CN112955553A - 与核酸抗凝剂有关的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供与具有治疗性适体的核酸分子有关的组合物和方法。具体地，本公开提供包含具有抗凝活性的一个或多个适体的核酸分子、以及相应的核酸解毒剂，以用于在疾病和手术介入的背景下调节血液凝固。

Description

与核酸抗凝剂有关的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年10月26日提交的美国临时专利申请号62/750,900的优先权和权益，该专利申请通过引用整体并入本文以用于所有目的。
政府资助
本发明是在美国国家科学基金会(National Science Foundation)(NSF)授予的资助号为1559077、1603179和1709010的政府支持下进行的。政府在本发明中拥有某些权利。
以电子方式提交的材料的通过引用合并
随本文同时提交并识别如下的计算机可读核苷酸/氨基酸序列表通过引用整体并入本文：于2019年10月25日创建的名为“37060-601_ST25.txt，”的一个10,156字节ASCII(文本)文件。
技术领域
本公开提供与具有治疗性适体的核酸分子有关的组合物和方法。具体地，本公开提供包含具有抗凝活性的一个或多个适体的核酸分子、以及相应的核酸解毒剂，以用于在疾病和手术介入的背景下调节血液凝固。
背景技术
凝固级联涉及最终在破裂的血管表面和细胞表面上产生纤维蛋白凝块的一系列酶促反应。抗凝剂通过阻断级联中的关键参与者来使凝固过程中断。因此，通过抗凝剂调控纤维蛋白凝块形成可以避免血栓形成，即避免在如心脏、肺和大脑等重要器官中形成血液凝块。血栓形成的危及生命的后果包括中风或短暂性脑缺血发作、心脏病发作、深静脉血栓形成和肺栓塞。
最常用的处方药抗凝剂是华法林(Warfarin)，其是一种经常用作杀鼠剂的小分子。华法林是一种维生素K拮抗剂，其抑制凝结因子II、VII、IX和X以及内源性抗凝蛋白C和S的合成。人体对维生素K波动的敏感性需要对其水平进行严格且及时地监测，并且相应地调整剂量。抗凝剂的其它形式包括肝素、因子Xa抑制剂、直接凝血酶抑制剂和纤溶酶(Fibrobrinolytics)。对于有效地治疗凝结且不会引起过度抗凝固的给药而言，例如，在手术中如果抗凝剂的剂量太高，则目前所有的抗凝固方法都一致地是狭窄的治疗窗口。遗憾的是，还没有用于基于化学制品的抗凝剂的解毒剂，该解毒剂可以进一步介导给药并且抑制细胞毒性效应。
发明概述
本公开的实施方案提供一种单链核酸分子，该单链核酸分子包括至少一个A型双螺旋结构和至少一个交叉区域、至少一个吻合环区域、以及具有抗凝活性的至少一个核酸适体。
在一些实施方案中，该核酸分子包括至少一个四环区域。在一些实施方案中，该核酸分子是RNA分子，或者是包括具有2’-修饰的至少一个核苷酸的RNA分子。
在一些实施方案中，该单链核酸分子包括包含四核苷酸基序的至少一个四环区域。在一些实施方案中，该单链核酸分子包括一至六个四环区域，每个四环区域都包含四核苷酸基序。在一些实施方案中，该单链核酸分子包括至少一个吻合环区域，该至少一个吻合环区域为180°吻合环区域。在一些实施方案中，该单链核酸分子包括一个180°吻合环区域。
在一些实施方案中，该单链核酸分子包括具有抗凝活性的一至四个适体。根据这些实施方案，该一至四个适体中的每一者替代四环区域。
在一些实施方案中，该核酸分子是与SEQ ID NO：1.SEQ 1具有至少80％序列同一性的RNA分子。
在一些实施方案中，该至少一个核酸适体的抗凝活性包含凝血酶抑制。在一些实施方案中，该至少一个核酸适体的抗凝活性包括对因子XIIa、因子XIIIa、因子XIa、因子IXa、因子Xa和von Willebrand因子中的一者或多者的抑制。在一些实施方案中，该至少一个核酸适体包含抗凝血酶RNAR9D-14T适体或其衍生物。在一些实施方案中，该至少一个核酸适体包含抗凝血酶Toggle-25t RNA适体或其衍生物。
在一些实施方案中，该核酸分子是包含约100至约600个核苷酸的RNA分子。
在一些实施方案中，该单链核酸分子是包含能够结合凝血酶外位点1的核酸适体和能够结合凝血酶外位点2的核酸适体的RNA分子(2HO-RNA-12NN或2HF-RNA-12NN)，其中能够结合凝血酶外位点1的核酸适体替代该RNA分子的四环区域1，并且能够结合凝血酶外位点2的核酸适体替代该RNA分子的四环区域2。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：2具有至少80％序列同一性。
在一些实施方案中，该单链核酸分子是包含能够结合凝血酶外位点1的核酸适体和能够结合凝血酶外位点2的核酸适体的RNA分子(2HO-RNA-1N2N或2HF-RNA-1N2N)，其中该能够结合凝血酶外位点1的核酸适体替代该RNA分子的四环区域1，并且该能够结合凝血酶外位点2的核酸适体替代该RNA分子的四环区域3。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ IDNO：3具有至少80％序列同一性。
在一些实施方案中，该单链核酸分子是包含能够结合凝血酶外位点2的核酸适体和能够结合凝血酶外位点1的核酸适体的RNA分子(2HO-RNA-2NN1或2HF-RNA-2NN1)，其中该能够结合凝血酶外位点2的核酸适体替代该RNA分子的四环区域1，并且该能够结合凝血酶外位点1的核酸适体替代该RNA分子的四环区域4。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ IDNO：4具有至少80％序列同一性。
在一些实施方案中，该单链核酸分子是包含连接至单链RNA接头一端的能够结合凝血酶外位点2的核酸适体和连接至单链RNA接头另一端的能够结合凝血酶外位点1的核酸适体的RNA分子(Fss12)。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：5具有至少80％序列同一性。
在一些实施方案中，该单链核酸分子是包含能够结合凝血酶外位点2的两个核酸适体和能够结合凝血酶外位点1的两个核酸适体的RNA分子(2H-2211)，其中该能够结合凝血酶外位点2的两个核酸适体各自分别替代该RNA分子的四环区域1和2，并且该能够结合凝血酶外位点1的两个核酸适体各自分别替代该RNA分子的四环区域3和4。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：6具有至少80％序列同一性。
在一些实施方案中，该单链核酸分子是包含能够结合凝血酶外位点2的核酸适体、能够结合凝血酶外位点1的核酸适体、以及A型双螺旋结构的RNA分子(3H-2NN1)，其中该能够结合凝血酶外位点2的核酸适体替代该RNA分子的四环区域1，该能够结合凝血酶外位点1的核酸适体替代该RNA分子的四环区域4，并且该A型双螺旋结构将该能够结合凝血酶外位点2的核酸适体与该能够结合凝血酶外位点1的核酸适体分离。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：7具有至少80％序列同一性。
在一些实施方案中，该单链核酸分子是包含能够结合凝血酶外位点2的核酸适体、能够结合凝血酶外位点1的核酸适体、以及两个A型双螺旋结构的RNA分子(4H-2NN1)，其中该能够结合凝血酶外位点2的核酸适体替代该RNA分子的四环区域1，该能够结合凝血酶外位点1的核酸适体替代该RNA分子的四环区域4，并且该两个A型双螺旋结构将该能够结合凝血酶外位点2的核酸适体与该能够结合凝血酶外位点1的核酸适体分离。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：8具有至少80％序列同一性。
在一些实施方案中，该能够结合凝血酶外位点1的核酸适体是RNAR9D-14T适体或其衍生物。在一些实施方案中，该能够结合凝血酶外位点2的核酸适体是Toggle-25t RNA适体或其衍生物。
本公开的实施方案还包括对本文描述的单链核酸分子中的任何一者进行编码的DNA分子。
本公开的实施方案还包括抗凝组合物。根据这些实施方案，该组合物包括单链核酸分子以及药学上可接受的赋形剂、溶剂、载体或稀释剂，该单链核酸分子包含至少一个A型双螺旋结构、至少一个交叉区域、至少一个四环区域、至少一个吻合环区域、以及具有抗凝活性的至少一个核酸适体。
本公开的实施方案还包括用于调节凝固的系统。根据这些实施方案，该系统包括本文描述的单链核酸分子中的任何一者、以及能够结合至本文描述的单链核酸分子中的任何一者的至少一部分的至少一种单链核酸解毒剂，该至少一种单链核酸解毒剂抵消这些单链核酸分子的抗凝活性。
在一些实施方案中，该至少一种核酸解毒剂是DNA分子、RNA分子、O-甲基RNA分子、氟代修饰的RNA分子、PNA分子、LNA分子、或者其组合或衍生物。在一些实施方案中，该至少一种核酸解毒剂以反向互补方式结合至本文描述的单链核酸分子中的任何一者的至少一部分。在一些实施方案中，该至少一种核酸解毒剂结合至本文描述的单链核酸分子中的任何一者的至少一个核酸适体以抵消抗凝活性。
附图说明
图1包括抗凝药物所靶向的凝固级联和相应酶的示意图。凝血酶通过催化纤维蛋白原、上游凝固因子和血小板受体的切割，在凝固中起着重要的作用。凝血酶的催化活性位点和两个延伸表面(被称为外位点)参与大分子配体结合，并且可以使用基于化学制品和生物制品的分子来阻断，从而阻止凝固。对凝固级联中凝血酶活性的控制提供了治疗、手术和临床益处。
图2A至2E包括具有抗凝活性的基于核酸的适体的代表性描绘。图2A包括凝血酶的三级结构，包括外位点1和外位点2的位置。图2B至2E包括DNA适体和RNA适体的实例，这些适体由于它们对凝血酶活性的特异性抑制而被用作抗凝剂。RNAR9D-14T(图2B)和Toggle-25t(图2C)RNA适体分别结合至凝血酶的外位点1和外位点2。DNA适体NU172(图2D)和HD22(图2E)分别结合至凝血酶的外位点1和外位点2。
图3描绘了结合至凝血酶外位点2的Toggle-25t RNA适体的晶体结构。
图4是结合至凝血酶的RNA折纸(origami)的说明性图像(不按比例)。RNA折纸结构包含2-螺旋结构。
图5A至5B包括具有A型双螺旋结构(图5A)和180°吻合环(图5B)的RNA分子的代表性图像。
图6A至6B包括从较大结构提取之前(图6A)和之后(图6B)的四环的代表性图像。红色圆圈示出了较大结构内的四环。
图7A至7B包括在从较大结构提取之前(图7A)和之后(图7B)的外位点2凝血酶适体的代表性图像。红色圆圈示出了较大结构内的四环。
图8A至8B包括被对齐以形成交叉之后的双螺旋的代表性图像(图8A；顶部螺旋是螺旋1，并且底部螺旋是螺旋2)。在交叉定位处的磷酸原子和主链以及侧(糖/碱基)分别以红色和黄色鉴定。图8B包括所有基序与螺旋对齐的RNA结构的代表性侧视图。顶部左基序是RNA凝血酶适体。
图9是包括RNA适体的2-螺旋RNA折纸分子的连接结构的3D描绘。
图10是从2D模型转录至文本文件(底部)的RNA折纸分子(顶部)的代表性图形。
图11A至11B包括RNA折纸序列的代表性描述。图11A包括在通过跟踪脚本之后运行文本文件的该文本文件的代表性描绘；红色框突出显示可以提交至随后提供RNA序列的NUPACK的输出代码。图11B包括由NUPACK输出的RNA序列的代表性描述；还提供了NED(通常，具有最低NED的序列被选择成用于分析)。
图12A-12B包括不具有RNA适体的2-螺旋RNA折纸(2HO-RNA-NNNN)的3D图示(图12A)和2D带状模型(图12B)的代表性描绘。数字表示包括RNA折纸分子上的RNA适体的四个可能位置。四环以黄色框表示，并且吻合环以绿色框指示。
图13A至13D包括RNA折纸的四种设计的代表性2D模型，该RNA折纸包括两个适体。图13A描绘了2HO-RNA-NNNN(SEQ ID NO：1)；图13B描绘了2HO-RNA-12NN(SEQ ID NO：2)；图13C描绘了2HO-RNA-1N2N(SEQ ID NO：3)，以及图13D描绘了2HO-RNA-2NN1(SEQ ID NO：4)。
图14A至14C包括2HO-RNA-NNNN的代表性2D模型(A)以及通过(B)mfold和(C)NUPACK分析的RNA折叠的计算模拟。四环和吻合环分别以黄色框和绿色框指示。
图15A至15C包括2HO-RNA-12NN的代表性2D模型(A)以及通过(B)mfold和(C)NUPACK分析的RNA折叠的计算模拟。四环和吻合环分别以黄色框和绿色框指示。外位点1和2结合RNA适体分别以紫色和蓝色矩形表示。
图16A至16C包括2HO-RNA-1N2N的代表性2D模型(A)以及通过(B)mfold和(C)NUPACK分析的RNA折叠的计算模拟。四环和吻合环分别以黄色框和绿色框指示。外位点1和2结合RNA适体分别以紫色和蓝色矩形表示。
图17A至17C包括2HO-RNA-2NN1的代表性2D模型(A)以及通过(B)mfold和(C)NUPACK分析的RNA折叠的计算模拟。四环和吻合环分别以黄色框和绿色框指示。外位点1和2结合RNA适体分别以紫色和蓝色矩形表示。
图18包括使用以150V运行30分钟的1％琼脂糖凝胶来表征DNA模板扩增的代表性图像。1kb梯(泳道1和5)、2H-DNA-NNNN(泳道2)、2H-DNA-12NN(泳道3)、2H-DNA-1N2N(泳道4)和2H-DNA-2NN1(泳道6)。
图19包括使用和不使用新鲜DTT的转录之间的差异的代表性图像。新英格兰生物实验室(New England Biolabs)的天然T7 RNA聚合酶用于未修饰的RNA结构的转录。
图20包括在以20W运行1小时的6％变性丙烯酰胺凝胶上运行的RNA折纸的代表性图像。1kb梯(泳道1)、2HO-RNA-NNNN(泳道2)、2HF-RNA-NNNN(泳道3)、2HO-RNA-2NN1(泳道4)、2HF-RNA-2NN1(泳道5)、2HO-RNA-1N2N(泳道6)和2HF-RNA-1N2N(泳道7)。
图21包括在以20W运行1小时的6％变性丙烯酰胺凝胶上运行的RNA折纸的代表性图像。1kb梯(泳道1)；2HO-RNA-1N2N，279个核苷酸(泳道2)；2HO-RNA-NNNN，210个核苷酸(泳道3)；1kb梯(泳道4)；2HF-RNA-2NN1，285个核苷酸(泳道5)；2HF-RNA-1N2N，279个核苷酸(泳道6)；2HF-RNA-12NN，279个核苷酸(泳道7)；以及2HF-RNA-NNNN，210个核苷酸(泳道8)。
图22包括在以150V运行3小时的6％天然丙烯酰胺凝胶上运行的RNA折纸的代表性图像。DNA标记、GeneRuler超低范围DNA梯(GeneRuler Ultra Low Range DNALadder)(左泳道)和2HO-RNA-2NN1(右泳道)。
图23包括使用aPTT测定2′-氟代修饰的游离适体、未修饰的RNA折纸(2HO-RNA)、2′-氟代修饰的RNA折纸(2HF-RNA)和DNA编织片(weave tile)(2HT-DNA)的平均凝结时间进行比较的抗凝固试验的代表性结果。误差条为标准偏差(N＝3)。
图24包括RNA折纸-凝血酶复合物的丙烯酰胺凝胶电泳结果的代表性图像。核酸染色的凝胶(左)和蛋白质染色凝胶(右)。
图25包括通过凝胶电泳迁移率变动测定对RNA折纸中所包括的凝血酶适体与四种不同蛋白质进行的特异性试验的丙烯酰胺凝胶电泳结果的代表性图像。泳道1∶DNA标记；泳道2：2HF-RNA-NNNN；泳道3至6：分别与凝血酶、因子IXa、因子Xa、以及BSA孵育的2HF-RNA-NNNN。左凝胶是核酸染色的凝胶，并且右凝胶是蛋白质染色的凝胶。
图26包括RNA折纸中所包括的凝血酶适体与四种不同蛋白质的特异性试验的丙烯酰胺凝胶电泳结果的代表性图像。泳道1：DNA标记；泳道2：2HF-RNA-12NN；泳道3至6：分别与凝血酶、因子IXa、因子Xa、以及BSA孵育的2HF-RNA-12NN。左凝胶是核酸染色的凝胶，并且右凝胶是蛋白质染色的凝胶。
图27包括RNA折纸中所包括的凝血酶适体与四种不同蛋白质的特异性试验的丙烯酰胺凝胶电泳结果的代表性图像。泳道1：DNA标记；泳道2：2HF-RNA-1N2N；泳道3至6：分别与凝血酶、因子IXa、因子Xa、以及BSA孵育的2HF-RNA-1N2N。左凝胶是核酸染色的凝胶，并且右凝胶是蛋白质染色的凝胶。
图28包括RNA折纸中所包括的凝血酶适体与四种不同蛋白质的特异性试验的丙烯酰胺凝胶电泳结果的代表性图像。泳道1：DNA标记；泳道2：2HF-RNA-2NN1；泳道3至6：分别与凝血酶、因子IXa、因子Xa、以及BSA孵育的2HF-RNA-2NN1。左凝胶是核酸染色的凝胶，并且右凝胶是蛋白质染色凝胶。
图29包括DNA编织片中所包括的凝血酶DNA适体与凝血酶的结合测定的代表性结果。左凝胶是核酸染色的凝胶，并且右凝胶是蛋白质染色凝胶。
图30A至30B包括用10ug/ml核糖核酸酶A(RNase A)处理的修饰(A)和未修饰的(B)RNA折纸的稳定性试验的代表性结果。样本通过变性凝胶电泳来表征。
图31A至31B包括用高浓度核糖核酸酶A(500ug/ml)处理的修饰(A)和未修饰的RNA折纸(B)的稳定性试验的代表性结果。样本通过变性凝胶电泳来表征。
图32A至32B包括储存在人血浆中10分钟至24小时的修饰的RNA折纸(2HF-RNA-2NN1)的稳定性试验的代表性结果。修饰的RNA折纸(A)与人血浆在37℃下一起储存4小时。2HF-RNA-2NN1折纸(B)储存在人血浆中10分钟至最多24小时。对照是37℃下储存在1x缓冲液中24小时的2HF-RNA-2NN1。
图33包括37℃下储存在人血浆中10分钟至24小时的未修饰的RNA折纸(2HO-RNA-2NN1)的稳定性试验的代表性结果。
图34包括37℃下储存在人血浆中10分钟至24小时的DNA编织片(2HT-DNA-PNNB)的稳定性试验的代表性结果。
图35A至35C包括RNA折纸的四种设计的代表性2D模型，该RNA折纸包括在31个核苷酸的单链RNA接头上的两个适体(Fss12；A)。通过mfold RNA和NUPACK软件分析的RNA折纸折叠的计算分析(B至C)。紫色和蓝色矩形分别表示外位点1和外位点2结合适体。
图36A至36C包括RNA折纸的四种设计的代表性2D模型，该RNA折纸包括四个适体(2H-RNA-2211；A)。通过mfold RNA和NUPACK软件分析的RNA折纸折叠的计算分析(B至C)。紫色和蓝色矩形分别表示外位点1和外位点2结合适体，并且绿色矩形指示吻合环基序。
图37A至37C包括RNA折纸的四种设计的代表性2D模型，该RNA折纸包括两个适体和三个A型双螺旋结构(3H-RNA-2NN1；A)。通过mfold RNA和NUPACK软件分析的RNA折纸折叠的计算分析(B至C)。紫色和蓝色矩形分别表示外位点1和外位点2结合适体，并且黄色和绿色矩形分别指示四环和吻合环基序。
图38A至38C包括RNA折纸的四种设计的代表性2D模型，该RNA折纸包括两个适体和四个A型双螺旋结构(4H-RNA-2NN1；A)。通过mfold RNA和NUPACK软件分析的RNA折纸折叠的计算分析(B至C)。紫色和蓝色矩形分别表示外位点1和外位点2结合适体，并且黄色和绿色矩形分别指示四环和吻合环基序。
图39包括表征DNA模板扩增的代表性图像。泳道1和8：DNA标记；泳道2：Fss12：泳道3：2H-DNA-NNNN。泳道4：2H-DNA-2NN1；泳道5：2H-DNA-2211：泳道6：3H-DNA-2NN1；以及泳道7：4H-DNA-2NN1。
图40包括通过变性丙烯酰胺凝胶电泳表征RNA折纸的代表性图像。泳道1和8：ssRNA标记；泳道2：31个核苷酸连接的适体(Fss12)；泳道3：2HF-RNA-NNNN；泳道4：2HF-RNA-2NN1；泳道5：2HF-RNA-2211；泳道6：3HF-RNA-2NN1；泳道7：4HF-RNA-2NN1。
图41A至41D包括通过6％天然丙烯酰胺凝胶电泳表征RNA折纸的代表性图像，该RNA折纸带有与凝血酶结合的适体。在表征之前RNA折纸在37℃下与凝血酶一起孵育1小时(A)。(A)和(B)中的凝胶是相同的凝胶，并且以150V运行3小时。(C)和(D)中的凝胶是相同的凝胶，并且以150V运行6小时。核酸染色的凝胶，溴化乙锭(A和C)。蛋白质染色的凝胶，考马斯蓝(B和D)。负值和正值分别指示凝血酶的不存在和存在。
图42A至42B包括通过天然丙烯酰胺凝胶电泳对31个核苷酸连接的两个适体(Fss12)与四种不同蛋白质进行的特异性结合试验的代表性图像。泳道1：Fss12。泳道2：与凝血酶一起孵育的Fss12。泳道3：与因子IXa一起孵育的Fss12。泳道4：与因子Xa一起孵育的Fss12；以及泳道5：与BSA一起孵育的Fss12。6％天然PAGE凝胶以150运行3小时。核酸染色的凝胶，溴化乙锭(A)。蛋白质染色的凝胶，考马斯蓝(B)。(A)和(B)是相同的凝胶。
图43A至43B包括通过天然丙烯酰胺凝胶电泳对2HF-RNA-2211与四种不同蛋白质进行的特异性结合试验的代表性图像。泳道1：2HF-RNA-2211。泳道2：与凝血酶一起孵育的2HF-RNA-2211。泳道3：与因子IXa一起孵育的2HF-RNA-2NN1。泳道4：与因子Xa一起孵育的2HF-RNA-2211；以及泳道5：与BSA一起孵育的2HF-RNA-2211。6％天然PAGE凝胶以150运行3小时。核酸染色的凝胶，溴化乙锭(A)。蛋白质染色的凝胶，考马斯蓝(B)。(A和B)。(A)和(B)是相同的凝胶。
图44A至44B包括通过天然丙烯酰胺凝胶电泳对3HF-RNA-2NN1与四种不同蛋白质的特异性结合试验的代表性图像。泳道1：3HF-RNA-2NN1。泳道2：与凝血酶一起孵育的3HF-2NN1。泳道3：与因子IXa一起孵育的3HF-RNA-2NN1。泳道4：与因子Xa一起孵育的3HF-RNA-2NN1；以及泳道5：与BSA一起孵育的3HF-RNA-2NN1。6％天然PAGE凝胶以150运行6小时。核酸染色的凝胶，溴化乙锭(A)。蛋白质染色的凝胶，考马斯蓝(B)。(A)和(B)是相同的凝胶。
图45A至45B包括通过天然丙烯酰胺凝胶电泳对4HF-RNA-2NN1与四种不同蛋白质进行的特异性结合试验的代表性图像。泳道1：2HF-RNA-4NN1。泳道2：与凝血酶一起孵育的4HF-RNA-2NN1。泳道3：与因子IXa一起孵育的4HF-RNA-2NN1。泳道4：与因子Xa一起孵育的2HF-RNA-4NN1；以及泳道5：与BSA一起孵育的4HF-RNA-2NN1。6％天然PAGE凝胶以150运行6小时。核酸染色的凝胶，溴化乙锭(A)。蛋白质染色的凝胶，考马斯蓝(B)。(A)和(B)是相同的凝胶。
图46包括对RNA折纸的长期储存进行试验的代表性结果。将新鲜制备的2HF-RNA-2NN1样本的平均抗凝活性与在4℃下储存最多达90天的样本进行比较。结果表明，在4℃下储存之后，RNA折纸抗凝剂至少稳定3个月并且是有活性的。
图47包括通过aPTT测定对游离适体、ssRNA连接的适体、以及包括适体的RNA折纸的抗凝活性进行试验的代表性结果。除2HF-RNA-2211之外，抗凝剂的所有设计的最终浓度均为500nM。2HF-RNA-2211的最终浓度为400nM。结果表明，与ssRNA连接的2个适体(Fss12)的抗凝活性高于游离适体和游离适体的混合物。另外，RNA折纸(2HF-RNA-2NN1)上包括的两个适体的抗凝活性大于ssRNA连接的适体(Fss12)。进一步地，包括四个适体的RNA折纸(2HF-RNA-2211)表现出最高的抗凝活性(是2HF-RNA-2NN1活性的两倍以上)。
图48包括对包括两个RNA适体的RNA折纸(2HF-RNA-2NN1)和包括四个RNA适体的RNA折纸(2HF-RNA-2211)的浓度依赖性凝结时间进行试验的代表性结果。对于浓度为400nM的2HF-RNA-2211，凝结时间达到最大极限(使用血凝仪测量的999秒)。令人惊讶地，2HF-RNA-2211(4个适体)的抗凝活性是2HF-RNA-2NN1(2个适体)的抗凝活性的两倍以上。
图49包括对包括两个RNA适体(2NN1)和2(2HF)个、3(3HF)个或4(4HF)个螺旋结构的RNA折纸的抗凝活性进行试验的代表性结果。结果指示，包括两个RNA适体的2HF、3HF和4HF RNA折纸均表现出抗凝活性。
图50A至50B包括凝血酶抑制的逆转的代表性结果。示出了凝结时间(A)抗凝活性(B)。
图51包括通过添加DNA或PNA解毒剂对凝血酶活性的逆转进行试验的代表性结果。将2HF-2NN1折纸抗凝剂的抗凝活性用作对照样本。将DNA或PNA解毒剂(9当量)与RNA折纸一起孵育。PNA解毒剂的抑制活性高于DNA解毒剂。
具体实施方式
本公开的实施方案提供基于核酸的抗凝剂，其将RNA适体与RNA折纸结构进行组合，该RNA折纸结构是作为2’-氟代修饰的转录物而产生的。本文公开的新型抗凝剂已经展示出比游离适体高许多倍的活性。单分子构建体用作手术抗凝剂是有利的，并且具有足够高的分子量以大大降低快速的肾清除率。与目前使用的小分子血液稀释剂相比，本文公开的核酸抗凝剂将具有较少的严重副作用。另外，本公开的实施方案包括抵消抗凝活性的由互补DNA制成的核酸解毒剂。
核酸治疗剂表示目前药物抗凝剂的替代解决方案(图2A至2E和图3)。DNA和RNA适体可以采用结合至特异性靶分子的结构，并且已经被开发成结合至凝血酶并使凝固级联中断。它们的优点包括：使副作用最小化的较大生物相容性、较大的治疗窗口、以及解毒剂的可用性。解毒剂包含与适体互补的可以使该适体展开的天然核酸(DNA/RNA)或非天然核酸(如PNA)。这为需要快速且稳健抗凝固的临床应用带来了优势。然而，这些适体由于尺寸小(小于30KDa)而表现出较差的药物代谢动力学；它们在循环后很快被肾清除，并且因此需要更浓缩的剂量才能有效。
本公开的实施方案包括可以结合至凝血酶并防止凝固的新型功能性RNA折纸(图4)。在一个实施方案中，将两个适体安置在RNA折纸上，以便通过增加RNA适体的局部浓度来增加结合亲和力并减少必需剂量。RNA的生物相容性质和解毒剂的可用性可以相似地允许精确治疗，同时使负面副作用最小化。由于分子量较高(例如，超过80kDa)，因此RNA折纸在人体中的循环长于游离适体。本公开的RNA折纸抗凝组合物和系统通过提供副作用较少的更可控解决方案，为目前的临床抗凝剂提供可行的替代方案。
如本章节中使用的章节标题以及本文中的全部公开内容仅用于组织目的，并且不旨在是限制性的。
1.定义
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同含义。在冲突的情况下，以本文献(包括定义)为准。尽管与本文描述的那些方法和材料相似或等效的方法和材料可以用于本公开的实践或试验，但是优选的方法和材料在下文中进行描述。本文提及的所有公开出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用整体并入本文。本文公开的材料、方法和实例仅是说明性的，并且不旨在是限制性的。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”、“可以”、“含有”及其变体旨在是不排除另外的行为或结构可能性的、开放式的过渡性短语、术语或单词。除非上下文清楚地另有指示，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数引用。无论是否明确地阐述，本公开还考虑了“包含”本文呈现的实施方案或元件、“由其组成”和“基本上由其组成”的其它实施方案。
为了表述本文中的数值范围，明确地考虑了该数值范围之间的具有相同精确度的每个居间数值。例如，对于6至9的范围，除了6和9之外，还考虑了数值7和8，并且对于范围6.0至7.0，明确地考虑了数值6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。
为了表述本文中的数值范围，明确地考虑了该数值范围之间的具有相同精确度的每个居间数值。例如，对于6至9的范围，除了6和9之外，还考虑了数值7和8，并且对于范围6.0至7.0，明确地考虑了数值6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。
如本文所用，“与......相关(conrrelated to)”是指与......相比。
术语“适体”通常是指单一定义序列的寡核苷酸或所述寡核苷酸的混合物，其中该混合物保留特异性地结合至靶分子的特性。因此，如本文所用，“适体”表示寡核苷酸的单数序列和复数序列二者。术语“适体”通常是指能够结合至蛋白质或其它分子并由此干扰蛋白质或其它分子的功能的单链或双链核酸。
术语“单链”寡核苷酸通常是指含有单一共价连接的一系列核苷酸残基的寡核苷酸。
术语“寡聚物”或“寡核苷酸”包括呈单链或双链体形式的一个以上核苷酸的RNA或DNA序列，并且具体包括呈单链或双链体形式的短序列(如二聚体和三聚体)，该短序列可以是产生特异性结合寡核苷酸中的中间体。候选池中使用的“修饰”形式含有至少一个非天然残基。“寡核苷酸”或“寡聚体”一般是指：多脱氧核糖核苷酸(含有2′-脱氧-D-核糖或其修饰形式)，如DNA；多核糖核苷酸(含有D-核糖或其修饰形式)，如RNA；以及任何其它类型的多核苷酸，其为嘌呤或嘧啶碱基、或修饰的嘌呤或嘧啶碱基或脱碱基核苷酸的N-糖苷或C-糖苷。“寡核苷酸”或“寡聚物”还可以用于描述与RNA和DNA相似的人工合成聚合物，包括但不限于肽核酸(PNA)的寡聚物。
“RNA适体”是包含核糖核苷单位的适体。“RNA适体”也意味着涵盖如本文所公开的RNA类似物。
术语“凝固因子”通常是指在固有的(intrinsic)和非固有的(extrinsic)凝固级联中的任一者或二者中起作用的因子。
术语“RNA类似物”或“RNA衍生物”或“修饰的RNA”通常是指聚合分子，其除了含有核糖核苷作为其单位之外，还包含以下各者中的至少一者：2′-脱氧；2′-卤代(包括2′-氟代)；2′-氨基(优选未取代或单取代或二取代)；2′-单、二或三卤代甲基；2′-O-烷基；2′--O-卤代-取代烷基；2′-烷基；叠氮基；硫代磷酸；巯基；甲基膦酸酯；荧光素；罗丹明；嵌二萘；生物素；黄嘌呤；次黄嘌呤；2，6-二氨基嘌呤；在6位置处被硫取代的或在5位置处被卤代或C1-5烷基基团取代的2-羟基-6-巯基嘌呤和嘧啶碱基；碱性接头；3′-脱氧腺苷以及其它可用的“链终止剂”或“不可延伸的”类似物(在RNA的3′-端处)；或标记物(如32P、33P等)。可以使用本文公开的标准合成技术将所有前述各者掺入至RNA中。
术语“结合活性”和“结合亲和力”通常是指配体分子结合至或不结合至靶标的趋势。这些相互作用的能量学在“结合活性”和“结合亲和力”方面具有重要意义，因为它们可以包括相互作用配偶体的浓度、这些配偶体能够缔和的速率以及溶液中结合分子和游离分子的相对浓度的定义。
“序列同一性”是指两个聚合物序列(例如，肽、多肽、核酸等)具有相同顺序组合的单体亚单位。术语“序列相似性”是指两个聚合物序列(例如，肽、多肽、核酸等)具有相似聚合物序列的程度。例如，相似的氨基酸是共享相同生物物理特征并且可以被分组成例如以下家族的那些氨基酸：酸性(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、碱性(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、以及无电荷极性(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)。“百分比序列同一性”(或“百分比序列相似性”)通过以下各项计算：(1)在比较窗口(例如，较长序列的长度、较短序列的长度、指定的窗口)上对两个最佳对齐序列进行比较；(2)确定含有相同(或相似)单体(例如，两个序列中都出现相同的氨基酸、两个序列中都出现相似的氨基酸)的位置的数目，以得到匹配位置的数目；(3)用匹配位置的数目除以比较窗口(例如，较长序列的长度、较短序列的长度、指定的窗口)中的位置的总数目；以及(4)将结果乘以100，以得到百分比序列同一性或百分比序列相似性。例如，如果肽A和肽B的长度均为20个氨基酸，并且除了1位置处以外的所有位置处的氨基酸均相同，则肽A和肽B具有95％序列同一性。如果不同位置处的氨基酸共享相同生物物理特征(例如，二者均为酸性)，则肽A和肽B将会具有100％序列相似性。作为另一实例，如果肽C的长度为20个氨基酸并且肽D的长度为15个氨基酸，并且肽D的15个氨基酸中有14个与肽C的一部分中的那些氨基酸相同，则肽C和D具有70％序列同一性，但肽D与肽C的最佳比较窗口具有93.3％序列同一性。出于计算本文中的“百分比序列同一性”(或“百分比序列相似性”)的目的，对齐序列中的任何缺口被视为在该位置处不匹配。
本公开的实施方案提供单链核酸分子，该单链核酸分子具有A型双螺旋结构以及至少一个交叉区域、至少一个吻合环区域、以及具有抗凝活性的至少一个核酸适体。根据这些实施方案，单链核酸分子可以是DNA分子或RNA分子、或者其任何衍生物或组合。
在一些实施方案中，该单链核酸分子可以是包括具有2′-修饰的至少一个核苷的RNA分子。在一些实施方案中，本公开的单链RNA折纸分子可以包括具有2′-修饰(如2′-氨基或2′-O-甲基)或主链磷酸基团(如硫代磷酸)化学修饰的至少一个2′-氟代-dCTP或2′-氟代-dUTP或一个其它核苷。
在一些实施方案中，该单链核酸分子包括包含四核苷酸基序的至少一个四环区域。在一些实施方案中，该单链核酸分子包括一至三个四环区域，每个四环区域都包含四核苷酸基序。在一些实施方案中，该单链核酸分子包括具有抗凝活性的一至四个适体。根据这些实施方案，该一至四个适体中的每一者替代该至少一个四环区域中的一者。在一些实施方案中，该单链核酸分子不包括四环区域。
在一些实施方案中，该单链核酸分子包括至少一个吻合环区域，该至少一个吻合环区域为180°吻合环区域。在一些实施方案中，该单链核酸分子包括一个180°吻合环区域。在一些实施方案中，该单链核酸分子不包括吻合环区域。
在一些实施方案中，该单链核酸分子包括单链RNA接头区域。在一些实施方案中，核酸适体可以连接至单链RNA接头区域的一端或两端。在一些实施方案中，该单链核酸分子不包括吻合环区域或四环区域。
在一些实施方案中，该单链核酸分子包括至少一个螺旋结构(例如，A型双螺旋结构)。在一些实施方案中，该单链核酸分子包括至少两个螺旋结构。在一些实施方案中，该单链核酸分子包括至少三个螺旋结构。在一些实施方案中，该单链核酸分子包括至少四个螺旋结构。在一些实施方案中，该单链核酸分子包括五个或更多个螺旋结构。在一些实施方案中，该单链核酸分子包括将两个或更多个核酸适体分离的至少一个螺旋结构。在一些实施方案中，将两个或更多个核酸适体分离的至少一个螺旋结构包括至少一个核酸适体。在一些实施方案中，将两个或更多个核酸适体分离的至少一个螺旋结构不包括核酸适体。
在一些实施方案中，该核酸分子是与SEQ ID NO：1具有至少80％序列同一性的RNA分子。在一些实施方案中，该核酸分子是与SEQ ID NO：1具有至少85％序列同一性的RNA分子。在一些实施方案中，该核酸分子是与SEQ ID NO：1具有至少90％序列同一性的RNA分子。在一些实施方案中，该核酸分子是与SEQ ID NO：1具有至少95％序列同一性的RNA分子。在一些实施方案中，该核酸分子是与SEQ ID NO：1具有至少96％序列同一性的RNA分子。在一些实施方案中，该核酸分子是与SEQ ID NO：1具有至少97％序列同一性的RNA分子。在一些实施方案中，该核酸分子是与SEQ ID NO：1具有至少98％序列同一性的RNA分子。在一些实施方案中，该核酸分子是与SEQ ID NO：1具有至少99％序列同一性的RNA分子。
在一些实施方案中，该至少一个核酸适体的抗凝活性包括对因子XIIa、因子XIIIa、因子XIa、因子IXa、因子Xa和von Willebrand因子中的一者或多者的抑制。在一些实施方案中，可以包括在本文公开的RNA折纸分子中的核酸适体包括参与调节血液凝固的任何适体，包括但不限于：ARC183/HD1(靶向FIIa)；HD22(靶向FIIa)；HD1-22(靶向FIIa)；Tog25(靶向FII)；R9d14t(靶向FII/FIIa)；11F7t(靶向FXa)；16.3(靶向FVIIa)；7S-1/7S-2(靶向FVII)；9.3t(靶向FIXa)；R4cXII-1(靶向FXII/FXIIa)；NU172(靶向凝血酶)；REG1(靶向FIX/FIXa)；REG2(靶向FIX/FIXa)；ARC1779(靶向von Willebrand因子)；以及ARC19499(靶向TFPI)。
在一些实施方案中，该至少一个核酸适体的抗凝活性包含凝血酶抑制。在一些实施方案中，该至少一个核酸适体包含抗凝血酶RNAR9D-14T适体或其衍生物。在一些实施方案中，该至少一个核酸适体包含抗凝血酶Toggle-25tRNA适体或其衍生物。在一些实施方案中，该能够结合凝血酶外位点1的核酸适体是RNAR9D-14T适体或其衍生物。在一些实施方案中，该能够结合凝血酶外位点2的核酸适体是Toggle-25t RNA适体或其衍生物。
在一些实施方案中，该核酸分子是包含约100至约1000个核苷酸的RNA分子。在一些实施方案中，该核酸分子是包含约100至约900个核苷酸的RNA分子。在一些实施方案中，该核酸分子是包含约100至约800个核苷酸的RNA分子。在一些实施方案中，该核酸分子是包含约100至约700个核苷酸的RNA分子。在一些实施方案中，该核酸分子是包含约100至约600个核苷酸的RNA分子。在一些实施方案中，该核酸分子是包含约100至约500个核苷酸的RNA分子。在一些实施方案中，该核酸分子是包含约100至约400个核苷酸的RNA分子。在一些实施方案中，该核酸分子是包含约100至约300个核苷酸的RNA分子。在一些实施方案中，该核酸分子是包含约150至约600个核苷酸的RNA分子。在一些实施方案中，该核酸分子是包含约150至约500个核苷酸的RNA分子。在一些实施方案中，该核酸分子是包含约150至约400个核苷酸的RNA分子。在一些实施方案中，该核酸分子是包含约150至约300个核苷酸的RNA分子。在一些实施方案中，该核酸分子是包含约200至约600个核苷酸的RNA分子。在一些实施方案中，该核酸分子是包含约225至约600个核苷酸的RNA分子。在一些实施方案中，该核酸分子是包含约250至约600个核苷酸的RNA分子。在一些实施方案中，该核酸分子是包含约200至约500个核苷酸的RNA分子。在一些实施方案中，该核酸分子是包含约200至约450个核苷酸的RNA分子。在一些实施方案中，该核酸分子是包含约200至约400个核苷酸的RNA分子。在一些实施方案中，该核酸分子是包含约200至约350个核苷酸的RNA分子。
在一些实施方案中，该单链核酸分子是包含能够结合凝血酶外位点1的核酸适体和能够结合凝血酶外位点2的核酸适体的RNA分子，其中该能够结合凝血酶外位点1的核酸适体替代该RNA分子的四环区域1，并且该能够结合凝血酶外位点2的核酸适体替代该RNA分子的四环区域2(2HO-RNA-12NN或2HF-RNA-12NN)。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ IDNO：2具有80％序列同一性。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：2具有至少85％序列同一性。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：2具有至少90％序列同一性。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：2具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：2具有至少96％序列同一性。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ IDNO：2具有至少97％序列同一性。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：2具有至少98％序列同一性。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：2具有至少99％序列同一性。
在一些实施方案中，该单链核酸分子是包含能够结合凝血酶外位点1的核酸适体和能够结合凝血酶外位点2的核酸适体的RNA分子，其中该能够结合凝血酶外位点1的核酸适体替代该RNA分子的四环区域1，并且该能够结合凝血酶外位点2的核酸适体替代该RNA分子的四环区域3(2HO-RNA-1N2N或2HF-RNA-1N2N)。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ IDNO：3具有80％序列同一性。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：3具有至少85％序列同一性。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：3具有至少90％序列同一性。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：3具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：3具有至少96％序列同一性。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ IDNO：3具有至少97％序列同一性。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：3具有至少98％序列同一性。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：3具有至少99％序列同一性。
在一些实施方案中，该单链核酸分子是包含能够结合凝血酶外位点2的核酸适体和能够结合凝血酶外位点1的核酸适体的RNA分子，其中该能够结合凝血酶外位点2的核酸适体替代该RNA分子的四环区域1，并且该能够结合凝血酶外位点1的核酸适体替代该RNA分子的四环区域4(2HO-RNA-2NN1或2HF-RNA-2NN1)。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ IDNO：4具有80％序列同一性。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：4具有至少85％序列同一性。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：4具有至少90％序列同一性。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：4具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：4具有至少96％序列同一性。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ IDNO：4具有至少97％序列同一性。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：4具有至少98％序列同一性。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：4具有至少99％序列同一性。
在一些实施方案中，该单链核酸分子是包含连接至单链RNA接头一端的能够结合凝血酶外位点2的核酸适体和连接至单链RNA接头另一端的能够结合凝血酶外位点1的核酸适体的RNA分子(Fss12)。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：5具有80％序列同一性。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：5具有至少85％序列同一性。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：5具有至少90％序列同一性。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：5具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：5具有至少96％序列同一性。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：5具有至少97％序列同一性。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：5具有至少98％序列同一性。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：5具有至少99％序列同一性。
在一些实施方案中，该单链核酸分子是包含能够结合凝血酶外位点2的两个核酸适体和能够结合凝血酶外位点1的两个核酸适体的RNA分子，其中该能够结合凝血酶外位点2的两个核酸适体各自分别替代该RNA分子的四环区域1和2，并且该能够结合凝血酶外位点1的两个核酸适体各自分别替代该RNA分子的四环区域3和4(2H-2211)。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：6具有80％序列同一性。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ IDNO：6具有至少85％序列同一性。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：6具有至少90％序列同一性。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：6具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：6具有至少96％序列同一性。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：6具有至少97％序列同一性。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：6具有至少98％序列同一性。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：6具有至少99％序列同一性。
在一些实施方案中，该单链核酸分子是包含能够结合凝血酶外位点2的核酸适体、能够结合凝血酶外位点1的核酸适体、以及A型双螺旋结构的RNA分子，其中该能够结合凝血酶外位点2的核酸适体替代该RNA分子的四环区域1，该能够结合凝血酶外位点1的核酸适体替代该RNA分子的四环区域4，并且该A型双螺旋结构将该能够结合凝血酶外位点2的核酸适体与该能够结合凝血酶外位点1的核酸适体分离(3H-2NN1)。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：7具有80％序列同一性。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：7具有至少85％序列同一性。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：7具有至少90％序列同一性。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：7具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：7具有至少96％序列同一性。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：7具有至少97％序列同一性。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：7具有至少98％序列同一性。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：7具有至少99％序列同一性。
在一些实施方案中，该单链核酸分子是包含能够结合凝血酶外位点2的核酸适体、能够结合凝血酶外位点1的核酸适体、以及两个A型双螺旋结构的RNA分子，其中该能够结合凝血酶外位点2的核酸适体替代该RNA分子的四环区域1，该能够结合凝血酶外位点1的核酸适体替代该RNA分子的四环区域4，并且该两个A型双螺旋结构将该能够结合凝血酶外位点2的核酸适体与该能够结合凝血酶外位点1的核酸适体分离(4H-2NN1)。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：8具有80％序列同一性。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ IDNO：8具有至少85％序列同一性。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：8具有至少90％序列同一性。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：8具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：8具有至少96％序列同一性。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：8具有至少97％序列同一性。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：8具有至少98％序列同一性。在一些实施方案中，该RNA分子与SEQ ID NO：8具有至少99％序列同一性。
本公开的实施方案还包括对本文描述的单链核酸分子中的任何一者进行编码的DNA分子。如本领域普通技术人员基于本公开将认识到的，对本文描述的单链核酸分子中的任何一者进行编码的DNA分子可以是单链的或双链的，并且可以充当用于生成本文描述的单链核酸分子中的任何一者的模板。DNA模板可以是用于体内和/或体外生物化学反应的表达质粒或其它构建体的一部分。
本公开的实施方案还包括抗凝组合物。根据这些实施方案，该组合物包括单链核酸分子以及药学上可接受的赋形剂、溶剂、载体或稀释剂，该单链核酸分子包含A型双螺旋结构和至少一个交叉区域、至少一个吻合环区域、以及具有抗凝血活性的至少一个核酸适体。在一些实施方案中，该单链核酸分子另外包含至少一个四环区域。如本领域普通技术人员基于本公开将认识到的，可以根据治疗方案将该组合物给药至受试者或患者，以在外科操作的背景下调节血液凝固和/或治疗疾病状况。
本公开的实施方案还包括用于调节凝固的系统。根据这些实施方案，该系统包括本文描述的单链核酸分子中的任何一者、以及能够结合至本文描述的单链核酸分子中的任何一者的至少一部分的至少一种单链核酸解毒剂，该至少一种单链核酸解毒剂抵消这些单链核酸分子的抗凝活性。如本领域普通技术人员基于本公开将认识到的，可以根据治疗方案将该系统用于治疗受试者或患者，以在外科操作的背景下调节血液凝固和/或治疗疾病状况。
在一些实施方案中，该至少一种核酸解毒剂是DNA分子、RNA分子、O-甲基RNA分子、氟代修饰的RNA分子、PNA分子、LNA分子、或者其组合或衍生物。在一些实施方案中，该至少一种核酸解毒剂以反向互补方式结合至本文描述的单链核酸分子中的任何一者的至少一部分。在一些实施方案中，该至少一种核酸解毒剂结合至本文描述的单链核酸分子中的任何一者的至少一个核酸适体以抵消抗凝活性。
除非本文另有定义，否则与本公开结合使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。例如，与本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学、蛋白质和核酸化学、以及杂交结合使用的任何术语和技术都是本领域众所周知和常用的那些术语和技术。术语的含义和范围应该是清楚的；然而，如果存在任何潜在的歧义，则本文提供的定义优先于任何词典或外在定义。进一步地，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数术语，并且复数术语应包括单数术语。
2.设计和方法
本公开的实施方案包括用于设计和生成单链核酸分子的方法，该单链核酸分子包含具有例如但不限于抗凝活性等各种治疗性功能的核酸适体。在一些实施方案中，本公开的单链核酸分子包括RNA分子(RNA折纸)，其包括具有抗凝活性的核酸适体。根据这些实施方案，本公开提供用于设计RNA折纸的一般步骤，其包括：(i)创建3D模型，(ii)转换至2D模型，(iii)从2D模型产生文本文件设计，以及(iv)分析RNA序列。
在RNA折纸设计的一些实施方案中，使用RNA双螺旋的A型(图5A至5B)。螺旋的几何形状有助于确定在何处放置双交叉。该设计可以使用多个基序。例如，吻合环基序的使用可以允许多螺旋结构按单链路径分布。在一些实施方案中，可以使用180°吻合环。另外，可以使用四环基序；四环是给结构的端部加帽的小四核苷酸基序。四环的存在可以起到使RNA分子的总体结构稳定的作用。
根据本文描述的方法，可以创建RNA折纸分子的3D模型。例如，创建2-螺旋RNA折纸结构并且包括凝血酶RNA适体。可以使用生物信息学软件来生成文件以用于基序中的每一者，包括但不限于RNA双螺旋、四环、180°吻合环和RNA凝血酶适体。通常，首先生成对应于A型RNA双螺旋的文件，因为其是所有其它基序的基础。接下来，添加对应于180°吻合环(图5B)的文件，随后添加对应于四环的文件，在一些情况下，可以从较大的文件中提取该对应于四环的文件(图6A至6B)。最后，添加对应于外位点1和外位点2RNA适体的文件；再者，在一些情况下，可以从较大的源中提取这些文件(图7A至7B)。
一旦已经获得所有基序文件，就可以使用如Chimera(cgl.ucsf.edu/chimera)等程序对它们进行组装并对齐。例如，可以对两个A型RNA螺旋进行对齐，如图8A所示。接下来，可以如用可替代的着色对将在其中定位交叉的核苷酸进行鉴定，这促进对交叉要被放置的地点的可视化。在对齐RNA螺旋之后，可以将包括四环、吻合环和RNA适体的所有基序插入至对齐面板中(图8B)。接下来的步骤涉及将该结构转换成单链结构，这可以使用各种生物信息学软件(例如，andersen-lab.dk)来进行，如图9所示。
本公开的方法还包括使用上文描述的文件和适当的软件程序(例如，Assemble2软件)将RNA折纸分子的3D模型转换成2D模型，如图10所示。然后，将2D模型转录成文本文件或相似格式。为了生成单链RNA折纸分子的核苷酸序列，使用适当的软件(例如，NUPACK.org)，并且然后将2D试验文件运行通过跟踪脚本(例如Anderson-lab.dk)。跟踪脚本的输出代码示出在图11A中，并且所生成的输出RNA序列示出在图11B中。
本公开的方法还包括对由软件(例如，NUPACK)生成的RNA序列进行分析。为了对RNA折纸分子的合适折叠进行试验，使用NUPACK和mfold。可以对序列进行分析，以选择确保合适序列折叠的最佳序列。例如，具有合适折叠的序列通常是一种具有低ΔG、小于65％的GC％、以及低标准集成缺陷(normalized ensemble defect，NED)的序列。序列具有越少的二级结构，则它越有可能合适地折叠。为了优化序列，可以进行序列的手动编辑，包括但不限于改变G-C碱基配对的位置以便去除不希望有的结构。
本公开的实施方案还包括用于将核酸适体包括在单链核酸折纸分子中的设计和方法。可以包括在本公开的单链RNA折纸分子中的核酸适体可以由RNA、DNA、PNA或其任何衍生物制成。例如，如本文进一步所描述的，RNA折纸分子可以包括一个或多个核酸适体，如特异性地结合至参与血液凝固的蛋白质并且对其进行调节的RNA适体。在一些实施方案中，该RNA适体通过对一种或多种凝固蛋白进行抑制而表现出抗凝活性，该一种或多种凝固蛋白包括但不限于凝血酶、因子XIIa、因子XIIIa、因子XIa、因子IXa、因子Xa和von Willebrand因子中的一者或多者。在一些实施方案中，该RNA适体表现出防止血液凝固并预防如血栓形成等症状的抗凝血酶活性。在一些实施方案中，包括在本公开的单链RNA折纸分子中的抗凝血酶RNA适体是结合外位点1处的凝血酶原和凝血酶的RNAR9D-14T适体(下文中的(A))以及结合凝血酶外位点2的Toggle-25适体(下文中的B))。
Figure BDA0003039663390000231
可以包括在本文公开的RNA折纸分子中的其它核酸适体包括参与调节血液凝固的任何适体，包括但不限于：ARC183/HD1(靶向FIIa)；HD22(靶向FIIa)；HD1-22(靶向FIIa)；Tog25(靶向FII)；R9d14t(靶向FII/FIIa)；11F7t(靶向FXa)；16.3(靶向FVIIa)；7S-1/7S-2(靶向FVII)；9.3t(靶向FIXa)；R4cXII-1(靶向FXII/FXIIa)；NU172(靶向凝血酶)；REG1(靶向FIX/FIXa)；REG2(靶向FIX/FIXa)；ARC1779(靶向von Willebrand因子)；以及ARC19499(靶向TFPI)。
为了改善和优化抗凝活性，将一至四个适体包括在四个不同位置处的RNA折纸分子中。例如，双螺旋RNA折纸(2HO-RNA-XXXX)为RNA适体提供四个可能的位置，每个四环处一个适体，如图12A至12B所示。
在一些实施方案中，确定的是，包括在RNA折纸分子中的双RNA适体的结合活性至少部分地取决于两个适体之间的距离以及RNA折纸上的不同位置处的每个适体的灵活性。根据这些实施方案，通过将RNA适体包括在RNA折纸中而设计出该RNA适体的四种构型，如图13A至13D所示。出于命名的目的，在所使用的特定RNA折纸之后添加四位数，例如2HO-RNA-XXXX(无适体；SEQ ID NO：1)。取决于适体和放置位置，X可以由对应于特定适体的数字或字母替代。例如，外位点1结合RNA适体和外位点2结合RNA适体分别称为“1”和“2”。(将无适体定义为“N”。)因此，2HO-RNA-1N2N是指放置在2-螺旋RNA折纸上的位置1处的外位点1结合适体以及栓系在该折纸上的位置3处的外位点2结合适体2。所有四种设计描绘在图13A至13D中。在随后的实验中，将2HO-RNA-NNNN分子用作阴性对照。
使用在线软件(mfold；参见unafold.rna.albany.edu)和NUPACK(参见nupack.org)对这些RNA折纸结构的折叠进行计算分析，如图14至17所示。在模拟中未示出吻合环形成。
根据这些实施方案，不具有适体的单链RNA折纸结构的长度为约200个核苷酸，并且当将两个适体包括在RNA折纸中时，其长度为约500个核苷酸。如本领域普通技术人员基于本公开将认识到的，具有或不具有适体的单链RNA分子可以化学地、酶促地或使用基于细胞的技术进行合成。例如，T7RNA聚合酶可以用于经由体外和体内转录的RNA产生。在一些实施方案中，可以将双链DNA用作模板。例如，DNA模板可以被工程化改造成含有RNA折纸的蓝图(Blueprint)以及位于序列的5′端处的T7启动子。
在一些实施方案中，可以生成修饰的和未修饰的RNA折纸结构二者。例如，本公开的单链RNA折纸分子可以包括具有2′-修饰的至少一个核苷。在一些实施方案中，本公开的单链RNA折纸分子可以包括具有2′-修饰(如2′-氨基或2′-O-甲基)或主链磷酸基团(如硫代磷酸)化学修饰的至少一个2′-氟代-dCTP或2′-氟代-dUTP或一个其它核苷。
上文描述的设计和方法可应用于本文描述的所有核酸分子的构建，包括实例和附图中所体现的那些。如本领域普通技术人员基于本公开将认识到的，上文描述的设计和方法还可以用于例如相对于期望的功能(例如，抗凝血酶活性)生成本文描述的核酸分子的变化。
3.实施例
对于本领域技术人员将显而易见的是，本文描述的本公开方法的其它适合的修改和改编是可容易地应用和理解的，并且可以在不脱离本公开的范围或本文公开的方面和实例的情况下使用适合的等效物来实现。现在已经详细描述了本公开，通过参考以下实例将更清楚地理解本公开，这些实例仅旨在说明本公开的一些方面和实施方案，并且不应被视为限制本公开的范围。本文涉及的所有期刊参考文献、美国专利和公开出版物的公开内容在此通过引用整体并入。
本公开具有多个方面，由以下非限制性实例进行说明。
实施例1
通过聚合酶链反应(PCR)扩增从G-block模板化的DNA。扩增DNA序列并且将其用于转录。每个序列是双链DNA，并且每个具有不同的适体放置，如图12至17和图35至39所示。将不具有适体的序列用作阴性对照。通过PCR从G-block扩增DNA模板，以用于体外产生。所有DNA序列均以高产率成功地扩增，以用于转录。图18和图39示出了用于所有扩增的DNA序列的具有恰当尺寸清晰条带的1％琼脂糖凝胶。在进行纯化之后，每次扩增通常产生大约30至60ng/ul的DNA。
从扩增的DNA产生RNA折纸。然后通过转录产生RNA折纸。产生两种类型的RNA折纸：(i)非修饰的RNA折纸和(ii)修饰的RNA折纸。为了产生修饰的RNA折纸，用常规CTP和UTP替换2′-氟代-dCTP和-dUTP，并且使用突变T7 RNA聚合酶(Y639F)代替天然T7聚合酶。使用和不使用DTT转录的RNA中的差异可以在图19中看到。此后，将DTT添加至每个转录反应。
基于尺寸的RNA折纸结构的分析。产生非修饰的RNA和修饰的RNA。除了2H-12NN以外，将所有DNA序列转录成修饰的和未修饰的RNA。对于具有各种适体放置的未修饰的两螺旋RNA，将该RNA标记为“2HO-RNA-XXXX”，并且对于具有各种适体放置的修饰的两螺旋RNA，标记为“2HF-RNA-XXXX”。结合至外位点1和2的RNA适体分别标记为“1”和“2”。图20示出了运行通过以20W持续1小时的6％变性丙烯酰胺凝胶的NNNN、2NN1和1N2N序列的修饰和未修饰的RNA条带。图21示出了NNNN和1N2N的未修饰的转录以及所有四个序列的修饰的转录。与图20相比，将少量的RNA添加至图21的凝胶中，以便实现更清晰可辨的单一条带。在热退火之后，运行天然凝胶以表征折叠的结构。图22示出了6％天然丙烯酰胺凝胶与2HO-RNA-2NN1热退火样本和1kb DNA梯在150V下运行3小时的实例。
还进行实验以表征图35至38中所体现的核酸构建体。图35A至35C包括31个核苷酸的单链RNA接头中包括的两个适体的代表性2D模型(Fss12；图35A)。图36A至36C包括RNA折纸的代表性2D模型(2H-RNA-2211；图36A)，该RNA折纸包括四个适体。图37A至37C包括RNA折纸的代表性2D模型(3H-RNA-2NN1；图37A)，该RNA折纸包括两个适体和三个A型双螺旋结构。以及图38A至38C包括RNA折纸的代表性2D模型(4H-RNA-2NN1；图38A)，该RNA折纸包括两个适体和四个A型双螺旋结构。使用mfold RNA和NUPACK软件对以上实施方案的RNA折纸折叠的计算分析进行分析。紫色和蓝色矩形分别表示外位点1和外位点2结合适体，并且黄色和绿色矩形分别指示四环和吻合环基序。
综上所述，这些结果提供很大范围的变化和灵活性，以用于构建有效的基于核酸的抗凝治疗剂。具体地，这些结果还表明了产生与凝血酶外位点1和2结合的修饰和未修饰的RNA折纸结构二者的能力。这是通过扩增DNA序列、然后转录并且加热退火以产生RNA折纸结构来进行的。如图12至17和图35至38所示，产生八种类型的折纸结构，每种都具有不同的适体放置(或作为对照的无适体；参见图13A至13D)，并且每种均通过凝胶电泳来表征。将氟修饰的NTP和突变的T7聚合酶用于创建在血浆中稳定的修饰的RNA。体外产生允许结构的大量产生，创建足以导致血浆中的凝固的物质。
实施例2
抗凝活性。人血液中的凝固是血液中各种蛋白质之间的被称为血液凝固级联(Blood Coagulation Cascade，BCC)的一系列复杂反应的结果。本文使用的适体结合至BCC中的蛋白质中的一者，即凝血酶。通过结合至凝血酶，RNA折纸中所包括的适体抑制BCC并且延迟凝固。折纸使用两个不同的适体来结合至凝血酶蛋白上的外位点1和2，从而防止BCC。可以使用aPTT测定在血凝仪上对BCC的相对抑制进行试验。凝血仪对使用CaCl2人工诱导之后凝固发生所需的时间进行测量。使用该方法，可以确定本文描述的单链核酸分子的凝固调节功效。
对于抗凝固试验，在Diagnostica Stago的ST4型血凝仪中对DNA和RNA者二者的四种适体布置进行试验。收集的所得数据证实，在所有适体布置设计中未发现未修饰的RNA折纸的抗凝活性，因为2HN RNA折纸示出了与标准缓冲液相同的凝固时间。这些结果还证实，未修饰的RNA折纸在人血浆中是不稳定的。然而，与未修饰的RNA片相比，修饰的RNA折纸示出了引人注目的活性，其凝固结时间在150至260秒之间。另外，对存在于DNA片上的DNA适体进行试验，其展示出如先前报道的抗凝活性相同的趋势，并且具有相似的活性量级。进行试验的所有片的活性提供在图23中。
结果表明，修饰的RNA与DNA片具有相似或比其更好的效果，而且数据落在标准偏差内。尽管程度不同，但是12NN、1N2N、2NN1(图23和48)和2211(图47和48)的RNA结构都表现出显著的抗凝活性。具有RNA适体的RNA折纸片的表现即便不比它们的DNA对应物好，也和它们的DNA对应物一样好。观察到的结合也进一步证实，修饰的RNA在人血浆中是稳定的。
实施例3
特异性试验。在凝固级联和人血浆的复杂环境中，血液中涉及并存在许多蛋白质和小分子。因此，捕获分子与其靶标的特异性结合是重要的。凝血酶含有用于激活凝固途径的被称为外位点1和2的两个活性位点。为了抑制凝血酶的活性，使用凝血酶RNA适体，如本文中进一步所描述的。设计含有结合至凝血酶以用于抑制凝固过程的两个适体的功能性RNA折纸分子。为了对凝血酶结合RNA折纸的特异性进行试验，将参与凝固级联的凝血酶、因子IXa和因子Xa与牛血清白蛋白(BSA)一起使用。RNA折纸-蛋白质复合物的结合通过凝胶电泳迁移率变动测定来表征。
使用凝胶电泳迁移率变动测定对RNA折纸(Th-RNA折纸)中所包括的RNA凝血酶适体与凝血酶的结合复合物进行试验。检查RNA折纸的八种设计(一种不具有凝血酶适体，并且七种含有凝血酶适体)。不具有凝血酶适体的RNA折纸(2HF-RNA-NNNN)不能与凝血酶结合。与凝血酶一起孵育的含凝血酶RNA折纸的所有七种设计(2HF-RNA-12NN、1N2N、2NN1、Fss12、2HF-2211、3HF-2NN1和4HF-2NN1)迁移都慢于不存在凝血酶情况下的RNA折纸(图24和41)。此外，蛋白质染色的凝胶示出，凝血酶蛋白的涂片模式条带出现在核酸染色的凝胶中的RNA-凝血酶复合物的相同位置处。这些结果指示，具有RNA凝血酶适体的RNA折纸与凝血酶结合。
进行Th-RNA折纸与参与凝固级联的两种蛋白质(因子IXa和Xa)和一种常见蛋白质(牛血清白蛋白，BSA)的特异性试验。为了对特异性进行试验，将RNA折纸与蛋白质在37℃下一起孵育一小时，并且通过天然丙烯酰胺凝胶电泳来表征。存在于RNA折纸(2HF-RNA-NNNN)上的非适体不能结合至所有四种蛋白质(图25)。具有RNA凝血酶适体的RNA折纸的所有七种设计(2HF-RNA-12NN、1N2N、2NN1、Fss12、2HF-2211、3HF-2NN1和4HF-2NN1)均示出了与凝血酶的特异性结合，如图26至28和图42至45中示出的结果。
另外，还对安置在DNA编织片上的凝血酶DNA适体与凝血酶蛋白的特异性结合进行试验。使用2-螺旋-DNA编织片(2HT)。对于DNA片，将被称为“Apt-P”和“Apt-B”的两个适体在与凝血酶外位点1和2结合的每种设计上延伸。被称为“NNNN”的DNA片不含有任何适体。对于2HT-DNA-BPNN构建体，将适体B和P从DNA编织片上的位置1和2延伸(图29)。这些结果表明，未观察到与2HT-DNA-NNNN结合的凝血酶。
使用凝胶电泳迁移率变动测定对含有两个适体和四个适体的2HF-RNA和2HT-DNA与凝血酶的结合进行评估。这些结果证明，具有适体的RNA折纸和DNA编织片二者均与凝血酶特异性地结合。另外，未发现RNA折纸与非特异性靶标(因子IXa、Xa和BSA)的非特异性结合(图26至28和42至45)。
如本文进一步所描述的，图35至38中所体现的核酸构建体表明，当与使用具有四环或吻合环基序中的一者或多者的双链RNA折纸平台相比时，使用不具有这些基序的连接至适体的单链RNA(图35A至35C)可以实现有效的抗凝活性。使用具有四个适体但不具有四环的RNA折纸平台也可以实现有效的抗凝活性(图36A至36C)。另外，使用具有两个适体以及将该适体分离的2、3或4个螺旋结构的RNA折纸平台也可以实现有效的抗凝活性。
实施例4
稳定性试验。RNA是一种在如基因调控等细胞生物学中起关键性作用的功能性生物分子。RNA在细胞生理状态下是稳定的，但通常在人血浆中具有短的半衰期(参见下文中的图)。为了将功能性RNA用于治疗目的，RNA的稳定性是主要挑战之一。核糖的2′修饰已经广泛用于改善如人血浆等核酸酶条件下RNA的稳定性。先前已经报道，整合至核酶中的2′-氟代和2′-氨基修饰的核苷可抵抗核糖核酸酶降解。重要地，2′-氟代-dCTP和2′氟代-dUTP不会影响核酶的催化活性。因此，2′-氟代-CTP和-UTP被选择为用于RNA折纸的体外产生的构造块。
Figure BDA0003039663390000291
如上所示：(A)天然核苷酸，胞苷-5′-三磷酸(CTP)以及(B至D)修饰的核苷酸：(B)2′-氟代-2′-脱氧胞苷-5′-三磷酸(2′F-dCTP)、(C)2′-氨基-2′-脱氧胞苷-5′-三磷酸(2′-氨基-dCTP)和(D)2′-O-甲基胞苷-5′-三磷酸(2′-O-甲基-CTP)。胞嘧啶、核糖、三磷酸和2′修饰分别以绿色、蓝色、橙色和黄色矩形表示。
为了对RNA折纸在核糖核酸酶A中的稳定性进行试验，将未修饰和修饰的RNA折纸与核糖核酸酶A(10和500μg/ml)在37℃下孵育10分钟至最多24小时。RNA折纸的完整性通过使用变性凝胶电泳来表征(图30-31)。如结果表明，在含核糖核酸酶的溶液中，未修饰的RNA折纸在10分钟内降解(图30B)。在10μg/ml核糖核酸酶中，2′-氟代-CTP和-UTP修饰的RNA折纸稳定至少6小时(图30A)。在高浓度的核糖核酸酶A(500μg/ml)下，修饰的RNA折纸稳定30分钟，如图31A所示。
对于治疗性应用，抗凝剂在人血浆中的稳定性是重要的。人血浆含有多种组分，如降解DNA和RNA结构的脱氧核糖核酸酶(DNase)和核糖核酸酶。此处，对合并的人血浆中的RNA折纸和DNA片的抵抗力进行试验。将变性凝胶电泳用于表征核酸纳米结构的完整性。将RNA折纸和DNA片在10分钟至最多24小时的各个时间点处与人血浆一起孵育。在人血浆中，2′-氟修饰的RNA折纸在24小时内是稳定的，如图32A至32B所示。出现在图32A中的顶部条带处的RNA的强度示出，在人血浆中，一定量的RNA折纸仍然与凝血酶结合。未修饰的RNA折纸在少于10分钟的时间内降解(图33)。在人血浆中，DNA编织片稳定6小时(图34)。这些结果表明，在人血浆中，2′-氟代修饰的RNA折纸比DNA片更稳定。
天然RNA折纸在少于10分钟的时间内被核糖核酸酶降解。为了将功能性RNA折纸利用于治疗性应用，RNA折纸的稳定性是重要的。这些结果表明，在核糖核酸酶A中，2′-氟代修饰的RNA折纸稳定至少6小时。另外，在人血浆中，修饰的RNA折纸在24小时内是稳定的，其比DNA片更稳定。2′-氟代修饰的RNA折纸在人血浆中24小时内的稳定性表明，RNA折纸是一种用于在治疗性应用中使用的有前途的生物分子。
还对本公开的核酸适体构建体的储存稳定性进行试验，如图46所示。在一个实施方案中，所使用的储存缓冲液包括20mM HEPES(pH 7.4)、150mM NaCl和2mM CaCl2。如本领域普通技术人员基于本公开将认识到的，取决于储存适体构建体的背景，该储存缓冲液的组分可以变化直到±25％。例如，如图46所示，将新鲜制备的2HF-RNA-2NN1样本的平均抗凝活性与在4℃下储存最多达90天的样本进行比较。结果表明，在4℃下储存之后，RNA折纸抗凝剂至少稳定3个月并且是有活性的。
根据这些实施方案，本公开的核酸适体构建体可以在室温至-20℃的温度范围内储存且不会有显著的抗凝活性损失。在一些实施方案中，在长期储存之前，可以将本公开的核酸适体构建体直接溶解在储存缓冲液中和/或在水(例如，超纯水)中冻干。在一些实施方案中，将本公开的核酸适体构建体先溶解在储存缓冲液中、或溶解在水中，并且然后冻干并储存。在使用之前，可以重新构建核酸适体构建体并且允许其合适地折叠达一段时间(例如，30分钟)。在其它实施方案中，在冻干之前，可以允许本公开的核酸适体构建体在储存缓冲液中合适地折叠。在使用之前，可以添加水或缓冲液以溶解冻干的构建体，该冻干的构建体将通常是功能性的并且是立即可用的。
实施例5
凝血酶抑制的逆转。对凝血级联的控制为手术和疾病应用提供益处。已经开发出基于化学制品的抗凝剂并且经常使用，但由于其治疗窗口小(治疗剂量与毒性剂量之间的浓度差狭窄)，因此需要对患者进行持续地监测，以防止危险的副作用，如溢血和出血。替代的解决方案是基于核酸的抗凝剂，其永远不会引起溢血，并且可以通过可用的解毒剂来终止。
用于基于适体的抗凝剂的解毒剂可以是具有与适体序列互补的核苷酸序列的单链核酸(DNA和PNA)的短链。先前的研究示出，通过添加ssDNA解毒剂可以对凝血酶活性进行逆转抑制和重新激活。这也可以用DNA片上的DNA适体来展示。与游离适体相比较，带有RNA适体的RNA折纸提供高的抗凝活性(如本文所展示)。由于需要中断适体的紧密凝血酶结合和稳定折叠，因此凝血酶抑制的逆转可能具有挑战性。此处，通过添加解毒剂对凝固活性的恢复进行检查，该解毒剂是外位点-1和-2结合适体的互补对应物。在医疗程序和疾病治疗期间，用于调节凝固级联的该解毒剂机制可以提供巨大的益处。
如图50A至50B所示，设计用于2HF-RNA-2NN1的由两个适体的DNA制成的解毒剂。在将RNA折纸与血浆和其它试剂一起孵育以进行aPTT测定之后，添加解毒剂，并且将整个样本进一步孵育5分钟。
数据示出，在添加解毒剂的情况下，活性的逆转是有可能的，因为解毒剂试验显示，平均凝结时间大约为85秒，在该时间内，恢复80％(仍有20％的凝血酶被抑制)。逆转不完全可能是由于解毒剂对两个适体中的一者的链侵袭的效果较差，或者是由于抵消凝血酶结合所需的解毒剂的浓度差异。另外，如图51所示，针对2HF-RNA-2NN1的肽核酸(PNA)解毒剂也是有效的，并且比基于DNA的对应物显著更有效。
已经示出，2HF-RNA-2NN1折纸以低至0.5μM的浓度也可有效地抑制和延迟凝固。然而，RNA折纸和RNA适体设计的另一益处是易于对适体实施解毒剂，从而允许外科医生例如终止抗凝固。使用ssDNA解毒剂，凝血酶的活性可以恢复约80％，或使用PNA解毒剂，恢复至少80％，如所展示的。
4.材料和方法
进行G-Block序列的扩增。将反应缓冲液、正向和反向引物、dNTP、DNA聚合酶和无核酸酶水以表1中所示的浓度添加至PCR管中。最后添加DNA聚合酶，并且将样本吸移以混合。
表1：G-block PCR浓度和体积。
最终浓度
反应缓冲液(x) 1
正向引物(μM) 0.5
反向引物(μM) 0.5
dNTP(mM) 0.2
DNA模板(μl/50μl) 2
DNA聚合酶(单位/μl) 0.02
无核酸酶水 至期望的体积
将样品放置在热循环仪中，并且使用以下流程进行PCR：
Figure BDA0003039663390000321
在PCR之后，将小体积的扩增的DNA样本(约2-5μl)用于在1％琼脂糖凝胶中进行试验。将DNA在150V下于1kb梯(普洛麦格(Promega))旁边运行30分钟。然后在紫外光(ProteinSimple仪器)下观察凝胶。如果观察到合适的条带尺寸，则然后使用GFX DNA纯化试剂盒(通用电气医疗(GE Healthcare))将剩余的DNA样本用于溶液内纯化。使用Nanodrop3000c分光光度计(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))将约1μl的纯化的溶液用于分析。记录浓度以供进一步使用，并且保留DNA并将其标记(2H-XXXX)以用于随后的转录。
然后进行未修饰的转录。将发现于下文表2中的所有内容物(不包括RNAT7聚合酶)在PCR管中进行混合。应当注意，将所使用的DTT在实验室内进行混合以确保新鲜度。最后，添加RNAT7聚合酶，并且将样本吸移以混合。在冰上合成样本，以尝试减慢对RNA产生有负面影响的酶(如核糖核酸酶)。在添加完所有组分并将它们混合之后，将样本放置热循环仪中，并且在37℃下孵育4至16小时，并且然后保持在4℃下。
表2：未修饰的转录内容物和浓度。
最终浓度
转录NEB缓冲液(x) 1
新鲜DTT(mM) 5
NTP(mM每种) 2.5
DNA模板(ng) 120
RNA T7聚合酶(μl/50μl) 2.5
无核酸酶水 至期望的体积
对于氟代修饰的转录，遵循如上文的流程，但使用发现于下文表3中的内容物：
表3：氟代修饰的转录内容物和浓度。
最终浓度
转录NEB缓冲液(x) 1
新鲜DTT(mM) 10
修饰的NTP(mM每种) 2.5
DNA模板(ng) 120
突变的RNA T7聚合酶(μl/50μl) 2.5
无核酸酶水 至期望的体积
在转录之后，将小体积的样本(约5μl)用于在6％丙烯酰胺变性凝胶中进行观察。将样本以20W于核酸制造者旁边运行1小时。然后在紫外光下观察凝胶以察看恰当的长度。如果序列长度恰当并且存在理想的条带，则然后使用Monarch RNA Clean-Up试剂盒对样本进行纯化。将约31μl的洗脱缓冲液用于纯化，并且使用Nanodrop 3000c将1μl的样本用于分析。记录光密度(A260)，并且根据比尔定律计算样本的摩尔浓度。
然后通过在95℃下加热5分钟对样本进行热退火，随后在-20℃下冷却3分钟。然后添加5X DNA片缓冲液，并且将样本加热至37℃保持30分钟。使用1X DNA片缓冲液将样本稀释至期望的体积，以供进一步使用。
APPT凝固试验评估了合并的人血浆与具有抗凝固适体的DNA/RNA片的凝固时间。在50μL的合并的人血浆、50μL的aPTT试剂和50μl的CaCl2溶液中对约16.67μL的5μM RNA和DNA片样本二者进行试验。
对于特异性试验，将热退火的RNA折纸或DNA编织片(5pmol)溶解在1X退火缓冲液中，并且与蛋白质(25pmol)在37℃下一起孵育1小时。通过在作为运行缓冲液的1X TBE中以150V持续3小时的6％丙烯酰胺凝胶电泳对样本进行试验。将凝胶用溴化乙锭染色以进行核酸染色，并且在紫外灯下使其可视化。然后，将凝胶用考马斯蓝进一步染色以进行蛋白质染色，并且用ProteinSimple仪器成像。
为了对RNA折纸进行折叠，将未修饰和修饰的RNA折纸溶解在无核酸酶水中，并且在95℃下加热5分钟，并且迅速地在-20℃下冷却3分钟。然后，将样本与5X退火缓冲液进行混合以达到在1X缓冲液下的浓度，并且在37℃下退火30分钟。最后，将1x缓冲液添加至折叠的RNA折纸中，以达到期望的浓度。将折叠的RNA折纸(1μl，5μM)与核糖核酸酶A(10和500μg/ml各1μl)或人血浆(3μl)进行混合，并且在37℃下孵育10分钟至24小时的各个时间过程。RNA折纸的完整性通过变性凝胶电泳来表征。对于变性凝胶电泳，将凝胶以20 W预运行15分钟，并且将样本以20 W运行1小时。最后，将凝胶用溴乙锭染色以进行核酸染色。在ProteinSimple仪器的紫外灯下使核酸条带可视化。
对于解毒剂试验，使用ST4型血凝仪(斯达戈诊断公司(Diagnostica Stago))在活化的部分促凝血酶原激酶时间(APTT)测定中运行凝固试验。在每个比色皿中添加约50μL合并的人血浆(George King Bio-Medical)，与50μL aPTT试剂(TriniClot)进行混合，并且将其在37℃下孵育5分钟。然后添加13.67μL的6.09μM RNA折纸样本或缓冲液，并且在37℃下再孵育5分钟。五分钟后，添加3.00μL的DNA或PNA解毒剂，并且在37℃下再孵育5分钟。为了激活凝结，添加50μL CaCl2溶液。RNA样本的最终浓度为0.5μM。然后用机器测量凝结时间并且将其记录。
5.序列
本公开提供以下核酸，如本文所引用。
RNA-NNNN(SEQ ID NO：1)
Figure BDA0003039663390000351
RNA-12NN(SEQ ID NO：2)
Figure BDA0003039663390000352
RNA-1N2N(SEQ ID NO：3)
Figure BDA0003039663390000353
RNA-2NN1(SEQ ID NO：4)
Figure BDA0003039663390000354
Figure BDA0003039663390000361
Fss12(SEQ ID NO：5)
Figure BDA0003039663390000362
2H-2211(SEQ ID NO：6)
Figure BDA0003039663390000363
3H-2NN1(SEQ ID NO：7)
Figure BDA0003039663390000364
4H-2NN1(SEQ ID NO：8)
Figure BDA0003039663390000365
Figure BDA0003039663390000371
下文提供Gblock序列(粗体为T7启动子)。
2H-DNAGblock-NNNN(SEQ ID NO：9)
Figure BDA0003039663390000372
2H-DNAGblock-12NN(SEQ ID NO：10)
Figure BDA0003039663390000373
2H-DNAGblock-1N2N(SEQ ID NO：11)
Figure BDA0003039663390000374
Figure BDA0003039663390000381
2H-DNAGblock-2NN1(SEQ ID NO：12)
Figure BDA0003039663390000382
DNAGblock-Fss12(SEQ ID NO：13)
Figure BDA0003039663390000383
2H-DNAGblock-2211(SEQ ID NO：14)
Figure BDA0003039663390000384
3H-DNAGblock-2NN1(SEQ ID NO：15)
Figure BDA0003039663390000385
Figure BDA0003039663390000391
4H-DNAGblock-2NN1(SEQ ID NO：16)
Figure BDA0003039663390000392
下文提供DNA和PNA解毒剂序列。
Anti_Ex1_A06(SEQ ID NO：17)
GTCTGCCTCGTACATTGGCT
Anti_Ex2_Full(SEQ ID NO：18)
GGGTAAGTACTTCAGCTTTGTTCCC
Anti_Ex1_PNA_A06(SEQ ID NO：19)
GTCTGCCTCGTACATTGGCT
Anti_Ex2_PNA_19nt(SEQ ID NO：20)
GTACTTCAGCTTTGTTCCC
对于本领域技术人员将显而易见的是，其它适合的修改
应当理解，前述详细描述和所附实例仅是说明性的，并且不应被视为是对本公开范围的限制，本公开范围仅由所附权利要求及其等效物来定义。
对所公开的实施方案的各种改变和修改对于本领域技术人员将是明显的。此类改变和修改，包括但不限于与本公开的化学结构、取代基、衍生物、中间体、合成、组合物、配制品或使用方法有关的那些，可以在不脱离本公开的精神和范围的情况下进行。
序列表
<110> 北卡罗来纳大学
<120> 与核酸抗凝剂有关的组合物和方法
<130> NCSU-37060.601
<150> US 62/750,900
<151> 2018-10-26
<160> 20
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 210
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 1
gggagaucga gcgacuuccg acuucggucg ggagucgggc uagucaucuu cggaugauua 60
gccgcuggug aagccuccac gccagccucg gucucccgca guaggaucgg acugaaggag 120
gcacgguccc agccgaagug ucuugcuucg gcaaggcacu uuggcugcua gacuggcugg 180
cuucggccag cuaguuuagg auucuauugc 210
<210> 2
<211> 279
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 2
gggagaucga gcgacuuccg acuucggucg ggagucgggc uagucaucgg gaacaaagcu 60
gaaguacuua cccgaugauu agccgcuggu gaagccucca cgccagccuc ggucucccgc 120
aguaggaucg gacugaagga ggcacggucc cagccgaagu gucuggcggu cgaucacaca 180
guucaaacgu aauaagccaa uguacgaggc agacgacucg ccaggcacuu uggcugcuag 240
acuggcuggc uucggccagc uaguuuagga uucuauugc 279
<210> 3
<211> 279
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 3
gggagaucga gcgacuuccg acgggaacaa agcugaagua cuuacccguc gggagucggg 60
cuagucaucu ucggaugauu agccgcuggu gaagccucca cgccagccuc ggucucccgc 120
aguaggaucg gacugaagga ggcacggucc cagccgaagu gucuggcggu cgaucacaca 180
guucaaacgu aauaagccaa uguacgaggc agacgacucg ccaggcacuu uggcugcuag 240
acuggcuggc uucggccagc uaguuuagga uucuauugc 279
<210> 4
<211> 285
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 4
gggagaucga gcgacuuccg acuucggucg ggagucgggc uagucaucuu cggaugauua 60
gccgcuggug aagccuccac gccagccucg gucucccgca guaggaucgg acugaaggag 120
gcacgguccc agccgaagug ucuugcggga acaaagcuga aguacuuacc cgcaaggcac 180
uuuggcugcu agacuggcug gcggcggucg aucacacagu ucaaacguaa uaagccaaug 240
uacgaggcag acgacucgcc gccagcuagu uuaggauucu auugc 285
<210> 5
<211> 114
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 5
gggaacaaag cugaaguacu uacccaccuu accacuccac cucacucacc uauuacggcg 60
gucgaucaca caguucaaac guaauaagcc aauguacgag gcagacgacu cgcc 114
<210> 6
<211> 378
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 6
gggagaucga gcgacuuccg acucuggcgg ucgaucacac aguucaaacg uaauaagcca 60
auguacgagg cagacgacuc gccagagucg ggagucgggc uagucaucag gcacgggaac 120
aaagcugaag uacuuacccg ugccugauga uuagccgcug gugaagccuc cacgccagcc 180
ucggucuccc gcaguaggau cggacugaag gaggcacggu cccagccgaa gugucuugcg 240
ggaacaaagc ugaaguacuu acccgcaagg cacuuuggcu gcuagacugg cuggcggcgg 300
ucgaucacac aguucaaacg uaauaagcca auguacgagg cagacgacuc gccgccagcu 360
aguuuaggau ucuauugc 378
<210> 7
<211> 385
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 7
ggaaaugaug ccgaguugac gcuucggcgu cagcucgccc uguggccuag uucgcuaggu 60
cacagacauc uuggcguucg cgccaggaug ucucgcccaa uuccguaggg cgaggguagc 120
caaauccaga ggcuagcauu auuuccgauc uaggaucgcg uugagaacug gauacucaac 180
agcgguaaac ggaaaaccgc ucagccgaag ugucuugcgg gaacaaagcu gaaguacuua 240
cccgcaaggc acuuuggcug gccacgcguc guauucguac ggcgcgugcu agacuggcug 300
gcggcggucg aucacacagu ucaaacguaa uaagccaaug uacgaggcag acgacucgcc 360
gccagcuagu uuaggauucu agauc 385
<210> 8
<211> 485
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 8
ggaaaugaug ccgaguugac gcuucggcgu cagcucgccc uguggccuag uucgcuaggu 60
cacagccgac cauugcguuu cgacgcagug gucacaucuu ggcguucgcg ccaggauguc 120
ucgcccaauu ccguagggcg aggggaccca aaucccuagg gucgguagcc aaauccagag 180
gcuagcauua uuuccgaucu aggaucgcgu ugagaacugg auacucaacc guggcauaaa 240
gggauaaugc caagcgguaa acggaaaacc gcucagccga agugucuugc gggaacaaag 300
cugaaguacu uacccgcaag gcacuuuggc ugcguggcgu uacaguucgc ugugacgcca 360
gccacgcguc guauucguac ggcgcgugcu agacuggcug gcggcggucg aucacacagu 420
ucaaacguaa uaagccaaug uacgaggcag acgacucgcc gccagcuagu uuaggauucu 480
agauc 485
<210> 9
<211> 261
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 9
cactttcagc cctcttatcc tcggcggatc cttctaatac gactcactat agggagatcg 60
agcgacttcc gacttcggtc gggagtcggg ctagtcatct tcggatgatt agccgctggt 120
gaagcctcca cgccagcctc ggtctcccgc agtaggatcg gactgaagga ggcacggtcc 180
cagccgaagt gtcttgcttc ggcaaggcac tttggctgct agactggctg gcttcggcca 240
gctagtttag gattctattg c 261
<210> 10
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 10
cactttcagc cctcttatcc tcggcggatc cttctaatac gactcactat agggagatcg 60
agcgacttcc gacttcggtc gggagtcggg ctagtcatcg ggaacaaagc tgaagtactt 120
acccgatgat tagccgctgg tgaagcctcc acgccagcct cggtctcccg cagtaggatc 180
ggactgaagg aggcacggtc ccagccgaag tgtctggcgg tcgatcacac agttcaaacg 240
taataagcca atgtacgagg cagacgactc gccaggcact ttggctgcta gactggctgg 300
cttcggccag ctagtttagg attctattgc 330
<210> 11
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 11
cactttcagc cctcttatcc tcggcggatc cttctaatac gactcactat agggagatcg 60
agcgacttcc gacgggaaca aagctgaagt acttacccgt cgggagtcgg gctagtcatc 120
ttcggatgat tagccgctgg tgaagcctcc acgccagcct cggtctcccg cagtaggatc 180
ggactgaagg aggcacggtc ccagccgaag tgtctggcgg tcgatcacac agttcaaacg 240
taataagcca atgtacgagg cagacgactc gccaggcact ttggctgcta gactggctgg 300
cttcggccag ctagtttagg attctattgc 330
<210> 12
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 12
cactttcagc cctcttatcc tcggcggatc cttctaatac gactcactat agggagatcg 60
agcgacttcc gacttcggtc gggagtcggg ctagtcatct tcggatgatt agccgctggt 120
gaagcctcca cgccagcctc ggtctcccgc agtaggatcg gactgaagga ggcacggtcc 180
cagccgaagt gtcttgcggg aacaaagctg aagtacttac ccgcaaggca ctttggctgc 240
tagactggct ggcggcggtc gatcacacag ttcaaacgta ataagccaat gtacgaggca 300
gacgactcgc cgccagctag tttaggattc tattgc 336
<210> 13
<211> 165
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 13
cactttcagc cctcttatcc tcggcggatc cttctaatac gactcactat agggaacaaa 60
gctgaagtac ttacccacct taccactcca cctcactcac ctattacggc ggtcgatcac 120
acagttcaaa cgtaataagc caatgtacga ggcagacgac tcgcc 165
<210> 14
<211> 429
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 14
cactttcagc cctcttatcc tcggcggatc cttctaatac gactcactat agggagatcg 60
agcgacttcc gactctggcg gtcgatcaca cagttcaaac gtaataagcc aatgtacgag 120
gcagacgact cgccagagtc gggagtcggg ctagtcatca ggcacgggaa caaagctgaa 180
gtacttaccc gtgcctgatg attagccgct ggtgaagcct ccacgccagc ctcggtctcc 240
cgcagtagga tcggactgaa ggaggcacgg tcccagccga agtgtcttgc gggaacaaag 300
ctgaagtact tacccgcaag gcactttggc tgctagactg gctggcggcg gtcgatcaca 360
cagttcaaac gtaataagcc aatgtacgag gcagacgact cgccgccagc tagtttagga 420
ttctattgc 429
<210> 15
<211> 472
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 15
cggccagtga attcgagctc ggtacccggg agatctcact ttcagccctc ttatcctcgg 60
ccgatccttc taatacgact cactatagga aatgatgccg agttgacgct tcggcgtcag 120
ctcgccctgt ggcctagttc gctaggtcac agacatcttg gcgttcgcgc caggatgtct 180
cgcccaattc cgtagggcga gggtagccaa atccagaggc tagcattatt tccgatctag 240
gatcgcgttg agaactggat actcaacagc ggtaaacgga aaaccgctca gccgaagtgt 300
cttgcgggaa caaagctgaa gtacttaccc gcaaggcact ttggctggcc acgcgtcgta 360
ttcgtacggc gcgtgctaga ctggctggcg gcggtcgatc acacagttca aacgtaataa 420
gccaatgtac gaggcagacg actcgccgcc agctagttta ggattctaga tc 472
<210> 16
<211> 572
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 16
cggccagtga attcgagctc ggtacccggg agatctcact ttcagccctc ttatcctcgg 60
ccgatccttc taatacgact cactatagga aatgatgccg agttgacgct tcggcgtcag 120
ctcgccctgt ggcctagttc gctaggtcac agccgaccat tgcgtttcga cgcagtggtc 180
acatcttggc gttcgcgcca ggatgtctcg cccaattccg tagggcgagg ggacccaaat 240
ccctagggtc ggtagccaaa tccagaggct agcattattt ccgatctagg atcgcgttga 300
gaactggata ctcaaccgtg gcataaaggg ataatgccaa gcggtaaacg gaaaaccgct 360
cagccgaagt gtcttgcggg aacaaagctg aagtacttac ccgcaaggca ctttggctgc 420
gtggcgttac agttcgctgt gacgccagcc acgcgtcgta ttcgtacggc gcgtgctaga 480
ctggctggcg gcggtcgatc acacagttca aacgtaataa gccaatgtac gaggcagacg 540
actcgccgcc agctagttta ggattctaga tc 572
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 17
gtctgcctcg tacattggct 20
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 18
gggtaagtac ttcagctttg ttccc 25
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 19
gtctgcctcg tacattggct 20
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 20
gtacttcagc tttgttccc 19

Claims (36)

1.一种单链核酸分子，包含：
至少一个A型双螺旋结构和至少一个交叉(crossover)区域；
至少一个吻合环区域；以及
具有抗凝活性的至少一个核酸适体。
2.根据权利要求1所述的核酸分子，进一步包含至少一个四环区域。
3.根据权利要求1或2所述的核酸分子，其中所述核酸分子是RNA分子。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子是包含具有2'-修饰的至少一个核苷的RNA分子。
5.根据权利要求2所述的核酸分子，其中所述至少一个四环区域包含四核苷酸基序。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含一至六个四环区域，每个四环包含四核苷酸基序。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的核酸分子，其中所述至少一个吻合环区域是180°吻合环区域。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含具有抗凝活性的一至四个适体。
9.根据权利要求8所述的核酸分子，其中所述一至四个适体中的每一者替代四环区域。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子是与SEQ ID NO：1.SEQ 1具有至少80％序列同一性的RNA分子。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的核酸分子，其中所述至少一个核酸适体的抗凝活性包含凝血酶抑制。
12.根据权利要求1至10中任一项所述的核酸分子，其中所述至少一个核酸适体的所述抗凝活性包含对因子XIIa、因子XIIIa、因子XIa、因子IXa、因子Xa和von Willebrand因子中的一者或多者的抑制。
13.根据权利要求11所述的核酸分子，其中所述至少一个核酸适体包含抗凝血酶RNAR9D-14T适体或其衍生物。
14.根据权利要求11所述的核酸分子，其中所述至少一个核酸适体包含抗凝血酶Toggle-25t RNA适体或其衍生物。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子是包含约100至约600个核苷酸的RNA分子。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子是包含以下的RNA分子：
能够结合凝血酶外位点1的核酸适体，其替代所述RNA分子的四环区域1；和
能够结合凝血酶外位点2的核酸适体，其替代所述RNA分子的四环区域2。
17.根据权利要求16所述的核酸分子，其中所述RNA分子与SEQ ID NO：2具有至少80％序列同一性。
18.根据权利要求1至15中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子是包含以下的RNA分子：
能够结合凝血酶外位点1的核酸适体，其替代所述RNA分子的四环区域1；和
能够结合凝血酶外位点2的核酸适体，其替代所述RNA分子的四环区域3。
19.根据权利要求18所述的核酸分子，其中所述RNA分子与SEQ ID NO：3具有至少80％序列同一性。
20.根据权利要求1至15中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子是包含以下的RNA分子：
能够结合凝血酶外位点2的核酸适体，其替代所述RNA分子的四环区域1；和
能够结合凝血酶外位点1的核酸适体，其替代所述RNA分子的四环区域4。
21.根据权利要求20所述的核酸分子，其中所述RNA分子与SEQ ID NO：4具有至少80％序列同一性。
22.根据权利要求1至15中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子是包含以下的RNA分子：
连接至单链RNA接头一端的能够结合凝血酶外位点2的核酸适体；和
连接至单链RNA接头另一端的能够结合凝血酶外位点1的核酸适体。
23.根据权利要求22所述的核酸分子，其中所述RNA分子与SEQ ID NO：5具有至少80％序列同一性。
24.根据权利要求1至15中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子是包含以下的RNA分子：
能够结合凝血酶外位点2的两个核酸适体，每个核酸适体分别替代所述RNA分子的四环区域1和2；和
能够结合凝血酶外位点1的两个核酸适体，每个核酸适体分别替代所述RNA分子的四环区域3和4。
25.根据权利要求24所述的核酸分子，其中所述RNA分子与SEQ ID NO：6具有至少80％序列同一性。
26.根据权利要求1至15中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子是包含以下的RNA分子：
能够结合凝血酶外位点2的核酸适体，其替代所述RNA分子的四环区域1；
能够结合凝血酶外位点1的核酸适体，其替代所述RNA分子的四环区域4；和
至少一个A型双螺旋结构，其将所述能够结合凝血酶外位点2的核酸适体与所述能够结合凝血酶外位点1的核酸适体分离。
27.根据权利要求26所述的核酸分子，其中所述RNA分子与SEQ ID NO：7具有至少80％序列同一性。
28.根据权利要求1至15中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子是包含以下的RNA分子：
能够结合凝血酶外位点2的核酸适体，其替代所述RNA分子的四环区域1；
能够结合凝血酶外位点1的核酸适体，其替代所述RNA分子的四环区域4；和
至少两个A型双螺旋结构，其将所述能够结合凝血酶外位点2的核酸适体与所述能够结合凝血酶外位点1的核酸适体分离。
29.根据权利要求26所述的核酸分子，其中所述RNA分子与SEQ ID NO：8具有至少80％序列同一性。
30.根据权利要求16至29中任一项所述的核酸分子，其中所述能够结合凝血酶外位点1的核酸适体是RNAR9D-14T适体或其衍生物，并且其中所述能够结合凝血酶外位点2的核酸适体是Toggle-25t RNA适体或其衍生物。
31.一种DNA分子，其对如权利要求1至30所述的单链核酸分子中的任何一者进行编码。
32.一种抗凝组合物，包含：
单链核酸分子，其包含至少一个A型双螺旋结构、至少一个交叉区域、至少一个四环区域、至少一个吻合环区域、以及具有抗凝活性的至少一个核酸适体；和
药学上可接受的赋形剂、溶剂、载体或稀释剂。
33.一种用于调节凝固的系统，所述系统包含：
如权利要求1至30所述的单链核酸分子中的任何一者；和
至少一种单链核酸解毒剂，其能够结合至如权利要求1至30所述的单链核酸分子中的任何一者的至少一部分以抵消如权利要求1至30所述的单链核酸分子的抗凝活性。
34.根据权利要求33所述的系统，其中所述至少一种核酸解毒剂是DNA分子、RNA分子、O-甲基RNA分子、氟代修饰的RNA分子、PNA分子、LNA分子、或者其组合或衍生物。
35.根据权利要求33或权利要求34所述的系统，其中所述至少一种核酸解毒剂以反向互补方式结合至如权利要求1至30所述的单链核酸分子中的任何一者的至少一部分。
36.根据权利要求33至35中任一项所述的系统，其中所述至少一种核酸解毒剂结合至如权利要求1至30所述的单链核酸分子中的任何一者的至少一个核酸适体以抵消所述抗凝活性。
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