JP2021052809A - H1プロモーターを用いるcrisprガイドrnaの発現のための組成物および方法 - Google Patents
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-
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-
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Abstract
Description
本願は、2014年6月16日に出願された米国仮出願第62/012,802号の利
益を主張する。この出願は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
本出願は、配列表を含有する。配列表は、「111232-00401_ST25.t
xt」と称するASCIIテキストファイルとして、EFS−Webを介する電子媒体に
より提出された。配列表は、14,827バイトのサイズであり、2015年6月2日に
作成された。配列表は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる。
cas(CRISPR関連:CRISPR−associated)遺伝子と併せたC
RISPR(clustered regularly interspaced sh
ort palindromic repeat)は、細菌内および古細菌内の侵入性外
来核酸に対する獲得性抵抗性をもたらす後天性免疫系を含む(Barrangouら(2007年
)、Science、315巻:1709〜12頁)。CRISPRは、スペーサーと呼ばれる
、同様のサイズの、固有の可変的DNA配列であって、ファージDNAまたはプラスミド
DNAに由来することが多いDNA配列を介在させた、一連の短い保存的リピート配列か
らなる(Barrangouら(2007年)、Science、315巻:1709〜12頁;Bolotin
ら(2005年)、Microbiology、151巻:2551〜61頁;Mojicaら(2005年
)、J. Mol. Evol.、60巻:174〜82頁)。CRISPR−Cas系は、CRI
SPR領域中に挿入され、マッチする配列を保有するファージおよびプラスミドへのその
後の曝露に対する免疫をもたらす、外来DNA(スペーサー)の短い断片を獲得すること
により機能する(Barrangouら(2007年)、Science、315巻:1709〜12頁;
Brounsら(2008年)、Science、321巻:960〜64頁)。外来核酸のcrRN
A媒介型サイレンシングを可能とするのは、このCRISPR−Cas干渉/免疫である
(HorvathおよびBarrangou(2010年)、Science、327巻:167〜70頁;Devea
uら(2010年)、Annu. Rev. Microbiol.、64巻:475〜93頁;Marraffiniお
よびSontheimer(2010年)、Nat. Rev. Genet.、11巻:181〜90頁;Bhaya
ら(2011年)、Annu. Rev. Genet.、45巻:273〜97頁;Wiedenheftら(2
012年)、Nature、482巻:331〜338頁)。
アーゼ活性に依拠するCRISPR構築物(Makarovaら(2011年)、Nat. Rev. Mi
crobiol.、9巻:467〜77頁)の使用は近年、ゲノム操作を革命化し、DNA配列の
前例のない取扱いを可能としている。CRISPR/Cas9構築物は、合成が簡単かつ
迅速であり、マルチプレックス化することもできる。しかし、それらの合成の相対的な容
易さにもかかわらず、CRISPRには、Cas9自体の特性およびそのgRNAの合成
の両方の関数である、ターゲティング可能なゲノム空間へのそれらのアクセスに関する技
術的制限がある。
に見出される短いヌクレオチドモチーフである、必須のプロトスペーサー隣接モチーフ(
PAM)への、gRNAの相補的塩基対合を要請する(Jinekら(2012年)、Science
、337巻:816〜821頁)。理論的には、CRISPR技術を使用して、ゲノム内
の、任意の固有のN20−PAM配列をターゲティングすることができる。援用される具
体的なCas9の由来する種に応じて変動する、PAM配列のDNA結合特異性は、1つ
の制約を課する。現在のところ、制限が最も小さく、最も一般的に使用されているCas
9タンパク質は、配列NGGを認識する、S.pyogenesに由来し、こうして、ゲ
ノム内の任意の固有の21ヌクレオチドの配列に続く2つのグアノシンヌクレオチド(N
20NGG)をターゲティングすることができる。タンパク質構成要素により付与される
、利用可能なターゲティング空間の拡大は、PAM要件を変更した新規のCas9タンパ
ク質の発見および使用(Congら(2013年)、Science、339巻:819〜823頁
;Houら(2013年)、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、110巻(39号):1
5644〜9頁)、または進行中の新規のCas9変異体の作出であって、突然変異誘発
もしくは指向性進化を介する作出に限定される。
NAの発現から生じる。RNAポリメラーゼIIIプロモーターのIII型クラスの使用
は、これらの短い非コード転写物が、十分に規定された末端を有し、1+ヌクレオチドを
除く、転写に必要な全てのエレメントが、上流のプロモーター領域内に含有されるため、
gRNAの発現に特に適している。しかし、一般に使用されるU6プロモーターは、転写
の開始に、グアノシンヌクレオチドを要請するので、U6プロモーターの使用により、ゲ
ノムのターゲティング部位は、GN19NGGにさらに制約される(Maliら(2013年
)、Science、339巻:823〜826頁;Dingら(2013年)、Cell Stem Cell
、12巻:393〜394頁)。T7プロモーター、T3プロモーター、またはSP6プ
ロモーターによるin vitro転写など、代替的な手法もまた、グアノシンヌクレオ
チドによる開始を要請するであろう(Adhyaら(1981年)、Proc. Natl. Acad. Sc
i. U.S.A.、78巻:147〜151頁;Meltonら(1984年)、Nucleic Acids Re
s.、12巻:7035〜7056頁;Pleissら(1998年)、RNA、4巻:1313〜
1317頁)。
本発明の実施は、そうでないことが指示されない限りにおいて、当技術分野の技術の範
囲内にある従来の技法であって、細胞生物学、細胞の培養、分子生物学、トランスジェニ
ック生物学、微生物学、組換え核酸(例えば、DNA)技術、免疫学、およびRNA干渉
(RNAi)の技法を援用することが典型的であろう。これらの技法のうちのいくつかに
ついての非限定的な記載は、以下の刊行物:Ausubel, F.ら(編)、Current Protocols
in Molecular Biology、Current Protocols in Immunology、Current Protocols
in Protein Science、およびCurrent Protocols in Cell Biology、2008年
12月現在の版では、全てJohn Wiley & Sons、N.Y.;Sambrook、RussellおよびSambr
ook、Molecular Cloning. A Laboratory Manual、第3版、Cold Spring Harbor L
aboratory Press、Cold Spring Harbor、2001年;Harlow, EおよびLane, D.、A
ntibodies - A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Co
ld Spring Harbor、1988年;Freshney, R. I.、「Culture of Animal Cells,
A Manual of Basic Technique」、第5版、John Wiley & Sons、Hoboken、N.J.
、2005年において見出される。治療剤およびヒト疾患に関する非限定的な情報は、Go
odman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics、第11版、M
cGraw Hill、2005年、Katzung, B.(編)、Basic and Clinical Pharmacology
、McGraw-Hill/Appleton & Lange、第10版(2006年)、または第11版(200
9年7月)において見出される。遺伝子および遺伝障害に関する非限定的な情報は、McKu
sick, V. A.、Mendelian Inheritance in Man. A Catalog of Human Genes a
nd Genetic Disorders、Baltimore: Johns Hopkins University Press、1998
年(第12版)、または2010年5月1日現在、World Wide Web:ht
tp://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/で入手可能である、
より近年のオンラインデータベース:Online Mendelian Inheri
tance in Man、OMIM(商標)、McKusick−Nathans I
nstitute of Genetic Medicine、Johns Hopki
ns University(Baltimore、Md.)およびNational
Center for Biotechnology Information、Nat
ional Library of Medicine(Bethesda、Md.)、
ならびにWorld Wide Web:http://omia.angis.org
.au/contact.shtmlで入手可能である、動物種(ヒトおよびマウス以外
)における遺伝子、遺伝性障害、および形質についてのデータベースである、Onlin
e Mendelian Inheritance in Animals(OMIA)
において見出される。本明細書で言及される、全ての特許、特許出願、および他の刊行物
(例えば、学術論文、書籍、ウェブサイト、およびデータベース)は、参照によりそれら
の全体において組み込まれる。本明細書と組み込まれる参考文献のうちのいずれかとの間
で利益相反が生じる場合は、本明細書(組み込まれる参考文献に基づきうる、その任意の
修正を含む)により裁定するものとする。本明細書では、そうでないことが指示されない
限りにおいて、当技術分野で許容される、用語の標準的な意味を使用する。本明細書では
、多様な用語について、標準的な略号を使用する。
Aを発現させるための組成物および方法を提供する。本明細書で開示される主題は、1ま
たは複数のベクターを含む非自然発生のCRISPR−Cas系を提供し、このCRIS
PR−Cas系は、a)CRISPR−Cas系のガイドRNA(gRNA)をコードす
る少なくとも1つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したH1プロモーターであって、
gRNAが、細胞内のDNA分子の標的配列とハイブリダイズし、DNA分子が、細胞内
で発現する1または複数の遺伝子産物をコードする、H1プロモーター;と、b)細胞内
で作動可能な調節エレメントであって、Cas9タンパク質をコードするヌクレオチド配
列に作動可能に連結した調節エレメントとを含み、構成要素(a)および(b)が、系の
同じベクターまたは異なるベクターに配置され、gRNAが、標的配列をターゲティング
し、これとハイブリダイズし、Cas9タンパク質が、DNA分子を切断して、1または
複数の遺伝子産物の発現を変更する。一部の態様では、標的配列は、ヌクレオチド配列A
N19NGG、GN19NGG、CN19NGG、またはTN19NGGを含む。一部の
態様では、細胞は、真核細胞である。一部の態様では、真核細胞は、哺乳動物細胞または
ヒト細胞である。一部の態様では、真核細胞は、網膜光受容体細胞である。一部の態様で
は、Cas9タンパク質は、細胞内の発現についてコドンが最適化されている。一部の態
様では、Cas9タンパク質は、II型Cas9タンパク質である。一部の態様では、1
または複数の遺伝子産物の発現が低減される。一部の態様では、1または複数の遺伝子産
物は、ロドプシンである。一部の態様では、系を、単一のアデノ随伴ウイルス(AAV)
粒子中にパッケージングする。
を提供し、この非自然発生のCRISPR−Cas系は、a)CRISPR−Cas系の
ガイドRNA(gRNA)をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列に作動可能に
連結したH1プロモーターであって、gRNAが、真核細胞内のDNA分子の標的配列と
ハイブリダイズし、DNA分子が、真核細胞内で発現する1または複数の遺伝子産物をコ
ードする、H1プロモーターと;b)真核細胞内で作動可能な調節エレメントであって、
II型Cas9タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した調節エレ
メントとを含む1または複数のベクターを含み、構成要素(a)および(b)が、系の同
じベクターまたは異なるベクターに配置され、gRNAが、標的配列をターゲティングし
、これとハイブリダイズし、Cas9タンパク質が、DNA分子を切断し、1または複数
の遺伝子産物の発現を変更する。別の態様では、標的配列は、ヌクレオチド配列AN19
NGG、GN19NGG、CN19NGG、またはTN19NGGを含む。別の態様では
、Cas9タンパク質は、細胞内の発現についてコドンが最適化されている。さらに別の
態様では、Cas9タンパク質は、真核細胞内の発現についてコドンが最適化されている
。さらなる態様では、真核細胞は、哺乳動物細胞またはヒト細胞である。別の態様では、
1または複数の遺伝子産物の発現が低減される。
る方法を提供し、この細胞が、1または複数の遺伝子産物をコードするDNA分子を含み
、この方法が、細胞中に、非自然発生のCRISPR−Cas系を導入するステップを含
み、この非自然発生のCRISPR−Cas系は、a)CRISPR−Cas系のガイド
RNA(gRNA)をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列に作動可能に連結し
たH1プロモーターであって、gRNAが、DNA分子の標的配列とハイブリダイズする
、H1プロモーターと;b)細胞内で作動可能な調節エレメントであって、Cas9タン
パク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した調節エレメントとを含む1ま
たは複数のベクターを含み、構成要素(a)および(b)が、系の同じベクターまたは異
なるベクターに配置され、gRNAが、標的配列をターゲティングし、これとハイブリダ
イズし、Cas9タンパク質が、DNA分子を切断して、1または複数の遺伝子産物の発
現を変更するも提供する。一部の態様では、標的配列は、ヌクレオチド配列AN19NG
G、GN19NGG、CN19NGG、またはTN19NGGを含む。一部の態様では、
細胞は、真核細胞である。一部の態様では、真核細胞は、哺乳動物細胞またはヒト細胞で
ある。一部の態様では、真核細胞は、網膜光受容体細胞である。一部の態様では、Cas
9タンパク質は、細胞内の発現についてコドンが最適化されている。一部の態様では、C
as9タンパク質は、II型Cas9タンパク質である。一部の態様では、1または複数
の遺伝子産物の発現が低減される。一部の態様では、1または複数の遺伝子産物は、ロド
プシンである。一部の態様では、系を、単一のアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子中にパ
ッケージングする。
物の発現を変更する方法を提供し、この細胞が、1または複数の遺伝子産物をコードする
DNA分子を含み、この方法が、細胞中に、非自然発生のCRISPR−Cas系を導入
するステップを含み、この非自然発生のCRISPR−Cas系が、a)CRISPR−
Cas系のガイドRNA(gRNA)をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列に
作動可能に連結したH1プロモーターであって、gRNAが、DNA分子の標的配列とハ
イブリダイズする、H1プロモーターと;b)真核細胞内で作動可能な調節エレメントで
あって、II型Cas9タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した
調節エレメントとを含む1または複数のベクターを含み、構成要素(a)および(b)が
、系の同じベクターまたは異なるベクターに配置され、gRNAが、標的配列をターゲテ
ィングし、これとハイブリダイズし、Cas9タンパク質が、DNA分子を切断し、1ま
たは複数の遺伝子産物の発現を変更する。別の態様では、標的配列は、ヌクレオチド配列
AN19NGG、GN19NGG、CN19NGG、またはTN19NGGを含む。別の
態様では、Cas9タンパク質は、細胞内の発現についてコドンが最適化されている。さ
らに別の態様では、Cas9タンパク質は、真核細胞内の発現についてコドンが最適化さ
れている。さらなる態様では、真核細胞は、哺乳動物細胞またはヒト細胞である。別の態
様では、1または複数の遺伝子産物の発現が低減される。
自然発生のCRISPR−Cas系を提供し、双方向性H1プロモーターが、a)CRI
SPR−Cas系のガイドRNA(gRNA)をコードする少なくとも1つのヌクレオチ
ド配列の1つの方向の転写をもたらす制御エレメントであって、gRNAが、細胞内のD
NA分子の標的配列とハイブリダイズし、DNA分子が、細胞内で発現する1または複数
の遺伝子産物をコードする、制御エレメントと;b)Cas9タンパク質をコードするヌ
クレオチド配列の反対方向の転写をもたらす制御エレメントとを含み、gRNAが、標的
配列をターゲティングし、これとハイブリダイズし、Cas9タンパク質が、DNA分子
を切断して、1または複数の遺伝子産物の発現を変更する。一部の態様では、標的配列は
、ヌクレオチド配列AN19NGG、GN19NGG、CN19NGG、またはTN19
NGGを含む。一部の態様では、細胞は、真核細胞である。一部の態様では、真核細胞は
、哺乳動物細胞またはヒト細胞である。一部の態様では、真核細胞は、網膜光受容体細胞
である。一部の態様では、Cas9タンパク質は、細胞内の発現についてコドンが最適化
されている。一部の態様では、Cas9タンパク質は、II型Cas9タンパク質である
。一部の態様では、1または複数の遺伝子産物の発現が低減される。一部の態様では、1
または複数の遺伝子産物は、ロドプシンである。一部の態様では、系を、単一のアデノ随
伴ウイルス(AAV)粒子中にパッケージングする。
ベクターを含む非自然発生のCRISPR−Cas系を提供し、ここで、双方向性H1プ
ロモーターが、a)CRISPR−Cas系のガイドRNA(gRNA)をコードする少
なくとも1つのヌクレオチド配列の1つの方向の転写をもたらす制御エレメントであって
、gRNAが、真核細胞内のDNA分子の標的配列とハイブリダイズし、DNA分子が、
真核細胞内で発現する1または複数の遺伝子産物をコードする、制御エレメントと;b)
II型Cas9タンパク質をコードするヌクレオチド配列の反対方向の転写をもたらす制
御エレメントとを含み、gRNAが、標的配列をターゲティングし、これとハイブリダイ
ズし、Cas9タンパク質が、DNA分子を切断し、1または複数の遺伝子産物の発現を
変更する。別の態様では、標的配列は、ヌクレオチド配列AN19NGG、GN19NG
G、CN19NGG、またはTN19NGGを含む。さらに別の態様では、Cas9タン
パク質は、真核細胞内の発現についてコドンが最適化されている。さらなる態様では、真
核細胞は、哺乳動物細胞またはヒト細胞である。別の態様では、1または複数の遺伝子産
物の発現が低減される。
る方法を提供し、ここで、この細胞が、1または複数の遺伝子産物をコードするDNA分
子を含み、この方法が、細胞中に、双方向性H1プロモーターを含むベクターを含む非自
然発生のCRISPR−Cas系を導入するステップを含み、双方向性H1プロモーター
が、a)CRISPR−Cas系のガイドRNA(gRNA)をコードする少なくとも1
つのヌクレオチド配列の1つの方向の転写をもたらす制御エレメントであって、gRNA
が、DNA分子の標的配列とハイブリダイズする、制御エレメントと;b)Cas9タン
パク質をコードするヌクレオチド配列の反対方向の転写をもたらす制御エレメントとを含
み、gRNAが、標的配列をターゲティングし、これとハイブリダイズし、Cas9タン
パク質が、DNA分子を切断して、細胞内の1または複数の遺伝子産物の発現を変更する
。一部の態様では、標的配列は、ヌクレオチド配列AN19NGG、GN19NGG、C
N19NGG、またはTN19NGGを含む。一部の態様では、細胞は、真核細胞である
。一部の態様では、真核細胞は、哺乳動物細胞またはヒト細胞である。一部の態様では、
真核細胞は、網膜光受容体細胞である。一部の態様では、Cas9タンパク質は、細胞内
の発現についてコドンが最適化されている。一部の態様では、Cas9タンパク質は、I
I型Cas9タンパク質である。一部の態様では、1または複数の遺伝子産物の発現が低
減される。一部の態様では、1または複数の遺伝子産物は、ロドプシンである。一部の態
様では、系を、単一のアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子中にパッケージングする。
更する方法を提供し、ここで、この細胞が、1または複数の遺伝子産物をコードするDN
A分子を含み、この方法が、細胞中に、双方向性H1プロモーターを含むベクターを含む
非自然発生のCRISPR−Cas系を導入するステップを含み、双方向性H1プロモー
ターが、a)CRISPR−Cas系のガイドRNA(gRNA)をコードする少なくと
も1つのヌクレオチド配列の1つの方向の転写をもたらす制御エレメントであって、gR
NAが、DNA分子の標的配列とハイブリダイズする、制御エレメントと;b)II型C
as9タンパク質をコードするヌクレオチド配列の反対方向の転写をもたらす制御エレメ
ントとを含み、gRNAが、標的配列をターゲティングし、これとハイブリダイズし、C
as9タンパク質が、DNA分子を切断し、1または複数の遺伝子産物の発現を変更する
。別の態様では、標的配列は、ヌクレオチド配列AN19NGG、GN19NGG、CN
19NGG、またはTN19NGGを含む。さらに別の態様では、Cas9タンパク質は
、真核細胞内の発現についてコドンが最適化されている。さらなる態様では、真核細胞は
、哺乳動物細胞またはヒト細胞である。別の態様では、1または複数の遺伝子産物の発現
が低減される。
マー調節型リボザイムは、a)触媒性コアと、そこから伸長する、ヘリックスI、ヘリッ
クスII、およびヘリックスIIIの二重鎖領域とを含むシス作用型ハンマーヘッド型リ
ボザイムであって、ヘリックスIIの二重鎖領域およびヘリックスIIIの二重鎖領域の
各々が、触媒性コアの反対側にループ領域を含み、ヘリックスIIの二重鎖領域が、リガ
ンドに結合するアプタマーを含む、シス作用型ハンマーヘッド型リボザイムと;b)CR
ISPR−Cas系のガイドRNA(gRNA)をコードするヌクレオチド配列であって
、gRNAが、真核細胞内のDNA分子の標的配列とハイブリダイズし、DNA分子が、
真核細胞内で発現する1または複数の遺伝子産物をコードし、ヌクレオチド配列が、5’
末端および3’末端を含み、ヌクレオチド配列の5’末端が、ヘリックスIIIの二重鎖
領域と直接カップリングしている、ヌクレオチド配列とを含み、リボザイムが、ヌクレオ
チド配列の5’末端と、ヘリックスIIIの二重鎖領域との間の自己切断を経るように、
リガンドのアプタマーへの結合により、リボザイム内のコンフォメーション変化がもたら
され、gRNAが産生される。また、(i)RNAに転写されると、アプタマー調節型リ
ボザイムをもたらすコード配列と;(ii)真核細胞内のRNAの転写を調節する、1ま
たは複数の転写調節配列とを含む発現構築物も提供される。また、発現構築物を含む真核
細胞も提供される。また、真核細胞内の1または複数の遺伝子産物の発現を変更する方法
であって、細胞が、1または複数の遺伝子産物をコードするDNA分子を含み、方法が、
発現構築物を細胞中に導入するステップと、細胞をリガンドと、リボザイムの活性を変更
する量で接触させるステップとを含み、特に、細胞が、哺乳動物被験体またはヒト被験体
における細胞である方法も提供される。一態様では、リガンドは、テオフィリンである。
体における眼の神経変性疾患を処置するための方法を提供し、この方法は、(a)i)C
RISPR−Cas系のガイドRNA(gRNA)をコードする少なくとも1つのヌクレ
オチド配列に作動可能に連結したH1プロモーターであって、gRNAが、被験体の細胞
内のDNA分子の標的配列とハイブリダイズし、DNA分子が、細胞内で発現する1また
は複数の遺伝子産物をコードする、H1プロモーターと;ii)細胞内で作動可能な調節
エレメントであって、Cas9タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連
結した調節エレメントとを含む1または複数のベクターを含む非自然発生のCRISPR
−Cas系であって、構成要素(i)および(ii)が、系の同じベクターまたは異なる
ベクターに配置され、gRNAが、標的配列をターゲティングし、これとハイブリダイズ
し、Cas9タンパク質が、DNA分子を切断して、1または複数の遺伝子産物の発現を
変更する、CRISPR−Cas系を用意するステップと;(b)被験体に有効量の系を
投与するステップとを含む。一部の態様では、網膜光受容体細胞の機能不全および/また
は死が、被験体において観察されている。一部の態様では、眼の神経変性疾患は、緑内障
、網膜変性、および加齢黄斑変性からなる群から選択される。一部の態様では、眼の神経
変性疾患は、色素性網膜炎(RP)である。一部の態様では、細胞は、網膜光受容体細胞
である。一部の態様では、1または複数の遺伝子産物は、ロドプシンである。一部の態様
では、H1プロモーターは、双方向性である。一部の態様では、被験体に投与するステッ
プの前に、系を、単一のアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子中にパッケージングする。一
部の態様では、被験体に投与するステップを、網膜下注射により行う。一部の態様では、
被験体は、ヒトである。一部の態様では、Cas9タンパク質は、II型Cas9タンパ
ク質である。一部の態様では、標的配列は、ヌクレオチド配列AN19NGG、GN19
NGG、CN19NGG、またはTN19NGGを含む。一部の態様では、Cas9タン
パク質は、細胞内の発現についてコドンが最適化されている。一部の態様では、本明細書
で開示される方法は、発現構築物およびリガンドを、リボザイムの活性を変更する量で投
与するステップをさらに含む。一部の態様では、リガンドは、テオフィリンである。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される:
(項目1)
非自然発生のCRISPR−Cas系であって、前記系は、
a)CRISPR−Cas系のガイドRNA(gRNA)をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したH1プロモーターであって、前記gRNAが、細胞内のDNA分子の標的配列とハイブリダイズし、前記DNA分子が、前記細胞内で発現する1または複数の遺伝子産物をコードする、H1プロモーターと;
b)細胞内で作動可能な調節エレメントであって、Cas9タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した調節エレメントと
を含む1または複数のベクターを含み、
構成要素(a)および(b)が、前記系の同じベクターまたは異なるベクターに配置され、前記gRNAが、前記標的配列をターゲティングし、これとハイブリダイズし、前記Cas9タンパク質が、前記DNA分子を切断して、前記1または複数の遺伝子産物の発現を変更する、系。
(項目2)
前記標的配列が、ヌクレオチド配列AN19NGG、GN19NGG、CN19NGG、またはTN19NGGを含む、項目1に記載の系。
(項目3)
前記Cas9タンパク質が、前記細胞内の発現についてコドンが最適化されている、項目1に記載の系。
(項目4)
前記Cas9タンパク質が、II型Cas9タンパク質である、項目1に記載の系。
(項目5)
前記細胞が、真核細胞である、項目1に記載の系。
(項目6)
前記真核細胞が、哺乳動物細胞またはヒト細胞である、項目5に記載の系。
(項目7)
前記真核細胞が、網膜光受容体細胞である、項目5に記載の系。
(項目8)
前記1または複数の遺伝子産物が、ロドプシンである、項目1に記載の系。
(項目9)
前記1または複数の遺伝子産物の前記発現が低減される、項目1に記載の系。
(項目10)
前記系が、単一のアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子中にパッケージングされている、項目1に記載の系。
(項目11)
細胞内の1または複数の遺伝子産物の発現を変更する方法であって、前記細胞が、前記1または複数の遺伝子産物をコードするDNA分子を含み、前記方法が、前記細胞中に、非自然発生のCRISPR−Cas系を導入するステップを含み、前記系が、
a)CRISPR−Cas系のガイドRNA(gRNA)をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したH1プロモーターであって、前記gRNAが、前記DNA分子の標的配列とハイブリダイズする、H1プロモーターと;
b)前記細胞内で作動可能な調節エレメントであって、Cas9タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した調節エレメントと
を含む1または複数のベクターを含み、
構成要素(a)および(b)が、前記系の同じベクターまたは異なるベクターに配置され、前記gRNAが、前記標的配列をターゲティングし、これとハイブリダイズし、前記Cas9タンパク質が、前記DNA分子を切断して、前記1または複数の遺伝子産物の発現を変更する、方法。
(項目12)
前記標的配列が、ヌクレオチド配列AN19NGG、GN19NGG、CN19NGG、またはTN19NGGを含む、項目11に記載の方法。
(項目13)
前記Cas9タンパク質が、前記細胞内の発現についてコドンが最適化されている、項目11に記載の方法。
(項目14)
前記Cas9タンパク質が、II型Cas9タンパク質である、項目11に記載の方法。
(項目15)
前記細胞が、真核細胞である、項目11に記載の方法。
(項目16)
前記真核細胞が、哺乳動物細胞またはヒト細胞である、項目15に記載の方法。
(項目17)
前記細胞が、網膜光受容体細胞である、項目15に記載の方法。
(項目18)
前記1または複数の遺伝子産物が、ロドプシンである、項目11に記載の方法。
(項目19)
前記1または複数の遺伝子産物の前記発現が低減される、項目11に記載の方法。
(項目20)
前記系を、前記細胞中に、単一のアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子を使用して導入する、項目11に記載の方法。
(項目21)
双方向性H1プロモーターを含むベクターを含む非自然発生のCRISPR−Cas系であって、前記双方向性H1プロモーターが、
a)CRISPR−Cas系のガイドRNA(gRNA)をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列の1つの方向の転写をもたらす制御エレメントであって、前記gRNAが、細胞内のDNA分子の標的配列とハイブリダイズし、前記DNA分子が、前記細胞内で発現する1または複数の遺伝子産物をコードする、制御エレメントと;
b)Cas9タンパク質をコードするヌクレオチド配列の反対方向の転写をもたらす制御エレメントと
を含み、
前記gRNAが、前記標的配列をターゲティングし、これとハイブリダイズし、前記Cas9タンパク質が、前記DNA分子を切断して、前記1または複数の遺伝子産物の発現を変更する、CRISPR−Cas系。
(項目22)
前記標的配列が、ヌクレオチド配列AN19NGG、GN19NGG、CN19NGG、またはTN19NGGを含む、項目21に記載の系。
(項目23)
前記Cas9タンパク質が、前記細胞内の発現についてコドンが最適化されている、項目21に記載の系。
(項目24)
前記Cas9タンパク質が、II型Cas9タンパク質である、項目21に記載の系。
(項目25)
前記細胞が、真核細胞である、項目21に記載の系。
(項目26)
前記真核細胞が、哺乳動物細胞またはヒト細胞である、項目25に記載の系。
(項目27)
前記真核細胞が、網膜光受容体細胞である、項目25に記載の系。
(項目28)
前記1または複数の遺伝子産物が、ロドプシンである、項目21に記載の系。
(項目29)
前記1または複数の遺伝子産物の前記発現が低減される、項目21に記載の系。
(項目30)
前記系が、単一のアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子中にパッケージングされる、項目21に記載の系。
(項目31)
細胞内の1または複数の遺伝子産物の発現を変更する方法であって、前記細胞が、前記1または複数の遺伝子産物をコードするDNA分子を含み、前記方法が、前記細胞中に、双方向性H1プロモーターを含むベクターを含む非自然発生のCRISPR−Cas系を導入するステップを含み、前記双方向性H1プロモーターが、
a)CRISPR−Cas系のガイドRNA(gRNA)をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列の1つの方向の転写をもたらす制御エレメントであって、前記gRNAが、前記DNA分子の標的配列とハイブリダイズする、制御エレメントと;
b)Cas9タンパク質をコードするヌクレオチド配列の反対方向の転写をもたらす制御エレメントと
を含み、
前記gRNAが、前記標的配列をターゲティングし、これとハイブリダイズし、前記Cas9タンパク質が、前記DNA分子を切断して、前記細胞内の前記1または複数の遺伝子産物の発現を変更する、方法。
(項目32)
前記標的配列が、ヌクレオチド配列AN19NGG、GN19NGG、CN19NGG、またはTN19NGGを含む、項目31に記載の方法。
(項目33)
前記Cas9タンパク質が、前記細胞内の発現についてコドンが最適化されている、項目31に記載の方法。
(項目34)
前記Cas9タンパク質が、II型Cas9タンパク質である、項目31に記載の方法。
(項目35)
前記細胞が、真核細胞である、項目31に記載の方法。
(項目36)
前記真核細胞が、哺乳動物細胞またはヒト細胞である、項目35に記載の方法。
(項目37)
前記真核細胞が、網膜光受容体細胞である、項目35に記載の方法。
(項目38)
前記1または複数の遺伝子産物が、ロドプシンである、項目31に記載の方法。
(項目39)
前記1または複数の遺伝子産物の前記発現が低減される、項目31に記載の方法。
(項目40)
前記系を、前記細胞中に、単一のアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子を使用して導入する、項目31に記載の方法。
(項目41)
アプタマー調節型リボザイムであって、前記アプタマー調節型リボザイムは、
a)触媒性コアと、そこから伸長する、ヘリックスI、ヘリックスII、およびヘリックスIIIの二重鎖領域とを含むシス作用型ハンマーヘッド型リボザイムであって、前記ヘリックスIIの二重鎖領域および前記ヘリックスIIIの二重鎖領域の各々が、前記触媒性コアの反対側にループ領域を含み、前記ヘリックスIIの二重鎖領域が、リガンドに結合するアプタマーを含む、シス作用型ハンマーヘッド型リボザイムと;
b)CRISPR−Cas系のガイドRNA(gRNA)をコードするヌクレオチド配
列であって、前記gRNAが、真核細胞内のDNA分子の標的配列とハイブリダイズし、前記DNA分子が、前記真核細胞内で発現する1または複数の遺伝子産物をコードし、前記ヌクレオチド配列が、5’末端および3’末端を含み、前記ヌクレオチド配列の前記5’末端が、前記ヘリックスIIIの二重鎖領域と直接カップリングしている、ヌクレオチド配列と
を含み、
ここで、前記リボザイムが、前記ヌクレオチド配列の前記5’末端と、前記ヘリックスIIIの二重鎖領域との間の自己切断を経るように、前記リガンドの前記アプタマーへの結合により、前記リボザイム内のコンフォメーション変化がもたらされ、前記gRNAが放出される、アプタマー調節型リボザイム。
(項目42)
前記リガンドが、テオフィリンである、項目41に記載のアプタマー調節型リボザイム。
(項目43)
(a)RNAに転写されると、項目41に記載のアプタマー調節型リボザイムをもたらすコード配列と;
(b)細胞内の前記RNAの転写を調節する、1または複数の転写調節配列と
を含む発現構築物。
(項目44)
項目43に記載の発現構築物を含む真核細胞。
(項目45)
細胞内の1または複数の遺伝子産物の発現を変更する方法であって、
前記細胞が、前記1または複数の遺伝子産物をコードするDNA分子を含み、
前記方法が、項目43に記載の発現構築物を前記細胞中に導入するステップと、前記リボザイムの活性を変更する量で前記細胞を前記リガンドと接触させるステップと、を含む方法。
(項目46)
前記細胞が、真核細胞である、項目45に記載の方法。
(項目47)
前記細胞が、被験体内にある、項目45に記載の方法。
(項目48)
被験体が、ヒトである、項目45に記載の方法。
(項目49)
前記リガンドが、テオフィリンである、項目45に記載の方法。
(項目50)
眼の神経変性疾患を処置することを必要とする被験体における眼の神経変性疾患を処置するための方法であって、
(a)非自然発生のCRISPR−Cas系を用意するステップであって、前記CRISPR−Cas系は、
i)CRISPR−Cas系のガイドRNA(gRNA)をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したH1プロモーターであって、前記gRNAが、前記被験体の細胞内のDNA分子の標的配列とハイブリダイズし、前記DNA分子が、前記細胞内で発現する1または複数の遺伝子産物をコードする、H1プロモーターと;
ii)細胞内で作動可能な調節エレメントであって、Cas9タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した調節エレメントと
を含む1または複数のベクターを含み、
ここで、構成要素(i)および(ii)が、前記系の同じベクターまたは異なるベクターに配置され、前記gRNAが、前記標的配列をターゲティングし、これとハイブリダイズし、前記Cas9タンパク質が、前記DNA分子を切断して、前記1または複数の遺伝子産物の発現を変更する、ステップと;
(b)前記被験体に有効量の前記系を投与するステップと
を含む方法。
(項目51)
網膜光受容体細胞の機能不全および/または死が、前記被験体において観察されている、項目50に記載の方法。
(項目52)
前記眼の神経変性疾患が、緑内障、網膜変性、および加齢黄斑変性からなる群から選択される、項目50に記載の方法。
(項目53)
前記眼の神経変性疾患が、色素性網膜炎(RP)である、項目50に記載の方法。
(項目54)
前記細胞が、網膜光受容体細胞である、項目50に記載の方法。
(項目55)
前記1または複数の遺伝子産物が、ロドプシンである、項目50に記載の方法。
(項目56)
前記H1プロモーターが、双方向性である、項目50に記載の方法。
(項目57)
前記被験体に投与するステップの前に、前記系を、単一のアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子中にパッケージングする、項目50に記載の方法。
(項目58)
前記被験体に投与するステップを、網膜下注射により行う、項目50に記載の方法。
(項目59)
前記被験体が、ヒトである、項目50に記載の方法。
(項目60)
前記Cas9タンパク質が、II型Cas9タンパク質である、項目50に記載の方法。
(項目61)
前記標的配列が、ヌクレオチド配列AN19NGG、GN19NGG、CN19NGG、またはTN19NGGを含む、項目50に記載の方法。
(項目62)
前記Cas9タンパク質が、前記細胞内での発現についてコドンが最適化されている、項目50に記載の方法。
(項目63)
項目43に記載の発現構築物および前記リガンドを、前記リボザイムの活性を変更する量で投与するステップをさらに含む、項目50に記載の方法。
(項目64)
前記リガンドが、テオフィリンである、項目63に記載の方法。
属の図を参照するが、これらは、必ずしも原寸に比例して描図されているわけではない。
の図面を伴う、本特許または特許出願公開の複製は、これを要望し、必要な手数料を支払
えば、特許庁により提供される。
これより、本明細書の以下では、本明細書で開示される主題について、付属の図を参照
しながら、より完全に記載するが、そこでは、本明細書で開示される主題の全てではなく
、一部の実施形態が示される。同じ番号は、本明細書を通して、同じエレメントを指す。
本明細書で開示される主題は、多くの異なる形態で具体化することができ、本明細書で記
される実施形態に限定されるものとみなされるべきではなく、それどころか、これらの実
施形態は、本開示が、関連法規の要件を満たすように提供される。実際、本明細書で開示
される主題が関する技術分野の当業者であって、前出の記載および関連する図において提
示される教示の利益を有する当業者は、本明細書に記される、本明細書で開示される主題
の多くの改変、および他の実施形態に想到するであろう。したがって、本明細書で開示さ
れる主題は、開示される具体的実施形態に限定されるものではなく、改変、および他の実
施形態が、添付の特許請求の範囲内に含まれるように意図するものであることを理解され
たい。
ience、300巻:763頁;Millerら(2007年)、Nat. Biotechnol.、25巻:7
78〜785頁;Sanderら(2011年)、Nature Methods、8巻:67〜69頁;Woo
dら(2011年)、Science、333巻:307頁)および転写活性化因子様エフェクタ
ーヌクレアーゼ(TALEN)(Woodら(2011年)、Science、333巻:307頁
;Bochら(2009年)、Science、326巻:1509〜1512頁;MoscouおよびBog
danove(2009年)、Science、326巻:1501頁;Christianら(2010年)、
Genetics、186巻:757〜761頁;Millerら(2011年)、Nat. Biotechnol.
、29巻:143〜148頁;Zhangら(2011年)、Nat. Biotechnol.、29巻:1
49〜153頁;Reyonら(2012年)、Nat. Biotechnol.、30巻:460〜465
頁)などのゲノム編集技術により、ターゲティングされたゲノム改変を作出する能力が強
化され、疾患突然変異を精密に補正する潜在的可能性が供されている。これらの技術は、
有効ではあるが、ZFNおよびTALENの対のいずれも、所与のDNA標的部位につい
ての、大型で固有の認識タンパク質を合成することを要請するので、実際的な限界に阻ま
れている。いくつかのグループが近年、操作されたII型CRISPR/Cas9系の使
用を介する高効率のゲノム編集であって、これらの鍵となる限界を回避するゲノム編集に
ついて報告している(Congら(2013年)、Science、339巻:819〜823頁;J
inekら(2013年)、eLife、2巻:e00471頁;Maliら(2013年)、Science
、339巻:823〜826頁;Choら(2013年)、Nat. Biotechnol.、31巻:2
30〜232頁;Hwangら(2013年)、Nat. Biotechnol.、31巻:227〜229
頁)。制作に比較的時間がかかり、労力を要するZFNおよびTALENと異なり、合成
のガイドRNA(gRNA)とカップリングさせた、Cas9タンパク質のヌクレアーゼ
活性に依拠するCRISPR構築物は、合成が簡単かつ迅速であり、マルチプレックス化
することもできる。しかし、それらの合成の相対的な容易さにもかかわらず、CRISP
Rには、Cas9自体の特性およびそのgRNAの合成の両方の関数である、ターゲティ
ング可能なゲノム空間へのそれらのアクセスに関する技術的制限がある。
に見出される短いヌクレオチドモチーフである、必須のプロトスペーサー隣接モチーフ(
PAM)への、gRNAの相補的塩基対合を要請する(Jinekら(2012年)、Science
、337巻:816〜821頁)。理論的には、CRISPR技術を使用して、ゲノム内
の、任意の固有のN20−PAM配列をターゲティングすることができる。援用される具
体的なCas9の由来する種に応じて変動する、PAM配列のDNA結合特異性は、1つ
の制約を課する。現在のところ、制限が最も小さく、最も一般的に使用されているCas
9タンパク質は、配列NGGを認識する、S.pyogenesに由来し、こうして、ゲ
ノム内の任意の固有の21ヌクレオチドの配列に続く2つのグアノシンヌクレオチド(N
20NGG)をターゲティングすることができる。タンパク質構成要素により付与される
、利用可能なターゲティング空間の拡大は、PAM要件を変更した新規のCas9タンパ
ク質の発見および使用(Congら(2013年)、Science、339巻:819〜823頁
;Houら(2013年)、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、110巻(39号):1
5644〜9頁)、または進行中の新規のCas9変異体の作出であって、突然変異誘発
もしくは指向性進化を介する作出に限定される。CRISPR系の第2の技術的制約は、
5’グアノシンヌクレオチドで開始されるgRNAの発現から生じる。RNAポリメラー
ゼIIIプロモーターのIII型クラスの使用は、これらの短い非コード転写物が、十分
に規定された末端を有し、1+ヌクレオチドを除く、転写に必要な全てのエレメントが、
上流のプロモーター領域内に含有されるため、gRNAの発現に特に適している。しかし
、一般に使用されるU6プロモーターは、転写の開始に、グアノシンヌクレオチドを要請
するので、U6プロモーターの使用により、ゲノムのターゲティング部位は、GN19N
GGにさらに制約される(Maliら(2013年)、Science、339巻:823〜826
頁;Dingら(2013年)、Cell Stem Cell、12巻:393〜394頁)。T7プロ
モーター、T3プロモーター、またはSP6プロモーターによるin vitro転写な
ど、代替的な手法もまた、グアノシンヌクレオチドによる開始を要請するであろう(Adhy
aら(1981年)、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、78巻:147〜151頁;
Meltonら(1984年)、Nucleic Acids Res.、12巻:7035〜7056頁;Plei
ssら(1998年)、RNA、4巻:1313〜1317頁)。
るH1プロモーターの使用により、多くのゲノム内のCRISPR/Cas9系の精度が
、5’ヌクレオチドの特異性の変更に起因して、倍加を超えて増大するという発見に関す
る。gRNAを発現させるH1プロモーターを使用して、内因性遺伝子を発現させ、改変
する能力は、AN19NGGゲノム部位およびGN19NGGゲノム部位のいずれをター
ゲティングするのにも使用することができる。AN19NGG部位は、ヒトゲノム内では
、GN19NGG部位を15%超える高頻度で生じ、ターゲティング空間の増大はまた、
ヒト遺伝子および疾患遺伝子座でも増進する。したがって、本明細書で開示される主題は
、ヒトゲノム内、および他の真核動物種内のターゲティング空間を、倍加を超えて増大さ
せることにより、CRISPR技術の多用途性を増強する。さらに、この改変は、ヒトゲ
ノムにおける、既存のCRISPR技術、TALEN技術、または亜鉛フィンガー技術よ
り高分解度のターゲティングを可能とする。
性プロモーターとしてのH1プロモーター配列の使用により、コンパクトであり、完全に
機能的な発現カセットであって、ウイルスベクターにより挿入および送達されうる発現カ
セットの作出が可能となるという発見にも関する。
vivoにおけるgRNAの発現を調節する、RNAリボザイムおよび調節可能なアプ
タザイムの使用にも関する。
A.組成物
イドRNA(gRNA)をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列に作動可能に連
結したH1プロモーターであって、gRNAが、細胞内のDNA分子の標的配列とハイブ
リダイズし、DNA分子が、細胞内で発現する1または複数の遺伝子産物をコードする、
H1プロモーターと;b)細胞内で作動可能な調節エレメントであって、Cas9タンパ
ク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した調節エレメントとを含む1また
は複数のベクターを含む非自然発生のCRISPR−Cas系であって、構成要素(a)
および(b)が、系の同じベクターまたは異なるベクターに配置され、gRNAが、標的
配列をターゲティングし、これとハイブリダイズし、Cas9タンパク質が、DNA分子
を切断して、1または複数の遺伝子産物の発現を変更する、CRISPR−Cas系を提
供する。
イドRNA(gRNA)をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列に作動可能に連
結したH1プロモーターであって、gRNAが、真核細胞内のDNA分子の標的配列とハ
イブリダイズし、DNA分子が、真核細胞内で発現する1または複数の遺伝子産物をコー
ドする、H1プロモーターと;b)真核細胞内で作動可能な調節エレメントであって、I
I型Cas9タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した調節エレメ
ントとを含む1または複数のベクターを含む非自然発生のCRISPR−Cas系であっ
て、構成要素(a)および(b)が、系の同じベクターまたは異なるベクターに配置され
、gRNAが、標的配列をターゲティングし、これとハイブリダイズし、Cas9タンパ
ク質が、DNA分子を切断し、1または複数の遺伝子産物の発現を変更する、CRISP
R−Cas系を提供する。一態様では、標的配列は、任意のヌクレオチド、例えば、N2
0NGGで始まる標的配列でありうる。一部の実施形態では、標的配列は、ヌクレオチド
配列AN19NGGを含む。一部の実施形態では、標的配列は、ヌクレオチド配列GN1
9NGGを含む。一部の実施形態では、標的配列は、ヌクレオチド配列CN19NGGを
含む。一部の実施形態では、標的配列は、ヌクレオチド配列TN19NGGを含む。一部
の実施形態では、標的配列は、ヌクレオチド配列AN19NGGまたはGN19NGGを
含む。別の態様では、Cas9タンパク質は、細胞内の発現についてコドンが最適化され
ている。別の態様では、Cas9タンパク質は、真核細胞内の発現についてコドンが最適
化されている。さらなる態様では、真核細胞は、哺乳動物細胞またはヒト細胞である。さ
らに別の態様では、1または複数の遺伝子産物の発現が低減される。
自然発生のCRISPR−Cas系であって、双方向性H1プロモーターが、a)CRI
SPR−Cas系のガイドRNA(gRNA)をコードする少なくとも1つのヌクレオチ
ド配列の1つの方向の転写をもたらす制御エレメントであって、gRNAが、真核細胞内
のDNA分子の標的配列とハイブリダイズし、DNA分子が、真核細胞内で発現する1ま
たは複数の遺伝子産物をコードする、制御エレメントと;b)II型Cas9タンパク質
をコードするヌクレオチド配列の反対方向の転写をもたらす制御エレメントとを含み、g
RNAが、標的配列をターゲティングし、これとハイブリダイズし、Cas9タンパク質
が、DNA分子を切断し、1または複数の遺伝子産物の発現を変更する、CRISPR−
Cas系も提供する。一態様では、標的配列は、任意のヌクレオチド、例えば、N20N
GGで始まる標的配列でありうる。一部の実施形態では、標的配列は、ヌクレオチド配列
AN19NGGを含む。一部の実施形態では、標的配列は、ヌクレオチド配列GN19N
GGを含む。一部の実施形態では、標的配列は、ヌクレオチド配列CN19NGGを含む
。一部の実施形態では、標的配列は、ヌクレオチド配列TN19NGGを含む。一部の実
施形態では、標的配列は、ヌクレオチド配列AN19NGGまたはGN19NGGを含む
。別の態様では、Cas9タンパク質は、細胞内の発現についてコドンが最適化されてい
る。別の態様では、Cas9タンパク質は、真核細胞内の発現についてコドンが最適化さ
れている。さらなる態様では、真核細胞は、哺乳動物細胞またはヒト細胞である。さらに
別の態様では、1または複数の遺伝子産物の発現が低減される。
可能な量のCRISPR複合体の蓄積を駆動するのに十分な長さの、1または複数の核局
在化配列を含む。理論に束縛されることを望まずに述べると、核局在化配列は、真核生物
におけるCRISPR複合体活性に必要ではないが、このような配列を含むことは、系の
活性、とりわけ、核内の核酸分子のターゲティングに関する活性を増強することが考えら
れる。一部の実施形態では、CRISPR酵素は、II型CRISPR系酵素である。一
部の実施形態では、CRISPR酵素は、Cas9酵素である。一部の実施形態では、C
as9酵素は、S.pneumoniae、S.pyogenes、またはS.ther
mophilusのCas9であり、これらの生物に由来する突然変異Cas9を含みう
る。酵素は、Cas9の相同体またはオーソログでありうる。
核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。ベクターは、一本鎖である核酸分子、二本
鎖である核酸分子、または部分的に二本鎖である核酸分子;1または複数の遊離末端を含
む核酸分子、遊離末端を含まない核酸分子(例えば、環状);DNAを含む核酸分子、R
NAを含む核酸分子、またはこれらの両方を含む核酸分子;および当技術分野で公知の、
他の多種多様なポリヌクレオチドを含むがこれらに限定されない。ベクターの1つの種類
は、標準的な分子クローニング技法などにより、さらなるDNAセグメントを挿入しうる
、環状二本鎖DNAループを指す、「プラスミド」である。ベクターの別の種類は、ウイ
ルスベクターであり、この場合、ウイルス由来のDNA配列またはRNA配列は、ウイル
ス(例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデ
ノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス)へのパッケージングのためにベクター内に存在
する。ウイルスベクターはまた、宿主細胞へのトランスフェクションのためにウイルスに
より保有されるポリヌクレオチドも含む。
ば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベク
ター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞中に導入されると、宿主細
胞のゲノム中に組み込まれ、これにより、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある特
定のベクターは、それらが作動的に連結された遺伝子の発現を方向付けることが可能であ
る。本明細書では、このようなベクターを、「発現ベクター」と称する。組換えDNA技
法において有用な、一般的な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。
の発現に適する形態の核酸を含みうるが、これは、組換え発現ベクターが、発現のために
使用される宿主細胞に基づき選択されうる、1または複数の調節エレメントであって、発
現させる核酸配列に作動的に連結される調節エレメントを含むことを意味する。
クレオチド配列の発現(例えば、in vitroの転写/翻訳系内の発現、またはベク
ターを、宿主細胞中に導入する場合は、宿主細胞内の発現)を可能とする形で、調節エレ
メントに連結されていることを意味するように意図される。
入部位(IRES)、および他の発現制御エレメント(例えば、ポリアデニル化シグナル
およびポリU配列などの転写終結シグナル)を含むことを意図する。このような調節エレ
メントは、例えば、Goeddel(1990年)、Gene Expression Technology: Methods
in Enzymology、185巻、Academic Press、San Diego、Calif.において記載され
ている。調節エレメントは、多くの種類の宿主細胞内のヌクレオチド配列の構成的発現を
方向付ける調節エレメントと、ある特定の宿主細胞内だけのヌクレオチド配列の発現を方
向付ける調節エレメント(例えば、組織特異的調節配列)とを含む。組織特異的プロモー
ターは、主に所望される目的の組織、例えば、筋肉、ニューロン、骨、皮膚、血液、特異
的臓器(例えば、肝臓、膵臓)または特定の細胞型(例えば、リンパ球)内の発現を方向
付けることが可能である。調節エレメントはまた、細胞周期依存的な形または発生段階依
存的な形など、時間依存的な形の発現であって、また、組織型特異的の場合もあり、組織
型特異的でない場合もあり、細胞型特異的の場合もあり、細胞型特異的でない場合もある
発現も方向付けることが可能である。
もしくは複数のpol IIプロモーター、1もしくは複数のpol Iプロモーター、
またはこれらの組合せを含む。pol IIIプロモーターの例は、U6プロモーターお
よびH1プロモーターを含むがこれらに限定されない。pol IIプロモーターの例は
、レトロウイルスであるラウス肉腫ウイルス(RSV)のLTRプロモーター(任意選択
で、RSVエンハンサーを伴う)、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター(任意
選択で、CMVエンハンサーを伴う)(例えば、Boshartら(1985年)、Cell、41
巻:521〜530頁)、SV40プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモータ
ー、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ(PGK)プロモーター、
およびEF1αプロモーターを含むがこれらに限定されない。
IのLTR内のR−U5’セグメント(Takebeら(1988年)、Mol. Cell. Biol.、
8巻:466〜472頁);SV40エンハンサー;およびウサギβ−グロビンのエクソ
ン2とエクソン3との間のイントロン配列(O'Hareら(1981年)、Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA.、78巻(3号):1527〜31頁)などのエンハンサーエレメント
も包摂される。当業者は、発現ベクターのデザインが、形質転換される宿主細胞の選択、
所望の発現レベルなどの因子に依存しうることを察知するであろう。ベクターを、宿主細
胞中に導入して、これにより、本明細書で記載される核酸によりコードされる融合タンパ
ク質または融合ペプチド(例えば、CRISPR(clustered regular
ly interspersed short palindromic repeat
)転写物、CRISPRタンパク質、CRISPR酵素、その突然変異体形態、その融合
タンパク質など)を含む、転写物、タンパク質、またはペプチドを作製することができる
。有利なベクターは、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルスを含み、このようなベク
ターの種類はまた、特定の種類の細胞をターゲティングするために選択することもできる
。
「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用される。これらは、デオキシリボヌ
クレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはその類似体である、任意の長さのヌクレオ
チドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することが可能
であり、任意の公知または未知の機能を果たしうる。以下は、ポリヌクレオチドの非限定
的な例である:遺伝子または遺伝子断片のコード領域または非コード領域、連鎖解析によ
り規定される複数の遺伝子座(単数の遺伝子座)、エクソン、イントロン、メッセンジャ
ーRNA(mRNA)、転移RNA、リボソームRNA、短鎖干渉RNA(siRNA)
、短鎖ヘアピンRNA(shRNA)、マイクロRNA(miRNA)、リボザイム、c
DNA、組換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任
意の配列の単離DNA、任意の配列の単離RNA、核酸プローブ、およびプライマー。ポ
リヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体など、1または複数
の修飾ヌクレオチドを含みうる。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマー
のアセンブリーの前に付与することもでき、ポリマーのアセンブリーの後で付与すること
もできる。ヌクレオチドの配列は、ヌクレオチド以外の構成要素により中断させることが
できる。ポリヌクレオチドは、標識用構成要素とのコンジュゲーションなど、多量体化の
後でさらに修飾することもできる。
「ガイドRNA」、「単一のガイドRNA」および「合成ガイドRNA」という用語は、
互換的に使用され、ガイド配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。「ガイド配列」とい
う用語は、標的部位を指定するガイドRNA内の約20bpの配列を指し、「ガイド」ま
たは「スペーサー」という用語と互換的に使用することができる。
の用語であり、天然で生じる、生物、株、遺伝子、または特徴の典型的な形態であって、
突然変異体形態または変異体形態から識別される形態を意味する。
脱するパターンを有する性質の呈示を意味するように理解するものとする。
を指し示す。核酸分子またはポリペプチドを指す場合の用語は、核酸分子またはポリペプ
チドが、それらが天然で会合し、天然で見出される、少なくとも1つの他の構成要素を少
なくとも実質的に含まないことを意味する。
により、別の核酸配列との水素結合を形成する核酸の能力を指す。相補性パーセントとは
、第2の核酸配列と水素結合(例えば、ワトソン−クリック塩基対合)を形成しうる、核
酸分子内の残基の百分率を指し示す(例えば、10のうち5つ、6つ、7つ、8つ、9つ
、10であれば、50%、60%、70%、80%、90%、および100%相補的であ
る)。「完全に相補的」とは、核酸配列の全ての連続残基が、第2の核酸配列内の同数の
連続残基と水素結合することを意味する。本明細書で使用される「実質的に相補的」とは
、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21
、22、23、24、25、30、35、40、45、50、もしくはこれを超えるヌク
レオチドの領域にわたり、少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%
、90%、95%、97%、98%、99%、もしくは100%である相補性の程度を指
すか、または厳密な条件下でハイブリダイズする2つの核酸を指す。
では、標的配列に対する相補性を有する核酸が、主に標的配列とハイブリダイズし、非標
的配列とは実質的にハイブリダイズしない条件を指す。厳密な条件は一般に、配列依存的
であり、多数の因子に応じて変動する。一般に、配列が長いほど、配列が、その標的配列
に特異的にハイブリダイズする温度が高くなる。厳密な条件の非限定的な例は、Tijssen
(1993年)、Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biolog
y-Hybridization With Nucleic Acid Probes、1部、2章、「Overview of princi
ples of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay」、
Elsevier、N.Y.において詳細に記載されている。
レオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化する複合体を形成する反応を指す。水素
結合は、ワトソンクリック塩基対合により生じる場合もあり、フーグスティーン結合によ
り生じる場合もあり、他の任意の配列特異的な形で生じる場合もある。複合体は、二重鎖
構造を形成する2本の鎖、多重鎖複合体を形成する3本もしくはこれを超える鎖、自己ハ
イブリダイズ型一本鎖、またはこれらの任意の組合せを含みうる。ハイブリダイゼーショ
ン反応は、PCRの開始または酵素によるポリヌクレオチドの切断など、より広範な工程
内のステップを構成しうる。所与の配列とハイブリダイズさせることが可能な配列を、所
与の配列の「相補体」と称する。
または他のRNA転写物などに)転写される工程、および/または転写されたmRNAが
その後、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に翻訳される工程を指す。転写物
と、コードされたポリペプチドとを、総体として、「遺伝子産物」と称する。ポリヌクレ
オチドが、ゲノムDNAに由来する場合、発現は、真核細胞内のmRNAのスプライシン
グを含みうる。
互換的に使用して、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、直鎖状の場合
もあり、分枝状の場合もあり、修飾アミノ酸を含むことが可能であり、アミノ酸以外で中
断されうる。用語はまた、修飾されたアミノ酸ポリマー、例えば、ジスルフィド結合の形
成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識用構成要素とのコンジュ
ゲーションなど、他の任意の取扱いを施されたアミノ酸ポリマーも包摂しうる。
よびL光学異性体の両方、ならびにアミノ酸類似体およびペプチド模倣体を含む、天然ア
ミノ酸および/または非天然アミノ酸もしくは合成アミノ酸を含む。
技術分野の技術の範囲内にある従来の技法であって、免疫学、生化学、化学、分子生物学
、微生物学、細胞生物学、ゲノム学、および組換えDNAの技法(Sambrook、Fritschお
よびManiatis(1989年)、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版;
Ausubelら編(1987年)、Current Protocols in Molecular Biology;MacPherso
nら編(1995年)、Methods in Enzymology(Academic Press, Inc.)、PCR 2:
A Practical Approach;HarlowおよびLane編(1988年)、Antibodies, A Labo
ratory Manual;Freshney編(1987年)、Animal Cell Culture)を援用する。
ター系、またはベクター自体に関する。ベクターは、原核細胞内または真核細胞内のCR
ISPR転写物(例えば、核酸転写物、タンパク質、または酵素)の発現のためにデザイ
ンすることができる。例えば、CRISPR転写物は、Escherichia col
iなどの細菌細胞内、昆虫細胞内(バキュロウイルス発現ベクターを使用する)、酵母細
胞内、または哺乳動物細胞内で発現させることができる。適切な宿主細胞については、Go
eddel(1990年)、Gene Expression Technology: Methods in Enzymology、1
85巻、Academic Press、San Diego、Calif.においてさらに論じられている。代替的
に、組換え発現ベクターは、例えば、T7プロモーター調節配列およびT7ポリメラーゼ
を使用して、in vitroにおいて転写および翻訳することもできる。
態では、原核生物を、真核細胞中に導入されるベクターのコピーを増幅するのに使用する
か、または真核細胞中に導入されるベクターの作製における中間体ベクター(例えば、ウ
イルスベクターパッケージング系の一部としてのプラスミドを増幅する)として使用する
。一部の実施形態では、原核生物を、宿主細胞または宿主生物に送達するための1または
複数のタンパク質の供給源を用意するなど、ベクターのコピーを増幅し、1または複数の
核酸を発現させるのに使用する。原核生物内のタンパク質の発現は、融合タンパク質また
は非融合タンパク質の発現を方向付ける、構成的プロモーターまたは誘導的プロモーター
を含有するベクターを伴う、Escherichia coli内で実行することが最も
多い。
質に、いくつものアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、(i)組換えタンパ
ク質の発現を増大させる目的;(ii)組換えタンパク質の可溶性を増大させる目的;お
よび(iii)アフィニティー精製におけるリガンドとして作用することにより、組換え
タンパク質の精製の一助となる目的など、1または複数の目的に適いうる。融合発現ベク
ター内では、融合タンパク質の精製の後に、組換えタンパク質の、融合部分からの分離を
可能にするのに、タンパク質分解性切断部位を、融合部分と、組換えタンパク質との接合
部に導入することが多い。このような酵素、およびそれらのコグネイト認識配列は、因子
Xa、トロンビン、およびエンテロキナーゼを含む。融合発現ベクターの例は、グルタチ
オンS−トランスフェラーゼ(GST)、マルトースE結合性タンパク質、またはプロテ
インAのそれぞれを、標的組換えタンパク質と融合させる、pGEX(Pharmaci
a Biotech Inc;SmithおよびJohnson(1988年)、Gene、67巻:31
〜40頁)、pMAL(New England Biolabs、Beverly、M
ass.)、およびpRIT5(Pharmacia、Piscataway、N.J.
)を含む。
年)、Gene、69巻:301〜315頁)およびpET 11d(Studierら(1990
年)、Gene Expression Technology: Methods in Enzymology、185巻、Academic
Press、San Diego、Calif.)を含む。
romyces cerivisae内の発現のためのベクターの例は、pYepSec
1(Baldariら(1987年)、EMBO J.、6巻:229〜234頁)、pMFa(Kuija
nおよびHerskowitz(1982年)、Cell、30巻:933〜943頁)、pJRY88
(Schultzら(1987年)、Gene、54巻:113〜123頁)、pYES2(Inv
itrogen Corporation、San Diego、Calif.)、およ
びpicZ(InVitrogen Corp、San Diego、Calif.)を
含む。
の1または複数の配列の発現を駆動することが可能である。哺乳動物発現ベクターの例は
、pCDM8(Seed(1987年)、Nature、329巻:840頁)およびpMT2PC
(Kaufmanら(1987年)、EMBO J.、6巻:187〜195頁)を含む。哺乳動物細
胞内で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、1または複数の調節エレメントによ
りもたらされることが典型的である。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオ
ーマウイルス、アデノウイルス2、サイトメガロウイルス、サルウイルス40、および本
明細書で開示され、当技術分野で公知である、他のウイルスに由来する。原核細胞および
真核細胞の両方に適する他の発現系については、例えば、Sambrookら(1989年)、Mo
lecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laborato
ry、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.の16お
よび17章を参照されたい。
で、優先的に方向付ける(例えば、組織特異的調節エレメントを使用して、核酸を発現さ
せる)ことが可能である。当技術分野では、組織特異的調節エレメントが公知である。適
切な組織特異的プロモーターの非限定的な例は、アルブミンプロモーター(肝臓特異的;
Pinkertら(1987年)、Genes Dev.、1巻:268〜277頁)、リンパ系特異的プ
ロモーター(CalameおよびEaton(1988年)、Adv. Immunol.、43巻:235〜2
75頁)、特に、T細胞受容体(WinotoおよびBaltimore(1989年)、EMBO J.、8
巻:729〜733頁)および免疫グロブリン(Baneijiら(1983年)、Cell、33
巻:729〜740頁;QueenおよびBaltimore(1983年)、Cell、33巻:741〜
748頁)のプロモーター、ニューロン特異的プロモーター(例えば、神経線維プロモー
ター;ByrneおよびRuddle(1989年)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、86巻:
5473〜5477頁)、膵臓特異的プロモーター(Edlundら(1985年)、Science
、230巻:912〜916頁)、ならびに乳腺特異的プロモーター(例えば、乳清プロ
モーター;米国特許第4,873,316号および欧州出願公開第264,166号)を
含む。また、発生調節型プロモーター、例えば、マウスhoxプロモーター(Kesselおよ
びGruss(1990年)、Science、249巻:374〜379頁)およびα−フェトタン
パク質プロモーター(CampesおよびTilghman(1989年)、Genes Dev.、3巻:53
7〜546頁)も包摂される。
うに、調節エレメントを、CRISPR系の1または複数のエレメントに作動可能に連結
する。一般に、SPIDR(spacer interspersed direct
repeat)としてもまた公知の、CRISPR(clustered regula
rly interspaced short palindromic repeat
)は、通例、特定の細菌種に特異的なDNA遺伝子座のファミリーを構成する。CRIS
PR遺伝子座は、E.coli(Ishinoら(1987年)、J. Bacteriol.、169巻:
5429〜5433頁;およびNakataら(1989年)、J. Bacteriol.、171巻:3
553〜3556頁)および関連する遺伝子内で認識された、散在型SSR(short
sequence repeat)の顕著に異なるクラスを含む。類似の散在型SSR
は、Haloferax mediterranei、Streptococcus p
yogenes、Anabaena属、およびMycobacterium tuber
culosisにおいても同定されている(Groenenら(1993年)、Mol. Microbiol
.、10巻:1057〜1065頁;Hoeら(1999年)、Emerg. Infect. Dis.、5
巻:254〜263頁;Masepohlら(1996年)、Biochim. Biophys. Acta、130
7巻:26〜30頁;およびMojicaら(1995年)、Mol. Microbiol.、17巻:85
〜93頁)。CRISPR遺伝子座は、SRSR(short regularly s
paced repeat)と名付けられたリピートの構造により、他のSSRと異なる
ことが典型的である(Janssenら(2002年)、OMICS J. Integ. Biol.、6巻:2
3〜33頁;およびMojicaら(2000年)、Mol. Microbiol.、36巻:244〜24
6頁)。一般に、リピートとは、長さが実質的に一定である固有の介在配列により規則的
に隔てられたクラスター内で生じる短いエレメントである(Mojicaら(2000年)、Mo
l. Microbiol.、36巻:244〜246頁)。リピート配列は、株の間で高度に保存的
であるが、散在型リピートの数と、スペーサー領域の配列とは、株により異なることが典
型的である(van Embdenら(2000年)、J. Bacteriol.、182巻:2393〜2
401頁)。CRISPR遺伝子座は、40を超える原核生物(例えば、Jansenら(20
02年)、Mol. Microbiol.、43巻:1565〜1575頁;およびMojicaら(200
5年)、J. Mol. Evol.、60巻:174〜82頁)であって、Aeropyrum属
、Pyrobaculum属、Sulfolobus属、Archaeoglobus属
、Halocarcula属、Methanobacteriumn属、Methano
coccus属、Methanosarcina属、Methanopyrus属、Py
rococcus属、Picrophilus属、Thermoplasma属、Cor
ynebacterium属、Mycobacterium属、Streptomyce
s属、Aquifrex属、Porphyromonas属、Chlorobium属、
Thermus属、Bacillus属、Listeria属、Staphylococ
cus属、Clostridium属、Thermoanaerobacter属、My
coplasma属、Fusobacterium属、Azarcus属、Chromo
bacterium属、Neisseria属、Nitrosomonas属、Desu
lfovibrio属、Geobacter属、Micrococcus属、Campy
lobacter属、Wolinella属、Acinetobacter属、Erwi
nia属、Escherichia属、Legionella属、Methylococ
cus属、Pasteurella属、Photobacterium属、Salmon
ella属、Xanthomonas属、Yersinia属、Treponema属、
およびThermotoga属を含むがこれらに限定されない原核生物において同定され
ている。
、CRISPR関連(「Cas」)遺伝子の発現に関与するか、もしくはこれらの活性を
方向付ける転写物、および他のエレメント、ガイド配列(内因性CRISPR系の文脈で
は、「スペーサー」ともまた称する)、またはCRISPR遺伝子座に由来する他の配列
および転写物を指す。一部の実施形態では、CRISPR系の1または複数のエレメント
は、I型CRISPR系、II型CRISPR系、またはIII型CRISPR系に由来
する。一部の実施形態では、CRISPR系の1または複数のエレメントは、Strep
tococcus pyogenesなど、内因性CRISPR系を含む特定の生物に由
来する。一般に、CRISPR系は、標的配列の部位における、CRISPR複合体の形
成を促進するエレメント(内因性CRISPR系の文脈では、プロトスペーサーともまた
称する)により特徴付けられる。
る相補性を有するようにデザインされる配列であって、標的配列とガイド配列との間のハ
イブリダイゼーションにより、CRISPR複合体の形成が促進される配列を指す。ハイ
ブリダイゼーションを引き起こし、CRISPR複合体の形成を促進するのに十分な相補
性が存在するという条件で、完全な相補性が必ずしも要請されるわけではない。標的配列
は、DNAポリヌクレオチドまたはRNAポリヌクレオチドなど、任意のポリヌクレオチ
ドを含みうる。一部の実施形態では、標的配列を、細胞の核内または細胞質内に配置する
。一部の実施形態では、標的配列は、真核細胞の細胞小器官内、例えば、ミトコンドリア
内またはクロロプラスト内に存在しうる。ターゲティングされる遺伝子座であって、標的
配列を含む遺伝子座への組換えのために使用しうる配列または鋳型を、「編集鋳型」また
は「編集ポリヌクレオチド」または「編集配列」と称する。本明細書で開示される主題の
態様では、外因性鋳型ポリヌクレオチドを、編集鋳型と称することができる。本明細書で
開示される主題の態様では、組換えは、相同組換えである。
部位」ともまた称する)など、1または複数の挿入部位を含む。一部の実施形態では、1
または複数の挿入部位(例えば、約1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、
9つ、10、もしくはこれを超える挿入部位、またはこれらを超える挿入部位)を、1ま
たは複数のベクターの、1または複数の配列エレメントの上流および/または下流に配置
する。複数の異なるガイド配列を使用する場合、単一の発現構築物を使用して、CRIS
PR活性を、細胞内の、複数の異なる、対応する標的配列にターゲティングすることがで
きる。例えば、単一のベクターは、約1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ
、9つ、10、15、20、もしくはこれを超えるガイド配列、またはこれらを超えるガ
イド配列を含みうる。一部の実施形態では、約1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7
つ、8つ、9つ、10、もしくはこれを超えるこのようなガイド配列含有ベクター、また
はこれらを超えるガイド配列含有ベクターを提供し、任意選択で、細胞に送達することが
できる。
する酵素コード配列に作動可能に連結した調節エレメントを含む。Casタンパク質の非
限定的な例は、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Ca
s6、Cas7、Cas8、Cas9(Csn1およびCsx12としてもまた公知であ
る)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、C
sc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、C
mr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、C
sx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Cs
x15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、これらの相同体、またはこれらの修
飾形を含む。これらの酵素は、公知であり、例えば、S.pyogenes Cas9タ
ンパク質のアミノ酸配列は、SwissProtデータベースにおいて、受託番号Q99
ZW2の下に見出すことができる。一部の実施形態では、Cas9などの非修飾CRIS
PR酵素は、DNA切断活性を有する。一部の実施形態では、CRISPR酵素は、Ca
s9であり、S.pyogenesまたはS.pneumoniaeに由来するCas9
でありうる。
体内など、標的配列の場所において、鎖の一方または両方の切断を方向付ける。一部の実
施形態では、CRISPR酵素は、標的配列の最初または最後のヌクレオチドに由来する
、約1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、15、20、25
、50、100、200、500、またはこれを超える塩基対内の、鎖の一方または両方
の切断を方向付ける。一部の実施形態では、突然変異させたCRISPR酵素が、標的配
列を含有する標的ポリヌクレオチドの鎖の一方または両方を切断する能力を欠くように、
ベクターは、対応する野生型酵素に照らして突然変異させたCRISPR酵素をコードす
る。
、特定の細胞内の発現についてコドンが最適化されている。真核細胞は、ヒト、マウス、
ラット、ウサギ、イヌ、または非ヒト霊長動物を含むがこれらに限定されない哺乳動物な
ど、特定の生物の細胞、またはこれらに由来する細胞でありうる。一般に、コドン最適化
とは、目的の宿主細胞内の発現を増強するために、核酸配列を改変する工程であって、天
然のアミノ酸配列を維持しながら、天然配列の少なくとも1つのコドン(例えば、約1つ
、2つ、3つ、4つ、5つ、10、15、20、25、50、もしくはこれを超えるコド
ン、またはこれらを超えるコドン)を、その宿主細胞の遺伝子内で、より高頻度に、また
は最も高頻度に使用されるコドンで置きかえることにより、核酸配列を改変する工程を指
す。多様な種は、特定のアミノ酸のある特定のコドンについて、特定のバイアスを呈示す
る。コドンバイアス(生物間のコドン使用の差違)は、メッセンジャーRNA(mRNA
)の翻訳の効率と相関することが多く、これは、ひいては、他の事柄にもまして、翻訳さ
れるコドンの特性および特定の転移RNA(tRNA)分子のアベイラビリティーに依存
すると考えられる。細胞内で選択されるtRNAの卓越は一般に、ペプチド合成において
最も高頻度で使用されるコドンの反映である。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基
づき、所与の生物における最適な遺伝子発現についてテーラリングすることができる。コ
ドン使用表は、例えば、「コドン使用データベース」でたやすく入手可能であり、これら
の表は、多数の方式で適合させることができる。Nakamuraら(2000年)、Nucl. Aci
ds Res.、28巻:292頁を参照されたい。また、特定の宿主細胞内の発現のために、
特定の配列のコドンを最適化するためのコンピュータアルゴリズムであって、Gene
Forge(Aptagen;Jacobus、Pa.)などのアルゴリズムも利用可能
である。一部の実施形態では、CRISPR酵素をコードする配列内の1または複数のコ
ドン(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、10、15、20、25、50、もしく
はこれを超えるコドン、または全てのコドン)は、特定のアミノ酸に最も高頻度で使用さ
れるコドンに対応する。
配列への配列特異的結合を方向付けるのに十分な、標的ポリヌクレオチド配列との相補性
を有する任意のポリヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、適切なアライメント
アルゴリズムを使用して最適に配列決定される場合の、ガイド配列と、その対応する標的
配列との相補性の程度は、約50%、60%、75%、80%、85%、90%、95%
、97.5%、99%、もしくはこれを超えるか、またはこれらを超える。最適のアライ
メントは、配列決定に適する任意のアルゴリズムであって、その非限定的な例が、スミス
−ウォーターマンアルゴリズム、ニードルマン−ブンシュアルゴリズム、バローズ−ホイ
ーラー変換に基づくアルゴリズム(例えば、Burrows Wheeler Alig
ner)、ClustalW、Clustal X、BLAT、Novoalign(N
ovocraft Technologies、ELAND(Illumina、San
Diego、Calif.)、SOAP(soap.genomics.org.cn
で入手可能)、およびMaq(maq.sourceforge.netで入手可能)を
含むアルゴリズムの使用により決定することができる。一部の実施形態では、ガイド配列
は、約5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21
、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、
75、もしくはこれを超えるヌクレオチドの長さ、またはこれらを超えるヌクレオチドの
長さである。一部の実施形態では、ガイド配列は、約75、50、45、40、35、3
0、25、20、15、12、もしくはこれより少ないヌクレオチドの長さ、またはこれ
ら未満のヌクレオチドの長さである。
、任意の適切なアッセイにより評価することができる。例えば、被験ガイド配列を含むC
RISPR複合体を形成するのに十分なCRISPR系の構成要素は、CRISPR配列
の構成要素をコードするベクターによるトランスフェクションに続く、本明細書で記載さ
れるSurveyorアッセイなどを介する、標的配列内の優先的切断の評価などにより
、対応する標的配列を有する宿主細胞に施すことができる。同様に、標的ポリヌクレオチ
ド配列の切断は、標的配列、被験ガイド配列を含むCRISPR複合体の構成要素、およ
び被験ガイド配列と異なる対照のガイド配列を用意し、被験ガイド配列反応物と対照ガイ
ド配列反応物との間で、標的配列における結合または切断率を比較することにより、試験
管内で査定することができる。他のアッセイも可能であり、当業者は、これらに想到する
であろう。
部の実施形態では、標的配列は、細胞のゲノム内の配列である。例示的な標的配列は、標
的ゲノム内で固有の標的配列を含む。
含む融合タンパク質の部分(例えば、CRISPR酵素に加えて、約1つ、2つ、3つ、
4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、もしくはこれを超えるドメイン、またはこ
れらを超えるドメイン)である。CRISPR酵素の融合タンパク質は、任意のさらなる
タンパク質配列と、任意選択で、任意の2つのドメインの間のリンカー配列とを含みうる
。CRISPR酵素と融合させうるタンパク質ドメインの例は、限定なしに述べると、エ
ピトープタグ、レポーター遺伝子配列、ならびに以下の活性:メチラーゼ活性、デメチラ
ーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、RN
A切断活性、および核酸結合活性のうちの1または複数を有するタンパク質ドメインを含
む。エピトープタグの非限定的な例は、ヒスチジン(His)タグ、V5タグ、FLAG
タグ、インフルエンザヘマグルチニン(HA)タグ、Mycタグ、VSV−Gタグ、およ
びチオレドキシン(Trx)タグを含む。レポーター遺伝子の例は、グルタチオン−5−
トランスフェラーゼ(GST)、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、クロラムフェ
ニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−
グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)、HcRed、Ds
Red、シアン蛍光タンパク質(CFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、および青色
蛍光タンパク質(BFP)を含む自己蛍光タンパク質を含むがこれらに限定されない。C
RISPR酵素は、DNA分子に結合するか、または他の細胞内分子に結合する、タンパ
ク質またはタンパク質の断片であって、マルトース結合性タンパク質(MBP)、S−タ
グ、Lex A DNA結合性ドメイン(DBD)融合体、GAL4A DNA結合性ド
メイン融合体、および単純ヘルペスウイルス(HSV)BP16タンパク質融合体を含む
がこれらに限定されない、タンパク質またはタンパク質の断片をコードする遺伝子配列と
融合させることができる。CRISPR酵素を含む融合タンパク質の部分を形成しうる、
さらなるドメインは、参照により本明細書に組み込まれる、US20110059502
において記載されている。一部の実施形態では、タグ付けされたCRISPR酵素を使用
して、標的配列の場所を同定する。
T)、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、クロラムフェニコールアセチルトランス
フェラーゼ(CAT)、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、ルシフ
ェラーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)、HcRed、DsRed、シアン蛍光タンパ
ク質(CFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、および青色蛍光タンパク質(BFP)
を含む自己蛍光タンパク質を含むがこれらに限定されないレポーター遺伝子を、遺伝子産
物の発現の変更または修飾を測定するためのマーカーとして用いられる遺伝子産物をコー
ドするように、細胞中に導入することができる。本明細書で開示される主題のさらなる実
施形態では、DNA分子をコードする遺伝子産物を、ベクターを介して細胞中に導入する
ことができる。本明細書で開示される主題の好ましい実施形態では、遺伝子産物は、ルシ
フェラーゼである。本明細書で開示される主題のさらなる実施形態では、遺伝子産物の発
現が低減される。
ス、近位配列エレメント(PSE)、および遠位配列エレメント(DSE)を含む、完全
Pol IIIプロモーター;ならびに2)DSEの5’末端とリバースの配向性で融合
させたPSEおよびTATAボックスを含む、第2の基本Pol IIIプロモーターを
含む。そのヌクレオチド配列にちなんで名付けられたTATAボックスは、Pol II
I特異性の主要な決定基である。TATAボックスは通例、転写される配列と比べてnt
.−23〜−30の間の位置に配置され、転写される配列の始点の最重要の決定基である
。PSEは通例、nt.−45〜−66の間に配置される。DSEは、基本Pol II
Iプロモーターの活性を増強する。H1プロモーターでは、PSEとDSEとの間にギャ
ップが存在しない。
ATAボックスを含有する、従来の完全一方向性Pol IIIプロモーター;ならびに
2)DSEの5’末端とリバースの配向性で融合させたPSEおよびTATAボックスを
含む、第2の基本Pol IIIプロモーターからなる。TATA結合性タンパク質によ
り認識されるTATAボックスは、Pol IIIを、プロモーター領域に動員するため
に不可欠である。TATA結合性タンパク質の、TATAボックスへの結合は、SNAP
cの、PSEとの相互作用により安定化する。まとめると、これらのエレメントは、それ
が、発現させる配列を転写しうるように、Pol IIIを適正に位置付ける。また、D
SEも、Pol IIIプロモーターの完全な活性に不可欠である(Murphyら(1992
年)、Mol. Cell Biol.、12巻:3247〜3261頁;Mittalら(1996年)、M
ol. Cell Biol.、16巻:1955〜1965頁;FordおよびHernandez(1997年
)、J.Biol.Chem.、272巻:16048〜16055頁;Fordら(1998年)、Gene
s Dev.、12巻:3528〜3540頁;Hovdeら(2002年)、Genes Dev.、16
巻:2772〜2777頁)。転写は、転写因子であるOct−1および/またはSBF
/Stafの、DSE内のそれらのモチーフとの相互作用により、最大で100倍に増強
される(KunkelおよびHixon(1998年)、Nucl. Acid Res.、26巻:1536〜1
543頁)。フォワードおよびリバースに配向させた基本プロモーターは、二本鎖DNA
鋳型の逆行鎖上の配列の転写を方向付けるので、リバースに配向させた基本プロモーター
のプラス鎖を、DSEのマイナス鎖の5’末端に付加する。H1プロモーターの制御下で
発現させた転写物は、4つまたは5つのTによる切れ目のない配列で終結させる。
skiら(2001年)、Nucl. Acid Res.、29巻:2502〜2509頁)。配列の反
復を最小化するために、リバース方向の転写が、U6プロモーターに由来するPSEおよ
びTATAボックスを付加することにより制御される、ハイブリッドプロモーターを創出
することにより、このプロモーターを双方向性とした。双方向性H1プロモーターの構築
を容易とするために、小型のスペーサー配列もまた、リバースに配向させた基本プロモー
ターとDSEとの間に挿入することができる。
一部の実施形態では、本明細書で開示される主題はまた、細胞内の1または複数の遺伝
子産物の発現を変更する方法であって、細胞が、1または複数の遺伝子産物をコードする
DNA分子を含み、方法が、細胞中に、a)CRISPR−Cas系のガイドRNA(g
RNA)をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したH1プロ
モーターであって、gRNAが、DNA分子の標的配列とハイブリダイズする、H1プロ
モーターと;b)細胞内で作動可能な調節エレメントであって、Cas9タンパク質をコ
ードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した調節エレメントとを含む1または複数の
ベクターを含む非自然発生のCRISPR−Cas系であって、構成要素(a)および(
b)が、系の同じベクターまたは異なるベクターに配置され、gRNAが、標的配列をタ
ーゲティングし、これとハイブリダイズし、Cas9タンパク質が、DNA分子を切断し
て、1または複数の遺伝子産物の発現を変更する、CRISPR−Cas系を導入するス
テップを含む方法も提供する。
遺伝子産物の発現を変更する方法であって、細胞が、1または複数の遺伝子産物をコード
するDNA分子を含み、方法が、細胞中に、a)CRISPR−Cas系のガイドRNA
(gRNA)をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列に作動可能に連結したH1
プロモーターであって、gRNAが、DNA分子の標的配列とハイブリダイズする、H1
プロモーターと;b)真核細胞内で作動可能な調節エレメントであって、II型Cas9
タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した調節エレメントとを含む
1または複数のベクターを含む非自然発生のCRISPR−Cas系であって、構成要素
(a)および(b)が、系の同じベクターまたは異なるベクターに配置され、gRNAが
、標的配列をターゲティングし、これとハイブリダイズし、Cas9タンパク質が、DN
A分子を切断し、1または複数の遺伝子産物の発現を変更する、CRISPR−Cas系
を導入するステップを含む方法も提供する。一態様では、標的配列は、任意のヌクレオチ
ド、例えば、N20NGGで始まる標的配列でありうる。一部の実施形態では、標的配列
は、ヌクレオチド配列AN19NGGを含む。一部の実施形態では、標的配列は、ヌクレ
オチド配列GN19NGGを含む。一部の実施形態では、標的配列は、ヌクレオチド配列
CN19NGGを含む。一部の実施形態では、標的配列は、ヌクレオチド配列TN19N
GGを含む。一部の実施形態では、標的配列は、ヌクレオチド配列AN19NGGまたは
GN19NGGを含む。別の態様では、Cas9タンパク質は、細胞内の発現についてコ
ドンが最適化されている。さらに別の態様では、Cas9タンパク質は、真核細胞内の発
現についてコドンが最適化されている。さらなる態様では、真核細胞は、哺乳動物細胞ま
たはヒト細胞である。別の態様では、1または複数の遺伝子産物の発現が低減される。
更する方法であって、細胞が、1または複数の遺伝子産物をコードするDNA分子を含み
、方法が、細胞中に、双方向性H1プロモーターを含むベクターを含む非自然発生のCR
ISPR−Cas系であって、双方向性H1プロモーターが、a)CRISPR−Cas
系のガイドRNA(gRNA)をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列の1つの
方向の転写をもたらす制御エレメントであって、gRNAが、DNA分子の標的配列とハ
イブリダイズする、制御エレメントと;b)II型Cas9タンパク質をコードするヌク
レオチド配列の反対方向の転写をもたらす制御エレメントとを含み、gRNAが、標的配
列をターゲティングし、これとハイブリダイズし、Cas9タンパク質が、DNA分子を
切断し、1または複数の遺伝子産物の発現を変更する、CRISPR−Cas系を導入す
るステップを含む方法も提供する。一態様では、標的配列は、任意のヌクレオチド、例え
ば、N20NGGで始まる標的配列でありうる。一部の実施形態では、標的配列は、ヌク
レオチド配列AN19NGGを含む。一部の実施形態では、標的配列は、ヌクレオチド配
列GN19NGGを含む。一部の実施形態では、標的配列は、ヌクレオチド配列CN19
NGGを含む。一部の実施形態では、標的配列は、ヌクレオチド配列TN19NGGを含
む。別の態様では、標的配列は、ヌクレオチド配列AN19NGGまたはGN19NGG
を含む。別の態様では、Cas9タンパク質は、細胞内の発現についてコドンが最適化さ
れている。さらに別の態様では、Cas9タンパク質は、真核細胞内の発現についてコド
ンが最適化されている。さらなる態様では、真核細胞は、哺乳動物細胞またはヒト細胞で
ある。別の態様では、1または複数の遺伝子産物の発現が低減される。
のベクターなど、1もしくは複数のポリヌクレオチド、1もしくは複数のその転写物、お
よび/またはそこから転写される1もしくは複数のタンパク質を、宿主細胞に送達するス
テップを含む方法を提供する。一部の態様では、本明細書で開示される主題はさらに、こ
のような方法により作製される細胞、およびこのような細胞を含む生物(動物、植物、ま
たは真菌など)またはこのような細胞から作製される生物を提供する。一部の実施形態で
は、ガイド配列と組み合わせた(および任意選択でガイド配列と複合体化させた)CRI
SPR酵素を、細胞に送達する。従来のウイルスベースの遺伝子導入方法および非ウイル
スベースの遺伝子導入方法を使用して、哺乳動物細胞内または標的組織内に核酸を導入す
ることができる。このような方法を使用して、CRISPR系の構成要素をコードする核
酸を、培養物中または宿主生物内の細胞に投与することができる。非ウイルスベクター送
達系は、DNAプラスミド、RNA(例えば、本明細書で記載されるベクターの転写物)
、ネイキッド核酸、およびリポソームなどの送達媒体と複合体化させた核酸を含む。ウイ
ルスベクター送達系は、DNAウイルスおよびRNAウイルスを含み、これらは、細胞へ
の送達の後で、ゲノムをエピソームとするか、または統合する。遺伝子治療手順の総説に
ついては、Anderson(1992年)、Science、256巻:808〜813頁;Nabelおよ
びFelgner(1993年)、TIBTECH、11巻:211〜217頁;MitaniおよびCaskey(
1993年)、TIBTECH、11巻:162〜166頁;Dillon(1993年)、TIBTECH、
11巻:167〜175頁;Miller(1992年)、Nature、357巻:455〜460
頁;Van Brunt(1998年)、Biotechnology、6巻(10号):1149〜1154
頁;Vigne(1995年)、Restorative Neurology and Neuroscience、8巻:35〜
36頁;KremerおよびPerricaudet(1995年)、British Medical Bulletin、51
巻(1号):31〜44頁;Haddadaら(1995年)、Current Topics in Microbio
logy and Immunology、DoerflerおよびBohm(編);ならびにYuら(1994年)、Gen
e Therapy、1巻:13〜26頁を参照されたい。
ンジェクション、遺伝子銃、ウィロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオ
ン、または脂質:核酸コンジュゲート、ネイキッドDNA、人工ビリオン、およびDNA
の薬剤増強型取込みを含む。リポフェクションは、例えば、米国特許第5,049,38
6号、同第4,946,787号;および同第4,897,355号において記載されて
おり、リポフェクション試薬は、市販されている(例えば、Transfectam(商
標)およびLipofectin(商標))。ポリヌクレオチドの、効率的な受容体認識
型リポフェクションに適する、カチオン性脂質および中性脂質は、Felgnerによる
カチオン性脂質および中性脂質(WO91/17424;WO91/16024)を含む
。送達は、細胞への送達(例えば、in vitro投与またはex vivo投与)の
場合もあり、標的組織への送達(例えば、in vivo投与)の場合もある。
は、当業者に周知である(例えば、Crystal(1995年)、Science、270巻:404
〜410頁;Blaeseら(1995年)、Cancer Gene Ther.、2巻:291〜297頁
:Behrら(1994年)、Bioconjugate Chem.、5巻:382〜389頁;Remyら(1
994年)、Bioconjugate Chem.、5巻:647〜654頁;Gaoら(1995年)、Ge
ne Therapy、2巻:710〜722頁;Ahmadら(1992年)、Cancer Res.、52巻
:4817〜4820頁;米国特許第4,186,183号、同第4,217,344号
、同第4,235,871号、同第4,261,975号、同第4,485,054号、
同第4,501,728号、同第4,774,085号、同第4,837,028号、お
よび同第4,946,787号)。
使用では、ウイルスを、体内の特異的細胞にターゲティングし、ウイルスのペイロードを
、核にトラフィッキングするための、高度に進化した工程を利用する。ウイルスベクター
は、患者に直接(in vivoにおいて)投与することもでき、in vitroにお
いて細胞を処置するのに使用することもでき、任意選択で、改変細胞を患者に投与する(
ex vivoにおいて)こともできる。従来のウイルスベースの系は、遺伝子導入のた
めのレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、
および単純ヘルペスウイルスベクターを含みうるであろう。レトロウイルス、レンチウイ
ルス、およびアデノ随伴ウイルスによる遺伝子導入方法では、宿主ゲノム内の統合が可能
であり、挿入されたトランス遺伝子の長期にわたる発現を結果としてもたらすことが多い
。加えて、多くの異なる細胞型および標的組織における形質導入効率の増大も観察されて
いる。
潜在的標的集団を拡大することにより変更することができる。レンチウイルスベクターと
は、非分裂細胞に形質導入するか、またはこれらに感染し、典型的には、高ウイルス力価
をもたらすことが可能なレトロウイルスベクターである。したがって、レトロウイルスの
遺伝子導入系の選択は、標的組織に依存するであろう。レトロウイルスベクターは、外来
配列のパッケージング容量を最大で6〜10kbとするシス作用型LTR(long t
erminal repeat)を含む。ベクターの複製およびパッケージングには、最
小限のシス作用型LTRで十分であり、次いで、これを使用して、治療用遺伝子を、標的
細胞中に組み込んで、恒久的なトランス遺伝子発現をもたらす。広く使用されるレトロウ
イルスベクターは、マウス白血病ウイルス(MuLV)、テナガザル白血病ウイルス(G
aLV)、サル免疫不全ウイルス(SIV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、および
これらの組合せに基づくレトロウイルスベクター(例えば、Buchscherら(1992年)
、J. Virol.、66巻:2731〜2739頁;Johannら(1992年)、J. Virol.、
66巻:1635〜1640頁;Sommnerfeltら(1990年)、J. Virol.、176巻
:58〜59頁;Wilsonら(1989年)、J. Virol.、63巻:2374〜2378頁
;Millerら(1991年)、J. Virol.、65巻:2220〜2224頁;PCT/US
94/05700)を含む。一過性発現が好ましい適用では、アデノウイルスのベースの
系を使用することができる。アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞型における
極めて高度な形質導入効率が可能であり、細胞分裂を要請しない。このようなベクターに
より、高力価および高発現レベルが得られる。このベクターは、比較的単純な系により大
量に作製することができる。アデノ随伴ウイルス(「AAV」)ベクターはまた、例えば
、in vitroでの核酸およびペプチドの産生において、細胞に標的核酸を形質導入
するのにも使用することができ、in vivoおよびex vivoにおける遺伝子治
療手順にも使用することができる(例えば、Westら(1987年)、Virology、160巻
:38〜47頁;米国特許第4,797,368号;WO93/24641;Kotin(1
994年)、Human Gene Therapy、5巻:793〜801頁;Muzyczka(1994年)
、J. Clin. Invest.、94巻:1351頁)。組換えAAVベクターの構築については
、米国特許第5,173,414号;Tratschinら(1985年)、Mol. Cell. Biol.
、5巻:3251〜3260頁;Tratschinら(1984年)、Mol. Cell. Biol.、4
巻:2072〜2081頁;HermonatおよびMuzyczka(1984年)、Proc. Natl. Ac
ad. Sci. U.S.A.、81巻:6466〜6470頁;ならびにSamulskiら(1989年
)、J. Virol.、63巻:03822〜3828頁を含む多数の刊行物において記載され
ている。
とが典型的である。このような細胞は、アデノウイルスをパッケージングする293細胞
、およびレトロウイルスをパッケージングするψ2細胞またはPA317細胞を含む。遺
伝子治療において使用されるウイルスベクターは通例、核酸ベクターを、ウイルス粒子中
にパッケージングする細胞系を作製することにより作出する。ベクターは、パッケージン
グおよびその後の宿主への統合に要請される、最小限のウイルス配列を含有することが典
型的であり、他のウイルス配列は、ポリヌクレオチドを発現させるための発現カセットで
置きかえられる。逸失するウイルス機能は、パッケージング細胞系により、トランスで供
給されることが典型的である。例えば、遺伝子治療において使用されるAAVベクターは
、AAVゲノムに由来するITR配列であって、パッケージングおよび宿主ゲノムへの統
合に要請されるITR配列だけを有することが典型的である。ウイルスDNAは、他のA
AV遺伝子、すなわち、repおよびcapはコードするが、ITR配列を欠く、ヘルパ
ープラスミドを含有する細胞系内にパッケージングされる。細胞系にはまた、ヘルパーと
してのアデノウイルスも感染させることができる。ヘルパーウイルスは、AAVベクター
の複製、およびAAV遺伝子の、ヘルパープラスミドからの発現を促進する。ヘルパープ
ラスミドは、ITR配列の欠如に起因して、著明量ではパッケージングされない。アデノ
ウイルスによる夾雑は、例えば、AAVよりアデノウイルスの感受性が高い熱処理により
低減することができる。当業者には、核酸を細胞に送達するためのさらなる方法が公知で
ある。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、US20030087817を参照
されたい。
一過性で、または恒久的にトランスフェクトする。一部の実施形態では、被験体における
自然発生の細胞にトランスフェクトする。一部の実施形態では、トランスフェクトされる
細胞を、被験体から採取する。一部の実施形態では、細胞は、細胞系など、被験体から採
取された細胞に由来する。当技術分野では、組織培養のための多種多様な細胞系が公知で
ある。細胞系の例は、C8161、CCRF−CEM、MOLT、mIMCD−3、NH
DF、HeLa−S3、Huh1、Huh4、Huh7、HUVEC、HASMC、HE
Kn、HEKa、MiaPaCell、Panel、PC−3、TF1、CTLL−2、
C1R、Rat6、CV1、RPTE、A10、T24、J82、A375、ARH−7
7、Calu1、SW480、SW620、SKOV3、SK−UT、CaCo2、P3
88D1、SEM−K2、WEHI−231、HB56、TIB55、Jurkat、J
45.01、LRMB、Bcl−1、BC−3、IC21、DLD2、Raw264.7
、NRK、NRK−52E、MRC5、MEF、Hep G2、HeLa B、HeLa
T4、COS、COS−1、COS−6、COS−M6A、BS−C−1サル腎臓上皮
、BALB/3T3マウス胚線維芽、3T3 Swiss、3T3−L1、132−d5
ヒト胎児線維芽;10.1マウス線維芽、293−T、3T3、721、9L、A278
0、A2780ADR、A2780cis、A172、A20、A253、A431、A
−549、ALC、B16、B35、BCP−1細胞、BEAS−2B、bEnd.3、
BHK−21、BR 293、BxPC3、C3H−10T1/2、C6/36、Cal
−27、CHO、CHO−7、CHO−IR、CHO−K1、CHO−K2、CHO−T
、CHO Dhfr−/−、COR−L23、COR−L23/CPR、COR−L23
/5010、COR−L23/R23、COS−7、COV−434、CML T1、C
MT、CT26、D17、DH82、DU145、DuCaP、EL4、EM2、EM3
、EMT6/AR1、EMT6/AR10.0、FM3、H1299、H69、HB54
、HB55、HCA2、HEK−293、HeLa、Hepa1c1c7、HL−60、
HMEC、HT−29、Jurkat、JY細胞、K562細胞、Ku812、KCL2
2、KG1、KYO1、LNCap、Ma−MeI1−48、MC−38、MCF−7、
MCF−10A、MDA−MB−231、MDA−MB−468、MDA−MB−435
、MDCK II、MDCK II、MOR/0.2R、MONO−MAC6、MTD−
1A、MyEnd、NCI−H69/CPR、NCI−H69/LX10、NCI−H6
9/LX20、NCI−H69/LX4、NIH−3T3、NALM−1、NW−145
、OPCN/OPCT細胞系、Peer、PNT−1A/PNT2、RenCa、RIN
−5F、RMA/RMAS、Saos−2細胞、Sf−9、SkBr3、T2、T−47
D、T84、THP1細胞系、U373、U87、U937、VCaP、Vero細胞、
WM39、WT−49、X63、YAC−1、YAR、およびこれらのトランスジェニッ
ク亜種を含むがこれらに限定されない。細胞系は、当業者に公知の様々な供給源(例えば
、the American Type Culture Collection(AT
CC)(Manassus、Va.)を参照されたい)から入手可能である。一部の実施
形態では、本明細書で記載される1または複数のベクターをトランスフェクトされた細胞
を使用して、1または複数のベクター由来配列を含む、新たな細胞系を確立する。一部の
実施形態では、本明細書で記載されるCRISPR系の構成要素を一過性にトランスフェ
クトされ(1もしくは複数のベクターの一過性トランスフェクション、またはRNAのト
ランスフェクションなどにより)、CRISPR複合体の活性を介して改変された細胞を
使用して、改変を含有するが、他の任意の外因性配列を欠く細胞を含む、新たな細胞系を
確立する。一部の実施形態では、本明細書で記載される1もしくは複数のベクターを、一
過性に、もしくは恒久的にトランスフェクトされた細胞、またはこのような細胞に由来す
る細胞系を、1または複数の被験化合物の評価において使用する。
トトランスジェニック動物を作製する。一部の実施形態では、トランスジェニック動物は
、マウス、ラット、またはウサギなどの哺乳動物である。ある特定の実施形態では、生物
または被験体は、植物である。当技術分野では、トランスジェニック動物を作製するため
の方法が公知であり、一般に、本明細書で記載される細胞トランスフェクション方法など
の細胞トランスフェクション方法で始める。
する方法であって、in vivo方法の場合もあり、ex vivo方法の場合もあり
、in vitro方法の場合もある方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、細
胞または細胞集団を、ヒトまたは非ヒト動物からサンプリングするステップと、1または
複数の細胞を改変するステップとを含む。培養は、ex vivoにおいて、任意の段階
で生じうる。1または複数の細胞はなお、非ヒト動物中に再導入することもできる。
する方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、CRISPR複合体を、標的ポリヌ
クレオチドに結合させ、標的ポリヌクレオチドの切断を果たさせ、これにより、標的ポリ
ヌクレオチドを改変するステップであって、CRISPR複合体が、標的ポリヌクレオチ
ド内の標的配列にハイブリダイズさせたガイド配列と複合体化させた、CRISPR酵素
を含むステップを含む。
飾する方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、結合が、ポリヌクレオチドの発現
の増大または減少を結果としてもたらすように、CRISPR複合体を、ポリヌクレオチ
ドに結合させるステップであって、CRISPR複合体が、ポリヌクレオチド内の標的配
列にハイブリダイズさせたガイド配列と複合体化させた、CRISPR酵素を含むステッ
プを含む。
トを使用するための方法を提供する。本明細書で開示される主題のCRISPR複合体は
、標的ポリヌクレオチドを改変するための有効な手段を提供する。本明細書で開示される
主題のCRISPR複合体は、多数の細胞型内の標的ポリヌクレオチドを改変すること(
例えば、欠失させること、挿入すること、転座させること、不活化させること、活性化さ
せること)を含む、多種多様な有用性を有する。したがって、本明細書で開示される主題
のCRISPR複合体は、例えば、遺伝子治療、薬物スクリーニング、疾患の診断、およ
び予後診断において広範に適用される。例示的なCRISPR複合体は、標的ポリヌクレ
オチド内の標的配列にハイブリダイズさせたガイド配列と複合体化させたCRISPR酵
素を含む。
である、任意のポリヌクレオチドでありうる。例えば、標的ポリヌクレオチドは、真核細
胞の核内に存在するポリヌクレオチドでありうる。標的ポリヌクレオチドは、遺伝子産物
(例えば、タンパク質)をコードする配列の場合もあり、非コード配列(例えば、調節的
ポリヌクレオチドまたはジャンクDNA)の場合もある。理論に束縛されることを望まず
に述べると、標的配列は、PAM(プロトスペーサー隣接モチーフ)、すなわち、CRI
SPR複合体により認識される短い配列と関連すると考えられる。PAMの正確な配列お
よび長さの要件は、使用されるCRISPR酵素に応じて異なるが、PAMは、プロトス
ペーサー(すなわち、標的配列)に隣接する2〜5塩基対の配列であることが典型的であ
る。PAM配列の例は、下記の実施例節で与えられるが、当業者は、所与のCRISPR
酵素を伴う使用のための、さらなるPAM配列を同定することも可能であろう。
ば、シグナル伝達のための生化学経路に関連する遺伝子またはポリヌクレオチドを含む。
標的ポリヌクレオチドの例は、疾患関連遺伝子または疾患関連ポリヌクレオチドを含む。
「疾患関連」遺伝子または「疾患関連」ポリヌクレオチドとは、罹患した組織に由来する
細胞内で、非疾患対照の組織または細胞と比較して、異常なレベルまたは異常な形態の転
写産物または翻訳産物をもたらす、任意の遺伝子またはポリヌクレオチドを指す。「疾患
関連」遺伝子は、異常な高レベルで発現する遺伝子の場合もあり、異常な低レベルで発現
する遺伝子の場合もあり、この場合、発現の変更は、疾患の発症および/または進行と相
関する。疾患関連遺伝子はまた、直接疾患の病因をなすか、または疾患の病因をなす遺伝
子と連鎖不均衡の関係にある突然変異または遺伝的変異を所持する遺伝子も指す。転写ま
たは翻訳される産物は、公知の産物の場合もあり、未知の産物の場合もあり、正常なレベ
ルの場合もあり、異常なレベルの場合もある。
ならびにDNAリピートの不安定性および神経障害と関連する特定の突然変異の修復に関
する方法および組成物(Robert D. Wells、Tetsuo Ashizawa、Genetic Instabilitie
s and Neurological Diseases、第2版、Academic Press、2011年10月13日
(Medical))にも関する。タンデムリピート配列の特異的な態様は、20を超えるヒト
疾患の一因となることが見出されている(McIvorら(2010年)、RNA Biol.、7巻(
5号):551〜8頁)。CRISPR−Cas系を利用して、ゲノムの不安定性による
これらの欠損を補正することができる。
、Traboulsi編(2012年)、Genetic Diseases of the Eye、第2版、Oxford Un
iversity Pressにおいてさらに記載されている、いくつかの遺伝子突然変異から生じる
眼の欠損を補正することができる。
連する欠損を補正することに関する。例えば、遺伝性脳疾患は、副腎白質ジストロフィー
、脳梁欠損症、エカルディ症候群、アルパース病(Alpers’ Disease)、アルツハイマ
ー病(Alzheimer’s Disease)、バース症候群、バッテン病、CADASIL、小脳変
性、ファブリー病、ゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー病、ハンチントン病、
および他のトリプレットリピート障害、リー病、レッシュ−ナイハン症候群、メンケス病
、ミトコンドリアミオパシー、ならびにNINDSコルポセファリーを含みうるがこれら
に限定されない。
黄斑変性でありうる。一部の実施形態では、状態は、統合失調症でありうる。一部の実施
形態では、状態は、トリヌクレオチドリピート障害でありうる。一部の実施形態では、状
態は、脆弱X症候群でありうる。一部の実施形態では、状態は、セクレターゼ関連障害で
ありうる。一部の実施形態では、状態は、プリオン関連障害でありうる。一部の実施形態
では、状態は、ALSでありうる。一部の実施形態では、状態は、薬物中毒でありうる。
一部の実施形態では、状態は、自閉症でありうる。一部の実施形態では、状態は、アルツ
ハイマー病でありうる。一部の実施形態では、状態は、炎症でありうる。一部の実施形態
では、状態は、パーキンソン病でありうる。
2、PINK1、Parkin、UCHL1、シンフィリン1、およびNURR1を含む
がこれらに限定されない。
ンパク質1(MCP1)、Ccr5遺伝子によりコードされるC−Cケモカイン受容体5
型(CCR5)、Fcgr2b遺伝子によりコードされるIgG受容体IIB(CD32
ともまた呼ばれるFCGR2b)、またはFcer1g遺伝子によりコードされるFcイ
プシロンR1g(FCER1g)タンパク質を含みうる。
XDH(キサンチンデヒドロゲナーゼ)、TP53(腫瘍タンパク質p53)、PTGI
S(プロスタグランジン12(プロスタサイクリン)シンターゼ)、MB(ミオグロビン
)、IL4(インターロイキン4)、ANGPT1(アンジオポエチン1)、ABCG8
(ATP結合性カセットサブファミリーG(WHITE)メンバー8)、またはCTSK
(カテプシンK)を含みうる。
る極低密度リポタンパク質受容体タンパク質(VLDLR)、UBA1遺伝子によりコー
ドされるユビキチン様修飾因子活性化酵素1(UBA1)、またはUBA3遺伝子により
コードされるNEDD8活性化酵素E1触媒性サブユニットタンパク質(UBE1C)を
含みうる。
よりコードされるベンゾジアゼピン受容体(末梢)関連タンパク質1(BZRAP1)、
AFF2遺伝子(MFR2ともまた呼ばれる)によりコードされるAF4/FMR2ファ
ミリーメンバー2タンパク質(AFF2)、FXR1遺伝子によりコードされるFXR1
(fragile X mental retardation autosomal
homolog 1)タンパク質、またはFXR2遺伝子によりコードされるFXR2(
fragile X mental retardation autosomal h
omolog 2)タンパク質を含みうる。
TP結合性カセットサブファミリーA(ABC1)メンバー4タンパク質(ABCA4)
、APOE遺伝子によりコードされるアポリポタンパク質Eタンパク質(APOE)、ま
たはCCL2遺伝子によりコードされるケモカイン(C−Cモチーフ)リガンド2タンパ
ク質(CCL2)を含みうる。
1、TPH2、NRXN1、GSK3A、BDNF、DISC1、GSK3B、およびこ
れらの組合せを含みうる。
iectasia mutated)、ATR(ataxia telangiecta
sia and Rad3 related)、EGFR(上皮増殖因子受容体)、ER
BB2(v−erb−b2 erythroblastic leukemia vir
al oncogene homolog 2)、ERBB3(v−erb−b2 er
ythroblastic leukemia viral oncogene hom
olog 3)、ERBB4(v−erb−b2 erythroblastic le
ukemia viral oncogene homolog 4)、Notch 1
、Notch2、Notch 3、またはNotch 4を含みうる。
エンハンサー2相同体(C.elegans))、CTSB(カテプシンB)、PSEN
1(プレセニリン1)、APP(アミロイドベータ(A4)前駆体タンパク質)、APH
1B(anterior pharynx defective 1 homolog
B(C.elegans))、PSEN2(プレセニリン2(アルツハイマー病4))、
またはBACE1(beta−site APP−cleaving enzyme 1
)を含みうる。
ムターゼ1)、ALS2(筋委縮性側索硬化症2)、FUS(fused in sar
coma)、TARDBP(TAR DNA結合性タンパク質)、VAGFA(血管内皮
増殖因子A)、VAGFB(血管内皮増殖因子B)、およびVAGFC(血管内皮増殖因
子C)、ならびにこれらの任意の組合せを含みうる。
1)、ALS2(筋委縮性側索硬化症2)、FUS(fused in sarcoma
)、TARDBP(TAR DNA結合性タンパク質)、VAGFA(血管内皮増殖因子
A)、VAGFB(血管内皮増殖因子B)、およびVAGFC(血管内皮増殖因子C)、
ならびにこれらの任意の組合せを含みうる。
ファ−2−マクログロブリン)、AATF(apoptosis antagonizi
ng transcription factor)、ACPP(前立腺酸性ホスファタ
ーゼ)、ACTA2(大動脈平滑筋アクチンアルファ2)、ADAM22(ADAMメタ
ロペプチダーゼドメイン)、ADORA3(アデノシンA3受容体)、またはADRA1
D(アルファ−1Dアドレナリン受容体に代わる、アルファ−1Dアドレナリン作動性受
容体)を含みうる。
ブリン];AANAT[アリールアルキルアミンN−アセチルトランスフェラーゼ];A
BCA1[ATP結合性カセットサブファミリーA(ABC1)メンバー1];ABCA
2[ATP結合性カセットサブファミリーA(ABC1)メンバー2];またはABCA
3[ATP結合性カセットサブファミリーA(ABC1)メンバー3]を含みうる。
ゲン 受容体)、FMR1(fragile X mental retardatio
n 1)、HTT(ハンチンチン)、またはDMPK(筋緊張性ジストロフィータンパク
質キナーゼ)、FXN(フラタキシン)、ATXN2(アタキシン2)を含む。
S1(一酸化窒素シンターゼ1(神経))、ADRA2A(アドレナリン作動性アルファ
2A受容体)、ADRA2C(アドレナリン作動性アルファ2C受容体)、TACR1(
タキキニン受容体1)、またはHTR2c(5−ヒドロキシトリプトアミン(セロトニン
)受容体2C)を含む。
1)、AADAT(アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ)、AANAT(アリー
ルアルキルアミンN−アセチルトランスフェラーゼ)、ABAT(4−アミノ酪酸アミノ
トランスフェラーゼ)、ABCA1(ATP結合性カセットサブファミリーA(ABC1
)メンバー1)、またはABCA13(ATP結合性カセットサブファミリーA(ABC
1)メンバー13)を含む。
;アレクサンダー病;アラン−ハーンドン−ダドリー症候群;POLG関連障害;アルフ
ァ−マンノシドーシス(II型およびIII型);アルストレーム症候群;アンゲルマン
症候群;毛細血管拡張性運動失調症;神経セロイドリポフスチン症;ベータ−サラセミア
;両側視神経萎縮および(乳児性)1型視神経萎縮;網膜芽細胞腫(両側);カナバン病
;脳眼顔骨格症候群1(COFS1);脳腱黄色腫症;コルネリアデランゲ症候群;MA
PT関連障害;遺伝性プリオン病;ドラベ症候群;早発性家族性アルツハイマー病;フリ
ードライヒ運動失調症[FRDA];フリンス症候群;フコシドーシス;福山型先天性筋
ジストロフィー;ガラクトシアリドーシス;ゴーシェ病;有機酸血症;血球貪食性リンパ
組織球症;ハッチンソン−ギルフォード早老症候群;II型ムコリピドーシス;乳児性遊
離シアル酸蓄積症;PLA2G6関連神経変性;ジャーベル・ランゲ−ニールセン症候群
;接合部型表皮水疱症;ハンチントン病;クラッベ病(乳児性);ミトコンドリアDNA
関連リー症候群およびNARP;レッシュ−ナイハン症候群;LIS1関連脳回欠損;ロ
ウ症候群;メープルシロップ尿症;MECP2重複症候群;ATP7A関連銅輸送障害;
LAMA2関連筋ジストロフィー;アリールスルファターゼA欠損症;I型ムコ多糖症、
II型ムコ多糖症、またはIII型ムコ多糖症;ツェルウェガー症候群スペクトルのペル
オキシソーム生合成障害;脳内鉄蓄積障害を伴う神経変性;酸性スフィンゴミエリナーゼ
欠損症;C型ニーマン−ピック病;グリシン脳症;ARX関連障害;尿素サイクル障害;
COL1A 1/2関連骨形成不全症;ミトコンドリアDNA欠失症候群;PLP1関連
障害;ペリー症候群;フェラン−マクダーミド症候群;II型糖原病(ポンぺ病)(乳児
性);MAPT関連障害;MECP2関連障害;1型肢根型点状軟骨異形成症;ロバート
症候群;サンドホフ病;1型シンドラー病;アデノシンデアミナーゼ欠損症;スミス−レ
ムリ−オピッツ症候群;脊髄性筋委縮症;乳児期発症型脊髄小脳性運動失調症;ヘキソサ
ミニダーゼA欠損症;1型タナトフォリック骨異形成症;VI型コラーゲン関連障害;I
型アッシャー症候群;先天性筋ジストロフィー;ウォルフ−ヒルシュホーン症候群;ライ
ソゾーム酸性リパーゼ欠損症;ならびに色素性乾皮症から選択することができる。
発現を調節する、RNAリボザイムおよび調節可能なアプタザイム
vivoにおけるgRNAの発現を調節する、RNAリボザイムおよび調節可能なアプ
タザイムの使用、特に、第1の非制限型ヌクレオチド特異性を伴う、ガイドRNAのシス
型プロセシングのための、5’側ハンマーヘッド型リボザイム、およびin vivoに
おける、RNAアプタザイムを介するgRNA機能の調節の使用にも関する。
、ヘリックスI、ヘリックスII、およびヘリックスIIIの二重鎖領域とを含むシス作
用型ハンマーヘッド型リボザイムであって、ヘリックスIIの二重鎖領域およびヘリック
スIIIの二重鎖領域の各々が、触媒性コアの反対側にループ領域を含み、ヘリックスI
Iの二重鎖領域が、リガンドに結合するアプタマーを含む、シス作用型ハンマーヘッド型
リボザイムと;b)CRISPR−Cas系のガイドRNA(gRNA)をコードするヌ
クレオチド配列であって、gRNAが、真核細胞内のDNA分子の標的配列とハイブリダ
イズし、DNA分子が、真核細胞内で発現する1または複数の遺伝子産物をコードし、ヌ
クレオチド配列が、5’末端および3’末端を含み、ヌクレオチド配列の5’末端が、ヘ
リックスIIIの二重鎖領域と直接カップリングしている、ヌクレオチド配列とを含むア
プタマー調節型リボザイムであって、リボザイムが、ヌクレオチド配列の5’末端と、ヘ
リックスIIIの二重鎖領域との間の自己切断を経るように、リガンドのアプタマーへの
結合により、リボザイム内のコンフォメーション変化がもたらされ、gRNAが産生され
る、アプタマー調節型リボザイムも提供する。また、(i)RNAに転写されると、アプ
タマー調節型リボザイムをもたらすコード配列と;(ii)真核細胞内のRNAの転写を
調節する、1または複数の転写調節配列とを含む発現構築物も提供される。また、発現構
築物を含む真核細胞も提供される。また、真核細胞内の1または複数の遺伝子産物の発現
を変更する方法であって、細胞が、1または複数の遺伝子産物をコードするDNA分子を
含み、方法が、発現構築物を細胞中に導入するステップと、細胞をリガンドと、リボザイ
ムの活性を変更する量で接触させるステップとを含み、特に、細胞が、哺乳動物被験体ま
たはヒト被験体における細胞である方法も提供される。一態様では、リガンドは、テオフ
ィリンである。
A分子である(LongおよびUhlenbeck(1993年)、FASEB J.、7巻:25〜30頁)
。多様な自然発生のリボザイムは、ウイルス、ウィロイド、および原虫において同定され
ている。最初の触媒性RNAのうちの1つは、タバコリングスポットウィロイド(sTR
SV)のサテライトRNAにおいて発見された(De la Penaら(2003年)、EMBO
J.、22巻:5561〜70頁)。in vivoにおいて、この病原性ウィロイドは、
シスにおいて作用し、複製時に自己切断することが示された。最初のリボザイムの発見以
来、ヘアピン型リボザイムおよびハンマーヘッド型リボザイムを含む、天然リボザイムの
多様なクラスが同定され、広範に特徴付けられている。
1つである(LongおよびUhlenbeck(1993年)、Faseb J.、7巻:25〜30頁;Pl
eyら(1994年)、Nature、372巻:68〜74頁;Hammannら(2001年)、Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA、98巻:5503〜8頁;BlountおよびUhlenbeck(20
05年)、Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct.、34巻:415〜40頁)。h
Rzは、11ヌクレオチド(nt)の、高度に保存的な触媒性コアに収束する、3つのヘ
リックス領域を含む(Khvorovaら(2003年)、Nat. Struct. Biol.、10巻:70
8〜12頁;Salehi-AshtianiおよびSzostak(2001年)、Nature、414巻:82〜
4頁)。切断は、配列特異的であり、5’−NUX−3’トリプレット[配列中、Nは、
任意の塩基であり、Uは、ウラシルであり、Xは、グアニン以外の任意の塩基である]を
ターゲティングする。効率的で迅速な切断に最適なNUXは、GUCである。リボザイム
による切断は、Xに由来する2’ヒドロキシル基であって、切断部位のすぐの3’側にあ
る2’ヒドロキシル基が、脱プロトン化されると触媒される。次いで、この求核剤が、切
断可能なリン酸を攻撃し、五配位三方両錘形遷移状態を介して、5’生成物および3’生
成物を生成させる(BlountおよびUhlenbeck(2005年)、Annu. Rev. Biophys. Bi
omol. Struct.、34巻:415〜40頁)。
イベントを介して進行すると仮定されている。高アフィニティーの結合イベントは、50
0μMで生じ、三次相互作用の第1のセットをもたらす。第2の低アフィニティーによる
イオンの付加は、10mMで生じ、ヘリックスIが、フォールドしてヘリックスIIIか
ら遠ざかり、ヘリックスIIと相互作用するように、hRzステムの配向性を再構築する
(Hammannら(2001年)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、98巻:5503〜8
頁)。保存的触媒性コアを伴うhRzであって、特異的ステムループを維持しないhRz
を、ミニマルハンマーヘッド型リボザイム(mhRz)と呼ぶ。mhRzは、二価イオン
濃度が高濃度(10mM)のときは活性であるが、低濃度では、事実上不活性である(De
la Penaら(2003年)、EMBO J.、22巻:5561〜70頁;Khvorovaら(20
03年)、Nat. Struct. Biol.、10巻:708〜12頁)。天然hRzの結晶構造で
は、ステムループのうちの2つが、「キッシングループ」として相互作用する、「Y」字
型分子が描示される(Pleyら(1994年)、Nature、372巻:68〜74頁)。ステ
ムループ内の、非対合塩基の間の、これらの三次相互作用は、触媒的に活性のコンフォメ
ーションを安定化させ、高二価イオン状態を不要とすることが提案されている。研究者ら
は、ループを、mhRzデザイン中に再組込みすることにより、100〜500μMの間
の、生物学的に関与性の二価イオン濃度で、in vitroにおける触媒活性が回復さ
れることを実証している(De la Penaら(2003年)、EMBO J.、22巻:5561
〜70頁;Khvorovaら(2003年)、Nat. Struct. Biol.、10巻:708〜12頁
;Cannyら(2004年)、J. Am. Chem. Soc.、126巻:10848〜9頁;Pened
oら(2004年)、RNA、10巻:880〜8頁;Saksmerpromeら(2004年)、RNA
、10巻:1916〜24頁;WeinbergおよびRossi(2005年)、FEBS Lett.、57
9巻:1619〜24頁)。ここで、in vivoにおける触媒活性のためのデザイン
規則を解明することにより、hRzを、遺伝子発現の有効な調節因子とする準備が整う。
含有する。本明細書では、「ステム」および「ヘリックス」という用語を互換的に使用す
る場合がある。したがって、本明細書では、コアから伸長する3本のステムを、ステムI
、ステムII、およびステムIII(またはヘリックスI、ヘリックスII、およびヘリ
ックスIII)と称し、少なくとも1つのループを、コアからのステムの反対の末端に配
置する。シス作用型リボザイムの実施形態では、リボザイムは、一方は、ステムII(ま
たはヘリックスII)の末端に配置され、他方は、ステムIII(またはヘリックスII
I)の末端に配置される、2つのループを含有する。
に単一のポリヌクレオチドを含む、ハンマーヘッド型リボザイムである。シス切断型ハン
マーヘッド型リボザイムは、自己切断が可能である。
、その少なくとも一部が二本鎖である核酸モチーフである。ある特定の実施形態では、リ
ボザイムコアからのステムの反対の末端にループを置き、このループにより、二本鎖ステ
ムの2つの鎖を接続する。ある特定の実施形態では、ステムは、2つ〜20の相補的塩基
対を含む。ある特定の実施形態では、ステムは、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、
または9つの相補的塩基対を含む。
的塩基対の部分である。残りの塩基対は、ミスマッチした非相補的塩基対の場合もあり、
バルジの部分の場合もある。ある特定の実施形態では、ステム内のヌクレオチドのうちの
少なくとも40%は、相補的塩基対の部分である。ある特定の実施形態では、ステム内の
ヌクレオチドのうちの少なくとも50%は、相補的塩基対の部分である。ある特定の実施
形態では、ステム内のヌクレオチドのうちの少なくとも60%は、相補的塩基対の部分で
ある。ある特定の実施形態では、ステム内のヌクレオチドのうちの少なくとも70%は、
相補的塩基対の部分である。ある特定の実施形態では、ステム内のヌクレオチドのうちの
少なくとも80%は、相補的塩基対の部分である。ある特定の実施形態では、ステム内の
ヌクレオチドのうちの少なくとも90%は、相補的塩基対の部分である。ある特定の実施
形態では、ステム内のヌクレオチドのうちの少なくとも95%は、相補的塩基対の部分で
ある。ある特定の実施形態では、ステム内のヌクレオチドのうちの少なくとも99%は、
相補的塩基対の部分である。ある特定の実施形態では、ステム内のヌクレオチドのうちの
100%が、相補的塩基対の部分である。
テムの遠位末端に配置される。ある特定の実施形態では、ループは、1〜20ヌクレオチ
ドの間の長さである。ある特定の実施形態では、ループは、2〜10ヌクレオチドの間の
長さである。ある特定の実施形態では、ループは、3〜8ヌクレオチドの間の長さである
。ループは、それが接合するステムに従い番号付けされる。したがって、ループIは、コ
アの反対側である、ステムIの末端に配置され、ループIIは、コアの反対側である、ス
テムIIの末端に配置され、ループIIIは、コアの反対側である、ステムIIIの末端
に配置される。
ステムの末端におけるループと共に、ステム(またはヘリックス)の全体を指す。例えば
、ステム/ループIIは、ステムII内に任意のバルジを含むステムIIと、ループII
とを含む。ステムが、ループを欠く場合、ステム/ループは、そのステム内の任意のバル
ジと共に、ステムを指す。本明細書で使用される「バルジ」とは、別の鎖と対合しないヌ
クレオチドの配列であり、両側を二本鎖核酸配列で挟まれている。ある特定の実施形態で
は、バルジは、ステム内に配置される。バルジが、ステム内に配置される場合、バルジの
ヌクレオチドは、ステムの部分であると考えられる。ある特定の実施形態では、ハンマー
ヘッド型リボザイムは、1つを超えるバルジを含む。ある特定の実施形態では、ステム内
のバルジは、コアから2塩基対に配置される。ある特定の実施形態では、ステムの鎖の一
方または両方は、バルジを含有する。
配列は、5’末端および3’末端を含み、ヌクレオチド配列の5’末端が、ヘリックスI
IIの二重鎖領域と直接カップリングしている。「直接カップリングしている」とは、ル
ープが、アプタマーの非存在下にある活性のリボザイム構造と比べて、ループの2つの残
基の間の一方の骨格ホスホジエステル結合だけにおいて中断され、骨格ホスホジエステル
結合が、アプタマーの5’末端および3’末端へのホスホジエステル結合で置きかえられ
ることを意味する。アプタマー調節型リボザイムの活性形態では、そうでなければ中断さ
れるループの構造を保存するために、情報伝送ドメインの5’側残基および3’残基を、
互いと塩基対合させて、二重鎖領域を形成する。
意の分子または化合物であり、本明細書で記載される通りにデザインおよび/または選択
されるアプタマーと相互作用しうる、分子または化合物を指すことが意図される。適切な
リガンドまたは解析物は、農薬、殺虫剤、毒素、治療薬、および乱用される薬物、ホルモ
ン、抗生剤、抗体、有機材料などを含むがこれらに限定されない、環境的化学物質もしく
は臨床的化学物質、汚染物質、または生体分子など、低分子の化学物質を含むがこれらに
限定されない。適切な生体分子は、タンパク質(酵素、免疫グロブリン、および糖タンパ
ク質を含む)、核酸、脂質、レクチン、炭水化物、ホルモン、全細胞(原核細胞(病原性
細菌など)および哺乳動物の腫瘍細胞を含む真核細胞を含む)、ウイルス、胞子などを含
むがこれらに限定されない。タンパク質である例示的な解析物は、酵素;薬物;細胞;抗
体;抗原;細胞膜抗原および細胞膜受容体(神経受容体、ホルモン受容体、栄養素受容体
、および細胞表面受容体)またはこれらの天然リガンドを含むがこれらに限定されない。
る切断またはシスにおける切断を持続することが可能なRNAモチーフである。シス作用
型ハンマーヘッド型リボザイム(chRz)とは、それ自身の骨格の自己切断を経て、2
つのRNA生成物を生成させる、触媒性RNAである。シス作用型ハンマーヘッド型リボ
ザイムは、3つの塩基対合型ステムと、切断に要請される残基の高度に保存的コアとを含
有する。切断反応は、触媒性部位であるシトシンの2’ヒドロキシル酸素による、同じ残
基の3’炭素に接合したリン原子に対する攻撃を介して進行する。これにより、糖リン酸
骨格が破壊され、2’,3’環状リン酸が生成する。
カルのワトソン−クリック塩基対の形成に関与しない、およそ13の保存的「コア」ヌク
レオチドまたは不変の「コア」ヌクレオチドを含む。コア領域には、一般に、カノニカル
のワトソン−クリック塩基対を含むが、その他の点では、配列に関して制約されない、ス
テムI、ステムII、およびステムIIIが隣接する。
的な様式でアニールし、切断可能なホスホジエステル結合の切断を方向付けるリボザイム
のハイブリダイジングアームにより制御される。この活性は、切断部分トリプレットの第
3のヌクレオチドの後で生じるように、特異的に方向付けられる。
ザイムと、アプタマー調節型シス作用型ハンマーヘッド型リボザイムとを提供する。対象
のアプタマー調節型thRzおよびアプタマー調節型chRzは、様々なリガンドに対し
て応答性となるようにたやすく操作することができ、多くの適用において有用な多用途の
リボザイムクラスである。例えば、アプタマー調節型thRzおよびアプタマー調節型c
hRzは、ターゲティングされる遺伝子の活性を、リガンド依存的な形でモジュレートす
るようにデザインすることができ、したがって、内因性遺伝子または異種遺伝子の発現を
モジュレートするのに有用である。
よび「オン」状態という、少なくとも2つのコンフォメーション状態であって、chRz
の場合における自己切断またはthRzの場合における標的配列の切断を経るために、そ
の活性レベル(例えば、反応速度)により規定されるコンフォメーション状態を有しうる
。本明細書で開示される主題のエフェクタードメインは、アプタマードメインへのリガン
ドの結合に応答して、それらの「オン」コンフォメーション状態と「オフ」コンフォメー
ション状態との間で切り換えることができる。したがって、本明細書で開示される主題の
アプタマー調節型リボザイムは、リガンドの結合に応答して、その活性が「オン」および
「オフ」とされる、スイッチとして作用する。ある特定の実施形態では、リボザイムドメ
インの機能は、リガンドの存在もしくは非存在に顕著に依存的であるか、またはアプタマ
ードメインへの結合に利用可能なリガンドの濃度に対するより大きな用量反応様の依存性
を示しうる。
は、広範にわたる。ある特定の場合、リガンドは、分子量が2500amu未満の低分子
である。これらは、例示だけを目的として述べると、ペプチド、有機低分子(薬物ならび
にある特定の代謝物および中間体、共因子などを含む)、および金属イオンを含む、自然
発生の分子の場合もあり、非自然発生の分子の場合もある。アプタマーに結合する例示的
なリガンドは、限定なしに述べると、薬物、代謝物、中間体、共因子、遷移状態類似体、
イオン、金属、核酸、および毒素などの低分子を含む。アプタマーはまた、タンパク質、
ペプチド、核酸、多糖、糖タンパク質、ホルモン、受容体、ならびに細胞壁および細胞膜
などの細胞表面を含む、天然ポリマーおよび合成ポリマーにも結合しうる。典型的にはR
NAであるアプタマーへのリガンドの結合は、情報伝送ドメインとの塩基対合を変更し、
これは、リボザイムドメインの構造的変化として持ち越され、ホスホジエステル結合の切
断(自己切断または標的配列の切断)を媒介するその能力を変更する。したがって、リガ
ンドの結合は、例えば、遺伝子の不活化、転写、翻訳を媒介するか、または、他の点で、
標的遺伝子もしくは標的mRNAの正常な活性に干渉する、エフェクタードメインの能力
に影響を及ぼす。
選択により得られているであろう。しかし、また、in vivoにおけるアプタマーの
選択も可能である。アプタマーは、環境内で、意図される標的分子との複合体を形成する
ことが可能な特異的結合領域であって、同じ環境内で、他の物質は、核酸と複合体化しな
い特異的結合領域を有する。結合の特異性は、アプタマーの、環境内の他の材料または非
類縁分子一般に対する解離定数と比較した、アプタマーの、そのリガンドに対する比較解
離定数(Kd)との関係で規定される。リガンドとは、非類縁材料に対する場合より大き
なアフィニティーでアプタマーに結合するリガンドである。典型的には、アプタマーの、
そのリガンドに関するKdは、アプタマーの、非類縁材料または環境内に付属する材料に
対するKdの、少なくとも約10分の1であろう。なおより好ましくは、Kdは、少なく
とも約50分の1、より好ましくは、少なくとも約100分の1であり、最も好ましくは
、少なくとも約200分の1であろう。アプタマーは典型的に、約10〜約300ヌクレ
オチドの間の長さであろう。より一般的に、アプタマーは、約30〜約100ヌクレオチ
ドの間の長さであろう。
開示される主題の方法を使用して、これらの分子の各々を、関連するリボザイムのモジュ
レーターとして使用することができる。例えば、有機分子、ヌクレオチド、アミノ酸、ポ
リペプチド、細胞表面上の標的特徴、イオン、金属、塩、糖は全て、それぞれのリガンド
に特異的に結合しうるアプタマーを単離するのに適することが示されている。例えば、H
oechst33258などの有機色素は、in vitroにおけるアプタマー選択の
ための標的リガンドとして使用されて成功している(WerstuckおよびGreen(1998年
)、Science、282巻:296〜298頁)。また、ドーパミン、テオフィリン、スル
ホローダミンB、およびセルロースなど、他の有機低分子も、アプタマーの単離において
、リガンドとして使用されている。また、カナマイシンA、リビドマイシン、トブラマイ
シン、ネオマイシンB、ビオマイシン、クロラムフェニコール、およびストレプトマイシ
ンなどの抗生剤に対するアプタマーも単離されている。低分子を認識するアプタマーの総
説については、Famulok(1999年)、Science、9巻:324〜9頁を参照されたい。
アプタマーのリガンドは、細胞透過性の有機低分子である。翻訳に対する一般的な阻害効
果を有さない有機低分子が、リガンドとして好ましい。低分子はまた、所望レベルの翻訳
の阻害を達成するのに十分な、in vivoにおける存続を呈示することも好ましい。
また、分子をスクリーニングして、例えば、経口投与の後で、バイオアベイラビリティー
を示す分子を同定することもできる。本明細書で開示される主題のある特定の実施形態で
は、リガンドは、非毒性である。リガンドは任意選択で、例えば、ステロイドを含む薬物
でありうる。しかし、遺伝子発現を制御する方法の一部では、リガンドは、薬理学的に不
活性であることが好ましい。一部の実施形態では、リガンドは、細胞内のその存在が、疾
患または病理学的状態を指し示すポリペプチドである。他の実施形態では、アプタマーの
リガンドは、クロラムフェニコールなどの抗生剤である。代替的な実施形態では、アプタ
マーのリガンドは、Hoeschst色素33258などの有機色素である。さらに別の
実施形態では、リガンドは、金属イオンでありうる。具体的な実施形態では、アプタマー
調節型核酸のアプタマードメインは、カフェインへの結合に応答する。
る、SELEXとして公知の選択技法(Ellingtonら(1990年)、Nature、346巻
、818〜22頁;およびTuerkら(1990年)、Science、249巻、505〜10頁
)を援用することにより、特定のリガンドに結合するアプタマーを開発することが典型的
である。アプタマーを制作する方法はまた、例えば、米国特許第5,582,981号;
PCT公開第WO00/20040号;米国特許第5,270,163号;Lorschおよび
Szostak(1994年)、Biochemistry、33巻:973頁;Mannironiら(1997年)
、Biochemistry、36巻:9726頁;Blind(1999年)、Proc. Natl. Acad. Sc
i. U.S.A.、96巻:3606〜3610頁;HuizengaおよびSzostak(1995年)、B
iochemistry、34巻:656〜665頁;PCT公開第WO99/54506号、同第
WO99/27133号、同第WO97/42317号;ならびに米国特許第5,756
,291号においても記載されている。
itroにおける選択技法は、まず、所望の長さのオリゴヌクレオチドの大規模なプール
であって、ランダム化または突然変異誘発された少なくとも一部の領域を含有するプール
を調製するステップを伴う。例えば、アプタマー選択のための一般的なオリゴヌクレオチ
ドプールは、20〜100のランダム化されたヌクレオチドの領域であって、両方の末端
が、約15〜25ヌクレオチド長の領域であり、PCRプライマーの結合に有用な、規定
された配列の領域で挟まれた領域を含有しうるであろう。選択された核酸配列の、信頼で
きる、効率的な増幅を可能とする、任意の手段を援用しうるが、オリゴヌクレオチドプー
ルは、標準的なPCR技法を使用して増幅する。次いで、DNAプールを、in vit
roにおいて転写して、RNA転写物を作製する。次いで、別の分子(例えば、タンパク
質または任意の標的分子)に特異的に結合するそれらの能力に基づく核酸の選択を可能と
する、任意のプロトコールを使用しうるが、RNA転写物を、アフィニティークロマトグ
ラフィーにかけることができる。アフィニティークロマトグラフィーの場合、転写物は、
カラムに通すか、または標的リガンドを固定化させた磁気ビーズなどと接触させることが
最も典型的である。プール内のRNA分子であって、リガンドに結合したRNA分子は、
カラム上またはビーズ上に保持されるが、結合しなかった配列は、洗い流される。次いで
、リガンドに結合するRNA分子を逆転写させ、PCRにより再度増幅する(通例、溶出
の後で)。次いで、選択されたプール配列を、同じ種類の選択の別のラウンドにかける。
プール配列は、選択手順の、のべ約3つ〜10の反復ラウンドにかけることが典型的であ
る。次いで、標的リガンドのアプタマーとして作用することが可能なRNA分子の配列を
同定する標準的な手順を使用して、cDNAを、増幅、クローニング、およびシークェン
シングする。アプタマー配列の同定に成功したら、突然変異誘発されたアプタマー配列を
含むオリゴヌクレオチドのプールから始まる、選択のさらなるラウンドを実施することに
より、アプタマーをさらに最適化することができる。本明細書で開示される主題における
使用のために、アプタマーは、正常な生理学的状態を模倣する塩濃度および温度の存在下
で、リガンドへの結合について選択することが好ましい。
ガンドを選択することができる。大半の場合において、当業者は、えり抜きのリガンドに
結合するアプタマーを得ることができる。in vitroにおける選択工程の固有の性
格は、どのような種類の構造が、所望のリガンドに結合しうるのかについての先行の知見
が全く不足しているにもかかわらず、所望のリガンドに結合する、適切なアプタマーの単
離を可能とする。
開示される主題のアプタマー調節型リボザイムを、「オン」状態と「オフ」状態との間で
切り換えるか、またはアプタマー調節型リボザイムの機能レベルをチューニングするよう
に、アプタマーの、リガンドに対する結合アフィニティーは、十分に大きくなければなら
ず、そのリガンドに結合した場合に、アプタマーにより形成される構造も、十分に有意義
でなければならない。
タマーに結合し、リガンドを投与したときに得られるリガンドの濃度で、所望の効果を及
ぼすような会合定数であることが好ましい。in vivoにおける使用では、例えば、
会合定数は、結合が、血清中または他の組織内で達成されうるリガンドの濃度を十分に下
回る濃度で生じるような会合定数であるものとする。好ましくは、in vivoにおけ
る使用に要請されるリガンド濃度はまた、生物に対して所望されない効果を及ぼしうる濃
度を下回る濃度でもある。
たは所定のリガンドに対して応答性であるアプタマーまたはアプタマードメインをデザイ
ンし、選択する方法を提供する。対象のアプタマー調節型リボザイムはまた、それらの切
換え挙動が、リガンドへの結合に対して概ね応答性となるようにも「チューニング」する
ことができる。アプタマー調節型リボザイムはまた、アプタマードメインの結合アフィニ
ティーが、そのリガンドに対して概ね感受性となるようにも「チューニング」することが
できる。例えば、アプタマー調節型リボザイム内の分子内二重鎖形成、ならびに他の二次
構造および三次構造についての熱力学特性は、アプタマードメインが、リガンドへの結合
に概ね適するように、すなわち、解離定数(Kd)または他の反応速度パラメータ(Ko
n速度およびKoff速度など)に顕示されうる通りに変更することができる。代替的に
、ハイブリダイゼーション、ならびにリボザイムドメインの二次構造および三次構造をも
たらしうる、他の分子内相互作用が変更されても、リボザイムドメインのアロステリック
変化は、リガンドへの結合に対して概ね応答性でありうる。当技術分野では、核酸構造の
熱力学特性を変更するためのフォワードエンジニアリング戦略が周知である。例えば、相
補的な核酸対合の増大は、リボザイムドメインまたはアプタマードメインの安定性を増大
させうる。
本明細書で開示される主題はまた、神経変性疾患、神経変性障害、または神経変性状態
を処置するための方法も提供する。一部の実施形態では、本明細書で開示される主題は、
それを必要とする被験体における眼の神経変性疾患を処置するための方法であって、(a
)i)CRISPR−Cas系のガイドRNA(gRNA)をコードする少なくとも1つ
のヌクレオチド配列に作動可能に連結したH1プロモーターであって、gRNAが、被験
体の細胞内のDNA分子の標的配列とハイブリダイズし、DNA分子が、細胞内で発現す
る1または複数の遺伝子産物をコードする、H1プロモーターと;ii)細胞内で作動可
能な調節エレメントであって、Cas9タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動
可能に連結した調節エレメントとを含む1または複数のベクターを含む非自然発生のCR
ISPR−Cas系であって、構成要素(i)および(ii)が、系の同じベクターまた
は異なるベクターに配置され、gRNAが、標的配列をターゲティングし、これとハイブ
リダイズし、Cas9タンパク質が、DNA分子を切断して、1または複数の遺伝子産物
の発現を変更する、CRISPR−Cas系を用意するステップと;(b)被験体に有効
量の系を投与するステップとを含む方法を提供する。
受容体細胞など、他の神経細胞の変性または機能不全と関連する疾患、障害、または状態
(ニューロパシーを含む)を意味する。神経変性疾患、神経変性障害、または神経変性状
態は、ニューロンの機能の低下もしくは機能不全、またはニューロンもしくは他の神経細
胞の喪失が生じうる、任意の疾患、障害、または状態でありうる。
)、三叉神経痛、舌咽神経痛、ベル麻痺、重症筋無力症、筋ジストロフィー、進行性筋委
縮症、原発性側索硬化症(PLS)、偽性延髄麻痺、進行性延髄麻痺、脊髄性筋委縮症、
遺伝性筋委縮症、椎間板症候群、頚椎症、神経叢障害、胸郭出口症候群、末梢神経障害、
ポルフィリン症(prophyria)、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、
パーキンソンプラス疾患、多系統委縮症、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、レ
ビー小体型認知症、前頭側頭型認知症、脱髄疾患、ギラン−バレー症候群、多発性硬化症
、シャルコー−マリー−トゥース病、プリオン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、ゲルス
トマン−ストロイスラー−シャインカー症候群(GSS)、致死性家族性不眠症(FFI
)、ウシ海綿状脳症(BSE)、ピック病、てんかん、およびAIDS認知症複合など、
神経系の神経変性疾患、神経変性障害、もしくは神経変性状態、またはこれらと関連する
神経系の神経変性疾患、神経変性障害、もしくは神経変性状態を含むがこれらに限定され
ない。
症、バッテン病(シュピールマイヤー−フォークト−シェーグレン−バッテン病としても
また公知である)、カナバン病、コケイン症候群、糖尿病性ニューロパシー、前頭側頭葉
変性症、HIV関連認知症、ケネディー病、クラッベ病、神経ボレリア症、マシャド−ジ
ョゼフ病(3型脊髄小脳性運動失調症)、ウェット型黄斑変性またはドライ型黄斑変性、
ニーマンピック病、ペリツェウス−メルツバッハー病、色素性網膜炎および関連疾患など
の光受容体変性疾患、レフサム病、サンドホフ病、シルダー病、悪性貧血に続発する亜急
性連合性脊髄変性症、シュピールマイヤー−フォークト−シェーグレン−バッテン病(バ
ッテン病としてもまた公知である)、脊髄小脳性運動失調症(多様な特徴を伴う複数の種
類)、スティール−リチャードソン−オルゼウスキー病、ならびに脊髄癆など、神経系の
他の神経変性疾患、神経変性障害、もしくは神経変性状態、またはこれらと関連する神経
系の他の神経変性疾患、神経変性障害、もしくは神経変性状態も含まれる。
(AMD)、ウェット型AMDまたはドライ型AMDと関連する光受容体変性、色素性網
膜炎(RP)など、他の網膜変性、視神経ドルーゼン、視神経症、および多発性硬化症か
ら生じる視神経炎などの視神経炎を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、
眼の神経変性疾患は、緑内障、網膜変性、および加齢黄斑変性からなる群から選択される
。一部の実施形態では、眼の神経変性疾患は、色素性網膜炎(RP)である。
定的な例は、原発性緑内障(原発性開放隅角緑内障、慢性開放隅角緑内障、慢性単性緑内
障、および単性緑内障としてもまた公知である)、低眼圧緑内障、原発性閉塞隅角緑内障
(primary angle−closure glaucoma)(原発性閉塞隅角
緑内障(primary closed−angle glaucoma)、狭隅角緑内
障、瞳孔ブロック緑内障、および急性うっ血緑内障としてもまた公知である)、急性閉塞
隅角緑内障、慢性閉塞隅角緑内障、間欠性閉塞隅角緑内障、慢性開放隅角緑内障(chroni
c open-angle closure glaucoma)、色素性緑内障、落屑緑内障(偽落屑緑内障または
水晶体嚢緑内障としてもまた公知である)、発達緑内障(例えば、原発性先天性緑内障お
よび乳児緑内障)、続発性緑内障(例えば、炎症性緑内障(例えば、ブドウ膜炎およびフ
ックス虹彩毛様体炎))、水晶体性緑内障(例えば、成熟白内障を伴う閉塞隅角緑内障、
水晶体嚢の破嚢に続発する水晶体過敏性緑内障、水晶体中毒による線維柱帯の目詰まりに
起因する水晶体融解緑内障、および水晶体亜脱臼)、眼内出血に続発する緑内障(例えば
、前房出血および溶血緑内障(erythroclastic glaucoma)とし
てもまた公知の溶血緑内障(hemolytic glaucoma))、外傷性緑内障
(例えば、隅角後退緑内障、前房隅角の外傷性後退、術後緑内障、無水晶体性瞳孔ブロッ
ク、および毛様体ブロック緑内障)、血管新生緑内障、薬物誘導性緑内障(例えば、コル
チコステロイド誘導性緑内障およびアルファ−キモトリプシン緑内障)、中毒性緑内障、
ならびに眼内腫瘍、網膜剥離、重度の眼化学火傷、および虹彩萎縮と関連する緑内障を含
む。ある特定の実施形態では、神経変性疾患、神経変性障害、または神経変性状態は、過
剰な血管新生と関連しない疾患、障害、または状態、例えば、血管新生緑内障ではない緑
内障である。
の1つに対する化合物による処置から利益を得る任意の状態であって、同定される標的ま
たは経路のうちの1つに対する有効量の化合物、または薬学的に許容されるその塩により
処置されうる、任意の疾患、障害、または状態を含む状態を指す。
る疾患、障害、もしくは状態、またはこのような疾患、障害、もしくは状態の、1もしく
は複数の症候もしくは症状(例えば、網膜光受容体細胞の機能不全および/または死を引
き起こす疾患または障害)を転導するか、緩和するか、その進行を阻害するか、これを防
止するか、またはその可能性を低減することを含みうる。一部の実施形態では、処置によ
り、網膜光受容体細胞の機能不全および/または死を低減する。例えば、処置により、網
膜光受容体細胞の機能不全および/または死を、処置を受ける前の被験体または処置を受
けない被験体における、網膜光受容体細胞の機能不全および/または死と比較して、少な
くとも5%、10%、15%、20%、25%、30%、33%、35%、40%、45
%、50%、55%、60%、66%、70%、75%、80%、85%、90%、91
%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはこれを
超えて低減することができる。一部の実施形態では、処置により、被験体における網膜光
受容体細胞の機能不全および/または死を完全に阻害する。本明細書で使用される「網膜
光受容体細胞」とは、網膜内で見出される、特化した種類のニューロンであって、光情報
伝達が可能なニューロンである。一部の実施形態では、少なくとも1つの遺伝子産物は、
ロドプシンである。
ルス(AAV)粒子中にパッケージングする。一部の実施形態では、被験体へ投与するス
テップを、網膜下注射により行う。処置、投与、または治療は、連続的な場合もあり、間
欠的な場合もある。連続的処置、連続的投与、または連続的治療とは、少なくとも毎日の
ベースで、処置中に1日または複数日の中断を伴わない処置を指す。間欠的処置もしくは
間欠的投与、または間欠式の処置もしくは投与とは、連続的ではなく、周期的な処置を指
す。本明細書で開示される方法に従う処置は、疾患、障害、または状態からの完全な軽快
または治癒を結果としてもたらす場合もあり、疾患、疾患、または状態の1または複数の
症候の部分的な改善を結果としてもたらす場合もあり、一時的な処置の場合もあり、恒久
的な処置の場合もある。「処置」という用語はまた、予防、治療、および治癒を包摂する
ことも意図する。
のに十分な薬剤量を指す。治療有効量は、当業者がたやすく決定しうる、処置される被験
体および疾患状態、被験体の体重および年齢、疾患状態の重症度、投与様式などのうちの
1または複数に応じて変動しうる。用語はまた、本明細書で記載されるイメージング方法
のうちのいずれか1つによる検出のための画像をもたらす用量にも適用される。具体的用
量は、選択される特定の薬剤、従う投与レジメン、他の化合物と組み合わせて投与するの
かどうか、投与回数、イメージングされる組織、および保有される物理的送達系のうちの
1または複数に応じて変動しうる。
くの実施形態における、本明細書で開示される方法により処置される被験体は、ヒト被験
体であることが所望されるが、本明細書で記載される方法は、「被験体」という用語に含
まれることが意図される、全ての脊椎動物種に関して有効であることを理解されたい。し
たがって、「被験体」は、既存の状態もしくは疾患の処置、または状態もしくは疾患の発
症を防止するための予防的処置などの医療目的のヒト被験体を含む場合もあり、医療目的
、獣医療目的、または開発目的の動物被験体を含む場合もある。適切な動物被験体は、霊
長動物、例えば、ヒト、サル、類人猿など;ウシ科動物、例えば、畜牛、役牛など;ヒツ
ジ科動物、例えば、ヒツジなど;ヤギ科動物、例えば、ヤギなど;ブタ科動物、例えば、
ブタ、成豚など;ウマ科動物、例えば、ウマ、ロバ、シマウマなど;野猫、飼い猫を含む
ネコ科動物;イヌを含むイヌ科動物;ウサギ、野兎などを含むウサギ目動物;およびマウ
ス、ラットなどを含む齧歯動物を含むがこれらに限定されない哺乳動物を含む。動物は、
トランスジェニック動物でありうる。一部の実施形態では、被験体は、胎児被験体、新生
児被験体、乳児被験体、青少年被験体、および成人被験体を含むがこれらに限定されない
ヒト被験体である。さらに、「被験体」は、状態もしくは疾患に罹患している患者、また
は状態もしくは疾患に罹患していることが疑われる患者を含みうる。
本明細書では、特殊な用語を援用するが、それらは、総称的意味および記載的意味だけ
で使用されるものであり、限定を目的とするものではない。そうでないことが規定されな
い限りにおいて、本明細書で使用される、全ての技術用語および学術用語は、本明細書で
記載される主題が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有す
る。
う用語は、特許請求の範囲を含む本出願で使用される場合、「1または複数の」を指す。
こうして、例えば、「対象」に対する言及は、文脈により反対のことが明らかにされない
限りにおいて(例えば、複数の対象)、複数の対象などを含む。
含む(comprises)」、および「〜を含むこと」という用語は、文脈によりそう
でないことが要請される場合を除き、非除外的な意味で使用される。同様に、リスト内の
項目の列挙が、他の類似の項目であって、列挙される項目を代替する場合もあり、これら
に付加される場合もある、類似の項目の除外とはならないように、「〜を含む(incl
ude)」という用語、およびその文法的変化形も、非限定的であることを意図する。
において、量(amounts)、サイズ、寸法、比率、形状、処方、パラメータ、百分
率、パラメータ、量(quantities)、特徴を表す全ての数、ならびに本明細書
および特許請求の範囲で使用される他の数値は、「約」という用語が、値、量、または範
囲と共に明示的に現れない場合であってもなお、全ての場合に、「約」という用語により
修飾されていると理解するものとする。したがって、反対のことが指し示されない限りに
おいて、以下の明細書および付随の特許請求の範囲で記される数値パラメータは、正確な
数値ではなく、そうでなくてもよく、本明細書で開示される主題により得ようとする所望
の特性に応じて、公差、換算係数、丸め誤差、測定誤差など、および当業者に公知の他の
因子を反映して、所望の通りに、概数の場合もあり、かつ/またはより大きい場合もあり
、より小さい場合もある。例えば、値に言及する場合の「約」という用語は、このような
変動は、開示される方法を実施するか、または開示される組成物を援用するのに適切であ
るので、指定された量からの、一部の実施形態では、±100%、一部の実施形態では、
±50%、一部の実施形態では、±20%、一部の実施形態では、±10%、一部の実施
形態では、±5%、一部の実施形態では、±1%、一部の実施形態では、±0.5%、一
部の実施形態では、±0.1%の変動を包摂することを意図しうる。
語は、範囲内の全ての数を含む、全てのこのような数を指すと理解すべきであり、記され
る数値の上限および下限を拡張することにより、その範囲を改変する。端点による数値範
囲の列挙は、その範囲内およびその範囲内の任意の範囲に包含される全ての数、例えば、
それらの分数を含む全整数を含む(例えば、1〜5の列挙は、1、2、3、4、および5
のほか、その分数、例えば、1.5、2.25、3.75、4.1なども含む)。
を、当業者に提供するために組み入れる。本開示および当技術分野における技術の一般的
な水準に照らして、当業者は、以下の実施例が、例示的であることだけを意図するもので
あり、本明細書で開示される主題の範囲から逸脱しない限りにおいて、数値的な変化、改
変、および変更を援用しうることを察知することができる。以下の合成についての記載お
よび具体例は、例示だけを目的とすることを意図するものであり、本開示の化合物が他の
方法でも制作されるように、いかなる形でも限定的とはみなさないものとする。
方法
プラスミドの構築:H1 gRNA発現構築物(下記の表1、2、および3を参照され
たい)を作出するために、重複オリゴヌクレオチドをアセンブルして、76bpのgRN
A足場およびpol III終結シグナルと融合させたH1プロモーターを創出した。H
1プロモーターとgRNA足場との間に、BamHI部位を組み込んで、ターゲティング
配列の挿入を可能とした。次いで、H1::gRNA足場::pol IIIターミネー
ター配列を、pCR4−Blunt(Invitrogen、Carlsbad、CA)
中にTOPOクローニングし、シークェンシングおよび検証した。結果として得られるベ
クターは、リバース配向性である(下記を参照されたい)。本研究で使用される多様なg
RNAを作出するために、重複オリゴヌクレオチドをアニールさせ、2ステップ増幅用の
Phusion Flash DNAポリメラーゼ(Thermo Fisher Sc
ientific、Rockford、IL)を使用してPCRにより増幅し、その後、
2倍容量の25%のPEGおよび1.5MのNaClと混合した、Carboxylat
e−Modified Sera−Mag Magnetic Beads(Therm
o Fisher Scientific)を使用して、精製した。次いで、精製された
PCR産物を、H2O中に再懸濁させ、NanoDrop 1000(Thermo F
isher Scientific)を使用して定量化した。gRNA発現構築物は、U
6発現のための、AflIIで消化するプラスミド(#41824、Addgene、C
ambridge MA)、またはH1発現のための、直前で記載したBamHIによる
プラスミドの消化について若干改変した、Gibson Assembly(New E
ngland Biolabs、Ipswich、MA)(Gibsonら(2009年)、Na
ture Methods、6巻:343〜345頁)を使用して作出した。総反応容量は、20μ
lから2μlに低減された。
adison WI)を、既に記載されたプロトコール(Walkerら(2010年)、Nat.
Commun.、1巻:71頁;Maruottiら(2013年)、Stem Cells Translational M
edicine、2巻:341〜354頁)に従う、10%のCO2/5%のO2によるインキ
ュベーター内、mTeSR1培地(Stem Cell Technologies、V
ancouver、BC)中、Growth Factor Reduced Matr
igel(BD Biosciences、Franklin Lakes、NJ)上の
クローン繁殖により維持した。継代培養のために、hESCコロニーを、まず、mTes
R1中に5μMのブレビスタチン(Sigma−Aldrich、St.Louis、M
O)と共にインキュベートし、次いで、Accutase(Sigma−Aldrich
)による5〜10分間の処理後に回収した。細胞集塊を、単一細胞懸濁液に静かに解離さ
せ、遠心分離によりペレット化した。その後、hPSCを、ブレビスタチンを伴うmTe
SR1中に再懸濁させ、1cm2当たりの細胞およそ1,000〜1,500個で播種し
た。継代の2日後、培地を、mTeSR1(ブレビスタチンを伴わない)で置きかえ、毎
日交換した。
Grand Island、NY)を、10%のウシ胎仔血清(Gibco、Life
Technologies、Grand Island、NY)および2mMのGlut
aMAX(Invitrogen)を補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)
(Invitrogen)中、5%のCO2/20%のO2を伴う37℃で維持した。
MのRho Kinase阻害剤(DDD00033325、EMD Millipor
e、Billerica、MA)中で培養した。電気穿孔は、製造元の指示書に従い、N
eonキット(Invitrogen)を使用して実施した。略述すると、電気穿孔の当
日、hESCを、コロニーがリフトするまで、1〜2分間にわたり、Accutase(
Sigma−Aldrich)で消化した。重要なことは、コロニーを、単一細胞懸濁液
に解離させなかったことである。コロニーを採取した後で、ウェットペレットを、氷上で
15分間にわたり保ち、次いで、遺伝子ターゲティングプラスミドを含有する電気穿孔緩
衝液中に再懸濁させた。電気穿孔パラメータは、以下:電圧:1400ms;間隔:30
ミリ秒;1パルスの通りであった。電気穿孔に続き、細胞コロニーを、10μMのRho
Kinase阻害剤を含有するmTeSR1培地にゆっくりと移し、次いで、室温で2
0分間にわたり保ってから、Matrigelでコーティングしたディッシュに播種し、
さらに培養した。
、サブコンフルエンシーまで増殖させ、前段落で記載した通りに継代培養し、35mmの
ディッシュ1枚当たりの細胞500個の密度で播種した。その後、単一のコロニーを、手
作業の採集により単離し、さらに培養した。
00個を、トランスフェクションの24時間前に、24ウェルプレート(Falcon、
Corning、NY)内に播種した。細胞は、製造元の推奨するプロトコールに従い、
Lipofectamine LTX Plus Reagent(Invitroge
n)を使用して、四連でトランスフェクトした。24ウェルプレートの各ウェルには、4
00ngのCas9プラスミドおよび200ngのgRNAプラスミドを、0.5μlの
Plus Reagentおよび1.5μlのLipofectamine LTX試薬
と混合した。
l)を、Matrigel基質上のmTeSR1(Stem Cell Technol
ogies)培地中で維持した。細胞を継代培養する前に、細胞を、ブレビスタチンによ
る短時間(>5分間)の前処理にかけて、細胞生存率を増大させ、Accutaseで7
分間にわたり処理し、単一細胞懸濁液に練和し、等容量のmTesRでクェンチングし、
80×gで5分間にわたりペレット化させ、ブレビスタチンを含有するmTesR中に再
懸濁させた。細胞1×106個をペレット化させ、培地を注意深く除去し、細胞を、10
〜15分間にわたり、氷上に置いた。AAVS1セーフハーバー遺伝子座に対する相同性
を含有する、10μgのAAV−CAGGSEGFPドナーベクター(#22212、A
ddgene)に加えて、R緩衝液中に5μgずつのhAAVS1 1R+L TALE
N(#35431および35432、Addgene)(Hockemeyerら(2009年)、
Nat. Biotechnol.、27巻:851〜857頁;Sanjanaら(2012年)、Nature Pr
otocols、7巻:171〜192頁)を、以下のパラメータ:1500V、パルス1つ当
たり20ミリ秒、および1パルスで、Neon Transfection Syste
m(Life Technologies)を使用する、100μl型のチップにより電
気穿孔した。次いで、細胞を、1mlの培地に静かに添加し、室温で15分間にわたりイ
ンキュベートし、次いで、mTeSRおよび5μMのブレビスタチンを含有する、Mat
rigelでコーティングした35mmのディッシュに播種した。2日後、細胞を、35
mmのディッシュ1枚当たりの細胞1×104個の密度で播種し、その後、時間的に安定
なクローン亜細胞系を、蛍光装備型Nikon TS100落射蛍光顕微鏡により、手作
業で選択した。
eyor解析のために、細胞を、QuickExtract溶液(Epicentre、
Madison、WI)中に再懸濁させ、65℃で15分間にわたりインキュベートし、
次いで、98℃で10分間にわたりインキュベートすることにより、ゲノムDNAを抽出
した。抽出物溶液は、DNA Clean and Concentrator(Zym
o Research、Irvine、CA)を使用して清浄化させ、NanoDrop
(Thermo Fisher Scientific)により定量化した。CRISP
R標的部位を取り囲むゲノム領域は、Phusion DNAポリメラーゼ(New E
ngland Biolabs)を使用して、100ngのゲノムDNAから増幅した。
複数の独立のPCR反応物をプールし、製造元のプロトコール(Qiagen、Vale
ncia、CA)に従い、Qiagen MinElute Spin Columnを
使用して、精製した。12.5mMのTris−HCl(pH8.8)、62.5mMの
KCl、および1.875mMのMgCl2中に、400ngのPCR産物を含有する、
8μlの容量を変性させ、ゆっくりと:95℃で10分間、1秒当たり−1.0℃の勾配
で95℃から85℃へ、85℃で1秒間、1秒当たり−1.0℃の勾配で85℃から75
℃へ、75℃で1秒間、1秒当たり−1.0℃の勾配で75℃から65℃へ、65℃で1
秒間、1秒当たり−1.0℃の勾配で65℃から55℃へ、55℃で1秒間、1秒当たり
−1.0℃の勾配で55℃から45℃へ、45℃で1秒間、1秒当たり−1.0℃の勾配
で45℃から35℃へ、35℃で1秒間、1秒当たり−1.0℃の勾配で35℃から25
℃へ再アニールさせ、次いで、4℃に保ち、ヘテロ二重鎖の形成を可能とした。1μlの
Surveyorエンハンサーおよび1μlのSurveyor Nuclease(T
ransgenomic、Omaha、NE)を、各反応物に添加し、42℃で60分間
にわたりインキュベートし、その後、1μlのStop Solutionを、反応物に
添加した。DNA 1000チップ(Agilent、Santa Clara、CA)
を使用して、1μlの反応物を、2100 Bioanalyzer上で定量化した。ゲ
ル解析のために、6倍濃度のローディング緩衝液(New England Biola
bs)2μlを、残りの反応物に添加し、臭化エチジウムを含有する3%のアガロースゲ
ルにロードした。ゲルは、Gel Logic 200 Imaging System
(Kodak、Rochester、NY)上で視覚化し、ImageJ v.1.46
を使用して定量化した。NHEJ頻度は、二項式から導出される方程式:
[式中、「a」および「b」の値は、バックグラウンド控除後の切断断片の積分面積に等
しく、「c」は、バックグラウンド控除後における非切断PCR産物の積分面積に等しい
(Guschinら(2010年)、Methods in Molecular Biology、649巻:247〜2
56頁)]
を使用して計算した。
ロニーを、Accutase処理により採取し、単一細胞懸濁液に解離させ、ペレット化
させた。次いで、細胞を、Vybrant DyeCycle ruby stain(
Invitrogen)を含有するLive Cell Solution(Invit
rogen)中に再懸濁させ、Accuri C6フローサイトメーター(BD Bio
sciences)上で解析した。
、12ウェルプレート(Falcon)中にウェル1つ当たりの細胞250,000個で
播種した。細胞は、gRNAプラスミドの6用量滴定:各ウェル内に0ng、31.25
ng、62.5ng、125ng、250ng、または500ngを伴う、製造元の推奨
するプロトコールに従い、Lipofectamine LTX with Plus
Reagent(Invitrogen)を使用して、三連でトランスフェクトした。ト
ランスフェクションの48時間後、総RNAは、RNAzol RT(Molecula
r Research Center、Cincinnati、OH)を使用して単離し
、Direct−zol RNA MiniPrep(Zymo)を使用して精製した。
500ngの総RNAを、dsDNase(ArticZymes;Plymouth
Meeting、PA USA)で処理して、残留ゲノムDNA夾雑物を除去し、製造元
の推奨に従い、Superscript III逆転写酵素(Invitrogen)を
使用して、20μlの反応物中で逆転写した。各反応では、0.1μMの以下のオリゴヌ
クレオチド;gRNA足場−
を使用して、各反応物をプライミングした。下線を付した足場配列は、転写物の安定性の
ために付加されるアンカー配列を表す。各qPCR反応は、10μlの容量中で、250
nMのオリゴヌクレオチドプライマーを含有するSsoAdvanced(商標)Uni
versal SYBR(登録商標)Green Supermix(Biorad)と
、上記による1:15の希釈率のRT反応産物1マイクロリットルとを使用する、Bio
rad CFX 96リアルタイムPCRマシンにより実行した。反応は、95℃の変性
ステップ、54℃のアニーリングステップ、および60℃の伸長ステップを伴う、40サ
イクルにわたり実行した。以下のプライマー:F1for−GTTTTAGAGCTAG
AAATAGCAAGTTAA(配列番号3)およびguideRNAscaffrev
−AAGCACCGACTCGGTGCCAC(配列番号4)およびU6snRNAF−
CTCGCTTCGGCAGCACATATACT(配列番号5)およびU6snRNA
Rev−ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC(配列番号6)を、ガイドRN
Aおよび参照遺伝子のそれぞれを検出するために使用した。各ガイドRNA試料について
の相対標準化発現およびs.e.mは、Biorad社製統合型CFXマネージャーソフ
トウェアを使用して計算した。
るために、特注のPerlスクリプトを使用して、23マーのCRISPR配列部位であ
る、GN19NGGまたはAN19NGGの両方の鎖および重複の発生を検索した。距離
値の平均値および中央値を計算するために、予測されるCRISPRによる切出し部位を
まず、PAM配列の上流の第3の塩基と第4の塩基との間で生じると規定した。配列を分
取した後で、次いで、ゲノム内で隣接する、全てのgRNAの間の距離を計算した。この
データを、Rにインポートして、平均値および中央値の統計学的値を計算し、データをプ
ロットした。平均値密度を計算するために、gRNAによる切出し部位を、ゲノムにわた
りビニングし、発生頻度について計算した。ggplot2パッケージまたはCirco
sを使用して、このデータを、Rによりプロットし、環状プロットを生成した(Krzywins
kiら(2009年)、Genome Research、19巻:1639〜1645頁)。ヒト遺伝子
内または疾患遺伝子座における発生を計算するために、BEDToolsのユーティリテ
ィーであるIntersectBED(QuinlanおよびHall(2010年)、Bioinformat
ics、26巻:841〜842頁)を使用して、UCSC Genome Browse
rから読み出されたRefSeq BEDファイルまたはOMIM(Online Me
ndelian Inheritance in Man、OMIM、McKusick
−Nathans Institute of Genetic Medicine、J
ohns Hopkins University(Baltimore、MD)、20
13年)から読み出されたBEDファイルとの重複の発生を見出した。本研究で使用され
たゲノムは、ヒト(hg19)、マウス(mm10)、ラット(rn5)、ウシ(bos
Tau7)、ニワトリ(galGal4)、ゼブラフィッシュ(dr7)、ショウジョウ
バエ(dm3)、C.elegans(ce10)、およびS.cerevisiae(
sacCer3)であった。
CRISPR/Cas9ターゲティングの現時点での限界を拡張するために、U6 p
ol IIIではなく、H1 pol IIIを、代替的なプロモーターとして使用しう
るのかどうかについて調べた(Baerら(1990年)、Nucleic Acids Res.、18巻:
97〜103頁)。H1は、プリン(ヌクレオチドR)のいずれかを+1位置に配置した
転写物を発現させうるため、S.pyogenes Cas9を伴い、AN19NGGお
よびGN19NGG部位の両方における切断を可能とすることにより、CRISPRター
ゲティング空間を拡大しうることが仮定された(図1A)。H1から発現させるgRNA
による部位特異的切断を実証するため、H7ヒト胚性幹細胞系(hESC;図1B)内の
AAVS−1遺伝子座において統合されたGFP標的遺伝子の、CRISPR媒介型切断
を測定するレポーターアッセイを開発した(Hockemeyerら(2009年)、Nat. Biotec
hnol.、27巻:851〜857頁)。エラープローン非相同末端結合(NHEJ)の頻
度に代わる代理指標として、コード配列の妨害に起因するGFP蛍光の喪失を測定した(
GFP蛍光を妨害しないインフレームの突然変異またはインデルは、検出されないので、
アッセイが、NHEJを過小評価することは注目に値する)(図1Bおよび図1C)。H
7細胞を、等モル比のCas9発現プラスミドおよびgRNA発現プラスミドで電気穿孔
し、コロニー形成の後で、細胞を、GFP蛍光について視覚化した。陰性対照の電気穿孔
とは対照的に、U6プロモーターおよびH1プロモーターからの、全ての被験gRNA構
築物は、ターゲティングされた突然変異を経た細胞内のGFPシグナルのモザイク喪失を
示した(図1Cおよび不図示のデータ)。核染色による総細胞数の定量化は、フローサイ
トメトリーによる、GFP蛍光についての、細胞ベースの解析を可能とした。GFP蛍光
の喪失により実証される通り、100%の構築物が、NHEJを結果としてもたらしたが
、効率の範囲は、U6構築物およびH1構築物の両方で異なった(図1C、右および不図
示のデータ)。U6プロモーターまたはH1プロモーターからgRNAを発現させること
により、これは、GFP遺伝子の突然変異誘発が、GN19NGGまたはAN19NGG
部位のそれぞれにおいて生じうることを実証する。
てGFPを発現させるHEK−293細胞系を、上記と同じgRNA構築物でターゲティ
ングした。Surveyor解析(Qiuら(2004年)、BioTechniques、36巻:70
2〜707頁)により、プロモーターの種類およびターゲティングの場所により変動する
、編集効率の範囲を検出した(図1Dおよび図2)。非改変IMR90.4人工多能性細
胞(hiPSC)を使用することにより、PPP1R12C遺伝子のイントロン領域内の
AAVS−1遺伝子座をターゲティングすることにより、内因性遺伝子を改変する能力も
また確認した。H1およびU6に駆動されるgRNAによるターゲティングされた切断が
、Surveyorアッセイにより測定された効率と同等の効率で観察された(図3A、
図3B、および図3C)。
実施して、ヒトゲノム内で利用可能なCRISPR部位を評価した。AN19NGG部位
は、GN19NGG部位とほぼ同じ頻度で生じると予測されうるが、実際には、AN19
NGG部位は、15%多いことが見出され(図4A、図4B、図4C、図4D、図5A、
図5B、図5C、図5D、図5E、および図5F)、こうして、特異性を、GN19NG
Gから、RN19NGGに変化させることにより、利用可能な部位の数が、倍加を超えて
増大する(およそ115%の増大)。少数の例外(chr16、chr17、chr19
、chr20、およびchr22)を除き、AN19NGG部位は、各染色体において、
GN19NGG部位より高頻度で存在する。ゲノムワイドの平均ターゲティング密度を比
較するために、ゲノム内で隣接するCRISPR部位の間の平均値距離を、GN19NG
G(59bp)、AN19NGG(47bp)、およびRN19NGG部位(26bp)
(図4B)について計算した。加えて、AN19NGG部位は、ヒトゲノム内の関与性の
ターゲティング領域において、なおさらにエンリッチされた。ヒト遺伝子内のAN19N
GG部位の20%の増大、およびOMIMデータベースから得られる疾患遺伝子座におけ
るAN19NGG部位の21%の増大が見出された(図4C)。また、ヒトゲノムに由来
する1165のmiRNA遺伝子も検討したところ、これらの遺伝子のうちの221は、
1または複数のAN19NGG部位を介してターゲティングしうるが、GN19NGG部
位を介してはターゲティングしえないことが見出された(データは示さない)。相同組換
えの効率が、切出し部位からの距離の増大と負に相関することを踏まえると、H1プロモ
ーターの使用によるCRISPRターゲティング部位の増大は、より正確なゲノムのター
ゲティングおよび突然変異の補正を容易とする(Ranら(2013年)、Cell、6巻:1
380〜1389頁)。
されつつあるので、他のゲノムにおけるH1プロモーターの使用の潜在的影響を決定した
。この解析は、H1プロモーターにおけるゲノム保存が高度である、他の5つの脊椎動物
(マウス;ラット;ニワトリ;ウシ;およびゼブラフィッシュ)ゲノムにおいて実行した
。全ての場合において、GN19NGG部位と比較して多数のAN19NGG部位:+9
%のウシ;+14%のニワトリ;+19%のラット;+21%のマウス;および+32%
のゼブラフィッシュが見出された(図4C)。この夥多に対する1つの説明は、高AT含
量に起因しうるであろう(図6A、図6B、図6C、図6D、図6E、および図6F)。
ヒトゲノムでは、GN19NGG部位およびAN19NGG部位の発生を、AT含量に照
らして標準化すると、頻度は同等に近づくが、これは、全てのゲノムには当てはまらない
(図6Aおよび図6F)。しかしながら、これは、ヒトゲノムにおいて現在利用可能なC
RISPRターゲティング空間を、倍加を超えて増大させ、他の全ての被験ゲノムにおい
てもこれを同様に増大させる、H1プロモーターを使用することの有用性を実証する。
ティングする能力を実証した。H7細胞を使用して、網膜色素上皮内およびマクロファー
ジ内の食作用と関与し、突然変異すると、網膜変性を引き起こす遺伝子である、MERT
K遺伝子座の第2のエクソンをターゲティングした(D'Cruzら(2000年)、Human M
olecular Genetics、9巻:645〜651頁)(図7Aおよび図7B)。全体的なター
ゲティング効率を推定するために、DNAを、電気穿孔された細胞集団から採取し、Su
rveyorアッセイを実施した。標的部位を取り囲む領域を、2つの独立のPCR反応
で増幅し、9.5%および9.7%のインデル頻度を計算した(図7B)。次に、42の
ランダムに選択されたクローンを単離し、Surveyor解析により、突然変異につい
て調べた(データは示さない)。シークェンシングにより、42例中7例(16.7%)
が、標的PAM部位の上流3〜4ヌクレオチド以内においてクラスターをなす突然変異を
持することが明らかにされた。クローン7例中6例が、固有の突然変異を有し(クローン
1例は、冗長であった)、これらのうちの3例は、予測されるMERTKヌル対立遺伝子
を結果としてもたらす、二対立遺伝子性のフレームシフト突然変異であり、これは、ウェ
スタンブロット解析により確認された(図7Cおよび図7D)。まとめると、これらの結
果は、内因性遺伝子座に配置されたAN19NGG部位を、有効にターゲティングする能
力を実証する。
念となりつつあるので、上記で記載したGFP gRNA構築物をモデル系として使用し
て、H1プロモーターの使用が、オフターゲティングにいかなる影響を及ぼすのかについ
て検討した。Surveyor解析を使用して、バイオインフォマティクスにより、オフ
ターゲット部位であることが予測される、3つのゲノム遺伝子座(GFP_11〜33、
GFP_219〜197、およびGFP_315〜293)について検討した。これらの
構築物のうちの2つ(GFP_219〜197、およびGFP_315〜293)は、両
方のプロモーターによる発現を可能とする、GN19NGG標的部位であった。AN19
NGG部位である1つ(GFP_11〜33)は、5’−Gヌクレオチドを付加すること
により、U6プロモーターから発現させた。検討される3つのオフターゲット遺伝子座の
いずれにおいても、オフターゲット切断は検出できなかった(データは示さない)。しか
し、検出可能なオフターゲットの欠如は、部位の選択が、他のゲノムの遺伝子座に対する
相同性の低さに基づきなされる、GFP gRNA標的の初期選択からも生じうるであろ
う。こうして、より厳密な課題は、高レベルのオフターゲットヒットを誘発することが具
体的に公知であるターゲティング部位(Fuら(2013年)、Nat. Biotechnol.、31
巻:822〜826頁;Pattanayakら(2013年)、Nat. Biotechnol.、31巻(9
号):839〜43頁;Choら(2014年)、Genome Research、24巻:132〜1
41頁)において、H1プロモーターからのgRNAの発現と、U6プロモーターからの
gRNAの発現とを比較することであろうと推論した。さらに、H1プロモーターの5’
ヌクレオチドの柔軟性により、GN19NGG部位をターゲティングする、同一なgRN
Aについての、U6プロモーターとH1プロモーターとの間の直接的な比較も可能となっ
た。Fuら(2013年)により既に報告されている2つの部位:VEGFA部位1(T1
)およびVEGFA部位3(T3)について調べた(表4、図8A、図8B、図8C、お
よび図8D)(Fuら(2013年)、Nat. Biotechnol.、31巻:822〜826頁;C
hoら(2014年)、Genome Research、24巻:132〜141頁)。gRNA濃度お
よびCas9濃度の増大は、オフターゲットヒットの増大を結果としてもたらすことが示
されている(Fuら(2013年)、Nat. Biotechnol.、31巻:822〜826頁;Pat
tanayakら(2013年)、Nat. Biotechnol.、31巻(9号):839〜43頁;Hsu
ら(2013年)、Nat. Biotechnol.、31巻(9号):827〜32頁)ため、H1
プロモーターからのgRNAの発現レベルを低下させる(Bodenら(2003年)、Nucle
ic Acids Res.、31巻:5033〜5038頁;Anら(2006年)、Molecular Th
erapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy、14巻:4
94〜504頁;Makinenら(2006年)、The Journal of Gene Medicine、8巻
:433〜44頁)ことにより、オフターゲット効果もまた低減しうると推論した。qR
T−PCRを使用して、H1プロモーターからのVEGFA T1 gRNAおよびU6
プロモーターからのVEGFA T1 gRNAの相対レベルについて調べることから、
H1プロモーターからの発現レベルの、予測される低減が確認された(図8A)。VEG
FA T1部位については、オンターゲット遺伝子座のほか、4つのオフターゲット遺伝
子座における切出しの効率も調べた。U6プロモーターと比較して、オンターゲット遺伝
子座における切出しは、同等であるか、またはわずかに低減されたが、H1プロモーター
から発現するgRNAが、検討したオフターゲット遺伝子座において、より厳密であり、
より大きな特異性を指し示したことは注目に値する(オフターゲット1:25%と対比し
た8%;オフターゲット2:20%と対比した検出不能;およびオフターゲット4:26
%と対比した9%)(表4、図8A、図8B、図8C、および図8D)。VEGFA T
3部位では、2つのプロモーター構築物の間の同等なターゲティング(26%)が検出さ
れたが、ここでもまた、H1プロモーターについては、オフターゲット切出しレベルの低
下が観察された(表4、図8A、図8B、図8C、および図8D)。H1プロモーターか
ら発現するgRNAおよびU6プロモーターから発現するgRNAについてのさらなる研
究を実施する必要があるが、データは、H1から発現させるgRNAによる特異性が、お
そらくはより大きいことを示唆する。
記載されている有望な手法であって、D10A Cas9突然変異体による協同作用的オ
フセットニッキングを援用して、潜在的オフターゲット効果を軽減する手法(Ranら(2
013年)、Cell、6巻:1380〜1389頁;Maliら(2013年)、Nat. Biotec
hnol.、31巻(9号):833〜8頁)に関する。この手法は、逆行鎖上に配向し、切
出し部位からおよそ20bp以内にある、2つのフランキングCRISPR部位の同定を
要請するので、厳密なターゲティングを必要とする(Ranら(2013年)、Cell、15
4巻(6号):1380〜9頁)。H1プロモーターの使用により、ターゲティング密度
が増加すれば、適切なフランキング部位の同定の一助となることが予測されるであろう。
ーゲティングについての証拠の蓄積は、Cas9:gRNAによる認識は、20塩基対の
ターゲティング部位の全体にわたり広がることを指し示す。第1に、in vitroに
おけるgRNAの特異性について、>1012の顕著に異なる変異体を調べる中で、1つ
の研究は、+1ヌクレオチドが、標的の認識において役割を果たすことを見出した。さら
に、このデータによる位置特異性の計算は、5’ヌクレオチドが、標的の認識において、
その3’側の隣接ヌクレオチドより大きな役割を寄与することを示すことから、CRIS
PR特異性についての「シード」モデルは、PAM近接ヌクレオチドの寄与を単純化し過
ぎるきらいがあることが指し示される(Pattanayakら(2013年)、Nat. Biotechnol
.、31巻(9号):839〜4328頁)。第2に、CRISPR系の目的を転写の抑
制に転じる、CRISPR干渉(CRISPRi)などの代替的な使用により、gRNA
における5’側の短縮は、抑制を大幅に損ない、また、ミスマッチしたヌクレオチド(U
6発現のためのG塩基のミスマッチなど)による5’側の伸長も、抑制効率を低減するこ
とが見出されたことから、長さ(20nt)および5’ヌクレオチドのコンテキストの両
方が、適正なCas9ターゲティングに重要であることが示唆される(Ranら(2013
年)、Cell、154巻(6号):1380〜9頁;Maliら(2013年)、Nat. Biotec
hnol.、31巻(9号):833〜8頁;Larsonら(2013年)、Nature Protocols、
8巻:2180〜2196頁;Qiら(2013年)、Cell、152巻:1173〜118
3頁;Shanら(2013年)、Nat. Biotechnol.、31巻:686〜688頁)。最後
に、gRNAの5’ヌクレオチドと、標的DNAの3’末端との有意義な接触がなされる
ので、結晶構造データもさらに、実験データおよびCas9内の5’ヌクレオチドの重要
性を裏付ける(Jinekら(2014年)、Science、343巻:6176頁;Nishimasuら
(2014年)、Cell、156巻:935〜949頁)。
thermophilesにおける通り、代替的なCas9タンパク質の使用も有効であ
ることが示されている(Houら(2013年)、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、1
10巻(39号):15644〜9頁;Esveltら(2013年)、Nature Methods、1
0巻(11号):1116〜21頁)。しかし、これらの代替的なタンパク質の潜在的可
能性にもかかわらず、報告されている、他のII型系のPAMによる制限は、厳密な要件
を有する(データは示さない;Congら(2013年)、Science、339巻:819〜8
23頁;Houら(2013年)、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、110巻(39号
):15644〜9頁)。これに対し、H1プロモーターの使用によるgRNAの発現の
改変は、PAMの差違にかかわらず、任意のCas9タンパク質によるターゲティングレ
パートリーを大幅に拡大することが予測されるであろう。オーソログのCas9タンパク
質について、それぞれのgRNA標的(N.meningitidesについてのGN2
3NNNNGATTと対比したAN23NNNNGATT、およびS.thermoph
ilusについてのN17NNAGAAWと対比したAN17NNAGAAW)を定量化
したところ、5’−Aヌクレオチドを伴うgRNA部位において、64%および69%の
増大が見出されたことから、代替的なCas9タンパク質を伴うH1プロモーターの使用
を介する、ターゲティング空間の、なおより大幅な拡大が指し示される(表5)。植物に
おいて示唆される通り、異なるプロモーターの使用は、CRISPR部位の頻度を拡大し
うる。U6プロモーターが、5’グアノシンヌクレオチドに制限されているのに対し、コ
メに由来するU3プロモーターは、5’アデノシンヌクレオチドに制約されていることか
ら、異なる系において、ターゲティング空間を増大させるのに、異なるプロモーターに対
する必要がさらに強調される(Shanら(2013年)、Nat. Biotechnol.、31巻:6
86〜688頁)。単一のプロモーター系を介して、AN19NGG部位およびGN19
NGG部位(および、おそらく、CN19NGG部位またはTN19NGG部位(Tuschl
(2002年)、Nat. Biotechnol.、20巻:446〜448頁))をターゲティング
するのに、H1プロモーターの使用だけを利用しうることは簡便である(図9Aおよび図
9B)。ひいては、これを援用して、現行のCas9変異体および部位の制限を変更した
将来のCas9変異体のいずれのターゲティング空間も拡大することができる。
さらなる共因子を介して、CRISPRターゲティングを増強する結果として、ターゲテ
ィング配列を通した特異性の増大がもたらされ、5’ヌクレオチドの同一性が重要となる
可能性が高い。これは、調査用ツールとしては、交絡突然変異を最小化しながら、より大
規模なゲノムの取扱いを可能とし、将来の臨床的適用のためには、高忠実度の標的認識と
カップリングさせた高ターゲティング密度が、安全で有効な治療剤を送達するのに最重要
となろう。
CRISPRターゲティング空間の増大およびオフターゲット効果の潜在的可能性の低
減は、ゲノムの操作について、広範な含意を有する。ターゲティング空間を増大させるた
めには、S.thermophilus(NNAGAAW)およびN.meningit
ides(NNNNGATT)における通り、代替的なCas9タンパク質の使用も有効
であることが示されているが、これまでに報告されている、他のII型系のPAMによる
制限は、厳密な要件を有し、したがって、単独で使用される場合、ターゲティングに利用
可能な配列空間を低減する(データは示さないが、Congら(2013年)、Science、3
39巻:819〜823頁;Houら(2013年)、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
、110巻(39号):15644〜9頁)。これに対し、H1プロモーターの使用によ
るgRNAの発現の改変は、任意のCas9タンパク質によるターゲティングレパートリ
ーを大幅に拡大することが予測されるであろう。植物では、U6プロモーターが、5’グ
アノシンヌクレオチドに制限されているのに対し、コメに由来するU3プロモーターは、
5’アデノシンヌクレオチドに制約されている。近年示唆されている通り、両方のプロモ
ーターの使用は、植物ゲノム内のCRISPR部位の頻度を拡大しうるであろう(Shanら
(2013年)、Nat. Biotechnol.、31巻:686〜688頁)。単一のプロモータ
ー系を介して、脊椎動物ゲノム内のAN19NGG部位およびGN19NGG部位をター
ゲティングするのに、H1プロモーターの使用だけを利用しうることは簡便である。ひい
ては、これを援用して、現行のCas9変異体および部位の制限を変更した将来のCas
9変異体のいずれのターゲティング空間も拡大することができる。
する1つの手法は、Cas9突然変異体(D10A)による協同作用的オフセットニッキ
ングを援用することでありうるであろう(Maliら(2013年)、Nat. Biotechnol.、
31巻(9号):833〜8頁;Ranら(2013年)、Cell、154巻(6号):13
80〜9頁)。これは、逆行鎖上の2つのフランキングCRISPR部位の同定を要請し
、AN19NGG部位によりもたらされるターゲティング密度の増加は、この手法を強化
することが予測されるであろう。U6プロモーターを凌駕するさらなる利益はまた、誤切
断を低減することでもありうる(いくつかのグループが、gRNA濃度およびCas9濃
度の増大は、オフターゲット突然変異への傾向の増大と相関することを報告している(Pa
ttanayakら(2013年)、Nat. Biotechnol.、31巻(9号):839〜43頁;Hsu
ら(2013年)、Nat. Biotechnol.、31巻(9号):827〜32頁;Fuら(20
13年)、Nat. Biotechnol.、31巻(9号):822〜6頁)通り、H1プロモータ
ーによりもたらされる発現レベルの低下は、オフターゲット切出しの低減を結果としても
たらしうる)。加えて、Pattanayakらは、Cas9:gRNAによる認識は、
20塩基対のターゲティング部位の全体にわたり広がることも報告した(Pattanayakら(
2013年)、Nat. Biotechnol.、31巻(9号):839〜43頁)。gRNAの特
異性について、>1012の顕著に異なる変異体を調べる中で、筆者らは、+1ヌクレオ
チドが、標的の認識に寄与することを見出したが、これにより、CRISPR特異性につ
いての「シード」モデル(PAM近接ヌクレオチド)は、単純化され過ぎるきらいがある
ことが指し示される。慎重な部位選択、Cas9変異体の改善、gRNAアーキテクチャ
ーの最適化、またはさらなる共因子を介して、CRISPRターゲティングを増強する結
果として、23bpのターゲティング配列を通した特異性の増大がもたらされ、5’ヌク
レオチドの同一性が重要となる可能性が高い。これは、調査用ツールとしては、交絡突然
変異を最小化しながら、より大規模なゲノムの取扱いを可能とし、将来の臨床的適用のた
めには、高忠実度の標的認識とカップリングさせた高ターゲティング密度が、安全で有効
な治療剤を送達するのに最重要となろう。
図10A、図10B、図10C、図10D、および図10Eは、Cas9タンパク質お
よびガイドRNAを同時に発現させる双方向性プロモーターとしてのH1プロモーターの
使用を示す。双方向性H1プロモーターは、左へのpol II転写物としてのCas9
(マイナス鎖)、および右へのpol III転写物としてのガイドRNA(プラス鎖)
を発現させることが示されている。発現カセットの全体は、およそ4.4kbである(図
10A)。双方向性H1構築物からのCRISPR媒介型切断を方向付ける能力について
調べるために、eGFPをターゲティングするgRNAを使用する双方向性構築物を、プ
ラスミド中にクローニングし、GFPを発現させるヒト幹細胞内で発現させた(図10B
)。GFPの喪失が目視により検出された(図10C;中パネル、矢じり形)ことから、
発現構築物による発現およびGFPのターゲティングの成功が指し示される。CRISP
Rターゲティングの成功はまた、レーン2および3における2つのバンドの存在を伴うS
urveyorアッセイを介しても示された(図10D)。約4.75bのコンパクトタ
ーゲティングカセットを作出するのにH1プロモーターを使用する双方向性CRISPR
構築物は、アデノ随伴ウイルスのパッケージング範囲内にある(図10E)。SV40タ
ーミネーターは、橙色で示され、構築物は、ウイルスの産生に要請されるITR(inv
erted terminal repeat)配列で挟まれている。
プラスミドの構築:H1双方向性構築物を作出するために、ヒトコドンが最適化された
Cas9遺伝子と、SV40ターミネーターとを、pol II転写物が内因性で見出さ
れる(マイナス鎖)、230bpのH1プロモーター(配列番号54)と融合させた。H
1プロモーターとgRNA足場との間に、AvrII部位を操作して、ターゲティング配
列の挿入を可能とした。次いで、SV40[rev]::hcas9[rev]::H1
::gRNA足場::pol IIIターミネーター配列を、NdeI/XbaIによる
消化物である、pUC19ベクター中にクローニングした。本研究で使用される多様なg
RNAを作出するために、重複オリゴヌクレオチドをアニールさせ、2ステップ増幅用の
Phusion Flash DNAポリメラーゼ(Thermo Fisher Sc
ientific、Rockford、IL)を使用してPCRにより増幅し、その後、
2倍容量の25%のPEGおよび1.5MのNaClと混合した、Carboxylat
e−Modified Sera−Mag Magnetic Beads(Therm
o Fisher Scientific)を使用して、精製した。次いで、精製された
PCR産物を、H2O中に再懸濁させ、NanoDrop 1000(Thermo F
isher Scientific)を使用して定量化した。gRNA発現構築物は、若
干改変した、Gibson Assembly(New England Biolab
s、Ipswich、MA)(Gibsonら(2009年)、Nature Methods、6巻:34
3〜345頁)を使用して作出した。総反応容量は、20μlから2μlに低減された。
adison WI)を、既に記載されたプロトコール(Walkerら(2010年)、Nat.
Commun.、1巻:71頁;Maruottiら(2013年)、Stem Cells Translational M
edicine、2巻:341〜354頁)に従う、10%のCO2/5%のO2によるインキ
ュベーター内、mTeSR1培地(Stem Cell Technologies、V
ancouver、BC)中、Growth Factor Reduced Matr
igel(BD Biosciences、Franklin Lakes、NJ)上の
クローン繁殖により維持した。継代培養のために、hESCコロニーを、まず、mTes
R1中に5μMのブレビスタチン(Sigma−Aldrich、St.Louis、M
O)と共にインキュベートし、次いで、Accutase(Sigma−Aldrich
)による5〜10分間の処理後に回収した。細胞集塊を、単一細胞懸濁液に静かに解離さ
せ、遠心分離によりペレット化した。その後、hPSCを、ブレビスタチンを伴うmTe
SR1中に再懸濁させ、1cm2当たりの細胞およそ1,000〜1,500個で播種し
た。継代の2日後、培地を、mTeSR1(ブレビスタチンを伴わない)で置きかえ、毎
日交換した。
Grand Island、NY)を、10%のウシ胎仔血清(Gibco、Life
Technologies、Grand Island、NY)および2mMのGlut
aMAX(Invitrogen)を補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)
(Invitrogen)中、5%のCO2/20%のO2を伴う37℃で維持した。
MのRho Kinase阻害剤(DDD00033325、EMD Millipor
e、Billerica、MA)中で培養した。電気穿孔は、製造元の指示書に従い、N
eonキット(Invitrogen)を使用して実施した。略述すると、電気穿孔の当
日、hESCを、コロニーがリフトするまで、1〜2分間にわたり、Accutase(
Sigma−Aldrich)で消化した。重要なことは、コロニーを、単一細胞懸濁液
に解離させなかったことである。コロニーを採取した後で、ウェットペレットを、氷上で
15分間にわたり保ち、次いで、遺伝子ターゲティングプラスミドを含有する電気穿孔緩
衝液中に再懸濁させた。電気穿孔パラメータは、以下:電圧:1400mS;間隔:30
ミリ秒;1パルスの通りであった。電気穿孔に続き、細胞コロニーを、10μMのRho
Kinase阻害剤を含有するmTeSR1培地にゆっくりと移し、次いで、室温で2
0分間にわたり保ってから、Matrigelでコーティングしたディッシュに播種し、
さらに培養した。
、サブコンフルエンシーまで増殖させ、前段落で記載した通りに継代培養し、35mmの
ディッシュ1枚当たりの細胞500個の密度で播種した。その後、単一のコロニーを、手
作業の採集により単離し、さらに培養した。
l)を、Matrigel基質上のmTeSR1(Stem Cell Technol
ogies)培地中で維持した。細胞を継代培養する前に、細胞を、ブレビスタチンによ
る短時間(>5分間)の前処理にかけて、細胞生存率を増大させ、Accutaseで7
分間にわたり処理し、単一細胞懸濁液に練和し、等容量のmTesRでクェンチングし、
80×gで5分間にわたりペレット化させ、ブレビスタチンを含有するmTesR中に再
懸濁させた。細胞1×106個をペレット化させ、培地を注意深く除去し、細胞を、10
〜15分間にわたり、氷上に置いた。AAVS1セーフハーバー遺伝子座に対する相同性
を含有する、10μgのAAV−CAGGSEGFPドナーベクター(#22212、A
ddgene)に加えて、R緩衝液中に5μgずつのhAAVS1 1R+L TALE
N(#35431および35432、Addgene)(Hockemeyerら(2009年)、
Nat. Biotechnol.、27巻:851〜857頁;Sanjanaら(2012年)、Nature Pr
otocols、7巻:171〜192頁)を、以下のパラメータ:1500V、パルス1つ当
たり20ミリ秒、および1パルスで、Neon Transfection Syste
m(Life Technologies)を使用する、100μl型のチップにより電
気穿孔した。次いで、細胞を、1mlの培地に静かに添加し、室温で15分間にわたりイ
ンキュベートし、次いで、mTeSRおよび5μMのブレビスタチンを含有する、Mat
rigelでコーティングした35mmのディッシュに播種した。2日後、細胞を、35
mmのディッシュ1枚当たりの細胞1×104個の密度で播種し、その後、時間的に安定
なクローン亜細胞系を、蛍光装備型Nikon TS100落射蛍光顕微鏡により、手作
業で選択した。
eyor解析のために、細胞を、QuickExtract溶液(Epicentre、
Madison、WI)中に再懸濁させ、65℃で15分間にわたりインキュベートし、
次いで、98℃で10分間にわたりインキュベートすることにより、ゲノムDNAを抽出
した。抽出物溶液は、DNA Clean and Concentrator(Zym
o Research、Irvine、CA)を使用して清浄化させ、NanoDrop
(Thermo Fisher Scientific)により定量化した。CRISP
R標的部位を取り囲むゲノム領域は、Phusion DNAポリメラーゼ(New E
ngland Biolabs)を使用して、100ngのゲノムDNAから増幅した。
複数の独立のPCR反応物をプールし、製造元のプロトコール(Qiagen、Vale
ncia、CA)に従い、Qiagen MinElute Spin Columnを
使用して、精製した。12.5mMのTris−HCl(pH8.8)、62.5mMの
KCl、および1.875mMのMgCl2中に、400ngのPCR産物を含有する、
8μlの容量を変性させ、ゆっくりと:95℃で10分間、1秒当たり−1.0℃の勾配
で95℃から85℃へ、85℃で1秒間、1秒当たり−1.0℃の勾配で85℃から75
℃へ、75℃で1秒間、1秒当たり−1.0℃の勾配で75℃から65℃へ、65℃で1
秒間、1秒当たり−1.0℃の勾配で65℃から55℃へ、55℃で1秒間、1秒当たり
−1.0℃の勾配で55℃から45℃へ、45℃で1秒間、1秒当たり−1.0℃の勾配
で45℃から35℃へ、35℃で1秒間、1秒当たり−1.0℃の勾配で35℃から25
℃へ再アニールさせ、次いで、4℃に保ち、ヘテロ二重鎖の形成を可能とした。1μlの
Surveyorエンハンサーおよび1μlのSurveyor Nuclease(T
ransgenomic、Omaha、NE)を、各反応物に添加し、42℃で60分間
にわたりインキュベートし、その後、1μlのStop Solutionを、反応物に
添加した。DNA 1000チップ(Agilent、Santa Clara、CA)
を使用して、1μlの反応物を、2100 Bioanalyzer上で定量化した。ゲ
ル解析のために、6倍濃度のローディング緩衝液(New England Biola
bs)2μlを、残りの反応物に添加し、臭化エチジウムを含有する3%のアガロースゲ
ルにロードした。ゲルは、Gel Logic 200 Imaging System
(Kodak、Rochester、NY)上で視覚化し、ImageJ v.1.46
を使用して定量化した。NHEJ頻度は、二項式から導出される方程式:
[式中、「a」および「b」の値は、バックグラウンド控除後の切断断片の積分面積に等
しく、「c」は、バックグラウンド控除後における非切断PCR産物の積分面積に等しい
(Guschinら(2010年)、Methods in Molecular Biology、649巻:247〜2
56頁)]
を使用して計算した。
図11A、図11B、および図11Cは、ガイドRNAの5’末端を作出するハンマー
ヘッド型リボザイムを示す。5’側シス型ハンマーヘッド型リボザイム(配列番号49)
およびgRNA(配列番号50)を、図11Aに描示する。ハンマーヘッド型リボザイム
の配列を指し示し、触媒作用に重要なヌクレオチドを指し示す(極めて重要なヌクレオチ
ドを赤色、重要なヌクレオチドを橙色で)。切断の場所を、矢印で指し示す。リボザイム
により切断される(下)と、結果として得られるgRNAは、新たに形成された5’側位
置におけるヌクレオチドに制約されずに放出される。ハンマーヘッド−gRNAを発現さ
せることが示されている構築物を、図11Bに示す。一般に、U6、H1、またはT7な
どのpol IIIプロモーターであるプロモーターを使用して、5’側シス型ハンマー
ヘッド型リボザイムを発現させることができ、これは、自己切断の後で、gRNAを放出
するであろう。2つの遺伝子座のターゲティングを、図11Cに、Surveyorアッ
セイ(HH1+CGG PAM配列=配列番号51;HH2+AGG PAM配列=配列
番号52)、5’側シス型ハンマーヘッド型リボザイムによる切断(矢印)の成功と共に
示す。
を使用する、調節可能なCRISPR構築物を示す。特に、図12は、テオフィリンアプ
タザイムを形成する、ハンマーヘッド型リボザイムのヘリックスIIと融合させたテオフ
ィリンアプタマー(橙)であって、gRNA(青)の5’側にあるテオフィリンアプタマ
ーを描示する。テオフィリンの結合は、ヘリックスIIを安定化させ、次いで、ハンマー
ヘッド型自己切断を可能とし、gRNAを遊離させる。ここで、gRNAは、Cas9と
共に、CRISPR系による切断をターゲティングすることが可能である。
プラスミドの構築:U6プロモーター、H1プロモーター、またはT7プロモーターに
より駆動される5’側シス型ハンマーヘッド型構築物を作出するために、ハンマーヘッド
型配列(GTACGTTTCCTCTGATGAGTCCCAAATAGGACGAAA
CGCGCTTCGGTGCGTC;配列番号53)を、プロモーターの下流であり、か
つ、gRNA標的および足場の上流に置いた。ヘリックスIを形成するために、gRNA
標的配列と相補的な10ヌクレオチドを、ハンマーヘッド型配列の5’側に置き、次いで
、これを、gRNA内で見出される相補的な配列に結合させた(図12)。本研究で使用
される多様なgRNAを作出するために、重複オリゴヌクレオチドをアニールさせ、2ス
テップ増幅用のPhusion Flash DNAポリメラーゼ(Thermo Fi
sher Scientific、Rockford、IL)を使用してPCRにより増
幅し、その後、2倍容量の25%のPEGおよび1.5MのNaClと混合した、Car
boxylate−Modified Sera−Mag Magnetic Bead
s(Thermo Fisher Scientific)を使用して、精製した。次い
で、精製されたPCR産物を、H2O中に再懸濁させ、NanoDrop 1000(T
hermo Fisher Scientific)を使用して定量化した。gRNA発
現構築物は、若干改変した、Gibson Assembly(New England
Biolabs、Ipswich、MA)(Gibsonら(2009年)、Nature Method
s、6巻:343〜345頁)を使用して作出した。総反応容量は、20μlから2μl
に低減された。
adison WI)を、既に記載されたプロトコール(Walkerら(2010年)、Nat.
Commun.、1巻:71頁;Maruottiら(2013年)、Stem Cells Translational M
edicine、2巻:341〜354頁)に従う、10%のCO2/5%のO2によるインキ
ュベーター内、mTeSR1培地(Stem Cell Technologies、V
ancouver、BC)中、Growth Factor Reduced Matr
igel(BD Biosciences、Franklin Lakes、NJ)上の
クローン繁殖により維持した。継代培養のために、hESCコロニーを、まず、mTes
R1中に5μMのブレビスタチン(Sigma−Aldrich、St.Louis、M
O)と共にインキュベートし、次いで、Accutase(Sigma−Aldrich
)による5〜10分間の処理後に回収した。細胞集塊を、単一細胞懸濁液に静かに解離さ
せ、遠心分離によりペレット化した。その後、hPSCを、ブレビスタチンを伴うmTe
SR1中に再懸濁させ、1cm2当たりの細胞およそ1,000〜1,500個で播種し
た。継代の2日後、培地を、mTeSR1(ブレビスタチンを伴わない)で置きかえ、毎
日交換した。
Grand Island、NY)を、10%のウシ胎仔血清(Gibco、Life
Technologies、Grand Island、NY)および2mMのGlut
aMAX(Invitrogen)を補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)
(Invitrogen)中、5%のCO2/20%のO2を伴う37℃で維持した。
MのRho Kinase阻害剤(DDD00033325、EMD Millipor
e、Billerica、MA)中で培養した。電気穿孔は、製造元の指示書に従い、N
eonキット(Invitrogen)を使用して実施した。略述すると、電気穿孔の当
日、hESCを、コロニーがリフトするまで、1〜2分間にわたり、Accutase(
Sigma−Aldrich)で消化した。重要なことは、コロニーを、単一細胞懸濁液
に解離させなかったことである。コロニーを採取した後で、ウェットペレットを、氷上で
15分間にわたり保ち、次いで、遺伝子ターゲティングプラスミドを含有する電気穿孔緩
衝液中に再懸濁させた。電気穿孔パラメータは、以下:電圧:1400ms;間隔:30
ミリ秒;1パルスの通りであった。電気穿孔に続き、細胞コロニーを、10μMのRho
Kinase阻害剤を含有するmTeSR1培地にゆっくりと移し、次いで、室温で2
0分間にわたり保ってから、Matrigelでコーティングしたディッシュに播種し、
さらに培養した。
、サブコンフルエンシーまで増殖させ、前段落で記載した通りに継代培養し、35mmの
ディッシュ1枚当たりの細胞500個の密度で播種した。その後、単一のコロニーを、手
作業の採集により単離し、さらに培養した。
l)を、Matrigel基質上のmTeSR1(Stem Cell Technol
ogies)培地中で維持した。細胞を継代培養する前に、細胞を、ブレビスタチンによ
る短時間(>5分間)の前処理にかけて、細胞生存率を増大させ、Accutaseで7
分間にわたり処理し、単一細胞懸濁液に練和し、等容量のmTesRでクェンチングし、
80×gで5分間にわたりペレット化させ、ブレビスタチンを含有するmTesR中に再
懸濁させた。細胞1×106個をペレット化させ、培地を注意深く除去し、細胞を、10
〜15分間にわたり、氷上に置いた。AAVS1セーフハーバー遺伝子座に対する相同性
を含有する、10μgのAAV−CAGGSEGFPドナーベクター(#22212、A
ddgene)に加えて、R緩衝液中に5μgずつのhAAVS1 1R+L TALE
N(#35431および35432、Addgene)(Hockemeyerら(2009年)、
Nat. Biotechnol.、27巻:851〜857頁;Sanjanaら(2012年)、Nature Pr
otocols、7巻:171〜192頁)を、以下のパラメータ:1500V、パルス1つ当
たり20ミリ秒、および1パルスで、Neon Transfection Syste
m(Life Technologies)を使用する、100μl型のチップにより電
気穿孔した。次いで、細胞を、1mlの培地に静かに添加し、室温で15分間にわたりイ
ンキュベートし、次いで、mTeSRおよび5μMのブレビスタチンを含有する、Mat
rigelでコーティングした35mmのディッシュに播種した。2日後、細胞を、35
mmのディッシュ1枚当たりの細胞1×104個の密度で播種し、その後、時間的に安定
なクローン亜細胞系を、蛍光装備型Nikon TS100落射蛍光顕微鏡により、手作
業で選択した。
eyor解析のために、細胞を、QuickExtract溶液(Epicentre、
Madison、WI)中に再懸濁させ、65℃で15分間にわたりインキュベートし、
次いで、98℃で10分間にわたりインキュベートすることにより、ゲノムDNAを抽出
した。抽出物溶液は、DNA Clean and Concentrator(Zym
o Research、Irvine、CA)を使用して清浄化させ、NanoDrop
(Thermo Fisher Scientific)により定量化した。CRISP
R標的部位を取り囲むゲノム領域は、Phusion DNAポリメラーゼ(New E
ngland Biolabs)を使用して、100ngのゲノムDNAから増幅した。
複数の独立のPCR反応物をプールし、製造元のプロトコール(Qiagen、Vale
ncia、CA)に従い、Qiagen MinElute Spin Columnを
使用して、精製した。12.5mMのTris−HCl(pH8.8)、62.5mMの
KCl、および1.875mMのMgCl2中に、400ngのPCR産物を含有する、
8μlの容量を変性させ、ゆっくりと:95℃で10分間、1秒当たり−1.0℃の勾配
で95℃から85℃へ、85℃で1秒間、1秒当たり−1.0℃の勾配で85℃から75
℃へ、75℃で1秒間、1秒当たり−1.0℃の勾配で75℃から65℃へ、65℃で1
秒間、1秒当たり−1.0℃の勾配で65℃から55℃へ、55℃で1秒間、1秒当たり
−1.0℃の勾配で55℃から45℃へ、45℃で1秒間、1秒当たり−1.0℃の勾配
で45℃から35℃へ、35℃で1秒間、1秒当たり−1.0℃の勾配で35℃から25
℃へ再アニールさせ、次いで、4℃に保ち、ヘテロ二重鎖の形成を可能とした。1μlの
Surveyorエンハンサーおよび1μlのSurveyor Nuclease(T
ransgenomic、Omaha、NE)を、各反応物に添加し、42℃で60分間
にわたりインキュベートし、その後、1μlのStop Solutionを、反応物に
添加した。DNA 1000チップ(Agilent、Santa Clara、CA)
を使用して、1μlの反応物を、2100 Bioanalyzer上で定量化した。ゲ
ル解析のために、6倍濃度のローディング緩衝液(New England Biola
bs)2μlを、残りの反応物に添加し、臭化エチジウムを含有する3%のアガロースゲ
ルにロードした。ゲルは、Gel Logic 200 Imaging System
(Kodak、Rochester、NY)上で視覚化し、ImageJ v.1.46
を使用して定量化した。NHEJ頻度は、二項式から導出される方程式:
[式中、「a」および「b」の値は、バックグラウンド控除後の切断断片の積分面積に等
しく、「c」は、バックグラウンド控除後における非切断PCR産物の積分面積に等しい
(Guschinら(2010年)、Methods in Molecular Biology、649巻:247〜2
56頁)]
を使用して計算した。
概要
色素性網膜炎(RP)とは、網膜光受容体細胞(杆体および錐体)の機能不全および死
が、視覚喪失をもたらし、潜在的に、失明をもたらす、遺伝性網膜変性疾患である。RP
には、常染色体劣性の遺伝形態および常染色体優性の遺伝形態の両方(それぞれ、ARR
PおよびADRP)が存在する。ARRPでは、疾患の一因となる遺伝子のいずれのコピ
ーにも(大半の遺伝子では、遺伝子の一方のコピーは、母親から受け継がれ、他方のコピ
ーは、父親から受け継がれる)突然変異が見られる。ARRPと関連する疾患原因突然変
異は一般に、関与遺伝子の機能の喪失をもたらす、すなわち、網膜変性は、その正常な機
能を果たす関与遺伝子の能力の喪失に起因する。このような症例では、少なくとも理論的
には、適切な処置を開発するのに行う必要がある(喪失した遺伝子機能を置きかえる必要
がある)ことが明白である。この手法の洗練された例は、レーバー先天性黒内障(LCA
)について進行中のヒト処置研究であり、この研究では、疾患を引き起こす欠損性RPE
65遺伝子の機能を置きかえるのに、アデノ随伴ウイルス(AAV)による遺伝子治療が
使用されている。
が突然変異している。大半の症例では、この単一の突然変異遺伝子は、機能を喪失してい
るために網膜変性を引き起こすのではなく、むしろ、杆体光受容体細胞および/または錐
体光受容体細胞に対して毒性であるかまたは有害な機能である、新たな機能を獲得した遺
伝子産物の産生を突然変異がもたらすために、疾患を引き起こす。機能的な遺伝子の導入
では十分でないので、この状況は、遺伝子置換戦略をより複雑なものとする(有効な治療
は、毒性の突然変異を伴う遺伝子から産生される「悪い」遺伝子産物の発現を取り除く手
法を開発することと、遺伝学者が「野生型」(WT)遺伝子と称する、突然変異していな
い遺伝子コピーの機能を維持することとの両方を要請する)。
の実験室および動物による調査研究の大半は、2ステップの手法:1)突然変異した遺伝
子コピーおよびWTの遺伝子コピーのいずれの機能も消失させ、次いで、2)通例、AA
V媒介型遺伝子治療を介して、WT遺伝子の、新たな「機能を喪失しにくい」形態であっ
て、内因性WT遺伝子を破壊する第1のステップで使用された治療に対して抵抗性である
形態を導入する手法を採用している。
R/Cas9による遺伝子編集を活用して、生存生物のゲノムの情報の編集を正確にター
ゲティングする戦略を提供する、すなわち、本明細書で開示される主題は、生存生物の遺
伝子の治療的モジュレーションを可能とする。本明細書で開示される方法は、WT遺伝子
の発現に影響を及ぼさないようにしながら、疾患原因遺伝子の突然変異コピーが、その毒
性遺伝子産物を発現させないように、CRISPR/Cas9による遺伝子編集を使用し
て、疾患原因遺伝子の突然変異コピーを特異的に変更する。例えば、ロドプシン遺伝子の
突然変異形であって、ADRP(P23H)と関連する突然変異形を、特異的にターゲテ
ィングし、毒性遺伝子産物をもはや発現させないように、その配列を変化させることがで
きる。一部の実施形態では、単一のAAVウイルス粒子内のCRISPR/Cas9構成
要素を、眼に送達することができる。この系は、ADRPのP23Hロドプシンマウス突
然変異体モデルにおいて調べられている。これらの研究は、ADRPを処置するために、
網膜細胞の特別の遺伝的操作に基づく遺伝子治療のための新たな手法を検証するものであ
る。本明細書で開示される主題は、ADRPの多様な形態のほか、他の常染色体優性の遺
伝性網膜ジストロフィーにも適用可能である。
40%を構成し、ADRP患者の中で、最も一般的に突然変異するRP関連遺伝子は、杆
体視物質であるロドプシンをコードする遺伝子である(Dryjaら(1990年)、The Ne
w England Journal of Medicine、323巻、1302〜1307頁;Dryjaら(19
90年)、Nature、343巻、364〜366頁)。本明細書で開示される主題は、CR
ISPR/Cas9による遺伝子編集技術を使用することにより、ADRPを処置する手
法(DoudnaおよびCharpentier(2014年)、Science、346巻、1258096頁;
Hsuら(2014年)、Cell、157巻、1262〜1278頁)であって、RNA誘導
型Cas9エンドヌクレアーゼを、カスタマイズ可能な低分子ガイドRNA(gRNA)
と共に使用して、突然変異体ロドプシン対立遺伝子をターゲティングし、切断する手法を
提供する。エラープローン非相同末端結合(NHEJ)は、正常対立遺伝子に影響を及ぼ
さずに、突然変異体対立遺伝子の発現を特異的にノックアウトする。必要とされる構成要
素は、哺乳動物の杆体における性能が記録されているAAV血清型である、単一のAAV
5により、光受容体に送達することができる。野生型レベルのわずか50%のロドプシン
の発現が生じさえすれば、臨床的に有用な杆体機能をもたらすのに十分であることを、動
物データは示唆している(Liangら、The Journal of Biological Chemistry、279
巻、48189〜48196頁)。
は、in vitroおよびin vivoにおいて有効であることが示されているが、
全ての現行の手法は、大部分が送達上の制約に起因して、いまだ臨床使用からは程遠い。
AAVベクターは、眼の遺伝子治療において最もしばしば使用されるウイルスベクターで
ある(DalkaraおよびSahel(2014年)、Comptes Rendus Biologies、337巻、1
85〜192頁;Dayら(2014年)、Advances in Experimental Medicine and
Biology、801巻、687〜693頁;WillettおよびBennett(2013年)、Frontie
rs in Immunology、4巻、261頁;Dinculescuら(2005年)、Human Gene The
rapy、16巻、649〜663頁)。非病原性のウイルスであり、分裂細胞および非分裂
細胞のいずれにも感染し、発現が長期間にわたり持続し、特に、臨床試験における、その
安全性、有効性、および一般的な毒性の欠如の履歴が注目に値する、いくつかの特徴は、
AAVを魅力的な選択としている。加えて、硝子体内注射の後に光受容体細胞をターゲテ
ィングするのに有効な、変異体AAV血清型とプロモーターとの組合せも開発されている
。しかし、それらの現行の状態において、これらのベクターは、免疫応答を誘発し、ヒト
サイズの眼における、光受容体への、効率的な、汎網膜的向細胞性を欠く(Kottermanら
(2015年)、Gene Therapy、22巻、116〜126頁;Mowatら(2014年)、
Gene Therapy、21巻、96〜105頁;Dalkaraら(2013年)、Science Transla
tional Medicine、5巻、189ra176頁)ので、焦点は既に、網膜下注射により投
与される、AAV5ベクターの、十分に特徴付けられた使用に絞られているであろう。
NAを保有するように改変しうるが、この限界を押し広げると、パッケージング効率の低
減およびインサートの欠失がもたらされる(Bernsら(1986年)、Fundamental Viro
logy、B.N. FieldsおよびKnipe, D.M.編、545〜562頁、Raven Press)。一般に
使用されるCas9タンパク質(4.1kb)をコードする遺伝子自体のサイズが大きい
ために、gRNAを伴う送達であって、単一のウイルスベクターを介する発現に必要な、
プロモーター配列、ターミネーター配列、ウイルスITR(inverted term
inal repeat)配列を含む送達は、現在のところ、このAAVのパッケージン
グ容量により限定されている。実際、活性CRISPR複合体の再構成は、共形質導入を
必須とするが、これは、単一の形質導入より効率性が低い。加えて、これは、ウイルス用
量の増大も要請し、免疫応答および関連する毒性の増大も、潜在的に誘導しうるであろう
。また、ヒト試験における第2のウイルスベクターの送達は、FDAによる承認へのさら
なる難題をもたらしうる可能性も高い。
ンガーヌクレアーゼ(ZFN)および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TA
LEN)などのゲノム編集技術の初期の方法により、ターゲティングされたゲノム改変を
作出する能力が強化され、疾患突然変異を精密に補正する潜在的可能性が供されている。
これらの技術は、有効ではあるが、ZFNおよびTALENの対のいずれも、所与のDN
A標的部位についての、大型で固有の認識タンパク質を合成することを要請するので、実
際的な限界に阻まれている。多数のグループが近年、操作されたII型CRISPR/C
as9系の使用を介する高効率のゲノム編集であって、これらの鍵となる限界を回避する
ゲノム編集について報告している(Jinekら(2012年)、Science、337巻、816
〜821頁;Congら(2013年)、Science、339巻、819〜823頁;Maliら(
2013年)、Science、339巻、823〜826頁)。CRISPR/Cas9系は
、Cas9ヌクレアーゼを、配列特異的DNAにターゲティングする、ガイドRNA(g
RNA)から構成される。CRISPR/Cas9ゲノム編集は、ゲノムターゲティング
のために、ZFNおよびTALENで要請される、ヌクレアーゼ内のDNA結合性ドメイ
ンの固有の組合せではなく、短鎖合成gRNAに依拠するので、ZFNおよびTALEN
の発現に必要な構築物を制作する、時間がかかり、労力を要する作業が解消される。CR
ISPR/Cas9系のための構築物の作出は、簡単かつ迅速であり、標的をマルチプレ
ックス化することができる。CRISPR系による切断は、20ヌクレオチドのDNA配
列および標的部位の3’側に見出される短いヌクレオチドモチーフである、必須のプロト
スペーサー隣接モチーフ(PAM)への、gRNAの相補的塩基対合を要請する。理論的
には、CRISPR技術を使用して、ゲノム内の、任意の固有のN20−PAM配列をタ
ーゲティングすることができる。現在のところ、制限が最も小さく、最も一般的に使用さ
れているCas9タンパク質は、配列NGGを認識する、S.pyogenesに由来し
、こうして、CRISPRターゲティング配列は、N20NGGとなる。
PR/Cas9エフェクター分子を、適切に操作されたAAV5ベクターの網膜下投与に
より、杆体細胞に送達する。血清5型ベクターは、非ヒト霊長動物(Mancusoら(200
9年)、Nature、461巻、784〜787頁)の光受容体およびイヌ科動物(Beltran
ら(2012年)、Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America、109巻、2132〜2137頁)の光受容体のいず
れへの形質導入においても、極めて効率的であり、網膜の治療を媒介することが可能であ
ることが示されている。カプシドを修飾されたAAVベクターは、マウスでは、硝子体か
ら光受容体に浸透しうる(Petrs-Silvaら(2011年)、Molecular Therapy: the J
ournal of the American Society of Gene Therapy、19巻、293〜301頁
)が、これまでのところ、イヌまたは非ヒト霊長動物では、同様な浸透性が可能となって
いない(観察は公表されていない)。
要素を発現させるのに要請されるDNAが、従来の方法では、5kb(プロモーター、約
500bp;spCas9、4,140bp;Pol IIターミネーター、約250b
p;U6プロモーター、約315bp;およびgRNA、約100bp)を超え、したが
って、AAVのパッケージング限界である、およそ4.7〜4.9kbを超えることであ
る。Swiechら(2015年、Nature Biotechnology、33巻、102〜106頁)は、
2ベクター手法:Cas9を送達する1つのAAVベクターと、gRNAを送達するため
の別のAAVベクターとを使用することにより、この課題に取り組んだ。しかし、この研
究における二重AAV手法は、網膜細胞内では発現するが、杆体内では発現しない特に低
分子のプロモーターである、マウスMecp2プロモーターを利用した(Songら(201
4年)、Epigenetics & Chromatin、7巻、17頁;Jainら(2010年)、Pediatric
Neurology、43巻、35〜40頁)。こうして、この系は、構築されても、ADRP
の大半の症例には適さないであろう。本明細書で開示される主題は、網膜の遺伝子編集の
ための単一ベクター手法であって、効率を増大させ、光受容体を特異的にターゲティング
し、ウイルスロードの送達に由来する潜在的毒性を低減する単一ベクター手法を提供する
。
gRNAの転写を方向付け、利用可能なCRISPR遺伝子ターゲティング空間をほぼ
倍化することを可能とするのに、従来使用されたU6プロモーターではなく、H1プロモ
ーターが使用されている(Ranganathanら(2014年)、Nature Communications、5
巻、4516頁)。とりわけ、オフターゲットの切出しへの傾向の低下が検出されたこと
から、H1プロモーターは、治療手法により好適であることが示唆される。これらの研究
では、内因性H1RNA遺伝子とゲノム内で近接するタンパク質コード遺伝子(PARP
−2)の存在が注目された(Baerら(1990年)、Nucleic Acids Research、18巻
、97〜103頁;Myslinskiら(2001年)、Nucleic Acids Research、29巻、
2502〜2509頁)。H1RNA(pol III RNA転写物)の始点と、PA
RP−2遺伝子(pol II転写物)の始点との間の配列は、230bp(図13)で
あることから、この比較的小さな配列は、コンパクト双方向性プロモーターとして機能し
うることが指し示される。これは、pol II転写物およびpol III転写物の両
方を方向付けうる、哺乳動物ゲノム内で唯一の双方向性プロモーター配列であり、両方の
CRISPR構成要素を、単一のAAV中にパッケージングする場合のサイズのハードル
を克服するのに使用しうると考えられる。
ーターとしてのH1の使用を開発するため、かつ、そのpol III活性は、既に十分
に特徴付けられているため、そのpol II活性をより良好に最適化するように、eG
FPレポーター構築物を創出した(図14)。ヒト(HEK293)内およびマウス細胞
(NIH3T3)内の最初の結果により、弱いが、明確に検出可能なGFP蛍光が実証さ
れたことから、H1プロモーターにより、弱くではあるが、pol II発現を方向付け
うることが指し示される。このGFPレポーター系を使用して、系内の3つの可変的構成
要素:プロモーター配列、5’UTR、およびターミネーター配列を査定することにより
、プロモーターのコンパクト性を維持しながら、pol II発現を増大させた。異なる
生物に由来するH1プロモーター配列について調べたところ、マウス(176bp)配列
およびラット(207bp)配列のいずれも、ヒトH1プロモーターより強いGFP発現
を駆動することが可能であることが指し示された(それぞれ、約7倍および約6倍)。し
かし、目標は、in vivoにおいてヒト細胞と共に使用するための系を導出すること
であるので、可能な場合は、ヒトプロモーター配列を使用した。異なるターミネーター配
列を査定するために、7つの異なる配列について調べたところ、SV40(240bp)
ターミネーター配列および49bpの合成ポリ(A)配列(SPA)(Levittら(198
9年)、Genes & Development、3巻、1019〜1025頁)はいずれも、GFP発
現のために機能的であることが見出された。5’UTRの修飾を介して翻訳効率を最適化
して、レポーターの発現を改善したところ、ベータ−グロビンの5’UTR配列から取り
出される50bpの配列の挿入により、レポーター発現を著明に改善しうることが見出さ
れた。強力なコザック配列をコードする9塩基(Kozak(1987年)、Nucleic Acids
Research、15巻、8125〜8148頁)(5’−GCCGCCACC−3’)を挿
入するだけで、これらのレベルを近似するのに十分であった(図15)ことは、この考え
と符合する。
およびターゲティングgRNAを同時に発現させるのに、ヒトH1プロモーター配列を使
用して、ターゲティング構築物を作出した。これらの双方向性構築物が、細胞内の切断を
方向付ける能力について調べるために、NIH3T3細胞を、標準的な2プラスミド手法
(pCAAGS:Cas9およびH1:gRNA)または両方の構成要素を発現させる単
一プラスミド系で電気穿孔した。マウスゲノム内の2つの異なる遺伝子座をターゲティン
グした。電気穿孔の48時間後、ゲノムDNAを採取し、T7 Endo I(T7EI
)アッセイ(Ranら(2013年)、Nature Protocols、8巻、2281〜2308頁)
を実施して、ゲノム改変のレベルを定量化した。欠失の検出においてより感受性であるこ
とが報告されている(Vouillotら(2015年))ため、従来のSurveyorアッセ
イではなく、T7EIアッセイを使用した。およそ4.7kbで、十分にAAVのパッケ
ージング容量内にある、コンパクト双方向性系を使用して、CRISPR切断を、これら
の2つの遺伝子座に有効にターゲティングしうることが見出された(図16Aおよび図1
6B)。ヒト細胞における、このターゲティング戦略の適用可能性および関与性をさらに
実証するように、ヒトH7胚性幹細胞系内のCas9ターゲティングについてのデータが
存在する。ヒト配列ではなくて、マウスH1プロモーターを使用し、SV40ターミネー
ター配列ではなくて、SPAターミネーターを使用することにより、理論的には、ターゲ
ティング構築物のサイズを、さらに200bp低減することができる。これらの配列の低
減により、より効率的なパッケージングを可能とすることもでき、Cas9系の発現をブ
ーストする場合もあり、低減する場合もあり、なおさらに調節する場合もある配列の改変
;潜在的なオフターゲット効果を低減するために重要でありうる改変のためのさらなる空
間を潜在的にもたらすこともできる。AAV Helper−free System(
Agilent)によるITR含有ベクター中に容易にクローニングされうるフランキン
グNotI部位と共に、Gibsonクローニング方法(NEB)を使用して、簡単な標
的の挿入を可能とする、固有の制限部位を伴う双方向性プラスミドが作出されている。
メントを、単一のAAVベクター系から有効に発現させ、適切なGMP様前臨床ベクター
を作出するように、デザインし、最適化する
ならびに最適化の取組みにより、CRISPR送達のサイズを、AAVパッケージング容
量未満に低減することの実質的な進展が、既になされている。代替的なプロモーター配列
、5’/3’UTR修飾、および異なるgRNAによる多様な組合せは、ターゲティング
効率の潜在的スペクトルについて調べるためのツールキットを提供する。
使用して、in vitroおよびin vivoにおける試験のためのAAVベクター
を作出することができる。最適化研究のために使用される構築物は、AAV産生のための
ITR含有ベクタープラスミドへのクローニングを可能とするフランキングNotI部位
と共に、簡単な標的の挿入を可能とする固有の制限部位を含有する。細胞培養研究および
マウス研究のための、高力価GMP様前臨床AAV5ベクターを、独立のベクター作製施
設において、ヘルパーフリーのプラスミドトランスフェクション方法を使用して作出し、
既に開発した技法(Dryjaら(1990年)、The New England Journal of Medicin
e、323巻、1302〜1307頁;Dryjaら(1990年)、Nature、343巻、36
4〜366頁)により精製することができる。各ウイルスの調製は、最終的なベクター内
のWTアデノウイルスおよび複製コンピテントAAV夾雑物を消失させる、pDG mi
ni−AdプラスミドDNAヘルパー系を使用して行うことができる。ベクターは、イオ
ジキサノール勾配遠心分離に続く、QカラムFPLCクロマトグラフィーにより精製する
。GMP様純度のAAVベクター原液を確立するために、各ベクターを、標準化された物
理的アッセイおよび生物学的アッセイのバッテリーであって、純度、バイオバーデン、無
菌性、DNA含有粒子の力価、感染力価、粒子対感染性比、および複製コンピテントAA
Vによる夾雑可能性についての評価を含むバッテリーにかけることができる。
ている(Ranganathanら(2014年)、Nature Communications、5巻、4516頁)
が、構築物は、最終的な臨床使用を目標として開発されつつあるので、潜在的なオフター
ゲット活性について注意深くモニタリングすべきである(Wuら(2014年)、Quantita
tive Biology、2巻、59〜70頁)。この目的で、いくつかの相補的な手法を追求す
ることができる。バイオインフォマティクス手法を取り、23マーのCRISPR配列部
位の両方の鎖および重複の発生を検索するように書かれた特注のPerlスクリプトを使
用して、ヒトゲノム内およびマウスゲノム内の全ての潜在的CRISPR部位が決定され
た(Ranganathanら、準備中の草稿、2015年)。例えば、ヒトゲノム内では、反復配
列をフィルタリングにより除外した後で、137,409,562のCRISPR部位に
よる初期セットが同定された。次いで、3’末端またはPAM末端(シード領域)へのバ
イアスがかかった、23塩基の配列の固有性に基づき、値を割り当てる特注のアルゴリズ
ム(Jinekら(2012年)、Science、337巻:816〜821頁)に従い、各部位を
スコア付けした。最後に、ターゲティング配列を通して最大で3つの塩基ミスマッチを許
容しながら、各CRISPR部位をゲノムに戻して再配列決定する、Bowtie(Lang
meadら(2009年)、Genome Biology、10巻、R25頁)を使用することにより、
各部位がオフターゲット効果を呈示する傾向を計算した。コンピュータによるオフターゲ
ットの予測を使用して、各gRNAを、任意の誤ターゲティングについて調べることがで
きる。予測される潜在的なオフターゲット部位を挟むPCRプライマーを使用して、ゲノ
ム配列を増幅することができ、次いで、これを、T7EIアッセイにより、切断効率につ
いて調べることができる。これは、in vitroおよびin vivoの両方におけ
る最適化実験のための、ターゲティング精度のモニタリングを可能とするであろう。オフ
ターゲット切出し0.5%未満を目指すが、5%未満は許容可能とする。
のターゲティングを含む、代替的な手法も検討される。Cas9は、標準的なNGG配列
に加えて、NAGを伴うPAMモチーフもターゲティングすることが報告されている(Hs
uら(2013年)、Nature Biotechnology、doi:10.1038/nbt.264
7)。ヒト配列内の2つのCRISPR配列と、マウスゲノム内の3つのターゲティング
配列との重複であって、P23H突然変異が同定された重複により、さらなるターゲティ
ング部位がもたらされうるであろう。NAG PAM部位は、NGG部位よりターゲティ
ング効率が低いと予測されている(Zhangら(2014年)、Scientific Reports、4巻
、5405頁)が、これにより、投与量を滴定する機構が提示される可能性があり、構築
物が著明なオフターゲット効果を及ぼすことを決定する場合、この機構は貴重でありうる
。まず、NAG PAM部位を使用する5つの配列を、Gibsonアセンブリー(NE
B)を使用するpH1v126中にクローニングすることができる。2つのヒト配列を、
Cas9プラスミドと共に、293細胞中に共トランスフェクト(Lipofectam
ine 3000)しうる一方、マウスプラスミドは、Cas9プラスミドと共に、NI
H3T3細胞中に電気穿孔(Invitrogen、Neon)することができる。gR
NA活性を検出するために、カノニカルのNGGのほか、非カノニカルのNAG部位の間
でも、Cas9切断部位においてNHEJにより導入される、インデル突然変異の比率を
定量化することができる。
ゼデッド形(dCas9)を活用して、P23H対立遺伝子の発現を特異的に抑制する治
療手法も、使用することができる(Qiら(2013年)、Cell、152巻、1173〜1
183頁;Gilbertら(2013年)、Cell、154巻、442〜451頁;Larsonら(
2013年)、Nature Protocols、8巻、2180〜2196頁;Fullerら(2014
年)、Advances in Experimental Medicine and Biology、801巻、773〜78
1頁)。切断を誘導する代わりに、dCas9は、DNA配列への緊密な結合を保ち、活
性状態で転写される遺伝子の内側をターゲティングする場合、立体障害機構を介するpo
l II進行の阻害により、効率的な転写の抑制をもたらしうる。DNAの破断を誘導せ
ずに、P23Hの治療的抑制を達成することにより、かつ、AAVの構成的な発現が与え
られることにより、AAV5による転写阻害剤の送達は、遺伝子治療および調節ハードル
の両方の観点から好適でありうるであろう。CRISPRiによる転写の抑制は、ロドプ
シンの対立遺伝子特異的発現を測定するqRT−PCRを使用して、最適化することがで
きる。
て、開発されたAAV5ベクターが、突然変異体ロドプシン対立遺伝子を切り出し、その
発現をノックアウトする能力を検証する
おいて、ターゲティング構築物を検証することができる。生後2〜10日目の動物を使用
して、ターゲティングアッセイのための細胞を単離するために、マウス網膜を採取および
解離することができる。構築物を、ヒト(h)Rho:GFPマウス(Chanら(2004
年)、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United St
ates of America、101巻、9109〜9114頁)内で調べることにより、ロドプ
シンターゲティングのさらなる最適化を可能とすることができる。hRho−GFPノッ
クインマウスは、マウスロドプシンのオープンリーディングフレームにノックインされた
ヒトロドプシン−GFP融合体を含有する(図17)。この部分的なヒト化マウスは、光
受容体細胞内のヒト特異的配列のターゲティングを可能とする。ヒトrho配列をターゲ
ティングすることができ、次いで、光受容体からのGFPの喪失を定量化することができ
る。ロドプシンをターゲティングしつつあるが、GFPレポーターをインフレームで融合
させて、こうして、蛍光の喪失を、標的部位の上流における、エラープローンNHEJの
簡便な代理指標として用いる。網膜細胞の電気穿孔により、10〜20%のトランスフェ
クション効率が日常的に達成されるが、CRISPR改変細胞の集団について濃縮するた
めに、トランスフェクトされた集団を、Cas9蛍光レポーターの強度に基づき分取する
ことができる。多様なP2A:レポータータンパク質と融合させた、いくつかのCas9
構築物であって、Cas9活性を損なわずに、蛍光活性のモニタリングを可能とするCa
s9構築物を作出した。Rho:GFPマウスに由来する網膜培養物を使用して、Cas
9:P2A:mCherryレポーターおよびターゲティングgRNAを電気穿孔するこ
とができる。次いで、24時間の培養後、二重陽性細胞を分取することができ、これによ
り、トランスフェクトされた光受容体について濃縮することができる。48時間後、細胞
を、QuickExtract緩衝液(Epicentre)中に再懸濁させて、ゲノム
DNAを採取し、T7EIアッセイによりゲノムの改変についてアッセイすることができ
る。同様に、ロドプシン突然変異のターゲティングは、P23Hマウスに由来する、初代
光受容体培養物を使用して検証することができる。構築物のターゲティング効率が10%
を超え、初期の結果と符合する場合は、トランスフェクションのレベルが低レベル(10
%)であってもなお、T7EIアッセイを使用して、ゲノム編集を検出することができる
。加えて、AAV5ベクターの使用は、著明に高度な形質導入効率をもたらすはずである
。
高感度の、部位特異的ディープシークェンシング解析も実施する。高忠実度のポリメラー
ゼ(NEB、Phusion)を使用して、CRISPR標的部位と予測されるオフター
ゲット部位とを挟むゲノム配列を、15サイクルにわたり増幅し、次いで、DNA Cl
ean & Concentrator−5(Zymo)を使用して、精製することがで
きる。精製されたPCR産物は、5サイクルにわたり増幅して、Illumina P5
アダプターおよび試料特異的バーコードを接合し、再度精製し、次いで、SYBRグリー
ン蛍光により定量化し、BioAnalyzer上で解析し、最後に等モル比でプールし
てから、MiSeq Personal Sequencerでシークェンシングするこ
とができる。シークェンシングデータを解析するためには、Illumina MiSe
q Reporterソフトウェアを使用して、300bpのペアドエンドMiSeqリ
ードを脱マルチプレックス化するのに続いて、生リードに、アダプター/品質トリミング
を施す。アライメントは、野生型配列に照らして、全てのリード上で実施し、NHEJ頻
度は、100×(インデルリードの数/インデルリードの数+WTリードの数)により計
算する。
改善されたベクターが、突然変異体ロドプシン対立遺伝子を切り出し、その発現をノック
アウトする能力を検証する
ティングを実証することになるであろう。バイオインフォマティクスの取組みにより、マ
ウスP23コドンと重複する、高スコアリングのCRISPRターゲティング部位が同定
されている。N20NGGの形態のCRISPR部位は、リバース鎖:
残念ながら、CRISPR部位内のマウスP23H突然変異の場所は、ターゲティング部
位内の、bp同一性を知りえない唯一の場所である、NGG PAMモチーフのNに当た
る。これは、P23H配列を指向するCRISPRが、野生型配列とP23H配列とを弁
別することは不可能であり、したがって、ターゲティングは、いずれの対立遺伝子も切り
出すと予測されることを意味するので、一塩基多型(SNP)の発生に基づく代替的な手
法が開発されている。
Pなどを含む)(180bpごとに約1つ)が報告されており、個別化ゲノム薬の文脈で
は、この変異は、極めて重要である。天然の遺伝子変異を活用することにより、マウスモ
デルにおけるP23Hロドプシン対立遺伝子を、特異的にターゲティングする方法をもた
らしうるだけでなく、また、将来のゲノム操作および治療手法になおより関与性となる可
能性が高い概念実証手法も実証しうることが推論された。castaneus(Cast
)マウスは、ロドプシン遺伝子のプロリン23コドン内のSNPであって、C57BL/
6J配列と異なるSNPを含有することが見出され、C57BL/6Jの遺伝子バックグ
ラウンドにおける、P23H突然変異体マウスを、解析のために得た。SNPは、P23
H内の原因C→Aトランスバージョンにじかに隣接しており、これにより、野生型ロドプ
シン対立遺伝子のターゲティングを伴わずに、優性P23H対立遺伝子をターゲティング
するための手法がもたらされる。P23H突然変異のバックグラウンドは、C57BL/
6Jであるので、一世代のCast/P23H交配の後で、CRISPRによりターゲテ
ィング可能なロドプシンP23H対立遺伝子、および、緊密に連関するSNP差違に起因
して、gRNA標的の「シード」領域内の20位に配置された単一のミスマッチで異なる
、野生型のCRISPR抵抗性ロドプシン対立遺伝子の両方を含有する、ヘテロ接合性マ
ウスを得た(図18A、図18B、および図18C)。
である、C57BL/6Jプロリン23コドン配列をターゲティングするH1双方向性構
築物、またはヘテロ接合性P23H/Cast動物のWTロドプシン対立遺伝子内に存在
する配列である、Castマウスにおけるプロリン23コドン配列をターゲティングする
H1双方向性構築物を作出した。NIH3T3細胞(C57BL/6J SNPを含有す
る)を、両方の構築物で独立に電気穿孔し、ゲノムDNAを単離し、次いで、T7EIア
ッセイを実施して、ゲノム改変のレベルを定量化した。特異的なロドプシンターゲティン
グを観察した:C57BL/6J(すなわち、P23H)指向性構築物だけが、著明な切
出しをもたらし、ゲノム改変のレベルは、50%近くであったが、全体の電気穿孔効率が
80%を下回ったことを踏まえると、これは、ターゲティングの潜在的可能性の過小評価
である可能性が高い(図19)。単一の塩基ミスマッチを含有する、Castロドプシン
配列に基づくgRNAは、検出可能なCas9切断をもたらさなかったので、ロドプシン
ターゲティング部位、およびコンパクト双方向性構築物が切断を方向付ける能力の検証に
加えて、これらの結果は、in vitroにおける切出しが、SNP/突然変異体配列
において特異的に生じることも実証した。
るが、AAV5媒介型送達は、大きな眼であってもなお、大部分の光受容体への形質導入
が可能であることが示されている。この形質導入率の高さ、形質導入された細胞のうちの
50%またはこれ超において遺伝子編集が生じること、およびNHEJイベントの3例中
2例が、フレームシフト突然変異を結果としてもたらすことを踏まえると、多数の杆体内
では、P23H対立遺伝子の発現のノックアウトが達成されるはずであり、大部分の杆体
内では、さらなる最適化も達成されるはずである。研究は、このレベルのターゲティング
ならば、杆体の直接的な保存および錐体の生存に対する二次効果の両方を介して、光受容
体の生存を支援し、妥当なレベルの視覚を維持するのに十分であることを示唆する(Leve
illardら(2004年)、Nature Genetics、36巻、755〜759頁;Leveillardお
よびSahel(2010年)、Science Translational Medicine、2巻、26ps16;S
ahelら(2013年)、Graefe's archive for clinical and experimental ophth
almology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle
Ophthalmologie、251巻、1669〜1677頁)。既に記載されている通り、最適
化されたウイルスを、P15におけるマウス10匹の一方の眼に網膜下注射することがで
きる(Maoら(2012年)、Advances in Experimental Medicine and Biology、
723巻、199〜205頁;Maoら(2012年)、Human Gene Therapy、23巻、
356〜366頁;Maoら(2011年)、Human Gene Therapy、22巻、567〜5
75頁)。パートナーの対照眼と対比した、処置眼についての、ERG解析およびSDO
CT(Bioptigen)解析を、処置の2、6、および12週間後に実施することが
できる。処置された眼では、12週間後に、機能的および構造的改善が観察されることを
仮定して、長期生存研究を後続させることもできる。屠殺時には、ONL厚、外側部内の
適正な局在化についてのスパイダーグラムおよび免疫組織学的ロドプシンアッセイ、なら
びにロドプシンレベルについてのウェスタンブロットを含む、組織学的解析を実施するこ
とができる。
ムシークェンシングは、オフターゲット突然変異を評価するために、最もバイアスのかか
らない方法であり、標的部位を確認するために理想的であろう。AAVで処置された眼に
由来するマウス網膜およびAAVで処置されていない眼に由来するマウス網膜を採取し、
解離させることができ、ゲノムDNAを、DNeasy Blood & Tissue
Kit(Qiagen)により抽出することができ、DNAを、Covaris AF
Aでせん断処理することができる。DNA断片は、末端修復し、Aテール処理し、Ill
umina製のバーコード処理シークェンシングアダプターにライゲーションすることが
できる。ライゲーションされた産物は、バーコード処理全ゲノムシークェンシングライブ
ラリーを作出するように、PCRにより増幅し、HiSeqプラットフォーム(Illu
mina)上で、15倍の平均値カバレッジまでシークェンシングすることができる。次
いで、Burrows−Wheeler Alignerを、デフォルトパラメータによ
る「mem」モード(「bwa mem」)で使用して、シークェンシングリードを、ヒ
ト参照ゲノム(hg19/GRCh37)に照らして配列決定することができる。CRI
SPR切断イベントごとに、固有の突然変異が結果としてもたらされるため、DNA二本
鎖破断部位は、同じデノボの突然変異を結果としてもたらさないことが仮定される。こう
して、複数の試料により共有される全ての変異体を棄却することにより、その後のバイオ
インフォマティクス解析におけるフィルタリングが可能となるであろう。
本明細書で言及される、全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、本明
細書で開示される主題が関する技術分野の当業者のレベルを指し示す。全ての刊行物、特
許出願、特許、および他の参考文献は、各個別の刊行物、特許出願、特許、および他の参
考文献が、参照により組み込まれることが、具体的かつ個別に指し示された場合と同じ程
度に、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書では、多数の特許出願、特許、およ
び他の参考文献が言及されるが、このような参考文献は、これらの文献のうちのいずれか
が、当技術分野における共通の一般的な知見の部分を形成することの容認を構成しないこ
とが理解されるであろう。
記載してきたが、当業者は、添付の特許請求の範囲内で、いくつかの変化および改変を実
施しうることを理解するであろう。
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- 明細書に記載の発明。
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