CN117777258A - 结核分枝杆菌Rv3921c重组蛋白在制备结核病疫苗中的应用 - Google Patents
结核分枝杆菌Rv3921c重组蛋白在制备结核病疫苗中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及结核分枝杆菌Rv3921c重组蛋白在制备结核病疫苗中的应用,属于免疫学领域。本发明提供了一种结核分枝杆菌Rv3921c重组蛋白,其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。本发明的Rv3921c重组蛋白能够提高小鼠血清中总IgG抗体水平和脾脏细胞上清液中IFN‑γ水平,表明Rv3921c重组蛋白加强免疫对强化BCG在潜伏期的免疫保护力有一定效果,可用于制备结核病疫苗。
Description
技术领域
本发明涉及免疫学领域,尤其涉及结核分枝杆菌Rv3921c重组蛋白在制备结核病疫苗中的应用。
背景技术
结核病(tuberculosis,TB)是一种主要以结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)为病原体、通过呼吸道传播的慢性传染性疾病,也是优先防治的三大传染性疾病之一。随着卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin Vaccine,BCG)保护效果逐渐缺失,加之目前依然缺乏新的具有高保护性的TB疫苗,从而造成TB疫情有蔓延的趋势,同时随着耐多药TB患者和HIV患者的增加,TB疫情的防控面临更加严峻的挑战。
BCG由活体减毒牛型结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis)悬浮液制备而成,是迄今为止唯一获得许可的TB疫苗,能够为婴幼儿对结核性脑膜炎、血行播散型肺结核等严重结核病类型提供适度免疫,但是对在青少年和成人中占主要类型的传染性肺结核的预防效果存在巨大差异。研究表明,BCG接种或再接种对结核病没有明显的防控作用。目前在研究的TB疫苗可分为减毒活疫苗、灭活分枝杆菌或提取物疫苗、重组亚单位疫苗以及病毒载体疫苗,其中,减毒活疫苗和灭活疫苗的生产工艺成熟,保留了完整的MTB抗原库,能够引起更广泛的免疫应答反应且不需要联合佐剂,但其免疫期较短,通常需要多次接种增强免疫力,对免疫功能缺陷患者(如HIV患者)接种时可能会增加其感染TB的风险;重组亚单位疫苗安全高效、可大规模生产,但免疫原性较弱,需联合佐剂使用,其抗原性与所选用的表达系统紧密相关,因此找到良好且适合的表达系统较为困难;病毒载体疫苗接种方式简单,接种次数少,但能够引发的免疫反应较低,可供选择的病毒载体有限,并且同样存在潜在的安全性问题。
当前,结核病的防治机制仍然以细胞免疫为主,由抗原引起的特异性抗体及其在抗结核免疫中的功能特性尽管开始受到关注,然而现有技术中尚未确定特异性抗体在防治结核病过程中的确切机制和贡献。
发明内容
本发明的目的在于针对上述现有技术中的缺陷,提供结核分枝杆菌Rv3921c重组蛋白在制备结核病疫苗中的应用。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种结核分枝杆菌Rv3921c重组蛋白,所述结核分枝杆菌Rv3921c重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了所述的结核分枝杆菌Rv3921c重组蛋白在制备抗结核病的制剂中的应用。
本发明还提供了一种编码所述的结核分枝杆菌Rv3921c重组蛋白的核苷酸序列,编码SEQ ID NO.1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;
编码SEQ ID NO.2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供了所述的核苷酸序列在制备抗结核病的制剂中的应用。
本发明还提供了一种重组质粒,所述重组质粒包括所述的核苷酸序列以及空载载体;
所述空载载体为pET-28a(+)载体。
本发明还提供了所述的重组质粒在制备抗结核病的制剂中的应用。
本发明还提供了一种重组菌,所述重组菌包括所述的重组质粒以及空载菌;
所述空载菌为大肠杆菌。
本发明还提供了所述的重组菌在制备抗结核病的制剂中的应用。
本发明还提供了一种结核病疫苗,所述结核病疫苗包括所述的结核分枝杆菌Rv3921c重组蛋白、所述的核苷酸序列、所述的重组质粒或所述的重组菌。
本发明具有如下技术效果和优点:
本发明的Rv3921c重组蛋白能够提高小鼠血清中总IgG抗体水平和小鼠脾脏细胞上清液中IFN-γ水平,表明Rv3921c重组蛋白加强免疫对强化BCG的免疫保护力有一定效果,可用于制备结核病疫苗。
附图说明
图1为pET-28a/TB gene重组质粒模式图;
图2为pET-28a/TB gene重组阳性质粒的菌液PCR鉴定结果;
图3为结核血清候选重组蛋白存在形式的SDS-PAGE检测结果,图中泳道M为Marker,泳道1~8分别为Rv1815、Rv3354、Rv3849、Rv1411c、Rv1566c、Rv1825、Rv3807c、Rv1579重组蛋白,为可溶性表达,泳道9~16分别为Rv0436c、Rv0835、Rv0229c、Rv1146、Rv1977、Rv3206c、Rv3738c、Rv3921c重组蛋白,为包涵体表达;
图4为结核血清候选重组蛋白纯化液的SDS-PAGE电泳结果,图中泳道M为Marker,泳道1~16分别为Rv1815、Rv3354、Rv3849、Rv1411c、Rv1566c、Rv1825、Rv3807c、Rv1579、Rv0436c、Rv0835、Rv0229c、Rv1146、Rv1977、Rv3206c、Rv3738c、Rv3921c重组蛋白;
图5为Rv3921c重组蛋白的SDS-PAGE电泳结果,其中泳道M为Marker,泳道1为未诱导的Rv3921c重组蛋白,泳道2为诱导1h后的Rv3921c重组蛋白,泳道3为诱导2h后的Rv3921c重组蛋白,泳道4为诱导3h后的Rv3921c重组蛋白,泳道5为诱导4h后的Rv3921c重组蛋白,泳道6为诱导5h后的Rv3921c重组蛋白,泳道7为BL21菌体经超声破碎后的可溶性表达情况,泳道8为BL21菌体经超声破碎后的包涵体表达情况,泳道9为经Ni-Sepharose柱吸附后的重组蛋白液,泳道10为柱后液样品,泳道11为洗脱液样品Ⅰ,泳道12为洗脱液样品Ⅱ,泳道13为洗脱液样品Ⅲ,泳道14为洗脱液样品Ⅳ;
图6为实验组和阳性对照组小鼠的血清抗体水平分析;
图7为实验组、阳性对照组和阴性对照组小鼠的脾细胞因子水平分析。
具体实施方式
本发明提供了一种结核分枝杆菌Rv3921c重组蛋白,所述结核分枝杆菌Rv3921c重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
在本发明中,SEQ ID NO.2位于SEQ ID NO.1的第258~366位点。
在本发明中,SEQ ID NO.2是对SEQ ID NO.1进行优化后的结核分枝杆菌Rv3921c重组蛋白的氨基酸序列。
本发明还提供了所述的结核分枝杆菌Rv3921c重组蛋白在制备抗结核病的制剂中的应用。
本发明还提供了一种编码所述的结核分枝杆菌Rv3921c重组蛋白的核苷酸序列,编码SEQ ID NO.1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;
编码SEQ ID NO.2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在本发明中,SEQ ID NO.4位于SEQ ID NO.3的第772~1098位点。
本发明还提供了所述的核苷酸序列在制备抗结核病的制剂中的应用。
本发明还提供了一种重组质粒,所述重组质粒包括所述的核苷酸序列以及空载载体;
所述空载载体为pET-28a(+)载体。
本发明还提供了所述的重组质粒在制备抗结核病的制剂中的应用。
本发明还提供了一种重组菌,所述重组菌包括所述的重组质粒以及空载菌;
所述空载菌为大肠杆菌;
所述大肠杆菌优选为大肠杆菌BL21表达菌。
本发明还提供了所述的重组菌在制备抗结核病的制剂中的应用。
本发明还提供了一种结核病疫苗,所述结核病疫苗包括所述的结核分枝杆菌Rv3921c重组蛋白、所述的核苷酸序列、所述的重组质粒或所述的重组菌。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
本申请的供试生物材料中:大肠杆菌DH5α感受态细胞、大肠杆菌BL21表达菌购自天根生化科技(北京)有限公司,BALB/c小鼠购自海军军医大学动物中心,LEAF-CD3ε抗体购自Biolegend公司,结核菌纯蛋白衍生物(PPD)购自成都生物制品研究所,牛血清白蛋白(BSA)购自Gibco公司。
本申请的供试试剂中:pET-28a(+)载体购自广州佰汇生物科技有限公司,Ni-Sepharose柱购自GE公司,不完全弗氏佐剂购自Abcam公司,TMB显色液购自eBioscience公司,红细胞裂解液(ACK)购自深圳达科为生物技术有限公司,RPMI-1640培养基购自上海翊圣生物科技有限公司,BCA试剂盒购自上海碧云天生物技术股份有限公司。
本申请的供试溶液中:
细胞裂解液的配置:将1.4mmol NaCl、0.027mmol KCl、0.1mmol MgCl2、0.1mmolNa2HPO4和0.018mmol KH2PO4定容至10mL水中,使用时加入2g100×溶菌酶、250mg 100×DnaseⅠ、250mg 100×RnaseⅠ、10mmol 100×PMSF和100mmol 100×DTT,并加入Triton-X100至终浓度为0.5%;
上清平衡液的配置:将20mmolNa3PO4和0.5molNaCl定容至1L水中,调pH至7.4~8.1;
上清洗涤液的配置:将20mmol Na3PO4、0.5molNaCl和60mmol咪唑定容至1L水中,调pH至7.4~8.1;
上清洗脱液的配置:将20mmol Na3PO4、0.5mol NaCl和500mmol咪唑定容至1L水中,调pH至7.4~8.1;
包涵体平衡液的配置:将20mmol Na3PO4、8mol尿素和0.5mol NaCl定容至1L水中,调pH至7.4~8.1;
包涵体洗涤液的配置:将20mmol Na3PO4、8mol尿素、0.5mol NaCl和10mmol咪唑定容至1L水中,调pH至7.4~8.1;
包涵体洗脱液的配置:将20mmol Na3PO4、8mol尿素、0.5mol NaCl和500mmol咪唑定容至1L水中,调pH至7.4~8.1;
改良C7复性液的配置:将50mmol Tris-HCl、1mmol TCEP、250mmol NaCl和0.2molL-arginine定容至1L水中,调pH至7.5;
包被液的配置:将0.05mol Na2CO3-NaHCO3定容至1L水中,调pH至9.6;
封闭液的配置:将137mmol NaCl、2.7mmol KCl、10mmol Na2HPO4、2mmol KH2PO4定容至1L水中,加入Tween-20至终浓度为0.05%。
实施例1:结核血清候选重组蛋白筛选
通过比较血清学从由408个结核抗原组成的GTS-TB融合表达筛选文库(参见Pubmed PMID:26481294)中筛选获得结核血清抗原的特异性抗体水平,再结合文献检索和生物信息学预测等方式,最终获得了16种血清强阳性(OD450nm值>0.5)、尚未见免疫原性研究报道的结核血清候选重组蛋白,如表1所示。
表1筛选得到的结核血清候选重组蛋白
实施例2:pET-28a/TB gene重组质粒构建
(1)引物设计:以H37Rv结核分枝杆菌标准株基因组(由上海市肺科医院结核科提供,参见NCBI ID:1773)为模版,设计用于合成各结核血清候选重组蛋白基因的引物序列,并送往华大基因公司合成,各引物的核苷酸序列如表2所示。
表2用于合成结核血清候选重组蛋白基因的引物序列
(2)PCR扩增:PCR扩增体系以50μL计,包括2×GC Buffer 25μL、H37Rv结核分枝杆菌基因组模版1μL、步骤(1)所述的浓度独立为10μmol/L的正向引物(F)和反向引物(R)各0.5μL、dNTP 5μL、TakaraPCR酶0.2μL和余量的ddH2O。混匀后按照以下程序进行PCR扩增:94℃变性5min→(94℃变性30s→58℃复性30s→72℃延伸1min)×35cycles→72℃延伸5min→10℃保存,得到结核血清候选重组蛋白基因。
(3)重组质粒构建:将步骤(2)得到的各结核血清候选重组蛋白基因分别按照表2记载的限制性内切酶进行双酶切,得到酶切重组蛋白基因,并用对应的限制性内切酶消化pET-28a(+)载体,得到酶切载体,参考pET-28a(+)载体的操作说明将各酶切重组蛋白基因分别连接到酶切载体上,得到pET-28a/TB gene重组质粒,如图1所示。
(4)转化:参考大肠杆菌DH5α感受态细胞的操作说明,将步骤(3)得到的各pET-28a/TB gene重组质粒分别转化至DH5α感受态细胞,涂布LB培养基(100μg/mL Kan+)于37℃过夜培养后得到单克隆细胞。挑取单克隆细胞独立与1μL ddH2O混合得到菌液,用于进行菌液PCR阳性鉴定。
(5)菌液PCR阳性鉴定:菌液PCR阳性鉴定体系以15μL计,包括2×GC Buffer 7.5μL、步骤(4)所述的菌液1μL、步骤(1)所述的浓度独立为10μmol/L的正向引物(F)和反向引物(R)各0.5μL、dNTP 2.5μL、TakaraPCR酶0.1μL和余量的ddH2O。混匀后按照步骤(2)所述的PCR扩增程序进行菌液PCR阳性鉴定和DNA测序,得到pET-28a/TB gene重组阳性质粒,结果如图2所示。
结果表明,各pET-28a/TB gene重组阳性质粒构建成功。
实施例3:结核血清候选重组蛋白表达和检测
(1)重组阳性质粒转化:参考大肠杆菌BL21表达菌的操作说明,将实施例2得到的各pET-28a/TB gene重组阳性质粒分别转化至BL21表达菌,涂布LB培养基(100μg/mL Kan+)于37℃过夜培养后得到阳性单克隆细胞,再挑取各阳性单克隆细胞分别接种至5mL LB培养液(100μg/mLKan+)于37℃过夜培养至OD600=0.6,得到BL21种子液。
(2)结核血清候选重组蛋白表达:分别取步骤(1)所述的各BL21种子液1mL接种至100mL 2×YT培养液(100μg/mL Kan+)于37℃、转速为250rpm条件下培养4h至OD600=0.7,加入IPTG至终浓度为1mmol/L用于诱导结核血清候选重组蛋白表达,继续培养5h得到BL21表达液。分别将各BL21表达液在4℃下8000rpm离心10min,得到BL21菌体。
(3)结核血清候选重组蛋白检测:将步骤(2)得到的各BL21菌体在-80℃和室温反复冻融2次,分别加入10mL细胞裂解液进行超声破碎,设置超声破碎的功率为500W,超声破碎的方式为每次破碎10s,每两次破碎之间间隔10s,共持续10min,得到破碎BL21菌体。采用SDS-PAGE检测各破碎BL21菌体中结核血清候选重组蛋白的存在形式,结果如图3所示。
结果表明,结核血清候选重组蛋白中,Rv1815、Rv3354、Rv3849、Rv1411c、Rv1566c、Rv1825、Rv3807c、Rv1579为可溶性表达,Rv0436c、Rv0835、Rv0229c、Rv1146、Rv1977、Rv3206c、Rv3738c、Rv3921c为包涵体表达。
实施例4:结核血清候选重组蛋白纯化
(1)可溶性表达的结核血清候选重组蛋白纯化:用25mL上清平衡液预平衡Ni-Sepharose柱,收集柱后液样品;将实施例3得到的各可溶性表达的结核血清候选重组蛋白经0.45μm过滤器过滤除杂后上Ni-Sepharose柱,之后依次加入15mL上清平衡液、15mL上清洗涤液、15mL上清平衡液洗涤Ni-Sepharose柱,最后加入15mL上清洗脱液将各可溶性表达的结核血清候选重组蛋白从Ni-Sepharose柱洗脱,分别收集至离心管中,得到可溶性表达的结核血清候选重组蛋白纯化液;对各可溶性表达的结核血清候选重组蛋白纯化液进行SDS-PAGE电泳,具体步骤为:向各样品中加入4μL 5×SDS-PAGE蛋白加样缓冲液(含巯基乙醇),沸水浴5min以充分变性结核血清候选重组蛋白;待各样品冷却至室温后加注至SDS-PAGE胶样品孔,其中上层胶使用80V电压恒压电泳20min,下层胶使用120V电压恒压电泳至溴酚蓝跑出胶外;SDS-PAGE电泳结束后取出胶板,用考马斯亮蓝染色10min后多次脱色至背景清晰,结果如图4中的泳道1~8所示。
(2)包涵体表达的结核血清候选重组蛋白纯化:按照步骤(1)所述的方法对实施例3得到的各包涵体表达的结核血清候选重组蛋白进行纯化,得到包涵体表达的结核血清候选重组蛋白纯化液,所不同的是,在本步骤中,所用到的缓冲液分别为包涵体平衡液、包涵体洗涤液和包涵体洗脱液,结果如图4中的泳道9~16所示,并以Rv3921c重组蛋白为例验证结核血清候选重组蛋白纯化方法的可行性,结果如图5所示。
(3)结核血清候选重组蛋白表达量和纯度分析
取步骤(1)~(2)得到的各结核血清候选重组蛋白纯化液10mL分别装入截留分子量为7kDa的透析袋中,用200mLPBS缓冲液透析各可溶性表达的结核血清候选重组蛋白纯化液,用200mL改良C7复性液透析各包涵体表达的结核血清候选重组蛋白纯化液,透析温度为4℃,每隔6h换一次PBS缓冲液或改良C7复性液,重复透析3次,得到结核血清候选重组蛋白透析液;使用超滤浓缩管将各结核血清候选重组蛋白透析液浓缩至1mL,参考BCA试剂盒的操作说明测定各结核血清候选重组蛋白的浓度并计算表达量;按照步骤(1)所述的SDS-PAGE电泳方法对各结核血清候选重组蛋白透析液进行SDS-PAGE,使用Quality One软件进行灰度分析并测定各结核血清候选重组蛋白的纯度,结果如表3所示。
表3结核血清候选重组蛋白的表达量和纯度
实施例5:结核血清候选重组蛋白免疫小鼠的血清抗体分析
(1)小鼠的BCG初免-结核血清候选重组蛋白加强免疫:选取90只BALB/c小鼠,采用腹股沟皮下注射100μL浓度为0.5mg/mL的BCG,培养8周得到BCG初免小鼠;取实施例4得到的各结核血清候选重组蛋白20μg用PBS缓冲液定容至50μL,再加入50μL不完全弗氏佐剂,采用高速分散匀质机8000rpm乳化10min,得到结核血清候选重组蛋白液。将所述BCG初免小鼠随机分成18组,其中16组为实验组,通过颈背部皮下三点注射方式分别注射100μL所述的各结核血清候选重组蛋白液,同时以注射100μLAg85B蛋白液(含20μgAg85B蛋白)的BCG初免小鼠作为阳性对照组,以注射100μL BSA蛋白液(含20μg BSA蛋白)的BCG初免小鼠作为阴性对照组;将实验组、阳性对照组和阴性对照组小鼠培养2周后,按照所述的结核血清候选重组蛋白免疫方法进行结核血清候选重组蛋白加强免疫,再培养2周后采用颈椎脱臼法处死实验组、阳性对照组和阴性对照组小鼠。
(2)免疫小鼠的血清抗体分析:从BCG初免前一周开始,每周通过尾静脉取血法采集各小鼠血液样本,4℃下3800rpm离心20min得到血清样本;使用包被液分别将各结核血清候选重组蛋白、Ag85B蛋白和BSA蛋白稀释至终浓度为2μg/mL,然后各取100μL包被至96孔板,4℃孵育过夜后弃液体,用300μL PBST溶液洗板3次;每孔加入200μL封闭液,室温封闭2h后弃液体,用300μL PBST溶液洗板3次;将所述血清样本用含3%脱脂奶粉的PBST溶液稀释200倍后加至96孔板,每孔100μL,室温孵育2h后弃液体,用300μL PBST溶液洗板3次;将偶联辣根过氧化物酶(HRP)的抗鼠IgG、IgG1和IgG2a抗体用含3%脱脂奶粉的PBST溶液稀释5000倍后分别加至96孔板,每孔100μL,室温孵育1h后弃液体,用300μL PBST溶液洗板3次;参考TMB显色液的操作说明将TMB显色液加至96孔板,每孔100μL,避光反应10min后加入50μL2mol/LH2SO4终止反应;采用酶标仪以A630nm为参考波长读取OD450nm值,结果如图6所示。
结果表明,经各结核血清候选重组蛋白免疫的实验组小鼠血清中总IgG抗体水平均显著升高,其中,采用Rv0436c、Rv0835、Rv1815、Rv3354、Rv3849、Rv1825和Rv3921c重组蛋白免疫的实验组小鼠血清中,IgG2a水平显著高于IgG1水平,与阳性对照组小鼠表现的体液免疫特征相似,表明Rv0436c、Rv0835、Rv1815、Rv3354、Rv3849、Rv1825和Rv3921c重组蛋白在小鼠体内引发的免疫反应偏向Th1型;Rv0229c、Rv1566c、Rv3738c和Rv1579c重组蛋白免疫的实验组小鼠血清中,IgG2a水平显著低于IgG1水平,表明Rv0229c、Rv1566c、Rv3738c和Rv1579c重组蛋白在小鼠体内引发的免疫反应偏向于Th2型;而Rv1411c、Rv1146、Rv1977、Rv3206c和Rv3807c重组蛋白免疫的实验组小鼠血清中,IgG1和IgG2a水平均无显著升高。
实施例6:结核血清候选重组蛋白免疫小鼠的脾细胞因子水平分析
(1)小鼠脾脏处理:将实施例5所述的实验组、阳性对照组和阴性对照组小鼠采用颈椎脱臼法处死后,分别置于75%乙醇中浸泡3min,取出小鼠脾脏,在5mL RPMI-1640培养基中碾磨至无明显组织块残留,得到小鼠脾脏细胞碾磨液;将小鼠脾脏细胞碾磨液室温下1500rpm离心5min后弃上清,加入2mLACK混匀并静置5min,加入8mL RPMI-1640培养基重悬,室温下1500rpm离心5min后弃上清,再加入10mL RPMI-1640培养基重悬,室温下1500rpm离心5min后弃上清,再次加入10mL RPMI-1640培养基重悬,得到小鼠脾脏细胞悬液;取各小鼠脾脏细胞悬液10μL加至细胞计数板内计数,并将剩余各小鼠脾脏细胞悬液室温下1500rpm离心5min后弃上清,然后用完全RPMI-1640培养基稀释至终浓度为1×107个/mL,得到小鼠脾脏细胞稀释液。
(2)小鼠脾脏细胞的重组蛋白刺激:将步骤(1)所述的各小鼠脾脏细胞稀释液分别加至96孔板中,每组设置A和B两个重复孔,每孔500μL;在实验组的各小鼠脾脏细胞稀释液的A孔加入100μL PPD和400μL完全RPMI-1640培养基的混合液,在B孔加入20μg对应的实施例4得到的各结核血清候选重组蛋白和500μL完全RPMI-1640培养基的混合液;在阳性对照组的小鼠脾脏细胞稀释液的A孔和B孔都独立加入1μL LEAF-CD3ε抗体和500μL完全RPMI-1640培养基的混合液;在阴性对照组的小鼠脾脏细胞稀释液的A孔和B孔都独立加入20μgGST蛋白和500μL完全RPMI-1640培养基的混合液;然后在37℃、CO2浓度为5%的条件下培养48h,室温下1500rpm离心5min得到小鼠脾脏细胞上清液。
(3)小鼠的脾细胞因子水平分析:根据各小鼠脾脏细胞上清液设置a、b和c三个重复孔;用包被液按照1:500的比例稀释小鼠一抗至终浓度为1μg/mL并加至96孔板,每孔50μL,4℃孵育过夜后用300μLPBST溶液洗板3次;每孔加入200μL封闭液,室温封闭1h后用300μLPBST溶液洗板3次;在a孔加入用PBS缓冲液按照1:20的比例稀释的步骤(2)所述的对应各小鼠脾脏细胞上清液50μL以检测IFN-γ水平,在b孔加入用PBS缓冲液按照1:6的比例稀释的步骤(2)所述的对应各小鼠脾脏细胞上清液50μL以检测IL-4水平,在c孔加入用PBS缓冲液按照1:1的比例稀释的步骤(2)所述的对应各小鼠脾脏细胞上清液50μL以检测IL-10水平,37℃孵育1h后用300μLPBST溶液洗板5次;用PBST溶液按照1:500的比例稀释生物素标记小鼠二抗并加至96孔板,每孔50μL,室温孵育2h后用300μLPBST溶液洗板5次;用PBST溶液按照1:1000比例稀释亲和素标记HRP并加至96孔板,每孔50μL,室温孵育30min后用300μLPBST溶液洗板7次;参考TMB显色液的操作说明将TMB显色液加至96孔板,每孔50μL,避光反应10min后加入25μL 2mol/L H2SO4终止反应;采用酶标仪以A630nm为参考波长读取OD450nm值,并根据标准曲线公式y=2.3855x-0.4132(R2=0.991,x为OD450nm值,y为IFN-γ浓度)计算各小鼠脾脏细胞上清液中IFN-γ浓度。结果如表4和图7所示。
表4各小鼠脾脏细胞上清液中的IFN-γ浓度
结果表明,阳性对照组小鼠脾脏细胞上清液的IFN-γ水平较阴性对照组显著升高(P<0.01),实验组小鼠中Rv3921c重组蛋白免疫的脾脏细胞上清液的IFN-γ水平较阴性对照组显著升高(P<0.01),其他15种重组蛋白免疫的脾脏细胞上清液的IFN-γ浓度在500~800pg/mL之间,显著低于阳性对照组小鼠脾脏细胞上清液的IFN-γ水平,并且与阴性对照组小鼠脾脏细胞上清液之间无统计学差异。结果说明,Rv3921c重组蛋白能够强化BCG的免疫保护力。
由以上实施例可知,本发明提供了结核分枝杆菌Rv3921c重组蛋白在制备结核病疫苗中的应用。采用本发明的Rv3921c重组蛋白对小鼠进行免疫,小鼠血清中总IgG抗体水平显著提高,并且IgG2a水平明显高于IgG1水平,表明其在小鼠体内引发的免疫反应偏向Th1型;小鼠脾脏细胞上清液中IFN-γ水平显著提高,表明Rv3921c重组蛋白加强免疫对强化BCG的免疫保护力具有一定效果,可用于制备结核病疫苗。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种结核分枝杆菌Rv3921c重组蛋白,其特征在于,所述结核分枝杆菌Rv3921c重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
2.权利要求1所述的结核分枝杆菌Rv3921c重组蛋白在制备抗结核病的制剂中的应用。
3.一种编码权利要求1所述的结核分枝杆菌Rv3921c重组蛋白的核苷酸序列,其特征在于,编码SEQ ID NO.1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;
编码SEQ ID NO.2的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.权利要求3所述的核苷酸序列在制备抗结核病的制剂中的应用。
5.一种重组质粒,其特征在于,所述重组质粒包括权利要求3所述的核苷酸序列以及空载载体;
所述空载载体为pET-28a(+)载体。
6.权利要求5所述的重组质粒在制备抗结核病的制剂中的应用。
7.一种重组菌,其特征在于,所述重组菌包括权利要求5所述的重组质粒以及空载菌;
所述空载菌为大肠杆菌。
8.权利要求7所述的重组菌在制备抗结核病的制剂中的应用。
9.一种结核病疫苗,其特征在于,所述结核病疫苗包括权利要求1所述的结核分枝杆菌Rv3921c重组蛋白、权利要求3所述的核苷酸序列、权利要求5所述的重组质粒或权利要求7所述的重组菌。
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