CN111440823A - 一种重组载体及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种重组载体及其构建方法和应用，属于昆虫基因工程技术领域，所述重组载体，包括双荧光素酶报告基因载体和褐飞虱Ccdc124基因的3’UTR区核苷酸序列；所述重组载体的构建方法，包括以下步骤：1)以褐飞虱的cDNA为模板，进行PCR扩增获得褐飞虱Ccdc124基因的3’UTR区核苷酸序列；2)将所述褐飞虱Ccdc124基因的3’UTR区核苷酸序列重组至双荧光素酶报告基因载体中获得重组载体。本发明提供的重组载体可以测定褐飞虱Ccdc124基因的表达活性，用于筛选调控褐飞虱Ccdc124基因的microRNA，还能够对预测的microRNA调控Ccdc124基因的调控机制进行研究。

Description

一种重组载体及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于昆虫基因工程技术领域，尤其涉及一种重组载体及其构建方法和应用。
背景技术
褐飞虱又称褐稻虱(Nilaparvata lugens
Figure BDA0002463454080000011
)，属同翅目(Homoptera)飞虱科(Delphacidae)。主要分布于东亚、东南亚、南亚次大陆、澳大利亚北部及南太平洋群岛。水稻是褐飞虱的主要寄主，一些野生稻和大田中的稗草也有可能成为寄主植物，一般来说，在自然条件下，褐飞虱不能在其它植物上重复完成世代。褐飞虱喜欢隐蔽、潮湿的环境，成虫、若虫一般群集在稻丛下部活动。褐飞虱大发生时，每一稻兜基部常聚集有数千头虫，严重时引起稻株下部变黑，瘫痪倒伏，稻田成片枯萎，引起飞虱火烧。
MicroRNA(即miRNA)是由18～25个核苷酸组成的一类内源性、短序列非编码单链RNA，它由DNA转录产生，不翻译蛋白质，通过和mRNA 3'UTR区结合来调控目标基因的表达。miRNA主要是通过5’端被称为种子序列的7nt序列与位于靶mRNA 3’UTR的miRNA调控元件相互作用以识别靶mRNA。作为一种转录后调控小分子RNA，在动物中主要通过与靶mRNA的3’UTR区特异性互补配对，抑制靶mRNA翻译或引起靶mRNA的降解，从而参与调控细胞分化、组织发育、肿瘤发生发展等多种生命过程。成熟的miRNA可同时封闭多个靶基因的翻译，干预调节miRNA可改变多个靶基因的表达水平，且干预调节效率很高。miRNA作为转录后基因调控的一种方式，在生物体内形成一个调控网络，由于miRNA调控涉及的方面广，调控作用明显，本身序列短，便于操作和研究，越来越受到人们对其生物学功能研究的重视。
在褐飞虱中，nlu-miR-8-5P和nlu-miR-2a-3P分别靶向甲壳素生物合成途径成分，膜结合海藻糖酶(tre2)和磷酸乙酰氨基葡萄糖突变酶(PAGM)(Chen J,Liang Z,Liang Y,Pang R,Zhang W.Conserved microRNAs miR-8-5p and miR-2a-3p modulate chitinbiosynthesis in response to 20-hydroxyecdysone signaling in the brownplanthopper,Nilaparvata lugens.Insect Biochem Mol Biol.2013；43(9):839–848.)。nlu-miR-5P和nlu-miR-2a-3P的过表达会导致个体存活率降低，并会导致甲壳素含量减少。此外，通过广谱复合物(BR-C)显示nlu-miR-8-5P和nlu-miR-2a-3P水平被20E负调节。在通常被称为甜菜军虫的斑点翅目昆虫中，sex-miR-4924可能通过调控几丁质酶1表达来调控幼虫的发育和蜕皮(Zhang YL,Huang QX,Yin GH,Lee S,Jia RZ,Liu ZX,Yu NT,PennermanKK,Chen X,Guo AP.Identification of microRNAs by small RNA deep sequencing forsynthetic microRNA mimics to control Spodoptera exigua.Gene.2015；557(2):215–221.)。飞蝗中的Dcr-1使miRNA含量减少，并破坏了蜕皮-若虫-若虫和若虫-成虫这两种蜕皮类型(Wang YL,Yang ML,Jiang F,Zhang JZ,Kang L.MicroRNA-dependent developmentrevealed by RNA interference-mediated gene silencing of LmDicer1 in themigratory locust.Insect Sci.2013；20(1):53–60.)。
目前，尚没有一种能够有效研究褐飞虱Ccdc124基因的调控机制及其miRNA的方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种包括褐飞虱Ccdc124基因双荧光素酶报告基因的重组载体及其构建方法和应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种重组载体，包括双荧光素酶报告基因载体和褐飞虱Ccdc124基因的3’UTR区核苷酸序列。
优选的，所述褐飞虱Ccdc124基因的3’UTR区核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
优选的，所述褐飞虱Ccdc124基因的3’UTR区核苷酸序列位于所述双荧光素酶报告基因载体的XhoI和NotI酶切位点之间。
本发明提供了所述的重组载体的构建方法，包括以下步骤：
1)以褐飞虱的cDNA为模板，进行PCR扩增获得褐飞虱Ccdc124基因的3’UTR区核苷酸序列；
2)将所述褐飞虱Ccdc124基因的3’UTR区核苷酸序列重组至双荧光素酶报告基因载体中获得重组载体。
优选的，步骤1)中所述PCR扩增的引物包括Ccdc124-3'UTR-F和Ccdc124-3'UTR-R；所述Ccdc124-3'UTR-F和Ccdc124-3'UTR-R的核苷酸序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。
优选的，步骤1)中所述PCR扩增的扩增体系以50μL计，包括以下组分：5×PhusionGreen HF Buffer 10μL、10mM dNTPs 1μL，引物Ccdc124-3'UTR-F 2.5μL，引物Ccdc124-3'UTR-R 2.5μL，cDNA模板1μL，Phusion DNAPolymerase 1μL和ddH2O 32μL。
优选的，步骤1)中所述PCR扩增的反应程序包括：98℃预变性30s；98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
优选的，步骤2)中所述重组包括分别进行的褐飞虱Ccdc124基因的3’UTR区核苷酸序列、双荧光素酶报告基因载体的双酶切和连接；所述连接的体系以10μL计，包括：双酶切后的双荧光素酶报告基因载体2μL，双酶切后的Ccdc124基因3'UTR扩增片段6μL，T4连接酶1μL，10×T4 DNA连接酶缓冲液1μL；所述连接的温度为3～5℃，所述连接的时间为8～15h。
本发明还提供了所述的重组载体在检测褐飞虱Ccdc124基因表达活性中的应用。
本发明还提供了所述的重组载体在筛选调控褐飞虱Ccdc124基因表达的microRNA、检测microRNA调控褐飞虱Ccdc124基因的调控机制中的应用。
本发明的有益效果：本发明提供的重组载体包括双荧光素酶报告基因载体和褐飞虱Ccdc124基因的3’UTR区核苷酸序列，所述重组载体可以稳定表达褐飞虱Ccdc124基因，同时双荧光素酶报告基因可以作为检测指标反映褐飞虱Ccdc124基因的表达量，可以作为一个生物模块应用于相关技术领域。本发明提供的重组载体的构建方法操作简便，快速易得，可以通过筛选基因准确的得到带有目的基因的重组载体，制备得到的重组载体可以稳定表达目的基因。本发明提供的褐飞虱Ccdc124基因双荧光素酶报告基因载体不仅可以通过荧光素酶活性的测定得到褐飞虱Ccdc124基因的表达活性，也可以用于筛选调控褐飞虱Ccdc124基因的microRNA，同时可以对预测的microRNA在细胞水平和动物水平上调控Ccdc124基因的调控机制进行研究，方法操作简便，条件简单，耗时短，特异性高，结果准确，为深入挖掘调控Ccdc124基因表达的microRNA提供实验基础。
附图说明
图1为实施例1中Ccdc124-3'UTR区片段PCR电泳结果图；其中M表示DNAMarker2000，1为目标片段Ccdc124基因的3'UTR区核苷酸序列；
图2为实施例1中psi-CHECK2载体的结构示意图；
图3为实施例1中褐飞虱Ccdc124基因双荧光素酶报告载体菌落PCR电泳结果图；其中M表示DNAMarker2000，1～5表示单菌落的菌落PCR鉴定结果；
图4为实施例1中褐飞虱Ccdc124-3'UTR连入载体psi-CHECK2后psi-CHECK2-Ccdc124-3'UTR载体的酶切图；
图5为实施例2中miRNA-8mimics对psi-CHECK2-Ccdc124-3'UTR细胞荧光素酶表达的影响的结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种重组载体，包括双荧光素酶报告基因载体和褐飞虱Ccdc124基因的3’UTR区核苷酸序列。
在本发明中，所述褐飞虱Ccdc124基因的3’UTR区核苷酸序列优选的如SEQ IDNo.1所示，具体如下：
caaatcaccc gagaacccta ccaatcaaag gaattagaaa atactttttg taataattgc
acgaatatat ttcaacttgt gtaaattttt caggacttga aagccagaat attagtgtaa
agcacacttg aaacaggggc attatagaca tccgcacgaatatagtccga cgttcaacgt
taccaaataa gagttggtca gcattgtcaatagc
在本发明中，所述褐飞虱Ccdc124基因的3’UTR区核苷酸序列优选的位于所述双荧光素酶报告基因载体的XhoI和NotI酶切位点之间，替换所述双荧光素酶报告基因载体的XhoI和NotI酶切位点之间的原有序列。
本发明对所述双荧光素酶报告基因载体的来源没有特殊限定，采用本领域市售产品即可；本发明中，所述褐飞虱Ccdc124基因的3’UTR区核苷酸序列优选的通过PCR扩增获得。
本发明提供了所述的重组载体的构建方法，包括以下步骤：1)以褐飞虱的cDNA为模板，进行PCR扩增获得褐飞虱Ccdc124基因的3’UTR区核苷酸序列；2)将所述褐飞虱Ccdc124基因的3’UTR区核苷酸序列重组至双荧光素酶报告基因载体中获得重组载体。
在本发明中，以褐飞虱的cDNA为模板，进行PCR扩增。在本发明中，所述褐飞虱的cDNA优选的通过褐飞虱的总RNA反转录获得。本发明对所述褐飞虱的总RNA的提取方法和反转录方法没有特殊限定，采用本领域常规的市售试剂盒完成。在本发明中，所述PCR扩增的引物包括Ccdc124-3'UTR-F和Ccdc124-3'UTR-R；所述Ccdc124-3'UTR-F和Ccdc124-3'UTR-R的核苷酸序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示，具体如下：
Ccdc124-3'UTR-F：5’-ccggctcgagcaaatcacccgagaacccta-3’(SEQ IDNo.2)；
Ccdc124-3'UTR-R：5’-taagcggccgcgctattgacaatgctgaccaa-3’(SEQ IDNo.3)；
在本发明中，所述Ccdc124-3'UTR-F和Ccdc124-3'UTR-R是根据GenBank中的褐飞虱Ccdc124基因序列(ID：XM_022350855.1)中的3'UTR区采用PrimerPremier5.0软件设计后，人工调整获得的；在本发明中，所述Ccdc124-3'UTR-F中加粗部分含有XhoI限制性内切酶的酶切位点；所述Ccdc124-3'UTR-R中加粗部分含有NotI限制性内切酶的酶切位点。
在本发明中，所述PCR扩增的扩增体系以50μL计，包括以下组分：5×PhusionGreen HF Buffer 10μL、10mM dNTPs 1μL，引物Ccdc124-3'UTR-F2.5μL，引物Ccdc124-3'UTR-R 2.5μL，cDNA模板1μL，Phusion DNA Polymerase 1μL和ddH2O 32μL。所述PCR扩增的反应程序优选的包括以下步骤：98℃预变性30s；98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
本发明在所述PCR扩增后获得PCR扩增产物，优选的还包括对所述PCR扩增产物进行回收和测序验证的过程；在本发明中，所述回收优选的采用琼脂糖凝胶电泳获得目的条带后，进行切胶回收。在本发明中，所述测序验证优选的委托生物公司进行。本发明在所述测序验证后还包括纯化的步骤，本发明对所述纯化的具体步骤没有特殊限定，采用本领域常规的DNA纯化方法即可。
本发明在获得所述褐飞虱Ccdc124基因的3’UTR区核苷酸序列后，将所述褐飞虱Ccdc124基因的3’UTR区核苷酸序列重组至双荧光素酶报告基因载体中获得重组载体。在本发明中，所述重组优选的包括分别进行的褐飞虱Ccdc124基因的3’UTR区核苷酸序列、双荧光素酶报告基因载体的双酶切和连接；在本发明中，所述双酶切用酶包括XhoI内切酶和NotI内切酶。
在本发明中，所述褐飞虱Ccdc124基因的3’UTR区核苷酸序列的双酶切体系以40μL计，优选的包括0.2μg/μL褐飞虱Ccdc124基因的3’UTR区核苷酸序列20μL，10×H缓冲液4μL，0.1％BSA4μL，Xho I限制性内切酶2μL，Not I限制性内切酶2μL和ddH2O 8μL。在本发明中，所述双酶切的温度优选为36～38℃，更优选为37℃；所述双酶切的时间优选为3～5h，更优选为4h。本发明在所述双酶切后优选的进行回收纯化。
在本发明中，所述双荧光素酶报告基因载体双酶切的体系以40μL计，优选的包括0.4μg/μL双荧光素酶报告基因载体10μL，10×H缓冲液4μL，0.1％BSA4μL，XhoI限制性内切酶2μL，NotI限制性内切酶2μL和ddH2O 18μL。在本发明中，所述双酶切的温度优选为36～38℃，更优选为37℃；所述双酶切的时间优选为3～5h，更优选为4h。本发明在所述双酶切后优选的进行回收纯化。
本发明在分别进行的褐飞虱Ccdc124基因的3’UTR区核苷酸序列、双荧光素酶报告基因载体的双酶切后，进行连接。在本发明中，所述连接的体系以10μL计，优选的包括：双酶切后的双荧光素酶报告基因载体2μL，双酶切后的褐飞虱Ccdc124基因3'UTR扩增片段6μL，T4连接酶1μL，10×T4DNA连接酶缓冲液1μL；所述连接的温度优选为3～5℃，更优选为4℃；所述连接的时间优选为8～15h，更优选为10～14h。
本发明在所述连接后，获得重组载体；在本发明中，优选的将所述重组载体导入大肠杆菌中进行筛选和验证。在本发明中，所述大肠杆菌优选为大肠杆菌DH5α；本发明对所述转化的具体步骤没有特殊限定，采用本领域常规的转化步骤即可。在本发明中，所述筛选优选的采用蓝白斑筛选；本发明将转化后大肠杆菌在含有氨苄的LB固体培养基中进行培养，挑选白色菌落进行菌落PCR验证和测序验证。本发明对所述菌落PCR验证和测序验证的具体步骤没有特殊限定，采用本领域常规的菌落PCR验证和测序验证的步骤即可。
本发明还提供了所述的重组载体在检测褐飞虱Ccdc124基因表达活性中的应用。褐飞虱Ccdc124基因双荧光素酶报告基因载体可以稳定表达褐飞虱Ccdc124基因，同时双荧光素酶报告基因可以作为检测指标反映褐飞虱Ccdc124基因的表达量。
本发明还提供了所述的重组载体在筛选调控褐飞虱Ccdc124基因表达的microRNA、检测microRNA调控褐飞虱Ccdc124基因的调控机制中的应用。microRNA对有调控作用的基因的调控机制可以分为正调控和负调控，正调控是提高microRNA作用基因的表达量，负调控是抑制microRNA作用基因的表达量。在本发明中，所述microRNA优选的包括miRNA-8。本发明具体实施过程中，分别检测载体psi-CHECK2-Ccdc124-3'UTR(No minic)，载体psi-CHECK2-Ccdc124-3'UTR+NC(Minic-CT)和载体psi-CHECK2-Ccdc124-3'UTR+Minic8(Minic-8)转染果蝇细胞后的相对荧光活性，即可获得microRNA与褐飞虱Ccdc124基因双荧光素酶报告基因载体的相互作用结果，检测褐飞虱Ccdc124基因的表达量变化，就可以得知预测microRNA调控褐飞虱Ccdc124基因的调控机制。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
褐飞虱Ccdc124基因3'UTR区片段的制备：
褐飞虱组织总RNA提取与检测
使用Trizol试剂(购自Invitrogen公司)提取褐飞虱(武汉大学提供)全虫的总RNA，具体提取步骤参照Trizol试剂自带说明书。溶解后的RNA在含有溴化乙锭(EB)的1.5％琼脂糖胶上电泳检测，同时在RNA浓度测定仪上测定浓度，浓度为1μg/μL，存放于-20℃备用。
褐飞虱Ccdc124基因3'UTR区片段的引物设计
根据GenBank中的褐飞虱Ccdc124基因序列(ID：XM_022350855.1)中的3'UTR区采用PrimerPremier5.0软件设计PCR引物，Ccdc124基因扩增引物序列如下：
Ccdc124-3'UTR-F:5’-ccggctcgagcaaatcacccgagaacccta-3’(SEQ ID No.2)；
Ccdc124-3'UTR-R:5’-taagcggccgcgctattgacaatgctgaccaa-3’(SEQ ID No.3)；
上述引物由广州市锐博生物科技有限公司合成。引物扩增的目标片段DNA大小为214bp。
反转录成cDNA模板
在冰上配置如下混合物：总RNA(1μg/μL)5μL，oligo(dT)18primer 1μL，ddH2O 14μL。轻柔混匀后，65℃放置5min，冰上急冷。随后依次加入如下试剂：5X ReactionBuffer4μL，RiboLockTM Rnase Inhibitor(20u/μL)1μL，10mM dNTPMix 2μL，RevertAidTM M-MuLVReverse Transcriptase(200u/μL)1μL。轻柔混匀，离心5s将试剂集中在管底，42℃放置60min。70℃5min终止反应，-20℃保存。
褐飞虱Ccdc124基因3'UTR区片段的扩增
核苷酸序列Ccdc124基因3'UTR区片段如SEQ ID No.1所示。PCR扩增体系如下：5×Phusion Green HF Buffer 10μL、10mM dNTPs 1μL，10mM引物Ccdc124-3'UTR-F 2.5μL，10mM引物Ccdc124-3'UTR-R 2.5μL，20ng/μL cDNA模板1μL，PhusionDNAPolymerase 1μL和ddH2O 32μL。
PCR扩增的反应程序包括：98℃预变性30s；98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
PCR反应产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，PCR结果见图1所示。从琼脂糖回收目的DNA，送北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序。图中M表示DNAMarker 2000，图中1表示目标片段Ccdc124基因的3'UTR区。从图中可以得出实验成功PCR扩增得到带有XhoI和NotI限制性内切酶酶切位点的褐飞虱Ccdc124基因的3'UTR区片段。
接着，对验证正确的PCR产物进行纯化，用两种内切酶XhoI和NotI对上述PCR产物进行双酶切，酶切反应体系如下，体系总体积为40μl。0.2μg/μL褐飞虱Ccdc124基因的3’UTR区核苷酸序列20μL，10×H缓冲液4μL，0.1％BSA4μL，Xho I限制性内切酶2μL，Not I限制性内切酶2μL和ddH2O8μL。反应程序为：在37℃酶切4h，随后进行回收纯化。
双荧光素酶报告基因载体psi-CHECK2双酶切处理
psi-CHECK2载体的结构示意图如图2所示，载体含有限制性内切酶XhoI和NotI酶切位点。用两种内切酶XhoI和NotI对上述PCR产物进行双酶切，酶切反应体系如下：0.4μg/μL双荧光素酶报告基因载体10μL，10×H缓冲液4μL，BSA4μL，XhoI限制性内切酶2μL，NotI限制性内切酶2μL和ddH2O 18μL。反应程序为：在37℃酶切4h，随后进行回收纯化。
连接
将上述双酶切处理制备得到的双酶切后的褐飞虱Ccdc124基因的3'UTR区片段和双酶切后的载体进行连接反应，连接反应体系如下，体系总体积为10μl：双酶切后的psi-CHECK2载体2μL，双酶切后的Ccdc124基因3'UTR扩增片段6μL，T4连接酶1μL，10×T4 DNA连接酶缓冲液1μL，共10μl。混合体系于4℃连接过夜。
转化
将上述连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，具体步骤如下：
向50μL感受态细胞中加入5μL的连接产物，轻轻混匀，冰上放置30min；42℃热激30s，立即冰上放置2min；加入400μL无氨苄的LB液体培养基，放入37℃恒温摇床中复苏60min；以4000rpm离心4min，去除300μL上清，将剩余的上清吹散细菌沉淀，并将他们均匀涂抹在含有100μg/ml氨苄的LB固体培养基平板中；37℃正置培养60min(待菌液完全吸收)后，倒置培养15h，观察有无白色菌落长出。
筛选阳性克隆并测序验证
用灭菌枪头从平板中挑取白色单克隆接入500μL含氨苄的LB液体培养基中，于37℃恒温摇床扩大培养6h。以菌液为模板，用引物Ccdc124-3'UTR-F和Ccdc124-3'UTR-R，以及上述提及的PCR扩增体系和程序检测，对阳性克隆菌落进行菌落PCR鉴定，结果如图3所示，图中M表示DNAMarker2000，图3中1～5表示单菌落的菌落PCR鉴定结果，将阳性克隆菌液送北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序。该载体用内切酶XhoI和NotI酶切后如图4所示，得到psi-CHECK2载体和Ccdc124-3'UTR片段。菌落PCR、测序结果和酶切结果都表明实验成功构建重组载体，将该载体命名为psi-CHECK2-Ccdc124-3'UTR。
实施例2 psi-CHECK2-Ccdc124-3'UTR荧光素酶报告载体的应用
人工合成候选miRNAs
人工合成miR-8：5’-ucuguuucagcagugcgagcgg-3’(SEQ ID No.4)和NC阴性对照：5’-ugacaaagucgucugcgagcgg-3’(SEQ ID No.5)。以上miRNAs及NC对照均由上海吉玛制药技术有限公司合成。
果蝇细胞的复苏和传代
持含有1mL果蝇细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中(水面要低于冻存管盖部)摇晃解冻，移入事先准备好的含有4mL培养基的15mL璃心管中混合均匀。在1000rpm条件下离心4min，弃去上清液，加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5mL暗养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。如果细胞密度达80％-90％，即可进行传代培养。
细胞转染
制备对数生长期果蝇细胞悬液，接种于24孔培养板(细胞数约为105/孔)，在37℃、5％CO2培养箱培养至细胞汇合度为60％。将载体psi-CHECK2-Ccdc124-3'UTR(No minic)，载体psi-CHECK2-Ccdc124-3'UTR+NC(Minic-CT)和载体psi-CHECK2-Ccdc124-3'UTR+Minic8(Minic-8)分别进行转染。各转染组的转染量分别为：载体0.1μg、miRNA质粒0.4μg。
Luciferase测定
将细胞用细胞裂解液裂解后，取5μL细胞裂解液与萤火虫荧光素酶缓冲液及底物5μL，(按promega双荧光报告系统测量试剂盒说明)混匀测量荧光强度，然后加入海肾荧光素酶反应缓冲液及腔肠素底物5μL，混匀再次测得海肾荧光素酶活性，psiCHECK-2Vector(初始载体)以萤火虫荧光素酶为内参。将每个样品按照萤火虫荧光素酶活性进行均一化处理，比较海肾荧光素酶活性并绘制图表。以No minic对照为参照，相对荧光活性检测结果如图5所示。结果可以看出，相对于No minic对照而言，miR-8活性下降37％。说明构建的psi-CHECK2-Ccdc124-3'UTR载体和miR-8有明显的互作反应，miR-8对Ccdc124基因负调控。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 湖北省农业科学院粮食作物研究所
<120> 一种重组载体及其构建方法和应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 214
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
caaatcaccc gagaacccta ccaatcaaag gaattagaaa atactttttg taataattgc 60
acgaatatat ttcaacttgt gtaaattttt caggacttga aagccagaat attagtgtaa 120
agcacacttg aaacaggggc attatagaca tccgcacgaa tatagtccga cgttcaacgt 180
taccaaataa gagttggtca gcattgtcaa tagc 214
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
ccggctcgag caaatcaccc gagaacccta 30
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
taagcggccg cgctattgac aatgctgacc aa 32
<210> 4
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
ucuguuucag cagugcgagc gg 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
ugacaaaguc gucugcgagc gg 22

Claims (10)

1.一种重组载体，其特征在于，包括双荧光素酶报告基因载体和褐飞虱Ccdc124基因的3’UTR区核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述褐飞虱Ccdc124基因的3’UTR区核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
3.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述褐飞虱Ccdc124基因的3’UTR区核苷酸序列位于所述双荧光素酶报告基因载体的XhoI和NotI酶切位点之间。
4.权利要求1～3任意一项所述的重组载体的构建方法，包括以下步骤：
1)以褐飞虱全虫的cDNA为模板，进行PCR扩增获得褐飞虱Ccdc124基因的3’UTR区核苷酸序列；
2)将所述褐飞虱Ccdc124基因的3’UTR区核苷酸序列重组至双荧光素酶报告基因载体中获得重组载体。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤1)中所述PCR扩增的引物包括Ccdc124-3'UTR-F和Ccdc124-3'UTR-R；所述Ccdc124-3'UTR-F和Ccdc124-3'UTR-R的核苷酸序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。
6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤1)中所述PCR扩增的扩增体系以50μL计，包括以下组分：5×Phusion Green HF Buffer 10μL、10mM dNTPs 1μL，10mM引物Ccdc124-3'UTR-F 2.5μL，10mM引物Ccdc124-3'UTR-R 2.5μL，20ng/μL cDNA模板1μL，Phusion DNAPolymerase1μL和ddH2O 32μL。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，步骤1)中所述PCR扩增的反应程序包括：98℃预变性30s；98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
8.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤2)中所述重组包括分别进行的褐飞虱Ccdc124基因的3’UTR区核苷酸序列、双荧光素酶报告基因载体的双酶切以及连接；所述连接的体系以10μL计，包括：双酶切后的双荧光素酶报告基因载体2μL，双酶切后的Ccdc124基因3'UTR扩增片段6μL，T4连接酶1μL，10×T4 DNA连接酶缓冲液1μL；所述连接的温度为3～5℃，所述连接的时间为8～15h。
9.权利要求1～3任意一项所述的重组载体在检测褐飞虱Ccdc124基因表达活性中的应用。
10.权利要求1～3任意一项所述的重组载体在筛选调控褐飞虱Ccdc124基因表达的microRNA、检测microRNA调控褐飞虱Ccdc124基因的调控机制中的应用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113736791A (zh) * 2021-09-30 2021-12-03 扬州大学 提高目的片段与psiCHECK2载体连接效率的方法
CN114480496A (zh) * 2022-02-23 2022-05-13 新乡医学院 一种昆虫细胞用双荧光素酶报告基因载体、构建方法、重组载体及应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2431463A1 (en) * 2009-05-13 2012-03-21 Shionogi&Co., Ltd. Test agent for visceral obesity and use thereof
CN103468730A (zh) * 2013-08-29 2013-12-25 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 一种基于猪cd163基因的双荧光素酶报告基因载体
WO2018045177A1 (en) * 2016-09-01 2018-03-08 Chimera Bioengineering, Inc. Gold optimized car t-cells
CN110373427A (zh) * 2019-07-08 2019-10-25 云南大学 一种人源tlr4基因3′非翻译区的双荧光素酶报告基因载体及其构建方法与应用
CN110643633A (zh) * 2019-10-11 2020-01-03 山西农业大学 猪c1qtnf3基因的双荧光素酶报告基因载体及其制备方法与应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2431463A1 (en) * 2009-05-13 2012-03-21 Shionogi&Co., Ltd. Test agent for visceral obesity and use thereof
CN103468730A (zh) * 2013-08-29 2013-12-25 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 一种基于猪cd163基因的双荧光素酶报告基因载体
WO2018045177A1 (en) * 2016-09-01 2018-03-08 Chimera Bioengineering, Inc. Gold optimized car t-cells
CN110373427A (zh) * 2019-07-08 2019-10-25 云南大学 一种人源tlr4基因3′非翻译区的双荧光素酶报告基因载体及其构建方法与应用
CN110643633A (zh) * 2019-10-11 2020-01-03 山西农业大学 猪c1qtnf3基因的双荧光素酶报告基因载体及其制备方法与应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MANOJ KUMAR GUPTA等: ""Insights into the structure–function relationship of brown plant hopper resistance protein,Bph14 of rice plant: a computational structural biology approach"", 《JOURNAL OF BIOMOLECULAR STRUCTURE AND DYNAMICS》 *
NCBI: ""PREDICTED: Nilaparvata lugens coiled-coil domain-containing protein 124-like (LOC111063171), mRNA"", 《GENBANK DATABASE》 *
陶永光: "《肿瘤分子生物学与细胞生物学实验手册》", 30 November 2014, 湖南科学技术出版社 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113736791A (zh) * 2021-09-30 2021-12-03 扬州大学 提高目的片段与psiCHECK2载体连接效率的方法
CN113736791B (zh) * 2021-09-30 2024-01-26 扬州大学 提高目的片段与psiCHECK2载体连接效率的方法
CN114480496A (zh) * 2022-02-23 2022-05-13 新乡医学院 一种昆虫细胞用双荧光素酶报告基因载体、构建方法、重组载体及应用
CN114480496B (zh) * 2022-02-23 2024-05-07 新乡医学院 一种昆虫细胞用双荧光素酶报告基因载体、构建方法、重组载体及应用

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