行毒株的中和能力要显著低于针对A基因型毒株的中和能力。同时，在豚鼠和小鼠模型中，F基因型腮腺炎病毒免疫产生的抗体对F基因型的中和能力略高于对A基因型病毒的中和能力。

本发明的重组F基因型腮腺炎病毒株

在本发明中，采用病毒学研究的前沿技术，反向遗传操作技术，直接构建基因组中整合有麻疹病毒H基因的重组F基因型腮腺炎病毒株，能够获得同时预防腮腺炎和麻疹的活疫苗。

在本发明的实施例中，通过将麻疹病毒的H基因序列克隆到F基因型腮腺炎病毒载体的F基因和HN基因中间，得到重组的病毒全长克隆载体。将获得的病毒全长克隆载体与辅助质粒共同转染宿主细胞，培养3天后，裂解细胞，并将细胞裂解液离心，得到含有所述的重组F基因型腮腺炎病毒株(rMuV-MV-H) 的上清液。

经多步生长曲线证明，rMuV-MV-H与亲本细胞具有基本相似的生长动力学；通过免疫原性分析，rMuV-MV-H能够同时刺激免疫小鼠产生针对F基因型腮腺炎病毒和麻疹病毒的中和抗体，证明对F基因型腮腺炎和麻疹均有预防作用。

具体地，本发明提供了一种重组F基因型腮腺炎病毒株，所述病毒株是保藏号为CCTCC No:V202102的麻疹病毒rMuV-MV-H。优选地，本发明所述的重组F基因型腮腺炎病毒株的基因组中含有如如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

在本发明中，所述的重组F基因型腮腺炎病毒株的基因组中含有以下核苷酸序列：

(i)在如SEQ ID NO：1所示的F基因型腮腺炎病毒的野生型基因组的F基因序列和HN基因序列中间插入如SEQ ID NO：2所示的含有麻疹病毒H基因的序列；和

(ii)与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的序列同一性≥85％，较佳地≥90％，更佳地≥95％。

在另一优选例中，所述病毒株的基因组中含有以下核苷酸序列：

(i)在如SEQ ID NO：1所示的F基因型腮腺炎病毒的野生型基因组的F基因序列和HN基因序列中间插入如SEQ ID NO：2所示的含有麻疹病毒H基因的序列。

(ii)与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的序列同一性≥85％、≥86％、≥ 87％、≥88％、≥89％、≥90％、≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％、≥ 96％、≥97％、≥98％或≥99％。

其中，所述含有麻疹病毒H基因的序列为：

AAGAAACAGTAAGCCCGGAAGTGGTGTTTTGCGATTTCGAGGCCGGGCTCGATCCTCACCTTCCATTG TCGATAGAGGATATTTTGACACTATCTGGAAAatgtcaccacaacgagaccggataaatgccttctacaaagataacccccatcccaagggaagtaggatagtcat taacagagaacatcttatgattgatagaccttatgttttgctggctgttctgtttgtcatgtttctgagcttgatcgggttgctag ccattgcaggcattagacttcatcgggcagccatctacaccgcagagatccataaaagcctcagcaccaatctagatgta actaactcaatcgagcatcaggtcaaggacgtgttgacaccactcttcaaaatcatcggtgatgaagtgggcctgagga cacctcagagattcactgacctagtgaaattcatctctgacaagattaaattccttaatccggatagggagtacgacttaag agatctcacttggtgtatcaacccgccagagagaatcaaattggattatgatcaatactgtgcagatgtggctgctgaaga gctcatgaatgcattggtgaactcaactctactggagaccagaacaaccaatcagttcctagctgtctcaaagggaaact gctcagggcccactacaatcagaggtcaattctcaaacatgtcgctgtccctgttagacttgtatttaggtcgaggttacaatgtgtcatctatagtcactatgacatcccagggaatgtatgggggaacttacctagtggaaaagcctaatctgagcagtaa aaggtcagagttgtcacaactgagcatgtaccgagtgtttgaagtaggtgttatcagaaatccgggtttgggggctccgg tgttccatatgacaaactatcttgagcaaccagtcagtaatgatctcagcaactgtatggtagctttgggggagctcaaact cgcagccctttgtcacggggaagattctatcacaattccctatcagggatcagggaaaggtgtcagcttccagctcgtca agctaggtgtctggaaatccccaaccgacatgcaatcctgggtccccttatcaacggatgatccagtgatagacaggctt tacctctcatctcacagaggtgttatcgctgacaatcaagcaaaatgggctgtcccgacaacacgaacagatgacaagtt gcgaatggagacatgcttccaacaggcgtgtaagggtaaaatccaagcactctgcgagaatcccgagtgggcaccatt gaaggataacaggattccttcatacggggtcttgtctgttgatctgagtctgacagttgagcttaaaatcaaaattgcttcg ggattcgggccattgatcacacacggttcagggatggacctatacaaatccaaccacaacaatgtgtattggctgactat cccgccaatgaagaacctagccttaggtgtaatcaacacattggagtggataccgagattcaaggttagtccctacctctt caatgtcccaattaaggaagcaggcgaagactgccatgccccaacatacctacctgcggaggtggatgatgatgtcaa actcagttccaatctggtgattctacctggtcaagatctccaatatgttttggcaacctacgatacttccagggttgaacatg ctgtggtttattacgtttacagcccaagccgctcattttcttacttttatccttttaggttgcctataaagggggtccccatcga attacaagtggaatgcttcacatgggaccaaaaactctggtgccgtcacttctgtgtgcttgcggactcagaatctggtgg acatatcactcactctgggatggtgggcatgggagtcagctgcacagtcacccgggaagatggaaccaatcgcagata gAAAGATCTCCAACCCGGACAAGTCCCAATCCATAATGAGAGAACAGGCTGCATTCAAACAATGCTGT TCAATCATGAGACATAAAGAAAAAA。(SEQ ID NO：2)

其中，下划线部分依次为腮腺炎病毒N基因的5’UTR和腮腺炎病毒SH基因的3’UTR，小写字母部分为麻疹病毒H基因的CDS序列。

本发明的病毒株的制备方法

在本发明中，提供了一种制备重组F基因型腮腺炎病毒株的方法，所述方法包括步骤：

(S1)构建在F基因序列和HN基因序列中插入麻疹病毒H基因序列的重组F 基因型腮腺炎病毒的全长重组质粒；

(S2)分别获得包含腮腺炎病毒中的N基因、P基因和L基因的三种辅助质粒；和

(S3)分别将(S1)中获得的全长重组质粒与(S2)所述的三种辅助质粒共转染宿主细胞，培养3天后，将细胞裂解，离心细胞裂解液后，得到上清液，即获得所述重组F基因型腮腺炎病毒株。

在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：BSR-T7细胞、293T细胞、Vero 细胞、Slam/Vero细胞，或其组合。

疫苗组合物

在本发明中，提供了一种疫苗组合物及其制备方法。

本发明的疫苗组合物包括：

(a)如本发明第一方面所述的重组F基因型腮腺炎病毒株；和

(b)疫苗上可接受的载体。

优选地，所述的载体是药学上可接受的载体。在一个优选的实施方式中，所述药学上可接受的载体含有液体，较佳地为水、盐水或缓冲液。

所述载体还可含有辅助性的物质，较佳地为填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。

在另一个优选的实施方式中，所述载体中还含有细胞转染试剂。

在本发明中，所述疫苗组合物为二联疫苗或多联疫苗。优选地，所述疫苗组合物还含有源自一种或多种选自下组的病原体的疫苗组分：风疹、乙型脑炎、甲型肝炎、水痘、脊髓灰质炎、或其组合。

在一个实施方式中，所述的疫苗组分包括灭活株、减毒株、或蛋白、核酸等。

在本发明中，所述的疫苗组合物还含有佐剂。优选地，所述佐剂包括：颗粒型和非颗粒型佐剂。在一个优选的实施方式中，所述颗粒型佐剂选自下组：铝盐、油包水乳剂、水包油乳剂、纳米颗粒、微小颗粒、脂质体、免疫刺激复合物，或其组合。在另一个优选的实施方式中，所述非颗粒型佐剂选自下组：胞壁酰二肽及其衍生物、皂苷、脂质A、细胞因子、衍生多糖、细菌毒素，微生物及其产物如分枝杆菌(结核杆菌、卡介苗)、短小杆菌、百日咳杆菌、蜂胶、或其组合。

在本发明中，优选地，所述疫苗组合物每剂量中病毒至少4.0lgCCID50。在更加优选的实施方式中，本发明所述的疫苗组合物为注射剂型。

本发明的疫苗组合物的制备方法包括以下步骤：

(S1)对保藏号为CCTCC No:V202102的重组F基因型腮腺炎病毒株麻疹病毒rMuV-MV-H进行传代或培养，从而制得减毒疫苗株；

(S2)将步骤(S1)中制备的所述减毒疫苗株与免疫上可接受的载体混合，从而制得疫苗组合物。

病毒株保藏

本发明的重组F基因型腮腺炎病毒株(麻疹病毒rMuV-MV-H)已于2020年12 月24日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉)，保藏号为CCTCC No:V202102。

相较于现有技术，本发明的主要优点在于：

(1)本发明的疫苗可以作为二联苗进行使用，同时预防腮腺炎病毒和麻疹病毒；

(2)本发明的疫苗只需一种病毒株，生产简单，容易质控；并且生产周期短，生产效率更高。

(3)本发明的疫苗所选择的腮腺炎毒株的基因型更符合我国的流行特点，更具针对性。

下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1

重组病毒全长克隆构建

重组病毒全长克隆的基本思路如下：首先基于F基因型腮腺炎病毒反向遗传操作技术平台，用限制性内切酶PmlI与NaeI将质粒pMuV(质粒图谱如图1所示)线性化，通过胶回收获得到16405bp的片段A；然后以MV的cDNA为模板，分别用引物MV-H-1-F和MV-H-1-R，MV-H-2-F和MV-H-2-R，MV-H-3-F和 MV-H-3-R扩增获得片段1、片段2和片段3；用引物MV-H-1-F和MV-H-3-R以片段1、片段2和片段3为模板，通过融合PCR获得片段4(3633bp)，然后用限制性内切酶PmlI与NaeI酶切获得大小为3370bp的片段5；最后将片段A和片段5用 T4连接酶与16℃条件下过夜链接，并转化感受态细胞XL10；最终通过酶切方法鉴定获得阳性克隆，备用。获得的重组全长克隆的基因架构模式如图2，MV的 H蛋白基因最终被插入到MuV基因组中的F基因和HN基因之间，该质粒的基因长度为19738bp。将筛选克隆用KpnI酶切鉴定，结果如图3所示，全长克隆被切成两个片段，其在核酸凝胶电泳中的大小与理论值16793bp和2945bp基因一致。对插入片段两端接头处的测序结果证明(图4)，目的基因插入的位置准确。实验中所用引物的序列信息如表1所示。

表1全长克隆构建相关引物信息

实施例2

病毒拯救

首先用去内毒素试剂盒大量提取全长克隆和辅助质粒；然后将细胞接种于六孔板中过夜培养供转染使用，使用时细胞汇合度应以80-90％为宜。转染过程如下：将全长质粒pMuV-MV-H(7μg)、辅助质粒pcDNA3.1-N(1.5μg)、pcDNA3.1-P(0.2μg)、pcDNA3.1-L(1.0μg)与Lipofectamine^TM 2000转染试剂(12 μL)一起加入到500μL DMEM培养基中并轻轻混匀，将混合液置于37℃孵育20 min备用；用PBS洗涤细胞3次，第3次洗涤后尽弃上清；将混合液加入细胞孔中， 37℃孵育6h；再用用PBS洗涤3次，更换为含2％血清，1％抗生素的DMEM培养基，37℃继续培养3-4d；将细胞连同上清冻融2次，2000g离心5min，取上清备用。

于24孔板中每孔接种10⁵个Vero细胞过夜培养，分别用rMuV、rMuV-MV-H 和MV以MOI＝0.01接种细胞，接种体积为200ul，37℃孵育1h，换含2％FBS的维持液继续培养48h，尽弃上清，用80％丙酮固定细胞15min，进行IFA鉴定。分别用MV的H蛋白兔源多克隆抗体(1:500)和MuV的HN蛋白的兔源多克隆抗体(1:500)作为一抗，37℃孵育90min，PBS洗三遍，然后用羊抗兔FITC标记二抗(1:200)孵育45min，PBS洗三遍，于荧光显微镜下拍照观察。

结果如图5所示，当一抗是兔源MuV的HN蛋白多抗时，rMuV和rMuV-MV-H 感染的细胞呈阳性，MV感染的细胞呈阴性；让一抗是兔源的MV的H蛋白多抗时，rMuV-MV-H和MV感染的细胞呈阳性，而rMuV感染的细胞呈阴性。这说明， rMuV-MV-H在Vero细胞中能够成功表达MV的H蛋白。

实施例3

重组病毒的生长特性

为了验证MV的H基因的插入是否影响了重组病毒rMuV-MV-H的复制能力，我们在Vero细胞中对重组病毒和亲本病毒的多步生长曲线进行了研究。首先在六孔细胞培养板每孔接种10⁶个Vero细胞过夜培养，然后将rMuV-MV-H和亲本病毒rMuV分别以MOI＝0.01接种细胞，吸附感染1h后换成含2％胎牛血清的细胞维持液进行培养。分别于接种病毒24h、48h、72h、96h、120h和收集培养上清进行毒价测定，绘制多步生长曲线，分析不同病毒在生长动力学上是否存在差异。

结果如图6所示，相较于亲本毒，在感染后前三天，重组病毒rMuV-MV-H 复制能力因MV的H蛋白的插入而略低，但整体差异不显著。

以上结果证明，麻疹病毒H蛋白的插入并不影响rMuV作为病毒载体的复制能力。

实施例4

重组病毒的免疫原性分析

选取SPF级6-8周雌性BALB/c小鼠30只，随机分成3组；各组分别通过腹腔注射的方式免疫10⁵CCID₅₀的免疫rMuV，rMuV-MV-H和DMEM(图7)，免疫体积为500ul；初次免疫14d以相同的病毒量和体积加强免疫一次，初次免疫28 d，采集血液分离血清，通过微量病变中和法测定测定血清中腮腺炎病毒和麻疹病毒的特异性中和抗体滴度。

腮腺炎病毒的微量病变中和试验方法如下：先将待检血清于56℃灭活30 min，然后进行2倍倍比稀释，每个血清稀释度取50μL加入50μL的F基因型病毒 (含100CCID₅₀)，37℃条件下作用1h。加入100μL含有10％胎牛血清DMEM细胞培养液，37℃，5％CO₂培养7d，于显微镜下观察细胞的病变情况。按照公式计算血清抗体的中和效价。

麻疹病毒的微量病变中和试验方法如下：先将待检血清于56℃灭活30min，然后进行2倍倍比稀释，每个血清稀释度取50μL加入50μL的A基因型病毒(含 100CCID₅₀)，37℃条件下作用1h。加入100μL含有10％胎牛血清DMEM细胞培养液，37℃，5％CO₂培养7d，于显微镜下观察细胞的病变情况。按照公式计算血清抗体的中和效价。

结果如图8，横坐标达标免疫原，蓝色图标代表用F基因型的MuV作为中和用病毒，黄色图标代表用A基因型的MV作为中和用病毒。重组病毒免疫小鼠后能够同时产生针对腮腺炎病毒及麻疹病毒的特异性中和抗体，在免疫后28 d(二免后14d)，其中针对MuV的特异性中和抗体的滴度几乎达到1：200，对 MV的特异性中和抗体也达到1:32；亲本病毒rMuV的MuV特异性中和抗体滴度达到1:256，没有检测到对MV的特异性中和抗体滴度。

以上结果说明，本发明构建的重组病毒的确能够同时用于对腮腺炎和麻疹的预防。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海青赛生物科技有限公司

北京赛尔富森生物科技有限公司

<120> 一种重组F基因型腮腺炎病毒活载体麻疹疫苗

<130> P2020-2733

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 15061

<212> DNA

<213> 腮腺炎病毒(Mumps virus)

<400> 1

accaagggga aaatgaagat gggatattgg tagaacaaat agtgtaagaa acagtaagcc 60

cggaagtggt gttttgcgat ttcgaggccg ggctcgatcc tcaccttcca ttgtcgatag 120

aggatatttt gacactatct ggaaaatgtc gtctgtgctc aaagcatttg agcgattcac 180

gatagaacag gaactccagg acaggggtga ggagggttca attccgccgg agactttaaa 240

gtcagcagtc aaagtcttcg tcattaacac acccaatccc accacacgct accagatgct 300

aaacttttgc ctaagaataa tctgcagtca aaacgctagg gcgtctcaca gggtaggtgc 360

attgataaca ttattctcgc ttccctcagc aggcatgcaa aatcatatta gattagcaga 420

tagatcaccc gaggctcaga tagaacgctg tgagattgat ggttttgagc ccggcacata 480

taggctgatt ccgaatgcac gcgccaatct tactgccaat gaaattgccg cctatgcttt 540

gcttgcagat gacctccctc caaccataaa taatggaact ccttatgtac atgcagatgt 600

tgaaggtcag ccatgtgatg agattgagca attcctggat cgatgctaca gtgtactaat 660

ccaggcttgg gtgatggtct gtaaatgtat gacagcatac gaccaacctg ctgggtctgc 720

tgatcggcga tttgctaagt accagcagca aggtcgcctg gaagcaagat acatgctgca 780

gccggaggcc caaaggttga ttcaaactgc catcaggaaa agtcttgttg ttagacagta 840

ccttaccttc gaactccaat tggcaagacg gcagggattg ctgtcaaaca gatactatgc 900

aatggtaggt gacattggaa agtacattga gaattcaggc cttactgcct tcttcctcac 960

cctcaaatac gcactaggta ctaaatggag tcctttgtca ttggccgcat tcacaggtga 1020

actcactaag cttcgatcct tgatgatgtt gtatcgggat ctcggggaac aagccagata 1080

ccttgctttg ttggaggctc cccaaataat ggactttgca cccgggggct acccattgat 1140

attcagttat gccatgggag tcggtacagt cctagatgtc cagatgcgaa attacactta 1200

tgcacgacct ttcctaaatg gctattactt ccagattggg gttgagaccg caagacggca 1260

acaaggcact gttgacaaca gagtagcaga tgatctaggc ctgactcctg agcaaagaac 1320

tgaggttact cagcttgttg acaggcttgc aaggggcaga ggtgcaggga taccaggtgg 1380

gcctgtgaat ccatttgttc ctccagttca acagcaacaa cctgctgctg tatatgagga 1440

cattcctgca ttggaggaat cagatgacga cggcgatgaa gatggaggtg caggattcca 1500

aaatggagca caagcaccag ctgtaagaca gggaggtcaa aatgacttta gagtacagcc 1560

gttacaggat ccaattcaag cacagctttt catgccacta tatcctcaag tcagcaacat 1620

cccaaatcat cagaatcatc agatcaatcg catcgggggg atggaacacc aagatttatt 1680

acgatataac gagaatggtg attctcaaca agacgcgagg ggcgaacaag gaaatacctt 1740

cccaaacaat cctaaccaaa acacacagtc gcaagtgggc gactgggatg agtaaattac 1800

tgacatggtc agactacccc caaatgcaat taccccagga caatctagcc acagctaact 1860

gcccaaatcc actacattcc atcaatattt agtctttaag aaaaatttag gcccggaaag 1920

aattagttat acgaacatcg acaaagttat cttgatcgtg tttctttccg ggcaagccat 1980

ggatcaattt ataaaacaag atgagactgg tgatttaatt gagacaggaa tgaacgttgc 2040

aaatcatttc ctatccgccc ccattcaggg aaccaactcg ttgggcaaag ccacaatcat 2100

ccctggtgtt gcaccagtac tcattggcaa tccagatcaa aagaacattc aataccccac 2160

cgcatcacat cagggatcta agtcaaaggg cagaagctca gggaccaggc ccatcatagt 2220

ctcatcttcc gaagggggca ctggagggac tcagattcct gagccccttt tcgcacaaac 2280

aggacaaggt ggcattgtca ccaccgttta tcaggatcca actatccaac caacaggttc 2340

atatcgaagt gtagaattgg ctaagatagg aaaagagaga atgattaatc gatttgttga 2400

aaaacccagg acctcaacgc cggtgacaga atttaagagg ggggccggga gcggctgctc 2460

aaggccagat aatccaagag gagggcatag acgggaatgg agcctcagct gggtccaagg 2520

agaggtccgg gtctttgagt ggtgcaaccc catatgctca cctatcactg ccgcagcaag 2580

attccactcc tgcaaatgtg ggaattgccc cgcaaagtgc gatcagtgcg aacgagatta 2640

tggacctcct tagagggatg gatgctcgtc tgcaacatct tgaacaaaag gtggacaagg 2700

tgcttgcaca gggcagcatg gtgacccaaa taaagaatga attatcaaca gtaaagacaa 2760

cactagctac aattgaggga atgatggcga ccgtaaagat catggatcct ggaaacccga 2820

caggagtccc agtcgatgag cttagaagaa gtttcagtga tcatgtaaca attattagtg 2880

gaccaggaga tgtgtcattc agctccggtg aagagcctac actgtattta gatgaactag 2940

caaggcctgt ccccaagcct cgtcctgcaa agcagccaaa accccaacca gtaaaggatt 3000

tagcaggacg gaaagtgatg ataaccaaaa tgatcactga ctgtgtggcc aaccctcaaa 3060

tgaagcaggt gtttgagcaa cgactggcaa aggccagcac ggaggatgcc ctgaatgaca 3120

tcaagcgaga catcatacgg agcgccatat gaatcaacct gaaacacaag acttgcggga 3180

aaatccacaa cttaagagcc acaatgattc cctgttaaat aaaaaataag cacgaacaca 3240

agtccgatcc aaccatagct gcaatggccg ggtcacagat caaaattccc cttccaaagc 3300

cccccgattc agactcccaa agactaaatg cattccctgt aattatggcc caagaaggta 3360

aagggcgact cctcagacag atcagactta ggaaaatatt atcaggggat ccgtctgatc 3420

agcaaattac atttgtgaat acatatggat tcatccgtgc caccccagaa acatccgagt 3480

tcatctctga atcatcacaa caaaaggtga ctcctgtagt gacggcgtgc atgctgtcct 3540

tcggtgctgg accagtacta gaagacccgc aacatatgct gaaagctctt gaccagacag 3600

acatcagggt tcggaaaaca gcgagtgata aagagcagat cttattcgag atcaaccgta 3660

tccccaatct attcaggcat catcaaatat ctgcggacca tctgattcag gccagctccg 3720

ataaatatgt caagtcacca gcaaagttga ttgcaggagt aaattacatt tactgtgtca 3780

catttttatc tgtgacagtt tgctctgcct cactcaagtt tcgagttgcg cgcccattgc 3840

ttgctgcacg atctagatta gtaagagcag ttcagatgga agttttgctt cgggtaactt 3900

gcaagaaaga ttcccaaatg gcaaagagca tgttaaatga ccctgatggc gaagggtgca 3960

ttgcatccgt gtggttccac ctgtgtaatc tgtgcaaagg caggaataaa cttagaagtt 4020

atgatgaaaa ttattttgca tctaaatgcc gtaagatgaa tctgacagtc agcataggag 4080

acatgtgggg gccaaccatt ctagtccatg caggcggtca cattccgaca actgcaaaac 4140

cttttttcaa ctcaagaggc tgggtctgcc accccatcca ccaatcatca ccatcgttgg 4200

cgaagaccct atggtcatct gggtgcgaaa tcaaggctgc cagtgctatc ctccagggct 4260

cagattatgc atcactcgca aaaactgatg acataatata ctcaaagata aaagtcgata 4320

aggatgctgc caactacaag ggtgtatcct ggagtccatt caggaagtct gcctcaatga 4380

gcaacctatg aaaatttcct ctattcccat tgatgcctcc aggaggatca ataatcagtc 4440

tgatttgact ggtggtaact tgattgaaat tatagaaaaa ataagcctag aaggatatct 4500

tacttctcaa ctttcaaact ttgaaaagag aacctatcag taatcatgaa ggctttttta 4560

gttatttgct tgggctttgc agtcttttca tattctatct gtgtgaatat caacatcttg 4620

cagcaagttg gatatatcaa gcaacaagtc aggcaactaa gctattactc acaaagttca 4680

agctcctaca tagtggtcaa gcttttaccg aatatccaac ccactgataa cagctgtgaa 4740

tttaagagtg taactcaata caataagacc ttgagtaatt tgctccttcc aattgcagaa 4800

aacataaaca atattgcatc gccctcacct gggtcaagac gtcataaaag gtttgctggc 4860

attgccatcg gcattgctgc gctcggtttt gcgaccgcag cacaagtaac tgccgctgtc 4920

tcattagttc aagcacagac aaatgcacgt gcgatagcgg cgatgaaaaa ttcaatacag 4980

gcaactaatc gagcagtctt cgaagtgaaa gaaggaactc aacagttagc tatagcggta 5040

caagcaatac aagaccacat caatactatt atgaacactc aattgagcaa tatgtcttgt 5100

cagatccttg ataaccagct tgcgacttcc ctaggattat acctaacaga attaacaaca 5160

gtgtttcagc cccaattaat taatccggca ctgtcaccga ttagtataca agccttgagg 5220

tctttgcttg gaagtatgac acttgcagtg gttcaagcaa cattatctac ttcaatttct 5280

gctgctgaaa tactaagtgc cggtctaatg gagggtcaga ttgtgtctgt tctgctagat 5340

gagatgcaga tgatagttaa gataaatatt ccaaccattg tcacacaatc aaatgcattg 5400

gtgattgact tctactcaat ttcgagcttt attaataatc aggaaaccat aattcaatta 5460

ccagacaggg tcttggagat cgggaatgaa cagtggagct atccagctaa aaattgtaag 5520

ttgacaagac acaacatatt ctgccaatac aatgaggcag agaggttgag cctagagtca 5580

aaactatgcc ttgcaggaaa tataagtgcc tgtgtgttct cacccatagc aggaagttat 5640

atgaggcgat ttgtagcact ggatggaaca attgttgcaa actgtcgaag tctaacgtgt 5700

ctatgcaaga gtccatctta tcctatatac caacctgacc atcatgcagt cacaaccgtt 5760

gatctaaccg catgtcaaac attgtcccta gacggattgg atttcagcat tgtctctcta 5820

agcaacatca cttacgctga gaatcttacc atttcattgt ctcagacaat caatactcaa 5880

cccattgaca tatcaactga actaagtaaa gttaatgcat ccctccaaaa tgccgttaag 5940

tacataaaag agagcaacca acaactccaa tctgtgagtg taaattccaa aatcggagct 6000

ataattctag cagccttagt cttgagcatc ctgtcaatca tcatttcgct attgttttgc 6060

tgctgggctt acattgcaac taaagaaatc aggagaatca acttcaaaac aaatcatatc 6120

aacacaatat caagtagtgt cgatgatctc atcaggtact aatcctaaca ttgtgattca 6180

ttctgcattg agaaaagatt tagaaaaaaa gcaggccaga acaaactcag gatcacaaca 6240

caatacagaa ccccagctgc tatcacaact gtgctccagc agcttgaaag atggatccct 6300

cgaaattctt cacaatatcg gacaatgcca cctttgcacc tgggcctgtt atcaatgcag 6360

ctgacaagaa gacattccga acctgcttcc gaatattggt attgtctgta caagctgtta 6420

cccttatatt agtcattgtc actttaggtg agcttgtgag gatgatcaat gatcaaggct 6480

tgagtaatca gttgtcttca attacaaaca agataagaga gtcagctact atgattgcat 6540

ctgctgtggg agtaatgaat caagttattc acggagtaac gatatcctta cccctacaaa 6600

ttgagggaaa ccaaaatcaa ttgttatcca cacttgccac aatctgtaca agcaaaaaac 6660

aagtctcaaa ctgctctacg aacatcccct tagttaatga ccttaggttt ataaatggga 6720

tcaataaatt catcattgaa gattatgcaa ctcatgattt ctctatcggc catccactca 6780

acatgcctag ctttatccca actgcaactt cacccaatgg ttgcacaagg attccatcct 6840

tctctctagg taagacacac tggtgttaca cacataatgt aattaatgcc aactgtaagg 6900

atcatacttc gtctaaccaa tatgtttcta tggggattct cgttcagacc gcgtcagggt 6960

atcctatgtt caaaacctta aaaatccaat atctcagtga tggcctgaat cggaaaagct 7020

gctcaattgc aacagtccct gatggatgcg caatgtattg ttacgtctca attcagcttg 7080

aaaccgacga ctatgcaggg ttcagcccac ctacccagaa acttaccctg ttattctata 7140

atgacaccgt cacagaacgg acaatatctc catctggtct tgaagggaat tgggctactt 7200

tggtaccagg agtggggagt ggaatatatt tcgagaataa attgatcttt cctgcatatg 7260

ggggtgtctt gcccaatagt acacttggag ttaaatcagc aagagaattt ttccgacctg 7320

ttaatccata taatccatgt tcaggaccac aacaagattt agatcagcgt gctttgagat 7380

catacttccc aagttacttc tctaatcgaa gagtgcagag tgcatttctt gtctgtgcct 7440

ggaaccagat cctagttaca aattgcgagc tagttgtccc ctcaaacaat cagacactga 7500

tgggtgcaga aggaagagtt ttattgatca ataatcgatt attatattat cagagaagta 7560

ccagctggtg gccgtatgaa ctcctctatg agatgtcatt cacctttaca aactctggtc 7620

aatcatctgt gaacatgtcc tggataccta tatactcatt cactcgtcct ggttcaggta 7680

actgcagtgg tgaaaatgtg tgcccgactg cttgtgtgtc aggggtttat cttgaccctt 7740

ggccattaac tccatatagc caccaatcag gcattaacag aaatttctat ttcacaggtg 7800

cactattaaa ttcaagcaca actagagtaa atcctaccct ttatgtctct gcccttaata 7860

atcttaaagt actagcccca tatggtactc aaggactgtt tgcctcgtac accacaacca 7920

cctgctttca agataccggt gatgctagtg tatattgtgt ttatattatg gaactagcat 7980

cgaatatcgt tggagaattc caaattctac ctgtgctaac caggctgacc atcacttgag 8040

tcatagtgaa tgcagcggta ggccctatga gcgtgtccca agttttatcg attattaaga 8100

aaaaataggc cagaatggcg ggcctaaatg agatactctt acctgaagta catttgaact 8160

cacccatcgt tagatataag cttttctact atatattgca tggccagtta ccaaatgatt 8220

tggagccaga tgacttgggc ccactagcaa atcagaattg gaaggcaatt cgatctgaag 8280

aatctcaggt tcatgcacgt ttaaaacaga tcagagtaga actcattgca aggattccta 8340

gtctccggtg gacccgctct caaagagaga ttgccatact catttggcca agaatacttc 8400

caatcctgca agcatatgat cttcggcaaa gtatgcaatt gcctacagca tgggagaaat 8460

tgactcaatc cacagttaat cttataagtg atggcctgga acgggttgta ttacatatca 8520

gcaatcaact gacaggcaag cctaacttgt ttaccagatc tcgagcagga caagacgcaa 8580

aggattcctc aattccatcc actagagagc tatctcaaat atggtttaac aatgagtgga 8640

gtggatctgt aaagacctgg cttatgatta aatatagaat gaggcagcta atcacaaacc 8700

aaaagacagg tgaattaaca gatttagtaa ccattgtgga tactagatcc actctatgca 8760

ttattacccc agaattagtt gctttatact ccaatgagca caaagcatta acgtacctca 8820

cctttgaaat ggtattaatg gtcactgata tgttagaggg acgattgaat gtgtcttctt 8880

tatgcactgc tagtcattat ctgtctcctc taaagaagag aatcgaaatt ctcctaacat 8940

tagttgatga ccttgctcta ctcatggggg acaaagtata cggtgttgtc tgttcacttg 9000

agagttttgt ttatgcccaa ttacagtatg gtgatcctgt tgtagacatt aagggcacat 9060

tctatggatt tatatgtaat gagattctcg acctcctgac tgaagacaac atctttactg 9120

aagaggaggc aaacaaggtt cttctggact tgacatcaca gtttgacaat ttatcccctg 9180

atttaactgc tgagctcctc tgcattatga gactttgggg ccatcccaca ttaaccgcca 9240

gccaagcagc atccaaggtc cgagagtcca tgtgtgctcc caaggtatta gatttccaaa 9300

caataatgaa gaccctggct ttctttcacg caatcctgat taacggttat aggaggagcc 9360

ataatggaat ctggcctcct actactcttc atggcaatgc ccccaaaagc ctcattgaga 9420

tgcgtcatga taattcagag cttaagtatg aatatgtcct caagaattgg aaaagtatat 9480

ctatgttaag gatacataaa tgctttgatg catcacctga tgaagatctc agcatattca 9540

tgaaggataa ggcaataagc tgtccaaagc aagactggat gggagtattt aggaggagcc 9600

tgataaaaca gcgatatcgt gatgcgaatc gacctctacc acaaccattc aaccgacggc 9660

tactgttgaa ttttctagaa gatgacagat tcgatcctat taaagaactt gagtatgtca 9720

ccagtggaga atatcttagg gaccctgaat tttgtgcatc ttactctctc aaggagaagg 9780

agataaaggc tacaggtcgt atatttgcta aaatgacaaa gagaatgaga tcgtgccaag 9840

taattgcaga gtcattgttg gccaatcatg caggaaaatt aatgagagag aatggagttg 9900

tcttagacca gttaaaactg acaaaatctt tgttaacgat gaaccaaatt ggtattatat 9960

cggagcacag ccgaagatcc actgctgaca acatgacttt ggcacactcc ggttcaaata 10020

agcacagaat taataatagc caattcaaga agaataaaga caataaacat gagatgcctg 10080

atgatgggtt tgagatagca gcctgctttc taacaactga cctcacaaag tactgcttaa 10140

attggaggta ccaagttatc atcccctttg cgcgtacatt gaactcaatg tatggtatac 10200

cccatctgtt cgaatggata catttaaggc taatgcgaag cactctctat gtcggtgatc 10260

ccttcaatcc tccatcagat cctacccaac ttgaccttga tacagctctc aacgatgata 10320

tatttatagt ttcccctcgt ggaggaatcg agggtttatg tcaaaaatta tggactatga 10380

tttccatctc aacaattata ttatccgcaa ctgaggctaa cactagagtt atgagcatgg 10440

ttcagggtga caaccaagca attgcaatca ccactagagt agtacgctcg ctcagtcatt 10500

ccgagaagaa ggagcaagct tataaagcga gtaaattatt ctttgaaagg cttagagcta 10560

acaaccatgg aattggacac cacttaaaag aacaagaaac aatccttagt tctgatttct 10620

tcatatatag taagagggtg ttttacaaag gtcgaatttt gactcaggcg ttaaagaatg 10680

tgagcaagat gtgcttaaca gctgatatac tgggggactg ctcacaagca tcatgctcca 10740

atttagccac tactgtaatg cgcctgactg agaatggggt cgagaaagat ttgtgttatt 10800

ttctaaatgc attcatgaca atcagacaat tgtgttatga tctagtattt ccccaaacta 10860

aatcccttag tcaggacatc actaatgctt atctcaatca tccaatactt atctcaagat 10920

tgtgtctatt accatctcaa ttggggggac tgaactttct ctcgtgtagt cgcctgttca 10980

atagaaacat aggagaccca ttagtgtctg caattgctga tgtgaaacga ttaattaaag 11040

ctggctgttt agacatctgg gtcttgtata acattcttgg aagaagacct gggaaaggta 11100

agtggagcac tctggcagct gatccctata ctttaaacat agattattta gttccttcaa 11160

caactttttt aaagaagcat gcacaatata ctttgatgga acggagtgtt aatcccatgc 11220

tccgtggagt attcagtgag aatgcagctg aggaagagga ggaactcgca cagtatctat 11280

tagatcgtga ggtagtcatg cccagggttg cacatgtaat acttgcccag tctagttgcg 11340

gtagaagaaa gcagattcaa ggttacttgg attccactag gactattatc aggtattcat 11400

tggaggtgag accattgtca gcaaagaagc tgaatacagt tatagaatat aacttattgt 11460

atctgtccta taatttggag attattgaaa aacccaatat agtccagcca tttttgaatg 11520

caatcaatgt tgatacttgt agcatagata tagctaggtc ccttagaaaa ctatcctggg 11580

caactttact taatggacgt cccatcgagg gattagaaac acctgatccc attgaattgg 11640

tacatgggtg tctgataatt gggtcagatg aatgtgagca ttgcagtagt ggtgatgaca 11700

agtttacctg gtttttccta cccaagggga taaggctaga taatgacccg gcgtccaacc 11760

cacccatcag agtaccttat attggatcta aaacagatga gcggagggtt gcgtcaatgg 11820

cttacatcaa aggagcatct gtatcactta aatcagcact caggttagcg ggggtatata 11880

tttgggcctt cggagataca gaagaatcat ggcaagatgc ctatgagtta gcctccactc 11940

gtgtcaatct cacgctagag caattgcaat ctctcactcc tttgccaaca tctgccaacc 12000

tagtccacag gttggatgat ggcactactc aattaaaatt taccccggca agctcttatg 12060

cattctctag ctttgtgcat atatctaatg actgtcaagt tcttgagatc gatgatcagg 12120

taacagattc taacctgatt taccaacaag ttatgattac tggccttgct ttaattgaga 12180

catggaacaa tcctccaatt aacttctccg tttatgaaac tacactacac ctacacacag 12240

gctcatcttg ctgtataaga cctgttgagt cttgtgtagt aaatcctcct ttgcttcctg 12300

tccccttcat caatgttctt caaatgaata agtttgtata tgaccctgaa ccactcagtt 12360

tgctagagat ggaaaaaatt gaggatattg cttatcaaac cagaattggt ggtttagatc 12420

aaatcccact tctggaaaaa atacccttac tagctcacct caccgccaag cagatggtaa 12480

atagcatcac tgggcttgat gaagcaacat ctatagtgaa tgacgctgta gttcaagcag 12540

actatactag caattggatt agtgaatgct gctacactta cattgattct gtgtttgttt 12600

attctggctg ggcattatta ttggaacttt cgtaccaaat gtactactta agaattcaag 12660

gcatccaagg aattctagac tatgtgtata tgaccttgcg gaggatacct ggaatggcta 12720

taacaggcat ctcatccaca atcagtcacc ctcgtatact cagaagatgc ataaatttgg 12780

atgtcatagc cccaatcaat tctccacaca tagcttcact ggattacaca aaattaagca 12840

tagatgcagt aatgtgggga actaagcaag ttttgaccaa catttcgcaa ggtatcgatt 12900

atgagatagt cgttccttct gaaagccagc tcacactcag tgatagagtt ctaaatctag 12960

ttgctcgaaa attatcacta cttgcaatca tctgggcaaa ttataactat cctccaaagg 13020

ttaaaggtat gtcacctgag gacaaatgtc aggctttaac tacacaccta ctccagactg 13080

tcgagtatgt tgagcacatt cagattgaaa agacaaacat caggaggatg attattgaac 13140

caaaattaac tgcctaccct agtaatttgt tttatctatc tcgaaagctg cttaatgcta 13200

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t 15061

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atgatttgga gccagatgac ttgggcccac tagcaaatca gaattggaag gcaattcgat 10320

ctgaagaatc tcaggttcat gcacgtttaa aacagatcag agtagaactc attgcaagga 10380

ttcctagtct ccggtggacc cgctctcaaa gagagattgc catactcatt tggccaagaa 10440

tacttccaat cctgcaagca tatgatcttc ggcaaagtat gcaattgcct acagcatggg 10500

agaaattgac tcaatccaca gttaatctta taagtgatgg cctggaacgg gttgtattac 10560

atatcagcaa tcaactgaca ggcaagccta acttgtttac cagatctcga gcaggacaag 10620

acgcaaagga ttcctcaatt ccatccacta gagagctatc tcaaatatgg tttaacaatg 10680

agtggagtgg atctgtaaag acctggctta tgattaaata tagaatgagg cagctaatca 10740

caaaccaaaa gacaggtgaa ttaacagatt tagtaaccat tgtggatact agatccactc 10800

tatgcattat taccccagaa ttagttgctt tatactccaa tgagcacaaa gcattaacgt 10860

acctcacctt tgaaatggta ttaatggtca ctgatatgtt agagggacga ttgaatgtgt 10920

cttctttatg cactgctagt cattatctgt ctcctctaaa gaagagaatc gaaattctcc 10980

taacattagt tgatgacctt gctctactca tgggggacaa agtatacggt gttgtctgtt 11040

cacttgagag ttttgtttat gcccaattac agtatggtga tcctgttgta gacattaagg 11100

gcacattcta tggatttata tgtaatgaga ttctcgacct cctgactgaa gacaacatct 11160

ttactgaaga ggaggcaaac aaggttcttc tggacttgac atcacagttt gacaatttat 11220

cccctgattt aactgctgag ctcctctgca ttatgagact ttggggccat cccacattaa 11280

ccgccagcca agcagcatcc aaggtccgag agtccatgtg tgctcccaag gtattagatt 11340

tccaaacaat aatgaagacc ctggctttct ttcacgcaat cctgattaac ggttatagga 11400

ggagccataa tggaatctgg cctcctacta ctcttcatgg caatgccccc aaaagcctca 11460

ttgagatgcg tcatgataat tcagagctta agtatgaata tgtcctcaag aattggaaaa 11520

gtatatctat gttaaggata cataaatgct ttgatgcatc acctgatgaa gatctcagca 11580

tattcatgaa ggataaggca ataagctgtc caaagcaaga ctggatggga gtatttagga 11640

ggagcctgat aaaacagcga tatcgtgatg cgaatcgacc tctaccacaa ccattcaacc 11700

gacggctact gttgaatttt ctagaagatg acagattcga tcctattaaa gaacttgagt 11760

atgtcaccag tggagaatat cttagggacc ctgaattttg tgcatcttac tctctcaagg 11820

agaaggagat aaaggctaca ggtcgtatat ttgctaaaat gacaaagaga atgagatcgt 11880

gccaagtaat tgcagagtca ttgttggcca atcatgcagg aaaattaatg agagagaatg 11940

gagttgtctt agaccagtta aaactgacaa aatctttgtt aacgatgaac caaattggta 12000

ttatatcgga gcacagccga agatccactg ctgacaacat gactttggca cactccggtt 12060

caaataagca cagaattaat aatagccaat tcaagaagaa taaagacaat aaacatgaga 12120

tgcctgatga tgggtttgag atagcagcct gctttctaac aactgacctc acaaagtact 12180

gcttaaattg gaggtaccaa gttatcatcc cctttgcgcg tacattgaac tcaatgtatg 12240

gtatacccca tctgttcgaa tggatacatt taaggctaat gcgaagcact ctctatgtcg 12300

gtgatccctt caatcctcca tcagatccta cccaacttga ccttgataca gctctcaacg 12360

atgatatatt tatagtttcc cctcgtggag gaatcgaggg tttatgtcaa aaattatgga 12420

ctatgatttc catctcaaca attatattat ccgcaactga ggctaacact agagttatga 12480

gcatggttca gggtgacaac caagcaattg caatcaccac tagagtagta cgctcgctca 12540

gtcattccga gaagaaggag caagcttata aagcgagtaa attattcttt gaaaggctta 12600

gagctaacaa ccatggaatt ggacaccact taaaagaaca agaaacaatc cttagttctg 12660

atttcttcat atatagtaag agggtgtttt acaaaggtcg aattttgact caggcgttaa 12720

agaatgtgag caagatgtgc ttaacagctg atatactggg ggactgctca caagcatcat 12780

gctccaattt agccactact gtaatgcgcc tgactgagaa tggggtcgag aaagatttgt 12840

gttattttct aaatgcattc atgacaatca gacaattgtg ttatgatcta gtatttcccc 12900

aaactaaatc ccttagtcag gacatcacta atgcttatct caatcatcca atacttatct 12960

caagattgtg tctattacca tctcaattgg ggggactgaa ctttctctcg tgtagtcgcc 13020

tgttcaatag aaacatagga gacccattag tgtctgcaat tgctgatgtg aaacgattaa 13080

ttaaagctgg ctgtttagac atctgggtct tgtataacat tcttggaaga agacctggga 13140

aaggtaagtg gagcactctg gcagctgatc cctatacttt aaacatagat tatttagttc 13200

cttcaacaac ttttttaaag aagcatgcac aatatacttt gatggaacgg agtgttaatc 13260

ccatgctccg tggagtattc agtgagaatg cagctgagga agaggaggaa ctcgcacagt 13320

atctattaga tcgtgaggta gtcatgccca gggttgcaca tgtaatactt gcccagtcta 13380

gttgcggtag aagaaagcag attcaaggtt acttggattc cactaggact attatcaggt 13440

attcattgga ggtgagacca ttgtcagcaa agaagctgaa tacagttata gaatataact 13500

tattgtatct gtcctataat ttggagatta ttgaaaaacc caatatagtc cagccatttt 13560

tgaatgcaat caatgttgat acttgtagca tagatatagc taggtccctt agaaaactat 13620

cctgggcaac tttacttaat ggacgtccca tcgagggatt agaaacacct gatcccattg 13680

aattggtaca tgggtgtctg ataattgggt cagatgaatg tgagcattgc agtagtggtg 13740

atgacaagtt tacctggttt ttcctaccca aggggataag gctagataat gacccggcgt 13800

ccaacccacc catcagagta ccttatattg gatctaaaac agatgagcgg agggttgcgt 13860

caatggctta catcaaagga gcatctgtat cacttaaatc agcactcagg ttagcggggg 13920

tatatatttg ggccttcgga gatacagaag aatcatggca agatgcctat gagttagcct 13980

ccactcgtgt caatctcacg ctagagcaat tgcaatctct cactcctttg ccaacatctg 14040

ccaacctagt ccacaggttg gatgatggca ctactcaatt aaaatttacc ccggcaagct 14100

cttatgcatt ctctagcttt gtgcatatat ctaatgactg tcaagttctt gagatcgatg 14160

atcaggtaac agattctaac ctgatttacc aacaagttat gattactggc cttgctttaa 14220

ttgagacatg gaacaatcct ccaattaact tctccgttta tgaaactaca ctacacctac 14280

acacaggctc atcttgctgt ataagacctg ttgagtcttg tgtagtaaat cctcctttgc 14340

ttcctgtccc cttcatcaat gttcttcaaa tgaataagtt tgtatatgac cctgaaccac 14400

tcagtttgct agagatggaa aaaattgagg atattgctta tcaaaccaga attggtggtt 14460

tagatcaaat cccacttctg gaaaaaatac ccttactagc tcacctcacc gccaagcaga 14520

tggtaaatag catcactggg cttgatgaag caacatctat agtgaatgac gctgtagttc 14580

aagcagacta tactagcaat tggattagtg aatgctgcta cacttacatt gattctgtgt 14640

ttgtttattc tggctgggca ttattattgg aactttcgta ccaaatgtac tacttaagaa 14700

ttcaaggcat ccaaggaatt ctagactatg tgtatatgac cttgcggagg atacctggaa 14760

tggctataac aggcatctca tccacaatca gtcaccctcg tatactcaga agatgcataa 14820

atttggatgt catagcccca atcaattctc cacacatagc ttcactggat tacacaaaat 14880

taagcataga tgcagtaatg tggggaacta agcaagtttt gaccaacatt tcgcaaggta 14940

tcgattatga gatagtcgtt ccttctgaaa gccagctcac actcagtgat agagttctaa 15000

atctagttgc tcgaaaatta tcactacttg caatcatctg ggcaaattat aactatcctc 15060

caaaggttaa aggtatgtca cctgaggaca aatgtcaggc tttaactaca cacctactcc 15120

agactgtcga gtatgttgag cacattcaga ttgaaaagac aaacatcagg aggatgatta 15180

ttgaaccaaa attaactgcc taccctagta atttgtttta tctatctcga aagctgctta 15240

atgctattag agattctgaa gaaggacaat tcctgattgc atcttattat aacagttttg 15300

gatatttgga gccaatacta atggaatcta aaatattcaa tctaagttca tctgaatcgg 15360

catctcttac agagttcgat ttcatcctca acttggaatt gtctgaaacc agccttgaga 15420

aatactctct cccaagtttg cttatgacgg ctgagaatat ggataaccca tttcctcaac 15480

ccccccttca tcatgttctc agaccattag gtttatcatc cacctcatgg tataaaacaa 15540

tcagtgtttt gaattatatt agccatatga agatatccga cggtgcccat ctatacttgg 15600

cagaggggag tggagcctct atgtcactta tagagacttt cttgcccggt gaaacaatat 15660

ggtacaacag cctattcaat agtggtgaga atcctcccca acgcaatttc gcccctttgc 15720

ccacccagtt tattgaaagt gtcccttaca gattgattca agcaggtata gcagcaggaa 15780

gtggtgtagt gcaaagtttc tatccactct ggaacggtaa cagcgatatc actgacttaa 15840

gcacgaaaac tagtgtcgaa tacattattc acaaggtggg agcggataca tgtgcattgg 15900

ttcatgtgga tttggagggt gtacccggtt caatgaatag catgctggag agagcccaag 15960

tacatgcgct actgatcacg gtaactgtat taaagccagg tggcttgcta atcttgaaag 16020

cttcatggga accttttaat cgattttcct ttttactcac aatcctctgg caattctttt 16080

caacaataag gatcctgcga tcttcatact ctgacccgaa taatcacgag gtatacataa 16140

tagctacatt agcagttgat cccaccacat cctcctttac aactgctctg aatagggcgc 16200

gcaccctaaa tgaacagggc ttttcactca tcccacctga attagtgagt gagtactgga 16260

ggaggcgcgt tgaacaaggg caaattatac aggatcgtat agataaagtc atatcggaat 16320

gtgtcagaga ccaatacctg gcagataaca acattatcct tcaggcagga ggaactccaa 16380

gcacaagaaa atggttggat ctacctgact atccgtcgtt caatgaatta caatcggaga 16440

tggccagact cataacaatt catctcaaag agataataga aatcctaaaa ggccaatcat 16500

cagatcatga caccttatta tttacttcgt acaatgtagg tcccctcggg aaaataaata 16560

caatactcag attgattgtt gagagaattc ttatgtacac tgtaaggaac tggtgcatct 16620

tgcccaccca aactcgtctc accttacgac agtctatcga gcttggagag tttagactaa 16680

gagacgtgat aacacccatg gagatcctta aactatcccc caacaggaaa tatctgaagt 16740

ctgcattaaa ccaatcaaca ttcaatcatc taatggggga aacatctgac atattgttaa 16800

atcgagccta tcagaagaga atttggaaag ccattggatg tgtaatctat tgctttggtt 16860

tgcttacccc ggatgttgaa gattccgagc gcattgatat tgataatgat atacctgatt 16920

atgatattca cggggacata atttaaatct gttaaagact cctctggtat gatacatcac 16980

cgaaaggtgc cacaccagca tcccaattct tctagaccgc acacgacctc gaacaatcat 17040

aaccacatca gtattaagtc cataatatca ttttaagaaa aaattgattt tactttctcc 17100

ccttggt 17107

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

attagttcaa gcacagacaa atgcacgtgc gatagcgg 38

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

cgttgtggtg acattttcca gatagtgtca aaatatcc 38

<210> 6

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

ggatattttg acactatctg gaaaatgtca ccacaacgag accggataaa tgccttc 57

<210> 7

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

gtttgaatgc agcctgttct ctcattatgg attgggactt gtccgggttg gagatctttc 60

tatctgcgat tggttccatc ttcccgggtg 90

<210> 8

<211> 93

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

ccataatgag agaacaggct gcattcaaac aatgctgttc aatcatgaga cataaagaaa 60

aaaccaaatt aagaatgaat ctcctggggt cgt 93

<210> 9

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

caggtgcaaa ggtggcattg tccgatattg tgaag 35

Claims (10)

1.一种重组F基因型腮腺炎病毒株，其特征在于，所述病毒株是保藏号为CCTCC No:V202102的重组F基因型腮腺炎病毒株。

2.如权利要求1所述的病毒株，其特征在于，所述病毒株的基因组中含有如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

3.如权利要求2所述的病毒株，其特征在于，所述病毒株的基因组中含有以下核苷酸序列：

(i)在如SEQ ID NO：1所示的F基因型腮腺炎病毒的野生型基因组的F基因序列和HN基因序列中间插入如SEQ ID NO：2所示的含有麻疹病毒H基因的序列；和

(ii)与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的序列同一性≥85％，较佳地≥90％，更佳地≥95％。

4.一种疫苗组合物，其特征在于，所述组合物包括：

(a)如权利要求1所述的重组F基因型腮腺炎病毒株；和

(b)疫苗上可接受的载体。

5.如权利要求4所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物为预防麻疹病毒和腮腺炎病毒的二联疫苗。

6.如权利要求4所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物每剂量中病毒至少为4.0lgCCID₅₀。

7.一种制备如权利要求1所述的重组F基因型腮腺炎病毒株的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(S1)构建在F基因序列和HN基因序列中插入麻疹病毒H基因序列的重组F基因型腮腺炎病毒的全长重组质粒；

(S2)分别获得包含腮腺炎病毒中的N基因、P基因和L基因的三种辅助质粒；和

(S3)分别将(S1)中获得的全长重组质粒与(S2)所述的三种辅助质粒共转染宿主细胞，培养3天后，将细胞裂解，离心细胞裂解液后，得到上清液，即获得所述重组F基因型腮腺炎病毒株。

8.一种如权利要求1所述的重组F基因型腮腺炎病毒株的用途，其特征在于，用于制备一种疫苗组合物，所述疫苗组合物用于预防腮腺炎和/或麻疹。

9.一种制备疫苗组合物的方法，其特征在于，包括步骤：

(S1)对保藏号为CCTCC No:V202102的重组F基因型腮腺炎病毒株进行传代或培养，从而制得减毒疫苗株；

(S2)将步骤(S1)中制备的所述减毒疫苗株与免疫上可接受的载体混合，从而制得疫苗组合物。

10.一种预防腮腺炎和麻疹的接种方法，其特征在于，包括步骤：给需要的对象接种如权利要求4所述的疫苗组合物。

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