CN106852157A - 用于使用h1启动子表达crispr向导rna的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本公开主题提供用于使用H1启动子表达CRISPR向导RNA的组合物和方法。具体而言，提供了组合物和方法，其用于使用H1启动子来表达具有5'核苷酸的改变特异性的CRISPR向导RNA(gRNA)，以及使用H1启动子序列作为双向启动子来同时表达Cas9核酸酶和gRNA。还提供了组合物和方法，其通过使用RNA核酶和可调节的适体酶在体内表达和调节gRNA表达。

Description

用于使用H1启动子表达CRISPR向导RNA的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年6月16日提交的美国临时申请号62/012,802(其以其整体通过引用并入本文)的权益。
电子提交的材料的通过引用并入
本申请含有序列表。其已经经由EFS-Web作为题为“111232-00401_ST25.txt”的ASCII文本文件电子提交。序列表的大小为14,827字节，并且在2015年6月2日创建。其在此以其整体通过引用并入本文。
背景
成簇规律间隔短回文重复(Clustered Regularly Interspaced Short PalindromicRepeats, CRISPR)与cas(CRISPR相关的)基因一起构成适应性免疫系统，其提供针对细菌和古菌中的侵入性外源核酸的获得性抗性(Barrangou等人(2007) Science 315:1709-12)。CRISPR由通过称为间隔区的类似大小的独特可变DNA序列间隔的短保守重复序列阵列组成，所述独特可变DNA序列通常来源于噬菌体或质粒DNA(Barrangou等人(2007) Science315:1709-12; Bolotin等人(2005) Microbiology 151 :2551-61; Mojica等人(2005) J. Mol.Evol.60:174-82)。CRISPR-Cas系统通过获取插入CRISPR区域中的外源DNA的短片段(间隔区)发挥功能，并且提供针对随后暴露于携带匹配序列的噬菌体和质粒的免疫性(Barrangou等人(2007) Science 315:1709-12; Brouns等人(2008) Science 321:960-64)。正是这种CRISPR-Cas干扰/免疫性使得实现外源核酸的crRNA介导的沉默(Horvath &Barrangou (2010) Science 327:167-70; Deveau等人(2010) Annu.Rev. Microbiol.64:475-93; Marraffini & Sontheimer (2010) Nat. Rev. Genet.11:181-90; Bhaya等人(2011) Annu.Rev. Genet.45:273-97; Wiedenheft等人(2012) Nature 482:331-338)。
使用与合成向导RNA(gRNA)偶联的依赖于Cas9蛋白(Makarova等人(2011) Nat. Rev. Microbiol.9:467-77)的核酸酶活性的CRISPR构建体最近已经彻底改革了基因组工程改造，其允许对DNA序列进行前所未有的操作。CRISPR/Cas9构建体对于合成是简单且快速的，并且可以多重化。然而，尽管它们的合成相对容易，但CRISPR具有与它们接近可靶向基因组空间相关的技术限制，这与Cas9本身的特性和其gRNA的合成相关。
通过CRISPR系统的切割需要gRNA与20-核苷酸DNA序列的互补碱基配对以及必需的前间区序列邻近基序(PAM)（在靶位点的3'处发现的短核苷酸基序）(Jinek等人(2012)Science 337:816-821)。在理论上，技术人员可以使用CRISPR技术靶向基因组中的任何独特的N20-PAM序列。PAM序列的DNA结合特异性（其根据采用的特定Cas9的来源物种而变化）提供了一种约束。目前，最少限制性和最常用的Cas9蛋白来自化脓性链球菌(S. pyogenes)，其识别序列NGG，因此，可以靶向基因组中的任何独特的21个核苷酸序列和随后的两个鸟苷核苷酸(N20NGG)。由蛋白组分施加的可用的靶向空间的扩展受限于具有改变的PAM需求的新型Cas9蛋白的发现和使用(Cong等人(2013) Science 339:819-823; Hou等人(2013)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.110(39):15644-9)，或未实现的经由诱变或定向进化产生新型Cas9变体。
CRISPR系统的第二个技术约束起因于在5'鸟苷核苷酸起始的gRNA表达。III型类别的RNA聚合酶III启动子的使用特别适用于gRNA表达，因为这些短的非编码转录物具有明确限定的末端，并且在上游启动子区域中含有排除1+核苷酸的所有必需的转录元件。然而，由于常用的U6启动子需要鸟苷核苷酸来启动转录，所以U6启动子的使用已将基因组靶向位点进一步限制于GN19NGG (Mali等人 (2013) Science 339:823-826; Ding等人 (2013)Cell Stem Cell 12:393-394)。替代方法，诸如通过T7、T3或SP6启动子的体外转录，也将需要起始鸟苷核苷酸(Adhya等人 (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:147-151;Melton等人 (1984) Nucleic Acids Res. 12:7035-7056; Pleiss等人 (1998) RNA 4:1313-1317)。
概述
除非另有说明，本发明的实践通常采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组核酸(例如DNA)技术、免疫学和RNA干扰(RNAi)的常规技术，其在本领域的技术内。这些技术中的某些的非限制性描述在以下出版物中找到：Ausubel, F.,等人,(编), Current Protocols in Molecular Biology、Current Protocols in Immunology、 Current Protocols in Protein Science和Current Protocols in Cell Biology, 均为John Wiley & Sons, N.Y., 至2008年12月的版本为止; Sambrook, Russell,和Sambrook, Molecular Cloning.A Laboratory Manual, 第3版, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, 2001; Harlow, E.和Lane, D.,Antibodies—A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, 1988; Freshney, R. I., “Culture of Animal Cells, A Manual ofBasic Technique”, 第5版, John Wiley & Sons, Hoboken, N.J., 2005。关于治疗剂和人类疾病的非限制性信息见于Goodman和Gilman的The Pharmacological Basis ofTherapeutics,第11版, McGraw Hill, 2005, Katzung, B. (编) Basic and ClinicalPharmacology, McGraw-Hill/Appleton & Lange 第10版 (2006)或第11版(2009年7月)。关于基因和遗传病症的非限制性信息见于McKusick, V. A.:Mendelian Inheritance inMan.A Catalog of Human Genes and Genetic Disorders.Baltimore:Johns HopkinsUniversity Press, 1998 (第12版)或更近的在线数据库：在线人类孟德尔遗传(OnlineMendelian Inheritance in Man, OMIM™).McKusick-Nathans Institute of GeneticMedicine, Johns Hopkins University (Baltimore, Md.)和National Center forBiotechnology Information, National Library of Medicine (Bethesda, Md.), 至2010年5月1日为止，可得自万维网:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/和在线动物孟德尔遗传(Online Mendelian Inheritance in Animals, OMIA), 基因数据库，动物物种(除人类和小鼠以外)的遗传疾病和性状，可得自万维网:http://omia.angis.org.au/contact.shtml。本文提及的所有专利、专利申请和其他出版物(例如，科学文章、书籍、网站和数据库)以其整体通过引用并入。在本说明书和任何并入的参考文献之间冲突的情况下，应当以说明书(包括其可以基于并入的参考文献的任何修改)为准。除非另有说明，本文使用术语的标准技术接受的含义。本文使用各种术语的标准缩写。
本公开主题提供用于使用H1启动子表达CRISPR向导RNA的组合物和方法。本公开主题提供包含一种或多种载体的非天然存在的CRISPR-Cas系统，所述载体包含：a)H1启动子，其可操作连接至编码CRISPR-Cas系统向导RNA(gRNA)的至少一个核苷酸序列，其中所述gRNA与细胞中的DNA分子的靶序列杂交，且其中所述DNA分子编码在所述细胞中表达的一种或多种基因产物；和b)在细胞中可操作的调节元件，其可操作连接至编码Cas9蛋白的核苷酸序列，其中组件(a)和(b)位于所述系统的相同或不同的载体上，其中所述gRNA靶向所述靶序列且与所述靶序列杂交，且所述Cas9蛋白切割DNA分子以改变一种或多种基因产物的表达。在一些方面，所述靶序列包含核苷酸序列AN19NGG、GN19NGG、CN19NGG或TN19NGG。在一些方面，所述细胞是真核细胞。在一些方面，所述真核细胞是哺乳动物或人细胞。在一些方面，所述真核细胞是视网膜感光细胞。在一些方面，将所述Cas9蛋白针对细胞中的表达进行密码子优化。在一些方面，所述Cas9蛋白是II型Cas9蛋白。在一些方面，一种或多种基因产物的表达减少。在一些方面，所述一种或多种基因产物是视紫红质。在一些方面，将所述系统包装至单个腺相关病毒(AAV)颗粒中。
在一些方面，本公开主题提供包含一种或多种载体的非天然存在的CRISPR-Cas系统，所述载体包含：a)H1启动子，其可操作连接至编码CRISPR-Cas系统向导RNA(gRNA)的至少一个核苷酸序列，其中所述gRNA与真核细胞中的DNA分子的靶序列杂交，且其中所述DNA分子编码在所述真核细胞中表达的一种或多种基因产物；和b)在真核细胞中可操作的调节元件，其可操作连接至编码II型Cas9蛋白的核苷酸序列，其中组件(a)和(b)位于所述系统的相同或不同的载体上，由此所述gRNA靶向所述靶序列且与所述靶序列杂交，且所述Cas9蛋白切割所述DNA分子，且由此一种或多种基因产物的表达改变。在另一个方面，所述靶序列包含核苷酸序列AN19NGG、GN19NGG、CN19NGG或TN19NGG。在另一个方面，将所述Cas9蛋白针对细胞中的表达进行密码子优化。在又另一个方面，将所述Cas9蛋白针对真核细胞中的表达进行密码子优化。在一个进一步方面，所述真核细胞是哺乳动物或人细胞。在另一个方面，一种或多种基因产物的表达减少。
本公开主题还提供改变细胞中的一种或多种基因产物的表达的方法，其中所述细胞包含编码一种或多种基因产物的DNA分子，所述方法包括将包含一种或多种载体的非天然存在的CRISPR-Cas系统引入所述细胞中，所述载体包含：a)H1启动子，其可操作连接至编码CRISPR-Cas系统向导RNA(gRNA)的至少一个核苷酸序列，其中所述gRNA与所述DNA分子的靶序列杂交，和b)在细胞中可操作的调节元件，其可操作连接至编码Cas9蛋白的核苷酸序列，其中组件(a)和(b)位于所述系统的相同或不同的载体上，其中所述gRNA靶向所述靶序列且与所述靶序列杂交，且所述Cas9蛋白切割DNA分子以改变一种或多种基因产物的表达。在一些方面，所述靶序列包含核苷酸序列AN19NGG、GN19NGG、CN19NGG或TN19NGG。在一些方面，所述细胞是真核细胞。在一些方面，所述真核细胞是哺乳动物或人细胞。在一些方面，所述真核细胞是视网膜感光细胞。在一些方面，将所述Cas9蛋白针对细胞中的表达进行密码子优化。在一些方面，所述Cas9蛋白是II型Cas9蛋白。在一些方面，一种或多种基因产物的表达减少。在一些方面，所述一种或多种基因产物是视紫红质。在一些方面，将所述系统包装至单个腺相关病毒(AAV)颗粒中。
在一些方面，本公开主题提供改变真核细胞中的一种或多种基因产物的表达的方法，其中所述细胞包含编码一种或多种基因产物的DNA分子，所述方法包括将包含一种或多种载体的非天然存在的CRISPR-Cas系统引入所述细胞中，所述载体包含：a)H1启动子，其可操作连接至编码CRISPR-Cas系统向导RNA(gRNA)的至少一个核苷酸序列，其中所述gRNA与所述DNA分子的靶序列杂交，和b)在真核细胞中可操作的调节元件，其可操作连接至编码II型Cas9蛋白的核苷酸序列，其中组件(a)和(b)位于所述系统的相同或不同的载体上，由此所述gRNA靶向所述靶序列且与所述靶序列杂交，且所述Cas9蛋白切割所述DNA分子，且由此一种或多种基因产物的表达改变。在另一个方面，所述靶序列包含核苷酸序列AN19NGG、GN19NGG、CN19NGG或TN19NGG。在另一个方面，将所述Cas9蛋白针对细胞中的表达进行密码子优化。在又另一个方面，将所述Cas9蛋白针对真核细胞中的表达进行密码子优化。在一个进一步方面，所述真核细胞是哺乳动物或人细胞。在另一个方面，一种或多种基因产物的表达减少。
本公开主题还提供包含载体的非天然存在的CRISPR-Cas系统，所述载体包含双向H1启动子，其中所述双向H1启动子包含：a)控制元件，其提供编码CRISPR-Cas系统向导RNA(gRNA)的至少一个核苷酸序列在一个方向的转录，其中所述gRNA与细胞中的DNA分子的靶序列杂交，且其中所述DNA分子编码在所述细胞中表达的一种或多种基因产物；和b)控制元件，其提供编码Cas9蛋白的核苷酸序列在相反方向的转录，其中所述gRNA靶向所述靶序列且与所述靶序列杂交，且所述Cas9蛋白切割DNA分子以改变一种或多种基因产物的表达。在一些方面，所述靶序列包含核苷酸序列AN19NGG、GN19NGG、CN19NGG或TN19NGG。在一些方面，所述细胞是真核细胞。在一些方面，所述真核细胞是哺乳动物或人细胞。在一些方面，所述真核细胞是视网膜感光细胞。在一些方面，将所述Cas9蛋白针对细胞中的表达进行密码子优化。在一些方面，所述Cas9蛋白是II型Cas9蛋白。在一些方面，一种或多种基因产物的表达减少。在一些方面，所述一种或多种基因产物是视紫红质。在一些方面，将所述系统包装至单个腺相关病毒(AAV)颗粒中。
在一些实施方案中，本公开主题提供包含载体的非天然存在的CRISPR-Cas系统，所述载体包含双向H1启动子，其中所述双向H1启动子包含：a)控制元件，其提供编码CRISPR-Cas系统向导RNA(gRNA)的至少一个核苷酸序列在一个方向的转录，其中所述gRNA与真核细胞中的DNA分子的靶序列杂交，且其中所述DNA分子编码在所述真核细胞中表达的一种或多种基因产物；和b)控制元件，其提供编码II型Cas9蛋白的核苷酸序列在相反方向的转录，由此所述gRNA靶向所述靶序列且与所述靶序列杂交，且所述Cas9蛋白切割所述DNA分子，且由此一种或多种基因产物的表达改变。在另一个方面，所述靶序列包含核苷酸序列AN19NGG、GN19NGG、CN19NGG或TN19NGG。在又另一个方面，将所述Cas9蛋白针对真核细胞中的表达进行密码子优化。在一个进一步方面，所述真核细胞是哺乳动物或人细胞。在另一个方面，一种或多种基因产物的表达减少。
本公开主题还提供改变细胞中的一种或多种基因产物的表达的方法，其中所述细胞包含编码一种或多种基因产物的DNA分子，所述方法包括将包含含有双向H1启动子的载体的非天然存在的CRISPR-Cas系统引入所述细胞中，其中所述双向H1启动子包含：a)控制元件，其提供编码CRISPR-Cas系统向导RNA(gRNA)的至少一个核苷酸序列在一个方向的转录，其中所述gRNA与所述DNA分子的靶序列杂交，和b)控制元件，其提供编码Cas9蛋白的核苷酸序列在相反方向的转录，其中所述gRNA靶向所述靶序列且与所述靶序列杂交，且所述Cas9蛋白切割DNA分子以改变所述细胞中的一种或多种基因产物的表达。在一些方面，所述靶序列包含核苷酸序列AN19NGG、GN19NGG、CN19NGG或TN19NGG。在一些方面，所述细胞是真核细胞。在一些方面，所述真核细胞是哺乳动物或人细胞。在一些方面，所述真核细胞是视网膜感光细胞。在一些方面，将所述Cas9蛋白针对细胞中的表达进行密码子优化。在一些方面，所述Cas9蛋白是II型Cas9蛋白。在一些方面，一种或多种基因产物的表达减少。在一些方面，所述一种或多种基因产物是视紫红质。在一些方面，将所述系统包装至单个腺相关病毒(AAV)颗粒中。
本公开主题还提供改变真核细胞中的一种或多种基因产物的表达的方法，其中所述细胞包含编码一种或多种基因产物的DNA分子，所述方法包括将包含含有双向H1启动子的载体的非天然存在的CRISPR-Cas系统引入所述细胞中，其中所述双向H1启动子包含：a)控制元件，其提供编码CRISPR-Cas系统向导RNA(gRNA)的至少一个核苷酸序列在一个方向的转录，其中所述gRNA与所述DNA分子的靶序列杂交，和b)控制元件，其提供编码II型Cas9蛋白的核苷酸序列在相反方向的转录，由此所述gRNA靶向所述靶序列且与所述靶序列杂交，且所述Cas9蛋白切割所述DNA分子，且由此一种或多种基因产物的表达改变。在另一个方面，所述靶序列包含核苷酸序列AN19NGG、GN19NGG、CN19NGG或TN19NGG。在又另一个方面，将所述Cas9蛋白针对真核细胞中的表达进行密码子优化。在一个进一步方面，所述真核细胞是哺乳动物或人细胞。在另一个方面，一种或多种基因产物的表达减少。
本公开主题还提供适配子调节的核酶，其包含：a)顺式作用锤头核酶，其包含催化核心和由其延伸的螺旋I、螺旋II和螺旋III双链体区，其中螺旋II双链体区和螺旋III双链体区各自包含与所述催化核心相对的环区域，且其中所述螺旋II双链体区包含结合配体的适配子；b)编码CRISPR-Cas系统向导RNA(gRNA)的核苷酸序列，其中所述gRNA与真核细胞中的DNA分子的靶序列杂交，且其中所述DNA分子编码在所述真核细胞中表达的一种或多种基因产物，其中所述核苷酸序列包含5'末端和3'末端，且其中所述核苷酸序列的5'末端直接偶联至所述螺旋III双链体区；其中所述配体与所述适配子的结合产生核酶的构象变化，使得所述核酶经历在所述核苷酸序列的5'末端和所述螺旋III双链体区之间的自我切割，由此产生gRNA。还提供表达构建体，其包含：(i)编码序列，其当转录为RNA时产生适配子调节的核酶；和(ii)一种或多种转录调节序列，其调节真核细胞中的RNA的转录。还提供包含所述表达构建体的真核细胞。还提供改变真核细胞中的一种或多种基因产物的表达的方法，其中所述细胞包含编码一种或多种基因产物的DNA分子，所述方法包括将所述表达构建体引入所述细胞中，且使所述细胞与所述配体以改变核酶的活性的量接触，特别是其中所述细胞在哺乳动物或人主体中。在一个方面，所述配体是茶碱。
本公开主题还提供用于在有需要的主体中治疗眼部神经变性疾病的方法，所述方法包括：(a)提供包含一种或多种载体的非天然存在的CRISPR-Cas系统，所述载体包含：i)H1启动子，其可操作连接至编码CRISPR-Cas系统向导RNA(gRNA)的至少一个核苷酸序列，其中所述gRNA与所述主体的细胞中的DNA分子的靶序列杂交，且其中所述DNA分子编码在所述细胞中表达的一种或多种基因产物；和ii)在细胞中可操作的调节元件，其可操作连接至编码Cas9蛋白的核苷酸序列，其中组件(i)和(ii)位于所述系统的相同或不同的载体上，其中所述gRNA靶向所述靶序列且与所述靶序列杂交，且所述Cas9蛋白切割DNA分子以改变一种或多种基因产物的表达；和(b)向所述主体施用有效量的所述系统。在一些方面，已经在主体中观察到视网膜感光细胞的功能障碍和/或死亡。在一些方面，所述眼部神经变性疾病选自青光眼、视网膜变性和年龄相关性黄斑变性。在一些方面，所述眼部神经变性疾病是视网膜色素变性(RP)。在一些方面，所述细胞是视网膜感光细胞。在一些方面，一种或多种基因产物是视紫红质。在一些方面，所述H1启动子是双向的。在一些方面，在施用于所述主体之前，将所述系统包装至单个腺相关病毒(AAV)颗粒中。在一些方面，施用于所述主体通过视网膜下注射发生。在一些方面，所述主体是人。在一些方面，所述Cas9蛋白是II型Cas9蛋白。在一些方面，所述靶序列包含核苷酸序列AN19NGG、GN19NGG、CN19NGG或TN19NGG。在一些方面，将所述Cas9蛋白针对细胞中的表达进行密码子优化。在一些方面，本公开的方法进一步包括以改变核酶活性的量施用所述表达构建体和所述配体。在一些方面，所述配体是茶碱。
已经在上文中陈述了本公开主题的某些方面，其通过本公开主题全部或部分地解决，当结合如下文最佳描述的所附实施例和附图进行描述时，其他方面将变得显而易见。
附图简述
因此已经一般地描述了本公开主题，现在将参考附图，所述附图不一定按比例绘制，并且其中：
图1A、图1B、图1C和图1D显示经由从H1启动子的gRNA合成引导CRISPR靶向的能力的评估。描绘gRNA表达构建体的示意图显示于图1A中。上面，U6启动子仅表达具有+1鸟苷核苷酸的gRNA；下面，H1启动子可以驱动在嘌呤(腺苷或鸟苷)核苷酸起始的gRNA的表达。下面，显示具有gRNA靶向基因组序列AN19NGG的Cas9蛋白的图示描绘(所示序列为SEQ ID NO:30)。指示+1 A的位置。eGFP靶向破坏测定的示意性概述显示于图1B中。eGFP荧光被CRISPR靶向和随后的易错NHEJ介导的修复(其导致破坏编码序列的移框突变)破坏，导致荧光的损失。图1C显示证明通过U6或H1启动子表达的gRNA的成功的CRISPR靶向的显微镜图像。将H7ES细胞染色，并且使集落可视化以显示核(左侧，品红色)，eGFP荧光(中间，绿色)，和合并的图像(右侧)，其指示集落中的GFP荧光镶嵌的区域。右侧显示各个构建体的通过流式细胞术的eGFP荧光损失的定量。下面是通过H1表达的gRNA靶向的H7集落的更高放大倍数，其显示表达镶嵌。比例尺，50μM。NHEJ频率的基于Surveyor测定的定量显示于图1D中。描绘对照(第一泳道)、U6表达的gRNA(第二泳道)、H1表达的gRNA(第三泳道)和标记(第四泳道)的Bioanalyzer凝胶图像。％插入缺失(如通过未切割(u)条带相对于切割(c)条带的分数计算)如下所示；
图2显示HEK-293细胞中的NHEJ的Surveyor分析和定量。上面显示eGFP示意图，其中箭头指示靶向位点。正链上的靶位点指示指向右侧，负链目标指示指向左侧；蓝色箭头指示H1启动子gRNA，且橙色箭头指示U6启动子gRNA。下面显示来自Surveyor测定的Bioanalyzer凝胶。上文列出靶位点坐标，且下面指示计算的％插入缺失；
图3A、图3B和图3C显示在AAVS1基因座处的靶向和同源重组。由H1启动子表达的三种gRNA(AAVS1-1a至-1-3a)、由U6启动子表达的三种gRNA(AAVS-1-1至-1-3)和对照非靶向gRNA的Surveyor分析显示于图3A中。图3B显示AAVS-1靶向供体载体(显示在AAVS1基因座上方(标记为“AAVS1”))的示意图和在用H1::AAVS1-3a gRNA和AAVS-1靶向载体电穿孔后GFP阳性H7 ES细胞集落的细胞成像。指示通过同源重组的正确整合的靶向连接区的Sanger测序显示于图3C中(所示序列为SEQ ID NO:31)；
图4A、图4B、图4C和图4D显示基因组中的GN19NGG和AN19NGG位点的生物信息学分析。描绘人类基因组中的CRIPSR位点的频率的Circos图显示于图4A中。外侧圆描绘人类染色体意符(ideogram)。向内移动，沿着染色体指示GN19NGG(橙色)、AN19NGG(蓝色)和RN19NGG(紫色)CRISPR位点频率。圆内绘制的是人外显子密度(黑色)和OMIM疾病位点(蓝色)。基因组中的CRISPR位点之间的频率和距离显示于图4B中。显示基因组中的相邻GN19NGG(橙色)、AN19NGG(蓝色)位点的频率和距离的条形图。平均值和中值在包括RN19NGG位点的图中插入。图4C显示人基因(左侧)或OMIM疾病基因座(右侧)的GN19NGG vs AN19NGG位点频率的条形图定量。图4D显示定量六种基因组(人、牛、小鼠、大鼠，鸡和斑马鱼)中GN19NGG vs. AN19NGG频率的条形图；
图5A、图5B、图5C、图5D、 图5E和图5F显示基因组中的GN19NGG和AN19NGG位点的生物信息学分析。显示描绘人基因组中每个gRNA位点的密度的三个小图：GN19NGG (图5A)、AN19NGG(图5B)和RN19NGG (图5C)。在每个图内，沿着每条染色体绘制CRISPR位点的密度。半透明(橙色、蓝色或紫色)的重叠是计算为平滑高斯核的密度曲线。虚线指示35bp；作为参考，平均来说，估计TALEN靶向位点每35个碱基对出现一次，且ZFN位点每几百个碱基对出现一次(Sander等人(2011) Nature Methods 8:67-69; Cermak等人(2011) Nucleic Acids Res.39(12):e82)。图5D中显示每条人染色体的累积平均CRISPR靶向密度的条形图。GN19NGG(橙色)、AN19NGG (紫色)和RN19NGG (紫色)指示各个CRISPR位点。虚线指示35bp参考。图5E显示基因组中相邻CRISPR位点之间的频率和距离。显示基因组中的相邻GN19NGG(橙色)和AN19NGG(蓝色)位点的频率和距离的条形图。平均值和中间值在图中插入。人基因组中的所有GN19NGG (左上)、AN19NGG (右上)和RN19NGG (底部)位点的SeqLogo显示于图5F中；
图6A、图6B、图6C、图6D、图6E和图6F显示AT/GC基因组含量和CRISPR位点频率：针对人、牛、小鼠、大鼠、鸡和斑马鱼基因组指示AT(蓝色)或GC(橙色)的百分比(图6A)。指示针对AT/GC含量均一化的GN19NGG (橙色)和AN19NGG (蓝色)的频率(图6B)。代表GN19NGG (左侧)、AN19NGG (中间)和RN19NGG (右侧)位点的CRISPR位点频率显示于图6C中。正链(左侧柱)由蓝绿色指示，且负链(右侧柱)以紫红色指示。图6D中指示果蝇、秀丽隐杆线虫和酿酒酵母中的GN19NGG(橙色)和AN19NGG(蓝色)位点频率。图6E显示AT(蓝色)或GC(橙色)百分比含量，且图6F显示CRISPR位点的均一化频率；
图7A、图7B、图7C和图7D显示H7 ES细胞中的内源基因(MERTK)处的AN19NGG的CRISPR靶向。MERTK基因座和各种蛋白结构域的示意图显示于图7A中。外显子2中的靶位点以较大比例显示在下面，指示CRISPR AN19NGG靶位点(显示的序列为SEQ ID NO:32)。通过Surveyor测定对外显子2处的CRISPR靶向的定量显示于图7B中。上面描绘外显子2中的CRISPR位点，其中在Surveyor测定中使用各种引物(箭头)；F1:R1和F2:R2都跨越靶位点，而对照PCR产物F3:R3恰好在靶位点之外。下面显示来自Surveyor测定的凝胶，其中左侧显示三种对照产物，且右侧显示靶向。下面指示％插入缺失频率。图7C显示突变体系的Sanger测序。分离克隆系并测序，表明在AN19NGG位点处的CRISPR靶向导致该区域处的诱变。比对的色谱图显示克隆的6个独特突变(wt是SEQ ID NO:33；Δ12是SEQ ID NO:34；Δ1是SEQ ID NO:35；Δ2,+2是SEQ ID NO:36；Δ6是SEQ ID NO:37；Δ7是SEQ ID NO:38)。图7D显示H7来源的RPE细胞中的Mertk表达的Western印迹分析。泳道1、3和4指示敲除系，且泳道2指示来自杂合系的表达；
图8A、图8B、图8C和图8D显示通过U6或H1表达的gRNA在中靶和脱靶位点处诱导的脱靶命中的分析。来自滴定量的H1启动子(蓝色)或U6启动子(橙色)的VEGFA T1 gRNA表达水平的qRT-PCR分析显示于图8A中。VEGFA T1的中靶和脱靶分析显示于图8B中。在左侧指示Surveyor分析，且在右侧指示靶序列，其中错配以红色指示(T1, SEQ ID NO:20；OT1-3,SEQ ID NO:21；OT1-4, SEQ ID NO:22；OT1-6, SEQ ID NO:23；OT1-11, SEQ ID NO:24)。图8C与图8B相同，其具有VEGFA T3目标(VEGFA T3, SEQ ID NO:25；OT3-1, SEQ ID NO:26；OT3-2, SEQ ID NO:27；OT3-4, SEQ ID NO:28；OT3-18, SEQ ID NO:29)。VEGFA T1的中靶相对脱靶特异性显示于图8D中。显示H1启动子(蓝色)或U6启动子(橙色)之间的中靶诱变/脱靶诱变的比率。在1.0处的虚线以下的值指示脱靶诱变多于中靶诱变。对于所有部分，中靶和脱靶位点如Fu等人((2013) Nat. Biotechnol. 31(9):822-6)和Cho等人((2014)Genome Research 24:132-141)中标记；
图9A和图9B显示U6 vs. H1启动子在表达用于CRISPR靶向的gRNA中的特性。图9A中的上图显示内源人U6启动子和转录起始位点(SEQ ID NO:39)。图9A中的下图指示使用U6启动子以驱动具有不同+1核苷酸的gRNA。因为U6需要G来启动(左上)，所以以A(右上)、C(左下)或T(右下)开始的小图可能启动第一下游G，导致截短的gRNA(U6:GN19NGG是SEQ ID NO:40；U6:AN19NGG是SEQ ID NO:41；U6:CN19NGG是SEQ ID NO:42；U6:TN19NGG是SEQ ID NO:43)。图9B中的上图显示内源人H1启动子和转录起始位点(SEQ ID NO:44)。图9B中的下图指示使用H1启动子以驱动具有不同+1核苷酸的gRNA。H1可以以G(左上)或A(右上)起始，导致全长gRNA。此外，已报道H1允许在C和T核苷酸处起始转录，这将允许H1启动子下游的任何+1核苷酸的全长转录物(H1:GN19NGG是SEQ ID NO:45；H1:AN19NGG是SEQ ID NO:46；H1:CN19NGG是SEQ ID NO:47；H1:TN19NGG是SEQ ID NO:48)；
图10A、图10B、图10C、图10D和图10E显示使用H1启动子作为双向启动子以同时表达Cas9蛋白和向导RNA。显示双向H1启动子，其表达Cas9作为向左(负链)的pol II转录物和向导RNA作为向右(正链)的pol III转录物(图10A)。总表达盒约为4.4kb。图10B显示用于测试从双向H1构建体引导CRISPR介导的切割的能力的构建体。将使用靶向eGFP的gRNA的双向构建体克隆至质粒中并在表达GFP的人干细胞中表达。目视检测到GFP的丢失(中间图，箭头)，表明由于表达构建体导致的GFP的成功表达和靶向(图10C)。还通过Surveyor测定显示了成功的CRISPR靶向，其中泳道2和3中存在两个条带(图10D)。使用H1启动子以生成~4.75b的紧密靶向盒的双向CRISPR构建体(其在腺相关病毒的包装范围内)显示于图10E中。以橙色显示SV40终止子，并且所述构建体侧接病毒生产所需的反向末端重复(ITR)序列；
图11A、图11B和图11C显示生成向导RNA的5'末端的锤头核酶。5'顺式-锤头核酶(SEQID NO:49)和gRNA (SEQ ID NO:50)的描绘显示于图11A中。指示锤头核酶的序列，且指示对于催化重要的核苷酸(红色是关键的，橙色是重要的)。通过箭头指示切割的位置。在核酶切割后(下图)，释放所得gRNA，而不限于在新形成的5'位置处的任何核苷酸。表达锤头-gRNA的构建体显示于图11B中。启动子，通常pol III启动子如U6、H1或T7，可用于表达5'顺式-锤头核酶，其在自我切割后将释放gRNA。用Surveyor测定法显示两个基因座的靶向(HH1 =SEQ ID NO:51；HH2 = SEQ ID NO:52)，其中通过5'顺式-锤头核酶成功裂解(箭头)(图11C)；
图12显示可调节的CRISPR构建体，其使用适体酶在特异性适配子存在的情况下处理gRNA。具体而言，图12描绘与锤头核酶的螺旋II融合的茶碱适配子(橙色)，形成茶碱适体酶，其为gRNA的5'(蓝色)。茶碱的结合稳定了螺旋II，其然后允许锤头自我切割，并释放gRNA(SEQ ID NO:50)。gRNA，连同Cas9，现在能够靶向CRISPR系统的切割。锤头核酶，SEQ IDNO:55；
图13显示H1RNA和PARP-2基因座的基因组结构。上面显示向右转录的PARP-2基因(蓝色)和向左转录的H1RNA基因(橙色)的描绘，按比例绘制。下面是两个基因的启动子区域的放大区域；
图14显示H1 pol II活性的eGFP报道分子。人H1启动子序列被取向为向右的eGFP的polII转录。待优化的三个组分以斜体指示；
图15显示eGFP报道分子表达。上小图指示内源性H1启动子，下小图指示用Kozak序列的表达；
图16A和图16B显示Cas9和gRNA的双向表达。双向靶向构建体的示意图显示于图16A中。使用标准的双载体递送(泳道2和5)或单个靶向质粒的递送(泳道3和6)在两个不同基因座处的切割的比较显示于图16B中。在每个泳道下方指示如通过T7EI测定法确定的％基因组修饰；
图17显示来自hRho:GFP敲入小鼠的视紫红质基因座。在上面，至3'UTR的末端的rho启动子区域的示意图上方指示相应的小鼠和人序列(按比例绘制)。在下面，下面显示(箭头)指示P23和gRNA的位置的放大区域；
图18A、图18B和图18C显示P23H等位基因在体内的特异性靶向。图18A显示P23靶向(WT(C57BL/6J，SEQ ID NO:56；P23H(CCC→CAC)，SEQ ID NO:57；WT(CAST/EiJ)，SEQ ID NO:58)。图18B显示来自两个野生型小鼠品系的视紫红质的测序；SNP由箭头指示(C57BL/6JDNA序列，SEQ ID NO:56；C57BL/6J蛋白序列，SEQ ID NO:59；CAST/EiJ+/+ DNA序列，SEQ IDNO:58；CAST/EiJ+/+蛋白序列，SEQ ID NO:59)。图18C显示P23H育种方案：将P23H纯合小鼠(黑色)与WT Cast(白色)杂交，并通过AAV5的视网膜下递送治疗所得的杂合幼崽(灰色)；和
图19显示视紫红质基因座的等位基因特异性靶向。显示C57BL/6J(P23H)等位基因 vs单碱基错配(Cast)的切割的比较。下面指示通过T7EI测定法确定的％基因组修饰。
专利或申请文件含有至少一张彩色图。在请求并支付必要费用后，将由专利局提供具有彩图的本专利或专利申请公开的拷贝。
详述
现在将参考附图在下文中更全面地描述本公开主题，所述附图中显示本公开主题的一些、但不是所有实施方案。类似数字是指通篇的类似要素。本公开主题可以以许多不同的形式实施，并且不应被解释为限于本文记载的实施方案；反而，提供这些实施方案，使得本公开将满足适用的法律要求。实际上，具有前述描述和相关附图中呈现的教导的益处的本公开主题所属领域的技术人员将想到本文所记载的本公开主题的许多修改和其他实施方案。因此，应当理解，本公开主题不限于公开的特定实施方案，并且修改和其他实施方案旨在包括于所附权利要求的范围内。
基因组编辑技术诸如锌指核酸酶(ZFN)(Porteus,和Baltimore (2003) Science300:763; Miller等人(2007) Nat. Biotechnol.25:778-785; Sander等人(2011) Nature Methods 8:67-69; Wood等人(2011) Science 333:307)和转录激活剂样效应核酸酶(TALEN)(Wood等人(2011) Science 333:307; Boch等人(2009) Science 326:1509-1512;Moscou和Bogdanove (2009) Science 326:1501; Christian等人(2010) Genetics 186:757-761; Miller等人(2011) Nat. Biotechnol. 29:143-148; Zhang等人(2011) Nat. Biotechnol. 29:149-153; Reyon等人(2012) Nat. Biotechnol. 30:460-465)已经赋予生成靶向的基因组修饰并提供准确地校正疾病突变的潜力的能力。尽管有效，但这些技术受实际限制的阻碍，因为ZFN和TALEN配对都需要合成用于给定DNA靶位点的大且独特的识别蛋白。几个研究组最近已经报道了绕过这些关键限制的通过使用工程改造的II型CRISPR/Cas9系统的高效基因组编辑(Cong等人(2013) Science 339:819-823; Jinek等人(2013) eLife 2:e00471; Mali等人(2013) Science 339:823-826; Cho等人(2013) Nat. Biotechnol.31:230-232; Hwang等人(2013) Nat. Biotechnol.31:227-229)。不同于制备相对耗时且困难的ZFN和TALEN，依赖于与合成向导RNA(gRNA)偶联的Cas9蛋白的核酸酶活性的CRISPR构建体，对于合成是简单且快速的，并且可以多重化。然而，尽管它们的合成相对容易，但CRISPR具有与它们接近可靶向基因组空间相关的技术限制，这与Cas9本身的特性和其gRNA的合成相关。
通过CRISPR系统的切割需要gRNA与20-核苷酸DNA序列的互补碱基配对以及必需的前间区序列邻近基序(PAM)(在靶位点的3'处发现的短核苷酸基序)(Jinek等人(2012)Science 337:816-821)。在理论上，技术人员可以使用CRISPR技术靶向基因组中的任何独特的N20-PAM序列。PAM序列的DNA结合特异性（其根据采用的特定Cas9的来源物种而变化）提供了一种约束。目前，最少限制性和最常用的Cas9蛋白来自化脓性链球菌，其识别序列NGG，因此，可以靶向基因组中的任何独特的21个核苷酸序列和随后的两个鸟苷核苷酸(N20NGG)。由蛋白组分施加的可用的靶向空间的扩展受限于具有改变的PAM需求的新型Cas9蛋白的发现和使用(Cong等人(2013) Science 339:819-823; Hou等人(2013) Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A., 110(39):15644-9)，或未实现的经由诱变或定向进化产生新型Cas9变体。CRISPR系统的第二个技术约束起因于在5'鸟苷核苷酸起始的gRNA表达。III型类别的RNA聚合酶III启动子的使用特别适用于gRNA表达，因为这些短的非编码转录物具有明确限定的末端，并且在上游启动子区域中含有排除1+核苷酸的所有必需的转录元件。然而，由于常用的U6启动子需要鸟苷核苷酸来启动转录，所以U6启动子的使用已将基因组靶向位点进一步限制于GN19NGG(Mali等人(2013) Science 339:823-826; Ding等人(2013) Cell Stem Cell 12:393-394)。替代方法，诸如通过T7、T3或SP6启动子的体外转录，也将需要起始鸟苷核苷酸(Adhya等人(1981) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:147-151; Melton等人(1984) Nucleic Acids Res.12:7035-7056; Pleiss等人(1998) RNA 4:1313-1317)。
本公开主题涉及以下发现：使用H1启动子来表达向导RNA(gRNA或sgRNA)，由于5'核苷酸的改变的特异性，使许多基因组中的CRISPR/Cas9系统的精确度超过倍增。使用H1启动子表达gRNA以表达和修饰内源基因的能力可用于靶向AN19NGG和GN19NGG基因组位点。在人基因组中，AN19NGG位点存在的频率比GN19NGG位点高15%，且靶向空间的增加也富集在人基因和疾病基因座处。因此，本公开主题通过将人基因组和其他真核物种内的靶向空间超过倍增来增强CRISPR技术的通用性。此外，与先前存在的CRISPR、TALEN或锌指技术相比，这种修饰允许在人基因组中更高分辨率的靶向。
本公开主题还涉及以下发现：使用H1启动子序列作为双向启动子来表达Cas9和gRNA同时允许生成可以通过病毒载体插入和递送的紧密和完全功能表达盒。
本公开主题还涉及使用RNA核酶和可调节的适体酶来在体内表达和调节gRNA表达。
I.使用H1启动子表达CRISPR向导RNA。
A. 组合物
在一些方案中，本公开主题提供包含一种或多种载体的非天然存在的CRISPR-Cas系统，所述载体包含：a)H1启动子，其可操作连接至编码CRISPR-Cas系统向导RNA(gRNA)的至少一个核苷酸序列，其中所述gRNA与细胞中的DNA分子的靶序列杂交，且其中所述DNA分子编码在所述细胞中表达的一种或多种基因产物；和b)在细胞中可操作的调节元件，其可操作连接至编码Cas9蛋白的核苷酸序列，其中组件(a)和(b)位于所述系统的相同或不同的载体上，其中所述gRNA靶向所述靶序列且与所述靶序列杂交，且所述Cas9蛋白切割DNA分子以改变一种或多种基因产物的表达。
在一些方案中，本公开主题提供包含一种或多种载体的非天然存在的CRISPR-Cas系统，所述载体包含：a)H1启动子，其可操作连接至编码CRISPR-Cas系统向导RNA(gRNA)的至少一个核苷酸序列，其中所述gRNA与真核细胞中的DNA分子的靶序列杂交，且其中所述DNA分子编码在所述真核细胞中表达的一种或多种基因产物；和b)在真核细胞中可操作的调节元件，其可操作连接至编码II型Cas9蛋白的核苷酸序列，其中组件(a)和(b)位于所述系统的相同或不同的载体上，由此所述gRNA靶向所述靶序列且与所述靶序列杂交，且所述Cas9蛋白切割DNA分子，且由此改变一种或多种基因产物的表达。在一个方面，所述靶序列可以是以任何核苷酸开始的靶序列，例如N20NGG。在一些实施方案中，所述靶序列包含核苷酸序列AN19NGG。在一些实施方案中，所述靶序列包含核苷酸序列GN19NGG。在一些实施方案中，所述靶序列包含核苷酸序列CN19NGG。在一些实施方案中，所述靶序列包含核苷酸序列TN19NGG。在一些实施方案中，所述靶序列包含核苷酸序列AN19NGG或GN19NGG。在另一个方面，将所述Cas9蛋白针对细胞中的表达进行密码子优化。在另一个方面，将所述Cas9蛋白针对真核细胞中的表达进行密码子优化。在一个进一步方面，所述真核细胞是哺乳动物或人细胞。在又另一个方面，一种或多种基因产物的表达减少。
本公开主题还提供包含载体的非天然存在的CRISPR-Cas系统，所述载体包含双向H1启动子，其中所述双向H1启动子包含：a)控制元件，其提供编码CRISPR-Cas系统向导RNA(gRNA)的至少一个核苷酸序列在一个方向的转录，其中所述gRNA与真核细胞中的DNA分子的靶序列杂交，且其中所述DNA分子编码在所述真核细胞中表达的一种或多种基因产物；和b)控制元件，其提供编码II型Cas9蛋白的核苷酸序列在相反方向的转录，由此所述gRNA靶向所述靶序列且与所述靶序列杂交，且所述Cas9蛋白切割DNA分子，且由此改变一种或多种基因产物的表达。在一个方面，所述靶序列可以是以任何核苷酸开始的靶序列，例如N20NGG。在一些实施方案中，所述靶序列包含核苷酸序列AN19NGG。在一些实施方案中，所述靶序列包含核苷酸序列GN19NGG。在一些实施方案中，所述靶序列包含核苷酸序列CN19NGG。在一些实施方案中，所述靶序列包含核苷酸序列TN19NGG。在一些实施方案中，所述靶序列包含核苷酸序列AN19NGG或GN19NGG。在另一个方面，将所述Cas9蛋白针对细胞中的表达进行密码子优化。在另一个方面，将所述Cas9蛋白针对真核细胞中的表达进行密码子优化。在一个进一步方面，所述真核细胞是哺乳动物或人细胞。在又另一个方面，一种或多种基因产物的表达减少。
在一些实施方案中，所述CRISPR复合物包含强度足以驱动所述CRISPR复合物以可检测量在细胞(例如真核细胞)的核中积累的一个或多个核定位序列。不希望受理论束缚，据信核定位序列不是真核生物中的CRISPR复合物活性必需的，但包括此类序列增强所述系统的活性，特别是关于靶向核中的核酸分子。在一些实施方案中，所述CRISPR酶是II型CRISPR系统酶。在一些实施方案中，所述CRISPR酶是Cas9酶。在一些实施方案中，所述Cas9酶是肺炎链球菌(S. pneumoniae)、化脓性链球菌或嗜热链球菌(S. thermophilus) Cas9，并且可以包括源自这些生物体的突变Cas9。所述酶可以是Cas9同源物或直向同源物。
通常，且在整个本说明书中，术语“载体”是指能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。载体包括但不限于，单链、双链、或部分双链的核酸分子；包含一个或多个游离端、无游离端(例如环状的)的核酸分子；包含DNA、RNA、或两者的核酸分子；以及本领域已知的其他多种多样的多核苷酸。一种类型的载体是“质粒”，其是指其中可以诸如通过标准分子克隆技术插入额外的DNA区段的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中病毒衍生的DNA或RNA序列存在于用于包装为病毒(例如，逆转录病毒、复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒、复制缺陷型腺病毒和腺相关病毒)的载体中。病毒载体还包括由用于转染入宿主细胞中的病毒携带的多核苷酸。
某些载体(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)能够在它们被导入的宿主细胞中自主复制。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后整合至宿主细胞的基因组中，并且由此与宿主基因组一起复制。而且，某些载体能够指导它们可操作连接的基因的表达。此类载体在本文中被称为“表达载体”。在重组DNA技术中使用的普通表达载体通常是质粒形式。
重组表达载体可包含以适合于在宿主细胞中的核酸表达的形式的本公开主题的核酸，这意味着所述重组表达载体包括基于待用于表达的宿主细胞而选择的一种或多种调节元件，所述调节元件可操作连接至待表达的核酸序列。
在重组表达载体内，“可操作连接”旨在意指目标核苷酸序列以允许核苷酸序列的表达的方式连接至调节元件(例如，在体外转录/翻译系统中或当载体被引入宿主细胞中时，在宿主细胞中)。
术语“调节元件”旨在包括启动子、增强子、内部核糖体进入位点(IRES)和其他表达控制元件(例如转录终止信号，诸如多聚腺苷酸化信号和多聚U序列)。此类调节序列例如描述于Goeddel (1990) Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press, San Diego, Calif中。调节元件包括指导核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中的组成型表达的那些以及指导核苷酸序列仅在某些宿主细胞中表达的那些(例如，组织特异性调节序列)。组织特异性启动子可主要指导在所需目标组织中的表达，所述组织诸如肌肉、神经元、骨、皮肤、血液、特定器官(例如肝脏、胰腺)、或具体细胞类型(例如淋巴细胞)。调节元件还可以时序依赖性方式(诸如以细胞周期依赖性或发育阶段依赖性方式)指导表达，所述方式可以是或者可以不是组织或细胞类型特异性的。
在一些实施方案中，载体包含一个或多个pol III启动子、一个或多个pol II启动子、一个或多个pol I启动子、或其组合。pol III启动子的实例包括但不限于U6和H1启动子。pol II启动子的实例包括但不限于逆转录劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(任选地具有RSV增强子)、巨细胞病毒(CMV)启动子(任选地具有CMV增强子)(例如，Boshart等人(1985)Cell 41:521-530))、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子、和EF1α启动子。
还被术语“调节元件”涵盖的是增强子元件，诸如WPRE；CMV增强子；HTLV-I的LTR中的R-U5’区段(Takebe等人(1988) Mol.Cell.Biol.8:466-472)；SV40增强子；以及在兔β-球蛋白的外显子2和3之间的内含子序列(O’Hare等人(1981) Proc.Natl.Acad.Sci.USA.78(3):1527-31)。本领域技术人员将理解，表达载体的设计可取决于因素诸如待转化的宿主细胞的选择、所需表达水平等。载体可以被引入宿主细胞中，由此产生转录物、蛋白、或肽，包括由如本文所述的核酸编码的融合蛋白或肽(例如，成簇规律间隔短回文重复(CRISPR)转录物、蛋白、酶、其突变体形式、其融合蛋白，等)。有利的载体包括慢病毒和腺相关病毒，并且也可选择此类型载体用于靶向具体类型的细胞。
术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用。它们是指任何长度的核苷酸的聚合形式，无论脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸、或其类似物。多核苷酸可具有任何三维结构，并且可以执行已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码区或非编码区、从连锁分析定义的多个基因座(一个基因座)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微-RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针、和引物。多核苷酸可以包含一个或多个修饰的核苷酸，诸如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可以在聚合物组装之前或之后进行核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后进一步修饰，诸如通过与标记的组分缀合来进一步修饰。
在本公开主题的方面，术语“嵌合RNA”、“嵌合向导RNA”、“向导RNA”、“单个向导RNA”和“合成向导RNA”可互换使用并且是指包含向导序列的多核苷酸序列。术语“向导序列”是指在指定靶位点的向导RNA内约20bp的序列，并且可与术语“引导”或“间隔区”互换地使用。
如本文所用，术语“野生型”是技术人员所理解的本领域的术语，并且意指生物体、菌株、基因的典型形式或者当其在自然界中存在时区别于突变体或变体形式的特征。
如本文所用，术语“变体”应当被理解为意指展现具有衍生自在自然界中存在的模式的性质。
术语“非天然存在的”或“工程改造的”可互换使用并且指示人工的参与。所述术语，当是指核酸分子或多肽时，意味着核酸分子或多肽至少基本上不含它们在自然界中或如发现于自然界中的与其天然缔合的至少另一种组分。
“互补性”是指核酸与另一核酸序列通过传统的沃森-克里克或其他非传统类型形成氢键的能力。互补性百分比表示核酸分子中可与第二核酸序列形成氢键(例如，沃森-克里克碱基配对)的残基的百分比(例如，10个中的5、6、7、8、9、10个为50%、60%、70%、80%、90%和100%互补)。“完全互补”意味着核酸序列的所有连续残基与第二核酸序列中的相同数目的连续残基形成氢键。如本文所用，“基本上互补”是指在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸的区域上为至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%的互补性程度，或者是指在严格条件下杂交的两个核酸。
如本文所用，对于杂交的“严格条件”是指与靶序列具有互补性的核酸主要地与靶序列杂交并且基本上不杂交至非靶序列的条件。严格条件通常是序列依赖性的，并且取决于许多因素而变化。一般而言，序列越长，序列特异性地杂交至其靶序列的温度越高。严格条件的非限制性实例描述于Tijssen (1993), Laboratory Techniques In BiochemistryAnd Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes，第I部分，第二章，"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidprobe assay", Elsevier, N.Y。
“杂交”是指其中一个或多个多核苷酸反应形成复合物的反应，所述复合物经由核苷酸残基的碱基之间的氢键键合而稳定化。氢键键合可以通过沃森-克里克碱基配对、Hoogstein结合或以任何其他序列特异性方式发生。复合物可包含形成双链体结构的两条链、形成多链复合物的三条或更多条链、单个自我杂交链、或这些的任何组合。杂交反应可以构成更广泛的过程(诸如PCR的起始、或通过酶的多核苷酸的切割)中的步骤。能够与给定序列杂交的序列被称为给定序列的“互补物”。
如本文所用，“表达”是指借此从DNA模板转录成多核苷酸(诸如转录成mRNA或其他RNA转录物)的过程和/或转录的mRNA随后借此翻译成肽、多肽或蛋白的过程。转录物和编码的多肽可以总称为“基因产物”。如果多核苷酸源自基因组DNA，则表达可以包括真核细胞中mRNA的剪接。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文可互换使用，是指任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可以是直链或支链的，其可以包含修饰的氨基酸，并且其可以被非氨基酸中断。所述术语还涵盖已经被修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化、或任何其他操作，诸如与标记组分的缀合。
如本文所用，术语“氨基酸”包括天然的和/或非天然的或者合成的氨基酸，包括甘氨酸以及D和L旋光异构体、以及氨基酸类似物和肽模拟物。
除非另有说明，本公开主题的实践采用免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA的常规技术，其在本领域的技术内(Sambrook,Fritsch和Maniatis (1989) Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版; Ausubel等人, 编(1987) Current Protocols in Molecular Biology); MacPherson等人, 编(1995)Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.):PCR 2:A PracticalApproach); Harlow和Lane, 编(1988) Antibodies, A Laboratory Manual; Freshney,编 (1987) Animal Cell Culture)。
本公开主题的几个方面涉及包含一种或多种载体的载体系统，或载体本身。载体可以被设计为用于在原核或真核细胞中表达CRISPR转录物(例如核酸转录物、蛋白、或酶)。例如，CRISPR转录物可表达于细菌细胞诸如大肠杆菌、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞中。合适的宿主细胞进一步讨论于Goeddel (1990) GeneExpression Technology:Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego,Calif中。或者，重组表达载体可在体外例如使用T7启动子调节序列和T7聚合酶来转录和翻译。
载体可以被引入原核生物中并在其中增殖。在一些实施方案中，原核生物用来扩增待引入真核细胞中的载体的多个拷贝，或者作为待引入真核细胞中的载体的产生中的中间载体(例如，扩增质粒作为病毒载体包装系统的一部分)。在一些实施方案中，原核生物用来扩增载体的多个拷贝并且表达一种或多种核酸，诸如提供用于递送至宿主细胞或宿主生物体中的一种或多种蛋白的来源。蛋白在原核生物中的表达最经常在大肠杆菌中用含有指导融合或非融合蛋白的表达的组成型或诱导型启动子的载体来进行。
融合载体将多个氨基酸添加至在其中编码的蛋白，诸如重组蛋白的氨基端。此类融合载体可以用于一个或多个目的，诸如：(i)增加重组蛋白的表达；(ii)增加重组蛋白的溶解性；和(iii)通过在亲和纯化中充当配体来辅助重组蛋白的纯化。通常，在融合表达载体中，将蛋白水解切割位点引入融合部分和重组蛋白的接合处以使得能够在纯化融合蛋白之后将重组蛋白与融合部分分离。此类酶以及它们的同源识别序列包括因子Xa、凝血酶和肠激酶。示例性融合表达载体包括pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith和Johnson(1988) Gene 67:31-40)、pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.)和pRIT5(Pharmacia, Piscataway, N.J.)，其分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或蛋白A融合至靶重组蛋白。
合适的诱导型非融合大肠杆菌表达载体的实例包括pTrc (Amrann等人(1988)Gene 69:301-315)和pET 11d (Studier等人(1990) Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif.)。
在一些实施方案中，载体是酵母表达载体。用于在酵母酿酒酵母中表达的载体的实例包括pYepSec1 (Baldari,等人(1987)EMBO J. 6:229-234)、pMFa (Kuijan和Herskowitz (1982) Cell 30:933-943)、pJRY88 (Schultz等人(1987) Gene 54:113-123)、pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.)和picZ (InVitrogenCorp, San Diego, Calif.)。
在一些实施方案中，使用哺乳动物表达载体，载体能够驱动一种或多种序列在哺乳动物细胞中表达。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8 (Seed (1987) Nature 329:840)和pMT2PC (Kaufman等人(1987) EMBO J. 6:187-195)。当用于哺乳动物细胞中时，表达载体的控制功能通常由一种或多种调节元件提供。例如，常用的启动子来源于多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒、猿猴病毒40、以及本文所述和本领域已知的其他病毒。对于用于原核细胞和真核细胞两者的其他合适的表达系统，参见例如Sambrook等人(1989) MolecularCloning:A Laboratory Manual.(第2版)的第16和第17章，Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.。
在一些实施方案中，重组哺乳动物表达载体能够指导核酸优先在特定细胞类型中表达(例如，使用组织特异性调节元件来表达核酸)。组织特异性调节元件是本领域中已知的。合适的组织特异性启动子的非限制性实例包括白蛋白启动子(肝脏特异性的；Pinkert等人(1987) Genes Dev.1:268-277)，淋巴特异性启动子(Calame和Eaton (1988)Adv.Immunol.43:235-275)，特别是T细胞受体的启动子(Winoto和Baltimore (1989)EMBOJ.8:729-733)和免疫球蛋白(Baneiji等人(1983) Cell 33:729-740; Queen和Baltimore (1983) Cell 33:741-748)，神经元特异性启动子(例如，神经丝启动子；Byrne和Ruddle (1989) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:5473-5477)，胰腺特异性启动子(Edlund等人(1985) Science 230:912-916)，以及乳腺特异性启动子(例如，乳清(milk whey)启动子；美国专利号4,873,316和欧洲申请公开号264,166)。还涵盖发育调节的启动子，例如，鼠科动物同源框蛋白(hox)启动子(Kessel和Gruss (1990) Science 249:374-379)和甲胎蛋白启动子(Campes和Tilghman (1989) Genes Dev.3:537-546)。
在一些实施方案中，调节元件可操作连接至CRISPR系统的一个或多个元件，从而驱动该CRISPR系统的一个或多个元件的表达。一般而言，CRISPR(成簇规律间隔短回文重复)，也称为SPIDR(SPacer间隔开的直接重复)，构成通常对于特定细菌物种特异性的DNA基因座的家族。CRISPR基因座包含在大肠杆菌中被识别的间隔的短序列重复(SSR)的不同类别(Ishino等人(1987) J. Bacteriol., 169:5429-5433;和Nakata等人(1989)J.Bacteriol., 171:3553-3556)、以及相关基因。类似的间隔的SSR已经鉴定于地中海富盐菌(Haloferax mediterranei)、化脓性链球菌、鱼腥藻属、和结核分枝杆菌中(Groenen等人(1993) Mol.Microbiol., 10:1057-1065; Hoe等人(1999) Emerg.Infect.Dis., 5:254-263; Masepohl等人(1996) Biochim.Biophys.Acta 1307:26-30;和Mojica等人(1995)Mol.Microbiol., 17:85-93)。所述CRISPR基因座与其他SSR的不同通常在于重复结构，其已被称为短的规律间隔重复(SRSR)(Janssen等人(2002) OMICS J. Integ.Biol., 6:23-33;和Mojica等人(2000) Mol.Microbiol., 36:244-246)。一般而言，所述重复是成簇存在的短元件，其被具有基本上恒定长度的独特间插序列规律地间隔开(Mojica等人(2000)Mol.Microbiol., 36:244-246)。尽管重复序列在菌株之间是高度保守的，但间隔开的重复的数目和所述间隔区的序列一般在菌株与菌株之间不同(van Embden等人(2000)J.Bacteriol., 182:2393-2401)。已经在超过40种原核生物中鉴定到CRISPR基因座(参见，例如，Jansen等人(2002) Mol.Microbiol., 43:1565-1575;和Mojica等人(2005)J.Mol.Evol.60:174-82)，所述原核生物包括但不限于：气火菌属(Aeropyrum)、热棒菌属(Pyrobaculum)、硫化叶菌属(Sulfolobus)、古球菌属(Archaeoglobus)、盐盒菌属(Halocarcula)、甲烷杆菌属(Methanobacteriumn)、甲烷球菌属(Methanococcus)、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)、甲烷火菌属(Methanopyrus)、热球菌属(Pyrococcus)、嗜酸菌属(Picrophilus)、热原体属(Thernioplasnia)、棒杆菌属(Corynebacterium)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、链霉菌属(Streptomyces)、产水菌属(Aquifrx)、卟啉单胞菌属(Porphvromonas)、绿菌属(Chlorobium)、栖热菌属(Thermus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、李斯特菌属(Listeria)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、梭菌属(Clostridium)、热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)、支原体属(Mycoplasma)、梭杆菌属(Fusobacterium)、固氮弓菌属(Azarcus)、色杆菌属(Chromobacterium)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、地杆菌属(Geobacter)、粘球菌属(Myrococcus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、沃林氏菌属(Wolinella)、不动杆菌属(Acinetobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、埃希氏菌属(Escherichia)、军团菌属(Legionella)、甲基球菌属(Methylococcus)、巴斯德氏菌属(Pasteurella)、发光杆菌属(Photobacterium)、沙门氏菌属(Salmonella)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、密螺旋体属(Treponema)和栖热袍菌属(Thermotoga)。
一般而言，“CRISPR系统”总体是指转录物和参与CRISPR相关(“Cas”)基因的表达或引导其活性的其他元件，包括编码Cas基因的序列、向导序列(在内源CRISPR系统背景下也称为“间隔区”)、或来自CRISPR基因座的其他序列和转录物。在一些实施方案中，CRISPR系统的一个或多个元件来源于I型、II型、或III型CRISPR系统。在一些实施方案中，CRISPR系统的一个或多个元件来源于包含内源CRISPR系统的特殊生物，诸如化脓性链球菌。一般而言，CRISPR系统的特征在于促进在靶序列的位点处的CRISPR复合物(在内源CRISPR系统的背景下也称为前间区)的形成的元件。
在CRISPR复合物形成的背景下，“靶序列”是指向导序列被设计为对其具有互补性的序列，其中在靶序列和向导序列之间的杂交促进CRISPR复合物的形成。完全互补性不是必需的，条件是存在足够互补性以引起杂交并且促进CRISPR复合物的形成。靶序列可以包含任何多核苷酸，诸如DNA或RNA多核苷酸。在一些实施方案中，靶序列位于细胞的核或细胞质中。在一些实施方案中，靶序列可位于真核细胞的细胞器例如线粒体或叶绿体内。可用于重组至包含该靶序列的靶基因座中的序列或模板被称为“编辑模板”或“编辑多核苷酸”或“编辑序列”。在本公开主题的方面，外源模板多核苷酸可被称为编辑模板。在本公开主题的一个方面，重组是同源重组。
在一些实施方案中，载体包含一个或多个插入位点，诸如限制性核酸内切酶识别序列(也称为“克隆位点”)。在一些实施方案中，一个或多个插入位点(例如，约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个、或更多个插入位点)位于一种或多种载体的一个或多个序列元件的上游和/或下游。当使用多个不同的向导序列时，可以使用单个表达构建体来将CRISPR活性靶向至细胞内的多个不同的相应靶序列。例如，单个载体可以包含约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20个、或更多个向导序列。在一些实施方案中，可以提供约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个、或更多个含有此类向导序列的载体，并且任选地将其递送至细胞。
在一些实施方案中，载体包含可操作连接至编码CRISPR酶(诸如Cas蛋白)的酶编码序列的调节元件。Cas蛋白的非限制性实例包括：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9 (也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、其同系物、或其修饰版本。这些酶是已知的；例如，化脓性链球菌Cas9蛋白的氨基酸序列可见于SwissProt数据库的登录号Q99ZW2下。在一些实施方案中，未修饰的CRISPR酶具有DNA切割活性，诸如Cas9。在一些实施方案中，所述CRISPR酶是Cas9，并且可以是来自化脓性链球菌或肺炎链球菌的Cas9。
在一些实施方案中，CRISPR酶引导在靶序列位置处(诸如在靶序列内和/或在靶序列的互补物内)的一条链或两条链的切割。在一些实施方案中，CRISPR酶引导距靶序列的第一个或最后一个核苷酸约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500个、或更多个碱基对内的一条链或两条链的切割。在一些实施方案中，载体编码相对于相应的野生型酶被突变的CRISPR酶，使得突变的CRISPR酶缺乏切割含有靶序列的靶多核苷酸的一条链和两条链的能力。
在一些实施方案中，编码CRISPR酶的酶编码序列针对在特定的细胞诸如真核细胞中表达进行密码子优化。所述真核细胞可以是特定生物的那些或来源于特定生物，所述特定生物诸如哺乳动物，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、狗、或非人灵长类动物。一般而言，密码子优化是指通过用在宿主细胞的基因中更频繁地或者最频繁地使用的密码子代替天然序列的至少一个密码子(例如约或多于约1、2、3、4、5、10、15、20、25、50个、或更多个密码子、同时维持天然氨基酸序列而修饰核酸序列用于增强在目标宿主细胞中的表达的方法。各种物种对于特定氨基酸的某些密码子展现特定的偏好。密码子偏好性(在生物体之间的密码子使用的差异)经常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，而该翻译效率据信依赖于(除其他之外)所翻译的密码子的特性和特定的转运RNA(tRNA)分子的可用性。细胞内选定的tRNA的优势一般反映了最频繁用于肽合成的密码子。因此，可以基于密码子优化将基因定制为在给定生物中的最佳基因表达。密码子使用表可以容易地获得，例如在“Codon UsageDatabase”，并且这些表可以通过不同的方式调整适用。参见，Nakamura等人(2000)Nucl.Acids Res.28:292。针对在特定的宿主细胞中表达而密码子优化特定的序列的计算机算法也是可得的，诸如Gene Forge (Aptagen; Jacobus, Pa.)，也是可得的。在一些实施方案中，在编码CRISPR酶的序列中的一个或多个密码子(例如1、2、3、4、5、10、15、20、25、50个、或更多个、或所有密码子)相应于对于特定氨基酸最频繁使用的密码子。
一般而言，向导序列是与靶多核苷酸序列具有足够互补性以便与该靶序列杂交并且引导CRISPR复合物与靶序列的序列特异性结合的任何多核苷酸序列。在一些实施方案中，当使用合适的比对算法进行最佳比对时，在向导序列和其相应的靶序列之间的互补性程度是约或多于约50%、60%、75%、80%、85%、90%、95%、97.5%、99%、或更多。可以使用用于比对序列的任何合适的算法来确定最佳比对，所述算法的非限制性实例包括Smith-Waterman算法、Needleman-Wunsch算法、基于Burrows-Wheeler转换的算法(例如Burrows WheelerAligner)、ClustalW、Clustal X、BLAT、Novoalign (Novocraft Technologies, ELAND(Illumina, San Diego, Calif.)、SOAP (可得自soap.genomics.org.cn)和Maq (可得自maq.sourceforge.net)。在一些实施方案中，向导序列长度为约或多于约5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75个、或更多个核苷酸。在一些实施方案中，向导序列长度为少于约75、50、45、40、35、30、25、20、15、12个、或更少的核苷酸。
可以通过任何合适的测定法来评价向导序列引导CRISPR复合物与靶序列的序列特异性结合的能力。例如，足以形成CRISPR复合物的CRISPR系统的组分，包括待测试的向导序列，可以诸如通过用编码该CRISPR序列的组分的载体进行转染而被提供至具有相应靶序列的宿主细胞，随后通过如本文所述的Surveyer测定来评价靶序列内的优先切割。类似地，通过提供靶序列、CRISPR复合物的组分，包括待测试的向导序列和不同于测试向导序列的对照向导序列，并且比较在测试和对照向导序列反应之间的靶序列处的结合或切割率，可以在试管中评估靶多核苷酸序列的切割。其他测定法是可能的，并且将由本领域技术人员想到。
可以选择向导序列以靶向任何靶序列。在一些实施方案中，所述靶序列是细胞基因组内的序列。示例性靶序列包括在靶基因组中独特的那些。
在一些实施方案中，CRISPR酶是包含一个或多个异源蛋白结构域(例如除了CRISPR酶之外，约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个、或更多个结构域)的融合蛋白的一部分。CRISPR酶融合蛋白可以包含任何额外蛋白序列，以及任选地在任何两个结构域之间的连接序列。可以融合至CRISPR酶的蛋白结构域的实例包括但不限于，表位标签、报道基因序列、以及具有下列活性中的一种或多种的蛋白结构域：甲基酶活性、脱甲基酶活性、转录激活活性、转录抑制活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、RNA切割活性和核酸结合活性。表位标签的非限制性实例包括组氨酸(His)标签、V5标签、FLAG标签、流感血凝素(HA)标签、Myc标签、VSV-G标签、和硫氧还蛋白(Trx)标签。报道基因的实例包括，但不限于，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、辣根过氧化物酶(HRP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、HcRed、DsRed、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)以及自发荧光蛋白，包括蓝色荧光蛋白(BFP)。CRISPR酶可以融合至编码蛋白或蛋白片段的基因序列，所述蛋白或蛋白片段结合DNA分子或结合其他细胞分子，包括，但不限于，麦芽糖结合蛋白(MBP)、S-标签、Lex A DNA结合结构域(DBD)融合体、GAL4A DNA结合结构域融合体、以及单纯疱疹病毒(HSV)BP16蛋白融合体。可以形成包含CR ISPR酶的融合蛋白的一部分的额外的结构域描述于US20110059502中，其通过引用并入本文。在一些实施方案中，使用标记的CRISPR酶来鉴定靶序列的位置。
在本公开主题的一个方面，可以将报道基因引入细胞中，以编码充当测量基因产物的表达的改变或修饰的标记物的基因产物，所述报道基因包括但不限于谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、辣根过氧化物酶(HRP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、HcRed、DsRed、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)以及自发荧光蛋白，包括蓝色荧光蛋白(BFP)。在本公开主题的一个进一步实施方案中，可以经由载体将编码基因产物的DNA分子引入细胞中。在本公开主题的一个优选实施方案中，所述基因产物是荧光素酶。在本公开主题的一个进一步实施方案中，基因产物的表达减少。
通常，本公开主题的启动子实施方案包含：1)完整Pol III启动子，其包括TATA盒、近端序列元件(PSE)和远端序列元件(DSE)；和2)第二基础Pol III启动子，其包括以相反方向与DSE的5'末端融合的PSE和TATA盒。以其核苷酸序列命名的TATA盒是Pol III特异性的主要决定因素。其通常位于相对于转录序列的nt-23和-30之间的位置，并且是转录序列的开始的主要决定因素。PSE通常位于nt-45和-66之间。DSE增强基础Pol III启动子的活性。在H1启动子中，在PSE和DSE之间没有间隙。
双向启动子由以下组成：1)完整的、常规的、单向的Pol III启动子，其含有3个外部控制元件：DSE、PSE和TATA盒；和2)第二基础Pol III启动子，其包括以相反方向与DSE的5'末端融合的PSE和TATA盒。被TATA结合蛋白识别的TATA盒对于将Pol III募集至启动子区是必需的。TATA结合蛋白与TATA盒的结合通过SNAPc与PSE的相互作用稳定化。一同地，这些元件正确定位Pol III，使得其可以转录表达的序列。DSE对于Pol III启动子的完全活性也是必需的(Murphy等人(1992) Mol.Cell Biol.12:3247-3261; Mittal等人(1996)Mol.Cell Biol.16:1955-1965; Ford和Hernandez (1997) J.Biol.Chem., 272:16048-16055; Ford等人(1998) Genes, Dev., 12:3528-3540; Hovde等人(2002) GenesDev.16:2772-2777)。转录因子Oct-1和/或SBF/Staf与其在DSE内的基序的相互作用使转录增强最多达100倍(Kunkel和Hixon (1998) Nucl.Acid Res., 26:1536-1543)。由于正向和反向取向的基础启动子引导在双链DNA模板的相对链上的序列的转录，所以反向取向的基础启动子的正链附接至DSE的负链的5'末端。在H1启动子控制下表达的转录物由4或5个T的未断裂序列终止。
在H1启动子中，DSE与PSE和TATA盒相邻(Myslinski等人(2001)Nucl.AcidRes.29:2502-2509)。为了尽可能减少序列重复，通过产生杂交启动子使该启动子双向，其中通过附接源自U6启动子的PSE和TATA盒来控制反向转录。为了促进双向H1启动子的构建，也可以在反向取向的基础启动子和DSE之间插入小间隔序列。
B.方法
在一些实施方案中，本公开主题还提供改变细胞中的一种或多种基因产物的表达的方法，其中所述细胞包含编码一种或多种基因产物的DNA分子，所述方法包括将包含一种或多种载体的非天然存在的CRISPR-Cas系统引入所述细胞中，所述载体包含：a)H1启动子，其可操作连接至编码CRISPR-Cas系统向导RNA(gRNA)的至少一个核苷酸序列，其中所述gRNA与所述DNA分子的靶序列杂交，和b)在细胞中可操作的调节元件，其可操作连接至编码Cas9蛋白的核苷酸序列，其中组件(a)和(b)位于所述系统的相同或不同的载体上，其中所述gRNA靶向所述靶序列且与所述靶序列杂交，且所述Cas9蛋白切割DNA分子以改变一种或多种基因产物的表达。
在一些实施方案中，本公开主题还提供改变真核细胞中的一种或多种基因产物的表达的方法，其中所述细胞包含编码一种或多种基因产物的DNA分子，所述方法包括将包含一种或多种载体的非天然存在的CRISPR-Cas系统引入所述细胞中，所述载体包含：a)H1启动子，其可操作连接至编码CRISPR-Cas系统向导RNA(gRNA)的至少一个核苷酸序列，其中所述gRNA与所述DNA分子的靶序列杂交，和b)在真核细胞中可操作的调节元件，其可操作连接至编码II型Cas9蛋白的核苷酸序列，由其中组件(a)和(b)位于所述系统的相同或不同的载体上，由此所述gRNA靶向所述靶序列且与所述靶序列杂交，且所述Cas9蛋白切割DNA分子，且由此改变一种或多种基因产物的表达。在一个方面，所述靶序列可以是以任何核苷酸开始的靶序列，例如N20NGG。在一些实施方案中，所述靶序列包含核苷酸序列AN19NGG。在一些实施方案中，所述靶序列包含核苷酸序列GN19NGG。在一些实施方案中，所述靶序列包含核苷酸序列CN19NGG。在一些实施方案中，所述靶序列包含核苷酸序列TN19NGG。在一些实施方案中，所述靶序列包含核苷酸序列AN19NGG或GN19NGG。在另一个方面，将所述Cas9蛋白针对细胞中的表达进行密码子优化。在又另一个方面，将所述Cas9蛋白针对真核细胞中的表达进行密码子优化。在一个进一步方面，所述真核细胞是哺乳动物或人细胞。在另一个方面，一种或多种基因产物的表达减少。
本公开主题还提供改变真核细胞中的一种或多种基因产物的表达的方法，其中所述细胞包含编码一种或多种基因产物的DNA分子，所述方法包括将包含含有双向H1启动子的载体的非天然存在的CRISPR-Cas系统引入所述细胞中，其中所述双向H1启动子包含：a)控制元件，其提供编码CRISPR-Cas系统向导RNA(gRNA)的至少一个核苷酸序列在一个方向的转录，其中所述gRNA与所述DNA分子的靶序列杂交，和b)控制元件，其提供编码II型Cas9蛋白的核苷酸序列在相反方向的转录，由此所述gRNA靶向所述靶序列且与所述靶序列杂交，且所述Cas9蛋白切割DNA分子，且由此改变一种或多种基因产物的表达。在一个方面，所述靶序列可以是以任何核苷酸开始的靶序列，例如N20NGG。在一些实施方案中，所述靶序列包含核苷酸序列AN19NGG。在一些实施方案中，所述靶序列包含核苷酸序列GN19NGG。在一些实施方案中，所述靶序列包含核苷酸序列CN19NGG。在一些实施方案中，所述靶序列包含核苷酸序列TN19NGG。在另一个方面，所述靶序列包含核苷酸序列AN19NGG或GN19NGG。在另一个方面，将所述Cas9蛋白针对细胞中的表达进行密码子优化。在又另一个方面，将所述Cas9蛋白针对真核细胞中的表达进行密码子优化。在一个进一步方面，所述真核细胞是哺乳动物或人细胞。在另一个方面，一种或多种基因产物的表达减少。
在一些方面，本公开主题提供这样的方法，其包括向宿主细胞递送一种或多种多核苷酸，诸如或如本文所述的一种或多种载体、其一种或多种转录物和/或一种或多种由其转录的蛋白。在一些方面，本公开主题进一步提供通过此类方法产生的细胞以及包含此类细胞或由此类细胞产生的生物体(诸如动物、植物、或真菌)。在一些实施方案中，将与(并且任选地与其复合)向导序列组合的CRISPR酶递送至细胞。可以使用常规的基于病毒和非病毒的基因转移方法来将核酸引入哺乳动物细胞或靶组织中。可以使用此类方法来向培养物中或宿主生物中的细胞施用编码CRISPR系统的组分的核酸。非病毒载体递送系统包括DNA质粒、RNA(例如本文描述的载体的转录物)、裸核酸以及与递送媒介物(诸如脂质体)复合的核酸。病毒载体递送系统包括DNA和RNA病毒，其在被递送至细胞后具有附加型或整合型基因组。对于基因疗法程序的综述，参见Anderson (1992) Science 256:808-813; Nabel和Felgner (1993) TIBTECH 11:211-217; Mitani和Caskey (1993) TIBTECH 11:162-166;Dillon (1993) TIBTECH 11:167-175; Miller (1992) Nature 357:455-460; Van Brunt(1998) Biotechnology 6(10):1149-1154; Vigne (1995)RestorativeNeurologyandNeuroscience 8:35-36; Kremer和Perricaudet (1995)British Medical Bulletin 51(1):31-44; Haddada等人(1995) Current Topics inMicrobiology and Immunology.Doerfler和Bohm (编);和Yu等人(1994) Gene Therapy1:13-26。
核酸的非病毒递送方法包括脂转染、核转染、显微注射、基因枪、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质：核酸缀合物、裸DNA、人工病毒粒子以及DNA的试剂增强性摄取。脂转染描述于例如美国专利号5,049,386、4,946,787和4,897,355中并且脂转染试剂是市售的(例如，Transfectam™和Lipofectin™)。适合于多核苷酸的有效的受体识别脂转染的阳离子和中性脂质包括Felgner，WO 91/17424；WO 91/16024的那些。递送可以针对细胞(例如体外或离体施用)或靶组织(例如体内施用)。
脂质:核酸复合物(包括靶向的脂质体，诸如免疫脂质复合物)的制备是本领域技术人员众所周知的(例如，Crystal (1995) Science 270:404-410; Blaese等人(1995)Cancer Gene Ther.2:291-297:Behr等人(1994) Bioconjugate Chem.5:382-389; Remy等人(1994) Bioconjugate Chem.5:647-654; Gao等人(1995) Gene Therapy 2:710-722;Ahmad等人(1992) Cancer Res.52:4817-4820; 美国专利号4,186,183、4,217,344、4,235,871、4,261,975、4,485,054、4,501,728、4,774,085、4,837,028和4,946,787)。
使用基于RNA或DNA病毒的用于递送核酸的系统利用用于将病毒靶向至体内的特定细胞并将病毒有效负荷(payload)转运至核的高度进化的过程。可以将病毒载体直接施用于患者(体内)或可以使用它们在体外处理细胞，并且任选地，可以将修饰的细胞施用于患者(离体)。常规的基于病毒的系统可以包括用于基因转移的逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体以及单纯疱疹病毒载体。用逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒基因转移方法整合于宿主基因组中是可能的，这通常导致插入转基因的长期表达。另外，已经在不同细胞类型和靶组织中观察到高转导效率。
可以通过并入外源包膜蛋白、扩展靶细胞的潜在靶群而改变逆转录病毒的向性。慢病毒载体是能够转导或感染非分裂细胞并通常产生较高病毒滴度的逆转录病毒载体。因此，逆转录病毒基因转移系统的选择将依赖于靶组织。逆转录病毒载体由顺式作用长末端重复组成，所述长末端重复具有最多达6-10 kb的外源序列的包装容量。最小顺式作用LTR对于载体的复制和包装是足够的，其然后用于将治疗基因整合入靶细胞中，以提供永久的转基因表达。广泛使用的逆转录病毒载体包括基于鼠白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)及其组合的那些(例如，Buchscher等人(1992) J. Virol.66:2731-2739; Johann等人(1992) J. Virol.66:1635-1640; Sommnerfelt等人(1990) J. Virol.176:58-59; Wilson等人(1989) J. Virol.63:2374-2378; Miller等人(1991) J. Virol.65:2220-2224; PCT/US94/05700)。在瞬时表达是优选的应用中，可以使用基于腺病毒的系统。基于腺病毒的载体在许多细胞类型中能够具有非常高的转导效率并且无需细胞分裂。用此类载体，已经获得了较高的滴度和表达水平。可以在相对简单的系统中大量产生此载体。还可以使用腺相关病毒(“AAV”)载体转导具有靶核酸的细胞，例如，在体外产生核酸和肽，以及用于体内和离体基因疗法程序(参见例如，West等人(1987) Virology 160:38-47; 美国专利号4,797,368; WO 93/24641; Kotin(1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Muzyczka (1994) J. Clin.Invest.94:1351)。重组AAV载体的构建描述于多个出版物，包括美国专利号5,173,414；Tratschin等人(1985)Mol.Cell.Biol.5:3251-3260; Tratschin等人(1984) Mol.Cell.Biol.4:2072-2081;Hermonat和Muzyczka (1984) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6466-6470;和Samulski等人(1989) J. Virol.63:03822-3828。
通常使用包装细胞来形成能够感染宿主细胞的病毒粒子。此类细胞包括包装腺病毒的293细胞和包装逆转录病毒的ψ2细胞或PA317细胞。在基因疗法中使用的病毒载体通常通过产生将核酸载体包装入病毒粒子的细胞系来产生。这些载体通常含有包装并且随后整合至宿主中所需的最小病毒序列，其他病毒序列由待表达的多核苷酸的表达盒替换。失去的病毒功能通常由包装细胞系反式提供。例如，在基因疗法中使用的AAV载体通常仅具有来自AAV基因组的ITR序列，其为包装并整合至宿主基因组中所需。将病毒DNA包装至这样的细胞系中，所述细胞系含有编码其他AAV基因(即rep和cap)、但缺少ITR序列的辅助质粒。该细胞系还可以被作为辅助者的腺病毒感染。该辅助病毒促进AAV载体的复制和从辅助质粒表达AAV基因。由于缺少ITR序列，未以显著的量包装该辅助质粒。可以通过例如腺病毒与AAV相比更加敏感的热处理减少腺病毒的污染。用于将核酸递送至细胞的额外方法是本领域技术人员已知的。参见例如通过引用并入本文的US 20030087817。
在一些实施方案中，用一种或多种本文描述的载体瞬时地或非瞬时地转染宿主细胞。在一些实施方案中，当细胞天然地出现在主体内时将其转染。在一些实施方案中，被转染的细胞取自主体。在一些实施方案中，该细胞来源于取自主体的细胞，诸如细胞系。用于组织培养的多种多样的细胞系是本领域中已知的。细胞系的实例包括但不限于，C8161、CCRF-CEM、MOLT、mIMCD-3、NHDF、HeLa-S3、Huh1、Huh4、Huh7、HUVEC、HASMC、HEKn、HEKa、MiaPaCell、Panel、PC-3、TF1、CTLL-2、C1R、Rat6、CV1、RPTE、A10、T24、J82、A375、ARH-77、Calu1、SW480、SW620、SKOV3、SK-UT、CaCo2、P388D1、SEM-K2、WEHI-231、HB56、TIB55、Jurkat、J45.01、LRMB、Bcl-1、BC-3、IC21、DLD2、Raw264.7、NRK、NRK-52E、MRC5、MEF、Hep G2、HeLa B、HeLa T4、COS、COS-1、COS-6、COS-M6A、BS-C-1猴肾上皮细胞、BALB/3T3小鼠胚胎成纤维细胞、3T3 Swiss、3T3-L1、132-d5人类胎儿成纤维细胞；10.1小鼠成纤维细胞、293-T、3T3、721、9L、A2780、A2780ADR、A2780cis、A172、A20、A253、A431、A-549、ALC、B16、B35、BCP-1细胞、BEAS-2B、bEnd.3、BHK-21、BR 293、BxPC3、C3H-10T1/2、C6/36、Cal-27、CHO、CHO-7、CHO-IR、CHO-K1、CHO-K2、CHO-T、CHO Dhfr −/−、COR-L23、COR-L23/CPR、COR-L23/5010、COR-L23/R23、COS-7、COV-434、CML T1、CMT、CT26、D17、DH82、DU145、DuCaP、EL4、EM2、EM3、EMT6/AR1、EMT6/AR10.0、FM3、H1299、H69、HB54、HB55、HCA2、HEK-293、HeLa、Hepa1c1c7、HL-60、HMEC、HT-29、Jurkat、JY细胞、K562细胞、Ku812、KCL22、KG1、KYO1、LNCap、Ma-MeI 1-48、MC-38、MCF-7、MCF-10A、MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-435、MDCK II、MDCK II、MOR/0.2R、MONO-MAC 6、MTD-1A、MyEnd、NCI-H69/CPR、NCI-H69/LX10、NCI-H69/LX20、NCI-H69/LX4、NIH-3T3、NALM-1、NW-145、OPCN/OPCT细胞系、Peer、PNT-1A/PNT 2、RenCa、RIN-5F、RMA/RMAS、Saos-2细胞、Sf-9、SkBr3、T2、T-47D、T84、THP1细胞系、U373、U87、U937、VCaP、Vero细胞、WM39、WT-49、X63、YAC-1、YAR及其转基因变种。细胞系可得自本领域技术人员已知的多种来源(参见例如，美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)(Manassus,Va.))。在一些实施方案中，使用用一种或多种本文描述的载体转染的细胞建立包含一种或多种载体来源的序列的新的细胞系。在一些实施方案中，使用用如本文描述的CRISPR系统的组分瞬时转染(诸如通过一种或多种载体的瞬时转染或RNA转染)且通过CRISPR复合物的活性修饰的细胞建立新的细胞系，所述新的细胞系包含以下细胞，所述细胞含有修饰、但缺乏任何其他外源序列。在一些实施方案中，在评价一种或多种测试化合物中使用用一种或多种本文描述的载体瞬时或非瞬时转染的细胞或来源于此类细胞的细胞系。
在一些实施方案中，使用一种或多种本文描述的载体来产生非人转基因动物。在一些实施方案中，所述转基因动物是哺乳动物，诸如小鼠、大鼠或兔。在某些实施方案中，所述生物体或主体是植物。用于产生转基因动物的方法是本领域中已知的，并且通常以细胞转染方法(诸如如本文描述的细胞转染方法)开始。
在一个方面，本公开主题提供修饰真核细胞中的靶多核苷酸的方法，其可以是体内、离体或体外的。在一些实施方案中，所述方法包括从人或非人动物取样细胞或细胞群，且修饰一个或多个细胞。培养可以在任何阶段离体发生。所述一个或多个细胞甚至可以被重新引入非人动物中。
在一个方面，本公开主题提供用于修饰真核细胞中的靶多核苷酸的方法。在一些实施方案中，所述方法包括允许CRISPR复合物结合至靶多核苷酸以实施所述靶多核苷酸的切割，由此修饰靶多核苷酸，其中所述CRISPR复合物包含与杂交至所述靶多核苷酸内的靶序列的向导序列复合的CRISPR酶。
在一个方面，本公开主题提供修饰多核苷酸在真核细胞中的表达的方法。在一些实施方案中，所述方法包括允许CRISPR复合物结合至多核苷酸，使得所述结合导致所述多核苷酸的表达增加或减少；其中所述CRISPR复合物包含与杂交至所述多核苷酸内的靶序列的向导序列复合的CRISPR酶。
在一个方面，本公开主题提供用于使用CRISPR系统的一个或多个元件的方法。本公开主题的CRISPR复合物提供用于修饰靶多核苷酸的有效方式。本公开主题的CRISPR复合物具有多种多样的效用，包括修饰(例如，缺失、插入、转位、失活、激活)多种细胞类型中的靶多核苷酸。因此，本公开主题的CRISPR复合物在例如基因疗法、药物筛选、疾病诊断和预后中具有广泛范围的应用。示例性CRISPR复合物包含与杂交至靶多核苷酸内的靶序列的向导序列复合的CRISPR酶。
CRISPR复合物的靶多核苷酸可以是对真核细胞而言内源或外源的任何多核苷酸。例如，所述靶多核苷酸可以是驻留在真核细胞的核中的多核苷酸。所述靶多核苷酸可以是编码基因产物(例如，蛋白)的序列或非编码序列(例如，调节多核苷酸或垃圾DNA)。不希望受理论束缚，据信所述靶序列应当与PAM(前间区序列邻近基序)相关；也就是说，与由CRISPR复合物识别的短序列相关。对PAM的精确序列和长度要求取决于使用的CRISPR酶而不同，但PAM通常是临近前间区(也就是说，靶序列)的2-5个碱基对序列。在以下实施例部分中给出PAM序列的实例，并且技术人员将能够鉴定与给定CRISPR酶一起使用的另外的PAM序列。
靶多核苷酸的实例包括与信号传导生化途径相关的序列，例如信号传导生化途径相关的基因或多核苷酸。靶多核苷酸的实例包括疾病相关基因或多核苷酸。“疾病相关”基因或多核苷酸是指与非疾病对照的组织或细胞相比，在来源于疾病影响的组织的细胞中以异常水平或以异常形式产生转录或翻译产物的任何基因或多核苷酸。在改变的表达与疾病的出现和/或进展相关的情况下，其可以是以异常高的水平变得表达的基因；其可以是以异常低的水平变得表达的基因。疾病相关基因还指具有突变或直接负责或与负责疾病的病因学的基因连锁不平衡的遗传变异的基因。转录或翻译的产物可以是已知的或未知的，并且可以处于正常或异常水平。
本公开主题的实施方案还涉及与敲除基因、扩增基因以及修复与DNA重复不稳定性和神经病症相关的具体突变相关的方法和组合物(Robert D. Wells, TetsuoAshizawa, Genetic Instabilities and Neurological Diseases, 第2版, AcademicPress, Oct. 13, 2011-Medical)。已经发现串联重复序列的特定方面负责超过二十种人类疾病 (McIvor 等人(2010) RNA Biol. 7(5):551-8)。可以利用CRISPR-Cas系统以校正这些基因组不稳定性的缺陷。
在本公开主题的又另一个方面，CRISPR-Cas系统可以用来校正起因于几种基因突变的眼部缺陷，其进一步描述于Traboulsi, 编 (2012) Genetic Diseases of the Eye,第2版, Oxford University Press。
本公开主题的几个进一步方面涉及校正与广泛范围的遗传性疾病相关的缺陷。例如，遗传性脑病可以包括但不限于，肾上腺脑白质营养不良、胼胝体发育不全、艾卡尔迪综合征(Aicardi Syndrome)、阿尔佩斯病(Alpers' Disease)、阿尔茨海默氏病、巴特综合征(Barth Syndrome)、巴滕病(Batten Disease)、CADASIL、小脑变性、法布瑞氏病(Fabry'sDisease)、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、亨廷顿氏病和其他三联体重复障碍、莱氏病(Leigh's Disease)、莱施-奈恩综合征(Lesch-Nyhan Syndrome)、门克斯病(MenkesDisease)、线粒体肌病以及NINDS空洞脑(Colpocephaly)。
在一些实施方案中，所述病况可以是瘤形成。在一些实施方案中，所述病况可以是年龄相关性黄斑变性。在一些实施方案中，所述病况可以是精神分裂性障碍。在一些实施方案中，所述病况可以是三核苷酸重复障碍。在一些实施方案中，所述病况可以是脆性X综合征。在一些实施方案中，所述病况可以是分泌酶相关障碍。在一些实施方案中，所述病况可以是朊病毒相关障碍。在一些实施方案中，所述病况可以是ALS。在一些实施方案中，所述病况可以是药物成瘾。在一些实施方案中，所述病况可以是自闭症。在一些实施方案中，所述病况可以是阿尔茨海默氏病。在一些实施方案中，所述病况可以是炎症。在一些实施方案中，所述病况可以是帕金森氏病。
与帕金森氏病相关的蛋白的实例包括但不限于α-突触核蛋白、DJ-1、LRRK2、PINK1、帕金蛋白、UCHL1、Synphilin-1和NURR1。
成瘾相关蛋白的实例可以包括例如ABAT。
炎症相关蛋白的实例可以包括例如由Ccr2基因编码的单核细胞趋化蛋白-1(MCP1)、由Ccr5基因编码的C-C趋化因子受体类型5(CCR5)、由Fcgr2b基因编码的IgG受体IIB(FCGR2b，也称为CD32)或由Fcer1g基因编码的Fc ε R1g(FCER1g)蛋白。
心血管疾病相关蛋白的实例可以包括例如IL1B(白介素1，β)、XDH(黄嘌呤脱氢酶)、TP53(肿瘤蛋白p53)、PTGIS(前列腺素12(前列腺环素)合酶)、MB(肌红蛋白)、IL4(白介素4)、ANGPT1(血管生成素1)、ABCG8(ATP-结合盒，亚家族G(WHITE)，成员8)或CTSK(组织蛋白酶K)。
阿尔茨海默氏病相关蛋白的实例可以包括例如由VLDLR基因编码的极低密度脂蛋白受体蛋白(VLDLR)、由UBA1基因编码的泛素样修饰剂激活酶1(UBA1)或由UBA3基因编码的NEDD8-激活酶E1催化亚基蛋白(UBE1C)。
自闭症谱系障碍相关蛋白的实例可以包括例如由BZRAP1基因编码的苯二氮䓬受体(外周)相关蛋白1(BZRAP1)、由AFF2基因编码的AF4/FMR2家族成员2蛋白(AFF2)(也称为MFR2)、由FXR1基因编码的脆性X智力迟钝常染色体同系物1蛋白(FXR1)或由FXR2基因编码的脆性X智力迟钝常染色体同系物2蛋白(FXR2)。
黄斑变性相关蛋白的实例可以包括例如由ABCR基因编码的ATP-结合盒，亚家族A(ABC1)成员4蛋白(ABCA4)、由APOE基因编码的载脂蛋白E蛋白(APOE)或由CCL2基因编码的趋化因子(C-C基序)配体2蛋白(CCL2)。
精神分裂症相关蛋白的实例可以包括NRG1、ErbB4、CPLX1、TPH1、TPH2、NRXN1、GSK3A、BDNF、DISC1、GSK3B及其组合。
参与肿瘤抑制的蛋白的实例可以包括例如ATM(共济失调性毛细血管扩张突变的)、ATR(共济失调性毛细血管扩张和Rad3相关的)、EGFR(表皮生长因子受体)、ERBB2(v-erb-b2成红细胞白血病病毒癌基因同系物2)、ERBB3(v-erb-b2成红细胞白血病病毒癌基因同系物3)、ERBB4(v-erb-b2成红细胞白血病病毒癌基因同系物4)、Notch 1、Notch 2、Notch3或Notch 4。
与分泌酶障碍相关的蛋白的实例可以包括例如PSENEN(早老素增强子2同系物(秀丽隐杆线虫))、CTSB(组织蛋白酶B)、PSEN1(早老素1)、APP(淀粉样蛋白β(A4)前体蛋白)、APH1B(前咽缺陷1同系物B(秀丽隐杆线虫))、PSEN2(早老素2(阿尔茨海默氏病4))或BACE1(β-位点APP-切割酶1)。
与肌萎缩性脊髓侧索硬化症相关的蛋白的实例可以包括SOD1(超氧化物歧化酶1)、ALS2(肌萎缩性脊髓侧索硬化2)、FUS(在肉瘤中融合)、TARDBP(TAR DNA结合蛋白)、VAGFA(血管内皮生长因子A)、VAGFB(血管内皮生长因子B)以及VAGFC(血管内皮生长因子C)及其任何组合。
与朊病毒病相关的蛋白的实例可以包括SOD1(超氧化物歧化酶1)、ALS2(肌萎缩性脊髓侧索硬化2)、FUS(在肉瘤中融合)、TARDBP(TAR DNA结合蛋白)、VAGFA(血管内皮生长因子A)、VAGFB(血管内皮生长因子B)以及VAGFC(血管内皮生长因子C)及其任何组合。
与朊病毒病症中的神经变性病况相关的蛋白的实例可以包括例如A2M(α-2-巨球蛋白)、AATF(凋亡拮抗转录因子)、ACPP(前列腺的酸性磷酸酶)、ACTA2(平滑肌主动脉肌动蛋白α2)、ADAM22(ADAM金属肽酶结构域)、ADORA3(腺苷A3受体)或ADRA1D(α-1D肾上腺素能受体(Alpha-1D adrenergic receptor for Alpha-1D adrenoreceptor))。
与免疫缺陷相关的蛋白的实例可以包括例如A2M [α-2-巨球蛋白]；AANAT [芳烷基胺 N-乙酰转移酶]；ABCA1 [ATP-结合盒，亚家族A(ABC1)，成员1]；ABCA2 [ATP-结合盒，亚家族A(ABC1)，成员2]；或ABCA3 [ATP-结合盒，亚家族A(ABC1)，成员3]。
与三核苷酸重复障碍相关的蛋白的实例包括例如AR(雄激素受体)、FMR1(脆性X智力迟钝1)、HTT(亨廷顿蛋白)或DMPK(强直性肌营养不良蛋白激酶)、FXN(弗氏共济失调蛋白(frataxin))、ATXN2(共济失调蛋白2)。
与神经传递障碍相关的蛋白的实例包括例如SST(生长抑素)、NOS1(一氧化氮合酶1(神经元的))、ADRA2A(肾上腺素能的，α-2A-，受体)、ADRA2C(肾上腺素能的，α-2C-，受体)、TACR1(速激肽受体1)或HTR2c(5-羟色胺(血清素)受体2C)。
神经发育相关序列的实例包括例如A2BP1 (共济失调蛋白2-结合蛋白1)、AADAT(氨基己二酸氨基转移酶)，AANAT (芳烷基胺 N-乙酰转移酶)、ABAT (4-氨基丁酸氨基转移酶)、ABCA1 (ATP-结合盒，亚家族A(ABC1)，成员1)或ABCA13 (ATP-结合盒，亚家族A(ABC1)，成员13)。
可用本系统治疗的优选病况的进一步实例可以选自：艾卡迪-古铁雷斯综合征(Aicardi-Goutières Syndrome)；亚历山大病(Alexander Disease)；阿伦-赫恩登-达德利综合征(Allan-Herndon-Dudley Syndrome)；POLG相关障碍；α-甘露糖苷贮积症(II和III型)；阿尔斯特伦综合征(Alström Syndrome)；安格曼综合征(Angelman Syndrome)；共济失调-毛细血管扩张；神经元蜡样-脂褐质沉积症；β-地中海贫血；双侧视神经萎缩和1型(婴儿)视神经萎缩；视网膜母细胞瘤(双侧的)；卡纳万病(Canavan Disease)；脑-眼-面-骨骼综合征(Cerebrooculofacioskeletal Syndrome)1 [COFS1]；脑腱黄瘤病；科尼利亚迪兰吉综合征(Cornelia de Lange Syndrome)；MAPT相关障碍；遗传性朊病毒病；德拉韦综合征(Dravet Syndrome)；早期发病家族性阿尔茨海默氏病；弗里德赖希共济失调[FRDA]；多发性畸形；岩藻糖苷贮积症；福山(Fukuyama)先天性肌营养不良；半乳糖唾液酸贮积症；戈谢病(Gaucher Disease)；有机酸血症；噬血细胞淋巴组织细胞增生症；早衰综合征(Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome)；粘脂贮积症II；婴儿游离唾液酸贮积病；PLA2G6相关神经变性；耶韦尔和朗格-尼尔森综合征(Jervell and Lange-NielsenSyndrome)；交界型大疱性表皮松解；亨廷顿氏病；克拉伯病(Krabbe Disease)(婴儿的)；线粒体DNA相关雷吉综合征(Mitochondrial DNA-Associated Leigh Syndrome)和NARP；莱施-奈恩综合征(Lesch-Nyhan Syndrome)；LIS1相关无脑回畸形；洛氏综合征(LoweSyndrome)；槭糖尿病；MECP2成倍综合征；ATP7A相关铜转运障碍；LAMA2相关肌营养不良；芳基硫酸酯酶A缺乏；I、II或III型粘多糖贮积症；过氧化物酶体生物发生障碍，齐薇格谱系综合征(Zellweger Syndrome Spectrum)；伴随脑铁累积障碍的神经变性；酸性鞘磷脂酶缺乏；C型尼曼-皮克病；甘氨酸脑病；ARX相关障碍；尿素循环障碍；COL1A1/2相关成骨不全；线粒体DNA缺失综合征；PLP1相关障碍；佩里综合征(Perry Syndrome)；费伦-麦克德米德综合征(Phelan-McDermid Syndrome)；II型糖原贮积症(蓬佩病(Pompe Disease))(婴儿的)；MAPT相关障碍；MECP2相关障碍；1型肢近端型点状软骨发育不全(RhizomelicChondrodysplasia Punctata Type 1)；罗伯茨综合征(Roberts Syndrome)；桑德霍夫病(Sandhoff Disease)；辛德勒病(Schindler Disease)-1型；腺苷脱氨酶缺乏；史-伦-奥三氏综合征(Smith-Lemli-Opitz Syndrome)；脊髓性肌萎缩；婴儿发病脊髓小脑性共济失调；己糖胺酶A缺乏；1型致死性发育不良；胶原VI型相关障碍；I型乌谢尔综合征(UsherSyndrome)；先天性肌营养不良；沃尔夫-赫奇霍恩综合征(Wolf-Hirschhorn Syndrome)；溶酶体酸脂酶缺乏；和着色性干皮病。
II.表达和在体内调节GRNA表达的RNA核酶和可调节的适体酶。
本公开主题还涉及使用RNA核酶和可调节的适体酶来在体内表达和调节gRNA表达，特别是使用5'锤头核酶用于顺式加工具有不受限的第一核苷酸特异性的向导RNA和在体内通过RNA适体酶调节gRNA功能。
因此，本公开主题还提供适配子调节的核酶，其包含：a)顺式作用锤头核酶，其包含催化核心和由其延伸的螺旋I、螺旋II和螺旋III双链体区，其中螺旋II双链体区和螺旋III双链体区各自包含与所述催化核心相对的环区域，且其中所述螺旋II双链体区包含结合配体的适配子；b)编码CRISPR-Cas系统向导RNA(gRNA)的核苷酸序列，其中所述gRNA与真核细胞中的DNA分子的靶序列杂交，且其中所述DNA分子编码在所述真核细胞中表达的一种或多种基因产物，其中所述核苷酸序列包含5'末端和3'末端，且其中所述核苷酸序列的5'末端直接偶联至所述螺旋III双链体区；其中所述配体与所述适配子的结合产生核酶的构象变化，使得所述核酶经历在所述核苷酸序列的5'末端和所述螺旋III双链体区之间的自我切割，由此产生gRNA。还提供表达构建体，其包含：(i)编码序列，其当转录为RNA时产生适配子调节的核酶；和(ii)一种或多种转录调节序列，其调节真核细胞中的RNA的转录。还提供包含所述表达构建体的真核细胞。还提供改变真核细胞中的一种或多种基因产物的表达的方法，其中所述细胞包含编码一种或多种基因产物的DNA分子，所述方法包括将所述表达构建体引入所述细胞中，且使所述细胞与所述配体以改变核酶的活性的量接触，特别是其中所述细胞在哺乳动物或人主体中。在一个方面，所述配体是茶碱。
核酶是催化各种化学反应诸如自我切割或连接的RNA分子(Long和Uhlenbeck(1993) FASEB J. 7:25-30)。已经在病毒、类病毒和原生动物中鉴定了各种天然存在的核酶。在烟草环点类病毒(sTRSV)的卫星RNA中发现了第一种催化性RNA之一(De la Pena等人(2003) EMBO J. 22:5561-70)。在体内，这种致病性类病毒显示在复制期间顺式作用和自我切割。自从发现第一种核酶以来，已经鉴定并广泛表征了各种类型的天然核酶，包括发夹和锤头核酶。
锤头核酶(hRz)是最广泛研究的核酶之一(Long和Uhlenbeck (1993) Faseb J.7:25-30; Pley等人(1994) Nature 372:68-74; Hammann等人(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:5503-8; Blount和Uhlenbeck (2005)Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.34:415-40)。其由聚集在11个核苷酸(nt)的高度保守的催化核心上的三个螺旋区构成(Khvorova等人(2003) Nat. Struct.Biol.10:708-12;Salehi-Ashtiani和Szostak (2001) Nature 414:82-4)。切割是序列特异性的，并靶向5'-NUX-3'三联体，其中N是任何碱基，U是尿嘧啶，X是除鸟嘌呤以外的任何碱基。对于有效和快速切割最佳的NUX是GUC。当将来自切割位点的直接3'的X的2'羟基去质子化时，催化核酶切割。然后，这种亲核体攻击易裂开的磷酸酯，并通过五配位的三角双锥形过渡态产生5'和3'产物(Blount和Uhlenbeck (2005) Annu.Rev. Biophys.Biomol.Struct.34:415-40)。
假设hRz折叠成活性构象通过双重二价离子结合事件进行。高亲和力结合事件在500μM下发生，并调整(order)三级相互作用的第一集合。离子的第二低亲和力添加在10 mM下发生，并重构hRz茎取向，使得螺旋I远离螺旋III折叠并与螺旋II相互作用(Hammann等人(2001) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:5503-8)。具有不维持特定茎环的保守催化核心的HRz被称为最小锤头核酶(mhRz)。尽管mhRz在高二价离子浓度(10 mM)下具有活性，但在较低浓度下，mhRz是有效地惰性的(De la Pena等人(2003) EMBO J., 22:5561-70;Khvorova等人(2003) Nat. Struct.Biol.10:708-12)。天然hRz的晶体结构描绘了具有作为“接吻环(kissing loops)”相互作用的两个茎环的“Y”形分子(Pley等人(1994)Nature.372:68-74)。提出茎环中的未配对碱基之间的这些三级相互作用以稳定催化活性构象并消除高二价离子条件。研究人员已经证明通过将环重新引入mhRz设计中而在生物学相关的二价离子浓度(100-500μM)下恢复的体外催化活性(De la Pena等人(2003) EMBOJ.22:5561-70; Khvorova等人(2003) Nat. Struct.Biol.10:708-12; Canny等人(2004)J.Am. Chem.Soc.126:10848-9; Penedo等人(2004) RNA 10:880-8; Saksmerprome等人(2004) RNA 10:1916-24; Weinberg和Rossi (2005) FEBS Lett.579:1619-24)。通过阐明体内催化活性的设计规则，hRz现在准备成为基因表达的有效调节剂。
因此，锤头核酶含有核心，从核心延伸的三个茎。术语“茎”和“螺旋”在本文中可互换使用。因此，从核心延伸的三个茎在本文中称为茎I、茎II和茎III(或螺旋I、螺旋II和螺旋III)，和至少一个环，其位于来自核心的茎的相对末端。在顺式作用核酶的实施方案中，核酶含有两个环，一个位于茎II(或螺旋II)的末端，而另一个位于茎II(或螺旋III)的末端。
如本文所用，“顺式切割锤头核酶”是这样的锤头核酶，其在切割之前由单个多核苷酸构成。顺式切割锤头核酶能够切割自身。
茎(或螺旋)是从核酶核心延伸的核酸基序，其中至少一部分是双链的。在某些实施方案中，在来自核酶核心的茎的相对末端存在环，并且该环连接双链茎的两条链。在某些实施方案中，茎包含2至20个互补碱基对。在某些实施方案中，茎包含3、4、5、6、7、8或9个互补碱基对。
在某些实施方案中，茎中至少30％的核苷酸是互补碱基对的一部分。剩余的碱基对可以是错配的、非互补碱基对，或者可以是凸起的一部分。在某些实施方案中，茎中至少40%的核苷酸是互补碱基对的一部分。在某些实施方案中，茎中至少50%的核苷酸是互补碱基对的一部分。在某些实施方案中，茎中至少60%的核苷酸是互补碱基对的一部分。在某些实施方案中，茎中至少70%的核苷酸是互补碱基对的一部分。在某些实施方案中，茎中至少80%的核苷酸是互补碱基对的一部分。在某些实施方案中，茎中至少90%的核苷酸是互补碱基对的一部分。在某些实施方案中，茎中至少95%的核苷酸是互补碱基对的一部分。在某些实施方案中，茎中至少99%的核苷酸是互补碱基对的一部分。在某些实施方案中，茎中100%的核苷酸是互补碱基对的一部分。
环是这样的核苷酸序列，其不与另一链配对且位于与核心相对的茎的远端。在某些实施方案中，环长度为1至20个核苷酸。在某些实施方案中，环长度为2至10个核苷酸。在某些实施方案中，环长度为3至8个核苷酸。环根据其附接的茎编号。因此，环I位于与核心相对的茎I的末端，环II位于与核心相对的茎II的末端，且环III位于与核心相对的茎III的末端。
如本文所用，“茎/环”是指整个茎(或螺旋)，连同该茎内的任何凸起和在茎的末端的环。例如，茎/环II包括茎II，包括茎II内的任何凸起，和环II。如果茎缺乏环，则茎/环是指茎，连同该茎内的任何凸起。如本文所用，“凸起”是这样的核苷酸序列，其不与另一链配对且在两侧上侧接双链核酸序列。在某些实施方案中，凸起位于茎内。当凸起位于茎内时，所述凸起的核苷酸被认为是茎的一部分。在某些实施方案中，锤头核酶包含多于一个凸起。在某些实施方案中，茎内的凸起位于距核心两个碱基对处。在某些实施方案中，所述茎的一条或两条链含有凸起。
如本文所用，编码CRISPR-Cas系统gRNA的核苷酸序列包含5'末端和3'末端，并且核苷酸序列的5'末端直接偶联至螺旋III双链体区。“直接偶联”意指环，相对于不存在适配子的活性核酶结构，在环的两个残基之间的仅一个骨架磷酸二酯键处中断，所述骨架磷酸二酯键被替换为与适配子的5'和3'末端的磷酸二酯键。在适配子调节的核酶的活性形式中，信息传递结构域的5'和3'残基与彼此碱基配对以形成双链体区域，以便保持否则中断的环的结构。
本文中的“配体”或“分析物”或语法等同物意指待检测的任何分子或化合物，并且其可以如本文所述与待设计和/或选择的适配子相互作用。合适的配体或分析物包括但不限于小的化学分子诸如环境或临床化学品，污染物或生物分子，包括但不限于杀虫剂，杀昆虫剂，毒素，治疗和滥用药物，激素，抗生素，抗体，有机材料等。合适的生物分子包括但不限于蛋白(包括酶、免疫球蛋白和糖蛋白)，核酸，脂质，凝集素，碳水化合物，激素，全细胞(包括原核细胞(诸如致病性细菌)和真核细胞，包括哺乳动物肿瘤细胞)，病毒，孢子等。作为蛋白的说明性分析物包括但不限于酶；药物；细胞；抗体；抗原；细胞膜抗原和受体(神经、激素、营养物和细胞表面受体)或其天然配体。
锤头核酶(hRz)是能够维持磷酸二酯键的反式或顺式切割的RNA基序。顺式作用锤头核酶(chRz)是催化性RNA，其经历其自身骨架的自我切割以产生两种RNA产物。顺式作用锤头核酶三个碱基配对的茎和切割所需的残基的高度保守核心。切割反应通过攻击附接至同一残基的3'碳的磷原子上的催化位点胞嘧啶的2'羟基氧而进行。这破坏糖磷酸酯骨架并产生2′,3′环磷酸酯。
自我切割反应所需的最小锤头序列包括约13个保守或不变的“核心”核苷酸，其中大部分不参与形成经典的Watson-Crick碱基对。核心区域侧接茎I、II和III，其通常由经典的Watson-Crick碱基对组成，但否则不受序列约束。
反式作用锤头核酶(thRz)的切割特异性由核酶的杂交臂控制，其以互补方式与底物退火并且直接切割易裂开的磷酸二酯键。该活性被特异性指向在裂解三联体的第三个核苷酸之后发生。
本公开主题提供适配子调节的反式作用锤头核酶和适配子调节的顺式作用锤头核酶。本适配子调节的thRz和chRz是通用类型的核酶，其可以容易地工程改造以响应于多种配体，并且可用于许多应用中。例如，适配子调节的thRz和chRz可以设计为以配体依赖性方式调节靶基因的活性，因此可用于调节内源或异源基因的表达。
核酶结构域(本文也称为效应子结构域)可以具有至少两种构象状态，即“关闭”状态和“开启”状态，其由其经历自我切割(在chRz的情况下)或切割靶序列(在thRz的情况下)的活性水平(例如反应速率)定义。本公开主题的效应子结构域可以响应于配体与适配子结构域的结合而在它们的“开启”和“关闭”构象状态之间切换。因此，本公开主题的适配子调节的核酶用作开关，其活性响应于配体结合而“开启”和“关闭”。在某些实施方案中，核酶结构域的功能明显取决于配体的存在或不存在，或者可以显示更多的剂量-响应，如对可用于结合适配子结构域的配体的浓度的依赖性。
适配子结合且因此核酶受调节的配体的选择是广泛的。在某些情况下，所述配体是具有小于2500amu的分子量的小分子。仅仅为了举例说明，这些可以是天然或非天然存在的分子，包括肽、小有机分子(包括药物和某些代谢物和中间体、辅因子等)和金属离子。结合适配子的示例性配体包括但不限于小分子，诸如药物、代谢物、中间体、辅因子、过渡态类似物、离子、金属、核酸和毒素。适配子还可以结合天然和合成聚合物，包括蛋白、肽、核酸、多糖、糖蛋白、激素、受体和细胞表面诸如细胞壁和细胞膜。配体与适配子(通常为RNA)的结合改变与信息传递结构域(其随着核酶结构域中的结构改变而移行(carried over))的碱基配对，并改变其介导磷酸二酯键的切割(自我切割或靶序列的切割)的能力。因此，配体结合影响效应子结构域例如介导基因失活、转录、翻译或以其他方式干扰靶基因或mRNA的正常活性的能力。
适配子最通常通过针对靶分子的结合体外选择而获得。然而，适配子的体内选择也是可能的。适配子具有能够在其中相同环境中的其他物质不与核酸复合的环境中与预期靶分子形成复合物的特异性结合区。结合的特异性在与适配子对于环境中的其他材料或通常无关分子的解离常数相比适配子对于其配体的比较解离常数(Kd)的方面来定义。配体是以比无关材料更大的亲和力结合适配子的配体。通常，适配子相对于其配体的Kd是适配子与环境中的无关材料或伴随物质的Kd的至少约1/10。甚至更优选地，Kd是至少约1/50，更优选至少约1/100，最优选至少约1/200。适配子通常长度为约10至约300个核苷酸。更通常地，适配子长度为约30至约100个核苷酸。
容易制备结合多种分子的适配子。这些分子各自可以使用本公开主题的方法用作相关核酶的调节剂。例如，有机分子、核苷酸、氨基酸、多肽、细胞表面上的目标特征、离子、金属、盐、糖都已经显示适合于分离可以特异性结合相应配体的适配子。例如，有机染料诸如Hoechst 33258已经成功地用作用于体外适配子选择的靶配体(Werstuck和Green(1998) Science 282:296-298)。其他小有机分子如多巴胺、茶碱、磺酰罗丹明B和纤维二糖也已经用作适配子分离中的配体。还已经分离了抗生素诸如卡那霉素A、利维霉素、妥布霉素、新霉素B、紫霉素、氯霉素和链霉素的适配子。对于识别小分子的适配子的综述，参见Famulok (1999) Science 9:324-9。
在某些实施方案中，本公开主题的适配子调节的核酶的适配子的配体是细胞可渗透的小有机分子。对翻译没有一般抑制作用的小有机分子优选作为配体。小分子优选还表现出足以实现所需水平的翻译抑制的体内持续性。还可以筛选分子以鉴定在例如口服施用之后是生物可利用的那些。在本公开主题的某些实施方案中，所述配体是无毒的。所述配体可以任选地是药物，包括例如类固醇。然而，在控制基因表达的一些方法中，优选的是，所述配体是药理学惰性的。在一些实施方案中，所述配体是其在细胞中的存在指示疾病或病理状况的多肽。在其他实施方案中，适配子的配体是抗生素，诸如氯霉素。在一个替代实施方案中，所述适配子的配体是有机染料，诸如Hoeschst染料33258。在又另一个实施方案中，所述配体可以是金属离子。在一个具体实施方案中，适配子调节的核酸的适配子结构域响应于与咖啡因的结合。
通常通过采用已知的称为SELEX的体内或体外(最通常，体外)选择技术(Ellington等人(1990) Nature 346, 818-22；和Tuerk等人(1990) Science 249, 505-10)来开发结合特定配体的适配子。制备适配子的方法也描述于，例如，美国专利号5,582,981; PCT公开号WO 00/20040; 美国专利号5,270,163; Lorsch和Szostak (1994)Biochemistry 33:973; Mannironi等人(1997) Biochemistry 36:9726; Blind (1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96:3606-3610; Huizenga和Szostak (1995) Biochemistry34:656-665; PCT公开号WO 99/54506、WO 99/27133、WO 97/42317和美国专利号5,756,291。
通常，以其最基本的形式，用于鉴定适配子的体外选择技术涉及首先制备所需长度的寡核苷酸的大合并物，所述寡核苷酸含有至少一些随机化或诱变的区域。例如，用于适配子选择的普通寡核苷酸合并物可能含有20-100个随机化核苷酸的区域，其在两端侧接可用于PCR引物结合的限定序列的约15-25个核苷酸长区域。使用标准PCR技术扩增寡核苷酸合并物，尽管可以采用允许所选核酸序列的忠实、有效的扩增的任何方式。然后将DNA合并物体外转录以产生RNA转录物。RNA转录物然后可以进行亲和色谱法，尽管可以使用允许基于核酸特异性结合另一分子(例如蛋白或任何靶分子)的能力来选择核酸的任何方案。在亲和色谱法的情况下，将转录物最通常通过柱或与其上已固定有靶配体的磁珠等接触。合并物中与配体结合的RNA分子保留在柱或珠上，而洗掉非结合序列。然后将结合配体的RNA分子逆转录并通过PCR(通常在洗脱后)再次扩增。然后将所选合并物序列通过另一轮相同类型的选择。通常，将合并物序列通过总共约三至十个迭代轮的选择程序。然后使用标准程序扩增、克隆和测序cDNA，以鉴定能够充当靶配体的适配子的RNA分子的序列。一旦已经成功鉴定了适配子序列，就可以通过进行额外轮的从包含诱变的适配子序列的寡核苷酸合并物开始的选择来进一步优化适配子。为了用于本公开主题，优选在模拟正常生理条件的盐浓度和温度存在的情况下选择适配子用于结合配体。
技术人员通常可以选择合适的配体，而不考虑适配子是否可用。在大多数情况下，可以获得由一些本领域普通技术人员选择的结合配体的适配子。体外选择方法的独特性质允许分离结合所需配体的合适适配子，尽管完全缺乏关于什么类型的结构可能结合所需配体的现有知识。
对于适合用于本公开主题的适配子，适配子对配体的结合亲和力必须足够强，并且当适配子与其配体结合时形成的结构必须足够显著，以便将本公开主题的适配子调节的核酶在“开启”和“关闭”状态之间切换，或调节适配子调节的核酶的功能水平。
适配子和相关配体的缔合常数优选使得配体发挥功能以结合适配子，并且在施用配体后获得的配体浓度下具有所需效果。对于体内使用，例如，缔合常数应当使得结合在低于血清或其他组织中可以实现的配体浓度下良好发生。优选地，体内使用所需的配体浓度也低于可以对生物体具有不期望的效果的浓度。
因此，某些实施方案提供了设计和选择响应于一种或多种预选或预定配体的适配子或适配子结构域的方法。也可以“调节”本发明的适配子调节的核酶，使得它们的切换行为或多或少地响应于配体结合。也可以“调节”适配子调节的核酶，使得适配子结构域的结合亲和力或多或少对其配体敏感。例如，可以改变适配子-调节的核酶中的分子内双链体形成的热力学性质和其他2°和3°结构，使得适配子结构域或多或少适合于配体结合，即，诸如可以在解离常数(Kd)或其他动力学参数(诸如Kon和Koff速率)中显现。或者，在杂交和可影响核酶结构域的2°和3°结构的其他分子内相互作用的改变后，核酶结构域的变构变化可以或多或少响应于配体结合。用于改变核酸结构的热力学特性的正向工程改造策略是本领域中众所周知的。例如，增加的互补核酸配对可以增加核酶结构域或适配子结构域的稳定性。
III.用于治疗神经变性疾病的方法
本公开主题还提供用于治疗神经变性疾病、病症或病况的方法。在一些实施方案中，本公开主题提供用于在有需要的主体中治疗眼部神经变性疾病的方法，所述方法包括：(a)提供包含一种或多种载体的非天然存在的CRISPR-Cas系统，所述载体包含：i)H1启动子，其可操作连接至编码CRISPR-Cas系统向导RNA(gRNA)的至少一个核苷酸序列，其中所述gRNA与所述主体的细胞中的DNA分子的靶序列杂交，且其中所述DNA分子编码在所述细胞中表达的一种或多种基因产物；和ii)在细胞中可操作的调节元件，其可操作连接至编码Cas9蛋白的核苷酸序列，其中组件(i)和(ii)位于所述系统的相同或不同的载体上，其中所述gRNA靶向所述靶序列且与所述靶序列杂交，且所述Cas9蛋白切割DNA分子以改变一种或多种基因产物的表达；和(b)向所述主体施用有效量的所述系统。
“神经变性疾病、病症或病况”意指与神经元或其他神经细胞诸如视网膜感光细胞的变性或功能障碍相关的疾病、病症或病况(包括神经病)。神经变性疾病、病症或病况可以是其中可发生神经元的功能降低或功能障碍或神经元或其他神经细胞的损失的任何疾病、病症或病况。
此类疾病、病症或病况包括但不限于青光眼和神经系统的神经变性疾病、病症或病况，诸如以下或与之相关：肌萎缩性脊髓侧索硬化(ALS)、三叉神经痛、舌咽神经痛、贝尔氏麻痹、重症肌无力、肌营养不良、进行性肌萎缩、原发性脊髓侧索硬化(PLS)、假性延髓性麻痹、进行性延髓性麻痹、脊髓性肌萎缩、 遗传性肌萎缩、无脊椎动物盘综合征、颈椎病、神经丛障碍、胸廓出口破坏综合征、外周神经病、卟啉病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病、帕金森氏病、帕金森氏病叠加病、多系统萎缩、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、具有路易小体的痴呆、额颞叶痴呆、脱髓鞘性疾病、吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barre syndrome)、多发性硬化、 腓骨肌萎缩症、朊病毒病、克雅二氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)、Gerstmann-Straussler-Scheinker综合征(GSS)、致死性家族失眠症(FFI)、牛海绵状脑病(BSE)、皮克氏病、癫痫、和AIDS痴呆复合征。
神经系统的其他神经变性疾病、病症或病况，诸如以下或与之相关：酒精中毒、亚历山大氏病、阿尔佩氏病、共济失调毛细血管扩张症、Batten病(也称为Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten病)、卡纳万病、科凯恩氏综合征、糖尿病性神经病变、额颞叶变性、HIV相关性痴呆、肯尼迪氏病、克腊伯氏病、神经轴突病(neuroborreliosis)、Machado-Joseph病(3型脊髓小脑性共济失调)，湿性或干性黄斑变性、尼曼皮克病、Pelizaeus-Merzbacher病、光感受器变性疾病诸如视网膜色素变性和相关疾病、Refsum氏病、Sandhoff氏病、Schilder氏病、继发于恶性贫血的脊髓的亚急性联合变性、Spielmeyer-Vogt- Sjogren-Batten病(也称为Batten病)、脊髓小脑性共济失调(具有不同特征的多种类型)、Steele-Richardson-Olszewski病和脊髓痨。
眼相关神经变性的实例包括但不限于青光眼、格子状角膜营养不良、视网膜色素变性、年龄相关性黄斑变性(AMD)、与湿性或干性AMD相关的感光器变性、其他视网膜变性诸如视网膜色素变性(RP)、视神经脉络膜小疣、视神经病变和视神经炎，诸如由多发性硬化症引起的视神经炎。在一些实施方案中，所述眼部神经变性疾病选自青光眼、视网膜变性和年龄相关性黄斑变性。在一些实施方案中，所述眼部神经变性疾病是视网膜色素变性(RP)。
可以根据本公开主题预防和治疗的不同类型的青光眼的非限制性实例包括原发性青光眼(也称为原发性开角型青光眼，慢性开角型青光眼，慢性单纯性青光眼和单纯性青光眼)，低眼压性青光眼，原发性闭角型青光眼 (也称为原发性闭角型青光眼，狭角性青光眼，孔阻滞性青光眼，和急性充血性青光眼)，急性闭角型青光眼，慢性闭角型青光眼，间歇性闭角型青光眼，慢性闭角型开角青光眼(chronic open-angle closure glaucoma)，色素性青光眼，剥脱性青光眼 (也称为假性剥脱性青光眼或囊膜性青光眼)，发育性青光眼(例如，原发性先天性青光眼和婴幼儿型青光眼)，继发性青光眼(例如，炎性青光眼(例如，葡萄膜炎和Fuchs异色性虹膜睫状体炎)，晶状体源性青光眼(例如，带有成熟白内障的闭角型青光眼，继发于晶状体囊破裂的晶状体过敏性青光眼，由于晶状体毒性网络堵塞和晶状体不全脱位导致的晶状体溶解性青光眼)，继发于眼内出血的青光眼(例如，眼前房出血和溶血性青光眼，也称为红细胞破碎青光眼)，外伤性青光眼(例如，房角退缩性青光眼，前房角上外伤性退缩，术后青光眼，无晶状体性瞳孔阻滞和睫状环阻塞性青光眼)，新生血管性青光眼，药物诱导的青光眼(例如，皮质类固醇诱导的青光眼和α-胰凝乳蛋白酶青光眼)，毒性青光眼和与眼内肿瘤相关的青光眼，视网膜脱落，眼的严重化学烧伤，和虹膜萎缩。在某些实施方案中，所述神经变性疾病、病症或病况是与过度血管生成无关的疾病、病症或病况，例如不是新生血管性青光眼的青光眼。
如本文所用，术语“病症”通常是指将受益于用针对鉴定的目标或途径之一的化合物治疗的任何病况，包括可以通过有效量的针对鉴定的目标或途径之一的化合物或其药学上可接受的盐治疗的任何疾病、病症或病况。
如本文所用，术语“治疗”可以包括逆转、减轻、抑制此类术语适用的疾病、病症或病况或此类疾病、病症或病况(例如，引起视网膜感光细胞功能障碍和/或死亡的疾病或病症)的一种或多种症状或表现的进展，预防或降低其可能性。在一些实施方案中，所述治疗降低视网膜感光细胞的功能障碍和/或死亡。例如，与经历治疗之前的主体中或未经历治疗的主体中的视网膜感光细胞的功能障碍和/或死亡相比，所述治疗可以使视网膜感光细胞的功能障碍和/或死亡降低至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、33%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、66%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多。在一些实施方案中，所述治疗完全抑制主体中的视网膜感光细胞的功能障碍和/或死亡。如本文所用，“视网膜感光细胞”是在视网膜中发现的能够光转导的专门类型的神经元。在一些实施方案中，至少一种基因产物是视紫红质。
在一些实施方案中，在施用于所述主体之前，将所述系统包装至单个腺相关病毒(AAV)颗粒中。在一些实施方案中，施用于所述主体通过视网膜下注射发生。所述治疗、施用或疗法可以是连续的或间歇的。连续治疗、施用或疗法是指在至少每天的基础上治疗，而治疗不中断一天或多天。间歇治疗或施用，或以间歇方式治疗或施用，是指性质上不是连续的、而是周期的治疗。根据本公开的方法的治疗可以导致从疾病、病症或病况的完全缓解或治愈，或者所述疾病的一种或多种症状、所述疾病或病况的部分改善，并且可以是暂时的或永久的。术语“治疗”还意欲涵盖预防、疗法和治愈。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以实现有益或期望结果的药剂的量。治疗有效量可以根据以下中的一种或多种而变化：所治疗的主体和疾病状况，主体的体重和年龄，疾病状况的严重性，施用方式等，其可以通过本领域普通技术人员容易地确定。该术语还适用于将通过本文所述的任何一种成像方法为检测提供图像的剂量。具体剂量可以根据以下中的一种或多种而变化：选择的具体药剂，待遵循的给药方案，其是否与其他化合物组合施用，施用时机，待成像的组织以及携带其的物理递送系统。
术语“主体”和“患者”在本文中可互换使用。通过本公开的方法在其许多实施方案中治疗的主体理想地是人主体，但应当理解，本文所述的方法关于旨在包括于术语“主体”中的所有脊椎动物物种是有效的。因此，“主体”可以包括用于医学目的，诸如现有病况或疾病的治疗或用于预防病症或疾病发作的预防性治疗的人主体，或用于医学、兽医目的或发展目的的动物主体。合适的动物主体包括哺乳动物，包括但不限于灵长类动物，例如人、猴、猿等；牛科动物，例如牛、公牛等；绵羊类，例如绵羊等；山羊类，例如山羊等；猪类，例如猪、大猪等；马科动物，例如马、驴、斑马等；猫科动物，包括野生猫和家猫；犬科动物，包括狗；兔类动物，包括兔、野兔等；和啮齿动物，包括小鼠、大鼠等。动物可以是转基因动物。在一些实施方案中，所述主体是人，包括但不限于胎儿、新生儿、婴儿、青少年和成年主体。此外，“主体”可以包括患有或疑似患有病况或疾病的患者。
IV. 一般定义
尽管本文采用特定术语，但它们仅在一般和描述性意义上、而不是为了限制的目的来使用。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所述主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
遵循长期专利法惯例，当在本申请(包括权利要求)中使用时，术语“一个/种(a)”，“一个/种(an)”和“该(the)”是指“一个/种或多个/种”。因此，例如，对“主体”的提及包括多个主体，除非上下文清楚地是相反的(例如，多个主体)等等。
在整个说明书和权利要求中，术语“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”在非排他的意义上使用，除非上下文另有要求。同样，术语“包括”及其语法变体旨在是非限制性的，使得列表中的项目的列举不排除可以替换或添加至所列项目的其他类似项目。
为了本说明书和所附权利要求的目的，除非另有说明，在说明书和权利要求中使用的表示量、尺寸、维度、比例、形状、制剂、参数、百分比、参数、量、特征的所有数字和其他数值，应当理解为在所有情况下由术语“约”修饰，即使术语“约”可能没有明确地与所述值、量或范围一起出现。因此，除非相反地指出，以下说明书和所附权利要中记载的数值参数不是且不必是精确的，但可以如期望是近似和/或更大或更小，反映公差、转换因子、舍入值、测量误差等以及本领域技术人员已知的其他因素，这取决于寻求由本公开主题所获得的期望特性。例如，当提及值时，术语“约”可以意欲包括在一些实施方案中±100％、在一些实施方案中±50％、在一些实施方案中±20％、在一些实施方案中±10％、在一些实施方案中±5％、在一些实施方案中±1％、在一些实施方案中±0.5％且在一些实施方案中±0.1％的从指定量的变化，因为此类变化适于进行公开的方法或使用公开的组合物。
此外，当与一个或多个数字或数字范围结合使用时，术语“约”应当被理解为是指所有此类数字，包括范围内的所有数字，并且通过延伸所述数值上方和下方的边界来修饰该范围。通过端点记载数值范围包括所有数字，例如包含在该范围内的全部整数(包括其分数)(例如，1至5的记载包括1、2、3、4和5以及其分数，例如1.5、2.25、3.75、4.1等)和该范围内的任何范围。
实施例
已经包括以下实施例以向本领域普通技术人员提供指导以实施本公开主题的代表性实施方案。鉴于本公开和本领域的一般技术水平，技术人员可以理解，以下实施例仅旨在是示例性的，并且在不脱离本公开主题范围的情况下可以采用许多改变、修饰和变化。以下的合成描述和具体实施例仅意在用于举例说明的目的，并且不应解释为以任何方式限制通过其他方法制备本公开的化合物。
实施例1
方法
质粒构建：为了生成表达H1 gRNA的构建体(参见下表1、2和3)，将重叠寡核苷酸组装以产生融合至76bp gRNA支架和pol III终止信号的H1启动子。在H1启动子和gRNA支架之间，将BamHI位点并入以允许靶向序列的插入。然后将H1::gRNA支架::pol III终止子序列TOPO克隆入pCR4-Blunt (Invitrogen, Carlsbad, CA)，并测序验证；所得载体为相反取向(参见下文)。为了生成本研究中使用的各种gRNA，将重叠寡核苷酸退火，并通过PCR使用两步扩增Phusion Flash DNA聚合酶(Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL)扩增，随后使用与2X体积25％ PEG和1.5M NaCl混合的羧化物修饰的Sera-Mag磁珠(Thermo FisherScientific)纯化。然后将纯化的PCR产物重悬浮于H2O中，并使用NanoDrop 1000 (ThermoFisher Scientific)定量。使用Gibson Assembly (New England Biolabs, Ipswich, MA)(Gibson等人(2009) Nature Methods 6:343-345)以AflII消化的用于U6表达的质粒(#41824, Addgene, Cambridge MA)或仅对于H1表达描述的质粒的BamHI消化的轻微改良形式产生表达gRNA的构建体。总反应体积从20μl减少至2μl。
细胞培养：通过根据前面描述的方案(Walker等人(2010) Nat. Commun.1:71;Maruotti等人(2013) Stem Cells Translational Medicine 2:341-354)在10% CO2/5% O2培养箱中在mTeSR1培养基(Stem Cell Technologies, Vancouver, BC)中的生长因子减少的Matrigel(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)上克隆繁殖来维持hESC系H7和IMR-90 iPS细胞(WiCell, Madison WI)。为了传代，首先将hESC集落与mTesR1中的5μMblebbistatin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)孵育，然后在用Accutase (Sigma-Aldrich)处理5-10分钟之后收集。将细胞块轻轻地离解成单细胞悬浮液，并通过离心沉淀。此后，将hPSC重悬浮于具有blebbistatin的mTeSR1中，并以约1,000-1,500个细胞/cm2铺板。传代之后两天，用mTeSR1(无blebbistatin)替换培养基并每日更换。
将人胚胎肾(HEK)细胞系293T(Life Technologies, Grand Island, NY)在37℃、5% CO2/20% O2下在补充有10％胎牛血清(Gibco, Life Technologies, Grand Island,NY)和2mM GlutaMAX (Invitrogen)的Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM)中维持。
H7细胞的基因靶向：在电穿孔前24小时，在10μM Rho激酶抑制剂(DDD00033325,EMD Millipore, Billerica, MA)中培养hESC细胞。使用Neon试剂盒(Invitrogen)根据制造商的说明进行电穿孔。简而言之，在电穿孔当天，将hESC用Accutase (Sigma-Aldrich)消化1-2分钟，直至集落转移。重要的是，集落不解离成单细胞悬浮液。收集集落之后，将湿沉淀物在冰上保持15分钟，然后重悬浮于含有基因靶向质粒的电穿孔缓冲液中。电穿孔参数如下：电压：1400 ms；时间间隔：30 ms；1个脉冲。电穿孔后，将细胞集落缓慢转移至含有10μM Rho激酶抑制剂的mTeSR1培养基中，然后在室温下保持20分钟，然后铺板在Matrigel包被的培养皿上并进一步培养。
为了分析克隆来源的集落，将电穿孔的hESC生长至亚汇合，如前面段落中所述传代，并以500个细胞/每35mm皿的密度铺板。随后，通过手工挑选分离单个集落并进一步培养。
对于293T细胞转染，在转染前24小时将约100,000个细胞/孔接种在24孔板(Falcon, Corning, NY)中。使用Lipofectamine LTX Plus试剂(Invitrogen)根据制造商推荐的方案一式四份转染细胞。对于24孔板的每个孔，将400ng Cas9质粒和200ng gRNA质粒与0.5μl Plus试剂和1.5μl Lipofectamine LTX试剂混合。
组成型表达的GFP ESC系的生成：将H7人ESC系(WiCell)保持在Matrigel基质上的mTeSR1 (Stem Cell Technologies)培养基中。在细胞传代前，将细胞进行用blebbistatin的短暂预处理(> 5分钟)以增加细胞活力，用Accutase处理7分钟，研磨成单细胞悬浮液，用等体积的mTesR猝灭，以80xg离心5分钟，重悬浮于含有blebbistatin的mTesR中。将1x106个细胞沉淀，小心去除培养基，并将细胞置于冰上10-15分钟。将R缓冲液中的10μg含有与AAVS1安全港(safe-harbor)基因座的同源性的AAV-CAGGSEGFP供体载体(#22212,Addgene)加上5μg各hAAVS1 1R + L TALENs (#35431和35432, Addgene)(Hockemeyer等人(2009) Nat. Biotechnol. 27:851-857; Sanjana等人(2012) Nature Protocols 7:171-192)使用Neon转染系统(Life Technologies)以100μl尖端型(tip-type)用以下参数电穿孔：1500V，20ms脉冲和1脉冲。然后将细胞轻轻地添加至1ml培养基，并在室温下孵育15分钟，然后铺板在含有mTeSR和5μM blebbistatin的Matrigel包被的35mm皿上。2天之后，以1x104的密度接种细胞，之后，用荧光配备的Nikon TS100落射荧光显微镜手动选择时间稳定的克隆亚系。
基因组修饰的Surveyor测定和测序分析：对于Surveyor分析，通过将细胞重悬浮于QuickExtract溶液(Epicentre, Madison, WI)中、在65℃下孵育15分钟、然后在98℃下孵育10分钟来提取基因组DNA。提取物溶液使用DNA Clean and Concentrator (ZymoResearch, Irvine, CA)清洗并通过NanoDrop (Thermo Fisher Scientific)定量。使用Phusion DNA聚合酶(New England Biolabs)从100ng基因组DNA扩增围绕CRISPR靶位点的基因组区域。合并多个独立的PCR反应物，并使用Qiagen MinElute Spin Column根据制造商的方案(Qiagen, Valencia, CA)纯化。将含有12.5mM Tris-HCl (pH 8.8)、62.5mM KCl和1.875mM MgCl2中的400ng PCR产物的8μl体积变性并缓慢再退火以允许形成异源双链体：95℃持续10分钟，以-1.0℃/秒从95℃斜变至85℃，85℃持续1秒，以-1.0℃/秒从85℃斜变至75℃，75℃持续1秒，以-1.0℃/秒从75℃斜变至65℃，65℃持续1秒，以-1.0℃/秒从65℃斜变至55℃，55℃持续1秒，以-1.0℃/秒从55℃斜变至45℃，45℃持续1秒，以-1.0℃/秒从45℃斜变至35℃，35℃持续1秒，以-1.0℃/秒从35℃斜变至25℃，然后保持在4℃。将1μlSurveyor Enhancer和1μl Surveyor Nuclease (Transgenomic, Omaha, NE)添加至每个反应物，在42℃下孵育60分钟，其后将1μl终止溶液添加至反应物。使用DNA 1000芯片(Agilent, Santa Clara, CA)在2100 Bioanalyzer上定量1μl反应物。对于凝胶分析，将2μl 6X上样缓冲液(New England Biolabs)添加至剩余的反应物，并上样至含有溴化乙锭的3％琼脂糖凝胶上。将凝胶在Gel Logic 200成像系统(Kodak, Rochester, NY)上可视化，并使用ImageJ v. 1.46定量。使用二项式推导的方程计算NHEJ频率：
%基因修饰=
其中“a”和“b”的值等于背景减去之后的切割片段的积分面积，且“c”等于背景减去之后的未切割PCR产物的积分面积(Guschin等人(2010) Methods in Molecular Biology649:247-256)。
流式细胞术：在blebbistatin处理之后，通过Accutase处理收获亚汇合的hESC集落，离解成单细胞悬浮液并沉淀。然后将细胞重悬浮于含有Vybrant DyeCycle红宝石染料(Invitrogen)的活细胞溶液(Invitrogen)中，并在Accuri C6流式细胞仪(BDBiosciences)上分析。
定量实时qPCR：在转染前24小时，将293T细胞以250,000个细胞/孔接种于12孔板(Falcon)中。使用Lipofectamine LTX与Plus Reagent (Invitrogen)根据制造商推荐的方案以每孔中用gRNA质粒的6剂量滴定一式三份转染细胞：0 ng、31.25ng、62.5ng、125ng、250ng或500ng。转染后48小时，使用RNAzol RT (Molecular Research Center,Cincinnati, OH)分离总RNA，并使用Direct-zol RNA MiniPrep (Zymo)纯化。将500ng总RNA以dsDNase (ArticZymes; Plymouth Meeting, PA USA)处理以去除残余的基因组DNA污染，并使用Superscript III逆转录酶(Invitrogen)遵循制造商的推荐在20μl反应中逆转录。对于每个反应，使用0.1μM以下寡核苷酸以引发每个反应；gRNA支架-
CTTCGATGTCGACTCGAGTCAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC(SEQ ID NO:1), U6 snRNA-AAAATATGGAACGCTTCACGAATTTG (SEQ ID NO:2)。加下划线的支架序列表示为转录物稳定性添加的锚定序列。在Biorad CFX 96实时PCR仪中在10μl体积中使用含有250nM寡核苷酸引物的SsoAdvanced™ Universal SYBR® Green Supermix (Biorad)和1微升的来自上述的RT反应产物的1:15稀释物进行每个qPCR反应。反应进行40个循环，其中95℃变性，54℃退火温度和60℃延伸步骤。以下引物分别用于检测向导RNA和参考基因：F1for-
GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAA (SEQ ID NO:3)和guideRNAscaffrev-
AAGCACCGACTCGGTGCCAC (SEQ ID NO:4)和U6snRNAF-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT (SEQID NO:5)和U6snRNARev- ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC (SEQ ID NO:6)。使用Biorad的集成CFX管理软件计算每个向导RNA样品的相对均一化表达和s.e.m。
生物信息学：为了确定人类基因组中的所有潜在的CRISPR位点，使用定制的Perl转录物来搜索两条链和23-mer CRISPR序列位点GN19NGG或AN19NGG的重叠出现。为了计算平均值和中值距离值，预测的CRISPR切割位点首先被定义为出现在PAM序列上游的第三和第四碱基之间。在分选序列之后，然后计算基因组中所有相邻gRNA之间的距离。将该数据导入R中以计算平均值和中值统计值，并绘制数据。为了计算平均密度，将gRNA切割位点跨越基因组分组(binned)并计算出现频率。将该数据使用ggplot2包或Circos绘制在R中以生成圆形图(Krzywinski等人(2009) Genome Research 19:1639-1645)。为了计算人类基因中或疾病基因座处的出现率，使用BEDTools utility IntersectBED (Quinlan和Hall (2010)Bioinformatics 26:841-842)来发现与从UCSC Genome Browser检索的RefSeq BED文件或来自OMIM(在线人类孟德尔遗传(Online Mendelian Inheritance in Man),OMIM.McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine, Johns Hopkins University(Baltimore, MD), 2013) BED文件重叠的出现率。用于本研究中的基因组是人(hg19)、小鼠(mm10)、大鼠(rn5)、牛(bosTau7)、鸡(galGal4)、斑马鱼(dr7)、果蝇(dm3)、秀丽隐杆线虫(ce10)、酿酒酵母(sacCer3)。
表1.gRNA靶向序列和特性 - eGFP靶向构建体，其指示eGFP坐标、gRNA启动子、5'核苷酸、靶向链、PAM基序、GC含量、Tm和热力学稳定性
*基于20 bp靶序列计算
**基于预测的DNA:DNA杂交值针对五个3'核苷酸计算。
表2.gRNA靶向序列和特性 - AAVS-1靶向序列，其指示gRNA启动子、5'核苷酸、靶向链、PAM基序、GC含量、Tm和热力学稳定性
。
表3. RNA靶向序列和特性 - 靶向eGFP的20碱基gRNA构建体的序列
。
结果
为了扩大CRISPR/Cas9靶向的当前限制，测试是否可以使用H1 pol III代替U6作为替代启动子(Baer等人(1990) Nucleic Acids Res.18:97-103)。因为H1可以表达具有位于+1位置的任一嘌呤(核苷酸R)的转录物，所以假设与化脓性链球菌Cas9一起，CRISPR靶向空间可以通过允许在AN19NGG和GN19NGG位点两者处切割而扩大(图1A)。为了证明H1表达的gRNA的位点特异性切割，开发了报道分子测定法以测量在H7人胚胎干细胞系(hESC；图1B)中的AAVS-1基因座处整合的GFP靶基因的CRISPR介导的切割(Hockemeyer等人(2009)Nat.Biotechnol.27:851-857)。将由于编码序列破坏导致的GFP荧光损失测量为易错非同源末端连接(NHEJ)频率的代理物；特别地，所述测定法将低估NHEJ，因为不会检测到不破坏GFP荧光的框内突变或插入缺失(图1B和图1C)。H7细胞用等摩尔比的Cas9和gRNA表达质粒进行电穿孔，并且在集落形成之后使细胞针对GFP荧光可视化。与阴性对照电穿孔相反，来自测试的U6和H1启动子的所有gRNA构建体在经历靶向突变的细胞中显示GFP信号的镶嵌型损失(图1C和未显示的数据)。用核染色定量总细胞数使得能够通过流式细胞术进行GFP荧光的基于细胞的分析。尽管100％的构建体导致NHEJ，如通过GFP荧光的损失所证明，但效率范围对于U6和H1构建体是不同的(图1C、右图和未显示的数据)。通过从U6或H1启动子表达gRNA，这证明GFP基因的诱变可以分别在GN19NGG或AN19NGG位点发生。
为了用另一细胞系证实和拓宽这些结果，用与上述相同的gRNA构建体靶向在相同基因座处表达GFP的表达GFP的HEK-293细胞系。通过Surveyor分析(Qiu等人(2004)BioTechniques 36:702-707)，检测到一定范围的因启动子类型和靶向位置而改变的编辑效率(图1D和图2)。通过使用未修饰的IMR90.4诱导的多能细胞(hiPSC)，还证实了通过靶向PPP1R12C基因的内含子区域内的AAVS-1基因座来修饰内源基因的能力。以相当的效率观察到来自H1和U6驱动的gRNA的靶向切割，如通过Surveyor测定法所测量(图3A、图3B和图3C)。
为了确定靶向空间的潜在增加，进行生物信息学分析以评价人类基因组中可用的CRISPR位点。尽管可能预测AN19NGG位点大致以与GN19NGG位点相同的频率存在，但发现它们实际上通常高15％(图4A、图4B、图4C、图4D、图5A、图5B、图5C、图5D、图5E和图5F)；因此将特异性从GN19NGG改变为RN19NGG，使可用位点的数量超过倍增(增加约115％)。有几个例外(chr16、chr17、chr19、chr20和chr22)，AN19NGG位点以比GN19NGG位点更高的频率存在于每个染色体上。为了比较平均全基因组靶向密度，针对GN19NGG (59 bp)、AN19NGG (47 bp)和RN19NGG位点(26 bp)计算基因组中相邻CRISPR位点之间的平均距离(图4B)。此外，AN19NGG位点在人类基因组中靶向的相关区域甚至更富集。发现人类基因中AN19NGG位点增加20％，并且从OMIM数据库获得的疾病基因座处增加21％(图4C)。还检查了来自人类基因组的1165个miRNA基因，并且发现这些基因中的221个可以通过一个或多个AN19NGG位点靶向，但不通过GN19NGG位点靶向(数据未显示)。考虑到同源重组的效率与增加与切割位点的距离负相关，通过使用H1启动子的CRISPR靶向位点的增加应当促进更精确的基因组靶向和突变校正(Ran等人(2013) Cell 6:1380-1389)。
随着CRISPR技术越来越多地用于广泛范围的模型生物体的基因组工程改造，确定在其他基因组中使用H1启动子的潜在影响。对在H1启动子(鼠；大鼠；鸡；牛；和斑马鱼)处具有高基因组保守性的5个其他脊椎动物基因组进行该分析。在所有情况下，发现AN19NGG与GN19NGG位点相比数目更高：+9%牛；+14%鸡；+19％大鼠；+21％小鼠；和+32％斑马鱼(图4C)。这种普遍性的一个解释可能是由于较高的AT含量(图6A、图6B、图6C、图6D、图6E和图6F)。在人类基因组中，将GN19NGG和AN19NGG位点存在率针对AT含量均一化使得频率更接近于等价，尽管这并不对于所有基因组都成立(图6A和图6F)。尽管如此，这证明了使用H1启动子的效用，其使人类基因组中目前可用的CRISPR靶向空间超过倍增，并且在所有其他测试的基因组中类似。
接下来，证明了用H1启动子构建体靶向内源基因中AN19NGG位点的能力。使用H7细胞，靶向MERTK基因座(涉及视网膜色素上皮和巨噬细胞中的吞噬作用，并且当突变时引起视网膜变性(D'Cruz等人(2000) Human Molecular Genetics 9:645-651)的第二个外显子(图7A和图7B)。为了估计整体靶向效率，从电穿孔的细胞群体收获DNA，并进行Surveyor测定。用两个独立的PCR反应扩增靶位点周围的区域，并计算9.5％和9.7％的插入缺失频率(图7B)。接下来，分离42个随机选择的克隆，并通过Surveyor分析测试突变(数据未显示)。测序揭示7/42(16.7％)具有在靶PAM位点上游3-4个核苷酸内成簇的突变。7个克隆中的6个具有独特的突变(1个克隆是冗余的)，且这些中的3个是双等位基因移码突变，其导致预测的空MERTK等位基因，其通过Western印迹分析证实(图7C和图7D)。总之，这些结果证明有效靶向位于内源基因座处的AN19NGG位点的能力。
由于用CRISPR-Cas9系统的脱靶突变的出现已经变得越来越受关注，所以使用上述GFP gRNA构建体作为模型系统来检查使用H1启动子如何可能影响脱靶。使用Surveyor分析来检查生物信息预测为脱靶位点的三个基因座(GFP_11-33、GFP_219-197和GFP_315-293)。这些构建体中的两个(GFP_219-197和GFP_315-293)是GN19NGG靶位点，允许用两种启动子表达。通过附加5'-G核苷酸而从U6启动子表达一种(GFP_11-33)，AN19NGG位点。在检查的所有三个脱靶基因座中，不能检测到任何脱靶切割(数据未显示)。然而，缺乏可检测的脱靶可能源于GFP gRNA靶的初始选择，其中基于与其他基因组基因座的低同源性来选择位点。因此，推断更严格的挑战是将来自具体已知能够引发高水平脱靶命中的靶向位点处的H1和U6启动子的gRNA表达进行比较(Fu等人(2013) Nat. Biotechnol.31:822–826;Pattanayak等人(2013) Nat. Biotechnol.31(9):839-43; Cho等人(2014)GenomeResearch 24:132-141)。此外，H1启动子的5'核苷酸灵活性允许直接比较U6和H1启动子之间靶向 GN19NGG位点的相同gRNA。测试先前从Fu等人(2013)报道的两个位点：VEGFA位点1(T1)和VEGFA位点3(T3)(表4、图8A、图8B、图8C和图8D)((Fu等人(2013)Nat.Biotechnol.31:822–826; Cho等人(2014) Genome Research 24:132-141)。因为已经显示增加的gRNA和Cas9浓度导致增加的脱靶命中((Fu等人(2013) Nat. Biotechnol.31:822–826; Pattanayak等人(2013) Nat. Biotechnol.31(9):839-43; Hsu等人(2013)Nat. Biotechnol.31(9):827-32)，推断来自H1启动子的较低的gRNA表达水平(Boden等人(2003) Nucleic Acids Res. 31:5033-5038; An等人(2006) Molecular Therapy : TheJournal of the American Society of Gene Therapy 14:494-504; Makinen等人(2006) The Journal of Gene Medicine 8:433-44)也可以减少脱靶效应。使用qRT-PCR，测试来自H1和U6启动子的VEGFA T1gRNA的相对水平，证实来自H1启动子的预期表达水平降低(图8A)。对于VEGFA T1位点，测试在靶向基因座以及四个脱靶位点处的切割效率。与U6启动子相比，在中靶基因座处的切割相当或略微降低；然而，H1启动子表达的gRNA在检查的脱靶基因座处显著更严格，表明更高的特异性(脱靶1：8% vs. 25%；脱靶2：不可检出 vs.20%；和脱靶4：9% vs. 26%)(表4、图8A、图8B、图8C和图8D)。在VEGFA T3位点处，检测到两个启动子构建体之间相等的靶向(26％)，但用H1启动子再次观察到较低水平的脱靶切割(表4、图8A、图8B、图8C和图8D)。尽管需要进行对H1和U6启动子表达的gRNA的进一步研究，但数据表明来自H1表达的gRNA的可能更大的特异性。
使用H1启动子方法的额外脱靶相关优点涉及最近描述和有希望的采用用D10ACas9突变体的协同偏移切口以减轻潜在脱靶效应的方法((Ran等人(2013) Cell 6:1380-1389; Mali等人(2013) Nat. Biotechnol.31(9):833-8)。该方法具有严格的靶向需要，因为其需要鉴定在相对链上定向且在切割位点的约20 bp内的两个侧接CRISPR位点(Ran等人(2013) Cell 154(6):1380-9)。预期通过使用H1启动子提供的额外靶向密度有助于鉴定合适的侧接位点。
化脓性链球菌Cas9体外和体内靶向的累积证据表明，Cas9:gRNA识别延伸遍及整个20个碱基对靶向位点。首先，在针对gRNA特异性体外测试>1012种不同变体中，一项研究发现+1核苷酸在目标识别中起作用。此外，从该数据的位置特异性计算显示，5'核苷酸在其目标识别中比其3'相邻者贡献更大的作用，表明CRISPR特异性的“种子”模型可能过度简化了PAM近端核苷酸的贡献(Pattanayak等人(2013) Nat. Biotechnol.31(9):839-4328)。其次，替代用途诸如CRISPR干扰(CRISPRi)(其重新旨在用于转录抑制的CRISPR系统)发现，gRNA中的5'截短严重损害抑制，并且具有错配核苷酸(诸如用于U6表达的错配G碱基)的5'延伸也降低抑制效率，表明长度(20nt)和5'核苷酸背景两者对于适当的Cas9靶向都是重要的(Ran等人(2013) Cell 154(6):1380-9; Mali等人(2013) Nat. Biotechnol.31(9):833-8; Larson等人(2013) Nature Protocols 8:2180-2196; Qi等人(2013) Cell 152:1173-1183; Shan等人(2013) Nat. Biotechnol.31:686-688)。最后，晶体结构数据进一步支持Cas9中的5'核苷酸的实验数据和重要性，因为gRNA的5'核苷酸和目标DNA的3'末端发生显著的接触(Jinek等人(2014) Science 343:6176); Nishimasu等人(2014) Cell 156:935-949)。
对于增加的靶向空间，已显示使用替代Cas9蛋白是有效的，如在脑膜炎奈瑟氏球菌(N. meningitides)和嗜热链球菌(S. thermophiles)中一样(Hou等人(2013)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.110(39):15644-9;Esvelt等人(2013) Nature Methods 10(11):1116-21)。然而，尽管这些替代蛋白的潜能，来自已报道的其他II型系统的PAM限制具有更严格的要求(数据未显示；Cong等人(2013) Science 339:819-823; Hou等人(2013)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 110(39):15644-9)。相比之下，预期通过使用H1启动子的修饰的gRNA表达大大延伸任何Cas9蛋白的靶向库，而不考虑PAM差异。当定量直系同源Cas9蛋白的各自gRNA靶向(对于脑膜炎奈瑟氏球菌，AN23NNNNGATT vs. GN23NNNNGATT，且对于嗜热链球菌，AN17NNAGAAW vs. N17NNAGAAW)时，发现具有5'-A核苷酸的gRNA位点增加64％和69％，表明通过使用H1启动子与替代Cas9蛋白，靶向空间的甚至更大扩展(表5)。如植物中所表明，使用不同的启动子可以扩展CRISPR位点的频率。尽管U6启动子限于5'鸟苷核苷酸，但来自稻的U3启动子被限制于5'腺苷核苷酸，进一步突出了在不同系统中需要不同启动子来增加靶向空间(Shan等人(2013) Nat. Biotechnol.31:686-688)。便利地，可以单独使用H1启动子来经由单一启动子系统来靶向AN19NGG和GN19NGG位点(以及可能的CN19NGG或TN19NGG位点(Tuschl (2002) Nat. Biotechnol.20:446-448)))(图9A和图9B)。这进而可以用于用改变的位点限制来扩大当前和未来的Cas9变体的靶位空间。
通过明智的位点选择、改进的Cas9变体、优化的gRNA结构或其他辅因子增强CRISPR靶向，将可能导致整个靶向序列的特异性增加，使得5'核苷酸的身份更加重要。作为研究工具，这将允许基因组的更大操纵，同时尽可能降低混杂突变，并且对于未来的临床应用，高靶向密度以及高保真目标识别将对于提供安全和有效的疗法是最重要的。
表4通过U6或H1表达的gRNA在中靶和脱靶位点处诱导的插入缺失的频率
。
表5人类基因组中的替代Cas9靶向位点的生物信息学分析。从左向右移动的列表明Cas9来源物种、CRISPR靶位点、未掩蔽的人类基因组中存在的频率以及重复掩蔽的人类基因组中存在的频率。在适当值后面以粗体表明百分比增加。
讨论
增加CRISPR靶向空间和减少脱靶效应的可能性对基因组工程改造具有广泛的影响。对于增加的靶向空间，已经显示使用替代Cas9蛋白是有效的，如在嗜热链球菌(NNAGAAW)和脑膜炎奈瑟氏球菌(NNNNGATT)中一样，但来自迄今报道的其他II型系统的PAM限制具有更严格的需求，因此当单独使用时减少可用于靶向的序列空间(数据未显示和Cong等人(2013)Science 339:819-823; Hou等人(2013) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 110(39):15644-9)。相比之下，预期通过使用H1启动子的修饰的gRNA表达大大延伸任何Cas9蛋白的靶向库。在植物中，尽管U6启动子限于5'鸟苷核苷酸，但来自稻的U3启动子限制于5'腺苷核苷酸。如新近所表明，两种启动子的使用可以扩大植物基因组中CRISPR位点的频率(Shan等人(2013) Nat. Biotechnol.31:686-688)。便利地，可以单独使用H1启动子来经由单一启动子系统来靶向脊椎动物基因组中的AN19NGG和GN19NGG位点。这进而可以用于用改变的位点限制来扩大当前和未来的Cas9变体的靶位空间。
与ZFN或TALEN技术类似，一种减少潜在脱靶效应的方法可能是采用以Cas9突变体(D10A)的协同偏移切口(offset nicking)(Mali等人(2013) Nat. Biotechnol.31(9):833-8; Ran等人(2013) Cell 154(6):1380-9)。这需要鉴定相对链上的两个侧接CRISPR位点，并且将预期由AN19NGG位点提供的额外靶向密度增强该方法。相对于U6启动子的额外益处还可以是减少假切割；因为几个研究组已报道增加的gRNA和Cas9浓度与脱靶突变倾向的增加相关(Pattanayak等人(2013) Nat. Biotechnol.31(9):839-43; Hsu等人(2013)Nat. Biotechnol., 31(9):827-32; Fu等人(2013) Nat. Biotechnol.31(9):822-6)，由H1启动子提供的较低表达水平可以导致减少的脱靶切割。此外，Pattanayak等人报道Cas9:gRNA识别延伸遍及整个20个碱基对靶向位点(Pattanayak等人(2013) Nat.Biotechnol.31(9):839-43)。在针对gRNA特异性测试>1012种不同的变体中，作者发现+1核苷酸有助于目标识别，表明过度简化了CRISPR特异性的“种子”模型(PAM近端核苷酸)。通过明智的位点选择、改进的Cas9变体、优化的gRNA结构或其他辅因子增强CRISPR靶向，将可能导致整个23bp靶向序列的特异性增加，使得5'核苷酸的身份更加重要。作为研究工具，这将允许基因组的更大操纵，同时尽可能降低混杂突变，并且对于未来的临床应用，高靶向密度以及高保真目标识别将对于提供安全和有效的疗法是最重要的。
实施例2
图10A、图10B、图10C、图10D和图10E显示使用H1启动子作为双向启动子以同时表达Cas9蛋白和向导RNA。显示双向H1启动子，其表达Cas9作为向左(负链)的pol II转录物和向导RNA作为向右(正链)的pol III转录物。总表达盒约为4.4kb(图10A)。为了测试从双向H1构建体引导CRISPR介导的切割的能力，将使用靶向eGFP的gRNA的双向构建体克隆至质粒中并在表达GFP的人干细胞中表达(图10B)。目视检测到GFP的丢失(图10C；中间图，箭头)，表明由于表达构建体导致的成功表达和GFP的靶向。还通过Surveyor测定显示了成功的CRISPR靶向，其中泳道2和3中存在两个条带(图10D)。使用H1启动子的双向CRISPR构建体生成~4.75b的紧密靶向盒，其在腺相关病毒的包装范围内(图10E)。以橙色显示SV40终止子，并且所述构建体侧接病毒生产所需的反向末端重复(ITR)序列；
方法
质粒构建：为了生成H1双向构建体，将人密码子优化的Cas9基因和SV40终止子与230bpH1启动子(SEQ ID NO:54)融合，其中pol II转录物是内源性发现的(负链)。在H1启动子和gRNA支架之间，将AvrII位点工程改造以允许靶向序列的插入。然后将SV40[rev]::hcas9[rev]::H1::gRNA支架::pol III终止子序列克隆至NdeI/XbaI消化pUC19载体。为了生成本研究中使用的各种gRNA，将重叠寡核苷酸退火，并通过PCR使用两步扩增Phusion FlashDNA聚合酶(Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL)扩增，随后使用与2X体积25％PEG和1.5M NaCl混合的羧化物修饰的Sera-Mag磁珠(Thermo Fisher Scientific)纯化。然后将纯化的PCR产物重悬浮于H2O中，并使用NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific)定量。使用Gibson Assembly (New England Biolabs, Ipswich, MA) (Gibson等人(2009)Nature Methods 6:343-345)以轻微改良生成表达gRNA的构建体。总反应体积从20μl减少至2μl。
细胞培养：通过根据前面描述的方案(Walker等人(2010) Nat. Commun.1:71;Maruotti等人(2013) Stem Cells Translational Medicine 2:341-354)在10% CO2/5% O2培养箱中在mTeSR1培养基(Stem Cell Technologies, Vancouver, BC)中的生长因子减少的Matrigel(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)上克隆繁殖来维持hESC系H7和IMR-90 iPS细胞(WiCell, Madison WI)。为了传代，首先将hESC集落与mTesR1中的5μMblebbistatin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)孵育，然后在用Accutase (Sigma-Aldrich)处理5-10分钟之后收集。将细胞块轻轻地离解成单细胞悬浮液，并通过离心沉淀。此后，将hPSC重悬浮于具有blebbistatin的mTeSR1中，并以约1,000-1,500个细胞/cm2铺板。传代之后两天，用mTeSR1(无blebbistatin)替换培养基并每日更换。
将人胚胎肾(HEK)细胞系293T(Life Technologies, Grand Island, NY)在37℃、5% CO2/20% O2下在补充有10％胎牛血清(Gibco, Life Technologies, Grand Island,NY)和2mM GlutaMAX (Invitrogen)的Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM)中维持。
H7细胞的基因靶向：在电穿孔前24小时，在10μM Rho激酶抑制剂(DDD00033325,EMD Millipore, Billerica, MA)中培养hESC细胞。使用Neon试剂盒(Invitrogen)根据制造商的说明进行电穿孔。简而言之，在电穿孔当天，将hESC用Accutase (Sigma-Aldrich)消化1-2分钟，直至集落转移。重要的是，集落不解离成单细胞悬浮液。收集集落之后，将湿沉淀物在冰上保持15分钟，然后重悬浮于含有基因靶向质粒的电穿孔缓冲液中。电穿孔参数如下：电压：1400 ms；时间间隔：30 ms；1个脉冲。电穿孔后，将细胞集落缓慢转移至含有10μM Rho激酶抑制剂的mTeSR1培养基中，然后在室温下保持20分钟，然后铺板在Matrigel包被的培养皿上并进一步培养。
为了分析克隆来源的集落，将电穿孔的hESC生长至亚汇合，如前面段落中所述传代，并以500个细胞/每35mm皿的密度铺板。随后，通过手工挑选分离单个集落并进一步培养。
组成型表达的GFP ESC系的生成：将H7人ESC系(WiCell)保持在Matrigel基质上的mTeSR1 (Stem Cell Technologies)培养基中。在细胞传代前，将细胞进行用blebbistatin的短暂预处理(> 5分钟)以增加细胞活力，用Accutase处理7分钟，研磨成单细胞悬浮液，用等体积的mTesR猝灭，以80xg离心5分钟，重悬浮于含有blebbistatin的mTesR中。将1x106个细胞沉淀，小心去除培养基，并将细胞置于冰上10-15分钟。将R缓冲液中的10μg含有与AAVS1安全港(safe-harbor)基因座的同源性的AAV-CAGGSEGFP供体载体(#22212,Addgene)加上5μg各hAAVS1 1R + L TALENs (#35431和35432, Addgene)(Hockemeyer等人(2009) Nat. Biotechnol. 27:851-857; Sanjana等人(2012) Nature Protocols 7:171-192)使用Neon转染系统(Life Technologies)以100μl尖端型用以下参数电穿孔：1500V，20ms脉冲和1脉冲。然后将细胞轻轻地添加至1ml培养基，并在室温下孵育15分钟，然后铺板在含有mTeSR和5μM blebbistatin的Matrigel包被的35mm皿上。2天之后，以1x104的密度接种细胞，之后，用荧光配备的Nikon TS100落射荧光显微镜手动选择时间稳定的克隆亚系。
基因组修饰的Surveyor测定和测序分析：对于Surveyor分析，通过将细胞重悬浮于QuickExtract溶液(Epicentre, Madison, WI)中、在65℃下孵育15分钟、然后在98℃下孵育10分钟来提取基因组DNA。提取物溶液使用DNA Clean and Concentrator (ZymoResearch, Irvine, CA)清洗并通过NanoDrop (Thermo Fisher Scientific)定量。使用Phusion DNA聚合酶(New England Biolabs)从100ng基因组DNA扩增围绕CRISPR靶位点的基因组区域。合并多个独立的PCR反应物，并使用Qiagen MinElute Spin Column根据制造商的方案(Qiagen, Valencia, CA)纯化。将含有12.5mM Tris-HCl (pH 8.8)、62.5mM KCl和1.875mM MgCl2中的400ng PCR产物的8μl体积变性并缓慢再退火以允许形成异源双链体：95℃持续10分钟，以-1.0℃/秒从95℃斜变至85℃，85℃持续1秒，以-1.0℃/秒从85℃斜变至75℃，75℃持续1秒，以-1.0℃/秒从75℃斜变至65℃，65℃持续1秒，以-1.0℃/秒从65℃斜变至55℃，55℃持续1秒，以-1.0℃/秒从55℃斜变至45℃，45℃持续1秒，以-1.0℃/秒从45℃斜变至35℃，35℃持续1秒，以-1.0℃/秒从35℃斜变至25℃，然后保持在4℃。将1μlSurveyor Enhancer和1μl Surveyor Nuclease (Transgenomic, Omaha, NE)添加至每个反应物，在42℃下孵育60分钟，其后将1μl终止溶液添加至反应物。使用DNA 1000芯片(Agilent, Santa Clara, CA)在2100 Bioanalyzer上定量1μl反应物。对于凝胶分析，将2μl 6X上样缓冲液(New England Biolabs)添加至剩余的反应物，并上样至含有溴化乙锭的3％琼脂糖凝胶上。将凝胶在Gel Logic 200成像系统(Kodak, Rochester, NY)上可视化，并使用ImageJ v. 1.46定量。使用二项式推导的方程计算NHEJ频率：
%基因修饰 =
其中“a”和“b”的值等于背景减去之后的切割片段的积分面积，且“c”等于背景减去之后的未切割PCR产物的积分面积(Guschin等人(2010) Methods in Molecular Biology649:247-256)。
实施例3
图11A、图11B和图11C显示生成向导RNA的5'末端的锤头核酶。5'顺式-锤头核酶(SEQID NO:49)和gRNA (SEQ ID NO:50)描绘于图11A中。指示锤头核酶的序列，且指示对于催化重要的核苷酸(红色是关键的，橙色是重要的)。通过箭头指示切割的位置。在核酶切割(下图)后，释放所得gRNA，而不限于在新形成的5'位置处的任何核苷酸。显示表达锤头-gRNA的构建体显示于图11B中。启动子，通常pol III启动子如U6、H1或T7，可用于表达5'顺式-锤头核酶，其在自我切割后将释放gRNA。用Surveyor测定法将两个基因座的靶向显示于图11C中(HH1 + CGG PAM序列 = SEQ ID NO:51；HH2 + AGG PAM序列 = SEQ ID NO:52)，其中通过5'顺式-锤头核酶成功裂解(箭头)。
图12显示可调节的CRISPR构建体，其使用适体酶在特异性适配子存在的情况下处理gRNA。具体而言，图12描绘与锤头核酶的螺旋II融合的茶碱适配子(橙色)，形成茶碱适体酶，其为gRNA的5'(蓝色)。茶碱的结合稳定了螺旋II，其然后允许锤头自我切割，并释放gRNA。gRNA，连同Cas9，现在能够靶向CRISPR系统的切割。
方法
质粒构建：为了生成由U6、H1或T7启动子驱动的5'顺式-锤头构建体，将锤头序列(GTACGTTTCCTCTGATGAGTCCCAAATAGGACGAAACGCGCTTCGGTGCGTC; SEQ ID NO:53)置于启动子的下游和gRNA目标和支架的上游。为了形成螺旋I，将与gRNA靶序列互补的10个核苷酸置于锤头序列的5'，其然后将结合至gRNA中发现的互补序列(图12)。为了生成本研究中使用的各种gRNA，将重叠寡核苷酸退火，并通过PCR使用两步扩增Phusion Flash DNA聚合酶(Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL)扩增，随后使用与2X体积25％ PEG和1.5MNaCl混合的羧化物修饰的Sera-Mag磁珠(Thermo Fisher Scientific)纯化。然后将纯化的PCR产物重悬浮于H2O中，并使用NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific)定量。使用Gibson Assembly (New England Biolabs, Ipswich, MA) (Gibson等人(2009)NatureMethods 6:343-345)以轻微改良生成表达gRNA的构建体。总反应体积从20μl减少至2μl。
细胞培养：通过根据前面描述的方案(Walker等人(2010) Nat. Commun.1:71;Maruotti等人(2013) Stem Cells Translational Medicine 2:341-354)在10% CO2/5% O2培养箱中在mTeSR1培养基(Stem Cell Technologies, Vancouver, BC)中的生长因子减少的Matrigel(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)上克隆繁殖来维持hESC系H7和IMR-90 iPS细胞(WiCell, Madison WI)。为了传代，首先将hESC集落与mTesR1中的5μMblebbistatin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)孵育，然后在用Accutase (Sigma-Aldrich)处理5-10分钟之后收集。将细胞块轻轻地离解成单细胞悬浮液，并通过离心沉淀。此后，将hPSC重悬浮于具有blebbistatin的mTeSR1中，并以约1,000-1,500个细胞/cm2铺板。传代之后两天，用mTeSR1(无blebbistatin)替换培养基并每日更换。
将人胚胎肾(HEK)细胞系293T(Life Technologies, Grand Island, NY)在37℃、5% CO2/20% O2下在补充有10％胎牛血清(Gibco, Life Technologies, Grand Island,NY)和2mM GlutaMAX (Invitrogen)的Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM)中维持。
H7细胞的基因靶向：在电穿孔前24小时，在10μM Rho激酶抑制剂(DDD00033325,EMD Millipore, Billerica, MA)中培养hESC细胞。使用Neon试剂盒(Invitrogen)根据制造商的说明进行电穿孔。简而言之，在电穿孔当天，将hESC用Accutase (Sigma-Aldrich)消化1-2分钟，直至集落转移。重要的是，集落不解离成单细胞悬浮液。收集集落之后，将湿沉淀物在冰上保持15分钟，然后重悬浮于含有基因靶向质粒的电穿孔缓冲液中。电穿孔参数如下：电压：1400 ms；时间间隔：30 ms；1个脉冲。电穿孔后，将细胞集落缓慢转移至含有10μM Rho激酶抑制剂的mTeSR1培养基中，然后在室温下保持20分钟，然后铺板在Matrigel包被的培养皿上并进一步培养。
为了分析克隆来源的集落，将电穿孔的hESC生长至亚汇合，如前面段落中所述传代，并以500个细胞/每35mm皿的密度铺板。随后，通过手工挑选分离单个集落并进一步培养。
组成型表达的GFP ESC系的生成：将H7人ESC系(WiCell)保持在Matrigel基质上的mTeSR1 (Stem Cell Technologies)培养基中。在细胞传代前，将细胞进行用blebbistatin的短暂预处理(> 5分钟)以增加细胞活力，用Accutase处理7分钟，研磨成单细胞悬浮液，用等体积的mTesR猝灭，以80xg离心5分钟，重悬浮于含有blebbistatin的mTesR中。将1x106个细胞沉淀，小心去除培养基，并将细胞置于冰上10-15分钟。将R缓冲液中的10μg含有与AAVS1安全港(safe-harbor)基因座的同源性的AAV-CAGGSEGFP供体载体(#22212,Addgene)加上5μg各hAAVS1 1R + L TALENs (#35431和35432, Addgene)(Hockemeyer等人(2009) Nat. Biotechnol. 27:851-857; Sanjana等人(2012) Nature Protocols 7:171-192)使用Neon转染系统(Life Technologies)以100μl尖端型用以下参数电穿孔：1500V，20ms脉冲和1脉冲。然后将细胞轻轻地添加至1ml培养基，并在室温下孵育15分钟，然后铺板在含有mTeSR和5μM blebbistatin的Matrigel包被的35mm皿上。2天之后，以1x104的密度接种细胞，之后，用荧光配备的Nikon TS100落射荧光显微镜手动选择时间稳定的克隆亚系。
基因组修饰的Surveyor测定和测序分析：对于Surveyor分析，通过将细胞重悬浮于QuickExtract溶液(Epicentre, Madison, WI)中、在65℃下孵育15分钟、然后在98℃下孵育10分钟来提取基因组DNA。提取物溶液使用DNA Clean and Concentrator (ZymoResearch, Irvine, CA)清洗并通过NanoDrop (Thermo Fisher Scientific)定量。使用Phusion DNA聚合酶(New England Biolabs)从100ng基因组DNA扩增围绕CRISPR靶位点的基因组区域。合并多个独立的PCR反应物，并使用Qiagen MinElute Spin Column根据制造商的方案(Qiagen, Valencia, CA)纯化。将含有12.5mM Tris-HCl (pH 8.8)、62.5mM KCl和1.875mM MgCl2中的400ng PCR产物的8μl体积变性并缓慢再退火以允许形成异源双链体：95℃持续10分钟，以-1.0℃/秒从95℃斜变至85℃，85℃持续1秒，以-1.0℃/秒从85℃斜变至75℃，75℃持续1秒，以-1.0℃/秒从75℃斜变至65℃，65℃持续1秒，以-1.0℃/秒从65℃斜变至55℃，55℃持续1秒，以-1.0℃/秒从55℃斜变至45℃，45℃持续1秒，以-1.0℃/秒从45℃斜变至35℃，35℃持续1秒，以-1.0℃/秒从35℃斜变至25℃，然后保持在4℃。将1μlSurveyor Enhancer和1μl Surveyor Nuclease (Transgenomic, Omaha, NE)添加至每个反应物，在42℃下孵育60分钟，其后将1μl终止溶液添加至反应物。使用DNA 1000芯片(Agilent, Santa Clara, CA)在2100 Bioanalyzer上定量1μl反应物。对于凝胶分析，将2μl 6X上样缓冲液(New England Biolabs)添加至剩余的反应物，并上样至含有溴化乙锭的3％琼脂糖凝胶上。将凝胶在Gel Logic 200成像系统(Kodak, Rochester, NY)上可视化，并使用ImageJ v. 1.46定量。使用二项式推导的方程计算NHEJ频率：
%基因修饰 =
其中“a”和“b”的值等于背景减去之后的切割片段的积分面积，且“c”等于背景减去之后的未切割PCR产物的积分面积(Guschin等人(2010) Methods in Molecular Biology649:247-256)。
实施例4
概述
视网膜色素变性(RP)是一种遗传性视网膜变性疾病，其中视网膜感光细胞(视杆细胞和视锥细胞)的功能障碍和死亡导致视力丧失且可能致盲。存在RP的常染色体隐性和常染色体显性遗传形式两者(分别为ARRP和ADRP)。在ARRP中，在负责该疾病的基因的两个拷贝中都存在突变(对于大多数基因，该基因的一个拷贝从其母体遗传，而另一个拷贝从其父体遗传)。与ARRP相关的引起疾病的突变通常导致所涉及的基因的功能丧失，即视网膜变性是由于所涉及的基因执行其正常功能的能力的丧失。在此类情况下，很清楚，至少在理论上，需要做什么来开发适当的治疗 - 技术人员需要替换丢失的基因功能。该方法的典型实例是正在进行的Leber先天性黑蒙病(LCA)的人类治疗研究，其中使用腺相关病毒(AAV)的基因疗法来替代引起疾病的缺陷型RPE65基因的功能。
在ADRP中，与ARRP不同，引起疾病的基因的两个拷贝中仅一个被突变。在大多数情况下，该单突变基因不会引起视网膜变性，因为其已经丧失功能；相反，其引起疾病，因为突变导致产生已经获得新功能(对视杆和/或视锥感光细胞有毒或有害的功能)的基因产物。这种情况使得基因置换策略更复杂，因为引入功能基因是不够的；有效的疗法需要开发消除从具有毒性突变的基因产生的“坏”基因产物的表达的方法并维持遗传学家称为“野生型”(WT)基因的基因的未突变拷贝的功能两者。
目前，没有FDA批准的用于ADRP的治疗。大多数正在进行的实验室和动物研究采取两步法：1)消除基因的突变和WT拷贝两者的功能，然后2)通常经由AAV介导的基因疗法引入WT基因的新的“硬化(hardened)”形式，其对破坏内源性WT基因的第一步中使用的疗法耐受。
本公开主题提供了用于ADRP治疗的新策略，其利用CRISPR/Cas9基因编辑来精确地靶向编辑活生物体的基因组信息，即其允许对一个基因的治疗性调节。本公开的方法使用CRISPR/Cas9基因编辑来特异性改变引起疾病的基因的突变拷贝，使得其不表达其毒性基因产物，而不影响WT基因的表达。例如，与ADRP相关的视紫红质基因的突变体形式(P23H)可以被特异性靶向，改变其序列，使得其不再表达毒性基因产物。在一些实施方案中，将CRISPR/Cas9组分在单个AAV病毒颗粒内递送至眼睛。该系统在ADRP的P23H视紫红质小鼠突变体模型中测试。这些研究验证了基于用于治疗ADRP的视网膜细胞的定制基因工程改造的基因疗法的新方法。本公开主题适用于ADRP的各种形式以及其他常染色体显性遗传性视网膜营养不良。
具体目标
视网膜色素变性的常染色体显性形式(ADRP)构成RP的所有病例的约30-40％，并且在ADRP患者中，最常见的突变的RP相关基因是编码视杆视色素视紫红质的基因(Dryja等人(1990) The New England Journal of Medicine 323, 1302-1307; Dryja等人(1990)Nature 343, 364-366)。本公开主题提供了通过使用CRISPR/Cas9基因编辑 技术来治疗ADRP的方法(Doudna & Charpentier (2014) Science 346, 1258096; Hsu等人(2014)Cell 157, 1262-1278)，其中RNA引导的Cas9内切核酸酶与可定制的小向导RNA(gRNA)结合使用以靶向和切割突变体视紫红质等位基因。易错非同源末端连接(NHEJ)特异性敲除突变体等位基因的表达，而不影响正常等位基因。所需组分可以通过单个AAV5(在哺乳动物视杆中具有记载的性能的AAV血清型)递送至光感受器。即使仅出现视紫红质的野生型水平的50％的表达，动物数据也表明这足以提供临床上有用的视杆功能(Liang等人TheJournalofBiological Chemistry 279, 48189-48196)。
尽管通过小鼠和其他动物研究已经显示疾病突变的CRISPR靶向在体外和体内是有效的，但所有目前的方法仍然远离临床使用，这在很大程度上归因于递送限制。AAV载体是眼部基因疗法中最常用的病毒载体(Dalkara & Sahel (2014) ComptesRendusBiologie s 337, 185-192; Day等人(2014) AdvancesinExperimentalMedicineand Biology 801,687-693; Willett & Bennett (2013) Frontiers in Immunology 4, 261; Dinculescu等人(2005) Human GeneTherapy 16, 649-663)。几个特征使得AAV成为有吸引力的选择：所述病毒是非致病性的，其感染分裂和非分裂细胞，表达可以持续长时间段，并且其对于其在临床试验中的安全性、效力和一般缺乏毒性的历史是特别值得注意的。此外，正在开发在玻璃体内注射后有效靶向感光细胞的变体AAV血清型和启动子的组合。然而，由于在其当前状态下，这些载体触发免疫应答，并且缺乏对人类大小的眼睛中光感受器的有效的全视网膜趋向性(Kotterman等人(2015) Gene therapy 22, 116-126；Mowat(2014) GeneTherapy 21, 96-105；Dalkara等人(2013) Science Translational Medicine 5,189ra176)，将聚焦于已经良好表征的通过视网膜下注射施用的AAV5载体的用途。
AAV基因组是4.7kb单链DNA分子，其可以被修饰以携带最多达5.2kb的重组DNA，尽管推动该限制导致降低的包装效率和缺失的插入(Berns等人(1986)FundamentalVirology, ed B.N.Fields and Knipe, D.M., 545-562 Raven Press)。由于编码通常使用的Cas9蛋白(4.1kb)本身的基因的大尺寸，通过单个病毒载体递送gRNA，包括表达所必需的启动子、终止子和病毒反向末端重复(ITR)序列，目前受到这种AAV包装能力的限制。实际上，活性CRISPR复合物的重构需要共转导，其与单一转导相比效率更低。此外，这需要较大的病毒剂量，其可潜在地诱导较大的免疫应答和相关毒性。此外，可能的是，在人试验中递送第二病毒载体会导致FDA批准的额外挑战。
CRISPR/Cas9技术的开发已经彻底改革了基因编辑的领域。基因组编辑技术的早期方法，诸如锌指核酸酶(ZFN)和转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)，赋予生成靶向的基因组修饰并提供准确地校正疾病突变的潜力的能力。尽管有效，但这些技术受实际限制的阻碍，因为ZFN和TALEN配对都需要合成用于给定DNA靶位点的大且独特的识别蛋白。许多研究组最近已经报道了绕过这些关键限制的通过使用工程改造的II型CRISPR/Cas9系统的高效基因组编辑(Jinek等人(2012) Science 337, 816-821; Cong等人(2013) Science339,819-823; Mali等人(2013) Science 339, 823-826)。CRISPR/Cas9系统由将Cas9核酸酶靶向至序列特异性DNA的向导RNA(gRNA)构成。由于CRISPR/Cas9基因组编辑依赖于用于基因组靶向的短的合成gRNA，而不是如ZFN和TALEN所需的核酸酶内的DNA结合结构域的独特组合，所以使得制备ZFN和TALEN表达所必需的构建体的耗时且繁重的任务得到消除。生成用于CRISPR/Cas9系统的构建体是简单且快速的，并且可以将目标多重化。通过CRISPR系统的切割需要gRNA与20-核苷酸DNA序列的互补碱基配对以及必需的前间区序列邻近基序(PAM)（在靶位点的3'处发现的短核苷酸基序）。在理论上，技术人员可以使用CRISPR技术靶向基因组中的任何独特的N20-PAM序列。目前，最少限制和最常用的Cas9蛋白来自化脓性链球菌，其识别序列NGG，因此，CRISPR靶向序列是N20NGG。NGG序列中的简并 N ，意味着鉴于20个核苷酸(N20)的独特序列，Cas9会同样地切割N20AGG、N20TGG、N20CGG和N20GGG，这可以是用于精确靶向等位基因的问题。
对于体内视紫红质基因靶向，通过视网膜下施用适当工程改造的AAV5载体将所需CRISPR/Cas9效应分子递送至视杆细胞。已经显示血清型5载体在转导非人灵长类动物(Mancuso等人(2009) Nature 461, 784-787)和犬(Beltran等人(2012) Proceedingsofth eNational Academy of Sciences of the UnitedStatesofAmerica109, 2132-2137)光感受器方面非常有效，且能够介导视网膜疗法。尽管衣壳修饰的AAV载体可以在小鼠中从玻璃体渗透至光感受器(Petrs-Silva等人(2011) MolecularTherapy:the Journal of the American Society of Gene Therapy 19, 293-301)，但迄今为止，它们在狗或非人灵长类动物中不能类似地渗透(未公开的观察结果)。
经由AAV递送Cas9和向导RNA中的重要挑战在于表达两种组分所需的DNA超过AAV的包装限度，约4.7-4.9kb，而通过常规方法表达Cas9和gRNA所需的DNA超过5 kb(启动子，~500bp；spCas9, 4,140bp；Pol II终止子，~250bp；U6启动子，~315bp；和gRNA，~100bp)。Swiech等人(2015, Nature Biotechnology 33, 102-106)通过使用以下双载体方法解决了该挑战：一种AAV载体递送Cas9，另一种AAV载体递送gRNA。然而，该研究中的双AAV方法利用特别小的启动子，鼠Mecp2启动子，其尽管在视网膜细胞中表达，但不在视杆中表达(Song等人(2014) Epigenetics & chromatin 7, 17; Jain等人(2010) Pediatric Neurology 43, 35-40)。因此，如构建的该系统将不适用于ADRP的大多数情况。本公开主题提供用于视网膜基因编辑的单一载体方法，其应当提高效率，特异性靶向光感受器，并降低来自病毒载量递送的潜在毒性。
结果
H1启动子，而不是更传统使用的U6启动子，已经用于引导gRNA转录并且允许可用的CRISPR基因靶向空间的近似倍增(Ranganathan等人(2014) Nature Communications 5,4516)。值得注意的是，检测到脱靶切割的较低倾向，表明H1启动子更有利于治疗方法。在这些研究期间，注意到在与内源性H1RNA基因紧密接近的基因组中存在蛋白编码基因(PARP-2)(Baer等人(1990) Nucleic Acids Research 18, 97-103; Myslinski等人(2001)Nucleic Acids Research 29, 2502-2509)。H1RNA(pol III RNA转录物)和PARP-2基因(pol II转录物)的起始之间的序列为230bp(图13)，表明该相对小的序列可以作为紧密的双向启动子发挥功能。据信这是哺乳动物基因组中唯一的双向启动子序列，其可以引导polII和pol III转录物，并且可以用于克服将两种CRISPR组分包装至单一AAV中的尺寸障碍。
为了开发H1作为用于双重Cas9/gRNA表达的双向pol II/III启动子的用途，并且因为其poll III活性已经被充分表征，产生eGFP报道构建体以更好地优化其pol II活性(图14)。人(HEK293)和小鼠细胞(NIH3T3)中的初始结果证明弱、但可清楚检测的GFP荧光，表明H1启动子可以引导pol II表达，尽管弱。使用该GFP报道系统，通过评估系统中的三种可变组分：启动子序列、5'UTR和终止子序列，pol II表达增加，同时维持启动子的紧密性。测试来自不同生物体的H1启动子序列表明，小鼠(176bp)和大鼠(207bp)序列能够比人H1启动子驱动更强的GFP表达(分别为~7倍和~6倍)。然而，由于目标是得到用于人细胞体内使用的系统，在可能的情况下使用人启动子序列。为了评估不同的终止子序列，测试了七种不同的序列，发现SV40 (240 bp)终止子和49 bp合成聚(A)序列(SPA)(Levitt等人(1989)Genes & Development 3, 1019-1025)对于GFP表达均有功能。尽管通过修饰5'UTR来优化翻译效率以改善报道分子表达，但发现取自β-球蛋白5'UTR序列的50 bp序列的插入能够显著改善报道分子表达。与该概念一致，编码强Kozak序列的9个碱基(Kozak (1987) NucleicAcids Research 15, 8125-8148) (5’-GCCGCCACC-3’)的简单插入足以接近这些水平(图15)。
基于从这些基于GFP的优化实验得到的信息，使用人H1启动子序列生成靶向构建体以同时表达Cas9蛋白和靶向gRNA。为了测试这些双向构建体在细胞中引导切割的能力，用标准双质粒方法(pCAAGS:Cas9和H1:gRNA)或用表达两种组分的单质粒系统将NIH3T3细胞电穿孔。靶向小鼠基因组中的两个不同的基因座。在电穿孔之后48小时，收获基因组DNA，并进行T7 Endo I (T7EI)测定(Ran等人(2013) Nature protocols 8, 2281-2308)以定量基因组修饰的水平。使用T7EI测定法，而不是更传统的Surveyor测定法，因为已经报道其在检测缺失中更灵敏(Vouillot等人(2015) G3)。据发现，可以使用紧密双向系统将CRISPR切割有效地靶向至这两个基因座，所述紧密双向系统为约4.7 kb，完全在AAV的包装容量内(图16A和图16B)。进一步证明该靶向策略在人细胞中的适用性和相关性，在人H7胚胎干细胞系中存在Cas9靶向的数据。通过使用小鼠H1启动子代替人序列和使用SPA终止子代替SV40终止子序列，靶向构建体的尺寸在理论上可以再减少200 bp。这些序列减少可以允许更有效的包装，或潜在地为以下增加空间：可以增强、减少和甚至调节Cas9系统的表达的序列修饰；可以对于减少潜在的脱靶效应重要的修饰。已经生成了具有独特的限制性位点连同侧接的NotI位点的双向质粒，所述限制性位点允许使用Gibson克隆方法(NEB)进行简单的目标插入，所述侧接的NotI位点可以被容易地克隆至来自不含AAV辅助者的系统(Agilent)的含有ITR的载体中。
设计和优化Cas9和gRNA启动子、RNA加工和结构元件，使得它们可以有效地从单个 AAV载体系统表达并生成适当的GMP样临床前载体。
通过同时驱动Cas9和gRNA的表达的双向H1启动子的组合和优化努力，已经在AAV包装能力下减小CRISPR递送的尺寸方面已经取得了实质性进展。来自替代启动子序列、5'-3'UTR修饰和不同gRNA的各种组合提供了测试靶向效率的潜在谱的工具包。
一旦在尺寸、表达和切割效率方面进一步优化构建体，它们就可用于生成用于体外和体内测试的AAV载体。用于优化研究的构建体含有允许简单目标插入的独特限制性位点，连同允许克隆至含有ITR的载体质粒中用于AAV产生的侧接的NotI位点。用于细胞培养和小鼠研究的高滴度GMP样临床前AAV5载体可以在独立的载体生产设备中使用不含辅助者的质粒转染方法生成，并通过我们开发的先前开发的技术纯化(Dryja等人(1990) The New England Journal of Medicine 323, 1302-1307; Dryja等人(1990) Nature 343, 364-366)。每种病毒制备物可以使用pDG mini-Ad质粒DNA辅助系统产生，所述pDG mini-Ad质粒DNA辅助系统在最终载体中消除WT腺病毒和能够复制的AAV的污染。载体通过碘克沙醇梯度离心、随后Q-柱FPLC色谱来纯化。为了建立AAV载体储备物的GMP样纯度，每种载体可以进行一套标准化的物理和生物测定法，包括评价纯度、生物负载、无菌性、含有DNA的颗粒滴度、感染滴度、颗粒与感染性比率和由能够复制的AAV的潜在污染。
尽管迄今为止的H1启动子的研究表明低水平的脱靶效应(Ranganathan等人(2014) Nature Communications 5,4516)，但因为正在以最终临床使用的目标开发构建体，应当针对潜在的脱靶活性仔细地监测它们(Wu等人(2014) Quantitative Biology 2,59-70)。为此目的，可以追寻几种补充方法。采用生物信息学方法，使用定制的Perl脚本来测定人和小鼠基因组中的所有潜在的CRISPR位点，所述Perl脚本经撰写用于搜索两条链和23-mer CRISPR序列位点的重叠出现率(Ranganathan等人，手稿准备中，2015 )。例如，在人类基因组中，在过滤掉重复序列之后鉴定了137,409,562个CRISPR位点的初始集合。然后根据定制算法对每个位点评分，所述定制算法基于偏向3'或PAM末端(种子区域)的23碱基序列的独特性来分配值(Jinek等人(2012) Science 337:816-821)。最后，通过使用Bowtie(Langmead等人(2009) Genome Biology 10, R25)来将每个CRISPR位点重新比对回基因组上(在整个靶向序列中允许最多达三个碱基错配)来计算每个位点表现出脱靶效应的倾向。使用计算预测的脱靶，可以针对任何假性靶向测试每个gRNA。侧接预测的潜在脱靶位点的PCR引物可用于扩增基因组序列，其然后可以用T7EI测定法测试其切割效率。这将允许针对体外和体内优化实验监测靶向准确度。小于0.5％脱靶切割将是目标，尽管小于5％将是可接受的。
尽管已经聚焦于标准Cas9靶向，但也考虑替代方法，包括靶向替代PAM序列。已经报道了Cas9靶向具有除了标准NGG序列以外的NAG的PAM基序(Hsu等人(2013) Nature Biotechnology, doi:10.1038/nbt.2647)。已经鉴定了人序列中的两个CRISPR序列和与P23H突变重叠的小鼠基因组中的三个靶向序列，其可以提供额外的靶向位点。尽管预期NAGPAM位点效率低于NGG位点(Zhang等人(2014) Scientific Reports 4, 5405)，但这可以提供滴定剂量的机制，如果确定构建体具有显著的脱靶效应，这可以是有价值的。可以最初使用Gibson assembly (NEB)将使用NAG PAM位点的5个序列克隆至pH1v126中。两种人序列可以与Cas9质粒共转染(Lipofectamine 3000)至293细胞中，而小鼠质粒可以与Cas9质粒电穿孔(Invitrogen, Neon)至NIH3T3细胞中。为了检测gRNA活性，可以定量通过NHEJ在经典NGG以及非经典NAG位点之间的Cas9切割位点处引入的插入缺失突变的比率。
也可以使用称为CRISPRi的替代性治疗方法，其利用Cas9的核酸酶-死亡形式(dCas9)来特异性抑制P23H等位基因的表达(Qi等人(2013) Cell 152, 1173-1183;Gilbert等人(2013) Cell 154, 442-451; Larson等人(2013) Nature Protocols 8,2180-2196; Fuller等人(2014) Advances in Experimental Medicine and Biology 801, 773-781)。代替诱导切割，dCas9保持与DNA序列紧密结合，并且当靶向在活跃转录的基因内部时，通过位阻机制抑制pol II行进可以导致有效的转录抑制。通过在不诱导DNA断裂的情况下实现P23H的治疗性阻遏，并且鉴于组成型AAV表达，从基因疗法和调节障碍观点两者来看，转录抑制剂的AAV5递送可以是有利的。可以使用qRT-PCR来优化CRISPRi的转录抑制以测量视紫红质的等位基因特异性表达。
使用来自P23H小鼠的原代光感受器培养物验证开发的AAV5载体在体外切割和敲 除突变体视紫红质等位基因的表达的能力。
原代小鼠感光细胞培养物可用于在进行至动物研究之前体外验证靶向构建体。出生后第2-10天的动物可用于收获和离解小鼠视网膜以分离细胞用于靶向测定。在人(h)Rho:GFP小鼠中测试构建体(Chan等人(2004) Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 101, 9109-9114)可以允许进一步优化视紫红质靶向。hRho-GFP敲入小鼠含有敲入小鼠视紫红质开放阅读框的人视紫红质-GFP融合体(图17)。这种部分人源化的小鼠允许靶向感光细胞中的人特异性序列。可以靶向人rho序列，然后可以定量来自光感受器的GFP的损失。尽管靶向视紫红质，但GFP报道分子被同框融合，并且因此荧光的损失充当在上游靶位点的易错NHEJ的便利代理物。用视网膜细胞电穿孔，常规实现了10-20％的转染效率，并且为了富集CRISPR修饰的细胞群体，可以基于Cas9荧光报道分子的强度分选转染的群体。已经生成了与各种P2A:报道蛋白融合的几种Cas9构建体，其允许监测荧光活性，而不损害Cas9活性。使用来自Rho:GFP小鼠的视网膜培养物，可以将Cas9:P2A:mCherry报道分子和靶向gRNA电穿孔。然后，培养24小时之后，可以分选双阳性细胞，由此富集已转染的光感受器。48小时之后，可以将细胞重悬于QuickExtract缓冲液(Epicentre)中以收获基因组DNA，并通过T7EI测定法测定基因组修饰。类似地，可以使用来自P23H小鼠的原代光感受器培养物验证视紫红质突变的靶向。甚至用低水平的转染(10％)，如果构建体的靶向效率大于10％，可以使用T7EI测定法来检测基因组编辑，与初始结果一致。此外，AAV5载体的使用应当产生显著更高的转导效率。
还将进行中靶和脱靶位点的高分辨率和高灵敏度位点特异性深度测序分析。侧接CRISPR靶位点和预测的脱靶位点的基因组序列可以使用高保真聚合酶(NEB, Phusion)扩增15个循环，然后使用DNA Clean & Concentrator-5 (Zymo)纯化。纯化的PCR产物可以扩增5个循环以附接Illumina P5适配子和样品特异性条形码，再次纯化，然后通过SYBR绿色荧光定量，在BioAnalyzer上分析，并且最后以等摩尔比合并，然后用MiSeq Personal测序仪测序。为了分析测序数据，将300bp末端配对的MiSeq读数使用Illumina MiSeq Reporter软件解多重化，随后对原始读数进行适配子和质量修剪。将对所有读数针对野生型序列进行比对，并且将通过以下计算NHEJ频率：100 x (插入缺失读数的数目/插入缺失读数的数目 + WT读数的数目)。
验证来自SA2的改进载体在视网膜下注入P23H小鼠之后体内切割和敲除突变体视 紫红质等位基因的表达的能力。
下一步将是证明小鼠中的P23H视紫红质突变的体内靶向。从生物信息学努力，已经鉴定了与小鼠P23密码子重叠的高评分CRISPR靶向位点。形式N20NGG的CRISPR位点落在反向链上：5’-AGTACTGTGGGTACTCGAAGGGG-3’ (PAM加下划线)。P23H突变是将CCC脯氨酸密码子改变为CAC组氨酸密码子的C→A颠换。不幸的是，小鼠P23H突变在CRISPR位点内的位置落在NGG PAM基序的N中，在靶向位点中对bp同一性不可知的唯一位置。由于这意味着针对P23H序列的CRISPR将不能区分野生型和P23H序列，且因此预期靶向将切割两个等位基因，已经基于单核苷酸多态性(SNP)的发生率开发了替代方法。
在人类基因组中报道了~17百万个SNP(包括单碱基变异、插入缺失、STR、MNP等)(每180bp ~1个)，并且这种变异在个性化基因组医学背景中是极其重要的。据推测，利用自然遗传变异可能不仅提供特异性靶向小鼠模型中的P23H视紫红质等位基因的方法，而且还证明对于未来的基因组工程改造和治疗方法将可能变得更加相关的概念验证方法。发现castaneus(Cast)小鼠在不同于C57BL/6J序列的视紫红质基因的脯氨酸23密码子内含有SNP，并且获得C57BL/6J遗传背景上的P23H突变小鼠用于分析。SNP与P23H中的致病性C→A颠换直接相邻，其提供了用于靶向显性P23H等位基因、而不靶向野生型视紫红质等位基因的方法。由于P23H突变的背景是C57BL/6J，在一代Cast/P23H繁殖之后，获得杂合小鼠，其含有CRISPR可靶向的视紫红质P23H等位基因和(由于紧密连接的SNP差异)野生型CRISPR耐受的视紫红质等位基因(其通过位于gRNA目标的“种子”区域中的位置20处的单个错配而不同)(图18A、图18B和图18C)。
为了验证该策略的可行性，生成H1双向构建体，其靶向C57BL/6J脯氨酸23密码子序列(存在于P23H突变体等位基因中的密码子序列)或Cast小鼠中的脯氨酸23密码子序列(将存在于杂合P23H/Cast动物的WT视紫红质等位基因中)。将NIH3T3细胞(其含有C57BL/6JSNP)用两种构建体独立地电穿孔，分离基因组DNA，然后进行T7EI测定以定量基因组修饰的水平。观察到特异性视紫红质靶向：仅C57BL/6J(即P23H)定向构建体产生显著切割，其中基因组修饰水平接近50％，鉴于总体电穿孔效率低于80％，这可能是靶向潜能的低估(图19)。除了验证视紫红质靶向位点和通过紧密双向构建体引导切割的能力以外，这些结果证明在SNP/突变体序列特异性发生的体外切割，作为含有单碱基错配的基于Cast视紫红质序列的gRNA，未能产生可检测的Cas9切割。
通常认为CRISPR靶向的限制因素是有效的递送，并且AAV5介导的递送已经显示能够转导大多数光感受器（甚至大规模地为眼）。鉴于这种高转导率、在50％或更多的转导细胞中发生的基因编辑以及2/3的NHEJ事件导致移码突变，应当在多数视杆和(在进一步优化的情况下)在大多数视杆中实现P23H等位基因表达的敲除。研究表明，这种靶向水平应当足以通过直接保存视杆和通过对视锥存活的二次效应支持光感受器存活且维持合理好的视觉水平(Leveillard等人(2004) Nature Genetics 36, 755-759; Leveillard & Sahel(2010) Science Translational Medicine 2, 26ps16; Sahel等人(2013) Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie 251, 1669-1677)。可以将优化的病毒在P15视网膜下注射至10只小鼠的一只眼，如先前所述(Mao等人(2012)Advances in Experimental Medicine and Biology 723, 199-205; Mao等人(2012)Human Gene Therapy 23, 356-366; Mao等人(2011) Human Gene Therapy 22, 567-575)。可以在治疗后2、6和12周进行治疗的相比于伴侣对照眼的ERG和SDOCT(Bioptigen)分析。假设在12周时在治疗的眼中观察到功能和结构改善，可以进行长期终生研究。可以在处死时进行组织学分析，其将包括ONL厚度、蛛网图和用于在外部区段中正确定位的免疫组化视紫红质测定以及用于视紫红质水平的western印迹。
可以评价AAV5/CRISPR治疗的脱靶效应。全基因组测序是用于评价脱靶突变的偏倚最少的方法，并且对于证实靶位点将是理想的。可以收获和离解来自AAV处理和未处理的眼的小鼠视网膜，并且可以用DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen)提取基因组DNA，并用Covaris AFA剪切DNA。可以将DNA片段末端修复，A加尾并连接至Illumina条形码化的测序的适配子。连接的产物可以通过PCR扩增以生成条形码化的全基因组测序文库，并在HiSeq平台(Illumina)上以15x的平均覆盖度测序。然后可以使用Burrows–Wheeler Aligner以具有默认参数的‘mem’模式(‘bwa mem’)将测序读取与人参考基因组(hg19/GRCh37)比对。因为每个CRISPR切割事件导致独特的突变，所以假设DNA双链断裂的位点不会导致相同的从头突变。因此，丢弃由多个样品共享的所有变体将允许在随后的生物信息学分析中进行过滤。
参考文献
说明书中提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献指示本公开主题所属领域的技术人员的水平。所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利申请、专利和其他参考文献被具体和单独地指明通过引用并入。应当理解，尽管本文提及了许多专利申请、专利和其他参考文献，但此类参考文献并不构成承认任何这些文献形成本领域的公知常识的一部分。
尽管为了清楚理解的目的，已经通过举例说明和实例的方式相当详细地描述了前述主题，但本领域技术人员将理解，可以在所附权利要求的范围内实施某些改变和修改。

Claims (64)

1.包含一种或多种载体的非天然存在的CRISPR-Cas系统，所述载体包含：
a) H1启动子，其可操作连接至编码CRISPR-Cas系统向导RNA(gRNA)的至少一个核苷酸序列，其中所述gRNA与细胞中的DNA分子的靶序列杂交，且其中所述DNA分子编码在所述细胞中表达的一种或多种基因产物；和
b) 在细胞中可操作的调节元件，其可操作连接至编码Cas9蛋白的核苷酸序列，
其中组件(a)和(b)位于所述系统的相同或不同的载体上，其中所述gRNA靶向所述靶序列且与所述靶序列杂交，且所述Cas9蛋白切割所述DNA分子以改变一种或多种基因产物的表达。
2.权利要求1的系统，其中所述靶序列包含核苷酸序列AN19NGG、GN19NGG、CN19NGG或TN19NGG。
3.权利要求1的系统，其中将所述Cas9蛋白针对所述细胞中的表达进行密码子优化。
4.权利要求1的系统，其中所述Cas9蛋白是II型Cas9蛋白。
5.权利要求1的系统，其中所述细胞是真核细胞。
6.权利要求5的系统，其中所述真核细胞是哺乳动物或人细胞。
7.权利要求5的系统，其中所述真核细胞是视网膜感光细胞。
8.权利要求1的系统，其中所述一种或多种基因产物是视紫红质。
9.权利要求1的系统，其中所述一种或多种基因产物的表达减少。
10.权利要求1的系统，其中将所述系统包装至单个腺相关病毒(AAV)颗粒中。
11.改变细胞中的一种或多种基因产物的表达的方法，其中所述细胞包含编码一种或多种基因产物的DNA分子，所述方法包括将包含一种或多种载体的非天然存在的CRISPR-Cas系统引入所述细胞中，所述载体包含：
a) H1启动子，其可操作连接至编码CRISPR-Cas系统向导RNA(gRNA)的至少一个核苷酸序列，其中所述gRNA与所述DNA分子的靶序列杂交；和
b) 在细胞中可操作的调节元件，其可操作连接至编码Cas9蛋白的核苷酸序列，
其中组件(a)和(b)位于所述系统的相同或不同的载体上，其中所述gRNA靶向所述靶序列且与所述靶序列杂交，且所述Cas9蛋白切割所述DNA分子以改变一种或多种基因产物的表达。
12.权利要求11的方法，其中所述靶序列包含核苷酸序列AN19NGG、GN19NGG、CN19NGG或TN19NGG。
13.权利要求11的方法，其中将所述Cas9蛋白针对所述细胞中的表达进行密码子优化。
14.权利要求11的方法，其中所述Cas9蛋白是II型Cas9蛋白。
15.权利要求11的方法，其中所述细胞是真核细胞。
16.权利要求15的方法，其中所述真核细胞是哺乳动物或人细胞。
17.权利要求15的方法，其中所述细胞是视网膜感光细胞。
18.权利要求11的方法，其中所述一种或多种基因产物是视紫红质。
19.权利要求11的方法，其中所述一种或多种基因产物的表达减少。
20.权利要求11的方法，其中使用单个腺相关病毒(AAV)颗粒将所述系统引入所述细胞中。
21.包含载体的非天然存在的CRISPR-Cas系统，所述载体包含双向H1启动子，其中所述双向H1启动子包含：
a) 控制元件，其提供编码CRISPR-Cas系统向导RNA(gRNA)的至少一个核苷酸序列在一个方向的转录，其中所述gRNA与细胞中的DNA分子的靶序列杂交，且其中所述DNA分子编码在所述细胞中表达的一种或多种基因产物；和
b) 控制元件，其提供编码Cas9蛋白的核苷酸序列在相反方向的转录，
其中所述gRNA靶向所述靶序列且与所述靶序列杂交，且所述Cas9蛋白切割所述DNA分子以改变一种或多种基因产物的表达。
22.权利要求21的系统，其中所述靶序列包含核苷酸序列AN19NGG、GN19NGG、CN19NGG或TN19NGG。
23.权利要求21的系统，其中将所述Cas9蛋白针对所述细胞中的表达进行密码子优化。
24.权利要求21的系统，其中所述Cas9蛋白是II型Cas9蛋白。
25.权利要求21的系统，其中所述细胞是真核细胞。
26.权利要求25的系统，其中所述真核细胞是哺乳动物或人细胞。
27.权利要求25的系统，其中所述真核细胞是视网膜感光细胞。
28.权利要求21的系统，其中所述一种或多种基因产物是视紫红质。
29.权利要求21的系统，其中所述一种或多种基因产物的表达减少。
30.权利要求21的系统，其中将所述系统包装至单个腺相关病毒(AAV)颗粒中。
31.改变细胞中的一种或多种基因产物的表达的方法，其中所述细胞包含编码所述一种或多种基因产物的DNA分子，所述方法包括将包含含有双向H1启动子的载体的非天然存在的CRISPR-Cas系统引入所述细胞中，其中所述双向H1启动子包含：
a) 控制元件，其提供编码CRISPR-Cas系统向导RNA(gRNA)的至少一个核苷酸序列在一个方向的转录，其中所述gRNA与所述DNA分子的靶序列杂交；和
b) 控制元件，其提供编码Cas9蛋白的核苷酸序列在相反方向的转录，
其中所述gRNA靶向所述靶序列且与所述靶序列杂交，且所述Cas9蛋白切割DNA分子以改变所述细胞中的一种或多种基因产物的表达。
32.权利要求31的方法，其中所述靶序列包含核苷酸序列AN19NGG、GN19NGG、CN19NGG或TN19NGG。
33.权利要求31的方法，其中将所述Cas9蛋白针对所述细胞中的表达进行密码子优化。
34.权利要求31的方法，其中所述Cas9蛋白是II型Cas9蛋白。
35.权利要求31的方法，其中所述细胞是真核细胞。
36.权利要求35的方法，其中所述真核细胞是哺乳动物或人细胞。
37.权利要求35的方法，其中所述真核细胞是视网膜感光细胞。
38.权利要求31的方法，其中所述一种或多种基因产物是视紫红质。
39.权利要求31的方法，其中所述一种或多种基因产物的表达减少。
40.权利要求31的方法，其中使用单个腺相关病毒(AAV)颗粒将所述系统引入所述细胞中。
41.适配子调节的核酶，其包含：
a) 顺式作用锤头核酶，其包含催化核心和由其延伸的螺旋I、螺旋II和螺旋III双链体区，其中螺旋II双链体区和螺旋III双链体区各自包含与所述催化核心相对的环区域，且其中所述螺旋II双链体区包含结合配体的适配子；
b) 编码CRISPR-Cas系统向导RNA(gRNA)的核苷酸序列，其中所述gRNA与真核细胞中的DNA分子的靶序列杂交，且其中所述DNA分子编码在所述真核细胞中表达的一种或多种基因产物，其中所述核苷酸序列包含5'末端和3'末端，且其中所述核苷酸序列的5'末端直接偶联至所述螺旋III双链体区；
其中所述配体与所述适配子的结合产生核酶的构象变化，使得所述核酶经历在所述核苷酸序列的5'末端和所述螺旋III双链体区之间的自我切割，其中释放gRNA。
42.权利要求41的适配子调节的核酶，其中所述配体是茶碱。
43.表达构建体，其包含：
(a) 编码序列，其当转录为RNA时产生权利要求41的适配子调节的核酶；和
(b) 一种或多种转录调节序列，其调节细胞中的RNA的转录。
44.真核细胞，其包含权利要求43的表达构建体。
45.改变细胞中的一种或多种基因产物的表达的方法，其中所述细胞包含编码所述一种或多种基因产物的DNA分子，所述方法包括将权利要求43的表达构建体引入所述细胞中，且使所述细胞与所述配体以改变核酶的活性的量接触。
46.权利要求45的方法，其中所述细胞是真核细胞。
47.权利要求45的方法，其中所述细胞在主体中。
48.权利要求45的方法，其中所述主体是人。
49.权利要求45的方法，其中所述配体是茶碱。
50.用于在有需要的主体中治疗眼部神经变性疾病的方法，所述方法包括：
(a) 提供包含一种或多种载体的非天然存在的CRISPR-Cas系统，所述载体包含：
i) H1启动子，其可操作连接至编码CRISPR-Cas系统向导RNA(gRNA)的至少一个核苷酸序列，其中所述gRNA与所述主体的细胞中的DNA分子的靶序列杂交，且其中所述DNA分子编码在所述细胞中表达的一种或多种基因产物；和
ii) 在细胞中可操作的调节元件，其可操作连接至编码Cas9蛋白的核苷酸序列，
其中组件(i)和(ii)位于所述系统的相同或不同的载体上，其中所述gRNA靶向所述靶序列且与所述靶序列杂交，且所述Cas9蛋白切割所述DNA分子以改变一种或多种基因产物的表达；且
(b) 向所述主体施用有效量的所述系统。
51.权利要求50的方法，其中已经在主体中观察到视网膜感光细胞的功能障碍和/或死亡。
52.权利要求50的方法，其中所述眼部神经变性疾病选自青光眼、视网膜变性和年龄相关性黄斑变性。
53.权利要求50的方法，其中所述眼部神经变性疾病是视网膜色素变性(RP)。
54.权利要求50的方法，其中所述细胞是视网膜感光细胞。
55.权利要求50的方法，其中所述一种或多种基因产物是视紫红质。
56.权利要求50的方法，其中所述H1启动子是双向的。
57.权利要求50的方法，其中在施用于所述主体之前，将所述系统包装至单个腺相关病毒(AAV)颗粒中。
58.权利要求50的方法，其中施用于所述主体通过视网膜下注射发生。
59.权利要求50的方法，其中所述主体是人。
60.权利要求50的方法，其中所述Cas9蛋白是II型Cas9蛋白。
61.权利要求50的方法，其中所述靶序列包含核苷酸序列AN19NGG、GN19NGG、CN19NGG或TN19NGG。
62.权利要求50的方法，其中将所述Cas9蛋白针对所述细胞中的表达进行密码子优化。
63.权利要求50的方法，其进一步包括以改变核酶的活性的量施用权利要求43的表达构建体和配体。
64.权利要求63的方法，其中所述配体是茶碱。
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