CN106170549A - 用于改变基因产物的表达的crispr‑cas系统和方法 - Google Patents

用于改变基因产物的表达的crispr‑cas系统和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106170549A
CN106170549A CN201380072715.1A CN201380072715A CN106170549A CN 106170549 A CN106170549 A CN 106170549A CN 201380072715 A CN201380072715 A CN 201380072715A CN 106170549 A CN106170549 A CN 106170549A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sequence
crispr
gene
cell
cas
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201380072715.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106170549B (zh
Inventor
F.张
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Massachusetts Institute of Technology
Broad Institute Inc
Original Assignee
Massachusetts Institute of Technology
Broad Institute Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=50441380&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN106170549(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Massachusetts Institute of Technology, Broad Institute Inc filed Critical Massachusetts Institute of Technology
Priority to CN201610902578.5A priority Critical patent/CN106480080B/zh
Priority to CN202010072631.XA priority patent/CN111187772A/zh
Publication of CN106170549A publication Critical patent/CN106170549A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106170549B publication Critical patent/CN106170549B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1082—Preparation or screening gene libraries by chromosomal integration of polynucleotide sequences, HR-, site-specific-recombination, transposons, viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/90—Vectors containing a transposable element
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea

Abstract

本发明提供了用于改变靶基因序列以及相关基因产物的表达的系统、方法和组合物。提供了多种载体和载体系统、以及用于设计和使用此类载体的方法，其中一些载体和载体系统编码CRISPR复合物的一种或多种组分。还提供了指导CRISPR复合物在真核细胞中形成的方法以及用于利用CRISPR‑Cas系统的方法。

Description

用于改变基因产物的表达的CRISPR-CAS系统和方法
相关应用和引用参考
本申请要求分别于2013年7月2日和10月5日提交的均具有博德参考号BI-2011/008A、标题为“用于改变基因产物的表达的CRISPR-CAS系统和方法(CRISPR-CAS SYSTEMSAND METHODS FOR ALTERING EXPRESSION OF GENE PRODUCTS)”的美国临时专利申请61/842,322和美国专利申请14/054,414的优先权。还要求分别于2012年12月12日、2013年1月2日、2013年3月15日以及2013年6月17日提交的分别具有博德参考号BI-2011/008/WSGR案卷号44063-701.101、BI-2011/008/WSGR案卷号44063-701.102、博德参考号BI-2011/008/VP案卷号44790.02.2003以及BI-2011/008/VP案卷号44790.03.2003、标题均为“用于序列操纵的系统、方法和组合物(SYSTEMS METHODS AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCEMANIPULATION)”的美国临时专利申请61/736,527、61/748,427、61/791,409以及61/835,931的优先权。
参考了美国临时专利申请61/758,468；61/769,046；61/802,174；61/806,375；61/814,263；61/819,803以及61/828,130，这些临时专利申请各自的标题为“用于序列操纵的系统、方法以及组合物的工程化以及优化”，分别提交于2013年1月30日；2013年2月25；2013年3月15；2013年3月28；2013年4月20；2013年5月6日以及2013年5月28日。还参考了美国临时专利申请61/835,936、61/836,127、61/836,101、61/836,080以及61/835,973，每个提交于2013年6月17日。
前述申请、以及在其中或在它们的审查程序期间引用的所有文献或(“申请引用文献”)以及在这些申请引用文献中引用或参考的所有文献、以及在本文中引用或参考的所有文献(“本文引用的文献”)、在本文中引用的文献中引用或参考的所有文献，连同针对在本文中提及或通过引用结合在本文中的任何文献中的任何产品的任何制造商的说明书、说明、产品规格、和产品表，特此通过引用并入本文，并且可以在本发明的实践中采用。更具体地说，所有参考的文献均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的文献被确切地并单独地指明通过引用而并入本文。
发明领域
本发明总体上涉及用于控制涉及序列靶向的基因表达的系统、方法、和组合物，该序列靶向例如可使用涉及规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)及其组分的载体系统的、基因组微扰或基因编辑。
关于联邦资助研究的声明
本发明是在美国国立卫生研究院颁发的NIH先锋奖(Pioneer Award)DP1MH100706的政府支持下完成的。美国政府享有本发明的某些权利。
发明背景
在基因组测序技术和分析方法中的最新进展显著加速了对与范围广泛的生物功能和疾病相关联的遗传因子进行编目和映射的能力。精确的基因组靶向技术对于通过允许个体遗传元件的选择性干扰而使得因果性遗传变异的统性逆向工程成为可能、以及推进合成生物学、生物技术应用、和医学应用是需要的。虽然基因组编辑技术，如设计师锌指、转录激活子样效应因子(TALE)、或归巢大范围核酸酶(homing meganuclease)对于产生靶向的基因组干扰是可得的，但是仍然需要负担得起的、易于建立的、可扩展的、并且便于靶向真核基因组内的多个位置的新的基因组工程技术。
发明概述
对于具有一系列广泛应用的序列靶向的替代性且稳健的系统和技术存在着迫切需要。本发明着手解决这种需要并且提供了相关优点。CRISPR/Cas或CRISPR-Cas系统(两个术语在本申请通篇可互换地使用)不要求产生靶向特异性序列的定制蛋白，而是通过一个短RNA分子识别一个特异性DNA靶标，可以对单个Cas酶进行程序设计，换句话说可以使用所述短RNA分子将Cas酶募集到一个特异性DNA靶标。将该CRISPR-Cas系统添加到基因组测序技术和分析方法的组库中可以显著使该方法论简化并且提高对与范围广泛的生物功能和疾病相关联的遗传因子进行编目和映射的能力。为了有效而无有害作用地利用CRISPR-Cas系统用于基因组编辑，了解这些基因组工程工具的工程化和优化方面是至关重要的，这些方面是请求保护的本发明的方面。
在一个方面，本发明提供了一种改变或修饰一种或多种基因产物的表达的方法，该方法可以包括向包含并表达编码该一种或多种基因产物的DNA分子的细胞中引入一种工程化的非天然存在的CRISPR-Cas系统，该系统可以包括一种Cas蛋白和一种或多种指导RNA，该一种或多种指导RNA靶向这些DNA分子，由此该一种或多种指导RNA靶向编码该一种或多种基因产物的DNA分子的基因组座位并且该Cas蛋白切割编码该一种或多种基因产物的DNA分子的该基因组座位，由此该一种或多种基因产物的表达被改变或修饰；并且，其中该Cas蛋白和该指导RNA并不共同天然存在。本发明包括，两种或更多种基因产物的表达可以被改变或修饰。本发明进一步包括，该指导RNA包括一种融合到tracr序列上的指导序列。在一个优选实施例中，该细胞是一种真核细胞，在一个更优选的实施例中，该细胞是一种哺乳动物细胞并且在一个仍更优选的实施例中，该哺乳动物细胞是一种人类细胞。本发明还包括，该Cas蛋白可以包括一个或多个核定位信号(NLS)。在一些实施例中，该Cas蛋白是一种II型CRISPR系统酶。在一些实施例中，该Cas蛋白是一种Cas9蛋白。在一些实施例中，该Cas9蛋白是肺炎链球菌、化脓链球菌或嗜热链球菌Cas9，并且可包括源自于这些生物的突变的Cas9。该蛋白可以是一种Cas9同系物或直向同源物。在一些实施例中，该Cas蛋白是密码子优化的，用于在真核细胞中进行表达。在一些实施例中，该Cas蛋白指导切割在该靶序列位置处的一条或两条链。在本发明的一个另外的方面，该基因产物的表达被降低并且该基因产物是一种蛋白质。本发明包括，引入细胞中是经由一种递送系统该递送系统可以包括病毒粒子、脂质体、电穿孔、显微注射或缀合。
在另一个方面，本发明提供了一种改变或修饰一种或多种基因产物的表达的方法，该方法包括向包含并表达编码该一种或多种基因产物的DNA分子的细胞中引入一种工程化的非天然存在的载体系统，该载体系统可以包括一种或多种载体，该一种或多种载体包括：a)一种第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接到一种或多种与编码该一种或多种基因产物的DNA分子的基因组座位中的靶序列杂交的CRISPR-Cas系统指导RNA上，b)一种第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接到一种Cas蛋白上，其中组分(a)和(b)位于该系统的相同或不同载体上，由此这些指导RNA靶向编码该一种或多种基因产物的DNA分子的基因组座位并且该Cas蛋白切割编码该一种或多种基因产物的DNA分子的该基因组座位，由此该一种或多种基因产物的表达被改变或修饰；并且，其中该Cas蛋白和这些指导RNA并不共同天然存在。本发明包括，两种或更多种基因产物的表达可以被改变或修饰。本发明进一步包括，该指导RNA包括一种融合到tracr序列上的指导序列。在一个优选实施例中，该细胞是一种真核细胞，在一个更优选的实施例中，该细胞是一种哺乳动物细胞并且在一个仍更优选的实施例中，该哺乳动物细胞是一种人类细胞。本发明还包括，该系统的载体可以进一步包括一个或多个NLS。在一些实施例中，该Cas蛋白是一种II型CRISPR系统酶。在一些实施例中，该Cas蛋白是一种Cas9蛋白。在一些实施例中，该Cas9蛋白是肺炎链球菌、化脓链球菌或嗜热链球菌Cas9，并且可包括源自于这些生物的突变的Cas9。该蛋白可以是一种Cas9同系物或直向同源物。在一些实施例中，该Cas蛋白是密码子优化的，用于在真核细胞中进行表达。在一些实施例中，该Cas蛋白指导切割在该靶序列位置处的一条或两条链。在本发明的一个另外的方面，该基因产物的表达被降低并且该基因产物是一种蛋白质。本发明包括，引入细胞中是经由一种递送系统该递送系统可以包括病毒粒子、脂质体、电穿孔、显微注射或缀合。
本发明还提供了一种工程化的非天然存在的载体系统，该载体系统可以包括一种或多种载体，该一种或多种载体包括：a)一种第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接到一种或多种与编码一种或多种基因产物的DNA分子的基因组座位中的靶序列杂交的CRISPR-Cas系统指导RNA上，b)一种第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接到一种Cas蛋白上，其中组分(a)和(b)位于该系统的相同或不同载体上，由此这些指导RNA在细胞中靶向编码该一种或多种基因产物的DNA分子的基因组座位并且该Cas蛋白切割编码该一种或多种基因产物的DNA分子的该基因组座位，由此该一种或多种基因产物的表达被改变或修饰；并且，其中该Cas蛋白和这些指导RNA并不共同天然存在。本发明包括，两种或更多种基因产物的表达可以被改变或修饰。本发明进一步包括，该指导RNA包括一种融合到tracr序列上的指导序列。在一个优选实施例中，该细胞是一种真核细胞，在一个更优选的实施例中，该细胞是一种哺乳动物细胞并且在一个仍更优选的实施例中，该哺乳动物细胞是一种人类细胞。本发明还包括，该系统的载体可以进一步包括一个或多个NLS。在一些实施例中，该Cas蛋白是一种II型CRISPR系统酶。在一些实施例中，该Cas蛋白是一种Cas9蛋白。在一些实施例中，该Cas9蛋白是肺炎链球菌、化脓链球菌或嗜热链球菌Cas9，并且可包括源自于这些生物的突变的Cas9。该蛋白可以是一种Cas9同系物或直向同源物。在一些实施例中，该Cas蛋白是密码子优化的，用于在真核细胞中进行表达。在一些实施例中，该Cas蛋白指导切割在该靶序列位置处的一条或两条链。在本发明的一个另外的方面，该基因产物的表达被降低并且该基因产物是一种蛋白质。本发明包括，引入细胞中是经由一种递送系统该递送系统可以包括病毒粒子、脂质体、电穿孔、显微注射或缀合。
在仍另一个方面，本发明提供了一种工程化的可编程的非天然存在的CRISPR-Cas系统，该系统可以包括一种Cas蛋白以及一种或多种指导RNA，该一种或多种指导RNA在细胞中靶向编码一种或多种基因产物的DNA分子的基因组座位，并且该Cas蛋白切割编码该一种或多种基因产物的DNA分子的基因组座位，由此该一种或多种基因产物的表达被改变或修饰；并且，其中该Cas蛋白和这些指导RNA并不共同天然存在。本发明包括，两种或更多种基因产物的表达可以被改变或修饰。本发明进一步包括，该指导RNA包括一种融合到tracr序列上的指导序列。在一个优选实施例中，该细胞是一种真核细胞，在一个更优选的实施例中，该细胞是一种哺乳动物细胞并且在一个仍更优选的实施例中，该哺乳动物细胞是一种人类细胞。本发明还包括，该CRISPR-Cas系统可以进一步包括一个或多个NLS。在一些实施例中，该Cas蛋白是一种II型CRISPR系统酶。在一些实施例中，该Cas蛋白是一种Cas9蛋白。在一些实施例中，该Cas9蛋白是肺炎链球菌、化脓链球菌或嗜热链球菌Cas9，并且可包括源自于这些生物的突变的Cas9。该蛋白可以是一种Cas9同系物或直向同源物。在一些实施例中，该Cas蛋白是密码子优化的，用于在真核细胞中进行表达。在一些实施例中，该Cas蛋白指导切割在该靶序列位置处的一条或两条链。在本发明的一个另外的方面，该基因产物的表达被降低并且该基因产物是一种蛋白质。本发明包括，引入细胞中是经由一种递送系统该递送系统可以包括病毒粒子、脂质体、电穿孔、显微注射或缀合。
在一个方面，本发明提供了包括一种或多种载体的载体系统。在一些实施例中，该系统包括：(a)一种第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接到一种tracr配对序列以及用于在该tracr配对序列的上游插入一个或多个指导序列的一个或多个插入位点，其中当表达时，该指导序列引导CRISPR复合物在真核细胞中与一个靶序列的序列特异性结合，其中该CRISPR复合物包括与以下各项复合的一种CRISPR酶：(1)杂交到该靶序列的指导序列，以及(2)杂交到该tracr序列的tracr配对序列；和(b)一种第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接到编码所述CRISPR酶的酶编码序列，该CRISPR酶包括一个核定位序列；其中组分(a)和(b)位于该系统的相同或不同载体上。在一些实施例中，组分(a)进一步包括在该第一调节元件的控制之下在tracr配对序列的下游的tracr序列。在一些实施例中，组分(a)进一步包括可操作地连接到该第一调节元件的两个或更多个指导序列，其中当表达时，该两个或更多个指导序列中的每个引导CRISPR复合物在真核细胞中与一个不同靶序列的序列特异性结合。在一些实施例中，该系统包括在一种第三调节元件(诸如一个聚合酶III启动子)控制之下的tracr序列。在一些实施例中，当最佳比对时，沿着该tracr配对序列的长度，该tracr序列展现至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、或99％序列互补性。确定最佳比对在本领域的普通技术人员的能力范围内。例如，存在公开和可商购的比对算法和程序，诸如但不限于ClustalW、matlab中的史密斯-沃特曼算法(Smith-Waterman)、Bowtie、Geneious、Biopython以及SeqMan。在一些实施例中，该CRISPR复合物包括一个或多个核定位序列，该一个或多个核定位序列具有足够强度来在真核细胞的细胞核中驱动所述CRISPR复合物以可检测到的量积聚。不希望受理论限制，认为核定位序列对于真核生物中的CRISPR复合物活性不是必要的，但包括此类序列增强该系统的活性，尤其对于靶向细胞核中的核酸分子而言。在一些实施例中，该CRISPR酶是II型CRISPR系统酶。在一些实施例中，该CRISPR酶是Cas9酶。在一些实施例中，该Cas9酶是肺炎链球菌、化脓链球菌、或嗜热链球菌Cas9，并且可包括源自于这些生物体的突变的Cas9。该酶可以是一种Cas9同系物或直向同源物。在一些实施例中，该CRISPR酶是密码子优化的以便在真核细胞中表达。在一些实施例中，该CRISPR酶引导在该靶序列位置处的一条或两条链的切割。在一些实施例中，该第一调节元件是一种聚合酶III启动子。在一些实施例中，该第二调节元件是一种聚合酶II启动子。在一些实施例中，该指导序列在长度上是至少15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个核苷酸，或10-30个之间、或15-25个之间、或15-20个之间的核苷酸。通常，并且贯穿本说明书，术语“载体”是指一种核酸分子，它能够运送与其连接的另一种核酸分子。载体包括但不限于，单链、双链、或部分双链的核酸分子；包括一个或多个自由端、无自由端(例如环状的)的核酸分子；包括DNA、RNA、或两者的核酸分子；以及本领域已知的其他多种多样的多核苷酸。一种类型的载体是“质粒”，其是指其中可以例如通过标准分子克隆技术插入另外的DNA片段的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中病毒衍生的DNA或RNA序列存在于用于包装病毒(例如，逆转录病毒、复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒、复制缺陷型腺病毒、以及腺相关病毒)的载体中。病毒载体还包含由用于转染到一种宿主细胞中的病毒携带的多核苷酸。某些载体(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)能够在它们被导入的宿主细胞中自主复制。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后整合到该宿主细胞的基因组中，并且由此与该宿主基因组一起复制。而且，某些载体能够指导它们可操作连接的基因的表达。这样的载体在此被称为“表达载体”。在重组DNA技术中使用的普通表达栽体通常是质粒形式。
重组表达载体可包含处于适合于在宿主细胞中的核酸表达的形式的本发明的核酸，这意味着这些重组表达载体包含基于待用于表达的宿主细胞而选择的一种或多种调节元件，所述调节元件可操作地连接至待表达的核酸序列。在重组表达载体内，“可操作地连接”旨在表示感兴趣的核苷酸序列以一种允许该核苷酸序列的表达的方式被连接至该一种或多种调节元件(例如，处于一种体外转录/翻译系统中或当该载体被引入到宿主细胞中时，处于该宿主细胞中)。
术语“调节元件”旨在包括启动子、增强子、内部核糖体进入位点(IRES)、和其他表达控制元件(例如转录终止信号，如多聚腺苷酸化信号和多聚U序列)。这样的调节序列例如描述于戈德尔(Goeddel)，《基因表达技术：酶学方法》(GENE EXPRESSION TECHNOLOGY:METHODS IN ENZYMOLOGY)185，学术出版社(Academic Press)，圣地亚哥(San Diego)，加利福尼亚州(1990)中。调节元件包括指导一个核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中的组成型表达的那些序列以及指导该核苷酸序列只在某些宿主细胞中表达的那些序列(例如，组织特异型调节序列)。组织特异型启动子可主要指导在感兴趣的期望组织中的表达，所述组织例如肌肉、神经元、骨、皮肤、血液、特定的器官(例如肝脏、胰腺)、或特殊的细胞类型(例如淋巴细胞)。调节元件还可以时序依赖性方式(如以细胞周期依赖性或发育阶段依赖性方式)指导表达，该方式可以是或者可以不是组织或细胞类型特异性的。在一些实施例中，一个载体包含一个或多个pol III启动子(例如1、2、3、4、5、或更多个pol III启动子)、一个或多个pol II启动子(例如1、2、3、4、5、或更多个pol II启动子)、一个或多个pol I启动子(例如1、2、3、4、5、或更多个pol I启动子)、或其组合。pol III启动子的实例包括但不限于U6和H1启动子。pol II启动子的实例包括但不限于逆转录劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(任选地具有RSV增强子)、巨细胞病毒(CMV)启动子(任选地具有CMV增强子)[参见，例如，波沙特(Boshart)等人，《细胞》(Cell)41:521-530(1985)]、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子、和EF1α启动子。还被术语“调节元件”涵盖的是增强子元件，如WPRE；CMV增强子；在HTLV-I的LTR中的R-U5’片段《分子细胞生物学》(Mol.Cell.Biol.，第8(1)卷，第466-472页，1988)；SV40增强子；以及在兔β-珠蛋白的外显子2与3之间的内含子序列(《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)，第78(3)卷，第1527-31页，1981)。本领域技术人员将理解，表达载体的设计可取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、所希望的表达水平等因素。一种载体可以被引入到宿主细胞中而由此产生转录物、蛋白质、或肽，包括由如本文所述的核酸编码的融合蛋白或肽(例如，规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)转录物、蛋白质、酶、其突变体形式、其融合蛋白，等等)。
有利的载体包括慢病毒以及腺相关病毒，并且也可选择此类型的载体以靶向具体类型的细胞。
在一个方面，本发明提供了一种真核宿主细胞，该真核宿主细胞包括：(a)一种第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接到一种tracr配对序列以及用于在该tracr配对序列的上游插入一个或多个指导序列的一个或多个插入位点，其中当表达时，该指导序列引导CRISPR复合物在真核细胞中与一个靶序列的序列特异性结合，其中该CRISPR复合物包括与以下各项复合的一种CRISPR酶：(1)杂交到该靶序列的指导序列，以及(2)杂交到该tracr序列的tracr配对序列；和/或(b)一种第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接到编码所述CRISPR酶的酶编码序列，该CRISPR酶包括一个核定位序列。在一些实施例中，该宿主细胞包括组分(a)以及(b)。在一些实施例中，组分(a)、组分(b)、或组分(a)和(b)稳定地整合到该宿主真核细胞的一个基因组中。在一些实施例中，组分(a)进一步包括在该第一调节元件的控制之下在tracr配对序列的下游的tracr序列。在一些实施例中，组分(a)进一步包括可操作地连接到该第一调节元件的两个或更多个指导序列，其中当表达时，该两个或更多个指导序列中的每个引导CRISPR复合物在真核细胞中与一个不同靶序列的序列特异性结合。在一些实施例中，该真核宿主细胞进一步包括一种第三调节元件，诸如一种聚合酶III启动子，该第三调节元件可操作地连接到所述tracr序列。在一些实施例中，当最佳比对时，沿着该tracr配对序列的长度，该tracr序列展现至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、或99％序列互补性。该酶可以是一种Cas9同系物或直向同源物。在一些实施例中，该CRISPR酶是密码子优化的以便在真核细胞中表达。在一些实施例中，该CRISPR酶引导在该靶序列位置处的一条或两条链的切割。在一些实施例中，该CRISPR酶缺少DNA链切割活性。在一些实施例中，该第一调节元件是一种聚合酶III启动子。在一些实施例中，该第二调节元件是一种聚合酶II启动子。在一些实施例中，该指导序列在长度上是至少15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个核苷酸，或10-30个之间、或15-25个之间、或15-20个之间的核苷酸。在一个方面，本发明提供一种非人的真核生物；优选地一种多细胞真核生物，包括根据所述实施例中任一个的一种真核宿主细胞。在其他方面，本发明提供一种真核生物；优选地一种多细胞真核生物，包括根据所述实施例中任一个的一种真核宿主细胞。在这些方面的一些实施例中，该生物体可以是一种动物；例如一种哺乳动物。另外，该生物体可以是一种节肢动物，诸如一种昆虫。该生物体也可以是一种植物。进一步，该生物体可以是一种真菌。
在一个方面，本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒包括在此所述的组分中的一种或多种。在一些实施例中，该试剂盒包括一种载体系统以及用于使用该试剂盒的说明书。在一些实施例中，该载体系统包括：(a)一种第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接到一种tracr配对序列以及用于在该tracr配对序列的上游插入一个或多个指导序列的一个或多个插入位点，其中当表达时，该指导序列引导CRISPR复合物在真核细胞中与一个靶序列的序列特异性结合，其中该CRISPR复合物包括与以下各项复合的一种CRISPR酶：(1)杂交到该靶序列的指导序列，以及(2)杂交到该tracr序列的tracr配对序列；和/或(b)一种第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接到编码所述CRISPR酶的酶编码序列，该CRISPR酶包括一个核定位序列。在一些实施例中，该试剂盒包括位于该系统的相同或不同载体上的组分(a)和(b)。在一些实施例中，组分(a)进一步包括在该第一调节元件的控制之下在tracr配对序列的下游的tracr序列。在一些实施例中，组分(a)进一步包括可操作地连接到该第一调节元件的两个或更多个指导序列，其中当表达时，该两个或更多个指导序列中的每个引导CRISPR复合物在真核细胞中与一个不同靶序列的序列特异性结合。在一些实施例中，该系统进一步包括一种第三调节元件，诸如一种聚合酶III启动子，该第三调节元件可操作地连接到所述tracr序列。在一些实施例中，当最佳比对时，沿着该tracr配对序列的长度，该tracr序列展现至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、或99％序列互补性。在一些实施例中，该CRISPR酶包括一个或多个核定位序列，该一个或多个核定位序列具有足够强度来在真核细胞的细胞核中驱动所述CRISPR酶以可检测到的量积聚。在一些实施例中，该CRISPR酶是II型CRISPR系统酶。在一些实施例中，该CRISPR酶是Cas9酶。在一些实施例中，该Cas9酶是肺炎链球菌、化脓链球菌或嗜热链球菌Cas9，并且可包括源自于这些生物体的突变的Cas9。该酶可以是一种Cas9同系物或直向同源物。在一些实施例中，该CRISPR酶是密码子优化的以便在真核细胞中表达。在一些实施例中，该CRISPR酶引导在该靶序列位置处的一条或两条链的切割。在一些实施例中，该CRISPR酶缺少DNA链切割活性。在一些实施例中，该第一调节元件是一种聚合酶III启动子。在一些实施例中，该第二调节元件是一种聚合酶II启动子。在一些实施例中，该指导序列在长度上是至少15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个核苷酸，或10-30个之间、或15-25个之间、或15-20个之间的核苷酸。
在一个方面，本发明提供了修饰在一种真核细胞中的靶多核苷酸的方法。在一些实施例中，该方法包括允许一种CRISPR复合物结合到该靶多核苷酸上以实施所述靶多核苷酸的切割，由此修饰该靶多核苷酸，其中该CRISPR复合物包括与杂交到在所述靶多核苷酸内的一个靶序列上的指导序列复合的CRISPR酶，其中所述指导序列连接到一种tracr配对序列上，该tracr配对序列进而杂交到一种tracr序列上。在一些实施例中，所述切割包括通过所述CRISPR酶切割在该靶序列位置的一条或两条链。在一些实施例中，所述切割导致靶基因的转录降低。在一些实施例中，该方法进一步包括通过与外源模板多核苷酸同源重组修复所述切割的靶多核苷酸，其中所述修复导致一种突变，包括所述靶多核苷酸的一个或多个核苷酸的插入、缺失、或取代。在一些实施例中，所述突变导致在从包含该靶序列的基因表达的蛋白质中的一个或多个氨基酸改变。在一些实施例中，该方法进一步包括将一种或多种载体递送到所述真核细胞，其中该一种或多种载体驱动下列一者或多者的表达：该CRISPR酶、连接到该tracr配对序列上的指导序列、以及该tracr序列。在一些实施例中，所述载体被递送到受试者内的真核细胞中。在一些实施例中，所述修饰发生在细胞培养物中的所述真核细胞中。在一些实施例中，该方法进一步包括在所述修饰之前从受试者中分离所述真核细胞。在一些实施例中，该方法进一步包括使所述真核细胞和/或从中衍生的细胞返回到所述受试者中。
在一个方面，本发明提供了修饰一种多核苷酸在真核细胞中的表达的方法。在一些实施例中，该方法包括允许一种CRISPR复合物结合到该多核苷酸上，这样使得所述结合导致所述多核苷酸的表达增加或降低；其中该CRISPR复合物包括与杂交到在所述多核苷酸内的一个靶序列上的指导序列复合的CRISPR酶，其中所述指导序列连接到一种tracr配对序列上，该tracr配对序列进而杂交到一种tracr序列上。在一些实施例中，该方法进一步包括将一种或多种载体递送到所述真核细胞，其中该一种或多种载体驱动下列一者或多者的表达：该CRISPR酶、连接到该tracr配对序列上的指导序列、以及该tracr序列。
在一个方面，本发明提供了一种产生包含突变的疾病基因的模式真核细胞的方法。在一些实施例中，疾病基因是与患有或产生一种疾病的风险的增加相关联的任何基因。在一些实施例中，该方法包括(a)将一种或多种载体引入真核细胞中，其中该一种或多种载体驱动以下一者或多者的表达：CRISPR酶、连接到tracr配对序列上的指导序列、以及tracr序列；以及(b)允许一种CRISPR复合物结合到一个靶多核苷酸上以实施在所述疾病基因内的该靶多核苷酸的切割，其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶多核苷酸内的该靶序列上的指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的CRISPR酶，由此产生包含突变的疾病基因的模式真核细胞。在一些实施例中，所述切割包括通过所述CRISPR酶切割在该靶序列位置的一条或两条链。在一些实施例中，所述切割导致靶基因的转录降低。在一些实施例中，该方法进一步包括通过与外源模板多核苷酸同源重组修复所述切割的靶多核苷酸，其中所述修复导致一种突变，包括所述靶多核苷酸的一个或多个核苷酸的插入、缺失、或取代。在一些实施例中，所述突变导致在从包含该靶序列的基因表达的蛋白质中的一个或多个氨基酸改变。
在一个方面，本发明提供了一种用于研发生物活性剂的方法，该生物活性剂调制与疾病基因相关的细胞信号传导事件。在一些实施例中，疾病基因是与患有或产生一种疾病的风险的增加相关联的任何基因。在一些实施例中，该方法包括(a)使一种测试化合物与所述实施例中的任一项的一种模式细胞接触；并且(b)检测读数变化，该变化指示与所述疾病基因的所述突变关联的细胞信号传导事件的减少或增加，从而开发调制与所述疾病基因关联的所述细胞信号传导事件的所述生物活性剂。
在一个方面，本发明提供包括在tracr配对序列上游的指导序列的一种重组多核苷酸，其中当表达时该指导序列引导一种CRISPR复合物与存在于真核细胞中的一个对应的靶序列的序列特异性结合。在一些实施例中，该靶序列是存在于真核细胞中的病毒序列。在一些实施例中，该靶序列是原癌基因或癌基因。
在一个方面，本发明提供了一种通过在一个或多个细胞中的基因中引入一个或多个突变来选择一个或多个细胞的方法，该方法包括：将一种或多种载体引入一个或多个细胞中，其中该一种或多种载体驱动以下一者或多者的表达：CRISPR酶、连接到tracr配对序列上的指导序列、tracr序列、以及编辑模板；其中该编辑模板包含消除CRISPR酶切的一个或多个突变；允许该编辑模板与在有待选择的一个或多个细胞中的靶多核苷酸同源重组；允许CRISPR复合物结合到靶多核苷酸上以实施在所述基因内的靶多核苷酸的切割，其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该靶多核苷酸内的靶序列上的指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的tracr配对序列复合的CRISPR酶，其中该CRISPR复合物到该靶多核苷酸上的结合诱导细胞死亡，由此允许选择其中已经引入一个或多个突变的一个或多个细胞。在一些实施例中，该CRISPR酶是II型CRISPR系统酶。在一些实施例中，该CRISPR酶是一种Cas9蛋白。在一些实施例中，该Cas9蛋白是肺炎链球菌、化脓链球菌或嗜热链球菌Cas9，并且可包括源自于这些生物的突变的Cas9。该酶可以是一种Cas9同系物或直向同源物。在一些实施例中，该酶是密码子优化的，用于在真核细胞中进行表达。在一些实施例中，该酶指导切割在该靶序列位置处的一条或两条链。在一个优选的实施例中，该CRISPR酶是Cas9。在本发明的另一个优选实施例中，该有待选择的细胞可以是真核细胞。本发明的方面允许选择特异细胞，而不需要选择标记或可能包括反选择系统的两步法。
本发明的方面包括内源基因组中的位点特异性基因敲除：本发明与使用基于锌指和TAL效应物的位点特异性核酸酶技术相比是有利的，因为它无需详尽的设计并且可用于同时敲除同一基因组内的多个基因。在一个另外的方面，本发明包括位点特异性基因组编辑。本发明与使用天然或人工位点特异性核酸酶或重组酶相比是有利的，因为它可以能够引入位点特异性双链断裂，以促进靶向的基因组座位处的同源重组。在另一个方面，本发明包括DNA序列特异性干扰。可以使用本发明失活基于有害DNA的生物(如微生物、病毒或甚至癌细胞)的基因组，通过直接造这些生物的基因组中的特定位点处引入断裂。本发明提供了多元基因组工程化的方法和组合物，因为本发明的CRISPR-Cas系统可以通过使用多个序列特异性CRISPR间隔子元件或指导序列而容易地靶向基因组中的多个位点。
因此，本发明的目的在于，在本发明中不涵盖任何先前已知的产品、制造该产品的过程、或使用该产品的方法，使得申请人保留和特此披露放弃任何先前已知的产品、过程、或方法的权利。进一步指出的是，在本发明的范围之内，本发明并不旨在涵盖任何产品、过程、或该产品的制造或使用该产品的方法，其不符合USPTO(35U.S.C.§112，第一段)或EPO(EPC的第83条)的书面说明和可实施性要求，使得申请人保留和特此公开放弃任何先前描述的产品、制造该产品的过程、或使用该产品的方法的权利。
应当指出的是，在本披露中并且尤其是在权利要求书和/或段落中，术语如“包含(comprises)”、“包含(comprised)”、“包含(comprising)”等等可具有在美国专利法中属于它的含义；例如，它们可以表示“包括(includes)”、“包括(included)”、“包括(including)”等等；并且术语如“基本上由……组成(consisting essentially of)”和“基本上由……组成(consists essentially of)”具有在美国专利法中归于它们的含义，例如，它们允许未被清楚叙述的要素，但是排除在现有技术中发现或者影响本发明的基本或新颖特征的要素。这些和其他实施例披露于以下详细说明中，或者据其显而易见并且由其涵盖。
附图简要说明
本发明的新颖特征在所附权利要求书中具体提出。通过参考对说明性实施例进行叙述的以下详细说明，将获得对本发明的特征和优点的更好理解，在这些实施例中利用了本发明的原理，并且在这些附图中：
图1显示了该CRISPR系统的示意模型。来自化脓链球菌(黄色)的Cas9核酸酶经由合成的指导RNA(sgRNA)而被靶向基因组DNA，该指导RNA包含一个20个nt的指导序列(蓝色)和一个支架(红色)。与DNA靶(蓝色)的指导序列碱基对，直接地在必要的5’-NGG原型间隔子邻近基序(PAM；红紫色)的上游，并且Cas9在该PAM(红色三角形)的上游约3bp介导了双链断裂(DSB)。
图2A-F显示了一个示例性CRISPR系统、一个可能的作用机制、一个在真核细胞中的表达的示例性适应性改变、以及评估核定位和CRISPR活性的试验的结果。图2C按照出现次序分别披露了SEQ ID NOS 23-24。图2E按照出现次序分别披露了SEQ ID NOS 25-27。图2F按照出现次序分别披露了SEQ ID NOS 28-32。
图3A-D显示了针对示例性靶标的SpCas9特异性的评估结果。图3A按照出现次序分别披露了SEQ ID NOS 33、26和34-44。图3C披露了SEQ ID NO:33。
图4A-G显示了一个示例性载体系统以及它在指导真核细胞中的同源重组中的使用结果。图4E披露了SEQ ID NO:45。图4F按照出现次序分别披露了SEQ ID NOS 46-47。图4G按照出现次序分别披露了SEQ ID NOS 48-52。
图5提供了原型间隔子序列的表(按照出现次序分别是SEQ ID NOS 16、15、14、53-58、18、17以及59-63)，并且总结了基于示例性脓链球菌和嗜热链球菌CRISPR系统设计的原型间隔子靶标的修饰效率结果，这些CRISPR系统具有针对人类和小鼠基因组中的座位的相应PAM。用Cas9以及前-crRNA/tracrRNA或嵌合RNA转染细胞，在转染72小时之后进行分析。基于来自指示细胞系的Surveyor分析结果，计算了indel(插入缺失)百分比(对于所有原型间隔子靶标N＝3，误差为S.E.M.，N.D.表示使用Surveyor测定未检测到，并且N.T.表示在本研究中未检测)。
图6A-C显示了对于Cas9介导的基因靶向而言的不同tracrRNA转录本的比较。图6A按照出现次序分别披露了SEQ ID NOS 64-65。
图7显示了对于双链断裂诱导的微插入和微缺失的检测的surveyor核酸酶试验的示意图。
图8A-B显示了用于CRISPR系统元件在真核细胞中的表达的示例性双顺反子表达载体。图8A按照出现次序分别披露了SEQ ID NOS 66-68。图8B按照出现次序分别披露了SEQID NOS 69-71。
图9A-C显示了在人类基因组中在邻近的化脓链球菌SF370座位1PAM(NGG)(图9A)和嗜热链球菌LMD9座位2PAM(NNAGAAW)(图9B)之间的距离、以及对于每个PAM就染色体而言的距离(Chr)(图9C)的直方图。
图10A-D显示了一个示例性CRISPR系统、一个针对在真核细胞中的表达的示例性适应性改变、以及评估CRISPR活性的试验的结果。图10B按照出现次序分别披露了SEQ IDNOS 72-73。图10C披露了SEQ ID NO:74。
图11A-C显示了用于靶向哺乳动物细胞中的基因组座位的CRISPR系统的示例性操纵。图11A披露了SEQ ID NO:75。图11B按照出现次序分别披露了SEQ ID NOS 76-78。
图12A-B显示了在哺乳动物中的crRNA加工的Northern印迹分析的结果。图12A披露了SEQ ID NO:79。
图13A-B显示了在人PVALB和小鼠Th座位中的原型间隔子的示例性选择。图13A披露了SEQ ID NO:80。图13B披露了SEQ ID NO:81。
图14显示了在人EMX1座位中的嗜热链球菌CRISPR系统的示例性原型间隔子和相应PAM序列靶标。图14披露了SEQ ID NO:74。
图15提供了用于Surveyor、RFLP、基因组测序、以及Northern印迹分析的引物和探针的序列表(按照出现次序分别是SEQ ID NOS 82-93)。
图16A-C显示了具有嵌合RNA的CRISPR系统的示例性操纵以及在真核细胞中的系统活性的SURVEYOR分析的结果。图16A披露了SEQ ID NO:94。
图17A-B显示了在真核细胞中的CRISPR系统活性的SURVEYOR分析的结果的图示。
图18显示了使用UCSC基因组浏览器进行的在人类基因组中的一些化脓链球菌Cas9靶位点的示例性可视化。图18按照出现次序分别披露了SEQ ID NOS 95-173。
图19A-D显示了揭示五个Cas9家族的系统发生分析的环状描绘，这五个家族包括三组大的Cas9(约1400个氨基酸)和两组小的Cas9(约1100个氨基酸)。
图20A-F显示了揭示五个Cas9家族的系统发生分析的线性描绘，这五个家族包括三组大的Cas9(约1400个氨基酸)和两组小的Cas9(约1100个氨基酸)。
图21A-D显示了经由同源重组的基因组编辑。(a)SpCas9切口酶的示意图，具有在RuvC I催化结构域中的D10A突变。(b)示意图,表示使用有义或反义单链寡核苷酸作为修复模板在人EMX1座位处的同源重组(HR)。以上红色箭头表示sgRNA切割位点；用于基因分型的PCR引物(表J和K)表示为右图中的箭头。图21C按照出现次序分别披露了SEQ ID NOS 174-176、174、177以及176。(c)由HR修饰的区域的序列。d，对于野生型(wt)和切口酶(D10A)SpCas9介导的在EMX1靶标1座位的indel的SURVEYOR分析(n＝3)。箭头指示预期片段大小的位置。
图22A-B显示了用于SpCas9的单个载体设计。图22A按照出现次序分别披露了SEQID NOS 178-180。图22B披露了SEQ ID NO:181。
本文的这些图仅仅是出于说明性的目的，并且不一定是按比例绘制的。
本发明的详细说明
术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换地使用。它们是指具有任何长度的核苷酸的聚合形式，是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸、或其类似物。多核苷酸可具有任何三维结构，并且可以执行已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码区或非编码区、根据连接分析定义的多个座位(一个座位)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、短发夹RNA(shRNA)、micro-RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针、和引物。多核苷酸可以包含一个或多个经修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可以在聚合物组装之前或之后进行核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后，如通过与标记的组分缀合来进一步修饰。
在本发明的多个方面，术语“嵌合RNA”、“嵌合指导RNA”、“指导RNA”、“单个指导RNA”以及“合成指导RNA”是可互换地使用的并且是指包括指导序列、tracr序列以及tracr配对序列的多核苷酸序列。术语“指导序列”是指在指定靶位点的指导RNA内约20bp的序列，并且可与术语“指导”或“间隔子”互换地使用。术语“tracr配对序列”也可与术语“(一个或多个)同向重复”互换地使用。一种示例性CRISPR-Cas系统示于图1中。
如本文所用的术语“野生型”是本领域技术人员所理解的术语，并且表示生物、菌株、基因的典型形式或者当它在自然界存在时区别于突变体或变体形式的特征。
如本文所用的术语“变体”应当被理解为表示具有衍生自在自然界中存在的模式的性质的展示。
术语“非天然存在的”或“工程化的”可互换地使用并且表面人工的参与。这些术语，当指核酸分子或多肽时，表示该核酸分子或多肽至少基本上从它们在自然界中或如发现于自然界中的与其结合的至少另一种组分游离出来。
“互补性”是指核酸与另一个核酸序列借助于传统的沃森-克里克或其他非传统类型形成一个或多个氢键的能力。互补百分比表示一个核酸分子中可与一个第二核酸序列形成氢键(例如，沃森-克里克碱基配对)的残基的百分比(例如，10个之中有5、6、7、8、9、10个即为50％、60％、70％、80％、90％、和100％互补)。“完全互补”表示一个核酸序列的所有连续残基与一个第二核酸序列中的相同数目的连续残基形成氢键。如本文使用的“基本上互补”是指在一个具有8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸的区域上至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、或100％的互补程度，或者是指在严格条件下杂交的两个核酸。
如本文使用的对于杂交的“严格条件”是指与靶序列具有互补性的一个核酸主要地与该靶序列杂交并且基本上不杂交到非靶序列上的条件。严格条件通常是序列依赖性的，并且取决于许多因素而变化。一般而言，该序列越长，则该序列特异性地杂交到其靶序列上的温度就越高。严格条件的非限制性实例描述于蒂森(Tijssen)(1993)的《生物化学和分子生物学中的实验室技术-核酸探针杂交》(Laboratory Techniques In BiochemistryAnd Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes)，第I部分，第二章，“杂交原理概述和核酸探针分析策略”(“Overview of principles of hybridization andthe strategy of nucleic acid probe assay”)，爱思唯尔(Elsevier)，纽约。
“杂交”是指其中一个或多个多核苷酸反应形成一种复合物的反应，该复合物经由这些核苷酸残基之间的碱基的氢键键合而稳定化。氢键键合可以借助于沃森-克里克碱基配对、Hoogstein结合或以任何其他序列特异性方式而发生。该复合物可包含形成一个双链体的两条链、形成多链复合物的三条或多条链、单个自我杂交链、或这些的任何组合。杂交反应可以构成一个更广泛的过程(如PCR的开始、或经由一种酶的多核苷酸的切割)中的一个步骤。能够与一个给定序列杂交的序列被称为该给定序列的“互补物”。
如本文使用的“表达”是指藉此从DNA模板转录成多核苷酸(如转录成mRNA或其他RNA转录物)的过程和/或转录的mRNA随后藉此翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽可以总称为“基因产物”。如果多核苷酸来源于基因组DNA，表达可以包括真核细胞中mRNA的剪接。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换地使用，是指具有任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可以是可以是直链或支链的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。这些术语还涵盖已经被修饰的氨基酸聚合物；这些修饰例如二硫键形成、糖基化、脂化(lipidation)、乙酰化、磷酸化、或任何其他操纵，如与标记组分的缀合。如本文使用的术语“氨基酸”包括天然的和/或非天然的或者合成的氨基酸，包括甘氨酸以及D和L旋光异构体、以及氨基酸类似物和肽模拟物。
术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中是可互换地使用的，指的是脊椎动物，优选地是哺乳动物，更加优选地是人类。哺乳动物包括但不限于鼠类、猴、人、农畜、体育用动物和宠物。也包括体内获得或体外培养的一种生物实体的组织、细胞及其子代。
术语“治疗剂(therapeutic agent)”、“可用于治疗的试剂(therapeutic capableagent)”或“处理剂(treatment agent)”是可互换地使用的，并且是指在给予受试者时赋予某种有益影响的一种分子或化合物。该有益影响包括诊断确定的实现；改进一种疾病、症状、障碍、或病理学病况；减少或预防一种疾病、症状、障碍或病况的发作；并且总体上对抗一种疾病、症状、障碍或病理学病况。
如此处使用的，“治疗(treatment)”或“进行治疗(treating)”或“减轻”或“改善”是可互换地使用的。这些术语是指如下途径，该途径用于获得有益或希望的结果，包括但不限于一种治疗益处和/或一种预防益处。治疗益处意指治疗中的一种或多种疾病、病况、或症状上的任何治疗上相关的改进或对其的影响。对于预防益处，该组合物可给予至处于发展一种具体的疾病、病况、或症状的风险的受试者，或给予至报告了一种疾病的一个或多个生理学症状的受试者，尽管该疾病、病况、或症状可能还没有体现出来。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指一种药剂的足以实现有益或希望的结果的量。治疗有效量可依赖于正治疗的受试者和疾病病状、受试者的重量和年龄、疾病病况的严重度、给药方式等中一项或多个而改变，并可以由本领域普通技术人员容易地确定。该术语也适用通过此处描述的显像方法中的任一项提供一种检测用图像的一个剂量。具体剂量可依赖于以下中一个或多个而变化：所选择的具体药剂、所遵循的给药方案、是否与其他化合物组合给予、给予时间、待显像的组织、以及携带它的物理递送系统。
除非另有说明，本发明的实践采用免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA的常规技术，这些在本领域的技能之内。参见萨姆布鲁克(Sambrook)、弗里奇(Fritsch)和马尼亚蒂斯(Maniatis)，《分子克隆：实验室手册》(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL)，第2次编辑(1989)；《当代分子生物学实验手册》(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)(F.M.奥苏贝尔(F.M.Ausubel)等人编辑，(1987))；《酶学方法》(METHODS IN ENZYMOLOGY)系列(学术出版公司)：《PCR 2：实用方法》(PCR 2:A PRACTICAL APPROACH)(M.J.麦克弗森(M.J.MacPherson)、B.D.黑姆斯(B.D.Hames)和G.R.泰勒(G.R.Taylor)编辑(1995))、哈洛(Harlow)和拉内(Lane)编辑(1988)《抗体：实验室手册》(ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL)，以及《动物细胞培养》(ANIMAL CELL CULTURE)(R.I.弗雷谢尼(R.I.Freshney)编辑(1987))。
本发明的若干方面涉及包括一种或多种载体的载体系统，或载体本身。载体可以被设计为用于在原核或真核细胞中表达CRISPR转录物(例如核酸转录物、蛋白质、或酶)。例如，CRISPR转录物可表达于例如大肠杆菌的细菌细胞、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞、或哺乳动物细胞中。适合的宿主细胞进一步讨论于Goeddel(戈德尔)，《基因表达技术：酶学方法》(GENE EXPRESSION TECHNOLOGY:METHODS IN ENZYMOLOGY)185，学术出版社(Academic Press)，圣地亚哥(San Diego)，加利福尼亚州(Calif.)(1990年)中。可替代地，重组表达载体可在体外例如使用T7启动子调节序列和T7聚合酶来转录和翻译。
载体可以被引入原核生物中并且在其中增殖。在一些实施例中，原核生物用来扩增有待引入真核细胞中的载体的多个拷贝，或者作为有待引入真核细胞中的载体的产生中的中间载体(例如，扩增质粒作为病毒载体包装系统的一部分)。在一些实施例中，原核生物用来扩增一个载体的多个拷贝并且表达一种或多种核酸，如提供用于递送到宿主细胞或宿主生物中的一种或多种蛋白质的来源。蛋白质在原核生物中的表达最经常在大肠杆菌中用含有指导融合或非融合蛋白的表达的组成型或诱导型启动子的载体来进行。融合载体将多个氨基酸添加到在其中编码的蛋白质上，如该重组蛋白的氨基端上。这样的融合载体可以用于一个或多个目的，如：(i)增加重组蛋白的表达；(ii)增加重组蛋白的溶解性；以及(iii)通过在亲和纯化中充当配体来辅助重组蛋白的纯化。通常，在融合表达载体中，将蛋白切割位点引入至融合部分与重组蛋白的接合处以使得能够在纯化融合蛋白之后将重组蛋白与融合部分分离。这类酶以及它们的同源识别序列包括因子Xa、凝血酶以及肠激酶。示例性融合表达载体包括pGEX(发玛西亚生物技术有限公司(Pharmacia Biotech Inc)；史密斯和约翰逊，1988，《基因》(Gene)67:31-40)、pMAL(纽英伦生物技术公司(New EnglandBiolabs)，贝弗利(Beverly)，马萨诸塞州(Mass.))以及pRIT5(发玛西亚公司，皮斯卡塔韦(Piscataway)，新泽西州(N.J.))，它们分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或蛋白A融合至靶重组蛋白。
适合的诱导型非融合大肠杆菌表达载体的实例包括pTrc(Amrann(阿姆兰)等人，(1988年)《基因》(Gene)69:301-315)以及pET 11d(Studier(斯图迪尔)等人，《基因表达技术：酶学方法》(GENE EXPRESSION TECHNOLOGY:METHODS IN ENZYMOLOGY)185，学术出版社(Academic Press)，圣地亚哥(San Diego)，加利福尼亚州(Calif.)(1990年)60-89。
在一些实施例中，载体是酵母表达载体。用于在酵母酿酒中表达的载体的实例包括pYepSec1(巴尔戴利(Baldari)等人，1987.《欧洲分子生物学学会杂志》(EMBO J)6:229-234)、pMFa(库尔坚(Kurjan)和赫斯库伍特兹(Herskowitz)，1982.《细胞》(Cell)30:933-943)、pJRY88(舒尔茨(Schultz)等人，1987.《基因》(Gene)54:113-123)、pYES2(InvitrogenCorporation(英杰公司)，San Diego(圣地亚哥)，Calif(加利福尼亚州))、以及picZ(Invitrogen Corp(英杰公司)，San Diego(圣地亚哥)，Calif(加利福尼亚州))。
在一些实施例中，使用杆状病毒载体，载体驱动昆虫细胞中的蛋白质表达。可用于在培养的昆虫细胞(例如，SF9细胞)中表达蛋白质的杆状病毒载体包括pAc系列(史密斯(Smith)等人，1983.《分子细胞生物学》(Mol.Cell.Biol.)3:2156-2165)和pVL系列(拉克瑙(Lucklow)和萨莫斯(Summers)，1989.《病毒学》(Virology)170:31-39)。
在一些实施例中，使用哺乳动物表达载体，载体能够驱动一种或多种序列在哺乳动物细胞中表达。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(锡德(Seed)，1987.《自然》(Nature)329:840)和pMT2PC(考夫曼(Kaufman)等人，1987.《欧洲分子生物学学会杂志》(EMBO J.)6:187-195)。当用于哺乳动物细胞中时，表达载体的控制功能典型地由一种或多种调节元件提供。例如，常用的启动子来源于多瘤、腺病毒2、巨细胞病毒、猴病毒40、以及本文所述和本领域已知的其他病毒。对于用于原核细胞和真核细胞两者的其他适合的表达系统参见例如萨姆布鲁克(Sambrook)等人的《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning：A LaboratoryManual.)(第2版)的第16和第17章，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港(Cold SpringHarbor)，纽约，1989。
在一些实施例中，重组哺乳动物表达载体能够指导核酸优先在特定细胞类型中表达(例如，使用组织特异型调节元件来表达核酸)。组织特异型调节元件是本领域中已知的。适合的组织特异型启动子的非限制性实例包括白蛋白启动子(肝脏特异性的；平克特(Pinkert)等人，1987.《基因发育》(Genes Dev.)1:268-277)，淋巴特异性启动子(卡里曼(Calame)和伊顿(Eaton)，1988.《免疫学进展》(Adv.Immunol)43:235-275)，特别是T细胞受体的启动子(维纳图(Winoto)和巴尔迪莫(Baltimore)，1989.《欧洲分子生物学学会杂志》(EMBO J.)8:729-733)和免疫球蛋白(巴纳吉(Baneiji)等人，1983.《细胞》(Cell)33:729-740；奎恩(Queen)和巴尔迪莫(Baltimore)，1983.《细胞》(Cell)33:741-748)，神经元特异性启动子(例如，神经丝启动子；伯恩(Byrne)和鲁德尔(Ruddle)，1989.《美国科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci USA)86:5473-5477)，胰腺特异性启动子(艾德兰德(Edlund)等人，1985.《科学》(Science)230:912-916)，以及乳腺特异性启动子(例如，乳清启动子；美国专利号4,873,316和欧洲申请公开号264,166)。还涵盖发育型调节启动子，例如，鼠科动物同源框蛋白(hox)启动子凯赛尔((Kessel)和格鲁斯(Gruss)，1990.《科学》(Science)249:374-379)和α-甲胎蛋白启动子(卡姆皮斯(Campes)和蒂尔曼(Tilghman)，1989.《基因发育》(Genes Dev.)3:537-546)。
在一些实施例中，调节元件可操作地连接至CRISPR系统的一个或多个元件，从而驱动该CRISPR系统的该一个或多个元件的表达。一般而言，CRISPR(规律间隔成簇短回文重复)，也称为SPIDR(SPacer间隔开的同向重复)，构成通常对于特定细菌物种而言特异性的DNA基因座的家族。该CRISPR座位包含在大肠杆菌中被识别的间隔开的短序列重复(SSR)的一个不同类(石野(Ishino)等人，《细菌学杂志》(J.Bacteriol.)，169:5429-5433[1987]；和中田(Nakata)等人，《细菌学杂志》(J.Bacteriol.)，171:3553-3556[1989])、以及相关基因。类似的间隔开的SSR已经鉴定于地中海富盐菌(Haloferax mediterranei)、化脓链球菌、鱼腥藻属、和结核分枝杆菌中(参见，格鲁恩(Groenen)等人，《分子微生物学》(Mol.Microbiol.)，10:1057-1065[1993]；霍(Hoe)等人，《新发感染性疾病》(Emerg.Infect.Dis.)，5:254-263[1999]；马斯波尔(Masepohl)等人，《生物化学与生物物理学学报》(Biochim.Biophys.Acta)1307:26-30[1996]；以及莫吉卡(Mojica)等人，《分子微生物学》，17:85-93[1995])。这些CRISPR座位典型地不同于其他SSR的重复结构，这些重复已被称为规律间隔的短重复(SRSR)(詹森(Janssen)等人，《OMICS：整合生物学杂志》(OMICS J.Integ.Biol.)，6:23-33[2002]；以及莫吉卡(Mojica)等人，《分子微生物学》(Mol.Microbiol.)，36:244-246[2000])。一般而言，这些重复是以簇存在的短元件，其被具有基本上恒定长度的独特间插序列规律地间隔开(莫吉卡(Mojica)等人，[2000]，同上)。虽然重复序列在菌株之间是高度保守的，许多间隔开的重复和这些间隔区的序列一般在菌株与菌株之间不同(冯·埃姆登(van Embden)等人，《细菌学杂志》(J.Bacteriol.)，182:2393-2401[2000])。已经在40种以上的原核生物中鉴定出CRISPR座位(参见，例如，詹森(Janssen)等人，《分子微生物学》(Mol.Microbiol.)，43:1565-1575[2002]；以及莫吉卡(Mojica)等人，[2005])，包括但不限于：气火菌属(Aeropyrum)、热棒菌属(Pyrobaculum)、硫化叶菌属(Sulfolobus)、古球菌属(Archaeoglobus)、盐盒菌属(Halocarcula)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、甲烷球菌属(Methanococcus)、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)、甲烷火菌属(Methanopyrus)、焦球菌属(Pyrococcus)、嗜酸菌属(Picrophilus)、热原体属(Thermoplasma)、棒杆菌属(Corynebacterium)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、链霉菌属(Streptomyces)、产水菌属(Aquifex)、紫单胞菌属(Porphyromonas)、绿菌属(Chlorobium)、栖热菌属(Thermus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、利斯特菌属(Listeria)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、梭菌属(Clostridium)、好热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)、支原体属(Mycoplasma)、梭杆菌属(Fusobacterium)、固氮弓菌属(Azarcus)、色杆菌属(Chromobacterium)、奈瑟球菌属(Neisseria)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、地杆菌属(Geobacter)、粘球菌属(Myxococcus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、类杆菌属(Wolinella)、不动杆菌属(Acinetobacter)、欧文菌属(Erwinia)、埃希菌属(Escherichia)、军团菌属(Legionella)、甲基球菌属(Methylococcus)、巴斯德菌属(Pasteurella)、发光细菌属(Photobacterium)、沙门菌属(Salmonella)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、耶尔森菌属(Yersinia)、密螺旋体属(Treponema)、和栖热袍菌属(Thermotoga)。
一般而言，“CRISPR系统”统称为转录物和涉及CRISPR相关(“Cas”)基因的表达或指导其活性的其他元件，包括编码Cas基因的序列、tracr(反式激活CRISPR)序列(例如tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr配对序列(涵盖“同向重复”和在内源CRISPR系统背景下的tracrRNA加工的部分同向重复)、指导序列(在内源CRISPR系统背景下也称为“间隔子(spacer)”)、或来自CRISPR座位的其他序列和转录物。在一些实施例中，CRISPR系统的一个或多个元件来源于I型、II型、或III型CRISPR系统。在一些实施例中，CRISPR系统的一个或多个元件来源于包含内源CRISPR系统的特殊生物，如化脓链球菌。一般而言，CRISPR系统的特征为促进在靶序列的位点处的CRISPR复合物(在内源CRISPR系统的背景下也称为前间区)的形成的元件。在CRISPR复合物形成的背景下，“靶序列”是指指导序列被设计为对其具有互补性的序列，其中在靶序列与指导序列之间的杂交促进CRISPR复合物的形成。完全互补性不是必需的，条件是存在足够互补性以引起杂交并且促进一种CRISPR复合物的形成。一个靶序列可以包含任何多核苷酸，如DNA或RNA多核苷酸。在一些实施例中，靶序列位于细胞的细胞核或细胞质中。在一些实施例中，该靶序列可位于真核细胞的一个细胞器例如线粒体或叶绿体内。可被用于重组到包括该靶序列的靶基因座中的序列或模板被称为“编辑模板”或“编辑多核苷酸”或“编辑序列”。在本发明的方面，外源的模板多核苷酸可被称为编辑模板。在本发明的一个方面，该重组是同源重组。
典型地，在内源CRISPR系统的背景下，CRISPR复合物(包含杂交到靶序列上并且与一种或多种Cas蛋白复合的指导序列)的形成导致在该靶序列中或其附近(例如在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、或更多个碱基对之内)的一条链或两条链的切割。不希望受到理论的束缚，该tracr序列(其可以包含或其组成为野生型tracr序列的全部或部分(例如野生型tracr序列的约或多于约20、26、32、45、48、54、63、67、85个、或更多个核苷酸))也可以形成CRISPR复合物的一部分，如通过沿着该tracr序列的至少一部分杂交到与该指导序列可操作地连接的tracr配对序列的全部或部分上。在一些实施例中，该tracr序列与一个tracr配对序列具有足够的互补性以进行杂交，并参与一种CRISPR复合物的形成。至于该靶序列，据信不需要完全互补性，只要足以具备功能性。在一些实施例中，当最佳比对时，沿着该tracr配对序列的长度，该tracr序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、或99％序列互补性。在一些实施例中，将驱动CRISPR系统的一个或多个元件的表达的一种或多种载体引入到宿主细胞中，使得该CRISPR系统的这些元件的表达在一个或多个靶位点指导CRISPR复合物的形成。例如，Cas酶、连接到tracr配对序列上的指导序列、以及tracr序列可以各自可操作地连接到在分开的载体上的分开的调节元件上。可替代地，从相同或不同调节元件表达的二个或更多个元件可以结合在单个载体中，其中提供该CRISPR系统的任何组分的一种或多种另外的载体不包括在该第一载体中。结合在单个载体中的CRISPR系统元件可以按照任何适合的取向排列，如一个元件相对于第二元件位于5’(“上游”)或3’(“下游”)。一个元件的编码序列可以位于第二元件的编码序列的同一条链或相对链上，并且取向为相同或相对的方向。在一些实施例中，单个启动子驱动编码CRISPR酶的转录物以及该指导序列、tracr配对序列(任选地可操作地连接到该指导序列上)、和嵌入在一个或多个内含子序列之内(例如，各自在不同的内含子中，两个或更多个在至少一个内含子中，或者全部都在单个内含子中)的tracr序列中的一者或多者的表达。在一些实施例中，该CRISPR酶、指导序列、tracr配对序列、和tracr序列可操作地连接到相同的启动子上并且从其表达。SpCas9的单个载体构建体示于图22中。
在一些实施例中，一个载体包含一个或多个插入位点，如限制性核酸内切酶识别序列(也称为“克隆位点”)。在一些实施例中，一个或多个插入位点(例如，约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个、或更多个插入位点)位于一种或多种载体的一个或多个序列元件的上游和/或下游。在一些实施例中，一个载体包含在tracr配对序列的上游、并且任选地在可操作地连接到该tracr配对序列上的调节元件的下游的插入位点，使得在将指导序列插入到该插入位点中之后并且在表达时该指导序列引导CRISPR复合物与真核细胞中的靶序列的序列特异性结合。在一些实施例中，一个载体包含一个或多个插入位点，每个插入位点位于两个tracr配对序列之间，从而允许在每个位点插入指导序列。在这样一种安排中，两个或更多个指导序列可以包含单指导序列的两个或更多个拷贝、两个或更多个不同的指导序列、或这些的组合。当使用多个不同的指导序列时，可以使用单个表达构建体使CRISPR活性靶向到细胞内的多个不同的相应靶序列。例如，单个载体可以包含约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20个、或更多个指导序列。在一些实施例中，可以提供约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个、或更多个这样的含有靶序列的载体，并且任选地将其递送到细胞中。
在一些实施例中，一个载体包含可操作地连接到编码CRISPR酶(如Cas蛋白)的酶编码序列上的调节元件。Cas蛋白的非限制性实例包括：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8，Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、其同系物、或其修饰形式。这些酶是已知的；例如，化脓链球菌Cas9蛋白的氨基酸序列可见于SwissProt数据库登录号Q99ZW2下。在一些实施例中，未修饰的CRISPR酶如Cas9具有DNA切割活性。在一些实施例中，该CRISPR酶是Cas9，并且可以是来自化脓链球菌或肺炎链球菌的Cas9。在一些实施例中，该CRISPR酶指导在靶序列位置处(例如在该靶序列之内和/或在该靶序列的互补物之内)的一条链或两条链的切割。在一些实施例中，该CRISPR酶指导距离靶序列的第一个或最后一个核苷酸约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500个、或更多个碱基对之内的一条链或两条链的切割。在一些实施例中，一个载体编码相对于相应的野生型酶被突变的CRISPR酶，使得该突变的CRISPR酶缺乏切割含有一个靶序列的靶多核苷酸的一条链和两条链的能力。例如，在来自化脓链球菌的Cas9的RuvC I催化结构域中的天冬氨酸到丙氨酸取代(D10A)将Cas9从切割两条链的核酸酶转化成切口酶(切割单条链)。致使Cas9为切口酶的其他突变实例包括而不限于H840A、N854A、和N863A。在本发明的方面，切口酶可以经由同源重组用于基因组编辑。例如，图21显示了经由同源重组的基因组编辑。图21(a)显示了SpCas9切口酶的示意图，具有在RuvC I催化结构域中的D10A突变。(b)示意图,表示使用有义或反义单链寡核苷酸作为修复模板在人EMX1座位处的同源重组(HR)。(c)由HR修饰的区域的序列。(d)对于野生型(wt)和切口酶(D10A)SpCas9介导的在EMX1靶标1座位处的indel而言的SURVEYOR分析(n＝3)。箭头指示预期片段大小的位置。
在一些实施例中，一种Cas9切口酶可与一种或多种指导序列组合使用，例如，两种引导序列，其分别靶向该DNA靶的有义以及反义链。此组合允许两个链被切口并且用以诱导NHEJ。申请人已证明(数据未显示)两种切口酶靶标(即，在相同位置靶向DNA的不同链的sgRNA)在诱导诱变的NHEJ方面的效力。一种单切口酶(具有单个sgRNA的Cas9-D10A)不能够诱导NHEJ并且建立indel，但申请人已经显示，双切口酶(Cas9-D10A以及在相同位置靶向不同链的两个sgRNA)在人胚胎干细胞(hESC)中可以这样做。该效率在hESC中是约50％的核酸酶(即，不具有D10突变的常规Cas9)。
作为一个另外的实例，Cas9的两个或更多个催化结构域(RuvC I、RuvC II、和RuvCIII)可以被突变为产生实质上缺乏所有DNA切割活性的突变的Cas9。在一些实施例中，D10A突变与H840A、N854A、或N863A突变的一者或多者相组合，以便产生实质上缺乏所有DNA切割活性的Cas9酶。在一些实施例中，当该突变的CRISPR酶的DNA切割活性比它的非突变形式低约25％、10％、5％、1％、0.1％、0.01％、或更少时，则该酶被考虑为实质上缺乏所有DNA切割活性。其他突变可能是有用的；其中Cas9或其他CRISPR酶是来自除化脓链球菌外的物种，可产生相应氨基酸的突变以实现类似效果。
在一些实施例中，编码CRISPR酶的酶编码序列经密码子优化，以便在特定的细胞如真核细胞中表达。这些真核细胞可以是特定生物的那些或来源于特定生物，如哺乳动物，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、狗、或非人类灵长动物。一般而言，密码子优化是指通过用在宿主细胞的基因中更频繁地或者最频繁地使用的密码子代替天然序列的至少一个密码子(例如约或多于约1、2、3、4、5、10、15、20、25、50个、或更多个密码子同时维持该天然氨基酸序列而修饰一个核酸序列以便增强在感兴趣宿主细胞中的表达的方法。不同的物种对于具有特定氨基酸的某些密码子展示出特定的偏好。密码子偏好性(在生物之间的密码子使用的差异)经常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，而该翻译效率则被认为依赖于(除其他之外)被翻译的密码子的性质和特定的转运RNA(tRNA)分子的可用性。细胞内选定的tRNA的优势一般反映了最频繁用于肽合成的密码子。因此，可以将基因定制为基于密码子优化在给定生物中的最佳基因表达。密码子利用率表可以容易地获得，例如在密码子使用数据库(“Codon Usage Database”)中，并且这些表可以通过不同的方式调整适用。参见，中村Y.(Nakamura Y.)等人，“从国际DNA序列数据库中制表的密码子使用：2000年的状态”(Codonusage tabulated from the international DNA sequence databases:status for theyear 2000)《核酸研究》(Nucl.Acids Res.)28:292(2000年)。用于密码子优化特定的序列以便在特定的宿主细胞中表达的计算机算法也是可得的，如基因制造(Gene Forge)(Aptagen公司；雅各布斯(Jacobus)，PA)，也是可得的。在一些实施例中，在编码CRISPR酶的序列中的一个或多个密码子(例如1、2、3、4、5、10、15、20、25、50个、或更多个、或所有密码子)相应于对于特定氨基酸最频繁使用的密码子。
一般而言，指导序列是与靶多核苷酸序列具有足够互补性以便与该靶序列杂交并且指导CRISPR复合物与该靶序列的序列特异性结合的任何多核苷酸序列。在一些实施例中，当使用适合的比对算法进行最佳比对是，在指导序列与其相应的靶序列之间的互补程度是约或多于约50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％、或更多。可以使用用于比对序列的任何适合的算法来确定最佳比对，其非限制性实例包括史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)算法、尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法、基于伯罗斯-惠勒变换(Burrows-Wheeler Transform)的算法(例如伯罗斯-惠勒比对工具(Burrows WheelerAligner))、ClustalW、Clustal X、BLAT、Novoalign(Novocraft技术公司)、ELAND(亿明达公司(Illumina)，圣地亚哥，加利福尼亚州)、SOAP(在soap.genomics.org.cn可获得)、以及Maq(在maq.sourceforge.net可获得)。在一些实施例中，指导序列在长度上为约或多于约5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75个、或更多个核苷酸。在一些实施例中，一个指导序列在长度上为少于约75、50、45、40、35、30、25、20、15、12个、或更少的核苷酸。可以通过任何适合的测定法来评估指导序列指导CRISPR复合物与靶序列的序列特异性结合的能力。例如，足以形成CRISPR复合物的CRISPR系统的组分，包括有待测试的指导序列在内，可以例如通过用编码该CRISPR序列的组分的载体进行转染而被提供到具有相应靶序列的宿主细胞中，随后通过如本文所述的测量员测定来评估在该靶序列之内的优先切割。类似地，通过提供该靶序列、包括有待测试的指导序列在内的CRISPR复合物的组分、和不同于该测试指导序列的对照指导序列，并且比较在该测试指导序列与该对照指导序列反应之间的靶序列处的结合或切割率，可以在一个试管中评估靶多核苷酸序列的切割。其他测定法是可能的，并且将由本领域技术人员想到。
指导序列可以被选择为靶向任何靶序列。在一些实施例中，该靶序列是在细胞的基因组内的序列。示例性靶序列包括在靶基因组中为独特的那些。例如，对于化脓链球菌Cas9，在基因组中的独特靶序列可以包括形式MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGG的Cas9靶位点，其中NNNNNNNNNNNNXGG(N是A、G、T、或C；并且X可以是任何物)在该基因组中单次出现。在基因组中的独特靶序列可以包括形式MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXGG的化脓链球菌Cas9靶位点，其中NNNNNNNNNNNXGG(N是A、G、T、或C；并且X可以是任何物)在该基因组中单次出现。对于嗜热链球菌CRISPR1Cas9，在基因组中的独特靶序列可以包括形式MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXXAGAAW(SEQ ID NO:1)的Cas9靶位点，其中NNNNNNNNNNNNXXAGAAW(SEQ ID NO:2)(N是A、G、T、或C；X可以是任何物；并且W是A或T)在该基因组中单次出现。在基因组中的独特靶序列可以包括形式MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXXAGAAW(SEQ ID NO:3)的嗜热链球菌CRISPR1Cas9靶位点，其中NNNNNNNNNNNXXAGAAW(SEQ ID NO:4)(N是A、G、T、或C；X可以是任何物；并且W是A或T)在该基因组中单次出现。对于化脓链球菌Cas9，在基因组中的独特靶序列可以包括形式MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGGXG的Cas9靶位点，其中NNNNNNNNNNNNXGGXG(N是A、G、T、或C；并且X可以是任何物)在该基因组中单次出现。在基因组中的独特靶序列可以包括形式MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXGGXG的化脓链球菌Cas9靶位点，其中NNNNNNNNNNNXGGXG(N是A、G、T、或C；并且X可以是任何物)在该基因组中单次出现。在这些序列的每一个中，“M”可以是A、G、T、或C，并且在序列鉴定中不必考虑为是独特的。
在一些实施例中，指导序列被选择为降低在该指导序列内的二级结构程度。可以通过任何适合的多核苷酸折叠算法来确定二级结构。一些算法是基于计算最小吉布斯(Gibbs)自由能。一种这样的算法的实例是mFold，正如祖克(Zuker)和施蒂格勒(Stiegler)《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)9(1981)，133-148)所描述。折叠算法的另一个实例是使用由维也纳大学(University of Vienna)的理论化学研究所(Institute forTheoretical Chemistry)研发的在线网络服务器RNAfold(参见例如A.R.格鲁伯(A.R.Gruber)等人，2008，《细胞》(Cell)106(1):23-24；以及PA卡尔(PA Carr)和GM丘奇(GMChurch)，2009，《自然生物技术》(Nature Biotechnology)27(12):1151-62)。另外的算法可以发现于通过引用结合在此的美国申请序列号61/836,080(代理人案号44790.11.2022；博德参考号BI-2013/004A)中。
一般而言，tracr配对序列包括与tracr序列具有足够互补性以促进下列一项或多项的任何序列：(1)在含有相应tracr序列的细胞中的侧翼为tracr配对序列的指导序列的切除；以及(2)在靶序列处的CRISPR复合物的形成，其中该CRISPR复合物包含杂交到tracr序列上的tracr配对序列。通常，互补程度是就tracr配对序列与tracr序列沿着这两个序列的较短者的长度的最佳比对而言。可以通过任何适合的比对算法来确定最佳比对，并且可以可以进一步对二级结构做出解释，如在该tracr序列或tracr配对序列之内的自我互补性。在一些实施例中，在进行最佳比对时，在该tracr序列与tracr配对序列之间沿着这两者的较短者的长度的互补程度是约或多于约25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97.5％、99％、或更高。图10B以及11B中提供了一个tracr序列以及一个tracr配对序列之间的最佳比对的实例说明。在一些实施例中，该tracr序列在长度上为约或多于约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50个、或更多个核苷酸。在一些实施例中，该tracr序列和tracr配对序列被包含在单个转录物中，使得在这两者之间的杂交产生具有二级结构(如发夹)的转录物。用于在发夹结构中使用的优选环形成序列在长度上为四个核苷酸，并且最优选地具有序列GAAA。然而，可以使用更长或更短的环序列，正如可替代的序列。这些序列优选地包括三联体(例如，AAA)、和另外的核苷酸(例如C或G)。环形成序列的实例包括CAAA和AAAG。在本发明的一个实施例中，该转录物或转录的多核苷酸序列具有至少两个或更多个发夹。在优选的实施例中，该转录物具有两个、三个、四个或五个发夹。在本发明的一个另外的实施例中，该转录物具有至多五个发夹。在一些实施例中，该单个转录物进一步包括一种转录终止序列；优选地这是一个polyT序列，例如六个T的核苷酸。图11B中的下面部分中提供了这样的发夹结构的实例说明，其中最终“N”的序列5’的部分以及环的上游对应于该tracr配对序列，并且该环的序列3’的部分对应于该tracr序列。另外的包含指导序列、tracr配对序列、和tracr序列的单个多核苷酸的非限制性实例如下(列出为5’到3’)，其中“N”代表指导序列的碱基，小写字体的第一区代表tracr配对序列，且小写字体的第二区代表tracr序列，并且该最后的多聚T序列代表转录终止子：(1)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaagatttaGAAAtaaatcttgcagaagctacaaagataaggcttcatgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgttttcgttatttaaTTTTTT(SEQ ID NO:5)；(2)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaGAAAtgcagaagctacaaagataaggcttcatgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgttttcgttatttaaTTTTTT(SEQ ID NO:6)；(3)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaGAAAtgcagaagctacaaagataaggcttcatgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgtTTTTTT(SEQ ID NO:7)；(4)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAAtagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcTTTTTT(SEQ ID NO:8)；(5)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAATAGcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtgTTTTTTT(SEQ ID NO:9)；以及(6)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctagAAATAGcaagttaaaataaggctagtccgttatcaTTTTTTTT(SEQ ID NO:10)。在一些实施例中，序列(1)到(3)与来自嗜热链球菌CRISPR1的Cas9结合使用。在一些实施例中，序列(4)到(6)与来自化脓链球菌CRISPR1的Cas9结合使用。在一些实施例中，该tracr序列是一个与包含该tracr配对序列的转录物分开的转录物(例如在图11B的顶部部分中所示的)。
在一些实施例中，该CRISPR酶是包含一个或多个异源蛋白结构域(例如除了该CRISPR酶之外的约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个、或更多个结构域)的融合蛋白的一部分。CRISPR酶融合蛋白可以包含任何其他蛋白质，以及任选地在任何两个结构域之间的连接序列。可以融合到CRISPR酶上的蛋白质结构域的实例包括但不限于，表位标签、报告基因序列、以及具有下列活性的一者或多者的蛋白质结构域：甲基酶活性、脱甲基酶活性、转录激活活性、转录阻抑活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、RNA切割活性和核酸结合活性。表位标签的非限制性实例包括组氨酸(His)标签、V5标签、FLAG标签、流感病毒血凝素(HA)标签、Myc标签、VSV-G标签、和硫氧还蛋白(Trx)标签。报告基因的实例包括，但不限于，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、辣根过氧化物酶(HRP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、HcRed、DsRed、青荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、以包括蓝色荧光蛋白(BFP)的自发荧光蛋白。CRISPR酶可以融合到编码一种蛋白质或蛋白质片段的基因序列上，所述蛋白质或蛋白质片段结合DNA分子或结合其他细胞分子，其包括，但不限于，麦芽糖结合蛋白(MBP)、S-tag、Lex A DNA结合结构域(DBD)融合物、GAL4DNA结合结构域融合物、以及单纯疱疹病毒(HSV)BP16蛋白融合物。可以形成包含CRISPR酶的融合蛋白的一部分的另外的结构域描述于US 20110059502中，通过引用将其并入本文。在一些实施例中，使用标记的CRISPR酶来鉴定靶序列的位置。
在本发明的一个方面，可以将一种报告基因引入细胞中，以编码充当测量基因产物的表达的改变或修饰的标记物的基因产物，该报告基因包括但不限于谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、辣根过氧化物酶(HRP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、HcRed、DsRed、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)以及自体荧光蛋白(包括蓝色荧光蛋白(BFP))。在本发明的一个另外的实施例中，可以经由载体将编码该基因产物的DNA分子引入该细胞中。在本发明的一个优选实施例中，该基因产物是荧光素酶。在本发明的一个另外的实施例中，该基因产物的表达被降低。
在一些方面，本发明提供了以下方法，这些方法包括向宿主细胞递送一种或多种多核苷酸，如或如在此描述的一种或多种载体、其一种或多种转录本和/或一种或多种自其转录的蛋白。本发明充当一种使得可以靶向修饰基于DNA的基因组的基础平台。它可以多种递送系统配合，包括但不限于病毒、脂质体、电穿孔、显微注射以及缀合。在一些方面，本发明进一步提供了通过这样的方法产生的细胞以及包括这样的细胞或由这样的细胞产生的生物体(例如动物、植物、或真菌)。在一些实施例中，将与(并且任选地与其复合)指导序列组合的CRISPR酶递送至细胞。可以使用常规的病毒和非病毒基的基因转移方法将核酸引入哺乳动物细胞或靶组织中。可以使用这样的方法向培养物中或宿主生物中的细胞给予编码CRISPR系统的组分的核酸。非病毒载体递送系统包括DNA质粒、RNA(例如在此描述的载体的转录本)、裸核酸以及与递送赋形剂(如脂质体)复合的核酸。病毒载体递送系统包括DNA和RNA病毒，在被递送至细胞后它们具有游离型或整合型基因组。关于基因疗法程序的综述，参见安德森(Anderson)，《科学》(Science)256:808-813(1992)；纳贝尔(Nabel)&费尔格纳(Felgner)，TIBTECH 11:211-217(1993)；三谷(Mitani)&卡斯基(Caskey)，TIBTECH 11:162-166(1993)；狄龙(Dillon)，TIBTECH 11:167-175(1993)；米勒(Miller)，《自然》(Nature)357:455-460(1992)；范·布朗特(Van Brunt)，《生物技术》(Biotechnology)6(10):1149-1154(1988)；维涅(Vigne)，《恢复神经学和神经科学》(Restorative Neurologyand Neuroscience)8:35-36(1995)；克雷默(Kremer)&佩里科德特(Perricaudet)，《英国医学公报》(British Medical Bulletin)51(1):31-44(1995)；哈嗒嗒(Haddada)等人，在《微生物学和免疫学当前主题》(Current Topics in Microbiology and Immunology)中多尔夫勒(Doerfler)和博姆()(编辑)(1995)；以及余(Yu)等人，《基因疗法》(GeneTherapy)1:13-26(1994)。
核酸的非病毒递送方法包括脂转染、核转染、显微注射、基因枪、病毒颗粒、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质：核酸共轭物、裸DNA、人工病毒体以及DNA的试剂增强性摄取。脂转染描述于例如美国专利号5,049,386、4,946,787和4,897,355中并且脂转染试剂是市售的(例如，TransfectamTM和LipofectinTM)。适于多核苷酸的有效的受体识别脂转染的阳离子和中性脂质包括Felgner(费尔格纳)，WO 91/17424；WO 91/16024的那些。递送可以针对细胞(例如体外或离体给予)或靶组织(例如体内给予)。
脂质:核酸复合物(包括靶向的脂质体，如免疫脂质复合物)的制备是本领域的技术人员熟知的(参见例如，克丽丝特尔(Crystal)，《科学》(Science)270:404-410(1995)；布莱泽(Blaese)等人，《癌症基因疗法》(Cancer Gene Ther.)2:291-297(1995)；贝尔(Behr)等人，《生物共轭化学》(Bioconjugate Chem.)5:382-389(1994)；雷米(Remy)等人，《生物共轭化学》5:647-654(1994)；高(Gao)等人，《基因疗法》(Gene Therapy)2:710-722(1995)；艾哈迈德(Ahmad)等人，《癌症研究》(Cancer Res.)52:4817-4820(1992)；美国专利号4,186,183、4,217,344、4,235,871、4,261,975、4,485,054、4,501,728、4,774,085、4,837,028以及4,946,787)。
使用RNA或DNA病毒基的系统递送核酸利用将病毒靶向体内的特定细胞并将病毒有效负荷(payload)运至细胞核中的高度进化的过程。可以将病毒载体直接给予至患者(体内)或可以使用它们在体外处理细胞，并且任选地，可以将修饰的细胞给予至患者(离体)。常规的病毒基的系统可以包括用于基因转移的逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体以及单纯疱疹病毒载体。用逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒基因转移方法整合进宿主基因组中是可能的，这通常导致插入转基因的长期表达。另外，已经在不同细胞类型和靶组织中观察到高转导效率。
可以通过掺入外源包膜蛋白，扩展靶细胞的潜在靶群而改变逆转录病毒的向性。慢病毒载体是能够转导或感染非分裂细胞并典型地产生较高病毒效价的逆转录病毒载体。因此，逆转录病毒基因转移系统的选择将依赖于靶组织。逆转录病毒载体由顺式作用长末端重复组成，这些长末端重复具有包装多达6-10kb的外源序列的能力。最低量的顺式作用LTR对于载体的复制和包装而言是足够的，然后使用这些载体将治疗基因整合进靶细胞中，以提供永久的转基因表达。广泛使用的逆转录病毒载体包括基于鼠白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)及其组合的那些(参见例如，布赫谢尔(Buchscher)等人，《病毒学杂志》(J.Virol.)66:2731-2739(1992)；约翰(Johann)等人，《病毒学杂志》66:1635-1640(1992)；佐姆内尔费尔特(Sommnerfelt)等人，《病毒学》(Virol.)176:58-59(1990)；威尔逊(Wilson)等人，《病毒学杂志》63:2374-2378(1989)；米勒(Miller)等人，《病毒学杂志》65:2220-2224(1991)；PCT/US 94/05700)。在瞬时表达是优选的应用中，可以使用腺病毒基系统。腺病毒基载体在许多细胞类型中能够具有非常高的转导效并且无需细胞分裂。用这样的载体，已经获得了较高的效价和表达水平。可以在相对简单的系统中大量地产生此载体。还可以使用腺相关病毒(“AAV”)载体转导具有靶核酸的细胞，例如，在体外产生核酸和肽，以及用于体内和离体基因疗法程序(参见例如，韦斯特(West)等人，《病毒学》(Virology)160:38-47(1987)；美国专利号4,797,368；WO 93/24641；科丁(Kotin)，《人类基因疗法》(Human Gene Therapy)5:793-801(1994)；缪斯科斯卡(Muzyczka)，《临床研究杂志》(J.Clin.Invest.)94:1351(1994))。重组AAV载体的构建描述于多个出版物中，包括美国专利号5,173,414；特拉特斯金(Tratschin)等人，《分子与细胞生物学》(Mol.Cell.Biol.)5:3251-3260(1985)；特拉特斯金等人，《分子与细胞生物学》4:2072-2081(1984)；埃尔莫奈特(Hermonat)&缪斯科斯卡(Muzyczka)，《美国国家科学院院刊》(PNAS)81:6466-6470(1984)；以及萨穆尔斯基(Samulski)等人，《病毒学杂志》(J.Virol.)63:03822-3828(1989)。
典型地使用包装细胞形成能够感染宿主细胞的病毒粒子。这样的细胞包括包装腺病毒的293细胞和包含逆转录病毒的ψ2细胞或PA317细胞。在基因疗法中使用的病毒载体通常由将核酸载体包装进病毒粒子的细胞系产生。这些载体典型地包含包装并且随后整合进宿主所需的最低量序列，其他病毒序列由用于有待表达的一个或多个多核苷酸的表达盒替换。失去的病毒功能典型地由包装细胞系反式地提供。例如，在基因疗法中使用的AAV载体典型地仅具有来自AAV基因组的ITR序列，这些序列为包装并整合进宿主基因组所需。将病毒DNA包装进以下细胞系中，该细胞系包含编码辅助质粒的其他AAV基因，即rep和cap，但缺少ITR序列。该细胞系还可以被作为辅助者的腺病毒感染。该辅助病毒促进AAV载体的复制和从辅助质粒表达AAV基因。由于缺少ITR序列，未以显著的量包装该辅助质粒。可以通过例如与AAV相比腺病毒更加敏感的热处理减少腺病毒的污染。用于将核酸递送至细胞的另外的方法是本领域的技术人员已知的。参见例如通过引用结合在此的US 20030087817。
在一些实施例中，用一种或多种在此描述的载体瞬时地或非瞬时地转染宿主细胞。在一些实施例中，当细胞天然地出现在受试者体内时将其转染。在一些实施例中，被转染的细胞取自受试者。在一些实施例中，该细胞来源于取自受试者的细胞，如细胞系。用于组织培养的多种多样的细胞系在本领域是已知的。细胞系的实例包括但不限于，C8161、CCRF-CEM、MOLT、mIMCD-3、NHDF、HeLa-S3、Huh1、Huh4、Huh7、HUVEC、HASMC、HEKn、HEKa、MiaPaCell、Panc1、PC-3、TF1、CTLL-2、C1R、Rat6、CV1、RPTE、A10、T24、J82、A375、ARH-77、Calu1、SW480、SW620、SKOV3、SK-UT、CaCo2、P388D1、SEM-K2、WEHI-231、HB56、TIB55、Jurkat、J45.01、LRMB、Bcl-1、BC-3、IC21、DLD2、Raw264.7、NRK、NRK-52E、MRC5、MEF、Hep G2、海拉B、海拉T4、COS、COS-1、COS-6、COS-M6A、BS-C-1猴肾上皮细胞、BALB/3T3小鼠胚胎成纤维细胞、3T3Swiss、3T3-L1、132-d5人类胎儿成纤维细胞；10.1小鼠成纤维细胞、293-T、3T3、721、9L、A2780、A2780ADR、A2780cis、A172、A20、A253、A431、A-549、ALC、B16、B35、BCP-1细胞、BEAS-2B、bEnd.3、BHK-21、BR 293、BxPC3、C3H-10T1/2、C6/36、Cal-27、CHO、CHO-7、CHO-IR、CHO-K1、CHO-K2、CHO-T、CHO Dhfr-/-、COR-L23、COR-L23/CPR、COR-L23/5010、COR-L23/R23、COS-7、COV-434、CML T1、CMT、CT26、D17、DH82、DU145、DuCaP、EL4、EM2、EM3、EMT6/AR1、EMT6/AR10.0、FM3、H1299、H69、HB54、HB55、HCA2、HEK-293、HeLa、Hepa1c1c7、HL-60、HMEC、HT-29、Jurkat、JY细胞、K562细胞、Ku812、KCL22、KG1、KYO1、LNCap、Ma-Mel 1-48、MC-38、MCF-7、MCF-10A、MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-435、MDCK II、MDCK II、MOR/0.2R、MONO-MAC 6、MTD-1A、MyEnd、NCI-H69/CPR、NCI-H69/LX10、NCI-H69/LX20、NCI-H69/LX4、NIH-3T3、NALM-1、NW-145、OPCN/OPCT细胞系、Peer、PNT-1A/PNT 2、RenCa、RIN-5F、RMA/RMAS、Saos-2细胞、Sf-9、SkBr3、T2、T-47D、T84、THP1细胞系、U373、U87、U937、VCaP、维洛(Vero)细胞、WM39、WT-49、X63、YAC-1、YAR及其转基因变种。细胞系可获得自本领域的技术人员已知的多种来源(参见例如，美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)(马纳萨斯(Manassus)，弗吉尼亚州))。在一些实施例中，使用用一种或多种在此描述的载体转染的细胞建立新的细胞系，该新的细胞系包括一种或多种载体来源的序列。在一些实施例中，使用用如在此描述的CRISPR系统的组分转染(如通过用一种或多种载体进行瞬时转染或用RNA进行转染)且通过CRISPR复合物的活性修饰的细胞建立新的细胞系，该新的细胞系包括以下细胞，这些细胞包含吸水但是缺少任何其他外源序列。在一些实施例中，在评估一种或多种测试化合物中使用用一种或多种在此描述的载体瞬时或非瞬时转染的细胞或来源于这样的细胞的细胞系。
本发明的方面涉及产生用于研究疾病的遗传变异的哺乳动物细胞的等基因系。本发明的一个另外的方面涉及产生转基因的或病毒介导的递送的基因修饰的动物模型。本发明还包括用于产生在生物医学、农业和工业上有用的产品的微生物、细胞、植物、动物或合成的生物的基因组修饰。在仍另一个方面，本发明包括基因疗法。可以将本发明用作生物学研究工具，用于理解基因组，例如基因敲除研究。本发明涉及许多其他方法和组合物，这些方法和组合物依赖于基础编辑能力和重写基因组的DNA成分以及基于DNA的生物的靶向失活。本发明还可以用作治疗，用于靶向细菌感染、病毒感染等的具体菌株。
在一些实施例中，使用一种或多种在此描述的载体产生非人转基因动物或转基因植物。在一些实施例中，该转基因动物是一种哺乳动物，如小鼠、大鼠或兔。在某些实施例中，该生物体或受试者是植物。在某些实施例中，该生物体或受试者或植物是藻类。用于产生转基因植物和动物的方法在本领域是已知的，并且通常以如在此描述的细胞转染方法开始。还提供了转基因动物，正如转基因植物一样，尤其是作物和藻类。转基因动物或植物可用于在除了提供疾病模型之外的应用中。通过表达例如比通常在野生型中可见的更高的蛋白质、碳水化合物、营养素或维生素水平，这些应用可包括食物或饲料生产。在这方面，转基因植物，尤其是豆类和块茎类，以及动物，尤其是哺乳动物，如家畜(奶牛、绵羊、山羊和猪)，而且还有禽类和食用昆虫，是优选的。
转基因藻类或其他植物，如油菜，可以在植物油或生物燃料例如像醇类(尤其是甲醇和乙醇)的生产中特别有用。这些可以被工程化为表达或过表达高水平的油或醇类，以供在油或生物燃料行业中使用。
在一个方面，本发明提供了修饰真核细胞中的靶多核苷酸的方法，这些方法可以在体内、离体或在体外。在一些实施例中，该方法包括从人或非人动物或植物(包括微藻)取样细胞或细胞群，并且修饰该细胞或这些细胞。培养可以发生在离体的任何阶段。该细胞或这些细胞甚至可以被重新引入该非人动物或植物(包括微藻)中。
在一个方面，本发明提供了用于修饰在一种真核细胞中的靶多核苷酸的方法。在一些实施例中，该方法包括允许一种CRISPR复合物结合到该靶多核苷酸上以实施所述靶多核苷酸的切割，由此修饰该靶多核苷酸，其中该CRISPR复合物包括与杂交到在所述靶多核苷酸内的一个靶序列上的指导序列复合的CRISPR酶，其中所述指导序列连接到一种tracr配对序列上，该tracr配对序列进而杂交到一种tracr序列上。
在一个方面，本发明提供了修饰一种多核苷酸在真核细胞中的表达的方法。在一些实施例中，该方法包括允许一种CRISPR复合物结合到该多核苷酸上，这样使得所述结合导致所述多核苷酸的表达增加或降低；其中该CRISPR复合物包括与杂交到在所述多核苷酸内的一个靶序列上的指导序列复合的CRISPR酶，其中所述指导序列连接到一种tracr配对序列上，该tracr配对序列进而杂交到一种tracr序列上。
随着作物基因组学的最新进展，使用CRISPR-Cas系统进行有效且符合成本效益的基因编辑和操纵的能力将允许快速选择并比较单个和多元遗传操作，以转化这样的基因组，以便改善生产并增强性状。在此方面，参考美国专利和出版物：美国专利号6,603,061-农杆菌介导的植物转化法(Agrobacterium-Mediated Plant Transformation Method)；美国专利号7,868,149-植物基因组序列及其用途(Plant Genome Sequences and UsesThereof)以及US 2009/0100536-转具有增强的农艺性状的基因植物(Transgenic Plantswith Enhanced Agronomic Traits)，将每者的所有内容和披露通过引用以其全文结合在此。在本发明的实践中，莫雷尔(Morrell)等人“作物基因组学：进展与应用(Cropgenomics:advances and applications)”《遗传学自然评论》(Nat Rev Genet.)2011年12月29日；13(2):85-96的内容和披露也通过引用以其全文结合在此。
在植物中，病原体常常是宿主特异性的。例如，番茄尖镰孢菌番茄专化型(Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici)引起番茄枯萎病，而且只攻击番茄，并且香石竹尖镰孢禾柄锈菌小麦专化型(F.oxysporum f.dianthii Puccinia graminisf.sp.tritici)只攻击小麦。植物具有抵抗大多数病原体的现有的和诱导性的防御。跨植物代的突变和重组事件导致产生敏感性的遗传变异性，特别是当病原体以比植物更高的频率繁殖时。在植物中可以存在非宿主抗性，例如，该宿主和病原体是不相容的。还可以存在水平抗性，例如典型地由许多基因控制的针对所有种的病原体的部分抗性，以及垂直抗性，例如典型地由很少的基因控制的针对病原体的某些种而不是其他种的完全抗性。在基因对基因水平中，植物和病原体一起演化，并且在一者中的遗传变化使在另一者中的变化平衡。因此，使用自然变异，育种者针对产率、质量、均匀性、耐性、抗性将最有用的基因进行结合。抗性基因的来源包括天然或外来品种、传家宝品种(Heirloom Varieties)、近缘野生植物、以及诱导的突变，例如用诱变剂处理植物材料。利用本发明，向植物育种者提供了一种新的诱导突变的工具。因此，本领域的技术人员可以分析抗性基因的来源的基因组，并且在具有所希望的特征或性状的品种方面，采用本发明来诱导抗性基因的发生，这样具有比先前的诱变剂更好的精确性，并且因此加速并改良植物育种计划。
在一个方面，本发明提供了以下试剂盒，这些试剂盒包含披露于以上方法和组合物中的元件中的任何一个或多个。在一些实施例中，该试剂盒包括一种载体系统以及用于使用该试剂盒的说明书。在一些实施例中，该载体系统包括：(a)一种第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接到一种tracr配对序列以及用于在该tracr配对序列的上游插入一种指导序列的一个或多个插入位点，其中当表达时，该指导序列引导CRISPR复合物在真核细胞中与一个靶序列的序列特异性结合，其中该CRISPR复合物包括与以下各项复合的一种CRISPR酶：(1)杂交到该靶序列的指导序列，以及(2)杂交到该tracr序列的tracr配对序列；和/或(b)一种第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接到编码所述CRISPR酶的酶编码序列,所述CRISPR酶包括核定位序列的。元件可以单独地或组合地提供，并且可以被提供于任何适合的容器中，如小瓶、瓶子或管。在一些实施例中，该试剂盒包括一种或多种语言，例如多于一种语言的说明书。
在一些实施例中，试剂盒包括一种或多种用于在利用在此描述的元件中的一种或多种的方法中使用的试剂。试剂可以被提供于任何适合的容器中。例如，试剂盒可以提供一种或多种反应或存储缓冲液。可以按在具体测定中可用的形式或按在使用之前需要添加一种或多种其他组分的形式(例如按浓缩或冻干形式)提供试剂。缓冲液可以是任何缓冲液，包括但不限于碳酸钠缓冲液、碳酸氢钠缓冲液、硼酸盐缓冲液、Tris缓冲液、MOPS缓冲液、HEPES缓冲液及其组合。在一些实施例中，该缓冲液是碱性的。在一些实施例中，该缓冲液具有从约7至约10的pH。在一些实施例中，该试剂盒包括一个或多个寡核苷酸，该一个或多个寡核苷酸对应于一个用于插入进载体中的指导序列，以便可操作地连接该指导序列和一个调节元件。在一些实施例中，该试剂盒包括一个同源重组模板多核苷酸。
在一个方面，本发明提供了用于使用CRISPR系统的一个或多个元件的方法。本发明的CRISPR复合物提供了用于修饰靶多核苷酸的有效手段。本发明的CRISPR复合物具有多种多样的实用性，包括修饰(例如，缺失、插入、转位、失活、激活)多种细胞类型中的靶多核苷酸。正因为如此，本发明的CRISPR复合物在例如基因疗法、药物筛选、疾病诊断以及预后中具有广阔的应用谱。示例性CRISPR复合物包括与一种指导序列复合的CRISPR酶，该指导序列与靶多核苷酸内的靶序列杂交。该指导序列与一种tracr配对序列连接，该tracr配对序列进而与一种tracr序列杂交。
CRISPR复合物的靶多核苷酸可以是对真核细胞而言内源或外源的任何多核苷酸。例如，该靶多核苷酸可以是一种驻留在真核细胞的细胞核中的多核苷酸。该靶多核苷酸可以是一个编码基因产物(例如，蛋白质)的序列或一个非编码序列(例如，调节多核苷酸或无用DNA)。不希望被理论所束缚，据信该靶序列应该与PAM(原型间隔子邻近基序)相关；也就是说，与由CRISPR复合物识别的短序列相关。对PAM的精确序列和长度要求取决于使用的CRISPR酶而不同，但是PAM典型地是临近原型间隔子(也就是说，靶序列)的2-5个碱基对序列。在以下实例部分中给出PAM序列的实例，并且熟练人员将能够鉴定与给定的CRISPR酶一起使用的另外的PAM序列。
CRISPR复合物的靶多核苷酸可以包括多个疾病相关基因和多核苷酸以及信号传导生化途径相基因和多核苷酸，如分别提交于2012年12月12日和2013年1月2日、标题均为用于序列操纵的系统方法和组合物(SYSTEMS METHODS AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCEMANIPULATION)的分别具有博德(Broad)参考号BI-2011/008/WSGR案卷号44063-701.101和BI-2011/008/WSGR案卷号44063-701.102的美国临时专利申请61/736,527和61/748,427中所列举，将所有这些申请的内容通过引用以其全文结合在此。
靶多核苷酸的实例包括与信号传导生化途径相关的序列，例如信号传导生化途径相关基因或多核苷酸。靶多核苷酸的实例包括疾病相关基因或多核苷酸。“疾病相关”基因或多核苷酸是指与非疾病对照的组织或细胞相比，在来源于疾病影响的组织的细胞中以异常水平或以异常形式产生转录或翻译产物的任何基因或多核苷酸。在改变的表达与疾病的出现和/或进展相关的情况下，它可以是一个以异常高的水平被表达的基因；它可以是一个以异常低的水平被表达的基因。疾病相关基因还指具有一个或多个突变或直接负责或与一个或多个负责疾病的病因学的基因连锁不平衡的遗传变异的基因。转录的或翻译的产物可以是已知的或未知的，并且可以处于正常或异常水平。
疾病相关基因和多核苷酸的实例可获得自约翰斯·霍普金斯大学的麦考斯克-纳森遗传医学研究所(McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine,Johns HopkinsUniversity)(巴尔的摩，马里兰州)和国立医学图书馆的国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information,National Library of Medicine)(贝塞斯达，马里兰州)。
疾病相关基因和多核苷酸的实例列于表A和B中。在万维网上可获得的疾病具体信息可获得自约翰斯·霍普金斯大学的麦考斯克-纳森遗传医学研究所(McKusick-NathansInstitute of Genetic Medicine,Johns Hopkins University)(巴尔的摩，马里兰州)和国立医学图书馆的国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation,National Library of Medicine)(贝塞斯达，马里兰州)。信号传导生化途径相关基因和多核苷酸的实例列于表C中。
这些基因和途径的突变可以导致产生不当的蛋白质或以不当的量影响功能的蛋白质。通过引用而特此结合来自2012年12月12日提交的美国临时申请61/736,527和2013年1月2日提交的61/748,427的基因、疾病和蛋白质的另外的实例。这样的基因、蛋白质和途径可以是CRISPR复合物的靶多核苷酸。
表A
表B：
表C：
本发明的实施例还涉及与敲除基因、扩增基因以及修复与DNA重复不稳定性和神经障碍相关的具体突变有关的方法和组合物(罗伯特D.·威尔斯(Robert D.Wells)、芦沢哲夫(Tetsuo Ashizawa)，遗传不稳定性与神经疾病(Genetic Instabilities andNeurological Diseases)，第二版，学术出版社(Academic Press)，2011年10月13日-《医学》(Medical))。已经发现串联重复序列的特定方面对超过二十种人类疾病负责(重复不稳定新见：RNA·DNA杂交体的作用(New insights into repeat instability:role ofRNA·DNA hybrids)，麦基弗EI(McIvor EI)、波拉克U(Polak U)、纳皮尔拉拉M(NapieralaM)，《RNA生物学》(RNA Biol.)2010年9月-10月；7(5):551-8)。可以利用CRISPR-Cas系统修正基因组不稳定性缺陷。
本发明的一个另外的方面涉及利用CRISPR-Cas系统修正EMP2A和EMP2B基因缺陷，这些基因已经被鉴定为与拉福拉病(Lafora disease)相关。拉福拉病是一种由可以作为青年期的癫痫发作而开始的进行性肌阵挛性癫痫表征的常染色体隐性病症。该疾病的少数病可以由尚未鉴定的基因的突变引起。该疾病引起发作、肌肉痉挛、行走困难、痴呆，并且最终引起死亡。当前没有疗法被证明有效对抗疾病进展。与癫痫相关的其他遗传异常还可以靶向CRISPR-Cas系统并且基础遗传学进一步描述于由朱利亚诺阿文济尼(GiulianoAvanzini)、杰弗里L.诺贝尔斯(Jeffrey L.Noebels)编辑的《癫痫与遗传癫痫遗传学》(Genetics of Epilepsy and Genetic Epilepsies)，马里亚尼儿科神经学基金会(Mariani Foundation Paediatric Neurology)：20；2009)中。
在本发明的又另一个方面，该CRISPR-Cas系统可以用来矫正几种基因突变引起的眼部缺陷，其进一步描述于《眼的遗传疾病》(Genetic Diseases of the Eye)，第二次编辑，由伊莱亚斯(Elias)I.特拉布勒西(Traboulsi)编辑，牛津大学出版社，2012年。
本发明的若干另外的方面涉及修正与范围广泛的遗传性疾病相关的缺陷，这些遗传性疾病在专题小节遗传性障碍(Genetic Disorders)下被进一步描述于国立卫生研究院的网站(网址为health.nih.gov/topic/GeneticDisorders)。遗传性脑病可以包括但不限于，肾上腺脑白质营养不良、胼胝体发育不全、艾卡尔迪综合征(Aicardi Syndrome)、阿尔佩斯病(Alpers' Disease)、阿尔茨海默病、巴特综合征(Barth Syndrome)、巴藤病(BattenDisease)、CADASIL、小脑变性、费波瑞病(Fabry's Disease)、格斯特曼-施特劳斯纳病(Gerstmann-Straussler-Scheinker Disease)、亨廷顿病以及其他三联体重复障碍、莱氏病(Leigh's Disease)、莱施-奈恩综合征、门克斯病、线粒体肌病以及NINDS空洞脑(Colpocephaly)。这些疾病在小节遗传性脑部障碍(Genetic Brain Disorders)下被进一步描述于国立卫生研究院的网站。
在一些实施例中，该病症可以是瘤形成。在一些实施例中，在该病症是瘤形成的情况下，有待被靶向的基因是列于表A中的那些基因中的任一种(在这种情况下是PTEN等)。在一些实施例中，该病症可以是年龄相关性黄斑变性。在一些实施例中，该病症可以是一种精神分裂症障碍。在一些实施例中，该病症可以是一种三核苷酸重复障碍。在一些实施例中，该病症可以是脆性X综合征。在一些实施例中，该病症可以是一种分泌酶相关障碍。在一些实施例中，该病症可以是一种朊病毒相关障碍。在一些实施例中，该病症可以是ALS。在一些实施例中，该病症可以是一种药物成瘾。在一些实施例中，该病症可以是自闭症。在一些实施例中，该病症可以是阿尔茨海默病。在一些实施例中，该病症可以是炎症。在一些实施例中，该病症可以是帕金森病。
与帕金森病相关的蛋白质的实例包括但不限于α-突触核蛋白、DJ-1、LRRK2、PINK1、帕金蛋白、UCHL1、Synphilin-1以及NURR1。
成瘾相关的蛋白质的实例可以包括例如ABAT。
炎症相关蛋白的实例可以包括例如由Ccr2基因编码的单核细胞趋化蛋白-1(MCP1)、由Ccr5基因编码的C-C趋化因子受体类型5(CCR5)、由Fcgr2b基因编码的IgG受体IIB(FCGR2b，亦称CD32)或由Fcer1g基因编码的FcεR1g(FCER1g)蛋白。
心血管疾病相关蛋白的实例可以包括例如IL1B(白介素1，β)、XDH(黄嘌呤脱氢酶)、TP53(肿瘤蛋白p53)、PTGIS(前列腺素I2(前列腺环素)合酶)、MB(肌红蛋白)、IL4(白介素4)、ANGPT1(血管生成素1)、ABCG8(ATP-结合盒，亚家族G(WHITE)，成员8)或CTSK(组织蛋白酶K)。
阿尔茨海默病相关蛋白的实例可以包括例如由VLDLR基因编码的极低密度脂蛋白受体蛋白(VLDLR)、由UBA1基因编码的泛素样改性剂激活酶1(UBA1)或由UBA3基因编码的NEDD8-激活酶E1催化亚基蛋白(UBE1C)。
自闭症谱系障碍相关蛋白的实例可以包括例如由BZRAP1基因编码的苯二氮卓受体(外周)相关蛋白1(BZRAP1)、由AFF2基因编码的AF4/FMR2家族成员2蛋白(AFF2)(亦称MFR2)、由FXR1基因编码的脆性X智力迟钝常染色体同系物1蛋白(FXR1)或由FXR2基因编码的脆性X智力迟钝常染色体同系物2蛋白(FXR2)。
黄斑变性相关蛋白的实例可以包括例如由ABCR基因编码的ATP-结合盒，亚家族A(ABC1)成员4蛋白(ABCA4)、由APOE基因编码的载脂蛋白E蛋白(APOE)或由CCL2基因编码的趋化因子(C-C基序)配体2蛋白(CCL2)。
精神分裂症相关蛋白的实例可以包括NRG1、ErbB4、CPLX1、TPH1、TPH2、NRXN1、GSK3A、BDNF、DISC1、GSK3B及其组合。
涉及肿瘤抑制的蛋白质的实例可以包括例如ATM(共济失调性毛细血管扩张突变的)、ATR(共济失调性毛细血管扩张和Rad3相关的)、EGFR(表皮生长因子受体)、ERBB2(v-erb-b2红白血病病毒癌基因同系物2)、ERBB3(v-erb-b2红白血病病毒癌基因同系物3)、ERBB4(v-erb-b2红白血病病毒癌基因同系物4)、Notch 1、Notch 2、Notch 3或Notch 4。
与分泌酶障碍相关的蛋白质的实例可以包括例如PSENEN(早老素增强子2同系物(秀丽隐杆线虫))、CTSB(组织蛋白酶B)、PSEN1(早老素1)、APP(淀粉样蛋白β(A4)前体蛋白)、APH1B(前咽缺陷1同系物B(秀丽隐杆线虫))、PSEN2(早老素2(阿尔茨海默病4))或BACE1(β-位点APP-切割酶1)。
与肌萎缩性侧索硬化相关的蛋白质的实例可以包括SOD1(超氧化物歧化酶1)、ALS2(肌萎缩性侧索硬化2)、FUS(融合在肉瘤中)、TARDBP(TAR DNA结合蛋白)、VAGFA(血管内皮生长因子A)、VAGFB(血管内皮生长因子B)以及VAGFC(血管内皮生长因子C)及其任何组合。
与朊病毒病相关的蛋白质的实例可以包括SOD1(超氧化物歧化酶1)、ALS2(肌萎缩性侧索硬化2)、FUS(融合在肉瘤中)、TARDBP(TAR DNA结合蛋白)、VAGFA(血管内皮生长因子A)、VAGFB(血管内皮生长因子B)以及VAGFC(血管内皮生长因子C)及其任何组合。
与朊病毒病症中的神经退行性疾病相关的蛋白质的实例可以包括例如A2M(α-2-巨球蛋白)、AATF(凋亡拮抗转录因子)、ACPP(前列腺的酸性磷酸酶)、ACTA2(肌动蛋白α2平滑肌主动脉)、ADAM22(ADAM金属肽酶结构域)、ADORA3(腺苷A3受体)或ADRA1D(α-1D肾上腺素能受体(Alpha-1D adrenergic receptor或Alpha-1D adrenoreceptor))。
与免疫缺陷相关的蛋白质的实例可以包括例如A2M[α-2-巨球蛋白]；AANAT[芳烷基胺N-乙酰转移酶]；ABCA1[ATP-结合盒，亚家族A(ABC1)，成员1]；ABCA2[ATP-结合盒，亚家族A(ABC1)，成员2]；或ABCA3[ATP-结合盒，亚家族A(ABC1)，成员3]。
与三核苷酸重复障碍相关的蛋白质的实例包括例如AR(雄激素受体)、FMR1(脆性X智力迟钝1)、HTT(亨廷顿蛋白)或DMPK(强直性肌营养不良蛋白激酶)、FXN(弗氏共济失调蛋白(frataxin))、ATXN2(共济失调蛋白2)。
与神经传递障碍相关的蛋白质的实例包括例如SST(生长抑素)、NOS1(一氧化氮合酶1(神经元的))、ADRA2A(肾上腺素能的，α-2A-，受体)、ADRA2C(肾上腺素能的，α-2C-，受体)、TACR1(速激肽受体1)或HTR2c(5-羟色胺(血清素)受体2C)。
神经发育相关序列的实例包括例如A2BP1[共济失调蛋白2-结合蛋白1]、AADAT[氨基己二酸氨基转移酶]，AANAT[芳烷基胺N-乙酰转移酶]、ABAT[4-氨基丁酸氨基转移酶]、ABCA1[ATP-结合盒，亚家族A(ABC1)，成员1]或ABCA13[ATP-结合盒，亚家族A(ABC1)，成员13]。
可用本发明系统治疗的优选病症的另外的实例可以选自：艾卡迪-古铁雷斯综合征(Aicardi-Goutières Syndrome)；亚历山大病；阿伦-赫恩登-达德利综合征(Allan-Herndon-Dudley Syndrome)；POLG相关障碍；α-甘露糖苷贮积症(II和III型)；阿尔斯特伦综合征(Syndrome)；安格曼；综合征；共济失调-毛细血管扩张；神经元蜡样-脂褐质沉积；β-地中海贫血；双侧视神经萎缩和1型(婴儿)视神经萎缩；视网膜母细胞瘤(双侧的)；卡纳万病(Canavan Disease)；脑-眼-面-骨骼综合征(CerebrooculofacioskeletalSyndrome)1[COFS1]；脑腱黄瘤病；科尼利亚迪兰吉综合征(Cornelia de LangeSyndrome)；MAPT相关障碍；遗传性朊病毒病；德拉韦综合征(Dravet Syndrome)；早期发病家族性阿尔茨海默病；弗里德赖希共济失调[FRDA]；多发性畸形；岩藻糖苷贮积症；福山(Fukuyama)先天性肌营养不良；半乳糖唾液酸贮积症；戈谢病(Gaucher Disease)；有机酸血症；噬血细胞淋巴组织细胞增生症；早衰症；粘脂贮积症II；婴儿游离唾液酸贮积病；PLA2G6相关神经变性；耶韦尔和朗格-尼尔森综合征(Jervell and Lange-NielsenSyndrome)；结合性大疱性表皮松解；亨廷顿病；克拉伯病(Krabbe Disease)(婴儿的)；线粒体DNA相关雷吉综合征(Mitochondrial DNA-Associated Leigh Syndrome)和NARP；莱施-奈恩综合征；LIS1相关无脑回；洛氏综合征(Lowe Syndrome)；槭糖尿病；MECP2复制综合征；ATP7A相关铜转运障碍；LAMA2相关肌营养不良；芳基硫酸酯酶A缺乏；I、II或III型粘多糖贮积症；过氧化物酶体生物发生障碍，齐薇格谱系综合征(Zellweger Syndrome Spectrum)；伴随脑铁累积障碍的神经变性；酸性鞘磷脂酶缺乏；C型尼曼-皮克病；甘氨酸脑病；ARX相关障碍；尿素循环障碍；COL1A1/2相关成骨不全；线粒体DNA缺失综合征；PLP1相关障碍；佩里综合征(Perry Syndrome)；费伦-麦克德米德综合征(Phelan-McDermid Syndrome)；II型糖原贮积症(蓬佩病(Pompe Disease))(婴儿的)；MAPT相关障碍；MECP2相关障碍；1型肢近端型点状软骨发育不全(Rhizomelic Chondrodysplasia Punctata Type 1)；罗伯茨综合征(Roberts Syndrome)；桑德霍夫病(Sandhoff Disease)；辛德勒病(Schindler Disease)-1型；腺苷脱氨酶缺乏；史-伦-奥三氏综合征；脊髓性肌萎缩；婴儿发病脊髓小脑性共济失调；己糖胺酶A缺乏；1型致死性发育不良；胶原VI型相关障碍；I型乌谢尔综合征(UsherSyndrome)；先天性肌营养不良；沃尔夫-赫奇霍恩综合征(Wolf-Hirschhorn Syndrome)；溶酶体酸脂酶缺乏；以及着色性干皮病。
如将是显而易见的，设想的是可以使用本发明系统靶向任何感兴趣的多核苷酸序列。使用本发明系统进行治疗可能是有用的病症或疾病的一些实例被包括在上表中并且当前与那些病症相关的基因的实例也被提供于此。然而，示例的基因并不是穷尽性的。
实例
以下实例出于说明本发明的不同实施例的目的而给出并且并不意在以任何方式限制本发明。本发明实例连同在此描述的方法目前代表优选的实施例，是示例性的，并且并不旨在限制本发明的范围。涵盖在如由权利要求书的范围所定义的本发明的精神内的在此的变化以及其他用途是本领域普通技术人员可以想到的。
实例1：真核细胞的细胞核中的CRISPR复合物活性
一个示例性II型CRISPR系统是来自化脓链球菌SF370的II型CRISPR座位，该座位包含四个基因Cas9、Cas1、Cas2和Csn1的聚簇以及两个非编码RNA元件tracrRNA和由非重复序列的短段(间隔子，每个约30bp)间隔开的重复序列(同向重复)的特征性阵列。在此系统中，以四个连续步骤产生靶向的DNA双链断裂(DSB)(图2A)。第一步，从CRISPR座位转录两个非编码RNA前-crRNA阵列和tracrRNA。第二步，将tracrRNA杂交到前-crRNA的同向重复上，然后将其加工成含有单独的间隔子序列的成熟crRNA。第三步，该成熟crRNA:tracrRNA复合物经由在crRNA的间隔子区与原型间隔子DNA之间形成异源双链体而将Cas9指向由原型间隔子和对应的PAM组成的DNA靶标。最后，Cas9介导PAM上游的靶DNA的切割，以在原型间隔子内产生一个DSB(图2A)。此实例描述了一种用于将此RNA可编程的核酸酶系统适配成指导真核细胞的细胞核中的CRISPR复合物活性的示例性过程。
细胞培养和转染
在37℃下，伴随5％CO2孵育，将人类胚肾(HEK)细胞系HEK293FT(生命技术公司)维持在补充有10％胎牛血清(海可隆公司(HyClone))、2mM GlutaMAX(生命技术公司)、100U/mL青霉素及100μg/mL链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s Medium)(DMEM)中。在37℃下，在5％CO2下，用补充有5％胎牛血清(海可隆公司)、2mMGlutaMAX(生命技术公司)、100U/mL青霉素及100μg/mL链霉素的DMEM维持小鼠neuro2A(N2A)细胞系(ATCC)。
在转染前一天，将HEK 293FT或N2A细胞以200,000个细胞/孔的密度接种到24孔板(康宁公司(Corning))中。遵循制造商推荐的方案，使用Lipofectamine 2000(生命技术公司)转染细胞。对于24孔板的每个孔，使用总共800ng的质粒。
基因组修饰的Surveyor测定和测序分析
如上所述，用质粒DNA转染HEK 293FT或N2A细胞。转染后，在基因组DNA提取之前，将细胞在37℃下孵育72小时。遵循制造商的方案，使用QuickExtract DNA提取试剂盒(Epicentre)提取基因组DNA。简言之，将细胞重悬于QuickExtract溶液中并在65℃下孵育15分钟并且在98℃下孵育10分钟。将提取的基因组DNA立即加工或存储在-20℃下。
对于每个基因而言，PCR扩增围绕CRISPR靶位点的基因组区域，并且遵循制造商的方案，使用QiaQuick Spin柱(凯杰公司(Qiagen))纯化产物。将总共400ng的纯化的PCR产物与2μl 10X Taq聚合酶PCR缓冲液(Enzymatics公司)和超纯水混合，至终体积为20μl，并使其经受重退火过程，以使得可以形成异源双链体：95℃持续10min，以-2℃/s 95℃降至85℃，以-0.25℃/s 85℃降至25℃，并且在25℃保持1分钟。重退火后，遵循制造商推荐的方案，将产物用Surveyor核酸酶和Surveyor增强子S(转基因组学公司(Transgenomics))处理，并且在4％-20％Novex TBE聚丙烯酰胺凝胶(生命技术公司)上进行分析。将凝胶用SYBRGold DNA染色剂(生命技术公司)染色30分钟并用Gel Doc凝胶成像系统(伯乐公司(Bio-rad))成像。定量是基于作为切割的DNA的部分的量度的相对条带强度。图7提供了此Surveyor测定的一个示意图。
用于检测同源重组的限制性片段长度多态性测定。
将HEK 293FT和N2A细胞用质粒DNA转染，并且如上所述，在基因组DNA提取之前，将其在37℃下孵育72小时。使用引物在同源重组(HR)模板的同源臂外PCR扩增靶基因组区域。将PCR产物分离在1％琼脂糖凝胶上并用MinElute GelExtraction试剂盒(凯杰公司)提取。将纯化产物用HindIII(费尔芒斯公司(Fermentas))消化并在6％Novex TBE聚丙烯酰胺凝胶(生命技术公司)上进行分析。
RNA二级结构预测和分析
使用质心结构预测算法，使用由维也纳大(University of Vienna)的理论化学研究所(Institute for Theoretical Chemistry)研发的在线网络服务器RNAfold进行RNA二级结构预测(参见例如A.R.格鲁伯(A.R.Gruber)等人，2008，《细胞》(Cell)106(1):23-24；以及PA卡尔(PA Carr)和GM丘奇(GM Church)，2009，《自然生物技术》(NatureBiotechnology)27(12):1151-62)。
RNA纯化
将HEK 293FT细胞如上所述地维持和转染。通过胰酶消化收获细胞，随后在磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)中洗涤。遵循制造商的方案，用TRI试剂(西格玛公司)提取总细胞RNA。使用Naonodrop(赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific))对提取的总RNA进行定量并标准化至同一浓度。
哺乳动物细胞中的crRNA和tracrRNA表达的Northern印迹分析
将RNA与等体积的2X加样缓冲液(Ambion)混合，加热至95℃持续5min，在冰上冷冻1min，并且然后在将凝胶预跑胶至少30分钟后，加样到8％变性聚丙烯酰胺凝胶(SequaGel，国家诊断(National Diagnostics))上。将样品以40W极限电泳1.5小时。之后，在室温下，将RNA转移到半干转移设备(伯乐公司(Bio-rad))中的300mA的Hybond N+膜(通用电气医疗公司(GE Healthcare))上，持续1.5小时。使用Stratagene UV Crosslinker theStratalinker(Stratagene)上的自动交联按钮将RNA交联到该膜上。在42℃下，伴随旋转，将该膜在ULTRAhyb-Oligo杂交缓冲液(Ambion)中预杂交30min，并且然后添加探针并杂交过夜。探针订购自IDT并将其用具有T4多核苷酸激酶(新英格兰生物实验室(New EnglandBiolabs)))的[γ-32P]ATP(珀金埃尔默公司)标记。将该膜用预加温的(42℃)2xSSC、0.5％SDS洗涤一次，持续1min，随后在42℃下洗涤两次，持续30分钟。将该膜在室温下向荧光屏暴露一小时或过夜并且然后用感光成像仪(Typhoon)扫描。
细菌CRISPR系统构建和评价
从具有用于吉布森拼接(Gibson Assembly)的侧翼同源臂的化脓链球菌SF370基因组DNA PCR扩增CRISPR座位元件(包括tracrRNA、Cas9和前导子)。将两个BsaI类型IIS位点引入在两个同向重复之间，以促进间隔子的方便插入(图8)。使用Gibson AssemblyMaster Mix(NEB)将PCR产物克隆进EcoRV-消化的pACYC184中，在tet启动子的下游。省略其他内源CRISPR系统元件，Csn2的最后50bp除外。将编码具有互补突出端的间隔子的寡聚物(整合DNA技术公司(Integrated DNA Technology))克隆进BsaI-消化的载体pDC000(NEB)中并且然后用T7连接酶(Enzymatics公司)连接，以产生pCRISPR质粒。包含具有在哺乳动物细胞中的PAM表达的间隔子的激发质粒(图6A中所示出的表达构建体，其中功能性是如显示于图6B中的Surveyor测定的结果所确定的)。将转录起始位点标为+1，并且还指示了转录终止子和通过Northern印迹探测的序列。还通过Northern印迹确认了加工的tracrRNA的表达。图6C显示了提取自293FT细胞的总RNA的Northern印迹分析的结果，用携带长或短tracrRNA以及SpCas9和DR-EMX1(1)-DR的U6表达构建体转染这些细胞。左图和右图分别是来自用或没用SpRNA酶III转染的293FT细胞。U6指示用靶向人类U6snRNA的探针进行印迹的加样对照。短tracrRNA表达构建体的转染产生丰富水平的加工形式的tracrRNA(～75bp)。在Northern印迹上检测极低量的长tracrRNA。
为了促进转录精确起始，选择基于RNA聚合酶III的U6启动子，以驱动tracrRNA的表达(图2C)。类似地，研发基于U6启动子的构建体，以表达由单个间隔子组成的前-crRNA阵列，该单个间隔子侧翼为两个同向重复(DR，还被术语“tracr配对序列”所涵盖；图2C)。将起始间隔子设计成靶向人EMX1座位(图2C)中的33-碱基对(bp)靶位点(满足Cas9的NGG识别基序的30-bp原型间隔子加3-bp CRISPR基序(PAM)序列)，该座位是大脑皮层的发育中的一个关键基因。
为了测试CRISPR系统(SpCas9、SpRNA酶III、tracrRNA以及前-crRNA)在哺乳动物细胞中的异源表达是否可以实现哺乳动物染色体的靶向切割，用CRISPR组分的组合转染HEK 293FT细胞。由于哺乳动物细胞核中的DSB通过导致形成indel的非同源末端连接(NHEJ)途径而部分地修复，使用Surveyor测定检测靶EMX1座位处的潜在的切割活性(图7)(参见例如格斯钦(Guschin)等人，2010，《分子生物学方法》(Methods Mol Biol)649:247)。所有四种CRISPR组分的共转染能够在原型间隔子中诱导高达5.0％切割(参见图2D)。所有CRISPR组分(减去SpRNA酶III)的共转染在原型间隔子中也诱导高达4.7％indel，表明可能存在能够辅助crRNA成熟的内源性哺乳动物RNA酶，如例如相关的切丁酶(Dicer)和Drosha酶。除去剩余的三种组分中的任何组分消除CRISPR系统的基因组切割活性(图2D)。包含已证实切割活性的靶座位的扩增子的桑格测序：在43个测序的克隆中，发现5个突变的等位基因(11.6％)。使用多种指导序列的类似实验产生了高达29％的indel百分比(参见图3-6、10和11)。这些结果定义了一种在哺乳动物细胞中的有效的CRISPR介导的基因组修饰的三组分系统。为了优化切割效率，申请人还测试了tracrRNA的不同亚型是否影响切割效率并且发现，在实例系统中，仅仅短(89-bp)转录本形式能够介导人类EMX1基因组座位的切割(图6B)。
图12提供了哺乳动物细胞中的crRNA加工的另外的Northern印迹分析。图12A示出了一个示意图，显示了侧翼为两个同向重复(DR-EMX1(1)-DR)的单个间隔子的表达载体。靶向人EMX1座位原型间隔子1(参见图6)的30bp间隔子和同向重复序列显示于图12A下方的序列中。直线指示其反向互补系列用于产生供EMX1(1)crRNA检测用的Northern印迹探针的区域。图12B显示了提取自293FT细胞的总RNA的Northern印迹分析，用携带DR-EMX1(1)-DR的U6表达构建体转染这些细胞。左图和右图分别是来自用或没用SpRNA酶III转染的293FT细胞。DR-EMX1(1)-DR仅在存在SpCas9和短tracrRNA的情况下被加工为成熟crRNA并且不依赖于SpRNA酶III的存在。检测的来自转染的293FT总RNA的成熟crRNA是约33bp并且比来自化脓链球菌的39-42bp成熟crRNA短。这些结果证明，CRISPR系统可以被移植进真核细胞中并被重新编程，以促进内源哺乳动物靶多核苷酸的切割。
图2示出了描述于此实例中的细菌CRISPR系统。图2A示出了一个示意图，显示了来自化脓链球菌SF370的CRISPR座位和通过此系统CRISPR介导的DNA切割的建议机制。加工自同向重复-间隔子阵列的成熟crRNA指导Cas9到以下基因组靶标，这些靶标由互补原型间隔子和原型间隔子相邻基序(PAM)组成。靶标-间隔子碱基配对后，Cas9介导靶DNA中的双链断裂。图2B示出了具有使得导入到哺乳动物细胞核中成为可能的核定位信号(NLS)的化脓链球菌Cas9(SpCas9)和RNA酶III(SpRNA酶III)的工程化。图2C示出了由组成型EF1a启动子驱动的SpCas9和SpRNA酶III以及由RNA Pol3启动子U6驱动的tracrRNA和前-crRNA阵列(DR-间隔子-DR)的哺乳动物表达，上述启动子促进转录精确起始和终止。将来自具有令人满意的PAM序列的人EMX1座位的原型间隔子用作前-crRNA阵列中的间隔子。图2D示出了SpCas9介导的次要插入和缺失的Surveyor核酸酶测定。使用和不使用SpRNA酶III、tracrRNA以及携带EMX1-靶间隔子的前-crRNA阵列表达SpCas9。图2E示出了靶座位与EMX1-靶向crRNA之间的碱基配对的一个示意表示以及一个显示了与SpCas9切割位点邻近的微小缺失的示例性色谱图。图2F示出了从43个克隆扩增子的测序分析鉴定出的突变的等位基因，这些扩增子显示出多种微小插入和缺失。破折号指示缺失的碱基，并且非比对或错配碱基指示插入或突变。比例尺＝10μm。
为了进一步简化该三组分系统，改编嵌合的crRNA-tracrRNA杂交体设计，其中成熟crRNA(包括一种指导序列)可以经由茎-环而融合到部分tracrRNA上，以模拟天然的crRNA:tracrRNA双链体。为了增加共递送效率，产生双顺反子表达载体，以驱动嵌合的RNA和SpCas9在转染细胞中的共表达。平行地，使用该双顺反子载体表达前-crRNA(DR-指导序列-DR)与SpCas9，以诱导用分开表达的tracrRNA加工为crRNA(比较图11B的顶图和底图)。图8提供了前-crRNA阵列(图8A)或嵌合的crRNA(由图8B中的指导序列插入位点的下游和EF1α启动子的上游的短线表示)与hSpCas9的双顺反子表达载体的示意图，显示了各种元件的位置和指导序列插入点。图8B中的围绕指导序列插入位点的位置的展开的序列还显示了部分DR序列(GTTTTAGAGCTA)(SEQ ID NO:11)和部分tracrRNA序列(TAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTTTT)(SEQ ID NO:12)。可以使用退火的寡核苷酸将指导序列插入在BbsI位点之间。寡核苷酸的序列设计显示在图8中的示意图的下方，其中指示了适当的连接适配子。WPRE表示土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件。通过靶向与上述相同的EMX1座位而测试嵌合RNA介导的切割效率。使用扩增子的Surveyor测定和桑格测序两者，申请人确认嵌合RNA设计以大约4.7％的修饰率促进人EMX1座位的切割(图3)。
通过设计靶向人EMX1和PVALB以及小鼠Th座位中的多个位点的嵌合RNA，通过靶向人类和小鼠细胞两者中的另外的基因组座位而测试CRISPR介导的切割在真核细胞中的普遍性。图13示出了人类PVALB(图13A)和小鼠Th(图13B)座位中的一些另外的靶向原型间隔子的筛选。提供了各自的最后的外显子内的基因座位位和三个原型间隔子的位置的示意图。加下划线的序列包括30bp的原型间隔子序列和对应于PAM序列的3’端处的3bp。分别在DNA序列的上方和下方指示了有义链和反义链上的原型间隔子。人类PVALB和小鼠Th座位分别达到了6.3％和0.75％的修饰率，证明了CRISPR系统跨多种生物在修饰不同座位方面的广阔适用性(图5)。虽然对于每个座位而言，使用嵌合的构建体仅伴随三分之一的间隔子检测切割，但是当使用共表达的前-crRNA安排时，所有靶序列都被切割，伴随达到27％的有效的indel产生(图6和13)。
图11提供了可以被重新编程为靶向哺乳动物细胞中的多个基因组座位的SpCas9的另外的图解。图11A提供了人EMX1座位的示意图，显示了五个原型间隔子的位置，由加下划线的序列指示。图11B提供了前-crRNA/trcrRNA复合物的示意图，显示了前-crRNA和tracrRNA的同向重复区之间的杂交(顶部)，以及嵌合RNA设计的示意图，包括一个20bp指导序列和由部分同向重复组成的tracr配对和tracr序列以及以发夹结构杂交的tracrRNA序列(底部)。比较人EMX1座位中的五个原型间隔子处的Cas9介导的切割的效率的Surveyor测定的结果示于图11C中。使用加工的前-crRNA/tracrRNA复合物(crRNA)或嵌合的RNA(chiRNA)靶向每个原型间隔子。
由于RNA的二级结构对于分子间相互作用可以是决定性的，使用基于最小自由能和玻尔兹曼(Boltzmann)加权结构集合的结构预测算法比较基因组靶向实验中使用的所有指导序列的假定的二级结构(参见例如格鲁贝尔(Gruber)等人，2008，《核酸研究》(NucleicAcids Research)，36:W70)。分析揭示到在大多数情况下，在嵌合的crRNA背景下有效的指导序列基本上不含二级结构基序，而无效的指导序列更可能形成可以阻止与靶原型间隔子DNA进行碱基配对的内部二级结构。因此，可能的是，当使用嵌合的crRNA时，间隔子二级结构的变异性可能影响CRISPR介导的干扰的效率。
SpCas9的另外的载体设计显示于图22中，示出了掺入连接到指导寡核苷酸的插入位点的U6启动子和连接到SpCas9编码序列上的Cbh启动子的单个表达载体。显示于图22b中的载体包括一个连接到H1启动子上的tracrRNA编码序列。
在细菌测定中，所有的间隔子均促进有效的CRISPR干扰(图3C)。这些结果表明，可能存在影响哺乳动物细胞中的CRISPR活性效率的另外的因素。
为了研究CRISPR介导的切割的特异性，使用一系列具有单点突变的EMX1-靶向嵌合的crRNA分析指导序列中的单核苷酸突变对哺乳动物基因组中的原型间隔子切割的影响(图3A)。图3B示出了比较当与不同突变的嵌合的RNA配对时Cas9的切割效率的Surveyor核酸酶测定的结果。PAM的5’的高达12-bp的单碱基错配基本上消除了由SpCas9进行的基因组切割，而在离上游位置更远处具有突变的间隔子保留针对原始原型间隔子靶标的活性(图3B)。除PAM之外，SpCas9在间隔子的最后12-bp内具有单碱基特异性。此外，CRISPR能够像一对靶向同一EMX1原型间隔子的TALE核酸酶(TALEN)一样有效地介导基因组切割。图3C提供了一个示意图，显示了靶向EMX1的TALEN的设计并且图3D显示了比较TALEN和Cas9的效率的Surveyor凝胶(n＝3)。
已经通过易错NHEJ机制建立了一套用于在哺乳动物细胞中实现CRISPR介导的基因编辑的组分，测试CRISPR刺激同源重组(HR)的能力，同源重组是一种用于使得基因组中的编辑精确的高保真基因修复途径。野生型SpCas9能够介导位点特异的DSB，这些DSB可以通过NHEJ和HR两者进行修复。另外，将SpCas9的RuvC I催化结构域中的天冬氨酸至丙氨酸取代(D10A)工程化，以将核酸酶转化为切口酶(SpCas9n；示于图4A中)(参见例如萨普拉诺萨克斯(Sapranausaks)等人，2011，《核酸研究》(Nucleic Acids Research)，39:9275；加索纳斯(Gasiunas)等人，2012，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，109:E2579)，这样使得带切口的基因组DNA经历高保真同源定向修复(HDR)。Surveyor测定确认到，SpCas9n在EMX1原型间隔子靶标处不产生indel。如图4B所示，EMX1-靶向嵌合的crRNA与SpCas9的共表达在靶位点中产生indel，而与SpCas9n的共表达不产生indel(n＝3)。此外，327个扩增子的测序未检测到由SpCas9n诱导的任何indel。选择相同的座位，以通过用靶向EMX1、hSpCas9或hSpCas9n的嵌合RNA以及用于在原型间隔子附近引入一对限制酶切位点(HindIII和NheI)的HR模板共转染HEK 293FT细胞而测试CRISPR介导的HR。图4C提供了HR策略的示意图，包含重组点的相对位置和引物退火序列(箭头)。SpCas9和SpCas9n的确催化将HR模板整合进EMX1座位中。PCR扩增靶区域，随后用HindIII进行限制酶切消化揭示了对应于期望片段尺寸的切割产物(显示于图4D中的限制性片段长度多态性分析中的箭头)，其中SpCas9和SpCas9n介导类似水平的HR效率。申请人使用基因组扩增子的桑格测序进一步证实了HR(图4E)。这些结果证明了CRISPR促进哺乳动物基因组中的靶向基因插入的实用性。鉴于14-bp(来自间隔子的12-bp和来自PAM的2-bp)特异地靶向野生型SpCas9，切口酶的可获得性可以显著减少脱靶修饰的可能性，因为单链断裂不是易错NHEJ途径的底物。
构建模拟具有阵列的间隔子的CRISPR座位的天然构造的表达构建体(图2A)，以测试多元序列靶向的可能性。使用编码一对EMX1-和PVALB-靶向间隔子的单CRISPR阵列，在两个座位处都检测到了有效的切割(图4F，显示了crRNA阵列的示意设计和显示出切割的有效修饰的Surveyor印迹两者)。使用针对由119bp间隔开的EMX1内的两个靶标的间隔子通过共存DSB还检测到了较大基因组区的靶向缺失，并且检测到了1.6％缺失效率(182个扩增子中的3个；图4G)。这证明，CRISPR系统可以介导单个基因组中的多元编辑。
实例2：CRISPR系统修饰和替代方案
使用RNA编程序列特异的DNA切割的能力定义了一个新类别的针对多种研究和工业应用的基因组工程化工具。可以进一步改善CRISPR系统的若干方面，以增加CRISPR靶向的效率和通用性。优化的Cas9活性可以依赖于处于比存在于哺乳动物细胞核中的游离Mg2+高的水平的游离Mg2+的可获得性(参见例如季聂克(Jinek)等人，2012，《科学》(Science)，337:816)，并且对恰好位于原型间隔子的下游的NGG基序的偏好限制靶向人类基因组中的平均每12-bp的能力(图9，评价了人类染色体序列的正链和负链两者)。这些约束中的一些可以通过探索CRISPR座位跨微生物宏基因组的多样性而克服(参见例如马卡洛娃(Makarova)等人，2011，《自然微生物学综述》(Nat Rev Microbiol)，9:467)。可以通过类似于实例1中描述的方法将其他CRISPR座位移植进哺乳动物细胞环境中。例如，图10示出了来自嗜热链球菌LMD-9的CRISPR 1的用于在哺乳动物细胞中进行异源表达的II型CRISPR系统的适应，以实现CRISPR介导的基因组编辑。图10A提供了来自嗜热链球菌LMD-9的CRISPR 1的示意图。图10B示出了嗜热链球菌CRISPR系统的表达系统的设计。使用组成型EF1α启动子表达人类密码子优化的hStCas9。使用促进转录精确起始的U6启动子表达tracrRNA和crRNA的成熟版本。示出了来自成熟crRNA和tracrRNA的序列。crRNA序列中的由小写字母“a”指示的单个碱基用于除去作为RNA polIII转录终止子的polyU序列。图10C提供了一个示意图，显示了靶向人EMX1座位的指导序列。图10D显示了使用Surveyor测定的靶座位中的hStCas9介导的切割的结果。RNA指导间隔子1和2分别诱导了14％和6.4％。在这两个原型间隔子位点处跨生物复制物的切割活性的统计分析还提供于图5中的。图14提供了嗜热链球菌CRISPR系统的另外的原型间隔子和在人EMX1座位中的对应的PAM序列靶标示意图。两个原型间隔子序列被凸显并且通过相对于对应的凸显序列为3’加下划线而指示满足NNAGAAW基序的对应的PAM序列。两个原型间隔子均靶向反义链。
实例3：样品靶序列选择算法
设计一个软件程序，以基于指定的CRISPR酶的希望的指导序列长度和CRISPR基序序列(PAM)，在输入DNA序列的两条链上鉴定候选CRISPR靶序列。例如，可以通过在输入序列和该输入序列的反向互补体两者上检索5’-Nx-NGG-3’而鉴定来自化脓链球菌的Cas9的具有PAM序列NGG的靶位点。同样地，可以通过在输入序列和该输入序列的反向互补体两者上检索5’-Nx-NNAGAAW-3’而鉴定化脓链球菌CRISPR1的Cas9的具有PAM序列NNAGAAW的靶位点。同样地，可以通过在输入序列和该输入序列的反向互补体两者上检索5’-Nx-NGGNG-3’而鉴定化脓链球菌CRISPR3的Cas9的具有PAM序列NGGNG的靶位点。可以通过程序固定或由使用者指定Nx中的值“x”，如20。
由于在DNA靶位点的基因组中出现多次可以导致非特异的基因组编辑，因此在鉴定所有潜在的位点后，基于序列在相关参比基因组中出现的次数，该程序将其滤出。对于其序列特异性是通过‘种子(seed)’序列(如来自PAM序列的11-12bp 5’，包括PAM序列本身)确定的那些CRISPR酶，过滤步骤可以基于该种子序列。因此，为了避免另外的基因组座位处的编辑，基于种子：PAM序列在相关基因组中出现的次数过滤结果。可以允许使用者选择种子序列的长度。处于通过过滤器的目的，还可以允许使用者指定种子：PAM序列在基因组中出现的次数。默认筛选独特序列。通过改变种子序列的长度和该序列在基因组中出现的次数两者而改变过滤水平。该程序可以另外或可替代地通过提供鉴定的一个或多个靶序列的反向互补体而提供与报告的一个或多个靶序列互补的指导序列的序列。一些靶位点在人类基因组中的示例性可视化提供于图18中。
用于优化序列选择的方法和算法的另外的细节可以发现于通过引用结合在此的美国申请序列号61/064,798(代理人案号44790.11.2022；博德参考号BI-2012/084)中。
实例4：多种嵌合的crRNA-tracrRNA杂交体的评价
此实例描述了针对具有掺入不同长度的野生型tracrRNA序列的tracr序列的嵌合的RNA(chiRNAs；在单个转录本中包括指导序列、tracr配对序列以及tracr序列)而获得的结果。图16a示出了嵌合RNA和Cas9的双顺反子表达载体的示意图。Cas9由CBh启动子驱动并且嵌合的RNA由U6启动子驱动。嵌合的指导RNA由接合到tracr序列的20bp指导序列(N)组成(从下链的第一个“U”到该转录本的结尾)，其在如指示的各点被截短。指导和tracr序列由tracr-配对序列GUUUUAGAGCUA(SEQ ID NO:13)，随后是环序列GAAA隔开。人EMX1和PVALB座位处的Cas9介导的indel的SURVEYOR测定的结果分别示于图16b和16c中。箭头指示预期的SURVEYOR片段。ChiRNA由其“+n”标志指示，并且crRNA是指指导和tracr序列被表达为分开的转录本的杂交体RNA。一式三份地进行的这些结果的定量示于图17a和17b的直方图中,分别对应于图16b和16c(“N.D.”指示未检测到indel)。原型间隔子ID及其对应的基因组靶标、原型间隔子、PAM序列以及链位置提供于表D中。将指导序列设计成与整个原型间隔子序列互补(在杂交体系统中的分开的转录本的情况下)，或仅为部分加下划线(在嵌合的RNA的情况下)。
表D：
用于优化指导序列的另外的细节可以发现于通过引用结合在此的美国申请序列号61/836,127(代理人案号44790.08.2022；博德参考号BI-2013/004G)中。
初始，靶向人HEK 293FT细胞中的EMX1座位内的三个位点。使用SURVEYOR核酸酶测定评估每种chiRNA的基因组修饰效率，该测定检测由DNA双链断裂(DSB)及其通过非同源末端连接(NHEJ)DNA损伤修复途径进行的随后修复造成的突变。被指定为chiRNA(+n)的构建体指示，野生型tracrRNA的直达第+n个核苷酸被包括在嵌合的RNA构建体中，其中48、54、67和85的值用于n。嵌合的RNA在所有三个EMX1靶位点处都包含长片段的野生型tracrRNA(chiRNA(+67)和chiRNA(+85))介导的DNA切割，其中chiRNA(+85)尤其展示出比以分开的转录本形式表达指导序列和tracr序列的对应的crRNA/tracrRNA杂交体显著更高水平的DNA切割(图16b和17a)。还使用chiRNA靶向PVALB座位中的两个位点,其不产生使用杂交体系统(作为分开的转录本而表达的指导序列和tracr序列)的可检测的切割。chiRNA(+67)和chiRNA(+85)能够在两个PVALB原型间隔子处介导显著的切割(图16c和17b)。
对于EMX1和PVALB座位中的所有五个靶标，伴随增加的tracr序列长度观察到一致增加的基因组修饰效率。不希望受任何理论的束缚，由tracrRNA的3’端形成的二级结构可以在增强CRISPR复合物形成率方面发挥一定作用。
实例5：Cas9多样性
CRISPR-Cas系统是一种由跨细菌和古生菌的相异物种利用的针对侵入型外源DNA的获得性免疫机制。II型CRISPR-Cas9系统由一套编码负责将外源DNA“捕获(acquisition)”进CRISPR座位中的蛋白质的基因以及一套编码负责“执行(execution)”DNA切割机制的蛋白质的基因组成；这些包括DNA核酸酶(Cas9)、非编码反式激活cr-RNA(tracrRNA)以及侧翼为同向重复的外源DNA衍生的间隔子阵列(crRNA)。当被Cas9成熟后，tracRNA和crRNA双链体指导Cas9核酸酶到由间隔子指导序列规定的靶DNA序列，并且在靶DNA中介导短序列基序附近的DNA中的双链断裂，该导短序列基序为切割所需并且对于每种CRISPR-Cas系统而言是特异的。II型CRISPR-Cas系统发现在整个细菌界中并且在用于靶标切割的Cas9蛋白序列和尺寸、tracrRNA和crRNA同向重复序列、这些元件的基因组组织以及基序要求方面高度相异。一个物种可以具有多种相异的CRISPR-Cas系统。
申请人评价了来自基于与已知Cas9的序列同源性和与已知亚结构域直向同源的结构鉴定的细菌种类的207个假定的Cas9，这些亚结构域包括HNH内切核酸酶结构域和RuvC内切核酸酶结构域[信息来自尤金库宁(Eugene Koonin)和基拉马卡洛娃(KiraMakarova)]。基于此套的蛋白质序列保守的系统发生分析揭示了五个Cas9家族，包括三组大的Cas9(～1400个氨基酸)和两组小的Cas9(～1100个氨基酸)(参见图19和20A-F)。
Cas9和Cas9酶转化为切口酶或DNA结合蛋白的突变及其具有的改变的功能性的用途的另外的细节可以发现于通过引用结合在此的美国申请序列号61/836,101和61/835,936(代理人案号分别为44790.09.2022和4790.07.2022并且博德参考号分别为BI-2013/004E和BI-2013/004F)中。
实例6：Cas9直向同源物
申请人分析了Cas9直向同源物，以鉴定相关的PAM序列和对应的嵌合的指导RNA。具有一套展开的PAM提供了跨基因组的更广泛的靶向并且还显著增加独特靶位点的数目并且提供了在基因组中鉴定具有增加水平的特异性的新颖的Cas9的潜力。
可以通过测试每种Cas9容忍指导RNA及其DNA靶标之间的错配的能力评价Cas9直向同源物的特异性。例如，已经通过测试指导RNA中的突变对切割效率的影响表征了SpCas9的特异性。用指导序列与靶DNA之间的单个或多个错配建立指导RNA文库。基于这些发现，可以基于以下准则选择SpCas9的靶位点：
为了最大化SpCas9编辑具体基因的特异性，应该在感兴趣的座位内选择一个靶位点，这样使得潜在的‘脱靶’基因组序列遵守以下四个约束：首先，它们的后面不应该是具有的5’-NGG或NAG序列的PAM。其次，它们与靶序列的整体序列相似性应该是最小化的。第三，最大数目的错配应该位于脱靶位点的PAM-近侧区内。最后，最大数目的错配应该是连续的或由少于四个碱基隔开。
可以使用类似的方法评价其他Cas9直向同源物的特异性和建立在靶标种类的基因组内选择特定靶位点的标准。如前所述，基于此套的蛋白质序列保守的系统发生分析揭示了五个Cas9家族，包括三组大的Cas9(～1400个氨基酸)和两组小的Cas9(～1100个氨基酸)(参见图19和20A-F)。Cas直向同源物的另外的细节可以发现于通过引用结合在此的美国申请序列号61/836,101和61/835,936(代理人案号分别为44790.09.2022和4790.07.2022并且博德参考号分别为BI-2013/004E和BI-2013/004F)中。
实例7：使用Cas9靶向并操纵植物基因而对植物(微藻)进行工程化
递送Cas9的方法
方法1：申请人使用在组成型启动子(如Hsp70A-Rbc S2或β2-微管蛋白)的控制之下表达Cas9的载体递送Cas9和指导RNA。
方法2：申请人使用在组成型启动子(如Hsp70A-Rbc S2或β2-微管蛋白)的控制之下表达Cas9和T7聚合酶的载体递送Cas9和T7聚合酶。将使用包含驱动指导RNA的T7启动子的载体递送该指导RNA。
方法3：申请人将Cas9mRNA和体外转录的指导RNA递送到藻类细胞中。RNA可以在体外转录。Cas9mRNA将由Cas9的编码区以及来自的Cop1的3’UTR组成，以保证Cas9mRNA的稳定。
用于同源重组，申请人提供了一个另外的同源定向修复模板。
在位于Cop1的3’UTR之后的β-2微管蛋白启动子的控制之下驱动Cas9的表达的盒的序列。
TCTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCTGCGAGACGGCTTCCCGGCGCTGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCCTTCGGGGCTGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCAGGCCCCCGATTGCAAAGACATTATAGCGAGCTACCAAAGCCATATTCAAACACCTAGATCACTACCACTTCTACACAGGCCACTCGAGCTTGTGATCGCACTCCGCTAAGGGGGCGCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAACCCGCAAACATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTCGCCGAAGAAAAAGCGCAAGGTCGAAGCGTCCGACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGACATCGGCACCAACTCTGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAATTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCCCTGCTGTTCGACAGCGGCGAAACAGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGAGAACCGCCAGAAGAAGATACACCAGACGGAAGAACCGGATCTGCTATCTGCAAGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAGTCCTTCCTGGTGGAAGAGGATAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGAGAAAGAAACTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTATCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAAAACCCCATCAACGCCAGCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGTCTGCCAGACTGAGCAAGAGCAGACGGCTGGAAAATCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAATGGCCTGTTCGGCAACCTGATTGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGATGCCAAACTGCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTTCTGGCCGCCAAGAACCTGTCCGACGCCATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCTCTATGATCAAGAGATACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAAGCTCTCGTGCGGCAGCAGCTGCCTGAGAAGTACAAAGAGATTTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATTGACGGCGGAGCCAGCCAGGAAGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAAAAGATGGACGGCACCGAGGAACTGCTCGTGAAGCTGAACAGAGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCAGCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGAGAGCTGCACGCCATTCTGCGGCGGCAGGAAGATTTTTACCCATTCCTGAAGGACAACCGGGAAAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGCATCCCCTACTACGTGGGCCCTCTGGCCAGGGGAAACAGCAGATTCGCCTGGATGACCAGAAAGAGCGAGGAAACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAAGTGGTGGACAAGGGCGCTTCCGCCCAGAGCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGATAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTATAACGAGCTGACCAAAGTGAAATACGTGACCGAGGGAATGAGAAAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAAAAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAAGTGACCGTGAAGCAGCTGAAAGAGGACTACTTCAAGAAAATCGAGTGCTTCGACTCCGTGGAAATCTCCGGCGTGGAAGATCGGTTCAACGCCTCCCTGGGCACATACCACGATCTGCTGAAAATTATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAATGAGGAAAACGAGGACATTCTGGAAGATATCGTGCTGACCCTGACACTGTTTGAGGACAGAGAGATGATCGAGGAACGGCTGAAAACCTATGCCCACCTGTTCGACGACAAAGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGAGATACACCGGCTGGGGCAGGCTGAGCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGTCCGGCAAGACAATCCTGGATTTCCTGAAGTCCGACGGCTTCGCCAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTTAAAGAGGACATCCAGAAAGCCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGATAGCCTGCACGAGCACATTGCCAATCTGGCCGGCAGCCCCGCCATTAAGAAGGGCATCCTGCAGACAGTGAAGGTGGTGGACGAGCTCGTGAAAGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAAATGGCCAGAGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGACAGAAGAACAGCCGCGAGAGAATGAAGCGGATCGAAGAGGGCATCAAAGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAACACCCCGTGGAAAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAATGGGCGGGATATGTACGTGGACCAGGAACTGGACATCAACCGGCTGTCCGACTACGATGTGGACCATATCGTGCCTCAGAGCTTTCTGAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTGCTGACCAGAAGCGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGACAACGTGCCCTCCGAAGAGGTCGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATTACCCAGAGAAAGTTCGACAATCTGACCAAGGCCGAGAGAGGCGGCCTGAGCGAACTGGATAAGGCCGGCTTCATCAAGAGACAGCTGGTGGAAACCCGGCAGATCACAAAGCACGTGGCACAGATCCTGGACTCCCGGATGAACACTAAGTACGACGAGAATGACAAGCTGATCCGGGAAGTGAAAGTGATCACCCTGAAGTCCAAGCTGGTGTCCGATTTCCGGAAGGATTTCCAGTTTTACAAAGTGCGCGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTCGTGGGAACCGCCCTGATCAAAAAGTACCCTAAGCTGGAAAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAGGAAATCGGCAAGGCTACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTTTTCAAGACCGAGATTACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGGCCTCTGATCGAGACAAACGGCGAAACCGGGGAGATCGTGTGGGATAAGGGCCGGGATTTTGCCACCGTGCGGAAAGTGCTGAGCATGCCCCAAGTGAATATCGTGAAAAAGACCGAGGTGCAGACAGGCGGCTTCAGCAAAGAGTCTATCCTGCCCAAGAGGAACAGCGATAAGCTGATCGCCAGAAAGAAGGACTGGGACCCTAAGAAGTACGGCGGCTTCGACAGCCCCACCGTGGCCTATTCTGTGCTGGTGGTGGCCAAAGTGGAAAAGGGCAAGTCCAAGAAACTGAAGAGTGTGAAAGAGCTGCTGGGGATCACCATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAGAAGAATCCCATCGACTTTCTGGAAGCCAAGGGCTACAAAGAAGTGAAAAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCTAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAAAACGGCCGGAAGAGAATGCTGGCCTCTGCCGGCGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCCCTGCCCTCCAAATATGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTATGAGAAGCTGAAGGGCTCCCCCGAGGATAATGAGCAGAAACAGCTGTTTGTGGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCTCCAAGAGAGTGATCCTGGCCGACGCTAATCTGGACAAAGTGCTGTCCGCCTACAACAAGCACCGGGATAAGCCCATCAGAGAGCAGGCCGAGAATATCATCCACCTGTTTACCCTGACCAATCTGGGAGCCCCTGCCGCCTTCAAGTACTTTGACACCACCATCGACCGGAAGAGGTACACCAGCACCAAAGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGAGCATCACCGGCCTGTACGAGACACGGATCGACCTGTCTCAGCTGGGAGGCGACAGCCCCAAGAAGAAGAGAAAGGTGGAGGCCAGCTAAGGATCCGGCAAGACTGGCCCCGCTTGGCAACGCAACAGTGAGCCCCTCCCTAGTGTGTTTGGGGATGTGACTATGTATTCGTGTGTTGGCCAACGGGTCAACCCGAACAGATTGATACCCGCCTTGGCATTTCCTGTCAGAATGTAACGTCAGTTGATGGTACT(SEQ ID NO:19)
在位于Cop1的3’UTR之后的β-2微管蛋白启动子的控制之下驱动T7聚合酶的表达的盒的序列：
TCTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCTGCGAGACGGCTTCCCGGCGCTGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCCTTCGGGGCTGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCAGGCCCCCGATTGCAAAGACATTATAGCGAGCTACCAAAGCCATATTCAAACACCTAGATCACTACCACTTCTACACAGGCCACTCGAGCTTGTGATCGCACTCCGCTAAGGGGGCGCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAACCCGCAAACatgcctaagaagaagaggaaggttaacacgattaacatcgctaagaacgacttctctgacatcgaactggctgctatcccgttcaacactctggctgaccattacggtgagcgtttagctcgcgaacagttggcccttgagcatgagtcttacgagatgggtgaagcacgcttccgcaagatgtttgagcgtcaacttaaagctggtgaggttgcggataacgctgccgccaagcctctcatcactaccctactccctaagatgattgcacgcatcaacgactggtttgaggaagtgaaagctaagcgcggcaagcgcccgacagccttccagttcctgcaagaaatcaagccggaagccgtagcgtacatcaccattaagaccactctggcttgcctaaccagtgctgacaatacaaccgttcaggctgtagcaagcgcaatcggtcgggccattgaggacgaggctcgcttcggtcgtatccgtgaccttgaagctaagcacttcaagaaaaacgttgaggaacaactcaacaagcgcgtagggcacgtctacaagaaagcatttatgcaagttgtcgaggctgacatgctctctaagggtctactcggtggcgaggcgtggtcttcgtggcataaggaagactctattcatgtaggagtacgctgcatcgagatgctcattgagtcaaccggaatggttagcttacaccgccaaaatgctggcgtagtaggtcaagactctgagactatcgaactcgcacctgaatacgctgaggctatcgcaacccgtgcaggtgcgctggctggcatctctccgatgttccaaccttgcgtagttcctcctaagccgtggactggcattactggtggtggctattgggctaacggtcgtcgtcctctggcgctggtgcgtactcacagtaagaaagcactgatgcgctacgaagacgtttacatgcctgaggtgtacaaagcgattaacattgcgcaaaacaccgcatggaaaatcaacaagaaagtcctagcggtcgccaacgtaatcaccaagtggaagcattgtccggtcgaggacatccctgcgattgagcgtgaagaactcccgatgaaaccggaagacatcgacatgaatcctgaggctctcaccgcgtggaaacgtgctgccgctgctgtgtaccgcaaggacaaggctcgcaagtctcgccgtatcagccttgagttcatgcttgagcaagccaataagtttgctaaccataaggccatctggttcccttacaacatggactggcgcggtcgtgtttacgctgtgtcaatgttcaacccgcaaggtaacgatatgaccaaaggactgcttacgctggcgaaaggtaaaccaatcggtaaggaaggttactactggctgaaaatccacggtgcaaactgtgcgggtgtcgacaaggttccgttccctgagcgcatcaagttcattgaggaaaaccacgagaacatcatggcttgcgctaagtctccactggagaacacttggtgggctgagcaagattctccgttctgcttccttgcgttctgctttgagtacgctggggtacagcaccacggcctgagctataactgctcccttccgctggcgtttgacgggtcttgctctggcatccagcacttctccgcgatgctccgagatgaggtaggtggtcgcgcggttaacttgcttcctagtgaaaccgttcaggacatctacgggattgttgctaagaaagtcaacgagattctacaagcagacgcaatcaatgggaccgataacgaagtagttaccgtgaccgatgagaacactggtgaaatctctgagaaagtcaagctgggcactaaggcactggctggtcaatggctggcttacggtgttactcgcagtgtgactaagcgttcagtcatgacgctggcttacgggtccaaagagttcggcttccgtcaacaagtgctggaagataccattcagccagctattgattccggcaagggtctgatgttcactcagccgaatcaggctgctggatacatggctaagctgatttgggaatctgtgagcgtgacggtggtagctgcggttgaagcaatgaactggcttaagtctgctgctaagctgctggctgctgaggtcaaagataagaagactggagagattcttcgcaagcgttgcgctgtgcattgggtaactcctgatggtttccctgtgtggcaggaatacaagaagcctattcagacgcgcttgaacctgatgttcctcggtcagttccgcttacagcctaccattaacaccaacaaagatagcgagattgatgcacacaaacaggagtctggtatcgctcctaactttgtacacagccaagacggtagccaccttcgtaagactgtagtgtgggcacacgagaagtacggaatcgaatcttttgcactgattcacgactccttcggtacgattccggctgacgctgcgaacctgttcaaagcagtgcgcgaaactatggttgacacatatgagtcttgtgatgtactggctgatttctacgaccagttcgctgaccagttgcacgagtctcaattggacaaaatgccagcacttccggctaaaggtaacttgaacctccgtgacatcttagagtcggacttcgcgttcgcgtaaGGATCCGGCAAGACTGGCCCCGCTTGGCAACGCAACAGTGAGCCCCTCCCTAGTGTGTTTGGGGATGTGACTATGTATTCGTGTGTTGGCCAACGGGTCAACCCGAACAGATTGATACCCGCCTTGGCATTTCCTGTCAGAATGTAACGTCAGTTGATGGTACT(SEQ IDNO:20)
由T7启动子驱动的指导RNA的序列(T7启动子，N表示靶向序列)：
gaaatTAATACGACTCACTATANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAAtagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttt(SEQ ID NO:21)
基因递送：
来自衣藻资源中心(Chlamydomonas Resource Center)的莱茵衣藻株CC-124和CC-125将被用于电穿孔。电穿孔方案遵循来自GeneArt Chlamydomonas Engineering试剂盒的标准推荐方案。
而且，申请人产生组成性地表达Cas9的莱茵衣藻系。这可以通过使用pChlamy1(使用PvuI线性化)并选择潮霉素抗性菌落而完成。以下是包含Cas9的pChlamy1的序列。以此方式实现基因敲除，简单地需要递送指导RNA的RNA。对于同源重组，申请人递送了指导RNA以及线性化同源重组模板。
pChlamy1-Cas9：
TGCGGTATTTCACACCGCATCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGTTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGTCGCTGAGGCTTGACATGATTGGTGCGTATGTTTGTATGAAGCTACAGGACTGATTTGGCGGGCTATGAGGGCGGGGGAAGCTCTGGAAGGGCCGCGATGGGGCGCGCGGCGTCCAGAAGGCGCCATACGGCCCGCTGGCGGCACCCATCCGGTATAAAAGCCCGCGACCCCGAACGGTGACCTCCACTTTCAGCGACAAACGAGCACTTATACATACGCGACTATTCTGCCGCTATACATAACCACTCAGCTAGCTTAAGATCCCATCAAGCTTGCATGCCGGGCGCGCCAGAAGGAGCGCAGCCAAACCAGGATGATGTTTGATGGGGTATTTGAGCACTTGCAACCCTTATCCGGAAGCCCCCTGGCCCACAAAGGCTAGGCGCCAATGCAAGCAGTTCGCATGCAGCCCCTGGAGCGGTGCCCTCCTGATAAACCGGCCAGGGGGCCTATGTTCTTTACTTTTTTACAAGAGAAGTCACTCAACATCTTAAAATGGCCAGGTGAGTCGACGAGCAAGCCCGGCGGATCAGGCAGCGTGCTTGCAGATTTGACTTGCAACGCCCGCATTGTGTCGACGAAGGCTTTTGGCTCCTCTGTCGCTGTCTCAAGCAGCATCTAACCCTGCGTCGCCGTTTCCATTTGCAGGAGATTCGAGGTACCATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTCGCCGAAGAAAAAGCGCAAGGTCGAAGCGTCCGACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGACATCGGCACCAACTCTGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAATTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCCCTGCTGTTCGACAGCGGCGAAACAGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGAGAACCGCCAGAAGAAGATACACCAGACGGAAGAACCGGATCTGCTATCTGCAAGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAGTCCTTCCTGGTGGAAGAGGATAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGAGAAAGAAACTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTATCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAAAACCCCATCAACGCCAGCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGTCTGCCAGACTGAGCAAGAGCAGACGGCTGGAAAATCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAATGGCCTGTTCGGCAACCTGATTGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGATGCCAAACTGCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTTCTGGCCGCCAAGAACCTGTCCGACGCCATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCTCTATGATCAAGAGATACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAAGCTCTCGTGCGGCAGCAGCTGCCTGAGAAGTACAAAGAGATTTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATTGACGGCGGAGCCAGCCAGGAAGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAAAAGATGGACGGCACCGAGGAACTGCTCGTGAAGCTGAACAGAGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCAGCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGAGAGCTGCACGCCATTCTGCGGCGGCAGGAAGATTTTTACCCATTCCTGAAGGACAACCGGGAAAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGCATCCCCTACTACGTGGGCCCTCTGGCCAGGGGAAACAGCAGATTCGCCTGGATGACCAGAAAGAGCGAGGAAACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAAGTGGTGGACAAGGGCGCTTCCGCCCAGAGCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGATAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTATAACGAGCTGACCAAAGTGAAATACGTGACCGAGGGAATGAGAAAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAAAAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAAGTGACCGTGAAGCAGCTGAAAGAGGACTACTTCAAGAAAATCGAGTGCTTCGACTCCGTGGAAATCTCCGGCGTGGAAGATCGGTTCAACGCCTCCCTGGGCACATACCACGATCTGCTGAAAATTATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAATGAGGAAAACGAGGACATTCTGGAAGATATCGTGCTGACCCTGACACTGTTTGAGGACAGAGAGATGATCGAGGAACGGCTGAAAACCTATGCCCACCTGTTCGACGACAAAGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGAGATACACCGGCTGGGGCAGGCTGAGCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGTCCGGCAAGACAATCCTGGATTTCCTGAAGTCCGACGGCTTCGCCAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTTAAAGAGGACATCCAGAAAGCCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGATAGCCTGCACGAGCACATTGCCAATCTGGCCGGCAGCCCCGCCATTAAGAAGGGCATCCTGCAGACAGTGAAGGTGGTGGACGAGCTCGTGAAAGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAAATGGCCAGAGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGACAGAAGAACAGCCGCGAGAGAATGAAGCGGATCGAAGAGGGCATCAAAGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAACACCCCGTGGAAAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAATGGGCGGGATATGTACGTGGACCAGGAACTGGACATCAACCGGCTGTCCGACTACGATGTGGACCATATCGTGCCTCAGAGCTTTCTGAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTGCTGACCAGAAGCGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGACAACGTGCCCTCCGAAGAGGTCGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATTACCCAGAGAAAGTTCGACAATCTGACCAAGGCCGAGAGAGGCGGCCTGAGCGAACTGGATAAGGCCGGCTTCATCAAGAGACAGCTGGTGGAAACCCGGCAGATCACAAAGCACGTGGCACAGATCCTGGACTCCCGGATGAACACTAAGTACGACGAGAATGACAAGCTGATCCGGGAAGTGAAAGTGATCACCCTGAAGTCCAAGCTGGTGTCCGATTTCCGGAAGGATTTCCAGTTTTACAAAGTGCGCGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTCGTGGGAACCGCCCTGATCAAAAAGTACCCTAAGCTGGAAAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAGGAAATCGGCAAGGCTACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTTTTCAAGACCGAGATTACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGGCCTCTGATCGAGACAAACGGCGAAACCGGGGAGATCGTGTGGGATAAGGGCCGGGATTTTGCCACCGTGCGGAAAGTGCTGAGCATGCCCCAAGTGAATATCGTGAAAAAGACCGAGGTGCAGACAGGCGGCTTCAGCAAAGAGTCTATCCTGCCCAAGAGGAACAGCGATAAGCTGATCGCCAGAAAGAAGGACTGGGACCCTAAGAAGTACGGCGGCTTCGACAGCCCCACCGTGGCCTATTCTGTGCTGGTGGTGGCCAAAGTGGAAAAGGGCAAGTCCAAGAAACTGAAGAGTGTGAAAGAGCTGCTGGGGATCACCATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAGAAGAATCCCATCGACTTTCTGGAAGCCAAGGGCTACAAAGAAGTGAAAAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCTAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAAAACGGCCGGAAGAGAATGCTGGCCTCTGCCGGCGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCCCTGCCCTCCAAATATGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTATGAGAAGCTGAAGGGCTCCCCCGAGGATAATGAGCAGAAACAGCTGTTTGTGGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCTCCAAGAGAGTGATCCTGGCCGACGCTAATCTGGACAAAGTGCTGTCCGCCTACAACAAGCACCGGGATAAGCCCATCAGAGAGCAGGCCGAGAATATCATCCACCTGTTTACCCTGACCAATCTGGGAGCCCCTGCCGCCTTCAAGTACTTTGACACCACCATCGACCGGAAGAGGTACACCAGCACCAAAGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGAGCATCACCGGCCTGTACGAGACACGGATCGACCTGTCTCAGCTGGGAGGCGACAGCCCCAAGAAGAAGAGAAAGGTGGAGGCCAGCTAACATATGATTCGAATGTCTTTCTTGCGCTATGACACTTCCAGCAAAAGGTAGGGCGGGCTGCGAGACGGCTTCCCGGCGCTGCATGCAACACCGATGATGCTTCGACCCCCCGAAGCTCCTTCGGGGCTGCATGGGCGCTCCGATGCCGCTCCAGGGCGAGCGCTGTTTAAATAGCCAGGCCCCCGATTGCAAAGACATTATAGCGAGCTACCAAAGCCATATTCAAACACCTAGATCACTACCACTTCTACACAGGCCACTCGAGCTTGTGATCGCACTCCGCTAAGGGGGCGCCTCTTCCTCTTCGTTTCAGTCACAACCCGCAAACATGACACAAGAATCCCTGTTACTTCTCGACCGTATTGATTCGGATGATTCCTACGCGAGCCTGCGGAACGACCAGGAATTCTGGGAGGTGAGTCGACGAGCAAGCCCGGCGGATCAGGCAGCGTGCTTGCAGATTTGACTTGCAACGCCCGCATTGTGTCGACGAAGGCTTTTGGCTCCTCTGTCGCTGTCTCAAGCAGCATCTAACCCTGCGTCGCCGTTTCCATTTGCAGCCGCTGGCCCGCCGAGCCCTGGAGGAGCTCGGGCTGCCGGTGCCGCCGGTGCTGCGGGTGCCCGGCGAGAGCACCAACCCCGTACTGGTCGGCGAGCCCGGCCCGGTGATCAAGCTGTTCGGCGAGCACTGGTGCGGTCCGGAGAGCCTCGCGTCGGAGTCGGAGGCGTACGCGGTCCTGGCGGACGCCCCGGTGCCGGTGCCCCGCCTCCTCGGCCGCGGCGAGCTGCGGCCCGGCACCGGAGCCTGGCCGTGGCCCTACCTGGTGATGAGCCGGATGACCGGCACCACCTGGCGGTCCGCGATGGACGGCACGACCGACCGGAACGCGCTGCTCGCCCTGGCCCGCGAACTCGGCCGGGTGCTCGGCCGGCTGCACAGGGTGCCGCTGACCGGGAACACCGTGCTCACCCCCCATTCCGAGGTCTTCCCGGAACTGCTGCGGGAACGCCGCGCGGCGACCGTCGAGGACCACCGCGGGTGGGGCTACCTCTCGCCCCGGCTGCTGGACCGCCTGGAGGACTGGCTGCCGGACGTGGACACGCTGCTGGCCGGCCGCGAACCCCGGTTCGTCCACGGCGACCTGCACGGGACCAACATCTTCGTGGACCTGGCCGCGACCGAGGTCACCGGGATCGTCGACTTCACCGACGTCTATGCGGGAGACTCCCGCTACAGCCTGGTGCAACTGCATCTCAACGCCTTCCGGGGCGACCGCGAGATCCTGGCCGCGCTGCTCGACGGGGCGCAGTGGAAGCGGACCGAGGACTTCGCCCGCGAACTGCTCGCCTTCACCTTCCTGCACGACTTCGAGGTGTTCGAGGAGACCCCGCTGGATCTCTCCGGCTTCACCGATCCGGAGGAACTGGCGCAGTTCCTCTGGGGGCCGCCGGACACCGCCCCCGGCGCCTGATAAGGATCCGGCAAGACTGGCCCCGCTTGGCAACGCAACAGTGAGCCCCTCCCTAGTGTGTTTGGGGATGTGACTATGTATTCGTGTGTTGGCCAACGGGTCAACCCGAACAGATTGATACCCGCCTTGGCATTTCCTGTCAGAATGTAACGTCAGTTGATGGTACT(SEQ ID NO:22)。
对于所有修饰的莱茵衣藻细胞而言，申请人使用了PCR、SURVEYOR核酸酶测定和DNA测序，以验证成功的修饰。
虽然已经在此示出并描述了本发明的优选实施例，但是对本领域的普通技术人员而言应该显而易见是这样的实施例仅以举例方式提供。在不偏离本发明的情况下众多变化、改变和取代现在将被本领域的普通技术人员想到。应该理解的是，在实践本发明中可以采用在此描述的本发明的实施例的不同替代方案。旨在按照以下权利要求限定本发明的范围，并且在这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物也包括在本发明的范围内。
参考文献：
1.乌尔诺夫，F.D.(Urnov，F.D.)、雷巴尔，E.J.(Rebar，E.J.)、福尔摩斯，M.C.(Holmes，M.C.)、张，H.S.(Zhang，H.S.)&格雷戈里，P.D.(Gregory，P.D.)用工程化的锌指核酸酶进行的基因组编辑(Genome editing with engineered zinc finger nucleases).《遗传学自然评论》(Nat Rev Genet.)11,636-646(2010)。
2.博格丹奥韦(Bogdanove)，A.J.&沃伊塔斯(Voytas)，D.F.TAL效应物：用于DNA靶向的可定制蛋白(TAL effectors:customizable proteins for DNA targeting).《科学》(Science)333,1843-1846(2011)。
3.斯托达德(Stoddard)，B.L.复位内切核酸酶结构以及功能(Homing endonucleasestructure and function).生物物理学季评(Q.Rev.Biophys.)38,49-95(2005)。
4.贝(Bae)，T.&施内温德(Schneewind)，O.用可诱导的逆筛选在金黄色葡萄球菌中进行的等位基因置换(Allelic replacement in Staphylococcus aureus with induciblecounter-selection).质粒(Plasmid)55,58-63(2006)。
5.孙(Sun)g，C.K.，Li，H.，克拉维瑞斯(Claverys)，J.P.&莫里森(Morrison)，D.A.一种rpsL盒，janus，用于通过阴性筛选在肺炎链球菌中进行基因置换(An rpsL cassette,janus,for gene replacement through negative selection in Streptococcuspneumoniae).应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol).67,5190-5196(2001)。
6.沙兰(Sharan)，S.K.，托马森(Thomason)，L.C.，库兹涅佐夫(Kuznetsov)，S.G.&考特(Court)，D.L.重组工程：基于同源重组的基因工程方法(Recombineering:a homologousrecombination-based method of genetic engineering).《自然方案》(Nat.Protoc.)4,206-223(2009)。
7.季聂克(Jinek)，M.等人在自适应细菌免疫中的可编程双重-RNA-引导DNA核酸内切酶(A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterialimmunity).《科学》(Science)337,816-821(2012)。
8.Deveau,H.,Garneau,J.E.&莫万诺(Moineau)，S.CRISPR/Cas系统及其在噬菌体-细菌相互作用中的角色(CRISPR/Cas system and its role in phage-bacteriainteractions).微生物学年鉴(Annu.Rev.Microbiol.)64,475-493(2010)。
9.霍瓦特(Horvath)，P.&巴尔朗勾(Barrangou)，R.CRISPR/Cas，细菌和古细菌的免疫系统(CRISPR/Cas,the immune system of bacteria and archaea).《科学》(Science)327,167-170(2010)。
10.特恩斯(Terns)，M.P.&特恩斯(Terns)，R.M.基于CRISPR的适应性免疫系统(CRISPR-based adaptive immune systems).微生物学现行观点(Curr.Opin.Microbiol.)14,321-327(2011)。
11.范德奥斯特，J.(van der Oost，J.)，捷雷，M.M.(Jore，M.M.)，韦斯特拉，E.R.(Westra，E.R.)伦德格伦，M.(Lundgren，M.)&布龙斯，S.J.(Brouns，S.J.)在原核生物中基于CRISPR的适应性以及可继承免疫(CRISPR-based adaptive and heritable immunityin prokaryotes).《生物化学科学趋势》(Trends.Biochem.Sci.)34，401-407(2009)。
12.布龙斯，S.J.(Brouns，S.J.)等人在原核生物中小CRISPR RNA引导抗病毒防御(Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes).《科学》(Science)321，960-964(2008)。
13.卡特，J.(Carte，J.)，王，R.(Wang，R.)，李，H.(Li，H.)，特恩斯，R.M.(Terns，R.M.)&特恩斯，M.P.(Terns，M.P.)Cas6是在原核生物中产生引导RNA用于入侵物防御的内切核糖核酸酶(Cas6is an endoribonuclease that generates guide RNAs for invaderdefense in prokaryotes).《基因与发育》(Genes Dev.)22，3489-3496(2008)。
14.德尔特科娃，E.(Deltcheva，E.)等人通过反式编码的小RNA和宿主因子RNA酶III熟化CRISPR RNA(CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factorRNase III).《自然》(Nature)471，602-607(2011)。
15.哈托姆-阿斯兰，A.(Hatoum-Aslan，A.)，曼伊夫，I.(Maniv，I.)&马拉菲尼，L.A.(Marraffini，L.A.)成熟成簇的、整齐间隔的、短回文重复RNA(crRNA)长度是通过在前体加工位点锚定的标尺机构测量的(Mature clustered，regularly interspaced，shortpalindromic repeats RNA(crRNA)length is measured by a ruler mechanismanchored at the precursor processing site).《美国科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)108，21218-21222(2011)。
16.华维茨，R.E.(Haurwitz，R.E.)，吉耐克，M.(Jinek，M.)，威登赫夫特，B.(Wiedenheft，B.)，周，K.(Zhou，K.)&杜德那，J.A.(Doudna，J.A.)通过CRISPR内切核酸酶进行序列-以及结构-特异性RNA加工(Sequence-and structure-specific RNA processingby a CRISPR endonuclease).《科学》(Science)329，1355-1358(2010)。
17.德沃，H.(Deveau，H.)等人在嗜热链球菌中对CRISPR编码的抗性的噬菌体响应(Phage response to CRISPR-encoded resistance in Streptococcus thermophilus).《细菌学杂志》(J.Bacteriol.)190,1390-1400(2008)。
18.加斯诺斯，G.(Gasiunas，G.)、巴郎镐，R.(Barrangou，R.)、霍瓦特，P.(Horvath，P.)&西克斯尼斯(Siksnys，V.)Cas9-crRNA核糖核蛋白复合体在细菌中针对获得性免疫介导特异的DNA切割(Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNAcleavage for adaptive immunity in bacteria).《美国科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)(2012)。
19.马卡洛娃，K.S.(Makarova，K.S.)，阿韦德，L.(Aravind，L.)，沃尔夫，Y.I.(Wolf，Y.I.)&库宁，E.V.(Koonin，E.V.)Cas蛋白家族的统一以及CRISPR-Cas系统的起源和进化的简单情境(Unification of Cas protein families and a simple scenario for theorigin and evolution of CRISPR-Cas systems).《生物定向》(Biol.Direct.)6，38(2011)。
20.巴尔朗勾，R.(Barrangou,R.)RNA介导的可编程DNA切割(RNA-mediatedprogrammable DNA cleavage).《自然生物技术》(Nat.Biotechnol.)30,836-838(2012)。
21.布龙斯，S.J.(Brouns，S.J.)《分子生物学》(Molecular biology).免疫的瑞士军刀(A Swiss army knife of immunity).《科学》(Science)337，808-809(2012)。
22.卡罗尔，D.(Carroll，D.)基因靶向的一种CRISPR途径(A CRISPR Approach toGene Targeting).《分子疗法》(Mol.Ther.)20，1658-1660(2012)。
23.必考尔德，D.(Bikard，D.)，哈托姆-阿斯兰，A.(Hatoum-Aslan，A.)，穆奇达，D.(Mucida，D.)&马拉菲尼，L.A.(Marraffini，L.A.)CRISPR干扰可防止在体内细菌感染过程中的天然转化和毒力获取(CRISPR interference can prevent natural transformationand virulence acquisition during in vivo bacterial infection).《细胞宿主微生物》(Cell Host Microbe)12，177-186(2012)。
24.萨普拉诺斯卡斯(Sapranauskas，R.)等人嗜热链球菌CRISPR/Cas系统在大肠杆菌中提供免疫力(The Streptococcus thermophilus CRISPR-Cas system providesimmunity in Escherichia coli).《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)(2011)。
25.塞梅诺娃，E.(Semenova，E.)等人.规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)RNA是通过种子序列给出的(Interference by clustered regularly interspaced shortpalindromic repeat(CRISPR)RNA is governed by a seed sequence).《美国科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)(2011)。
26.威登赫夫特，B.(Wiedenheft，B.)等人.来自细菌性免疫系统的RNA引导复合体通过种子序列相互作用增强靶识别(RNA-guided complex from a bacterial immune systemenhances target recognition through seed sequence interactions).《美国科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)(2011)。
27.扎娜，D.(Zahner，D.)&哈肯贝克，R.(Hakenbeck，R.)肺炎链球菌β-半乳糖苷酶是一种表面蛋白(The Streptococcus pneumoniae beta-galactosidase is a surfaceprotein).《细菌学杂志》(J.Bacteriol.)182，5919-5921(2000)。
28.马拉菲尼，L.A.(Marraffini，L.A.)，迪登特，A.C.(Dedent，A.C.)&施内温德，O.(Schneewind，O.)将蛋白锚定到革兰氏阳性菌的被膜的分选酶和技术(Sortases and theart of anchoring proteins to the envelopes of gram-positive bacteria).《微生物学与分子生物学综述》(Microbiol.Mol.Biol.Rev.)70，192-221(2006)。
29.莫塔梅迪，M.R.(Motamedi，M.R.)，兹格提，S.K.(Szigety，S.K.)&罗森伯格，S.M.(Rosenberg，S.M.)大肠杆菌中的双链断裂修复重组：体内DNA复制机制的物理证据(Double-strand-break repair recombination in Escherichia coli:physicalevidence for a DNA replication mechanism in vivo).《基因与发育》(Genes Dev).13，2889-2903(1999)。
30.霍萨卡，T.(Hosaka，T.)等人核糖体蛋白S12中的新颖突变K87E在大肠杆菌的后期生长阶段过程中增强蛋白合成活性(The novel mutation K87E in ribosomal proteinS12enhances protein synthesis activity during the late growth phase inEscherichia coli).《分子遗传学基因组学》(Mol.Genet.Genomics)271,317-324(2004)。
31.科斯坦蒂诺，N.(Costantino，N.)&考特，D.L.(Court，D.L.)在错配修复突变体中增强水平的λ红介导的重组体(Enhanced levels of lambda Red-mediated recombinantsin mismatch repair mutants).《美国科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)100，15748-15753(2003)。
32.埃德加，R.(Edgar，R.)&奇姆龙，U.(Qimron，U.)肠杆菌CRISPR系统保护溶素原免受λ溶源化作用以及原噬菌体诱导(The Escherichia coli CRISPR system protects fromlambda lysogenization，lysogens，and prophage induction).《细菌学杂志》(J.Bacteriol.)192，6291-6294(2010)。
33.马拉菲尼，L.A.(Marraffini，L.A.)&松塞摩尔，E.J.(Sontheimer，E.J.)在CRISPRRNA指导的免疫过程中的自我辨别对非自我辨别(Self versus non-self discriminationduring CRISPR RNA-directed immunity).《自然》(Nature)463，568-571(2010)。
34.费舍尔，S.(Fischer，S.)等人古生菌免疫系统可检测多个原型间隔子邻近基序(PAM)以靶向入侵物DNA(An archaeal immune system can detect multipleProtospacer Adjacent Motifs(PAMs)to target invader DNA).《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)287，33351-33363(2012)。
35.歌德博格斯道蒂尔，S.(Gudbergsdottir，S.)等人当用载体传播的病毒和质粒基因以及原型间隔子激发时，硫化裂片菌CRISPR/Cas以及CRISPR/Cmr系统的动态性能(Dynamicproperties of the Sulfolobus CRISPR-Cas and CRISPR/Cmr systems whenchallenged with vector-borne viral and plasmid genes and protospacers).《分子微生物学》(Mol.Microbiol.)79，35-49(2011)。
36.王，H.H.(Wang，H.H.)等人通过共选择MAGE进行的基因组规模启动子工程((Genome-scale promoter engineering by coselection MAGE).《自然方法》(NatMethods)9，591-593(2012)。
37.丛，L.(Cong，L.)等人使用CRISPR/Cas系统的多重基因组工程化(MultiplexGenome Engineering Using CRISPR/Cas Systems).《科学》(Science)出版中(2013)。
38.玛丽，P.(Mali，P.)等人通过Cas9进行的RNA引导的人类基因组工程(RNA-GuidedHuman Genome Engineering via Cas9).《科学》(Science)出版中(2013)。
39.霍斯金斯，J.(Hoskins，J.)等人.细菌肺炎链球菌菌株R6的基因组(Genome of thebacterium Streptococcus pneumoniae strain R6).《细菌学杂志》(J.Bacteriol.)183,5709-5717(2001)。
40.哈维尔斯泰因，L.S.(Havarstein，L.S.)，库马拉斯瓦米，G.(Coomaraswamy，G.)&莫里森，D.A.(Morrison，D.A.)未修饰的十七肽信息素诱导针对肺炎链球菌中的遗传转化的感受态(An unmodified heptadecapeptide pheromone induces competence forgenetic transformation in Streptococcus pneumoniae).《美国科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)92,11140-11144(1995)。
41.堀之内，S.(Horinouchi，S.)&维斯布卢姆，B.(Weisblum，B.)指定可诱导氯霉素抗性的一种质粒pC194的核苷酸序列以及功能性图(Nucleotide sequence and functionalmap of pC194，a plasmid that specifies inducible chloramphenicol resistance)《细菌学杂志》(J.Bacteriol.)150,815-825(1982)。
42.荷顿(Horton)，R.M.DNA的体外重组和诱变：基因拼接一起专用的基因.分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)15,251-261(1993)。
43.波德比尔斯基(Podbielski)，A.，斯佩莱博格(Spellerberg)，B.，沃伊施尼克(Woischnik)，M.，波尔(Pohl)，B.&鲁提肯(Lutticken)，R.用于组A链球菌(GAS)中的基因失活以及表达分析的新系列的质粒载体(Novel series of plasmid vectors for geneinactivation and expression analysis in group A streptococci(GAS)).基因(Gene)177,137-147(1996)。
44.胡斯曼(Husmann)，L.K.，斯科特(Scott)，J.R.，林达尔(Lindahl)，G.&斯坦伯格(Stenberg)，L.Arp蛋白即M蛋白家族的一员的表达不足够抑制化脓链球菌的噬菌体细胞增多(Expression of the Arp protein,a member of the M protein family,is notsufficient to inhibit phagocytosis of Streptococcus pyogenes).传染以及免疫(Infection and immunity)63,345-348(1995)。
45.吉布森(Gibson)，D.G.等人几百千碱基的DNA分子的酶拼接(Enzymatic assemblyof DNA molecules up to several hundred kilobases).自然：方法6(Nat Methods 6)，343-345(2009)。
46.加尔诺，J.E.(Garneau，J.E.)等人CRISPR/Cas细菌免疫系统切割噬菌体和质粒DNA(The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmidDNA).《自然》(Nature)468,67-71(2010年11月04日)。
47.巴郎镐R.(Barrangou R.)等人CRISPR在原核生物中提供了对抗病毒的获得性抗性(CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes).《科学》(Science)2007年3月23日；315(5819):1709-12。
48.石野Y.(Ishino Y.)等人在大肠杆菌中负责碱性磷酸酶同工酶转化的iap基因的核苷酸序列以及基因产物的鉴定(Nucleotide sequence of the iap gene,responsiblefor alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli,andidentification of the gene product).《细菌学杂志》(J Bacteriol.)1987年12月；169(12):5429-33。
49.莫吉卡F.J.M.(Mojica F.J.M)等人规律间隔的重复序列家族在古生菌、细菌和线粒体的基因组中的生物学意义(Biological significance of a family of regularlyspaced repeats in the genomes of Archaea,Bacteria and mitochondria).《分子微生物学》(Molecular Microbiology)(2000)36(1),244-246。
50.詹森R.(Jansen R.)等人在原核生物中鉴定与DNA重复相关的基因(Identification of genes that are associated with DNA repeats inprokaryotes).《分子微生物学》(Molecular Microbiology)(2002)43(6),1565-1575。

Claims (27)

1.一种改变一种或多种基因产物的表达的方法，该方法包括向包含并表达编码该一种或多种基因产物的DNA分子的细胞中引入一种工程化的非天然存在的CRISPR-Cas系统，该系统包括一种Cas蛋白和一种或多种指导RNA，该一种或多种指导RNA靶向这些DNA分子，由此该一种或多种指导RNA靶向编码该一种或多种基因产物的DNA分子的基因组座位并且该Cas蛋白切割编码该一种或多种基因产物的DNA分子的基因组座位，由此该一种或多种基因产物的表达被改变；并且，其中该Cas蛋白和该指导RNA并不共同天然存在。
2.一种改变一种或多种基因产物的表达的方法，该方法包括向包含并表达编码该一种或多种基因产物的DNA分子的细胞中引入一种工程化的非天然存在的载体系统，该载体系统包括一种或多种载体，该一种或多种载体包括：
a)一种第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接到一种或多种CRISPR-Cas系统指导RNA上，该一种或多种CRISPR-Cas系统指导RNA与编码该一种或多种基因产物的DNA分子的基因组座位中的靶序列杂交，
b)一种第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接至一种Cas蛋白，
其中组分(a)和(b)位于该系统的相同或不同载体上，
由此这些指导RNA靶向编码该一种或多种基因产物的DNA分子的基因组座位并且该Cas蛋白切割编码该一种或多种基因产物的DNA分子的基因组座位，由此该一种或多种基因产物的表达被改变；并且，其中该Cas蛋白和这些指导RNA并不共同天然存在。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中两种或更多种基因产物的表达被改变。
4.如任何以上权利要求所述的方法，其中该系统的载体或Cas蛋白进一步包括一个或多个NLS。
5.如任何以上权利要求所述的方法，其中这些指导RNA包括一种融合到tracr序列上的指导序列。
6.如任何以上权利要求所述的方法，其中该细胞是一种真核细胞。
7.如权利要求6所述的方法，其中该真核细胞是一种哺乳动物细胞。
8.如权利要求7所述的方法，其中该哺乳动物细胞是一种人类细胞。
9.如任何以上权利要求所述的方法，其中该Cas蛋白是一种Cas9蛋白。
10.如任何以上权利要求所述的方法，其中该Cas蛋白是密码子优化的，用于在真核细胞中进行表达。
11.如任何以上权利要求所述的方法，其中该基因产物的表达被降低。
12.如任何以上权利要求所述的方法，其中该基因产物是一种蛋白质。
13.如任何以上权利要求所述的方法，其中引入该细胞中是经由一种递送系统，该递送系统包括病毒粒子、脂质体、电穿孔、显微注射或缀合。
14.一种工程化的非天然存在的载体系统，该载体系统包括一种或多种载体，该一种或多种载体包括：
a)一种第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接到一种或多种CRISPR-Cas系统指导RNA上，该一种或多种CRISPR-Cas系统指导RNA与编码一种或多种基因产物的DNA分子的基因组座位中的靶序列杂交，
b)一种第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接至一种Cas蛋白，
其中组分(a)和(b)位于该系统的相同或不同载体上，
由此这些指导RNA在细胞中靶向编码该一种或多种基因产物的DNA分子的基因组座位并且该Cas蛋白切割编码该一种或多种基因产物的DNA分子的基因组座位，由此该一种或多种基因产物的表达被改变；并且，其中该Cas蛋白和这些指导RNA并不共同天然存在。
15.一种工程化的、可编程的、非天然存在的CRISPR-Cas系统，该系统包括一种Cas蛋白以及一种或多种指导RNA，该一种或多种指导RNA在细胞中靶向编码一种或多种基因产物的DNA分子的基因组座位，并且该Cas蛋白切割编码该一种或多种基因产物的DNA分子的基因组座位，由此该一种或多种基因产物的表达被改变；并且，其中该Cas蛋白和这些指导RNA并不共同天然存在。
16.如权利要求14或15所述的系统，其中两种或更多种基因产物的表达被改变。
17.如权利要求14至16中任一项所述的系统，其中该系统进一步包括一个或多个NLS。
18.如权利要求14至17中任一项所述的系统，其中这些指导RNA包括一种融合到tracr序列上的指导序列。
19.如权利要求14至18中任一项所述的系统，其中该细胞是一种真核细胞。
20.如权利要求19所述的系统，其中该真核细胞是一种哺乳动物细胞。
21.如权利要求20所述的系统，其中该哺乳动物细胞是一种人类细胞。
22.如权利要求14至21中任一项所述的系统，其中该CRISPR-Cas系统是一种II型CRISPR-Cas系统。
23.如权利要求14至22中任一项所述的系统，其中该Cas蛋白是一种Cas9蛋白。
24.如权利要求14至23中任一项所述的系统，其中该Cas蛋白是密码子优化的，用于在真核细胞中进行表达。
25.如权利要求14至24中任一项所述的系统，其中该基因产物的表达被降低。
26.如权利要求14至25中任一项所述的系统，其中该基因产物是一种蛋白质。
27.如权利要求14至26中任一项所述的系统，其中经由一种递送系统将该系统引入该细胞中，该递送系统包括病毒粒子、脂质体、电穿孔、显微注射或缀合。
CN201380072715.1A 2012-12-12 2013-12-12 用于改变基因产物的表达的crispr-cas系统和方法 Active CN106170549B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610902578.5A CN106480080B (zh) 2012-12-12 2013-12-12 用于改变基因产物的表达的crispr-cas系统和方法
CN202010072631.XA CN111187772A (zh) 2012-12-12 2013-12-12 用于改变基因产物的表达的crispr-cas系统和方法

Applications Claiming Priority (13)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261736527P 2012-12-12 2012-12-12
US61/736527 2012-12-12
US201361748427P 2013-01-02 2013-01-02
US61/748427 2013-01-02
US201361791409P 2013-03-15 2013-03-15
US61/791409 2013-03-15
US201361835931P 2013-06-17 2013-06-17
US61/835931 2013-06-17
US201361842322P 2013-07-02 2013-07-02
US61/842322 2013-07-02
US14/054,414 US8697359B1 (en) 2012-12-12 2013-10-15 CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
US14/054414 2013-10-15
PCT/US2013/074743 WO2014093661A2 (en) 2012-12-12 2013-12-12 Crispr-cas systems and methods for altering expression of gene products

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610902578.5A Division CN106480080B (zh) 2012-12-12 2013-12-12 用于改变基因产物的表达的crispr-cas系统和方法
CN202010072631.XA Division CN111187772A (zh) 2012-12-12 2013-12-12 用于改变基因产物的表达的crispr-cas系统和方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106170549A true CN106170549A (zh) 2016-11-30
CN106170549B CN106170549B (zh) 2020-02-21

Family

ID=50441380

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380072715.1A Active CN106170549B (zh) 2012-12-12 2013-12-12 用于改变基因产物的表达的crispr-cas系统和方法
CN201610902578.5A Active CN106480080B (zh) 2012-12-12 2013-12-12 用于改变基因产物的表达的crispr-cas系统和方法
CN202010072631.XA Pending CN111187772A (zh) 2012-12-12 2013-12-12 用于改变基因产物的表达的crispr-cas系统和方法

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610902578.5A Active CN106480080B (zh) 2012-12-12 2013-12-12 用于改变基因产物的表达的crispr-cas系统和方法
CN202010072631.XA Pending CN111187772A (zh) 2012-12-12 2013-12-12 用于改变基因产物的表达的crispr-cas系统和方法

Country Status (15)

Country Link
US (8) US8697359B1 (zh)
EP (2) EP2998400A1 (zh)
JP (5) JP6545621B2 (zh)
KR (1) KR20150107739A (zh)
CN (3) CN106170549B (zh)
AU (4) AU2013359238B2 (zh)
BR (1) BR112015013785A2 (zh)
CA (1) CA2894688A1 (zh)
DK (1) DK2764103T3 (zh)
ES (1) ES2552535T3 (zh)
HK (2) HK1201290A1 (zh)
PL (1) PL2764103T3 (zh)
PT (1) PT2764103E (zh)
RU (1) RU2687451C1 (zh)
WO (1) WO2014093661A2 (zh)

Families Citing this family (1175)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9314005B2 (en) 2009-07-01 2016-04-19 Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. Genetically modified rat models for severe combined immunodeficiency (SCID)
EP2579711B1 (en) 2010-06-11 2019-04-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Production of fertile xy female animals from xy es cells
US9730967B2 (en) 2011-02-04 2017-08-15 Katherine Rose Kovarik Method and system for treating cancer cachexia
US11191665B2 (en) 2011-02-04 2021-12-07 Joseph E. Kovarik Method and system for reducing the likelihood of a porphyromonas gingivalis infection in a human being
US10314865B2 (en) 2011-02-04 2019-06-11 Katherine Rose Kovarik Method and system for treating cancer and other age-related diseases by extending the healthspan of a human
US11844720B2 (en) 2011-02-04 2023-12-19 Seed Health, Inc. Method and system to reduce the likelihood of dental caries and halitosis
US10842834B2 (en) 2016-01-06 2020-11-24 Joseph E. Kovarik Method and system for reducing the likelihood of developing liver cancer in an individual diagnosed with non-alcoholic fatty liver disease
US10583033B2 (en) 2011-02-04 2020-03-10 Katherine Rose Kovarik Method and system for reducing the likelihood of a porphyromonas gingivalis infection in a human being
US11419903B2 (en) 2015-11-30 2022-08-23 Seed Health, Inc. Method and system for reducing the likelihood of osteoporosis
US11951140B2 (en) 2011-02-04 2024-04-09 Seed Health, Inc. Modulation of an individual's gut microbiome to address osteoporosis and bone disease
US10512661B2 (en) 2011-02-04 2019-12-24 Joseph E. Kovarik Method and system for reducing the likelihood of developing liver cancer in an individual diagnosed with non-alcoholic fatty liver disease
US11951139B2 (en) 2015-11-30 2024-04-09 Seed Health, Inc. Method and system for reducing the likelihood of osteoporosis
US11273187B2 (en) 2015-11-30 2022-03-15 Joseph E. Kovarik Method and system for reducing the likelihood of developing depression in an individual
US9528124B2 (en) 2013-08-27 2016-12-27 Recombinetics, Inc. Efficient non-meiotic allele introgression
US10920242B2 (en) 2011-02-25 2021-02-16 Recombinetics, Inc. Non-meiotic allele introgression
US10323236B2 (en) 2011-07-22 2019-06-18 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
HUE047507T2 (hu) 2011-10-17 2020-04-28 Massachusetts Inst Technology Intracelluláris célbajuttatás
RU2663354C2 (ru) 2011-12-16 2018-08-03 Таргитджин Байотекнолоджиз Лтд Композиции и способы для модификации заданной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени
US11021737B2 (en) 2011-12-22 2021-06-01 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for analyte detection
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
EP2825663B1 (en) 2012-03-13 2019-08-07 Board of Trustees of the University of Arkansas Separatome-based protein expression and purification platform
US9637739B2 (en) 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
SG10201702445TA (en) 2012-04-25 2017-04-27 Regeneron Pharma Nuclease-mediated targeting with large targeting vectors
RS64622B1 (sr) 2012-05-25 2023-10-31 Univ California Metode i sastavi za modifikaciju ciljane dnk upravljenu pomoću rnk i za modulaciju transkripcije upravljanu rnk
CA2877290A1 (en) 2012-06-19 2013-12-27 Daniel F. Voytas Gene targeting in plants using dna viruses
AU2013289206B2 (en) 2012-07-11 2018-08-09 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for the treatment of lysosomal storage diseases
US10648001B2 (en) 2012-07-11 2020-05-12 Sangamo Therapeutics, Inc. Method of treating mucopolysaccharidosis type I or II
ES2757623T3 (es) * 2012-07-25 2020-04-29 Broad Inst Inc Proteínas de unión a ADN inducibles y herramientas de perturbación genómica y aplicaciones de las mismas
JP6517143B2 (ja) 2012-10-23 2019-05-22 ツールゲン インコーポレイテッド 標的ｄｎａに特異的なガイドｒｎａおよびｃａｓタンパク質コード核酸またはｃａｓタンパク質を含む、標的ｄｎａを切断するための組成物、ならびにその使用
WO2014066830A1 (en) * 2012-10-25 2014-05-01 Department Of Veterans Affairs Composition and methods for the prevention and treatment of diet-induced obesity
KR102006880B1 (ko) 2012-12-06 2019-08-02 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨 Crispr-기초된 유전체 변형과 조절
PT2898075E (pt) 2012-12-12 2016-06-16 Harvard College Manipulação e otimização de sistemas, métodos e composições de enzima melhorados para manipulação de sequências
PT2896697E (pt) * 2012-12-12 2015-12-31 Massachusetts Inst Technology Engenharia de sistemas, métodos e composições guia otimizadas para a manipulação de sequências
EP4286402A3 (en) 2012-12-12 2024-02-14 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation
WO2014093718A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Methods, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
IL239317B (en) 2012-12-12 2022-07-01 Broad Inst Inc Providing, engineering and optimizing systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
EP3434776A1 (en) 2012-12-12 2019-01-30 The Broad Institute, Inc. Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
DK2931898T3 (en) 2012-12-12 2016-06-20 Massachusetts Inst Technology CONSTRUCTION AND OPTIMIZATION OF SYSTEMS, PROCEDURES AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION WITH FUNCTIONAL DOMAINS
SG11201504621RA (en) 2012-12-17 2015-07-30 Harvard College Rna-guided human genome engineering
CA2898184A1 (en) 2013-01-16 2014-07-24 Emory University Cas9-nucleic acid complexes and uses related thereto
PT2963113T (pt) * 2013-02-14 2020-02-14 Univ Osaka Método para isolar região genómica específica utilizando molécula que se liga especificamente a sequência de adn endógena
ES2904803T3 (es) 2013-02-20 2022-04-06 Regeneron Pharma Modificación genética de ratas
US10138509B2 (en) 2013-03-12 2018-11-27 President And Fellows Of Harvard College Method for generating a three-dimensional nucleic acid containing matrix
WO2014153118A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Treatment of diseases and conditions associated with dysregulation of mammalian target of rapamycin complex 1 (mtorc1)
ES2901396T3 (es) 2013-03-14 2022-03-22 Caribou Biosciences Inc Composiciones y métodos de ácidos nucleicos dirigidos a ácido nucleico
US10119133B2 (en) 2013-03-15 2018-11-06 The General Hospital Corporation Using truncated guide RNAs (tru-gRNAs) to increase specificity for RNA-guided genome editing
US10760064B2 (en) 2013-03-15 2020-09-01 The General Hospital Corporation RNA-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci
US20140273235A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Regents Of The University Of Minnesota ENGINEERING PLANT GENOMES USING CRISPR/Cas SYSTEMS
US20140273230A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Sigma-Aldrich Co., Llc Crispr-based genome modification and regulation
US9234213B2 (en) 2013-03-15 2016-01-12 System Biosciences, Llc Compositions and methods directed to CRISPR/Cas genomic engineering systems
US9957515B2 (en) 2013-03-15 2018-05-01 Cibus Us Llc Methods and compositions for targeted gene modification
JP2016522679A (ja) 2013-04-04 2016-08-04 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いたゲノム編集の治療的使用
RS58255B1 (sr) 2013-04-16 2019-03-29 Regeneron Pharma Ciljana modifikacija genoma pacova
WO2014172470A2 (en) * 2013-04-16 2014-10-23 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods of mutating, modifying or modulating nucleic acid in a cell or nonhuman mammal
EP2997146A4 (en) 2013-05-15 2017-04-26 Sangamo BioSciences, Inc. Methods and compositions for treatment of a genetic condition
WO2014186686A2 (en) * 2013-05-17 2014-11-20 Two Blades Foundation Targeted mutagenesis and genome engineering in plants using rna-guided cas nucleases
EP3778899A1 (en) 2013-05-22 2021-02-17 Northwestern University Rna-directed dna cleavage and gene editing by cas9 enzyme from neisseria meningitidis
WO2014194190A1 (en) 2013-05-30 2014-12-04 The Penn State Research Foundation Gene targeting and genetic modification of plants via rna-guided genome editing
US9267135B2 (en) 2013-06-04 2016-02-23 President And Fellows Of Harvard College RNA-guided transcriptional regulation
WO2014197568A2 (en) * 2013-06-04 2014-12-11 President And Fellows Of Harvard College Rna-guideded transcriptional regulation
AU2014274840B2 (en) * 2013-06-05 2020-03-12 Duke University RNA-guided gene editing and gene regulation
EP3008181B1 (en) 2013-06-11 2019-11-06 The Regents of The University of California Methods and compositions for target dna modification
KR20160044457A (ko) 2013-06-17 2016-04-25 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 서열 조작을 위한 탠덤 안내 시스템, 방법 및 조성물의 전달, 조작 및 최적화
AU2014281027A1 (en) 2013-06-17 2016-01-28 Massachusetts Institute Of Technology Optimized CRISPR-Cas double nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation
RU2716420C2 (ru) 2013-06-17 2020-03-11 Те Брод Инститьют Инк. Доставка и применение систем crispr-cas, векторов и композиций для целенаправленного воздействия и терапии в печени
WO2014204727A1 (en) * 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof
SG10201710487VA (en) * 2013-06-17 2018-01-30 Broad Inst Inc Delivery, Use and Therapeutic Applications of the Crispr-Cas Systems and Compositions for Targeting Disorders and Diseases Using Viral Components
US10011850B2 (en) 2013-06-21 2018-07-03 The General Hospital Corporation Using RNA-guided FokI Nucleases (RFNs) to increase specificity for RNA-Guided Genome Editing
JP2016528890A (ja) 2013-07-09 2016-09-23 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いるゲノム編集の治療用の使用
EP3666892A1 (en) 2013-07-10 2020-06-17 President and Fellows of Harvard College Orthogonal cas9 proteins for rna-guided gene regulation and editing
WO2015010114A1 (en) 2013-07-19 2015-01-22 Larix Bioscience, Llc Methods and compositions for producing double allele knock outs
US11060083B2 (en) 2013-07-19 2021-07-13 Larix Bioscience Llc Methods and compositions for producing double allele knock outs
US11306328B2 (en) 2013-07-26 2022-04-19 President And Fellows Of Harvard College Genome engineering
US9163284B2 (en) * 2013-08-09 2015-10-20 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease
AU2014306423B2 (en) 2013-08-16 2019-04-18 Massachusetts Institute Of Technology Selective delivery of material to cells
CN105916989A (zh) 2013-08-22 2016-08-31 纳幕尔杜邦公司 大豆u6聚合酶iii启动子及其使用方法
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
CA2920899C (en) 2013-08-28 2023-02-28 Sangamo Biosciences, Inc. Compositions for linking dna-binding domains and cleavage domains
US20160251410A1 (en) 2013-09-03 2016-09-01 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Compositions and methods for expressing recombinant polypeptides
US9340799B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College MRNA-sensing switchable gRNAs
US9737604B2 (en) 2013-09-06 2017-08-22 President And Fellows Of Harvard College Use of cationic lipids to deliver CAS9
US9322037B2 (en) 2013-09-06 2016-04-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof
US9822371B2 (en) 2013-09-17 2017-11-21 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas E. coli separatome-based protein expression and purification platform
EP3418379B1 (en) * 2013-09-18 2020-12-09 Kymab Limited Methods, cells & organisms
WO2015048690A1 (en) * 2013-09-27 2015-04-02 The Regents Of The University Of California Optimized small guide rnas and methods of use
WO2015057976A1 (en) 2013-10-17 2015-04-23 Sangamo Biosciences, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering in hematopoietic stem cells
DK3441468T3 (da) 2013-10-17 2021-07-26 Sangamo Therapeutics Inc Afgivelsesfremgangsmåder og sammensætninger til nukleasemedieret genom-manipulation
US10767156B2 (en) 2013-10-24 2020-09-08 Yeda Research And Development Co., Ltd. Polynucleotides encoding BREX system polypeptides and methods of using same
WO2015065964A1 (en) * 2013-10-28 2015-05-07 The Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, screens and applications thereof
US10584358B2 (en) * 2013-10-30 2020-03-10 North Carolina State University Compositions and methods related to a type-II CRISPR-Cas system in Lactobacillus buchneri
WO2015070062A1 (en) * 2013-11-07 2015-05-14 Massachusetts Institute Of Technology Cell-based genomic recorded accumulative memory
KR102523466B1 (ko) 2013-11-07 2023-04-20 에디타스 메디신, 인코포레이티드 지배적인 gRNA를 이용하는 CRISPR-관련 방법 및 조성물
US10787684B2 (en) 2013-11-19 2020-09-29 President And Fellows Of Harvard College Large gene excision and insertion
US9074199B1 (en) 2013-11-19 2015-07-07 President And Fellows Of Harvard College Mutant Cas9 proteins
WO2015088643A1 (en) 2013-12-11 2015-06-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the targeted modification of a genome
SG10201804976YA (en) 2013-12-12 2018-07-30 Broad Inst Inc Delivery, Use and Therapeutic Applications of the Crispr-Cas Systems and Compositions for Genome Editing
US9068179B1 (en) 2013-12-12 2015-06-30 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting presenilin point mutations
RU2016128077A (ru) 2013-12-12 2018-12-06 Те Брод Инститьют Инк. Доставка, применение и применения в терапии систем и композиций crispr-cas для лечения обусловленных hbv и вирусных заболеваний и нарушений
WO2015089473A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Engineering of systems, methods and optimized guide compositions with new architectures for sequence manipulation
EP3835419A1 (en) * 2013-12-12 2021-06-16 The Regents of The University of California Methods and compositions for modifying a single stranded target nucleic acid
JP6793547B2 (ja) 2013-12-12 2020-12-02 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 最適化機能ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系による配列操作のための系、方法および組成物
WO2015089364A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Crystal structure of a crispr-cas system, and uses thereof
AU2014362248A1 (en) 2013-12-12 2016-06-16 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods of use of CRISPR-Cas systems in nucleotide repeat disorders
WO2015089419A2 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for targeting disorders and diseases using particle delivery components
AU2014361834B2 (en) 2013-12-12 2020-10-22 Massachusetts Institute Of Technology CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products, structural information and inducible modular Cas enzymes
WO2015089375A1 (en) 2013-12-13 2015-06-18 The General Hospital Corporation Soluble high molecular weight (hmw) tau species and applications thereof
CA2931684C (en) 2013-12-19 2024-02-20 Novartis Ag Human mesothelin chimeric antigen receptors and uses thereof
US11826388B2 (en) 2013-12-20 2023-11-28 Seed Health, Inc. Topical application of Lactobacillus crispatus to ameliorate barrier damage and inflammation
US11833177B2 (en) 2013-12-20 2023-12-05 Seed Health, Inc. Probiotic to enhance an individual's skin microbiome
US11839632B2 (en) 2013-12-20 2023-12-12 Seed Health, Inc. Topical application of CRISPR-modified bacteria to treat acne vulgaris
WO2015103026A2 (en) 2014-01-03 2015-07-09 The Regents Of The University Of Michigan Treatment of neurological disorders
US9850525B2 (en) * 2014-01-29 2017-12-26 Agilent Technologies, Inc. CAS9-based isothermal method of detection of specific DNA sequence
GB201401707D0 (en) * 2014-01-31 2014-03-19 Sec Dep For Health The Adeno-associated viral vectors
KR102496984B1 (ko) 2014-02-11 2023-02-06 더 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 콜로라도, 어 바디 코퍼레이트 Crispr 이용의 다중화된 게놈 조작
US10287590B2 (en) * 2014-02-12 2019-05-14 Dna2.0, Inc. Methods for generating libraries with co-varying regions of polynuleotides for genome modification
WO2015126927A2 (en) 2014-02-18 2015-08-27 Duke University Compositions for the inactivation of virus replication and methods of making and using the same
AU2015222944A1 (en) 2014-02-27 2016-09-08 Massachusetts Institute Of Technology T cell balance gene expression, compositions of matters and methods of use thereof
WO2015131101A1 (en) 2014-02-27 2015-09-03 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for site directed genomic modification
WO2015134812A1 (en) 2014-03-05 2015-09-11 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating usher syndrome and retinitis pigmentosa
EP3613854A1 (en) * 2014-03-05 2020-02-26 National University Corporation Kobe University Genomic sequence modification method for specifically converting nucleic acid bases of targeted dna sequence, and molecular complex for use in same
US11339437B2 (en) 2014-03-10 2022-05-24 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
US9938521B2 (en) 2014-03-10 2018-04-10 Editas Medicine, Inc. CRISPR/CAS-related methods and compositions for treating leber's congenital amaurosis 10 (LCA10)
US11141493B2 (en) 2014-03-10 2021-10-12 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290-associated disease
EP3116533B1 (en) * 2014-03-12 2020-08-12 Precision Biosciences, Inc. Dystrophin gene exon deletion using engineered nucleases
RS65213B1 (sr) 2014-03-14 2024-03-29 Cibus Us Llc Postupci i kompozicije za povećanje efikasnosti ciljane modifikacije gena korišćenjem reparacije gena posredovane oligonukleotidima
EP3593812A3 (en) 2014-03-15 2020-05-27 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric antigen receptor
WO2015139139A1 (en) * 2014-03-20 2015-09-24 UNIVERSITé LAVAL Crispr-based methods and products for increasing frataxin levels and uses thereof
EP3122880B1 (en) * 2014-03-26 2021-05-05 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating sickle cell disease
PL3129470T3 (pl) 2014-04-07 2021-11-29 Novartis Ag Leczenie nowotworu złośliwego z zastosowaniem chimerycznego receptora antygenowego anty-CD19
CN106460003A (zh) 2014-04-08 2017-02-22 北卡罗来纳州立大学 用于使用crispr相关基因rna引导阻遏转录的方法和组合物
SG10201809157VA (en) * 2014-04-18 2018-11-29 Editas Medicine Inc Crispr-cas-related methods, compositions and components for cancer immunotherapy
CA2946378A1 (en) * 2014-04-22 2015-10-29 Q-State Biosciences, Inc. Analysis of compounds for pain and sensory disorders
WO2015168404A1 (en) * 2014-04-30 2015-11-05 Massachusetts Institute Of Technology Toehold-gated guide rna for programmable cas9 circuitry with rna input
GB201407852D0 (en) 2014-05-02 2014-06-18 Iontas Ltd Preparation of libraries od protein variants expressed in eukaryotic cells and use for selecting binding molecules
EP3142707A4 (en) 2014-05-13 2018-02-21 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for prevention or treatment of a disease
AU2015266767A1 (en) 2014-05-30 2016-12-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compositions and methods to treat latent viral infections
WO2015188056A1 (en) 2014-06-05 2015-12-10 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for nuclease design
RU2704283C9 (ru) 2014-06-06 2020-02-07 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Способы и композиции для модификации целевого локуса
WO2015191693A2 (en) 2014-06-10 2015-12-17 Massachusetts Institute Of Technology Method for gene editing
CA2952121A1 (en) 2014-06-13 2015-12-17 Childrens' Medical Center Corporation Products and methods to isolate mitochondria
CN106852157B (zh) 2014-06-16 2022-04-12 约翰斯·霍普金斯大学 用于使用h1启动子表达crispr向导rna的组合物和方法
BR112016030145A8 (pt) 2014-06-23 2018-12-11 Regeneron Pharma métodos para a montagem de ao menos dois ácidos nucleicos e de dois ou mais ácidos nucleicos
WO2015200378A1 (en) 2014-06-23 2015-12-30 The General Hospital Corporation Genomewide unbiased identification of dsbs evaluated by sequencing (guide-seq)
ES2694629T3 (es) * 2014-06-26 2018-12-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Métodos y composiciones para modificaciones genéticas objetivo y métodos de uso
US20180187172A1 (en) * 2014-07-01 2018-07-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Regulated gene expression from viral vectors
WO2016005985A2 (en) 2014-07-09 2016-01-14 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Method for reprogramming cells
WO2016007347A1 (en) 2014-07-11 2016-01-14 E. I. Du Pont De Nemours And Company Compositions and methods for producing plants resistant to glyphosate herbicide
WO2016011080A2 (en) * 2014-07-14 2016-01-21 The Regents Of The University Of California Crispr/cas transcriptional modulation
EP3169310A1 (en) 2014-07-15 2017-05-24 Life Technologies Corporation Compositions with lipid aggregates and methods for efficient delivery of molecules to cells
WO2016014530A1 (en) 2014-07-21 2016-01-28 Novartis Ag Combinations of low, immune enhancing. doses of mtor inhibitors and cars
US11542488B2 (en) 2014-07-21 2023-01-03 Novartis Ag Sortase synthesized chimeric antigen receptors
TWI750110B (zh) 2014-07-21 2021-12-21 瑞士商諾華公司 使用人類化抗-ｂｃｍａ嵌合抗原受體治療癌症
KR102594343B1 (ko) 2014-07-21 2023-10-26 노파르티스 아게 Cd33 키메라 항원 수용체를 사용한 암의 치료
US9816074B2 (en) 2014-07-25 2017-11-14 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for modulating nuclease-mediated genome engineering in hematopoietic stem cells
US9757420B2 (en) 2014-07-25 2017-09-12 Sangamo Therapeutics, Inc. Gene editing for HIV gene therapy
WO2016019144A2 (en) 2014-07-30 2016-02-04 Sangamo Biosciences, Inc. Gene correction of scid-related genes in hematopoietic stem and progenitor cells
AU2015298571B2 (en) 2014-07-30 2020-09-03 President And Fellows Of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
ES2781175T3 (es) 2014-07-31 2020-08-31 Novartis Ag Subconjunto optimizado de células T que contienen un receptor de antígeno quimérico
WO2016022931A1 (en) * 2014-08-07 2016-02-11 The Rockefeller University Compositions and methods for transcription-based crispr-cas dna editing
US9932566B2 (en) 2014-08-07 2018-04-03 Agilent Technologies, Inc. CIS-blocked guide RNA
US10513711B2 (en) 2014-08-13 2019-12-24 Dupont Us Holding, Llc Genetic targeting in non-conventional yeast using an RNA-guided endonuclease
CA2958200A1 (en) 2014-08-14 2016-02-18 Novartis Ag Treatment of cancer using a gfr alpha-4 chimeric antigen receptor
US11071289B2 (en) 2014-08-14 2021-07-27 Biocytogen Boston Corp DNA knock-in system
EP3180426B1 (en) 2014-08-17 2019-12-25 The Broad Institute, Inc. Genome editing using cas9 nickases
US10435685B2 (en) 2014-08-19 2019-10-08 Pacific Biosciences Of California, Inc. Compositions and methods for enrichment of nucleic acids
PT3183268T (pt) 2014-08-19 2020-05-15 Novartis Ag Recetor de antigénio quimérico (car) anti-cd123 para uso no tratamento de cancro
KR20170036801A (ko) 2014-08-19 2017-04-03 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 핵산의 프로빙 및 맵핑을 위한 ｒｎａ-가이드된 시스템
WO2016033246A1 (en) 2014-08-27 2016-03-03 Caribou Biosciences, Inc. Methods for increasing cas9-mediated engineering efficiency
EP3186375A4 (en) 2014-08-28 2019-03-13 North Carolina State University NEW CAS9 PROTEINS AND GUIDING ELEMENTS FOR DNA TARGETING AND THE GENOME EDITION
WO2016036754A1 (en) 2014-09-02 2016-03-10 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for rna-directed target dna modification
EP3191578B1 (en) 2014-09-12 2020-11-04 Whitehead Institute for Biomedical Research Cells expressing apolipoprotein e and uses thereof
CA2956487A1 (en) 2014-09-12 2016-03-17 E. I. Du Pont De Nemours And Company Generation of site-specific-integration sites for complex trait loci in corn and soybean, and methods of use
IL234638A0 (en) 2014-09-14 2014-12-02 Yeda Res & Dev NMDA receptor antagonists for the treatment of Gaucher disease
EP3194570B1 (en) 2014-09-16 2021-06-30 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering and correction in hematopoietic stem cells
AU2015317608B2 (en) 2014-09-17 2021-03-11 Novartis Ag Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
WO2016049024A2 (en) 2014-09-24 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for modeling competition of multiple cancer mutations in vivo
WO2016049163A2 (en) 2014-09-24 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Use and production of chd8+/- transgenic animals with behavioral phenotypes characteristic of autism spectrum disorder
WO2016049251A1 (en) 2014-09-24 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for modeling mutations in leukocytes
US10040048B1 (en) 2014-09-25 2018-08-07 Synthego Corporation Automated modular system and method for production of biopolymers
WO2016049258A2 (en) 2014-09-25 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Functional screening with optimized functional crispr-cas systems
US10370673B2 (en) 2014-09-26 2019-08-06 Purecircle Sdn Bhd Single nucleotide polymorphism (SNP) markers for stevia
WO2016054032A1 (en) 2014-09-29 2016-04-07 The Jackson Laboratory High efficiency, high throughput generation of genetically modified mammals by electroporation
CA2963080A1 (en) 2014-10-01 2016-04-07 The General Hospital Corporation Methods for increasing efficiency of nuclease-induced homology-directed repair
ES2741387T3 (es) 2014-10-15 2020-02-10 Regeneron Pharma Métodos y composiciones para generar o mantener células pluripotentes
WO2016061523A1 (en) 2014-10-17 2016-04-21 Howard Hughes Medical Institute Genomic probes
US10612042B2 (en) 2014-10-24 2020-04-07 Avectas Limited Delivery across cell plasma membranes
US20170247762A1 (en) 2014-10-27 2017-08-31 The Board Institute Inc. Compositions, methods and use of synthetic lethal screening
JP2017533702A (ja) 2014-10-31 2017-11-16 マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー 生体分子の免疫細胞への送達
KR102546296B1 (ko) * 2014-10-31 2023-06-21 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 변형된 t 세포에서 유전자 발현의 변경 및 그의 용도
US20190100769A1 (en) 2014-10-31 2019-04-04 Massachusetts Institute Of Technology Massively parallel combinatorial genetics for crispr
CA2966731C (en) 2014-11-06 2023-01-31 E. I. Du Pont De Nemours And Company Peptide-mediated delivery of rna-guided endonuclease into cells
CA2963820A1 (en) 2014-11-07 2016-05-12 Editas Medicine, Inc. Methods for improving crispr/cas-mediated genome-editing
WO2016077624A1 (en) 2014-11-12 2016-05-19 Nmc, Inc. Transgenic plants with engineered redox sensitive modulation of photosynthetic antenna complex pigments and methods for making the same
US11470826B2 (en) 2014-11-17 2022-10-18 National University Corporation Tokyo Medical And Dental University Method of conveniently producing genetically modified non-human mammal with high efficiency
PT3221457T (pt) 2014-11-21 2019-06-27 Regeneron Pharma Métodos e composições para modificação genética visada através da utilização de arn guia emparelhados
KR101833433B1 (ko) 2014-11-25 2018-02-28 한국생명공학연구원 돼지 t 세포 및 b 세포 면역결핍 세포주 생산 및 그의 제조 방법
WO2016086197A1 (en) 2014-11-25 2016-06-02 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Method of identifying and treating a person having a predisposition to or afflicted with a cardiometabolic disease
WO2016086227A2 (en) 2014-11-26 2016-06-02 The Regents Of The University Of California Therapeutic compositions comprising transcription factors and methods of making and using the same
GB201421096D0 (en) 2014-11-27 2015-01-14 Imp Innovations Ltd Genome editing methods
WO2016089433A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 Agilent Technologies, Inc. Guide rna with chemical modifications
US9888673B2 (en) 2014-12-10 2018-02-13 Regents Of The University Of Minnesota Genetically modified cells, tissues, and organs for treating disease
WO2016094874A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Escorted and functionalized guides for crispr-cas systems
EP3230452A1 (en) 2014-12-12 2017-10-18 The Broad Institute Inc. Dead guides for crispr transcription factors
WO2016094880A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of crispr systems and compositions for genome editing as to hematopoietic stem cells (hscs)
EP3985115A1 (en) 2014-12-12 2022-04-20 The Broad Institute, Inc. Protected guide rnas (pgrnas)
US10889834B2 (en) 2014-12-15 2021-01-12 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for enhancing targeted transgene integration
US20170327834A1 (en) 2014-12-15 2017-11-16 Syngenta Participations Ag Pesticidal microrna carriers and use thereof
JP6842417B2 (ja) 2014-12-16 2021-03-17 シー３ジェイ セラピューティクス インコーポレイテッド インビトロウイルスゲノム工学のための組成物及びその方法
JP6814142B2 (ja) 2014-12-16 2021-01-13 ダニスコ・ユーエス・インク 真菌ゲノム改変システムおよび使用方法
WO2016100562A1 (en) 2014-12-16 2016-06-23 Danisco Us Inc Compositions and methods for helper strain-mediated fungal genome modification
AU2015364282B2 (en) * 2014-12-18 2021-04-15 Integrated Dna Technologies, Inc. CRISPR-based compositions and methods of use
KR102530821B1 (ko) 2014-12-19 2023-05-10 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 단일 단계 다중 표적화를 통한 표적화된 유전자 변형을 위한 방법 및 조성물
WO2016098078A2 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Novartis Ag Dimerization switches and uses thereof
US10196613B2 (en) 2014-12-19 2019-02-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Stem cells for modeling type 2 diabetes
WO2016100974A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 The Broad Institute Inc. Unbiased identification of double-strand breaks and genomic rearrangement by genome-wide insert capture sequencing
ES2785329T3 (es) 2014-12-23 2020-10-06 Syngenta Participations Ag Métodos y composiciones para identificar y enriquecer células que comprenden modificaciones genómicas específicas para el sitio
WO2016106236A1 (en) 2014-12-23 2016-06-30 The Broad Institute Inc. Rna-targeting system
AU2015369725A1 (en) 2014-12-24 2017-06-29 Massachusetts Institute Of Technology CRISPR having or associated with destabilization domains
WO2016108926A1 (en) 2014-12-30 2016-07-07 The Broad Institute Inc. Crispr mediated in vivo modeling and genetic screening of tumor growth and metastasis
AU2015373893B2 (en) * 2014-12-31 2021-07-29 Synthetic Genomics, Inc. Compositions and methods for high efficiency in vivo genome editing
CA2971626A1 (en) * 2015-01-12 2016-07-21 Massachusetts Institute Of Technology Gene editing through microfluidic delivery
EP3245232B1 (en) 2015-01-12 2021-04-21 The Regents of The University of California Heterodimeric cas9 and methods of use thereof
WO2016112963A1 (en) 2015-01-13 2016-07-21 Riboxx Gmbh Delivery of biomolecules into cells
AR103446A1 (es) * 2015-01-19 2017-05-10 Inst Genetics & Dev Biolog Cas Método para modificar con precisión una planta a través de la expresión transitoria de genes
WO2016118726A2 (en) 2015-01-21 2016-07-28 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for identification of highly specific nucleases
AU2016212529B2 (en) 2015-01-27 2018-11-01 Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences A method for site-directed modification of whole plant through gene transient expression
FI3250691T3 (fi) 2015-01-28 2023-08-24 Caribou Biosciences Inc Crispr hybridi dna/rna polynukleotidit ja käyttömenetelmät
US11180792B2 (en) 2015-01-28 2021-11-23 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for labeling a single-stranded target nucleic acid
WO2016120480A1 (fr) 2015-01-29 2016-08-04 Meiogenix Procede pour induire des recombinaisons meiotiques ciblees
WO2016124920A1 (en) 2015-02-03 2016-08-11 The Institute Of Genetics And Developmental Biology Rice plants with altered seed phenotype and quality
US10793868B2 (en) 2015-02-03 2020-10-06 Institute Of Genetics And Developmental Biology Chinese Academy Of Sciences Plants with increased seed size
HRP20220890T1 (hr) 2015-02-06 2022-10-14 National University Of Singapore Postupci za povećanje učinkovitosti terapijskih imunosnih stanica
EP3262193A2 (en) 2015-02-26 2018-01-03 The Broad Institute Inc. T cell balance gene expression, compositions of matters and methods of use thereof
TW201702380A (zh) * 2015-02-27 2017-01-16 再生元醫藥公司 宿主細胞蛋白質修飾
EP3265567B1 (en) 2015-03-02 2020-07-29 Conagen Inc. Regulatory elements from labyrinthulomycetes microorganisms
WO2016138574A1 (en) 2015-03-02 2016-09-09 Sinai Health System Homologous recombination factors
KR20230156800A (ko) 2015-03-03 2023-11-14 더 제너럴 하스피탈 코포레이션 변경된 PAM 특이성을 갖는 조작된 CRISPR-Cas9 뉴클레아제
WO2016142427A1 (en) 2015-03-10 2016-09-15 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method ank kit for reprogramming somatic cells
WO2016145516A1 (en) 2015-03-13 2016-09-22 Deep Genomics Incorporated System and method for training neural networks
US10066256B2 (en) 2015-03-17 2018-09-04 Bio-Rad Laboratories, Inc. Detection of genome editing
US20180064748A1 (en) 2015-03-27 2018-03-08 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods of treating motor neuron diseases
CN107567499A (zh) 2015-03-27 2018-01-09 纳幕尔杜邦公司 大豆u6核小rna基因启动子及其在植物小rna基因的组成型表达中的用途
EP3277805A1 (en) 2015-03-31 2018-02-07 Exeligen Scientific, Inc. Cas 9 retroviral integrase and cas 9 recombinase systems for targeted incorporation of a dna sequence into a genome of a cell or organism
CN107787367B (zh) 2015-04-06 2021-10-26 里兰斯坦福初级大学理事会 用于crispr/cas介导的基因调控的化学修饰的引导rna
US11214779B2 (en) 2015-04-08 2022-01-04 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Activatable CRISPR/CAS9 for spatial and temporal control of genome editing
GB201506509D0 (en) 2015-04-16 2015-06-03 Univ Wageningen Nuclease-mediated genome editing
EP3286211A1 (en) 2015-04-23 2018-02-28 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker
EP3286571B1 (en) 2015-04-24 2021-08-18 Editas Medicine, Inc. Evaluation of cas9 molecule/guide rna molecule complexes
WO2016176652A2 (en) 2015-04-29 2016-11-03 Fred Hutchinson Cancer Research Center Modified stem cells and uses thereof
WO2016179038A1 (en) * 2015-05-01 2016-11-10 Spark Therapeutics, Inc. ADENO-ASSOCIATED VIRUS-MEDIATED CRISPR-Cas9 TREATMENT OF OCULAR DISEASE
SI3291679T1 (sl) 2015-05-06 2022-04-29 Snipr Technologies Limited Predrugačenje mikrobnih populacij in spreminjanje mikrobiote
US10179918B2 (en) 2015-05-07 2019-01-15 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for increasing transgene activity
WO2016182893A1 (en) 2015-05-08 2016-11-17 Teh Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems for saturating mutagenesis of non-coding elements, compositions, methods, libraries and applications thereof
AU2016261358B2 (en) 2015-05-11 2021-09-16 Editas Medicine, Inc. Optimized CRISPR/Cas9 systems and methods for gene editing in stem cells
CA2985816A1 (en) 2015-05-15 2016-11-24 The General Hospital Corporation Antagonistic anti-tumor necrosis factor receptor superfamily antibodies
AU2016265255B2 (en) 2015-05-16 2022-03-17 Genzyme Corporation Gene editing of deep intronic mutations
CN114634943A (zh) 2015-05-18 2022-06-17 T细胞受体治疗公司 使用融合蛋白对tcr重编程的组合物和方法
EP3095870A1 (en) 2015-05-19 2016-11-23 Kws Saat Se Methods for the in planta transformation of plants and manufacturing processes and products based and obtainable therefrom
DE102015006335A1 (de) 2015-05-19 2016-11-24 Kws Saat Se Verfahren und Konstrukte zur gezielten Nukleinsäure Editierung in Pflanzen
DE102015014252A1 (de) 2015-11-05 2017-05-11 Kws Saat Se Verfahren und Konstrukte zur gezielten Nukleinsäure Editierung in Pflanzen
EP3297642B1 (en) 2015-05-22 2019-09-11 STCube & Co., Inc. Screening methods for targets for cancer therapy
US10117911B2 (en) 2015-05-29 2018-11-06 Agenovir Corporation Compositions and methods to treat herpes simplex virus infections
KR102377189B1 (ko) 2015-05-29 2022-03-22 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 C9orf72 유전자좌에서 파괴를 갖는 비-인간 동물
EP3303585A4 (en) 2015-06-03 2018-10-31 Board of Regents of the University of Nebraska Dna editing using single-stranded dna
EP3303634B1 (en) 2015-06-03 2023-08-30 The Regents of The University of California Cas9 variants and methods of use thereof
US20180296537A1 (en) 2015-06-05 2018-10-18 Novartis Ag Methods and compositions for diagnosing, treating, and monitoring treatment of shank3 deficiency associated disorders
CN116334142A (zh) 2015-06-09 2023-06-27 爱迪塔斯医药公司 用于改善移植的crispr/cas相关方法和组合物
US10185803B2 (en) 2015-06-15 2019-01-22 Deep Genomics Incorporated Systems and methods for classifying, prioritizing and interpreting genetic variants and therapies using a deep neural network
WO2016205680A1 (en) 2015-06-17 2016-12-22 The Uab Research Foundation Crispr/cas9 complex for introducing a functional polypeptide into cells of blood cell lineage
WO2016205728A1 (en) 2015-06-17 2016-12-22 Massachusetts Institute Of Technology Crispr mediated recording of cellular events
WO2016205703A1 (en) 2015-06-17 2016-12-22 The Uab Research Foundation Crispr/cas9 complex for genomic editing
KR102575342B1 (ko) 2015-06-18 2023-09-05 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 표적외 효과를 감소시키는 crispr 효소 돌연변이
EP3436575A1 (en) 2015-06-18 2019-02-06 The Broad Institute Inc. Novel crispr enzymes and systems
FI3430134T3 (fi) 2015-06-18 2023-01-13 Uusia CRISPR-entsyymejä ja järjestelmiä
WO2016205745A2 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Cell sorting
WO2016205759A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Engineering and optimization of systems, methods, enzymes and guide scaffolds of cas9 orthologs and variants for sequence manipulation
US9957501B2 (en) 2015-06-18 2018-05-01 Sangamo Therapeutics, Inc. Nuclease-mediated regulation of gene expression
US10648020B2 (en) 2015-06-18 2020-05-12 The Broad Institute, Inc. CRISPR enzymes and systems
US9790490B2 (en) * 2015-06-18 2017-10-17 The Broad Institute Inc. CRISPR enzymes and systems
US10669528B2 (en) 2015-06-25 2020-06-02 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions relating to hematopoietic stem cell expansion, enrichment, and maintenance
US11414657B2 (en) 2015-06-29 2022-08-16 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modified CRISPR RNA and modified single CRISPR RNA and uses thereof
CN107922911A (zh) 2015-07-09 2018-04-17 麻省理工学院 将物质递送至无核细胞
CA2991301A1 (en) 2015-07-13 2017-01-19 Sangamo Therapeutics, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering
EP3957731A1 (en) 2015-07-15 2022-02-23 Rutgers, The State University of New Jersey Nuclease-independent targeted gene editing platform and uses thereof
US10682390B2 (en) 2015-07-16 2020-06-16 Biokine Therapeutics Ltd. Compositions and methods for treating cancer
AU2016295291A1 (en) 2015-07-17 2018-02-08 Institute Of Genetics And Developmental Biology Chinese Academy Of Sciences Wheat plants resistant to powdery mildew
WO2017015101A1 (en) * 2015-07-17 2017-01-26 University Of Washington Methods for maximizing the efficiency of targeted gene correction
JP6937740B2 (ja) 2015-07-28 2021-09-22 ダニスコ・ユーエス・インク ゲノム編集システムおよび使用方法
IL295616A (en) 2015-07-31 2022-10-01 Us Health Adapted cells and treatment methods
AU2016301195B2 (en) 2015-08-06 2022-09-01 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Targeted protein degradation to attenuate adoptive T-cell therapy associated adverse inflammatory responses
WO2017024317A2 (en) 2015-08-06 2017-02-09 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods to induce targeted protein degradation through bifunctional molecules
US9580727B1 (en) 2015-08-07 2017-02-28 Caribou Biosciences, Inc. Compositions and methods of engineered CRISPR-Cas9 systems using split-nexus Cas9-associated polynucleotides
WO2017027392A1 (en) 2015-08-07 2017-02-16 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric cd3 receptor proteins
CA3033617A1 (en) 2015-08-11 2017-02-16 Anie Philip Peptidic tgf-beta antagonists
EP3334746B1 (en) 2015-08-14 2021-11-24 The University Of Sydney Connexin 45 inhibition for therapy
JP2018527920A (ja) 2015-08-14 2018-09-27 インスティテュート・オブ・ジェネティクス・アンド・ディヴェロプメンタル・バイオロジー、チャイニーズ・アカデミー・オブ・サイエンシズＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 部位特異的ヌクレオチド置換によりグリホサート耐性イネを取得するための方法
EP3337908A4 (en) 2015-08-18 2019-01-23 The Broad Institute, Inc. METHOD AND COMPOSITIONS FOR CHANGING THE FUNCTION AND STRUCTURE OF CHROMATIN GRINDING AND / OR DOMAINS
CA2995582A1 (en) * 2015-08-19 2017-02-23 Children's Research Institute, Children's National Medical Center Compositions and methods for treating graft versus host disease
IL288662B2 (en) 2015-08-25 2023-09-01 Univ Duke Preparations and methods for improving specificity in genomic engineering using RNA-guided endonucleases
US9512446B1 (en) 2015-08-28 2016-12-06 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
US9926546B2 (en) 2015-08-28 2018-03-27 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
CN108350449B (zh) 2015-08-28 2022-05-31 通用医疗公司 工程化的CRISPR-Cas9核酸酶
EP3344575B1 (en) 2015-09-04 2020-04-15 SQZ Biotechnologies Company Intracellular delivery of biomolecules to cells comprising a cell wall
EP3348638B1 (en) 2015-09-09 2022-12-14 National University Corporation Kobe University Method for converting genome sequence of gram-positive bacterium by specifically converting nucleic acid base of targeted dna sequence, and molecular complex used in same
IL241462A0 (en) 2015-09-10 2015-11-30 Yeda Res & Dev Heterologous engineering of betalain pigments in plants
AU2016319110B2 (en) 2015-09-11 2022-01-27 The General Hospital Corporation Full interrogation of nuclease DSBs and sequencing (FIND-seq)
CN105132427B (zh) * 2015-09-21 2019-01-08 新疆畜牧科学院生物技术研究所 一种以RNA介导的特异性敲除双基因获得基因编辑绵羊的方法及其专用sgRNA
CA2999500A1 (en) 2015-09-24 2017-03-30 Editas Medicine, Inc. Use of exonucleases to improve crispr/cas-mediated genome editing
AU2016331185A1 (en) 2015-09-30 2018-04-26 The General Hospital Corporation Comprehensive in vitro reporting of cleavage events by sequencing (CIRCLE-seq)
WO2017059241A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Lentiviral protein delivery system for rna-guided genome editing
EP4108255A1 (en) 2015-10-05 2022-12-28 Precision Biosciences, Inc. Genetically-modified cells comprising a modified human t cell receptor alpha constant region gene
US10799535B2 (en) 2015-10-05 2020-10-13 Precision Biosciences, Inc. Engineered meganucleases with recognition sequences found in the human T cell receptor alpha constant region gene
US20190255107A1 (en) 2015-10-09 2019-08-22 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Modulation of novel immune checkpoint targets
KR102628801B1 (ko) 2015-10-12 2024-01-25 이아이디피, 인크. 세포내 유전자 변형 및 증가된 상동 재조합을 위한 보호 dna 주형 및 이용 방법
EP3362571A4 (en) 2015-10-13 2019-07-10 Duke University GENOMIC ENGINEERING WITH TYPE I CRISPRISMS IN EUKARYOTIC CELLS
MX2018004546A (es) 2015-10-16 2019-04-15 Univ Columbia Composiciones y métodos para la inhibicion de antígenos específicos de linaje.
EP3362074B1 (en) 2015-10-16 2023-08-09 President and Fellows of Harvard College Regulatory t cell pd-1 modulation for regulating t cell effector immune responses
EP3365454A1 (en) * 2015-10-20 2018-08-29 10X Genomics, Inc. Methods and systems for high throughput single cell genetic manipulation
WO2017070605A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 The Broad Institute Inc. Type vi-b crispr enzymes and systems
EP3365461B1 (en) * 2015-10-22 2020-10-14 Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale (INSERM) Endonuclease-barcoding
DK3350327T3 (en) 2015-10-23 2019-01-21 Caribou Biosciences Inc CONSTRUCTED CRISPR CLASS-2-NUCLEIC ACID TARGETING-NUCLEIC ACID
EP3159407A1 (en) 2015-10-23 2017-04-26 Silence Therapeutics (London) Ltd Guide rnas, methods and uses
IL258821B (en) 2015-10-23 2022-07-01 Harvard College Nucleobase editors and their uses
US11492670B2 (en) * 2015-10-27 2022-11-08 The Broad Institute Inc. Compositions and methods for targeting cancer-specific sequence variations
WO2017075451A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 The Broad Institute Inc. Compositions and methods for evaluating and modulating immune responses by detecting and targeting pou2af1
WO2017075465A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 The Broad Institute Inc. Compositions and methods for evaluating and modulating immune responses by detecting and targeting gata3
US11092607B2 (en) 2015-10-28 2021-08-17 The Board Institute, Inc. Multiplex analysis of single cell constituents
WO2017075294A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 The Board Institute Inc. Assays for massively combinatorial perturbation profiling and cellular circuit reconstruction
WO2017075478A2 (en) 2015-10-28 2017-05-04 The Broad Institute Inc. Compositions and methods for evaluating and modulating immune responses by use of immune cell gene signatures
AU2016343978A1 (en) 2015-10-29 2018-05-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for identification, assessment, prevention, and treatment of metabolic disorders using PM20D1 and N-lipidated amino acids
CA3004285A1 (en) 2015-11-03 2017-05-11 President And Fellows Of Harvard College Method and apparatus for volumetric imaging of a three-dimensional nucleic acid containing matrix
EP4036228A1 (en) 2015-11-13 2022-08-03 Avellino Lab USA, Inc. Methods for the treatment of corneal dystrophies
US10669320B2 (en) 2015-11-18 2020-06-02 The Regents Of The University Of Michigan Mps1 and KNL1 phosphorylation system
UA125929C2 (uk) 2015-11-18 2022-07-13 Сінгента Партісіпейшнс Аг Спосіб індукування утворення гаплоїдних зародків при схрещуванні між двома рослинами
WO2017087708A1 (en) 2015-11-19 2017-05-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Lymphocyte antigen cd5-like (cd5l)-interleukin 12b (p40) heterodimers in immunity
AU2016361350B2 (en) 2015-11-23 2023-04-06 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for engineering immunity
AU2016359629B2 (en) * 2015-11-23 2023-03-09 Ranjan BATRA Tracking and manipulating cellular RNA via nuclear delivery of CRISPR/Cas9
WO2017090761A1 (ja) 2015-11-27 2017-06-01 国立大学法人神戸大学 標的化したｄｎａ配列の核酸塩基を特異的に変換する、単子葉植物のゲノム配列の変換方法、及びそれに用いる分子複合体
WO2017095946A1 (en) 2015-11-30 2017-06-08 Flagship Pioneering, Inc. Methods and compositions relating to chondrisomes
CN105296518A (zh) * 2015-12-01 2016-02-03 中国农业大学 一种用于CRISPR/Cas9技术的同源臂载体构建方法
MX2018005392A (es) 2015-12-04 2019-05-30 Caribou Biosciences Inc Acidos nucleicos modificados dirigidos a acidos nucleicos.
WO2017100376A2 (en) 2015-12-07 2017-06-15 Zymergen, Inc. Promoters from corynebacterium glutamicum
US9988624B2 (en) 2015-12-07 2018-06-05 Zymergen Inc. Microbial strain improvement by a HTP genomic engineering platform
US11208649B2 (en) 2015-12-07 2021-12-28 Zymergen Inc. HTP genomic engineering platform
WO2017106251A1 (en) * 2015-12-14 2017-06-22 President And Fellows Of Harvard College Cas discrimination using tuned guide rna
AU2016374253B2 (en) 2015-12-18 2021-10-21 Sangamo Therapeutics, Inc. Targeted disruption of the MHC cell receptor
EP3390624A4 (en) 2015-12-18 2019-07-10 The Regents of The University of California MODIFIED POLYPEPTIDES AND METHOD OF USE THEREOF
CA3008413A1 (en) 2015-12-18 2017-06-22 Sangamo Therapeutics, Inc. Targeted disruption of the t cell receptor
WO2017112620A1 (en) 2015-12-22 2017-06-29 North Carolina State University Methods and compositions for delivery of crispr based antimicrobials
EP3394092A1 (en) 2015-12-23 2018-10-31 Fred Hutchinson Cancer Research Center High affinity t cell receptors and uses thereof
WO2017115268A1 (en) * 2015-12-28 2017-07-06 Novartis Ag Compositions and methods for the treatment of hemoglobinopathies
ES2944597T3 (es) 2015-12-30 2023-06-22 Novartis Ag Terapias con células efectoras inmunitarias de eficacia mejorada
CN109312315B (zh) * 2015-12-30 2023-06-09 阿维塔斯有限公司 基因编辑蛋白和组合物向细胞和组织的无载体递送
RU2021121824A (ru) 2016-01-04 2021-08-18 Те Борд Оф Трастиз Оф Те Лилэнд Стэнфорд Джуниор Юниверсити Генная терапия для рецессивного дистрофического буллезного эпидермолиза с использованием генетически корректированных аутологичных кератиноцитов
CA3009127A1 (en) 2016-01-06 2017-07-13 Yeda Research And Development Co. Ltd. Compositions and methods for treating malignant, autoimmune and inflammatory diseases
EA201891614A1 (ru) 2016-01-11 2019-02-28 Те Борд Оф Трастиз Оф Те Лилэнд Стэнфорд Джуниор Юниверсити Химерные белки и способы иммунотерапии
EA201891619A1 (ru) 2016-01-11 2019-02-28 Те Борд Оф Трастиз Оф Те Лилэнд Стэнфорд Джуниор Юниверсити Химерные белки и способы регулирования экспрессии генов
CN109414001A (zh) 2016-01-15 2019-03-01 杰克逊实验室 通过cas9蛋白的多循环电穿孔产生的遗传修饰的非人哺乳动物
WO2017125931A1 (en) 2016-01-21 2017-07-27 The State Of Israel, Ministry Of Agriculture & Rural Development, Agricultural Research Organization (Aro) (Volcani Center) Parthenocarpic plants and methods of producing same
US11261433B2 (en) 2016-01-31 2022-03-01 Hadasit Medical Research Services And Development Ltd. Autosomal-identical pluripotent stem cell populations having non-identical sex chromosomal composition and uses thereof
CA3011049A1 (en) 2016-02-02 2017-08-10 Sangamo Therapeutics, Inc. Compositions for linking dna-binding domains and cleavage domains
EA201891629A1 (ru) 2016-02-09 2019-03-29 Сибас Юс Ллс Способы и композиции для повышения эффективности нацеленной модификации генов с применением опосредуемой олигонуклеотидами репарации генов
US10876129B2 (en) 2016-02-12 2020-12-29 Ceres, Inc. Methods and materials for high throughput testing of mutagenized allele combinations
WO2017138008A2 (en) 2016-02-14 2017-08-17 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods of modulating protein exocytosis and uses of same in therapy
EP3416663B1 (en) 2016-02-18 2021-04-14 The Penn State Research Foundation Generating gabaergic neurons in brains
WO2017143071A1 (en) 2016-02-18 2017-08-24 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for gene editing in stem cells
EP3420102B1 (en) 2016-02-22 2024-04-03 Massachusetts Institute of Technology Methods for identifying and modulating immune phenotypes
US11530253B2 (en) 2016-02-25 2022-12-20 The Children's Medical Center Corporation Customized class switch of immunoglobulin genes in lymphoma and hybridoma by CRISPR/CAS9 technology
CA3015665C (en) 2016-02-26 2020-09-22 Lanzatech New Zealand Limited Crispr/cas systems for c1-fixing bacteria
WO2017153982A1 (en) 2016-03-06 2017-09-14 Yeda Research And Development Co. Ltd. Method for modulating myelination
EP3429603B1 (en) 2016-03-15 2021-12-29 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions relating to hematopoietic stem cell expansion
WO2017161005A1 (en) 2016-03-16 2017-09-21 Synthetic Genomics, Inc. Production of proteins in labyrinthulomycetes
JP2019515654A (ja) 2016-03-16 2019-06-13 ザ ジェイ． デヴィッド グラッドストーン インスティテューツ 肥満及び／又は糖尿病を処置するための方法及び組成物、並びに候補処置薬剤を識別するための方法及び組成物
US11427861B2 (en) 2016-03-17 2022-08-30 Massachusetts Institute Of Technology Methods for identifying and modulating co-occurant cellular phenotypes
EP3219799A1 (en) 2016-03-17 2017-09-20 IMBA-Institut für Molekulare Biotechnologie GmbH Conditional crispr sgrna expression
KR20190080825A (ko) 2016-03-21 2019-07-08 다나-파버 캔서 인스티튜트 인크. T-세포 기능소실 상태-특이적 유전자 발현 조절인자 및 그 용도
EP3433363A1 (en) 2016-03-25 2019-01-30 Editas Medicine, Inc. Genome editing systems comprising repair-modulating enzyme molecules and methods of their use
US11512311B2 (en) 2016-03-25 2022-11-29 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for treating alpha 1-antitrypsin (A1AT) deficiency
US11236313B2 (en) 2016-04-13 2022-02-01 Editas Medicine, Inc. Cas9 fusion molecules, gene editing systems, and methods of use thereof
CA3021027A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Novartis Ag Compositions and methods for selective expression of chimeric antigen receptors
PT3443075T (pt) 2016-04-15 2022-12-16 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Células t transgénicas e composições de células t que expressam um recetor antigénico quimérico e métodos relacionados
AU2017253107B2 (en) 2016-04-19 2023-07-20 Massachusetts Institute Of Technology CPF1 complexes with reduced indel activity
KR101929239B1 (ko) * 2016-04-22 2018-12-17 한양대학교 산학협력단 Ｒｇｅｎ ｒｎｐ를 이용한 미세조류의 교정 방법
WO2017189525A1 (en) 2016-04-25 2017-11-02 President And Fellows Of Harvard College Hybridization chain reaction methods for in situ molecular detection
US10752904B2 (en) 2016-04-26 2020-08-25 Massachusetts Institute Of Technology Extensible recombinase cascades
WO2017192544A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 Massachusetts Institute Of Technology AMPHIPHILIC NANOPARTICLES FOR CODELIVERY OF WATER-INSOLUBLE SMALL MOLECULES AND RNAi
US20200325483A1 (en) * 2016-05-12 2020-10-15 Brian P. Hanley Safe delivery of crispr and other gene therapies to large fractions of somatic cells in humans and animals
NZ747857A (en) 2016-05-20 2023-01-27 Regeneron Pharma Methods for breaking immunological tolerance using multiple guide rnas
CA3025171A1 (en) 2016-05-24 2017-11-30 Indiana University Research And Technology Corporation Ku inhibitors and their use for gene editing
RU2741786C2 (ru) 2016-05-25 2021-01-28 Энсэрм (Энститю Насьональ Де Ла Санте Э Де Ла Решерш Медикаль) Способы и композиции для лечения опухолей
KR20220147710A (ko) 2016-06-02 2022-11-03 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨 프로그램가능한 dna 결합 단백질을 사용한, 표적화된 게놈 변형의 개선
GB201609811D0 (en) 2016-06-05 2016-07-20 Snipr Technologies Ltd Methods, cells, systems, arrays, RNA and kits
US10767175B2 (en) 2016-06-08 2020-09-08 Agilent Technologies, Inc. High specificity genome editing using chemically modified guide RNAs
US11708588B2 (en) * 2016-06-16 2023-07-25 Adam Brian Robertson Gene editing
CA3028158A1 (en) 2016-06-17 2017-12-21 The Broad Institute, Inc. Type vi crispr orthologs and systems
US11293021B1 (en) 2016-06-23 2022-04-05 Inscripta, Inc. Automated cell processing methods, modules, instruments, and systems
CA3029254A1 (en) 2016-06-24 2017-12-28 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Methods for generating barcoded combinatorial libraries
US11471462B2 (en) 2016-06-27 2022-10-18 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for detecting and treating diabetes
US10544411B2 (en) 2016-06-30 2020-01-28 Zymergen Inc. Methods for generating a glucose permease library and uses thereof
JP2019519242A (ja) 2016-06-30 2019-07-11 ザイマージェン インコーポレイテッド 細菌ヘモグロビンライブラリーを生成するための方法およびその使用
JP7033583B2 (ja) 2016-07-13 2022-03-10 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ゲノム編集効率を高めるための方法、組成物及びキット
WO2018013918A2 (en) 2016-07-15 2018-01-18 Novartis Ag Treatment and prevention of cytokine release syndrome using a chimeric antigen receptor in combination with a kinase inhibitor
CN106191061B (zh) * 2016-07-18 2019-06-18 暨南大学 一种特异靶向人ABCG2基因的sgRNA导向序列及其应用
US20190309283A1 (en) * 2016-07-19 2019-10-10 Biodynamics Laboratory, Inc. Method for preparing long-chain single-stranded dna
AU2017302657A1 (en) 2016-07-29 2019-02-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice comprising mutations resulting in expression of c-truncated fibrillin-1
AU2017305404B2 (en) 2016-08-02 2023-11-30 Editas Medicine, Inc. Compositions and methods for treating CEP290 associated disease
CA3032498A1 (en) 2016-08-02 2018-02-08 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
US11078481B1 (en) 2016-08-03 2021-08-03 KSQ Therapeutics, Inc. Methods for screening for cancer targets
IL264565B1 (en) 2016-08-03 2024-03-01 Harvard College Adenosine nuclear base editors and their uses
CA3033327A1 (en) 2016-08-09 2018-02-15 President And Fellows Of Harvard College Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
WO2018030457A1 (ja) 2016-08-10 2018-02-15 武田薬品工業株式会社 真核細胞のゲノムの標的部位を改変する方法及び標的部位における検出対象核酸配列の存在又は非存在を検出する方法
KR101710026B1 (ko) 2016-08-10 2017-02-27 주식회사 무진메디 Cas9 단백질 및 가이드 RNA의 혼성체를 함유하는 나노 리포좀 전달체 조성물
EP4056701A1 (en) 2016-08-12 2022-09-14 Nexuspiral Inc. Genome editing method
US20210166783A1 (en) 2016-08-17 2021-06-03 The Broad Institute, Inc. Methods for identifying class 2 crispr-cas systems
EP3500671A4 (en) 2016-08-17 2020-07-29 The Broad Institute, Inc. NEW CRISPR ENZYMS AND SYSTEMS
WO2018035364A1 (en) 2016-08-17 2018-02-22 The Broad Institute Inc. Product and methods useful for modulating and evaluating immune responses
IL247368A0 (en) 2016-08-18 2016-11-30 Yeda Res & Dev Diagnostic and therapeutic uses of exosomes
RU2019103691A (ru) * 2016-08-19 2020-09-22 Тулджен Инкорпорейтед Искусственно сконструированная система регуляции ангиогенеза
US20190185850A1 (en) * 2016-08-20 2019-06-20 Avellino Lab Usa, Inc. Single guide rna/crispr/cas9 systems, and methods of use thereof
WO2020225754A1 (en) 2019-05-06 2020-11-12 Mcmullen Tara Crispr gene editing for autosomal dominant diseases
IL264792B2 (en) 2016-08-24 2023-10-01 Sangamo Therapeutics Inc Engineered target-specific zinc-finger nucleases
WO2018039438A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
US11078483B1 (en) 2016-09-02 2021-08-03 KSQ Therapeutics, Inc. Methods for measuring and improving CRISPR reagent function
WO2018049009A2 (en) 2016-09-07 2018-03-15 Sangamo Therapeutics, Inc. Modulation of liver genes
WO2018049025A2 (en) 2016-09-07 2018-03-15 The Broad Institute Inc. Compositions and methods for evaluating and modulating immune responses
JP2019533139A (ja) 2016-09-08 2019-11-14 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル ネフローゼ症候群を診断及び処置するための方法
IL247752A0 (en) 2016-09-11 2016-11-30 Yeda Res & Dev Compositions and methods for modulating gene expression for site-directed mutagenesis
CA3036854A1 (en) 2016-09-15 2018-03-22 Labcyte Inc. High-efficiency transfection of biological cells using sonoporation
CA3034643A1 (en) 2016-09-20 2018-03-29 Ellen Weisberg Compositions and methods for identification, assessment, prevention, and treatment of aml using usp10 biomarkers and modulators
CA3035075A1 (en) 2016-09-23 2018-03-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center Tcrs specific for minor histocompatibility (h) antigen ha-1 and uses thereof
US20190225974A1 (en) 2016-09-23 2019-07-25 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Targeted genome optimization in plants
EP3519577A1 (en) 2016-09-28 2019-08-07 Novartis AG Porous membrane-based macromolecule delivery system
AU2017336094A1 (en) 2016-09-29 2019-04-18 Immunitybio, Inc. HLA class I-deficient NK-92 cells with decreased immunogenicity
GB2569733B (en) 2016-09-30 2022-09-14 Univ California RNA-guided nucleic acid modifying enzymes and methods of use thereof
AU2017336100B2 (en) * 2016-09-30 2023-11-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a hexanucleotide repeat expansion in a C9ORF72 locus
ES2811500T3 (es) 2016-10-04 2021-03-12 Prec Biosciences Inc Dominios coestimuladores para su uso en células genéticamente modificadas
US10669539B2 (en) 2016-10-06 2020-06-02 Pioneer Biolabs, Llc Methods and compositions for generating CRISPR guide RNA libraries
US11242542B2 (en) 2016-10-07 2022-02-08 Integrated Dna Technologies, Inc. S. pyogenes Cas9 mutant genes and polypeptides encoded by same
CA3036745A1 (en) 2016-10-07 2018-04-12 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for t-cell receptors reprogramming using fusion proteins
US20200016202A1 (en) 2016-10-07 2020-01-16 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Modulation of novel immune checkpoint targets
WO2018068053A2 (en) 2016-10-07 2018-04-12 Integrated Dna Technologies, Inc. S. pyogenes cas9 mutant genes and polypeptides encoded by same
WO2018069232A1 (en) 2016-10-10 2018-04-19 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for predicting the risk of having cardiac hypertrophy
JP2019530464A (ja) 2016-10-14 2019-10-24 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 核酸塩基エディターのａａｖ送達
GB201617559D0 (en) 2016-10-17 2016-11-30 University Court Of The University Of Edinburgh The Swine comprising modified cd163 and associated methods
GB2605883B (en) 2016-10-18 2023-03-15 Univ Minnesota Tumor infiltrating lymphocytes and methods of therapy
AU2017345430A1 (en) 2016-10-20 2019-05-02 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for the treatment of Fabry disease
WO2018081531A2 (en) 2016-10-28 2018-05-03 Ariad Pharmaceuticals, Inc. Methods for human t-cell activation
CN106637421B (zh) * 2016-10-28 2019-12-27 博雅缉因（北京）生物科技有限公司 双sgRNA文库的构建及其应用于高通量功能性筛选研究的方法
CA3041668A1 (en) 2016-10-31 2018-05-03 Sangamo Therapeutics, Inc. Gene correction of scid-related genes in hematopoietic stem and progenitor cells
WO2018076335A1 (en) 2016-10-31 2018-05-03 Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences Compositions and methods for enhancing abiotic stress tolerance
US10633454B2 (en) 2016-11-01 2020-04-28 Conagen Inc. Expression of modified glycoproteins and glycopeptides
WO2018083606A1 (en) 2016-11-01 2018-05-11 Novartis Ag Methods and compositions for enhancing gene editing
CA3042259A1 (en) 2016-11-04 2018-05-11 Flagship Pioneering Innovations V. Inc. Novel plant cells, plants, and seeds
WO2018144097A1 (en) 2016-11-04 2018-08-09 Akeagen Llc Genetically modified non-human animals and methods for producing heavy chain-only antibodies
US20190345500A1 (en) 2016-11-14 2019-11-14 |Nserm (Institut National De La Santé Et De La Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for modulating stem cells proliferation or differentiation
WO2018093797A1 (en) 2016-11-15 2018-05-24 The Schepens Eye Research Institute, Inc. Compositions and methods for the treatment of aberrant angiogenesis
US11851491B2 (en) 2016-11-22 2023-12-26 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for TCR reprogramming using fusion proteins
CN110268049A (zh) 2016-11-22 2019-09-20 新加坡国立大学 用于t细胞恶性肿瘤免疫疗法的cd7表达阻滞剂和嵌合抗原受体
AU2017364084A1 (en) 2016-11-22 2019-05-16 Integrated Dna Technologies, Inc. CRISPR/Cpf1 systems and methods
EP3545095A1 (en) 2016-11-28 2019-10-02 Yeda Research and Development Co., Ltd. Isolated polynucleotides and polypeptides and methods of using same for expressing an expression product of interest
WO2018100190A1 (en) 2016-12-02 2018-06-07 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for diagnosing renal cell carcinoma
US9816093B1 (en) 2016-12-06 2017-11-14 Caribou Biosciences, Inc. Engineered nucleic acid-targeting nucleic acids
CA3046199A1 (en) 2016-12-08 2018-06-14 Case Western Reserve University Methods and compositions for enhancing functional myelin production
US11293022B2 (en) 2016-12-12 2022-04-05 Integrated Dna Technologies, Inc. Genome editing enhancement
CA3045134A1 (en) 2016-12-14 2018-06-21 Ligandal, Inc. Compositions and methods for nucleic acid and/or protein payload delivery
JP2020513754A (ja) 2016-12-21 2020-05-21 ティーシーアール２ セラピューティクス インク． がん治療用に操作されたｔ細胞
EP4095228A1 (en) 2016-12-22 2022-11-30 Avectas Limited System for vector-free intracellular delivery by reversible permeabilisation
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
WO2018126087A1 (en) 2016-12-29 2018-07-05 Applied Stemcell, Inc. Gene editing method using virus
WO2018122771A1 (en) 2016-12-29 2018-07-05 Ukko Inc. Methods for identifying and de-epitoping allergenic polypeptides
US11859219B1 (en) 2016-12-30 2024-01-02 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Methods of altering a target nucleotide sequence with an RNA-guided nuclease and a single guide RNA
WO2018127585A1 (en) 2017-01-06 2018-07-12 Txcell Monospecific regulatory t cell population with cytotoxicity for b cells
EP3346001A1 (en) 2017-01-06 2018-07-11 TXCell Monospecific regulatory t cell population with cytotoxicity for b cells
JP7118072B2 (ja) 2017-01-06 2022-08-15 イミュニティーバイオ インコーポレイテッド Ｃｄ９６／ｔｉｇｉｔ発現が低下した遺伝子改変型ｎｋ－９２細胞
DK3565891T3 (da) 2017-01-09 2023-07-24 Whitehead Inst Biomedical Res Fremgangsmåder til ændring af genekspression ved forstyrrelse af transkriptionsfaktor-multimere, der strukturerer regulatoriske sløjfer
CN106636204B (zh) * 2017-01-09 2019-08-23 华中农业大学 一种能够稳定遗传的白化大鳞副泥鳅育种方法
US11519009B2 (en) 2017-01-09 2022-12-06 University Of Massachusetts Complexes for gene deletion and editing
GB201700380D0 (en) 2017-01-10 2017-02-22 Plant Bioscience Ltd Methods of increasing seed yield
JP7215716B2 (ja) 2017-01-13 2023-01-31 学校法人自治医科大学 肝臓ゲノム上の凝固関連因子遺伝子を破壊するためのａａｖベクター
EP3571321A1 (en) 2017-01-23 2019-11-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Hydroxysteroid 17-beta dehydrogenase 13 (hsd17b13) variants and uses thereof
EP3574005B1 (en) 2017-01-26 2021-12-15 Novartis AG Cd28 compositions and methods for chimeric antigen receptor therapy
US11624071B2 (en) 2017-01-28 2023-04-11 Inari Agriculture Technology, Inc. Method of creating a plurality of targeted insertions in a plant cell
EP3577134A1 (en) 2017-01-31 2019-12-11 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric t cell receptor proteins having multiple specificities
TW201839136A (zh) 2017-02-06 2018-11-01 瑞士商諾華公司 治療血色素異常症之組合物及方法
IL250479A0 (en) 2017-02-06 2017-03-30 Sorek Rotem Genetically engineered cells expressing a disarm system that confers resistance to phages and methods for their production
WO2018148246A1 (en) 2017-02-07 2018-08-16 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for rna-guided genetic circuits
EP3580212A4 (en) 2017-02-08 2021-03-17 Dana Farber Cancer Institute, Inc. REGULATION OF CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS
WO2018146481A1 (en) 2017-02-09 2018-08-16 Fujian Agriculture And Forestry University Expression of a phosphate transporter for improving plant yield
EP3579872A1 (en) 2017-02-10 2019-12-18 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of cancers associated with activation of the mapk pathway
CA3049989A1 (en) 2017-02-10 2018-08-16 Zymergen Inc. A modular universal plasmid design strategy for the assembly and editing of multiple dna constructs for multiple hosts
EP3583118A1 (en) 2017-02-17 2019-12-25 Denali Therapeutics Inc. Transferrin receptor transgenic models
WO2018154418A1 (en) * 2017-02-22 2018-08-30 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of early onset parkinson's disease (park1) and other synuclein, alpha (snca) gene related conditions or disorders
EP3589647A1 (en) 2017-02-28 2020-01-08 Novartis AG Shp inhibitor compositions and uses for chimeric antigen receptor therapy
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
CN110914310A (zh) 2017-03-10 2020-03-24 哈佛大学的校长及成员们 胞嘧啶至鸟嘌呤碱基编辑器
EP3596217A1 (en) 2017-03-14 2020-01-22 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for the treatment of hemoglobinopathies
SG11201908527SA (en) 2017-03-15 2019-10-30 Hutchinson Fred Cancer Res High affinity mage-a1-specific tcrs and uses thereof
EP3596207B1 (en) 2017-03-15 2023-12-20 The Broad Institute, Inc. Novel cas13b orthologues crispr enzymes and systems
EP3595645A1 (en) 2017-03-15 2020-01-22 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Pharmaceutical compositions for the treatment of thrombosis in patients suffering from a myeloproliferative neoplasm
US11771703B2 (en) 2017-03-17 2023-10-03 The Johns Hopkins University Targeted epigenetic therapy against distal regulatory element of TGFβ2 expression
WO2018170515A1 (en) 2017-03-17 2018-09-20 The Broad Institute, Inc. Methods for identifying and modulating co-occurant cellular phenotypes
WO2018176009A1 (en) 2017-03-23 2018-09-27 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable dna binding proteins
EP3600269A1 (en) 2017-03-24 2020-02-05 INSERM - Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Gfi1 inhibitors for the treatment of hyperglycemia
WO2018172785A1 (en) 2017-03-24 2018-09-27 Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences Methods for increasing grain yield
US20210186982A1 (en) 2017-03-24 2021-06-24 Universite Nice Sophia Antipolis Methods and compositions for treating melanoma
WO2018183580A1 (en) * 2017-03-29 2018-10-04 The Broad Institute, Inc Compositions and methods for treatment of peroxisome proliferator-activated receptor gamma (pparg) activated cancer
US20210275543A1 (en) 2017-03-30 2021-09-09 Nserm (Institut National De La Santé Et De La Recherche Médicale) Methods for the treatment of mitochondrial genetic diseases
US11913075B2 (en) 2017-04-01 2024-02-27 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for detecting and modulating an immunotherapy resistance gene signature in cancer
EP3607071A1 (en) * 2017-04-06 2020-02-12 DSM IP Assets B.V. Self-guiding integration construct (sgic)
US20200071773A1 (en) 2017-04-12 2020-03-05 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Tumor signature for metastasis, compositions of matter methods of use thereof
JP2020516285A (ja) 2017-04-12 2020-06-11 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 新規ｖｉ型ｃｒｉｓｐｒオルソログ及び系
WO2018191520A1 (en) 2017-04-12 2018-10-18 The Broad Institute, Inc. Respiratory and sweat gland ionocytes
AU2018253115B2 (en) 2017-04-12 2022-08-11 Edigene Biotechnology, Inc. Aryl hydrocarbon receptor antagonists and uses thereof
WO2018191750A2 (en) 2017-04-14 2018-10-18 The Broad Institute Inc. Novel delivery of large payloads
WO2018195129A1 (en) 2017-04-17 2018-10-25 University Of Maryland, College Park Embryonic cell cultures and methods of using the same
EP3612629A1 (en) 2017-04-18 2020-02-26 The Broad Institute, Inc. Compositions for detecting secretion and methods of use
US11834670B2 (en) * 2017-04-19 2023-12-05 Global Life Sciences Solutions Usa Llc Site-specific DNA modification using a donor DNA repair template having tandem repeat sequences
WO2018193075A1 (en) 2017-04-21 2018-10-25 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of diseases associated with reduced cftr function
AU2018254619B2 (en) 2017-04-21 2022-07-21 The General Hospital Corporation Variants of Cpf1 (CAS12a) with altered PAM specificity
US20200384115A1 (en) 2017-04-21 2020-12-10 The Broad Institute , Inc. Targeted delivery to beta cells
WO2018201051A1 (en) 2017-04-28 2018-11-01 Novartis Ag Bcma-targeting agent, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
EP3615672A1 (en) 2017-04-28 2020-03-04 Editas Medicine, Inc. Methods and systems for analyzing guide rna molecules
WO2018201056A1 (en) 2017-04-28 2018-11-01 Novartis Ag Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
CN110799492B (zh) 2017-04-28 2023-06-27 爱康泰生治疗公司 用于递送核酸的新型羰基脂质和脂质纳米颗粒制剂
US11655275B2 (en) 2017-05-03 2023-05-23 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for modification of a cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene
WO2018204777A2 (en) 2017-05-05 2018-11-08 The Broad Institute, Inc. Methods for identification and modification of lncrna associated with target genotypes and phenotypes
IL252151A0 (en) 2017-05-07 2017-07-31 Fainzilber Michael Treatment of stress disorders
EP3634493A1 (en) 2017-05-08 2020-04-15 Precision BioSciences, Inc. Nucleic acid molecules encoding an engineered antigen receptor and an inhibitory nucleic acid molecule and methods of use thereof
CA3062595A1 (en) 2017-05-10 2018-11-15 The Regents Of The University Of California Directed editing of cellular rna via nuclear delivery of crispr/cas9
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
US20200171022A1 (en) 2017-05-17 2020-06-04 Inserm (Institut National De La Santé Et Da La Recherche Médicale) Flt3 inhibitors for improving pain treatments by opioids
CN111417727A (zh) 2017-05-18 2020-07-14 博德研究所 用于靶向核酸编辑的系统、方法和组合物
US10780119B2 (en) 2017-05-24 2020-09-22 Effector Therapeutics Inc. Methods and compositions for cellular immunotherapy
EP3634984A1 (en) 2017-05-25 2020-04-15 Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences Methods for increasing grain productivity
US11326157B2 (en) 2017-05-25 2022-05-10 The General Hospital Corporation Base editors with improved precision and specificity
EP3409104A1 (en) 2017-05-31 2018-12-05 Vilmorin et Cie Tomato plant resistant to tomato yellow leaf curl virus, powdery mildew, and nematodes
WO2018221685A1 (ja) 2017-05-31 2018-12-06 国立大学法人 東京大学 改変されたＣａｓ９タンパク質及びその用途
EP3409106A1 (en) 2017-06-01 2018-12-05 Vilmorin et Cie Tolerance in plants of solanum lycopersicum to the tobamovirus tomato brown rugose fruit virus (tbrfv)
WO2020249996A1 (en) 2019-06-14 2020-12-17 Vilmorin & Cie Resistance in plants of solanum lycopersicum to the tobamovirus tomato brown rugose fruit virus
EP3635113A4 (en) 2017-06-05 2021-03-17 Fred Hutchinson Cancer Research Center GENOMIC SAFE HARBORS FOR GENETIC THERAPIES IN HUMAN STEM CELLS AND MANIPULATED NANOPARTICLES TO DELIVER TARGETED GENETIC THERAPIES
EP3634983A1 (en) 2017-06-05 2020-04-15 Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) - Delegación Andalucía Targeting of gluten by genome editing
ES2875579T3 (es) 2017-06-06 2021-11-10 Zymergen Inc Plataforma de ingeniería genómica de HTP para mejorar Escherichia coli
US11820822B2 (en) 2017-06-06 2023-11-21 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for sensitizing cancer cells to T cell-mediated killing by modulating molecular pathways
JP7227162B2 (ja) 2017-06-06 2023-02-21 ザイマージェン インコーポレイテッド 真菌株を改良するためのｈｔｐゲノム操作プラットフォーム
WO2018224615A1 (en) 2017-06-08 2018-12-13 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating hyperpigmentation disorders
US10428319B2 (en) 2017-06-09 2019-10-01 Editas Medicine, Inc. Engineered Cas9 nucleases
US11845942B2 (en) 2017-06-09 2023-12-19 Vilmorin & Cie Compositions and methods for genome editing
CA3066750A1 (en) 2017-06-13 2018-12-20 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Compositions comprising curons and uses thereof
US11845954B2 (en) 2017-06-14 2023-12-19 Technische Universität Dresden Methods and means for genetic alteration of genomes utilizing designer DNA recombining enzymes
EP3638218A4 (en) 2017-06-14 2021-06-09 The Broad Institute, Inc. COMPOSITIONS AND METHOD OF TARGETING COMPLEMENTING COMPONENT 3 FOR INHIBITION OF TUMOR GROWTH
CA3067382A1 (en) 2017-06-15 2018-12-20 The Regents Of The University Of California Targeted non-viral dna insertions
US11512287B2 (en) 2017-06-16 2022-11-29 Sangamo Therapeutics, Inc. Targeted disruption of T cell and/or HLA receptors
DK3538645T3 (da) 2017-06-20 2021-04-19 Inst Curie Immunceller der mangler suv39h1
US10011849B1 (en) 2017-06-23 2018-07-03 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
RU2022103603A (ru) 2017-06-23 2022-03-11 Инскрипта, Инк. Направляемые нуклеиновыми кислотами нуклеазы
US9982279B1 (en) 2017-06-23 2018-05-29 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
CN111328290A (zh) 2017-06-26 2020-06-23 博德研究所 用于靶向核酸编辑的基于crispr/cas-腺嘌呤脱氨酶的组合物、系统和方法
ES2913457T3 (es) 2017-06-30 2022-06-02 Inscripta Inc Métodos, módulos, instrumentos y sistemas de procesamiento celular automatizados
JP2020530307A (ja) 2017-06-30 2020-10-22 インティマ・バイオサイエンス，インコーポレーテッド 遺伝子治療のためのアデノ随伴ウイルスベクター
WO2019005957A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Precision Biosciences, Inc. GENETICALLY MODIFIED T CELLS COMPRISING A MODIFIED INTRON IN THE ALPHA T CELL RECEPTOR GENE
US20200140896A1 (en) 2017-06-30 2020-05-07 Novartis Ag Methods for the treatment of disease with gene editing systems
AU2018301393A1 (en) 2017-07-11 2020-02-06 Compass Therapeutics Llc Agonist antibodies that bind human CD137 and uses thereof
WO2019014664A1 (en) * 2017-07-14 2019-01-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. MODULATION OF BIOMARKERS TO INCREASE ANTITUMOR IMMUNITY AND IMPROVE THE EFFECTIVENESS OF ANTICANCER IMMUNOTHERAPY
WO2019011118A1 (zh) 2017-07-14 2019-01-17 苏州克睿基因生物科技有限公司 一种基因编辑系统及基因编辑的方法
US11866726B2 (en) 2017-07-14 2024-01-09 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for targeted integration and genome editing and detection thereof using integrated priming sites
US20190316101A1 (en) 2017-07-18 2019-10-17 Howard Hughes Medical Institute Methods and compositions for genetically manipulating genes and cells
WO2019016310A1 (en) 2017-07-20 2019-01-24 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING CANCERS
IL253642A0 (en) 2017-07-24 2017-09-28 Seger Rony Combined treatment for cancer
WO2019023291A2 (en) 2017-07-25 2019-01-31 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR PRODUCTION AND DECODING OF GUIDE RNA LIBRARIES AND USES THEREOF
EP3658173A1 (en) 2017-07-25 2020-06-03 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for modulating monocytopoiesis
WO2019023680A1 (en) 2017-07-28 2019-01-31 President And Fellows Of Harvard College METHODS AND COMPOSITIONS FOR EVOLUTION OF BASIC EDITORS USING PHAGE-ASSISTED CONTINUOUS EVOLUTION (PACE)
CN110891419A (zh) 2017-07-31 2020-03-17 瑞泽恩制药公司 评价crispr/cas-诱导的与外源供体核酸的体内重组
NZ761655A (en) 2017-07-31 2024-03-22 Reflection Biotechnologies Ltd Cellular models of and therapies for ocular diseases
CA3068072A1 (en) 2017-07-31 2019-02-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for assessing crispr/cas-mediated disruption or excision and crispr/cas-induced recombination with an exogenous donor nucleic acid in vivo
CA3067872A1 (en) 2017-07-31 2019-02-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Cas-transgenic mouse embryonic stem cells and mice and uses thereof
JP7207665B2 (ja) 2017-08-04 2023-01-18 北京大学 メチル化により修飾されたｄｎａ塩基を特異的に認識するｔａｌｅ ｒｖｄおよびその使用
WO2019028686A1 (zh) 2017-08-08 2019-02-14 北京大学 基因敲除方法
CN111263810A (zh) * 2017-08-22 2020-06-09 纳匹基因公司 使用多核苷酸指导的核酸内切酶的细胞器基因组修饰
EP3672612A4 (en) 2017-08-23 2021-09-29 The General Hospital Corporation MANIPULATED CRISPR-CAS9-NUCLEASES WITH CHANGED PAM SPECIFICITY
WO2019038771A1 (en) 2017-08-23 2019-02-28 Technion Research & Development Foundation Limited COMPOSITIONS AND METHODS FOR ENHANCING ALCOHOL TOLERANCE IN YEAST
CN111655861A (zh) 2017-08-24 2020-09-11 内布拉斯加大学董事委员会 用于原位生殖系基因组工程的方法和组合物
WO2019038417A1 (en) 2017-08-25 2019-02-28 Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences METHODS FOR INCREASING GRAIN YIELD
US10738327B2 (en) 2017-08-28 2020-08-11 Inscripta, Inc. Electroporation cuvettes for automation
WO2019139645A2 (en) 2017-08-30 2019-07-18 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising gam
EP3675880B1 (en) 2017-09-01 2023-06-07 The Johns Hopkins University Targeted epigenetic therapy for inherited aortic aneurysm condition
CN107446859B (zh) * 2017-09-02 2020-12-18 河南省农业科学院畜牧兽医研究所 一株鸡毒支原体及其应用
EP3680331A4 (en) 2017-09-05 2021-06-09 The University Of Tokyo MODIFIED CAS9 PROTEIN AND USING IT
US20210106618A1 (en) 2017-09-06 2021-04-15 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods for improving adoptive cell therapy
CA3071661A1 (en) 2017-09-06 2019-03-14 Fred Hutchinson Cancer Research Center Strep-tag specific chimeric receptors and uses thereof
US20200262879A1 (en) 2017-09-11 2020-08-20 Insideoutbio, Inc. Methods and compositions to enhance the immunogenicity of tumors
WO2019055862A1 (en) 2017-09-14 2019-03-21 Fred Hutchinson Cancer Research Center HIGH AFFINITY T CELL RECEPTORS AND USES THEREOF
CN109517796A (zh) 2017-09-18 2019-03-26 博雅辑因（北京）生物科技有限公司 一种基因编辑t细胞及其用途
EP3684914A4 (en) 2017-09-18 2021-06-02 Futuragene Israel Ltd. DELLA POLYPEPTIDES FABRIC SPECIFIC EXPRESSION CONTROL
WO2019057649A1 (en) 2017-09-19 2019-03-28 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) METHODS AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF ACUTE MYELOID LEUKEMIA
US20200268837A1 (en) 2017-09-20 2020-08-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for modulating autophagy
BR112020005519A2 (pt) 2017-09-20 2020-10-27 The University Of British Columbia novos anticorpos anti-hla-a2 e usos dos mesmos
US11534471B2 (en) 2017-09-21 2022-12-27 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Isolation, preservation, compositions and uses of extracts from justicia plants
CN111511388A (zh) 2017-09-21 2020-08-07 博德研究所 用于靶向核酸编辑的系统、方法和组合物
KR101896847B1 (ko) 2017-09-22 2018-09-07 한국생명공학연구원 DNA 절단 활성이 불활성화된 Cpf1을 포함하는 유전자 발현 억제용 조성물 및 그 용도
MX2020003589A (es) 2017-09-29 2020-07-22 Regeneron Pharma Animales no humanos que comprenden un locus ttr humanizado y metodos de uso.
US11603536B2 (en) * 2017-09-29 2023-03-14 Inari Agriculture Technology, Inc. Methods for efficient maize genome editing
CN111372650A (zh) 2017-09-30 2020-07-03 因思科瑞普特公司 流通式电穿孔仪器
EP3692057B9 (en) 2017-10-03 2023-10-04 Precision BioSciences, Inc. Modified epidermal growth factor receptor peptides for use in genetically-modified cells
EP3692152A4 (en) 2017-10-04 2021-12-01 The Broad Institute, Inc. PROCESSES AND COMPOSITIONS FOR MODIFYING THE FUNCTION AND STRUCTURE OF CHROMATIN LOOPS AND / OR DOMAINS
CA3076740A1 (en) * 2017-10-06 2019-04-11 Oregon Health & Science University Compositions and methods for editing rna
WO2019075197A1 (en) 2017-10-11 2019-04-18 The General Hospital Corporation METHODS OF DETECTION OF INDIVIDUAL SITE-SPECIFIC PARASITE GENOMIC DEAMINATION BY BASE EDITING TECHNOLOGIES
US10709085B2 (en) 2017-10-13 2020-07-14 Bejo Zaden Bv Lettuce variety ‘80020-0911-007’
WO2019079347A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 The Broad Institute, Inc. USES OF BASIC EDITORS ADENOSINE
WO2019079362A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Massachusetts Institute Of Technology HOST-PATHOGENIC INTERACTION OF MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
JP2021502330A (ja) 2017-10-20 2021-01-28 フレッド ハッチンソン キャンサー リサーチ センター Ｔｉｇｉｔおよび／またはｃｄ１１２ｒを標的とするか、またはｃｄ２２６過剰発現を含む、組成物および免疫治療の方法
MX2020004063A (es) 2017-10-20 2020-10-05 Hutchinson Fred Cancer Res Sistemas y metodos para producir celulas b modificadas geneticamente para expresar anticuerpos seleccionados.
US11690856B2 (en) 2017-10-23 2023-07-04 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Compounds for treating CMV related diseases
SG11202003798TA (en) 2017-10-27 2020-05-28 Univ California Targeted replacement of endogenous t cell receptors
CN109722415B (zh) 2017-10-27 2021-01-26 博雅辑因（北京）生物科技有限公司 一种造血干细胞的培养组合物、培养基以及造血干细胞的培养方法
WO2019089826A1 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Magenta Therapeutics Inc. Compositions and methods for the expansion of hematopoietic stem and progenitor cells
US20210179709A1 (en) 2017-10-31 2021-06-17 Novartis Ag Anti-car compositions and methods
CN111683669A (zh) 2017-10-31 2020-09-18 美真达治疗公司 用于造血干细胞和祖细胞移植疗法的组合物和方法
WO2019089753A2 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Compass Therapeutics Llc Cd137 antibodies and pd-1 antagonists and uses thereof
WO2019089803A1 (en) 2017-10-31 2019-05-09 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for studying cell evolution
EP3704238B1 (en) 2017-11-01 2024-01-03 Precision Biosciences, Inc. Engineered nucleases that target human and canine factor viii genes as a treatment for hemophilia a
WO2019087113A1 (en) 2017-11-01 2019-05-09 Novartis Ag Synthetic rnas and methods of use
WO2019094725A2 (en) 2017-11-09 2019-05-16 Sangamo Therapeutics, Inc. Genetic modification of cytokine inducible sh2-containing protein (cish) gene
WO2019094983A1 (en) 2017-11-13 2019-05-16 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for treating cancer by targeting the clec2d-klrb1 pathway
AU2018369784B2 (en) 2017-11-14 2023-06-01 Massachusetts Eye And Ear Infirmary RUNX1 inhibition for treatment of proliferative vitreoretinopathy and conditions associated with epithelial to mesenchymal transition
IL255664A0 (en) 2017-11-14 2017-12-31 Shachar Idit Hematopoietic stem cells with enhanced properties
BR112020009663A2 (pt) 2017-11-17 2020-11-10 Iovance Biotherapeutics, Inc. método para a expansão de linfócitos infiltrantes de tumor (tils) em uma população terapêutica de tils, método para o tratamento de um indivíduo com câncer, composição
WO2019099823A1 (en) * 2017-11-17 2019-05-23 Stc.Unm Therapy for myotonic dystrophy type 1 via genome editing of the dmpk gene
US11851497B2 (en) 2017-11-20 2023-12-26 Compass Therapeutics Llc CD137 antibodies and tumor antigen-targeting antibodies and uses thereof
JP2021503885A (ja) 2017-11-22 2021-02-15 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 末梢血からの末梢血リンパ球（ｐｂｌ）の拡大培養
JP7408036B2 (ja) 2017-11-24 2024-01-05 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル ガンを処置するための方法及び組成物
WO2019101995A1 (en) 2017-11-27 2019-05-31 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for cardiac regeneration
SG11202004980RA (en) 2017-11-28 2020-06-29 Mirimus Inc METHODS OF GENETIC MEDIATED ENGINEERING OF RNAi MODELS
WO2019109047A1 (en) 2017-12-01 2019-06-06 Fred Hutchinson Cancer Research Center Binding proteins specific for 5t4 and uses thereof
GB201720351D0 (en) 2017-12-06 2018-01-17 Iontas Ltd Selecting for developability in drug discovery
AU2018378804A1 (en) 2017-12-06 2020-06-11 Ensoma, Inc. Dosing regimens for the mobilization of hematopoietic stem and progenitor cells
WO2019113506A1 (en) 2017-12-07 2019-06-13 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for multiplexing single cell and single nuclei sequencing
WO2019113463A1 (en) 2017-12-08 2019-06-13 Synthetic Genomics, Inc. Improving algal lipid productivity via genetic modification of a tpr domain containing protein
CA3084191A1 (en) 2017-12-15 2019-06-20 Danisco Us Inc. Cas9 variants and methods of use
CN107868123B (zh) 2017-12-25 2020-05-12 中国农业科学院作物科学研究所 一种同时提高植物产量和抗性的基因及其应用
WO2019133881A1 (en) 2017-12-29 2019-07-04 Rubius Therapeutics, Inc. Gene editing and targeted transcriptional modulation for enginerering erythroid cells
US20200338132A1 (en) 2018-01-03 2020-10-29 Magenta Therapeutics Inc. Compositions and methods for the expansion of hematopoietic stem and progenitor cells and treatment of inherited metabolic disorders
US20210072244A1 (en) 2018-01-04 2021-03-11 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating melanoma resistant
AU2019207703A1 (en) 2018-01-09 2020-07-16 Cibus Europe B.V. Shatterproof genes and mutations
WO2019140278A1 (en) 2018-01-11 2019-07-18 Fred Hutchinson Cancer Research Center Immunotherapy targeting core binding factor antigens
WO2019138083A1 (en) 2018-01-12 2019-07-18 Basf Se Gene underlying the number of spikelets per spike qtl in wheat on chromosome 7a
CN111757876B (zh) 2018-01-17 2024-03-22 沃泰克斯药物股份有限公司 Dna-pk抑制剂
ES2940786T3 (es) 2018-01-17 2023-05-11 Vertex Pharma Compuestos de quinoxalinona, composiciones, métodos y kits para aumentar la eficiencia de edición del genoma
EP3740479A1 (en) 2018-01-17 2020-11-25 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Dna-pk inhibitors
US20210054064A1 (en) 2018-01-24 2021-02-25 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Antagonists of il-33 for use in methods for preventing ischemia reperfusion injusry in an organ
US20190233816A1 (en) * 2018-01-26 2019-08-01 Massachusetts Institute Of Technology Structure-guided chemical modification of guide rna and its applications
US11220694B1 (en) 2018-01-29 2022-01-11 Inari Agriculture, Inc. Rice cells and rice plants
US11926835B1 (en) * 2018-01-29 2024-03-12 Inari Agriculture Technology, Inc. Methods for efficient tomato genome editing
IL257225A (en) 2018-01-29 2018-04-09 Yeda Res & Dev Treatment of sarcoma
US11802288B1 (en) * 2018-01-29 2023-10-31 Inari Agriculture Technology, Inc. Methods for efficient soybean genome editing
CN112041659A (zh) * 2018-02-06 2020-12-04 瓦罗贝克两合公司 微流体装置、系统、基础设施、其用途以及使用其用于基因工程改造的方法
KR20200119239A (ko) 2018-02-08 2020-10-19 지머젠 인코포레이티드 코리네박테리움에서 crispr을 사용하는 게놈 편집
BR112020014242A2 (pt) 2018-02-14 2020-12-15 Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences Métodos de aumento da eficiência de uso de nutriente
CA3091311A1 (en) 2018-02-16 2019-08-22 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Use of antagonists of cxcr3b for treating vitiligo
WO2019165116A1 (en) 2018-02-26 2019-08-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
BR112020018658A2 (pt) 2018-03-15 2020-12-29 KSQ Therapeutics, Inc. Composições de regulação gênica e métodos para imu-noterapia aprimorada
KR20240038811A (ko) 2018-03-19 2024-03-25 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 CRISPR/Cas 시스템을 사용한 동물에서의 전사 조절
US10760075B2 (en) 2018-04-30 2020-09-01 Snipr Biome Aps Treating and preventing microbial infections
WO2019190874A1 (en) 2018-03-29 2019-10-03 Inscripta, Inc. Automated control of cell growth rates for induction and transformation
WO2019193375A1 (en) 2018-04-04 2019-10-10 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of fzd7 inhibitors for the treatment of retinal neovascularization
IT201800004253A1 (it) 2018-04-05 2019-10-05 Composizioni e metodi per il trattamento della tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica dominante ereditaria.
JP2021520781A (ja) 2018-04-06 2021-08-26 チルドレンズ メディカル センター コーポレーションＣｈｉｌｄｒｅｎ’Ｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 体細胞リプログラミングおよびインプリンティングのモジュレートのための組成物および方法
WO2019200122A1 (en) 2018-04-12 2019-10-17 Precision Biosciences, Inc. Optimized engineered nucleases having specificity for the human t cell receptor alpha constant region gene
SG11202010116PA (en) 2018-04-13 2020-11-27 Sangamo Therapeutics France Chimeric antigen receptor specific for interleukin-23 receptor
WO2019200004A1 (en) 2018-04-13 2019-10-17 Inscripta, Inc. Automated cell processing instruments comprising reagent cartridges
CN112313241A (zh) 2018-04-17 2021-02-02 总医院公司 核酸结合、修饰、和切割试剂的底物偏好和位点的灵敏体外试验
WO2019204585A1 (en) 2018-04-19 2019-10-24 Massachusetts Institute Of Technology Single-stranded break detection in double-stranded dna
AU2019255789A1 (en) 2018-04-19 2020-10-22 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for gene editing
US10858761B2 (en) 2018-04-24 2020-12-08 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided editing of exogenous polynucleotides in heterologous cells
US10501738B2 (en) 2018-04-24 2019-12-10 Inscripta, Inc. Automated instrumentation for production of peptide libraries
PL3560330T3 (pl) 2018-04-24 2022-09-19 KWS SAAT SE & Co. KGaA Rośliny o ulepszonej strawności i haplotypach markerowych
US10526598B2 (en) 2018-04-24 2020-01-07 Inscripta, Inc. Methods for identifying T-cell receptor antigens
US11957695B2 (en) 2018-04-26 2024-04-16 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions targeting glucocorticoid signaling for modulating immune responses
CN108707621B (zh) 2018-04-26 2021-02-12 中国农业科学院作物科学研究所 一种CRISPR/Cpf1系统介导的以RNA转录本为修复模板的同源重组方法
WO2019210268A2 (en) 2018-04-27 2019-10-31 The Broad Institute, Inc. Sequencing-based proteomics
KR20210005138A (ko) 2018-04-27 2021-01-13 이오반스 바이오테라퓨틱스, 인크. 종양 침윤 림프구의 확장 및 유전자 편집을 위한 폐쇄 방법 및 면역요법에서의 그의 용도
WO2019210153A1 (en) 2018-04-27 2019-10-31 Novartis Ag Car t cell therapies with enhanced efficacy
JP2021522385A (ja) 2018-04-27 2021-08-30 ジーンエディット インコーポレイテッド カチオン性ポリマーおよびその生体分子送達のための使用
CN110184301B (zh) * 2018-04-28 2023-02-24 辉大(上海)生物科技有限公司 通过Tild-CRISPR实现高效精确的靶向整合
WO2019213660A2 (en) 2018-05-04 2019-11-07 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for modulating cgrp signaling to regulate innate lymphoid cell inflammatory responses
WO2019216338A1 (ja) 2018-05-08 2019-11-14 国立大学法人大阪大学 ホモ接合型細胞の作製方法
WO2019217837A1 (en) 2018-05-11 2019-11-14 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center T cell receptors targeting pik3ca mutations and uses thereof
GB2589246A (en) 2018-05-16 2021-05-26 Synthego Corp Methods and systems for guide RNA design and use
US11690921B2 (en) 2018-05-18 2023-07-04 Sangamo Therapeutics, Inc. Delivery of target specific nucleases
GB201808424D0 (en) 2018-05-23 2018-07-11 Lucite Int Uk Ltd Methods for producing BMA and MMA using genetically modified microorganisms
WO2019232542A2 (en) 2018-06-01 2019-12-05 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for detecting and modulating microenvironment gene signatures from the csf of metastasis patients
US20210261901A1 (en) 2018-06-01 2021-08-26 Avectas Limited Cell engineering platform
US11866719B1 (en) 2018-06-04 2024-01-09 Inari Agriculture Technology, Inc. Heterologous integration of regulatory elements to alter gene expression in wheat cells and wheat plants
KR20210018437A (ko) 2018-06-07 2021-02-17 더 브리검 앤드 우먼즈 하스피털, 인크. 조혈 줄기 세포를 생산하기 위한 방법
EP3806888B1 (en) 2018-06-12 2024-01-31 Obsidian Therapeutics, Inc. Pde5 derived regulatory constructs and methods of use in immunotherapy
CN112203725A (zh) 2018-06-13 2021-01-08 诺华股份有限公司 Bcma嵌合抗原受体及其用途
WO2019237386A1 (zh) * 2018-06-16 2019-12-19 深圳市博奥康生物科技有限公司 一种敲除人ct1.1基因的方法
BR112020025319A2 (pt) 2018-06-26 2021-03-09 The Broad Institute Inc. Composições, sistemas e métodos de amplificação baseada em crispr/cas e transposase
SG11202012786RA (en) 2018-06-26 2021-01-28 Massachusetts Inst Technology Crispr effector system based amplification methods, systems, and diagnostics
US11629179B2 (en) 2018-06-29 2023-04-18 Stichting Het Nederlands Kanker Instituut—Antoni van Leeuwenhoek Ziekenhuis TWEAK-receptor agonists for use in combination with immunotherapy of a cancer
WO2020005341A1 (en) 2018-06-29 2020-01-02 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Anc80 encoding sphingolipid-metabolizing proteins
EP4070802A1 (en) 2018-06-30 2022-10-12 Inscripta, Inc. Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
US20210292381A1 (en) 2018-07-04 2021-09-23 Ukko Inc. Methods of de-epitoping wheat proteins and use of same for the treatment of celiac disease
CA3105925A1 (en) * 2018-07-10 2020-01-16 Alia Therapeutics S.R.L. Vesicles for traceless delivery of guide rna molecules and/or guide rna molecule/rna-guided nuclease complex(es) and a production method thereof
EP3821012A4 (en) 2018-07-13 2022-04-20 The Regents of The University of California RETROTRANSPOSON-BASED DELIVERY VEHICLE AND METHOD OF USE THEREOF
WO2020018964A1 (en) 2018-07-20 2020-01-23 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for controlled expression of antigen-specific receptors
KR20210053898A (ko) 2018-07-31 2021-05-12 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 신규 crispr 효소 및 시스템
WO2020028686A1 (en) * 2018-08-01 2020-02-06 New York University Targeting piezo1 for treatment of cancer and infectious diseases
WO2020030634A1 (en) 2018-08-06 2020-02-13 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating cancers
CN113286884A (zh) 2018-08-07 2021-08-20 博德研究所 新型cas12b酶和系统
CA3109253A1 (en) 2018-08-10 2020-02-13 Sangamo Therapeutics France New car constructs comprising tnfr2 domains
EP3607819A1 (en) 2018-08-10 2020-02-12 Vilmorin et Cie Resistance to xanthomonas campestris pv. campestris (xcc) in cauliflower
US11142740B2 (en) 2018-08-14 2021-10-12 Inscripta, Inc. Detection of nuclease edited sequences in automated modules and instruments
US10532324B1 (en) 2018-08-14 2020-01-14 Inscripta, Inc. Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
US10752874B2 (en) 2018-08-14 2020-08-25 Inscripta, Inc. Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
CA3107002A1 (en) 2018-08-15 2020-04-30 Zymergen Inc. Applications of crispri in high throughput metabolic engineering
WO2020041387A1 (en) 2018-08-20 2020-02-27 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Degradation domain modifications for spatio-temporal control of rna-guided nucleases
US20210317429A1 (en) 2018-08-20 2021-10-14 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for optochemical control of crispr-cas9
WO2020041384A1 (en) 2018-08-20 2020-02-27 The Broad Institute, Inc. 3-phenyl-2-cyano-azetidine derivatives, inhibitors of rna-guided nuclease activity
CA3109496A1 (en) 2018-08-22 2020-02-27 Fred Hutchinson Cancer Research Center Immunotherapy targeting kras or her2 antigens
AU2019326408A1 (en) 2018-08-23 2021-03-11 Sangamo Therapeutics, Inc. Engineered target specific base editors
WO2020047099A1 (en) 2018-08-28 2020-03-05 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods and compositions for adoptive t cell therapy incorporating induced notch signaling
BR112021003670A2 (pt) 2018-08-28 2021-05-18 Vor Biopharma, Inc. células-tronco hematopoéticas geneticamente modificadas e seus usos
US11479762B1 (en) 2018-08-31 2022-10-25 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
AU2019333914A1 (en) 2018-09-04 2021-04-22 Magenta Therapeutics Inc. Aryl hydrocarbon receptor antagonists and methods of use
WO2020048942A1 (en) 2018-09-04 2020-03-12 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for enhancing cytotoxic t lymphocyte-dependent immune responses
WO2020049026A1 (en) 2018-09-05 2020-03-12 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating asthma and allergic diseases
WO2020051283A1 (en) * 2018-09-05 2020-03-12 The Regents Of The University Of California Generation of heritably gene-edited plants without tissue culture
WO2020051507A1 (en) 2018-09-06 2020-03-12 The Broad Institute, Inc. Nucleic acid assemblies for use in targeted delivery
EP3846837A4 (en) * 2018-09-07 2022-09-14 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established under The Will of J. David Gladstone DETECTION OF HIV OR HCV USING CRISPR-CAS13A
US20220047567A1 (en) 2018-09-10 2022-02-17 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for the treatment of neurofibromatosis
US20220098613A1 (en) 2018-09-12 2022-03-31 Fred Hutchinson Cancer Research Center Reducing cd33 expression to selectively protect therapeutic cells
EP3852813A4 (en) 2018-09-18 2022-06-22 VNV Newco Inc. ARC-BASED CAPSIDS AND THEIR USES
EP4234570A3 (en) 2018-09-18 2023-12-13 Sangamo Therapeutics, Inc. Programmed cell death 1 (pd1) specific nucleases
WO2020061391A1 (en) * 2018-09-20 2020-03-26 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods for inhibiting tumor cells using inhibitors of foxo3a antagonists
AU2019342197A1 (en) 2018-09-21 2021-04-15 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for treating diabetes, and methods for enriching mRNA coding for secreted proteins
WO2020068702A1 (en) 2018-09-24 2020-04-02 Fred Hutchinson Cancer Research Center Chimeric receptor proteins and uses thereof
WO2020064702A1 (en) 2018-09-25 2020-04-02 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of antagonists of th17 cytokines for the treatment of bronchial remodeling in patients suffering from allergic asthma
GB201815672D0 (en) 2018-09-26 2018-11-07 Innes John Centre Methods for altering starch granule size profile
WO2020072248A1 (en) 2018-10-01 2020-04-09 North Carolina State University Recombinant type i crispr-cas system
WO2020070062A1 (en) 2018-10-01 2020-04-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of tim-3 inhibitors for the treatment of exacerbations in patients suffering from severe asthma
EP3862430A4 (en) 2018-10-04 2022-06-15 Kaneka Corporation DNA CONSTRUCT FOR USE IN PLANT GENO EDITING
WO2020074937A1 (en) 2018-10-09 2020-04-16 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of alpha-v-integrin (cd51) inhibitors for the treatment of cardiac fibrosis
WO2020077236A1 (en) 2018-10-12 2020-04-16 The Broad Institute, Inc. Method for extracting nuclei or whole cells from formalin-fixed paraffin-embedded tissues
US11851663B2 (en) 2018-10-14 2023-12-26 Snipr Biome Aps Single-vector type I vectors
WO2020081730A2 (en) 2018-10-16 2020-04-23 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for modulating microenvironment
WO2020079162A1 (en) 2018-10-18 2020-04-23 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for inducing full ablation of hematopoiesis
US11214781B2 (en) 2018-10-22 2022-01-04 Inscripta, Inc. Engineered enzyme
CN113227368B (zh) 2018-10-22 2023-07-07 因思科瑞普特公司 工程化酶
US20210371590A1 (en) 2018-10-24 2021-12-02 GenEdit, Inc. Cationic polymer with alkyl side chains and use for biomolecule delivery
US20210386788A1 (en) 2018-10-24 2021-12-16 Obsidian Therapeutics, Inc. Er tunable protein regulation
US11407995B1 (en) 2018-10-26 2022-08-09 Inari Agriculture Technology, Inc. RNA-guided nucleases and DNA binding proteins
IL262658A (en) 2018-10-28 2020-04-30 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Prevention of age related clonal hematopoiesis and diseases associated therewith
US11066663B2 (en) 2018-10-31 2021-07-20 Zymergen Inc. Multiplexed deterministic assembly of DNA libraries
WO2020092140A2 (en) 2018-11-02 2020-05-07 Insideoutbio, Inc. Methods and compositions to induce or suppress immune responses through the use of membrane bound complement split products
US11434477B1 (en) 2018-11-02 2022-09-06 Inari Agriculture Technology, Inc. RNA-guided nucleases and DNA binding proteins
US20200140533A1 (en) 2018-11-02 2020-05-07 Annexon, Inc. Compositions and methods for treating brain injury
EP3877512A2 (en) 2018-11-05 2021-09-15 Iovance Biotherapeutics, Inc. Selection of improved tumor reactive t-cells
CN113272421A (zh) 2018-11-05 2021-08-17 艾欧凡斯生物治疗公司 用于产生肿瘤浸润性淋巴细胞的方法及其在免疫疗法中的用途
MX2021004775A (es) 2018-11-05 2021-06-08 Iovance Biotherapeutics Inc Expansion de linfocitos infiltrantes de tumores (tils) usando inhibidores de la via de proteina cinasa b (akt).
WO2020096989A1 (en) 2018-11-05 2020-05-14 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of nsclc patients refractory for anti-pd-1 antibody
BR112021009036A2 (pt) 2018-11-08 2021-08-24 Sutro Biopharma, Inc. Cepas de e coli apresentando um citoplasma oxidativo
MX2021005308A (es) 2018-11-09 2021-09-08 Fred Hutchinson Cancer Center Star Receptores de celulas t especificos para mesotelina y su uso en inmunoterapia.
SG11202104864QA (en) 2018-11-13 2021-06-29 Compass Therapeutics Llc Multispecific binding constructs against checkpoint molecules and uses thereof
EP3653708A1 (en) 2018-11-14 2020-05-20 Evonik Operations GmbH Isomaltulose production
US20220282275A1 (en) 2018-11-15 2022-09-08 The Broad Institute, Inc. G-to-t base editors and uses thereof
KR20210096143A (ko) 2018-11-26 2021-08-04 아소시아시온 센트로 데 인베스티가시온 코오페라티바 엔 비오시엔시아스-시스 비오구네 급성 또는 만성 간, 신장 또는 폐 질환의 진단 및/또는 치료 방법
RU2712497C1 (ru) * 2018-11-26 2020-01-29 Автономная некоммерческая образовательная организация высшего образования Сколковский институт науки и технологий Средство разрезания ДНК на основе Cas9 белка из биотехнологически значимой бактерии Clostridium cellulolyticum
RU2712492C1 (ru) * 2018-11-26 2020-01-29 Автономная некоммерческая образовательная организация высшего образования Сколковский институт науки и технологий Средство разрезания днк на основе cas9 белка из defluviimonas sp.
EP3896155A4 (en) 2018-12-12 2022-08-17 Kyushu University, National University Corporation PRODUCTION PROCESS FOR GENOMEEDIT CELLS
US11166996B2 (en) 2018-12-12 2021-11-09 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Anellovirus compositions and methods of use
EP3893898B1 (en) 2018-12-13 2024-04-03 Versiti Blood Research Institute Foundation, Inc. Method of treating autoimmune and inflammatory diseases using b cells
AU2019398351A1 (en) 2018-12-14 2021-06-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel CRISPR-Cas systems for genome editing
WO2020131586A2 (en) 2018-12-17 2020-06-25 The Broad Institute, Inc. Methods for identifying neoantigens
US11384344B2 (en) 2018-12-17 2022-07-12 The Broad Institute, Inc. CRISPR-associated transposase systems and methods of use thereof
EP3898949A1 (en) 2018-12-19 2021-10-27 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of expanding tumor infiltrating lymphocytes using engineered cytokine receptor pairs and uses thereof
CN113227375A (zh) 2018-12-20 2021-08-06 原住民股份有限公司 合成的微小rna模拟物
JP7449291B2 (ja) 2018-12-20 2024-03-13 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ヌクレアーゼ媒介リピート伸長
EP3898661A1 (en) 2018-12-21 2021-10-27 Precision BioSciences, Inc. Genetic modification of the hydroxyacid oxidase 1 gene for treatment of primary hyperoxaluria
WO2020136216A1 (en) 2018-12-27 2020-07-02 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods of identifying subjects having or at risk of having a coagulation related disorder
AU2020205150A1 (en) 2019-01-03 2021-07-22 Assistance Publique-Hôpitaux De Paris (Aphp) Methods and pharmaceutical compositions for enhancing CD8+ T cell-dependent immune responses in subjects suffering from cancer
US11739156B2 (en) 2019-01-06 2023-08-29 The Broad Institute, Inc. Massachusetts Institute of Technology Methods and compositions for overcoming immunosuppression
WO2020146805A1 (en) 2019-01-11 2020-07-16 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for lipid nanoparticle delivery of active agents
CA3126761C (en) 2019-01-15 2023-01-10 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Green bean plants with improved disease resistance
EP3911669A1 (en) 2019-01-16 2021-11-24 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Variants of erythroferrone and their use
EP3911369A4 (en) 2019-01-18 2022-11-16 Orthobio Therapeutics, Inc. EDITING GENES TO IMPROVE JOINT FUNCTION
WO2020161083A1 (en) 2019-02-04 2020-08-13 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for modulating blood-brain barrier
US11946040B2 (en) 2019-02-04 2024-04-02 The General Hospital Corporation Adenine DNA base editor variants with reduced off-target RNA editing
EP3826664A4 (en) 2019-02-06 2022-10-26 Sangamo Therapeutics, Inc. METHOD FOR THE TREATMENT OF TYPE I MUCOPOLYSACCHARIDOSES
WO2020163856A1 (en) 2019-02-10 2020-08-13 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Modified mitochondrion and methods of use thereof
WO2020168315A1 (en) 2019-02-15 2020-08-20 Just-Evotec Biologics, Inc. Automated biomanufacturing systems, facilities, and processes
WO2020169472A2 (en) 2019-02-18 2020-08-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods of inducing phenotypic changes in macrophages
GB2596461B (en) 2019-02-20 2023-09-27 Fred Hutchinson Cancer Center Binding proteins specific for RAS neoantigens and uses thereof
MX2021010288A (es) 2019-03-01 2021-09-23 Iovance Biotherapeutics Inc Expansion de linfocitos infiltrantes de tumores a partir de tumores liquidos y usos terapeuticos de los mismos.
EP3934417A1 (en) 2019-03-05 2022-01-12 The State of Israel - Ministry of Agriculture & Rural Development, Agricultural Research Organization (ARO) (Volcani Center) Genome-edited birds
KR20210149060A (ko) 2019-03-07 2021-12-08 더 트러스티스 오브 컬럼비아 유니버시티 인 더 시티 오브 뉴욕 Tn7-유사 트랜스포존을 사용한 rna-유도된 dna 통합
AU2020231380A1 (en) 2019-03-07 2021-09-23 The Regents Of The University Of California CRISPR-Cas effector polypeptides and methods of use thereof
KR20210136997A (ko) 2019-03-08 2021-11-17 지머젠 인코포레이티드 미생물에서 반복적 게놈 편집
US11053515B2 (en) 2019-03-08 2021-07-06 Zymergen Inc. Pooled genome editing in microbes
EP3935159A1 (en) 2019-03-08 2022-01-12 Obsidian Therapeutics, Inc. Human carbonic anhydrase 2 compositions and methods for tunable regulation
WO2020185867A1 (en) 2019-03-11 2020-09-17 Sorrento Therapeutics, Inc. Improved process for integration of dna constructs using rna-guided endonucleases
SG11202109745PA (en) 2019-03-11 2021-10-28 Hutchinson Fred Cancer Res High avidity wt1 t cell receptors and uses thereof
US20220177863A1 (en) 2019-03-18 2022-06-09 The Broad Institute, Inc. Type vii crispr proteins and systems
IL286359B1 (en) 2019-03-18 2024-02-01 Regeneron Pharma A CRISPR/CAS knock-out screening platform for uncovering genetic vulnerabilities associated with tau aggregation
EP4317950A3 (en) 2019-03-18 2024-04-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr/cas screening platform to identify genetic modifiers of tau seeding or aggregation
WO2020191239A1 (en) 2019-03-19 2020-09-24 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for editing nucleotide sequences
US11001831B2 (en) 2019-03-25 2021-05-11 Inscripta, Inc. Simultaneous multiplex genome editing in yeast
AU2020247900A1 (en) 2019-03-25 2021-11-04 Inscripta, Inc. Simultaneous multiplex genome editing in yeast
WO2020193740A1 (en) 2019-03-28 2020-10-01 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) New strategy for treating pancreatic cancer
US20220249511A1 (en) 2019-03-29 2022-08-11 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for the treatment of keloid, hypertrophic scars and/or hyperpigmentation disorders
US20220175848A1 (en) 2019-04-01 2022-06-09 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for cell therapy
WO2020206036A1 (en) 2019-04-01 2020-10-08 The Broad Institute, Inc. Novel nucleic acid modifier
EP3947737A2 (en) 2019-04-02 2022-02-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods of predicting and preventing cancer in patients having premalignant lesions
EP3946384A1 (en) 2019-04-02 2022-02-09 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods for the treatment of beta-thalassemia
EP4332115A2 (en) 2019-04-03 2024-03-06 Precision Biosciences, Inc. Genetically-modified immune cells comprising a microrna-adapted shrna (shrnamir)
BR112021019512A2 (pt) 2019-04-03 2022-02-15 Regeneron Pharma Métodos para inserir uma sequência de codificação de proteína de ligação ao antígeno e para tratar ou efetuar a profilaxia de uma doença em um animal, animal, célula, genoma, ácido nucleico doador exógeno, gene de porto seguro, e, agente de nuclease ou um ou mais ácidos nucleicos
WO2020206134A1 (en) 2019-04-04 2020-10-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for scarless introduction of targeted modifications into targeting vectors
US11737435B2 (en) 2019-04-04 2023-08-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized coagulation factor 12 locus
EP3947656A1 (en) 2019-04-05 2022-02-09 Danisco US Inc. Methods for polynucleotide integration into the genome of bacillus using dual circular recombinant dna constructs and compositions thereof
WO2020206202A1 (en) 2019-04-05 2020-10-08 Danisco Us Inc Methods for integrating a donor dna sequence into the genome of bacillus using linear recombinant dna constructs and compositions thereof
EP3947646A1 (en) 2019-04-05 2022-02-09 Precision BioSciences, Inc. Methods of preparing populations of genetically-modified immune cells
WO2020208082A1 (en) 2019-04-09 2020-10-15 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method for treating cmv related diseases
BR112021021095A2 (pt) 2019-04-23 2022-02-08 Genedit Inc Polímero catiônico com cadeias laterais alquila
EP3959320A1 (en) 2019-04-24 2022-03-02 Novartis AG Compositions and methods for selective protein degradation
US20220220565A1 (en) 2019-04-30 2022-07-14 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating melanoma
EP3964579A4 (en) 2019-04-30 2023-07-26 EdiGene (GuangZhou) Inc. METHOD OF PREDICTING THE EFFECTIVENESS OF THE TREATMENT OF HEMOGLOBINOPATHY
UY38693A (es) 2019-05-13 2020-12-31 Kws Saat Se & Co Kgaa Tolerancia a la sequía en maíz
US20220249559A1 (en) 2019-05-13 2022-08-11 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods and compositions for selecting tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy
US20220220169A1 (en) 2019-05-15 2022-07-14 Insideoutbio, Inc. Modular Therapeutics for the Treatment of Inflammatory Diseases and Cancer
WO2020236645A1 (en) * 2019-05-17 2020-11-26 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Compositions and methods for homology directed repair
US20220235340A1 (en) 2019-05-20 2022-07-28 The Broad Institute, Inc. Novel crispr-cas systems and uses thereof
WO2020236972A2 (en) 2019-05-20 2020-11-26 The Broad Institute, Inc. Non-class i multi-component nucleic acid targeting systems
CN113924367A (zh) 2019-05-23 2022-01-11 南京农业大学 提高水稻籽粒产量的方法
WO2020239623A1 (en) 2019-05-24 2020-12-03 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of ngal inhibitors for the treating chronic wound
AR118995A1 (es) 2019-05-25 2021-11-17 Kws Saat Se & Co Kgaa Mejorador de la inducción de haploides
EP3976015A1 (en) 2019-05-28 2022-04-06 Genedit Inc. Polymer comprising multiple functionalized sidechains for biomolecule delivery
US20220243178A1 (en) 2019-05-31 2022-08-04 The Broad Institute, Inc. Methods for treating metabolic disorders by targeting adcy5
EP3980012A1 (en) 2019-06-04 2022-04-13 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) A neuropilin antagonist in combination with a p38alpha-kinase inhibitor for the treatment of cancer
EP3801011A1 (en) 2019-06-04 2021-04-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized ttr locus with a beta-slip mutation and methods of use
WO2020245208A1 (en) 2019-06-04 2020-12-10 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of cd9 as a biomarker and as a biotarget in glomerulonephritis or glomerulosclerosis
WO2020244759A1 (en) 2019-06-05 2020-12-10 Klemm & Sohn Gmbh & Co. Kg New plants having a white foliage phenotype
WO2020247587A1 (en) 2019-06-06 2020-12-10 Inscripta, Inc. Curing for recursive nucleic acid-guided cell editing
MX2021015122A (es) 2019-06-07 2022-04-06 Regeneron Pharma Animales no humanos que comprenden un locus de albumina humanizado.
RU2722933C1 (ru) * 2019-06-11 2020-06-05 Автономная некоммерческая образовательная организация высшего образования Сколковский институт науки и технологий Средство разрезания днк на основе cas9 белка из бактерии demequina sediminicola
WO2020249769A1 (en) 2019-06-14 2020-12-17 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating ocular diseases related to mitochondrial dna maintenance
CA3137765A1 (en) 2019-06-14 2020-12-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Models of tauopathy
US10907125B2 (en) 2019-06-20 2021-02-02 Inscripta, Inc. Flow through electroporation modules and instrumentation
WO2020254850A1 (en) 2019-06-21 2020-12-24 Vilmorin & Cie Improvement of quality and permanence of green color of peppers at maturity and over-maturity
CN114008070A (zh) 2019-06-21 2022-02-01 因思科瑞普特公司 导致大肠杆菌赖氨酸产量增加的全基因组合理设计的突变
CN114450326A (zh) 2019-06-24 2022-05-06 普罗美加公司 用于将生物分子递送到细胞中的改性聚胺聚合物
US10927385B2 (en) 2019-06-25 2021-02-23 Inscripta, Inc. Increased nucleic-acid guided cell editing in yeast
EP3990633A1 (en) 2019-06-25 2022-05-04 Inari Agriculture Technology, Inc. Improved homology dependent repair genome editing
MX2021015433A (es) 2019-07-02 2022-06-08 Hutchinson Fred Cancer Res Vectores ad35 recombinantes y mejoras de la terapia génica relacionadas.
EP3993786A1 (en) 2019-07-02 2022-05-11 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for the prophylactic treatment of cancer in patients suffering from pancreatitis
WO2021001431A1 (en) 2019-07-02 2021-01-07 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of pi3ka-selective inhibitors for treating metastatic disease in patients suffering from pancreatic cancer
EP3994268A1 (en) 2019-07-04 2022-05-11 Ukko Inc. De-epitoped alpha gliadin and use of same for the management of celiac disease and gluten sensitivity
US10653731B1 (en) 2019-07-15 2020-05-19 Vigene Biosciences Inc. Recombinantly-modified adeno-associated virus (rAAV) having improved packaging efficiency
US10801042B1 (en) 2019-07-15 2020-10-13 Vigene Biosciences, Inc. Use of ion concentrations to increase the packaging efficiency of recombinant adeno-associated virus
US10557149B1 (en) 2019-07-15 2020-02-11 Vigene Biosciences, Inc. Recombinantly-modified adeno-associated virus helper vectors and their use to improve the packaging efficiency of recombinantly-modified adeno-associated virus
IL268111A (en) 2019-07-16 2021-01-31 Fainzilber Michael Methods of treating pain
WO2021009299A1 (en) 2019-07-17 2021-01-21 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Bcl-xl:fkbp12 fusion proteins suitable for screening agents capable of slowing down the aging process
US20220251572A1 (en) 2019-07-23 2022-08-11 Mnemo Therapeutics Immune cells defective for suv39h1
EP4003325A1 (en) 2019-07-24 2022-06-01 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Inhibitors of the sting pathway for the treatment of hidradenitis suppurativa
WO2021016608A1 (en) 2019-07-25 2021-01-28 Precision Biosciences, Inc. Compositions and methods for sequential stacking of nucleic acid sequences into a genomic locus
WO2021019272A1 (en) 2019-07-31 2021-02-04 Vilmorin & Cie Tolerance to tolcndv in cucumber
CN114401743A (zh) 2019-08-02 2022-04-26 法国国家健康和医学研究院 中和颗粒酶b用于向经历过心肌梗塞的受试者提供心脏保护
EP3772542A1 (en) 2019-08-07 2021-02-10 KWS SAAT SE & Co. KGaA Modifying genetic variation in crops by modulating the pachytene checkpoint protein 2
WO2021028359A1 (en) 2019-08-09 2021-02-18 Sangamo Therapeutics France Controlled expression of chimeric antigen receptors in t cells
US20220409661A1 (en) 2019-08-20 2022-12-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center T-cell immunotherapy specific for wt-1
EP4017526A1 (en) 2019-08-20 2022-06-29 Precision BioSciences, Inc. Lymphodepletion dosing regimens for cellular immunotherapies
WO2021035170A1 (en) 2019-08-21 2021-02-25 Precision Biosciences, Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
US20220298501A1 (en) 2019-08-30 2022-09-22 The Broad Institute, Inc. Crispr-associated mu transposase systems
WO2021043278A1 (zh) 2019-09-04 2021-03-11 博雅辑因（北京）生物科技有限公司 基于脱靶评估评价基因编辑治疗的方法
WO2021044012A1 (en) 2019-09-05 2021-03-11 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method of treatment and pronostic of acute myeloid leukemia
MX2022002722A (es) 2019-09-05 2022-06-09 Inst Genetics & Developmental Biology Cas Metodos para mejorar el tama?o y la calidad de las semillas.
US20220348937A1 (en) 2019-09-06 2022-11-03 Obsidian Therapeutics, Inc. Compositions and methods for dhfr tunable protein regulation
GB201913060D0 (en) 2019-09-10 2019-10-23 Innes John Centre Methods of increasing biotic stress resistance in plants
WO2021047775A1 (en) 2019-09-12 2021-03-18 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of inhibitors of tgfb/activinb signaling pathway for the treatment of patients suffering from medulloblastoma group 3
US20210079394A1 (en) 2019-09-13 2021-03-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Transcription modulation in animals using crispr/cas systems delivered by lipid nanoparticles
CN115175996A (zh) 2019-09-20 2022-10-11 博德研究所 新颖vi型crispr酶和系统
CN114391040A (zh) 2019-09-23 2022-04-22 欧米茄治疗公司 用于调节载脂蛋白b(apob)基因表达的组合物和方法
EP4041894A1 (en) 2019-09-23 2022-08-17 Omega Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING HEPATOCYTE NUCLEAR FACTOR 4-ALPHA (HNF4a) GENE EXPRESSION
US11542513B2 (en) 2019-09-26 2023-01-03 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Lettuce plants having resistance to Nasonovia ribisnigri biotype Nr:1
WO2021063968A1 (en) 2019-09-30 2021-04-08 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method and composition for diagnosing chronic obstructive pulmonary disease
GB201914137D0 (en) 2019-10-01 2019-11-13 Univ Leeds Innovations Ltd Modified Plants
EP4037714A1 (en) 2019-10-03 2022-08-10 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for modulating macrophages polarization
CA3153197A1 (en) 2019-10-03 2021-04-08 Ryan T. Gill Crispr systems with engineered dual guide nucleic acids
WO2021072244A1 (en) 2019-10-11 2021-04-15 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Anti-tn antibodies and uses thereof
WO2021072031A1 (en) 2019-10-11 2021-04-15 Insideoutbio, Inc. Methods and compositions for the manufacture and use of circular dna encoded therapeutics for genetic disorders and other diseases
EP3808766A1 (en) 2019-10-15 2021-04-21 Sangamo Therapeutics France Chimeric antigen receptor specific for interleukin-23 receptor
EP4045522A1 (en) 2019-10-17 2022-08-24 KWS SAAT SE & Co. KGaA Enhanced disease resistance of crops by downregulation of repressor genes
WO2021078359A1 (en) 2019-10-21 2021-04-29 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of inhibitors of cubilin for the treatment of chronic kidney diseases
EP4048295A1 (en) 2019-10-25 2022-08-31 Iovance Biotherapeutics, Inc. Gene editing of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
WO2021081468A1 (en) * 2019-10-25 2021-04-29 The Johns Hokins University A crispr-cas9 platform with an intrinsic off-switch and enhanced specificity
WO2021083959A1 (en) 2019-10-29 2021-05-06 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating uveal melanoma
IL270306A (en) 2019-10-30 2021-05-31 Yeda Res & Dev Prevention and treatment of pre-myeloid and myeloid malignancies
US20220411479A1 (en) 2019-10-30 2022-12-29 Precision Biosciences, Inc. Cd20 chimeric antigen receptors and methods of use for immunotherapy
WO2021087406A1 (en) 2019-11-01 2021-05-06 Magenta Therapeutics, Inc. Dosing regimens for the mobilization of hematopoietic stem and progentor cells
GB201916020D0 (en) 2019-11-04 2019-12-18 Univ Of Essex Enterprise Limited Crispr-mediated identification of biotinylated proteins and chromatin regions
EP4054651A1 (en) 2019-11-08 2022-09-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr and aav strategies for x-linked juvenile retinoschisis therapy
AU2020382017A1 (en) * 2019-11-13 2022-05-12 Crispr Therapeutics Ag Methods of manufacturing CAR-T cells
CA3158122A1 (en) * 2019-11-13 2021-05-20 Hui Yu Manufacturing process for making t cells expressing chimeric antigen receptors
EP4057802A1 (en) 2019-11-14 2022-09-21 Vilmorin & Cie Resistance to acidovorax valerianellae in corn salad
WO2021102059A1 (en) 2019-11-19 2021-05-27 Inscripta, Inc. Methods for increasing observed editing in bacteria
KR20220104766A (ko) 2019-11-22 2022-07-26 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 약물 전달을 위한 이온성 액체
JP2023503429A (ja) 2019-11-22 2023-01-30 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル 白血病幹細胞を根絶することによる、急性骨髄性白血病の処置のための、アドレノメデュリン阻害剤
WO2021108363A1 (en) 2019-11-25 2021-06-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr/cas-mediated upregulation of humanized ttr allele
AU2020391215A1 (en) 2019-11-27 2022-06-02 Bayer Healthcare Llc Methods of synthesizing RNA molecules
BR112022010153A2 (pt) 2019-11-27 2022-08-09 Promega Corp Peptídeos, ácido nucleico, polipeptídeo, composição, complexo bioluminescente, métodos, dipeptídeo, sistema e kit
JP2023503979A (ja) 2019-11-27 2023-02-01 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル 子宮内膜症の治療におけるニューロピリン拮抗薬の使用。
EP4069285A1 (en) 2019-12-06 2022-10-12 Precision BioSciences, Inc. Methods for cancer immunotherapy, using lymphodepletion regimens and cd19, cd20 or bcma allogeneic car t cells
US10883095B1 (en) 2019-12-10 2021-01-05 Inscripta, Inc. Mad nucleases
CA3161104A1 (en) 2019-12-11 2021-06-17 Cecile Chartier-Courtaud Processes for the production of tumor infiltrating lymphocytes (tils) and methods of using the same
US20230000063A1 (en) 2019-12-13 2023-01-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha System for detecting extracellular purinergic receptor ligand, and non-human animal having the system introduced thereinto
WO2021118927A1 (en) 2019-12-13 2021-06-17 Insideoutbio, Inc. Methods and compositions for targeted delivery of nucleic acid therapeutics
US10704033B1 (en) 2019-12-13 2020-07-07 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
IL292895A (en) 2019-12-18 2022-07-01 Inscripta Inc Cascade/dcas3 complementation assays for in vivo detection of nucleic acid-directed nuclease-edited cells
GB201918902D0 (en) 2019-12-19 2020-02-05 Genome Res Ltd Cell differentiation
IL271656A (en) 2019-12-22 2021-06-30 Yeda Res & Dev System and methods for identifying cells that have undergone genome editing
US11060141B1 (en) 2019-12-23 2021-07-13 Stilla Technologies Multiplex drop-off digital polymerase chain reaction methods
EP4086340A1 (en) 2019-12-30 2022-11-09 Edigene Biotechnology Inc. Universal car-t targeting t-cell lymphoma cell and preparation method therefor and use thereof
US20230054266A1 (en) 2019-12-30 2023-02-23 Edigene Biotechnology Inc. Method for purifying ucart cell and use thereof
WO2021138560A2 (en) 2020-01-02 2021-07-08 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Programmable and portable crispr-cas transcriptional activation in bacteria
US10689669B1 (en) 2020-01-11 2020-06-23 Inscripta, Inc. Automated multi-module cell processing methods, instruments, and systems
CN116234906A (zh) 2020-01-13 2023-06-06 萨那生物技术股份有限公司 血型抗原的修饰
WO2021144426A1 (en) 2020-01-17 2021-07-22 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating melanoma
US20230073514A1 (en) 2020-01-21 2023-03-09 Limagrain Europe Wheat haploid inducer plant and uses
AU2021211713A1 (en) 2020-01-23 2022-08-25 The Children's Medical Center Corporation Stroma-free T cell differentiation from human pluripotent stem cells
US11225674B2 (en) 2020-01-27 2022-01-18 Inscripta, Inc. Electroporation modules and instrumentation
EP4096647A1 (en) 2020-01-30 2022-12-07 Yeda Research and Development Co. Ltd Treating acute liver disease with tlr-mik inhibitors
EP4099818A1 (en) 2020-02-07 2022-12-14 Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences Methods of controlling grain size and weight
WO2021165508A1 (en) 2020-02-21 2021-08-26 Biogemma Prime editing technology for plant genome engineering
EP3872190A1 (en) 2020-02-26 2021-09-01 Antibodies-Online GmbH A method of using cut&run or cut&tag to validate crispr-cas targeting
US20230183377A1 (en) 2020-02-26 2023-06-15 Sorrento Therapeutics, Inc. Activatable antigen binding proteins with universal masking moieties
CN115485385A (zh) 2020-03-04 2022-12-16 瑞泽恩制药公司 用于使肿瘤细胞对免疫疗法敏感的方法和组合物
JP2023517326A (ja) 2020-03-11 2023-04-25 オメガ セラピューティクス， インコーポレイテッド フォークヘッドボックスｐ３（ｆｏｘｐ３）遺伝子発現をモジュレートするための組成物および方法
CN115916823A (zh) 2020-03-20 2023-04-04 法国国家健康和医学研究院 人cd45rc特异的嵌合抗原受体及其用途
WO2021191678A1 (en) 2020-03-23 2021-09-30 Avectas Limited Engineering of dendritic cells for generation of vaccines against sars-cov-2
WO2021195079A1 (en) 2020-03-23 2021-09-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized ttr locus comprising a v30m mutation and methods of use
WO2021193865A1 (ja) 2020-03-26 2021-09-30 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 温度感受性雄性不稔植物の製造方法
US20230263121A1 (en) 2020-03-31 2023-08-24 Elo Life Systems Modulation of endogenous mogroside pathway genes in watermelon and other cucurbits
WO2021202938A1 (en) 2020-04-03 2021-10-07 Creyon Bio, Inc. Oligonucleotide-based machine learning
US20230147287A1 (en) 2020-04-06 2023-05-11 LogoMix, Inc. Genome engineering method and genome engineering kit
US20230132275A1 (en) 2020-04-08 2023-04-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of cdon inhibitors for the treatment of endothelial dysfunction
JP2023522848A (ja) 2020-04-08 2023-06-01 アストラゼネカ・アクチエボラーグ 改善された部位特異的改変のための組成物及び方法
MX2022012778A (es) 2020-04-14 2023-01-16 Academisch Ziekenhuis Leiden Metodos para la induccion de eventos de duplicacion en tandem endogena.
NL2025344B1 (en) 2020-04-14 2021-10-26 Academisch Ziekenhuis Leiden Methods for induction of endogenous tandem duplication events
WO2021216622A1 (en) 2020-04-21 2021-10-28 Aspen Neuroscience, Inc. Gene editing of gba1 in stem cells and method of use of cells differentiated therefrom
WO2021216623A1 (en) 2020-04-21 2021-10-28 Aspen Neuroscience, Inc. Gene editing of lrrk2 in stem cells and method of use of cells differentiated therefrom
WO2021217082A1 (en) 2020-04-23 2021-10-28 Genedit Inc. Polymer with cationic and hydrophobic side chains
EP4139345A1 (en) 2020-04-24 2023-03-01 Sorrento Therapeutics, Inc. Memory dimeric antigen receptors
US20210332388A1 (en) 2020-04-24 2021-10-28 Inscripta, Inc. Compositions, methods, modules and instruments for automated nucleic acid-guided nuclease editing in mammalian cells
AU2021263754A1 (en) 2020-04-27 2022-12-01 Ensoma, Inc. Methods and compositions for transducing hematopoietic stem and progenitor cells in vivo
US20210340586A1 (en) 2020-04-30 2021-11-04 Sutro Biopharma, Inc. Methods of Producing Full-Length Antibodies Using E. coli
GB202006463D0 (en) 2020-05-01 2020-06-17 Innes John Centre Metabolic engineering of plants enriched in L-DOPA
TW202208617A (zh) 2020-05-04 2022-03-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 用於產生腫瘤浸潤性淋巴球的過程及其在免疫療法中的用途
EP4146797A1 (en) 2020-05-06 2023-03-15 Orchard Therapeutics (Europe) Limited Treatment for neurodegenerative diseases
WO2021224401A1 (en) 2020-05-07 2021-11-11 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for determining a reference range of β-galactose exposure platelet
DE112021002672T5 (de) 2020-05-08 2023-04-13 President And Fellows Of Harvard College Vefahren und zusammensetzungen zum gleichzeitigen editieren beider stränge einer doppelsträngigen nukleotid-zielsequenz
US20230183664A1 (en) 2020-05-11 2023-06-15 Precision Biosciences, Inc. Self-limiting viral vectors encoding nucleases
US11787841B2 (en) 2020-05-19 2023-10-17 Inscripta, Inc. Rationally-designed mutations to the thrA gene for enhanced lysine production in E. coli
GB202007943D0 (en) 2020-05-27 2020-07-08 Snipr Biome Aps Products & methods
AR122206A1 (es) 2020-05-29 2022-08-24 Kws Saat Se & Co Kgaa Inducción de haploides en plantas
WO2021245435A1 (en) 2020-06-03 2021-12-09 Vilmorin & Cie Melon plants resistant to scab disease, aphids and powdery mildew
US11946077B2 (en) * 2020-06-04 2024-04-02 Emendobio Inc. OMNI-59, 61, 67, 76, 79, 80, 81, and 82 CRISPR nucleases
JP2023527925A (ja) 2020-06-05 2023-06-30 ビルモラン エ コンパニー トマトの植物におけるＴｏＢＲＦＶに対する耐性
JP2023530234A (ja) 2020-06-05 2023-07-14 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 新生物を治療するための組成物および方法
JP2023527578A (ja) 2020-06-05 2023-06-29 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル 眼疾患を処置するための方法及び医薬組成物
WO2021252920A1 (en) 2020-06-11 2021-12-16 Novartis Ag Zbtb32 inhibitors and uses thereof
WO2021255204A1 (en) 2020-06-18 2021-12-23 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) New strategy for treating pancreatic cancer
WO2022008597A1 (en) 2020-07-08 2022-01-13 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical composition for the treatment of infectious diseases
AU2021204717A1 (en) 2020-07-15 2022-02-03 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Green Bean Plants with Improved Disease Resistance
KR20230074713A (ko) 2020-07-30 2023-05-31 엥스띠뛰 퀴리 Socs1에 결함이 있는 면역 세포
US20230323299A1 (en) 2020-08-03 2023-10-12 Inserm (Institut National De La Santé Et De La Recherch Médicale) Population of treg cells functionally committed to exert a regulatory activity and their use for adoptive therapy
WO2022035793A1 (en) 2020-08-10 2022-02-17 Precision Biosciences, Inc. Antibodies and fragments specific for b-cell maturation antigen and uses thereof
WO2022034474A1 (en) 2020-08-10 2022-02-17 Novartis Ag Treatments for retinal degenerative diseases
US20230304047A1 (en) 2020-08-11 2023-09-28 University Of Oslo Improved gene editing
AU2021328478A1 (en) 2020-08-20 2023-04-20 A2 Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for treating egfr positive cancers
CA3188862A1 (en) 2020-08-20 2022-02-24 Carl Alexander Kamb Compositions and methods for treating mesothelin positive cancers
CN116724052A (zh) 2020-08-20 2023-09-08 A2生物治疗股份有限公司 用于治疗ceacam阳性癌症的组合物和方法
WO2022046760A2 (en) 2020-08-25 2022-03-03 Kite Pharma, Inc. T cells with improved functionality
WO2022056254A2 (en) 2020-09-11 2022-03-17 LifeEDIT Therapeutics, Inc. Dna modifying enzymes and active fragments and variants thereof and methods of use
US11299731B1 (en) 2020-09-15 2022-04-12 Inscripta, Inc. CRISPR editing to embed nucleic acid landing pads into genomes of live cells
EP4214311A2 (en) 2020-09-18 2023-07-26 Artisan Development Labs, Inc. Constructs and uses thereof for efficient and specific genome editing
WO2022066973A1 (en) 2020-09-24 2022-03-31 Fred Hutchinson Cancer Research Center Immunotherapy targeting pbk or oip5 antigens
JP2023542528A (ja) 2020-09-24 2023-10-10 フレッド ハッチンソン キャンサー センター Ｓｏｘ２抗原を標的とする免疫療法
US20230348874A1 (en) 2020-10-02 2023-11-02 Limagrain Europe Crispr-mediated directed codon re-write
MA60153A1 (fr) 2020-10-02 2023-08-31 Vilmorin & Cie Melon à durée de conservation prolongée
KR20230113283A (ko) 2020-10-05 2023-07-28 프로탈릭스 리미티드 다이서-유사 넉아웃 식물 세포
JP2023544387A (ja) 2020-10-05 2023-10-23 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル 虚血後の心臓リモデリングにおけるバイオマーカー及びバイオターゲットとしてのｇｄｆ３
WO2022076606A1 (en) 2020-10-06 2022-04-14 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
WO2022076353A1 (en) 2020-10-06 2022-04-14 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for treating mage-a1-expressing disease
JP2023546359A (ja) 2020-10-06 2023-11-02 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 腫瘍浸潤リンパ球療法によるｎｓｃｌｃ患者の治療
WO2022076547A1 (en) 2020-10-07 2022-04-14 Precision Biosciences, Inc. Lipid nanoparticle compositions
WO2022079719A1 (en) 2020-10-15 2022-04-21 Yeda Research And Development Co. Ltd. Method of treating myeloid malignancies
WO2022084531A1 (en) 2020-10-23 2022-04-28 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating glioma
CR20230175A (es) 2020-10-23 2023-07-26 Elo Life Systems Inc Métodos para producir plantas de vainilla con mejor sabor y producción agronómica
CA3194664A1 (en) 2020-10-23 2022-04-28 Xi Chen Compositions and methods for t-cell receptor identification
US11332744B1 (en) 2020-10-26 2022-05-17 Arsenal Biosciences, Inc. Safe harbor loci
RU2762831C1 (ru) * 2020-10-26 2021-12-23 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии" (ФГБНУ ВНИИСБ) Молекула рнк-проводника для геномного редактирования протомоторной области гена vrn-a1 однодольных зерновых с применением системы crispr/cas9
RU2749307C1 (ru) * 2020-10-30 2021-06-08 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии" (ФГБНУ ВНИИСБ) Новая компактная нуклеаза CAS9 II типа из Anoxybacillus flavithermus
US11512297B2 (en) 2020-11-09 2022-11-29 Inscripta, Inc. Affinity tag for recombination protein recruitment
US20240033358A1 (en) 2020-11-13 2024-02-01 Novartis Ag Combination therapies with chimeric antigen receptor (car)-expressing cells
EP4244391A1 (en) 2020-11-16 2023-09-20 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for predicting and treating uveal melanoma
EP4001429A1 (en) 2020-11-16 2022-05-25 Antibodies-Online GmbH Analysis of crispr-cas binding and cleavage sites followed by high-throughput sequencing (abc-seq)
CA3200350A1 (en) 2020-11-26 2022-06-02 Yanay OFRAN Modified high molecular weight glutenin subunit and uses thereof
EP4256052A1 (en) 2020-12-02 2023-10-11 Decibel Therapeutics, Inc. Crispr sam biosensor cell lines and methods of use thereof
JP2023551722A (ja) 2020-12-03 2023-12-12 ビルモラン エ コンパニー ＴｏＢＲＦＶ、ＴＭＶ、ＴｏＭＶ、およびＴｏＭＭＶに対する耐性を有するトマト植物および対応する耐性遺伝子
CA3201767A1 (en) 2020-12-14 2022-06-23 Thomas M. Schmitt Compositions and methods for cellular immunotherapy
JP2024500403A (ja) 2020-12-17 2024-01-09 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 腫瘍浸潤リンパ球によるがんの治療
IL279559A (en) 2020-12-17 2022-07-01 Yeda Res & Dev Controlling the ubiquitination process of mlkl for disease treatment
WO2022133140A1 (en) 2020-12-17 2022-06-23 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with ctla-4 and pd-1 inhibitors
WO2022130388A2 (en) 2020-12-18 2022-06-23 Yeda Research And Development Co. Ltd. Compositions for use in the treatment of chd2 haploinsufficiency and methods of identifying same
CA3202599A1 (en) 2020-12-18 2022-06-23 Johnathan Andrew Napier Increasing the accumulation of epa and dha in recombinant camelina
IL303892A (en) 2020-12-23 2023-08-01 Flagship Pioneering Innovations V Inc In vitro assembly of RNA-encapsulating enalavirus capsids
CN116709908A (zh) 2020-12-23 2023-09-05 中国科学院遗传与发育生物学研究所 控制谷粒大小的方法
EP4269580A1 (en) 2020-12-25 2023-11-01 Logomix, Inc. Method for causing large-scale deletions in genomic dna and method for analyzing genomic dna
AU2021415461A1 (en) 2021-01-04 2023-08-17 Inscripta, Inc. Mad nucleases
US11332742B1 (en) 2021-01-07 2022-05-17 Inscripta, Inc. Mad nucleases
EP4284823A1 (en) 2021-01-28 2023-12-06 Precision BioSciences, Inc. Modulation of tgf beta signaling in genetically-modified eukaryotic cells
AR124712A1 (es) 2021-01-29 2023-04-26 Merck Sharp & Dohme Composiciones de anticuerpos del receptor de muerte programada 1 (pd-1) y métodos para obtener las composiciones de los mismos
TW202241508A (zh) 2021-01-29 2022-11-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 細胞介素相關之腫瘤浸潤性淋巴球組合物及方法
WO2022162646A1 (en) 2021-02-01 2022-08-04 Avectas Limited Delivery platform
KR20230147109A (ko) 2021-02-16 2023-10-20 에이투 바이오쎄라퓨틱스, 인크. Her2 양성 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법
US11884924B2 (en) 2021-02-16 2024-01-30 Inscripta, Inc. Dual strand nucleic acid-guided nickase editing
WO2022187278A1 (en) * 2021-03-01 2022-09-09 The Johns Hopkins University Nucleic acid detection and analysis systems
JP6944226B1 (ja) 2021-03-03 2021-10-06 株式会社Ｌｏｇｏｍｉｘ ゲノムｄｎａを改変する方法および改変を検出する方法
JP2024509194A (ja) 2021-03-05 2024-02-29 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー インビボｄｎａアセンブリー及び解析
WO2022197776A1 (en) 2021-03-16 2022-09-22 Magenta Therapeutics, Inc. Dosing regimens for hematopoietic stem cell mobilization for stem cell transplants in multiple myeloma patients
EP4308118A1 (en) 2021-03-17 2024-01-24 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Methods and compositions for treating melanoma
EP4308691A1 (en) 2021-03-19 2024-01-24 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods for tumor infiltrating lymphocyte (til) expansion related to cd39/cd69 selection and gene knockout in tils
CN117295817A (zh) 2021-03-22 2023-12-26 生命编辑制药股份有限公司 Dna修饰酶及其活性片段和变体以及使用方法
AU2022249318A1 (en) 2021-03-31 2023-10-12 Entrada Therapeutics, Inc. Cyclic cell penetrating peptides
WO2022208489A1 (en) 2021-04-02 2022-10-06 Vilmorin & Cie Semi-determinate or determinate growth habit trait in cucurbita
EP4320234A2 (en) 2021-04-07 2024-02-14 Astrazeneca AB Compositions and methods for site-specific modification
EP4320153A1 (en) 2021-04-09 2024-02-14 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for the treatment of anaplastic large cell lymphoma
JP2024514649A (ja) 2021-04-16 2024-04-02 ビーム セラピューティクス インク． 肝細胞の遺伝子修飾
JP2024515189A (ja) 2021-04-19 2024-04-05 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 細胞免疫療法におけるキメラ共刺激受容体、ケモカイン受容体、及びそれらの使用
WO2022225978A1 (en) 2021-04-21 2022-10-27 The Regents Of The University Of California Use of a split dcas fusion protein system for epigenetic editing
WO2022226316A1 (en) 2021-04-22 2022-10-27 Precision Biosciences, Inc. Compositions and methods for generating male sterile plants
WO2022223791A1 (en) 2021-04-23 2022-10-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating cell senescence accumulation related disease
WO2022235929A1 (en) 2021-05-05 2022-11-10 Radius Pharmaceuticals, Inc. Animal model having homologous recombination of mouse pth1 receptor
US20220356264A1 (en) * 2021-05-06 2022-11-10 New York University Inhibition of atf7ip and setdb1 for cancer treatment
EP4337263A1 (en) 2021-05-10 2024-03-20 Entrada Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating interferon regulatory factor-5 (irf-5) activity
KR20240017813A (ko) 2021-05-10 2024-02-08 이슘 리서치 디벨롭먼트 컴퍼니 오브 더 히브루 유니버시티 오브 예루살렘 엘티디. 신경질환 치료용 약학적 조성물
AU2022271873A1 (en) 2021-05-10 2024-01-04 Entrada Therapeutics, Inc. Compositions and methods for intracellular therapeutics
EP4337261A2 (en) 2021-05-10 2024-03-20 Entrada Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating mrna splicing
WO2022240824A1 (en) 2021-05-13 2022-11-17 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Compositions and methods for treating sickle cell diseases
WO2022245754A1 (en) 2021-05-17 2022-11-24 Iovance Biotherapeutics, Inc. Pd-1 gene-edited tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
WO2022256448A2 (en) 2021-06-01 2022-12-08 Artisan Development Labs, Inc. Compositions and methods for targeting, editing, or modifying genes
CA3222341A1 (en) 2021-06-11 2022-12-15 Kunwoo Lee Biodegradable polymer comprising side chains with polyamine and polyalkylene oxide groups
WO2022264132A1 (en) 2021-06-13 2022-12-22 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Method for reprogramming human cells
WO2022266287A1 (en) * 2021-06-16 2022-12-22 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods to transfect, test, and treat skin cells
CA3223311A1 (en) 2021-06-18 2022-12-22 Andrea BARGHETTI Compositions and methods for targeting, editing or modifying human genes
WO2022271818A1 (en) 2021-06-23 2022-12-29 Entrada Therapeutics, Inc. Antisense compounds and methods for targeting cug repeats
FR3124522A1 (fr) 2021-06-25 2022-12-30 François CHERBONNEAU Composition et méthode permettant l’édition génomique
WO2023283359A2 (en) 2021-07-07 2023-01-12 Omega Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating secreted frizzled receptor protein 1 (sfrp1) gene expression
TW202317602A (zh) 2021-07-15 2023-05-01 福瑞德哈金森腫瘤中心 嵌合多肽
WO2023287707A1 (en) 2021-07-15 2023-01-19 Just-Evotec Biologics, Inc. Bidirectional tangential flow filtration (tff) perfusion system
CA3226111A1 (en) 2021-07-22 2023-01-26 Iovance Biotherapeutics, Inc. Method for cryopreservation of solid tumor fragments
WO2023009716A1 (en) 2021-07-28 2023-02-02 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with kras inhibitors
WO2023006933A1 (en) 2021-07-30 2023-02-02 KWS SAAT SE & Co. KGaA Plants with improved digestibility and marker haplotypes
WO2023010133A2 (en) 2021-07-30 2023-02-02 Tune Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating expression of frataxin (fxn)
CA3227105A1 (en) 2021-07-30 2023-02-02 Tune Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating expression of methyl-cpg binding protein 2 (mecp2)
CA3226947A1 (en) 2021-08-03 2023-02-09 Muhammad YASSIN Engineered tcr complex and methods of using same
EP4130028A1 (en) 2021-08-03 2023-02-08 Rhazes Therapeutics Ltd Engineered tcr complex and methods of using same
AU2022324708A1 (en) 2021-08-06 2024-02-15 Kws Vegetables B.V. Durable downy mildew resistance in spinach
IL310564A (en) 2021-08-06 2024-03-01 Vilmorin & Cie Resistance to Leveillula Taurica in pepper plant
WO2023031885A1 (en) 2021-09-02 2023-03-09 SESVanderHave NV Methods and compositions for ppo herbicide tolerance
JP7125727B1 (ja) 2021-09-07 2022-08-25 国立大学法人千葉大学 核酸配列改変用組成物および核酸配列の標的部位を改変する方法
CA3230927A1 (en) 2021-09-10 2023-03-16 Agilent Technologies, Inc. Guide rnas with chemical modification for prime editing
GB202113075D0 (en) 2021-09-14 2021-10-27 Innes John Centre Methods of improving vitamin d levels in plants
GB202113933D0 (en) 2021-09-29 2021-11-10 Genome Res Ltd Methods for gene editing
WO2023052508A2 (en) 2021-09-30 2023-04-06 Astrazeneca Ab Use of inhibitors to increase efficiency of crispr/cas insertions
WO2023060186A1 (en) 2021-10-07 2023-04-13 Hepatx Corporation Methods of tracking donor cells in a recipient
CA3233824A1 (en) 2021-10-08 2023-04-13 Samir Mitragotri Ionic liquids for drug delivery
CA3234612A1 (en) 2021-10-14 2023-04-20 Weedout Ltd. Methods of weed control
WO2023064872A1 (en) 2021-10-14 2023-04-20 Precision Biosciences, Inc. Combinations of anti-bcma car t cells and gamma secretase inhibitors
WO2023070003A1 (en) 2021-10-19 2023-04-27 Precision Biosciences, Inc. Gene editing methods for treating alpha-1 antitrypsin (aat) deficiency
AR127482A1 (es) 2021-10-27 2024-01-31 Iovance Biotherapeutics Inc Sistemas y métodos para coordinar la fabricación de células para inmunoterapia específica de paciente
WO2023077053A2 (en) 2021-10-28 2023-05-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for knocking out c5
WO2023077148A1 (en) 2021-11-01 2023-05-04 Tome Biosciences, Inc. Single construct platform for simultaneous delivery of gene editing machinery and nucleic acid cargo
WO2023078900A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating triple negative breast cancer (tnbc)
WO2023081756A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Precise genome editing using retrons
WO2023086803A1 (en) 2021-11-10 2023-05-19 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of expansion treatment utilizing cd8 tumor infiltrating lymphocytes
WO2023086847A1 (en) 2021-11-10 2023-05-19 Encodia, Inc. Methods for barcoding macromolecules in individual cells
WO2023091910A1 (en) 2021-11-16 2023-05-25 Precision Biosciences, Inc. Methods for cancer immunotherapy
WO2023093862A1 (en) 2021-11-26 2023-06-01 Epigenic Therapeutics Inc. Method of modulating pcsk9 and uses thereof
WO2023108047A1 (en) 2021-12-08 2023-06-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mutant myocilin disease model and uses thereof
US20230193310A1 (en) 2021-12-10 2023-06-22 Seminis Vegetabe Seeds, Inc. Lettuce plants having resistance to downy mildew
GB202118058D0 (en) 2021-12-14 2022-01-26 Univ Warwick Methods to increase yields in crops
US20230279442A1 (en) 2021-12-15 2023-09-07 Versitech Limited Engineered cas9-nucleases and method of use thereof
WO2023111173A1 (en) 2021-12-16 2023-06-22 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) An ezh2 degrader or inhibitor for use in the treatment of resistant acute myeloid leukemia
BE1030047B1 (nl) 2021-12-17 2023-07-17 Anheuser Busch Inbev Sa Werkwijzen voor het voorkomen van remming van de smaakproductie in gist
TW202342498A (zh) 2021-12-17 2023-11-01 美商薩那生物科技公司 經修飾副黏液病毒科融合醣蛋白
WO2023115041A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Sana Biotechnology, Inc. Modified paramyxoviridae attachment glycoproteins
WO2023122805A1 (en) 2021-12-20 2023-06-29 Vestaron Corporation Sorbitol driven selection pressure method
WO2023118165A1 (en) 2021-12-21 2023-06-29 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating melanoma
WO2023122764A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Tome Biosciences, Inc. Co-delivery of a gene editor construct and a donor template
WO2023122800A1 (en) 2021-12-23 2023-06-29 University Of Massachusetts Therapeutic treatment for fragile x-associated disorder
WO2023126458A1 (en) 2021-12-28 2023-07-06 Mnemo Therapeutics Immune cells with inactivated suv39h1 and modified tcr
WO2023133595A2 (en) 2022-01-10 2023-07-13 Sana Biotechnology, Inc. Methods of ex vivo dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
WO2023137471A1 (en) 2022-01-14 2023-07-20 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for programming t cell phenotypes through targeted gene activation
WO2023137472A2 (en) 2022-01-14 2023-07-20 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for programming t cell phenotypes through targeted gene repression
WO2023141602A2 (en) 2022-01-21 2023-07-27 Renagade Therapeutics Management Inc. Engineered retrons and methods of use
WO2023144235A1 (en) 2022-01-27 2023-08-03 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for monitoring and treating warburg effect in patients with pi3k-related disorders
WO2023147488A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 Iovance Biotherapeutics, Inc. Cytokine associated tumor infiltrating lymphocytes compositions and methods
WO2023150518A1 (en) 2022-02-01 2023-08-10 Sana Biotechnology, Inc. Cd3-targeted lentiviral vectors and uses thereof
WO2023150620A1 (en) 2022-02-02 2023-08-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr-mediated transgene insertion in neonatal cells
WO2023150647A1 (en) 2022-02-02 2023-08-10 Sana Biotechnology, Inc. Methods of repeat dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses
WO2023152164A1 (en) 2022-02-08 2023-08-17 University Of Glasgow Modified ion channels
WO2023156906A1 (en) 2022-02-15 2023-08-24 Futuragene Israel Ltd A bacillus thuringiensis pesticidal protein (bt pp) combination useful for plant protection
WO2023158732A1 (en) 2022-02-16 2023-08-24 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for decreasing pathologic alpha-synuclein using agents that modulate fndc5 or biologically active fragments thereof
WO2023156587A1 (en) 2022-02-18 2023-08-24 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of tcr-deficient car-tregs in combination with anti-tcr complex monoclonal antibodies for inducing durable tolerance
WO2023167882A1 (en) 2022-03-01 2023-09-07 Artisan Development Labs, Inc. Composition and methods for transgene insertion
EP4256950A1 (en) 2022-04-06 2023-10-11 Vilmorin et Cie Tolerance to cgmmv in cucumber
WO2023196877A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
WO2023201369A1 (en) 2022-04-15 2023-10-19 Iovance Biotherapeutics, Inc. Til expansion processes using specific cytokine combinations and/or akti treatment
WO2023205744A1 (en) 2022-04-20 2023-10-26 Tome Biosciences, Inc. Programmable gene insertion compositions
WO2023212677A2 (en) 2022-04-29 2023-11-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Identification of tissue-specific extragenic safe harbors for gene therapy approaches
WO2023215725A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
WO2023215831A1 (en) 2022-05-04 2023-11-09 Tome Biosciences, Inc. Guide rna compositions for programmable gene insertion
WO2023215498A2 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Modernatx, Inc. Compositions and methods for cd28 antagonism
WO2023219933A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Entrada Therapeutics, Inc. Compositions and methods for delivery of nucleic acid therapeutics
WO2023220035A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Synteny Therapeutics, Inc. Erythroparvovirus compositions and methods for gene therapy
WO2023220603A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vectors and methods for in vivo antibody production
WO2023220040A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Synteny Therapeutics, Inc. Erythroparvovirus with a modified capsid for gene therapy
WO2023220043A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Synteny Therapeutics, Inc. Erythroparvovirus with a modified genome for gene therapy
WO2023220608A1 (en) 2022-05-10 2023-11-16 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with an il-15r agonist
WO2023225670A2 (en) 2022-05-20 2023-11-23 Tome Biosciences, Inc. Ex vivo programmable gene insertion
EP4279085A1 (en) 2022-05-20 2023-11-22 Mnemo Therapeutics Compositions and methods for treating a refractory or relapsed cancer or a chronic infectious disease
WO2023225410A2 (en) 2022-05-20 2023-11-23 Artisan Development Labs, Inc. Systems and methods for assessing risk of genome editing events
WO2023230549A2 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Compositions and methods for modulation of tumor suppressors and oncogenes
WO2023230578A2 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Compositions and methods for modulating circulating factors
WO2023230570A2 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Compositions and methods for modulating genetic drivers
WO2023230573A2 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Compositions and methods for modulation of immune responses
WO2023230566A2 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Compositions and methods for modulating cytokines
WO2023235726A2 (en) 2022-05-31 2023-12-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr interference therapeutics for c9orf72 repeat expansion disease
WO2023235725A2 (en) 2022-05-31 2023-12-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr-based therapeutics for c9orf72 repeat expansion disease
WO2023240282A1 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Umoja Biopharma, Inc. Engineered stem cells and uses thereof
US20230404003A1 (en) 2022-06-21 2023-12-21 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Novel qtls conferring resistance to cucumber mosaic virus
WO2023250511A2 (en) 2022-06-24 2023-12-28 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for reducing low-density lipoprotein through targeted gene repression
EP4299733A1 (en) 2022-06-30 2024-01-03 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
WO2024005863A1 (en) 2022-06-30 2024-01-04 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
GB2621813A (en) 2022-06-30 2024-02-28 Univ Newcastle Preventing disease recurrence in Mitochondrial replacement therapy
WO2024005864A1 (en) 2022-06-30 2024-01-04 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
EP4299739A1 (en) 2022-06-30 2024-01-03 Inari Agriculture Technology, Inc. Compositions, systems, and methods for genome editing
WO2024008752A1 (en) 2022-07-05 2024-01-11 John Innes Centre Methods to increase iron content in plants
WO2024008799A1 (en) 2022-07-06 2024-01-11 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for the treatment of proliferative glomerulonephritis
WO2024015881A2 (en) 2022-07-12 2024-01-18 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for targeted transcriptional activation
WO2024020346A2 (en) 2022-07-18 2024-01-25 Renagade Therapeutics Management Inc. Gene editing components, systems, and methods of use
WO2024020587A2 (en) 2022-07-22 2024-01-25 Tome Biosciences, Inc. Pleiopluripotent stem cell programmable gene insertion
WO2024026474A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for transferrin receptor (tfr)-mediated delivery to the brain and muscle
WO2024026406A2 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Vestaron Corporation Next Generation ACTX Peptides
LU502613B1 (en) 2022-08-01 2024-02-01 Plant Bioscience Ltd Methods of altering the starch granule profile in plants
WO2024028433A1 (en) 2022-08-04 2024-02-08 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for the treatment of lymphoproliferative disorders
US20240067969A1 (en) 2022-08-19 2024-02-29 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for regulation of hepatitis b virus through targeted gene repression
WO2024040222A1 (en) 2022-08-19 2024-02-22 Generation Bio Co. Cleavable closed-ended dna (cedna) and methods of use thereof
WO2024044655A1 (en) 2022-08-24 2024-02-29 Sana Biotechnology, Inc. Delivery of heterologous proteins
WO2024042489A1 (en) 2022-08-25 2024-02-29 LifeEDIT Therapeutics, Inc. Chemical modification of guide rnas with locked nucleic acid for rna guided nuclease-mediated gene editing
WO2024044723A1 (en) 2022-08-25 2024-02-29 Renagade Therapeutics Management Inc. Engineered retrons and methods of use
WO2024042199A1 (en) 2022-08-26 2024-02-29 KWS SAAT SE & Co. KGaA Use of paired genes in hybrid breeding
WO2024047110A1 (en) 2022-08-31 2024-03-07 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Method to generate more efficient car-t cells
WO2024050544A2 (en) 2022-09-01 2024-03-07 J.R. Simplot Company Enhanced targeted knock-in frequency in host genomes through crispr exonuclease processing
WO2024047605A1 (en) 2022-09-01 2024-03-07 SESVanderHave NV Methods and compositions for ppo herbicide tolerance
WO2024052318A1 (en) 2022-09-06 2024-03-14 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Novel dual split car-t cells for the treatment of cd38-positive hematological malignancies
WO2024056659A1 (en) 2022-09-13 2024-03-21 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Method for treating prostate cancer and other epithelial cancers
WO2024059618A2 (en) 2022-09-13 2024-03-21 Arsenal Biosciences, Inc. Immune cells having co-expressed tgfbr shrnas
WO2024056902A2 (en) 2022-09-16 2024-03-21 Christopher Shaw Compositions and methods for treating neurological diseases
WO2024059824A2 (en) 2022-09-16 2024-03-21 Arsenal Biosciences, Inc. Immune cells with combination gene perturbations
WO2024064642A2 (en) 2022-09-19 2024-03-28 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for modulating t cell function
WO2024064838A1 (en) 2022-09-21 2024-03-28 Sana Biotechnology, Inc. Lipid particles comprising variant paramyxovirus attachment glycoproteins and uses thereof
WO2024062138A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Mnemo Therapeutics Immune cells comprising a modified suv39h1 gene
WO2024073606A1 (en) 2022-09-28 2024-04-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Antibody resistant modified receptors to enhance cell-based therapies
GB202214410D0 (en) 2022-09-30 2022-11-16 Ivy Farm Tech Limited genetically modified cells

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100076057A1 (en) * 2008-09-23 2010-03-25 Northwestern University TARGET DNA INTERFERENCE WITH crRNA
WO2014089290A1 (en) * 2012-12-06 2014-06-12 Sigma-Aldrich Co. Llc Crispr-based genome modification and regulation
CN104854241A (zh) * 2012-05-25 2015-08-19 埃玛纽埃尔·沙尔庞捷 用于rna定向的靶dna修饰和用于rna定向的转录调节的方法和组合物

Family Cites Families (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4217344A (en) 1976-06-23 1980-08-12 L'oreal Compositions containing aqueous dispersions of lipid spheres
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4186183A (en) 1978-03-29 1980-01-29 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Liposome carriers in chemotherapy of leishmaniasis
US4261975A (en) 1979-09-19 1981-04-14 Merck & Co., Inc. Viral liposome particle
US4485054A (en) 1982-10-04 1984-11-27 Lipoderm Pharmaceuticals Limited Method of encapsulating biologically active materials in multilamellar lipid vesicles (MLV)
US4501728A (en) 1983-01-06 1985-02-26 Technology Unlimited, Inc. Masking of liposomes from RES recognition
US4946787A (en) 1985-01-07 1990-08-07 Syntex (U.S.A.) Inc. N-(ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US5049386A (en) 1985-01-07 1991-09-17 Syntex (U.S.A.) Inc. N-ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)Alk-1-YL-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4797368A (en) 1985-03-15 1989-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector
US4774085A (en) 1985-07-09 1988-09-27 501 Board of Regents, Univ. of Texas Pharmaceutical administration systems containing a mixture of immunomodulators
DE3751873T2 (de) 1986-04-09 1997-02-13 Genzyme Corp Genetisch transformierte Tiere, die ein gewünschtes Protein in Milch absondern
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US4873316A (en) 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
AU7979491A (en) 1990-05-03 1991-11-27 Vical, Inc. Intracellular delivery of biologically active substances by means of self-assembling lipid complexes
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
US5587308A (en) 1992-06-02 1996-12-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter
US6534261B1 (en) 1999-01-12 2003-03-18 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US7868149B2 (en) 1999-07-20 2011-01-11 Monsanto Technology Llc Plant genome sequence and uses thereof
US6479808B1 (en) 1999-07-07 2002-11-12 The United States Of America As Represented By The Administrator Of The National Aeronautics And Space Administration Method and systems for collecting data from multiple fields of view
US6603061B1 (en) 1999-07-29 2003-08-05 Monsanto Company Agrobacterium-mediated plant transformation method
US7033744B2 (en) * 2001-03-16 2006-04-25 Naoya Kobayashi Method for proliferating a liver cell, a liver cell obtained thereby, and use thereof
US20090100536A1 (en) 2001-12-04 2009-04-16 Monsanto Company Transgenic plants with enhanced agronomic traits
US20050220796A1 (en) 2004-03-31 2005-10-06 Dynan William S Compositions and methods for modulating DNA repair
CA2615532C (en) * 2005-07-26 2016-06-28 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted integration and expression of exogenous nucleic acid sequences
NZ592231A (en) * 2007-03-02 2012-07-27 Danisco Methods to generate bacteriophage resistant bacterial strains and produce bacteriophage CRISPR loci phage mutants
US8546553B2 (en) 2008-07-25 2013-10-01 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Prokaryotic RNAi-like system and methods of use
US9404098B2 (en) 2008-11-06 2016-08-02 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Method for cleaving a target RNA using a Cas6 polypeptide
EP2352369B1 (en) * 2008-12-04 2017-04-26 Sangamo BioSciences, Inc. Genome editing in rats using zinc-finger nucleases
US8889394B2 (en) 2009-09-07 2014-11-18 Empire Technology Development Llc Multiple domain proteins
US10087431B2 (en) 2010-03-10 2018-10-02 The Regents Of The University Of California Methods of generating nucleic acid fragments
KR101867359B1 (ko) 2010-05-10 2018-07-23 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 엔도리보뉴클레아제 조성물들 및 이들의 사용 방법들
WO2011146121A1 (en) 2010-05-17 2011-11-24 Sangamo Biosciences, Inc. Novel dna-binding proteins and uses thereof
US9405700B2 (en) 2010-11-04 2016-08-02 Sonics, Inc. Methods and apparatus for virtualization in an integrated circuit
JP5607827B2 (ja) 2011-05-30 2014-10-15 トヨタ自動車株式会社 高強度ポリプロピレン繊維及びその製造方法
US20140113376A1 (en) 2011-06-01 2014-04-24 Rotem Sorek Compositions and methods for downregulating prokaryotic genes
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
US9637739B2 (en) * 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
WO2013141680A1 (en) 2012-03-20 2013-09-26 Vilnius University RNA-DIRECTED DNA CLEAVAGE BY THE Cas9-crRNA COMPLEX
JP6517143B2 (ja) 2012-10-23 2019-05-22 ツールゲン インコーポレイテッド 標的ｄｎａに特異的なガイドｒｎａおよびｃａｓタンパク質コード核酸またはｃａｓタンパク質を含む、標的ｄｎａを切断するための組成物、ならびにその使用
WO2014093479A1 (en) 2012-12-11 2014-06-19 Montana State University Crispr (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) rna-guided control of gene regulation
PT2896697E (pt) 2012-12-12 2015-12-31 Massachusetts Inst Technology Engenharia de sistemas, métodos e composições guia otimizadas para a manipulação de sequências
PT2898075E (pt) 2012-12-12 2016-06-16 Harvard College Manipulação e otimização de sistemas, métodos e composições de enzima melhorados para manipulação de sequências
WO2014093718A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Methods, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
WO2014093701A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof
EP3434776A1 (en) 2012-12-12 2019-01-30 The Broad Institute, Inc. Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
EP4286402A3 (en) 2012-12-12 2024-02-14 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation
DK2931898T3 (en) 2012-12-12 2016-06-20 Massachusetts Inst Technology CONSTRUCTION AND OPTIMIZATION OF SYSTEMS, PROCEDURES AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION WITH FUNCTIONAL DOMAINS
WO2014093694A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation in eukaryotes
IL239317B (en) 2012-12-12 2022-07-01 Broad Inst Inc Providing, engineering and optimizing systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
SG11201504621RA (en) 2012-12-17 2015-07-30 Harvard College Rna-guided human genome engineering
JP6244391B2 (ja) * 2016-03-17 2017-12-06 本田技研工業株式会社 車両

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100076057A1 (en) * 2008-09-23 2010-03-25 Northwestern University TARGET DNA INTERFERENCE WITH crRNA
CN104854241A (zh) * 2012-05-25 2015-08-19 埃玛纽埃尔·沙尔庞捷 用于rna定向的靶dna修饰和用于rna定向的转录调节的方法和组合物
WO2014089290A1 (en) * 2012-12-06 2014-06-12 Sigma-Aldrich Co. Llc Crispr-based genome modification and regulation

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JINEK M等: "A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity", 《SCIENCE》 *
VENKEN KJ等: "P[acman]: a BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in D. melanogaster", 《SCIENCE》 *

Also Published As

Publication number Publication date
ES2552535T3 (es) 2015-11-30
RU2687451C1 (ru) 2019-05-13
AU2019201608B2 (en) 2021-12-09
US8945839B2 (en) 2015-02-03
JP7463436B2 (ja) 2024-04-08
JP2021104055A (ja) 2021-07-26
US20140170753A1 (en) 2014-06-19
US8771945B1 (en) 2014-07-08
WO2014093661A3 (en) 2014-08-07
WO2014093661A9 (en) 2014-10-16
US20150203872A1 (en) 2015-07-23
US20160281072A1 (en) 2016-09-29
AU2019201608A1 (en) 2019-04-04
HK1216259A1 (zh) 2016-10-28
US20140227787A1 (en) 2014-08-14
JP2016500262A (ja) 2016-01-12
PL2764103T3 (pl) 2016-05-31
JP7090775B2 (ja) 2022-06-24
CA2894688A1 (en) 2014-06-19
KR20150107739A (ko) 2015-09-23
AU2016244244B2 (en) 2018-12-13
JP6545621B2 (ja) 2019-07-17
AU2016244244A1 (en) 2016-11-03
JP2022113799A (ja) 2022-08-04
BR112015013785A2 (pt) 2017-07-11
EP2764103A2 (en) 2014-08-13
AU2013359238A1 (en) 2015-07-30
JP6870015B2 (ja) 2021-05-12
RU2019112514A (ru) 2019-06-13
PT2764103E (pt) 2015-11-18
CN106480080A (zh) 2017-03-08
US8697359B1 (en) 2014-04-15
WO2014093661A2 (en) 2014-06-19
HK1201290A1 (zh) 2015-08-28
AU2013359238B2 (en) 2016-07-14
CN106480080B (zh) 2020-02-28
AU2022201052A1 (en) 2022-03-10
JP2019115348A (ja) 2019-07-18
US20170175142A1 (en) 2017-06-22
EP2998400A1 (en) 2016-03-23
JP6723094B2 (ja) 2020-07-15
CN106170549B (zh) 2020-02-21
EP2764103B1 (en) 2015-08-19
DK2764103T3 (en) 2015-11-16
US20190153476A1 (en) 2019-05-23
CN111187772A (zh) 2020-05-22
JP2016171817A (ja) 2016-09-29
US20150184139A1 (en) 2015-07-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7463436B2 (ja) 遺伝子産物の発現を変更するためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系および方法
JP6896786B2 (ja) 配列操作のためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ成分系、方法および組成物
JP7198328B2 (ja) 配列操作のための系、方法および最適化ガイド組成物のエンジニアリング
DK2921557T3 (en) Design of systems, methods and optimized sequence manipulation guide compositions
RU2701662C2 (ru) Компоненты системы crispr-cas, способы и композиции для манипуляции с последовательностями
CN105209621A (zh) 对用于序列操纵的改进的系统、方法和酶组合物进行的工程化和优化
CN106062197A (zh) 用于序列操纵的串联指导系统、方法和组合物的递送、工程化和优化
CN106852157A (zh) 用于使用h1启动子表达crispr向导rna的组合物和方法
CN109790551A (zh) 改进的基因编辑

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant