JP2023551722A - ＴｏＢＲＦＶ、ＴＭＶ、ＴｏＭＶ、およびＴｏＭＭＶに対する耐性を有するトマト植物および対応する耐性遺伝子 - Google Patents

Abstract

本発明は、トマトブラウンルゴースフルーツウイルス（ＴｏＢＲＦＶ）の移行タンパク質（ＭＰ）の認識を付与するＴＭ－２－２タンパク質の変異体に関し、前記変異体は、ＴＭ－２－２タンパク質のチロシン７６７に対応する位置にチロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）、またはトリプトファン（Ｗ）を含み、かつ潜在的にＦ６５５Ｌ変異と組み合わせて、ＴＭ－２－２タンパク質に対してＣ８４８Ｒ、Ｎ８２２Ｃ、Ｎ８２２Ｆ、Ｎ８２２Ｍ、Ｎ８２２Ｙ、Ｎ８２２Ｗ、Ｎ８２５Ｈ、Ｎ８２５Ｋ、およびＮ８２５Ｔの変異のうちの少なくとも１つを含む。本発明はまた、そのような変異タンパク質をコードする遺伝子配列、好ましくは変異Ｔｍ－２－２遺伝子に関し、かつＴｏＢＲＦＶに対する耐性を付与する前記変異遺伝子をそのゲノム中に含む植物、特にソラヌム・リコペルシクム（トマト）植物に関する。本発明はまた、これらの植物の部分ならびに子孫、およびＴｏＢＲＦＶ耐性を提供するためのこれらの配列の使用を対象とする。

Description

本発明は、リコペルシクム・エスクレントゥム（Lycopersicum esculentum）としても知られるソラヌム・リコペルシクム（Solanum lycopersicum）（トマト）植物でのトバモウイルス、特にトマトブラウンルゴースフルーツウイルス（ＴｏＢＲＦＶ、以前の略称はＴＢＲＦＶ）、好ましくはさらにタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、トマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶ）、および／またはトマト斑点モザイクウイルス（ＴｏＭＭＶ）に対する耐性に関する。より具体的には、本発明は、少なくともＴｏＢＲＦＶ、好ましくは少なくとも１種のさらなるトバモウイルスに対する耐性を誘導する耐性遺伝子を含むトマト植物およびトマト果実に関する。本発明によると、これらのトバモウイルスに対する耐性を付与する耐性遺伝子は、Ｔｍ－２遺伝子およびＴｍ－２－２遺伝子の対立遺伝子の変異体である。耐性遺伝子は、トマト植物のゲノム中にホモ接合またはヘテロ接合で存在してもよい。本発明はさらに、この耐性遺伝子またはその一部、コードされたポリペプチドおよびタンパク質に関し、ならびにこれらの配列およびタンパク質を用いて耐性を有する植物を得ることに関する。本発明はまた、この植物の種子および子孫に関し、この植物を得るための繁殖部材に関し、かつこれらの植物の種々の活用に関する。

本発明の背景
トマトの全ての栽培形態および商業用形態は、最も頻繁にはリコペルシコン・エスクレントゥム・ミラー（Lycopersicon esculentum Miller）と呼ばれる種に属している。トマト属は、トウガラシ、タバコ、ナスなどの約９０個の属からなると考えられている非常に広範囲で多様なナス科の中の比較的小さな属である。トマト属は、２種の亜属、すなわち市販のトマトと容易に交配できる種を含むエスクレントゥム複合体と、交配がかなり困難な種を含むペルウィアヌム複合体に区分されている。作物としてのその価値に起因して、リコペルシコン・エスクレントゥム・ミラーが世界中に広く普及している。

トマトは、果実を目的に栽培されていて、生鮮市場への産物あるいは加工品として広く利用されている。作物としてのトマトは、環境条件が経済的に実行可能な収量での生産を可能にするのなら、どこでも商業的に栽培される。生鮮市場でのトマトの大部分は、茎が成長して成熟した緑色の段階で手作業により収穫される。生鮮市場では、トマトは一年中入手可能である。加工トマトは、殆どは機械で収穫され、缶詰めトマト、トマトジュース、トマトソース、ピューレ、ペースト、さらにケチャップなど様々な形態に用いられている。

トマトは、通常は１２対の分化した染色体を有する単純な二倍体の種である。但し倍数性のトマトも本発明の一部である。栽培されるトマトは自家受精でき、ほぼ例外なく自家受粉性である。トマトの花は雌雄同体である。市販の栽培品種は、当初は放任受粉性であった。トマトには雑種強勢が認められているので、より優れた収量および均一な植物特性を有する雑種が、放任受粉品種に取って代わり、農家の間で次第に汎用的になってきている。トマトは広く普及してその価値は高いことにより、集中的に品種改良が実施されてきた。このことが、現在このような幅広い種類のトマトが入手可能になった理由を物語っている。形状は幅広く小から大まで可能であり、サクランボ状、プラム状、ナシ状、ブロック型、丸型、ビフテキ型まで存在する。トマトは、植物が果実を成熟させて収穫するまでに要する時間によって分類されてもよく、一般的に栽培品種には、早生、中生、または晩生があると考えられる。トマトはまた、植物の成長習性、すなわち有限花序、半有限花序、または非有限花序の習性によって分類できる。有限花序の植物は、まずその葉を生長させ、次いで花を咲かせて受粉が成功すると成熟して実を結ぶ傾向がある。果実は全て、一本の木でほぼ同時に熟する傾向がある。非有限花序のトマトは、部分的な葉の生長から始まり、生長期の全体を通して葉および花を生成し続ける。これらの植物は、種々の成熟段階のトマト果実を常時実らせる傾向がある。半有限花序のトマトは、有限花序と非有限花序の中間の表現型を有し、それらトマトは有限花序の品種よりも大きく成長する点を除けば典型的な有限花序の種類となる。トマトの品種改良での最近の進歩により、果実の色はさらに多様になっている。トマトは、標準的な赤色の完熟色に加えて、クリーム白色、濃緑色、ピンク色、黄色、黄金色、オレンジ色、または紫色にできる。

雑種の市販トマトの種子は、手作業による受粉によって生産できる。雄親の花粉を採取して、近交系の雌親の柱頭表面に手で塗布する。人工受粉の前後には、昆虫が外来の花粉を持ち込んで混合物や不純物が生じないように花を覆う。花をタグ付けし受粉された果実を識別して、それから種子を収穫する。

ウイルス、真菌、細菌、線虫、および昆虫を含む様々な病原体がトマト植物の生産性に影響を及ぼす。トマトは、特に多くのウイルスに感染し易いので、ウイルス耐性は農業的に非常に重要である。

トバモウイルスは、世界中の農業、特に野菜および観賞用作物に深刻な被害を引き起こす最も重要な植物ウイルスの１つである。トバモウイルスは、器質的な手段によって伝染され易く、ならびに種子によっても伝染され易い。トバモウイルスは、一般的に、４つのタンパク質をコードする一本鎖のプラス鎖ＲＮＡゲノムをキャプシド形成する約３００ ｎｍの棒状粒子を特徴とする。トマトでは、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）およびトマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶ）は、例えば不規則な熟成などにより（果実の表面に黄色味のある斑模様を持ち、その表面の下部に茶色味のある斑点がある）、作物の生産に重大な損害を与える可能性があるので、世界中の生産者に恐れられている。しかし長年に亘って植物栽培家によっていくつかの遺伝子が識別されていて、現在ではＴＭＶおよび／またはＴｏＭＶに耐性を有するトマト品種を入手可能である。

最近になって、別のトバモウイルス、すなわちトマト斑点モザイクウイルス（ＴｏＭＭＶ）が、世界中のいくつかの国でトマト植物に感染することが報告されていて、この感染はトマト生産の年間収量および品質を低下させる。

トバモウイルスは、ウイルスのα様高次分類群に属する。それらは、鎖状のＲＮＡ（＋）ゲノムを包含する外被タンパク質（ＣＰ）のコピーで構成されるタンパク質性の桿状体細胞を有する。植物細胞への感染後に、ＲＮＡゲノムは外被除去後に転写されて、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）、移行タンパク質（ＭＰ）、および外被タンパク質（ＣＰ）を生成する。ウイルスの隣接細胞への感染ならびに長距離の移動は、移行タンパク質（ＭＰ）に依存している。

トバモウイルスなどの病原体に対する耐性には、耐性（Ｒ）遺伝子の存在が必要であり、そのポリペプチド産物であるＲタンパク質は、トバモウイルスの産物を識別して、続いて防御応答、一般的には過敏感反応を誘発できる。

過去数十年に亘って、最近の全ての有限花序のトマト品種および多くの有限花序のトマト品種は、確かに耐性遺伝子としてＴｍ－２遺伝子あるいは好ましくはこの遺伝子のＴｍ－２^２（Ｔｍ－２－２としても知られる）対立遺伝子を含んでいる。ソラヌム・ペルウィアヌム（野生種トマト）から移入されたこれらの遺伝子は、２０１４年以前に市販トマトに影響を及ぼしたトバモウイルス（ＴｏＭＶおよびＴＭＶ）のほぼ全ての既知の種に対して、確かに免疫を付与している。耐性遺伝子であるＴｍ－２－２はまた、ＴｏＭＭＶに対する耐性もほぼ付与しているように見受けられる（Ｎａｇａｉ ｅｔ ａｌ， ２０１９；Ｓｕｉ ｅｔ ａｌ， ２０１７）。

Ｔｍ－２（配列番号２）耐性遺伝子およびＴｍ－２－２（配列番号３）耐性遺伝子は、対立遺伝子であると考えられ、適合する非病原性（Ａｖｒ）タンパク質としてＴｏＭＶの移行タンパク質（ＭＰ）を共有する。ＴＭ－２タンパク質およびＴＭ－２－２タンパク質（それぞれ配列番号７および８）は、Ｒタンパク質のヌクレオチド結合部位／ロイシンリッチリピート型（ＮＢＳ－ＬＲＲタンパク質、ＮＬＲタンパク質としても知られる）の特徴を有し、易感染性のリコペルシクム・エスクレントゥム株から単離されたｔｍ－２対立遺伝子（配列番号１）によってコードされたポリペプチド（配列番号６）とはかなり異なる（Ｌａｎｆｅｒｍｅｉｊｅｒ ｅｔ ａｌ． ２００３）。Ｔｍ－２およびＴｍ－２－２を媒介とする耐性には、これらのＮＬＲタンパク質がトバモウイルス移行タンパク質（ＭＰ）を認識することが必要となる（Ｃａｌｄｅｒ ａｎｄ Ｐａｌｕｋａｉｔｉｓ １９９２；Ｍｅｓｈｉ ｅｔ ａｌ． １９８９；Ｗｅｂｅｒ ａｎｄ Ｐｆｉｔｚｎｅｒ １９９８；Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ． １９９３）。

ｔｍ２遺伝子とＴｍ－２遺伝子の産物間の差異は、Ｔｍ－２遺伝子とＴｍ－２－２遺伝子との間の差異と同様に、ロイシンリッチロイシンリッチ（ＬＲＲ）ドメインに集中している（Ｌａｎｆｅｒｍｅｉｊｅｒ ｅｔ ａｌ． ２００５）。

２０１４年から２０１５年にかけて、ウイルスの深刻な流行が、ヨルダンやイスラエルなどの中東でのトマト生産地域に影響を及ぼした。影響を受けたトマト品種の大半は、ＴＭＶ耐性および／またはＴｏＭＶ耐性を有すると考えられていたが、依然として深刻な影響を受けて典型的なＴＭＶ／ＴｏＭＶ様症状を呈示した。葉面の症状はＴＭＶ／ＴｏＭＶの症状に極めて類似していたが、果実の症状は、果実の病変や変形を伴うこれらウイルスによる通常の症状よりも遥かに頻度高く見られかつ重篤であった。果実の品質は非常に劣り、より端的にいえば市場に適さないものであった。Ｓａｌｅｍら（２０１５）は、新たなトバモウイルス種を配列決定して、このヨルダンのウイルスをトマトブラウンルゴースフルーツウイルス（略称は、以前はＴＢＲＦＶで現在はＴｏＢＲＦＶ）と命名するように提案した。他のトバモウイルス配列との比較により、そのウイルスは確かにトバモウイルスであるが、ＴＭＶやＴｏＭＶではないことが分かった。ＴＭＶおよび／またはＴｏＭＶに対する耐性は、この新たなウイルスであるＴｏＢＲＦＶに対する耐性を付与せず、すなわちＴｍ－２耐性遺伝子またはＴｍ－２－２耐性遺伝子のいずれかを含む植物は、依然としてＴｏＢＲＦＶに対して易感染性である。

Ｌｕｒｉａら（２０１７）は、イスラエルのトマトに感染するイスラエルトバモウイルスの完全なゲノムを並行して単離・配列決定し、イスラエルウイルスとヨルダンウイルスの間の非常に高い配列同一性（９９％を超える配列同一性）を明確にし、トマトブラウンルゴースフルーツウイルスの２種の異なる分離株であると結論付けた。

最近になってこのウイルスは、特にシチリア島、ドイツ、オランダ、およびフランスなどの欧州で、かつメキシコで確認されたので、現在ではトマト作物に対する国際的な重大な脅威と考えられている。

従って、この新たなトバモウイルスに対する耐性遺伝子の識別は、トマト栽培家にとって重要かつ緊急の課題となっている。

ＴｏＢＲＦＶに対する耐性を示すトマト植物の識別ならびにトマトブラウンルゴースフルーツウイルスに対する耐性を誘導する、以下でＱＴＬ（定量形質遺伝子座）とも呼ぶ遺伝決定基の位置特定および識別が、最近になって国際特許ＷＯ２０１８／２１９９４１号に開示されている。それぞれ染色体６および９上の２個のＱＴＬ、すなわちＱＴＬ１およびＱＴＬ２は、ソラヌム・リコペルシクムの背景内にホモ接合で存在する場合に、単独でまたは組合せでＴｏＢＲＦＶに感染したあるいは感染し得るトマト植物の果実に許容性または耐性の向上を付与する。染色体１１上の第３のＱＴＬ、すなわちＱＴＬ３は、ホモ接合で存在する場合に、ＴｏＢＲＦＶに感染したあるいは感染し得るトマト植物の葉部に許容性または耐性の向上を付与する。

単独または組合せのいずれかでのこれらのＱＴＬは、ＴｏＢＲＦＶに対する許容性または耐性を提供するが、この許容性／耐性は量依存でありかつ多遺伝子性であるように見受けられ、植物にはウイルスが含まれないことはない。さらにこれらのＱＴＬは、ホモ接合で存在する場合に耐性を提供すると説明されている。染色体９上のＱＴＬ２がＴｍ－２－２遺伝子と同じ遺伝子座に、すなわち一般的に組換えを伴わずに「一括して」伝達される領域内に存在する限り、そのような染色体９上のＱＴＬは、商業植物にとって依然として必須であるＴｍ－２－２遺伝子と結合するのが困難な可能性がある。

最近になってＷＯ２０２０／１４８０２１号は、ＴｏＢＲＦＶに対する耐性を付与する染色体８上の耐性遺伝子を開示していて、この遺伝子は、ＮＢＳ－ＬＲＲタンパク質（ヌクレオチド結合部位ロイシンリッチリピート）をコードしている。従ってこの文献に開示の耐性遺伝子は、ＴｏＢＲＦＶ、ＴＭＶ、およびＴｏＭＶに対する耐性を同時に提供するために、Ｔｍ－２－２耐性遺伝子と結合されることになる。

トバモウイルス粒子は非常に安定でかつ感染性が高いので、その感染防止は一般的に非常に困難である。従ってトバモウイルス感染症と戦う最も効果的な方法のうちの１つは、耐性遺伝子の遺伝的な導入である。従ってこの新たなトバモウイルスであるＴｏＢＲＦＶを含むいくつかのトバモウイルスに対する耐性を同時に向上する遺伝子を識別する緊急の必要性があり、これに失敗すると、これら地域全体でトマト作物がもはや生産できなくなる可能性がある。

植物性ＮＬＲタンパク質が広範囲に検討されている（Ｂａｇｇｓ ｅｔ ａｌ． ２０１７；Ｋａｐｏｓ ｅｔ ａｌ． ２０１９）。ＮＬＲは、植物内で「エフェクタータンパク質」を認識すると耐性応答を誘発するタンパク質である。ＮＬＲは、Ｎ末端ドメインに従って２つの主要な下位区分に分類される。２つの主要な下位区分は、Ｎ末端にそれぞれ二重コイル（ＣＣ）ドメインまたはトール／インターロイキン１受容体（ＴＩＲ）ドメインのいずれかを含むタンパク質であるＣＮＬおよびＴＮＬである。Ｎ末端ドメインに加えて、ＮＬＲはまた、ヌクレオチド結合（ＮＢ）ドメインおよびロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ドメインを有する。共通ドメイン（ＮＢ、ＬＲＲ、ＣＣ、およびＴＩＲ）のそれぞれは、ＮＬＲタンパク質の活性化に役割を果たすことが提示されている（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． ２０２０）。特にＬＲＲドメインは通常、エフェクタータンパク質の認識に関連している。結果として、ＬＲＲドメイン内の対立遺伝子の多様性は、エフェクタータンパク質結合の特異性に関連していることが多く、ＬＲＲドメインの多様性は正の選択を受けているように見受けられる（Ｍｏｎｄｒａｇｏｎ－Ｐａｌｏｍｉｎｏ ｅｔ ａｌ． ２００２）。ＬＲＲドメインはまた、自動活性化および下流へのシグナル伝達を阻害する自己抑制ドメインとしても機能する。ＮＢドメインはＡＴＰに結合し、それを活性形態と非活性形態に切り替えることができる。ＣＣドメインおよびＴＩＲドメインは、一般的にシグナル伝達に関与すると考えられている。さらに２つのＮＬＲタンパク質の間でＬＲＲドメインの一部を移動させると、ＮＬＲタンパク質に新たな特異性が付与される可能性があるという報告がある（Ｓｌｏｏｔｗｅｇ ｅｔ ａｌ． ２０１７）。

ＮＬＲタンパク質であるＴＭ２／ＴＭ－２－２の場合には、ＬＲＲドメイン内の単一アミノ酸（ＡＡ）の変化が、このタンパク質によって認識されるトバモウイルスの移行タンパク質（ＭＰ）の多様性の拡大を担っていることが証明されている（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ． ２０１１）。

本発明者らは、従来技術の教示に反して、ＴＭＶ、ＴｏＭＶ、およびＴｏＢＲＦＶに対する耐性が、種々の耐性遺伝子および耐性タンパク質の組合せを必要とせずに、単一の耐性遺伝子によってコードされる単一の耐性タンパク質によって付与できることを、予想外に見出した。

さらに本発明者らは、ＴｏＢＲＦＶに対する耐性を付与するそのようなタンパク質が、ＴＭＶおよびＴｏＭＶに対する耐性を付与するＮＬＲタンパク質の認識ドメイン、すなわちＬＲＲドメインを修飾して得ることができる、換言すればＴＭ－２－２タンパク質のＬＲＲドメインを修飾して得ることができることを見出した。

本発明は、ＴＭ－２－２タンパク質のＬＲＲドメインに由来する変異型ＬＲＲドメインに関し、前記変異型ＬＲＲドメインを含むＮＢＳ－ＬＲＲタンパク質により、少なくともＴｏＢＲＦＶ、好ましくはＴＭＶ、ＴｏＭＶ、および／またはＴｏＭＭＶ、最も好ましくはＴＭＶ、ＴｏＭＶ、およびＴｏＭＭＶを含むいくつかの異なるトバモウイルスの移行タンパク質を認識しかつ／あるいは結合するようになる。

本発明はまた、そのような変異型ＬＲＲドメインを含むポリペプチド、ならびに前記ドメインおよびポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に関する。

本発明はまた、少なくともＴｏＢＲＦＶに対する耐性を含むいくつかのトバモウイルスに対する耐性をトマトに付与するＴＭ－２－２タンパク質（配列番号８）の変異体または対立遺伝子変異体をコードする耐性遺伝子に関する。

新たに見出された耐性タンパク質またはＬＲＲドメインは、ＴＭ－２－２タンパク質のＬＲＲドメイン中の８２２位、８２５位、または８４８位の少なくとも１つの置換、すなわちアスパラギン（Ｎ）８２２のシステイン（Ｃ）、フェニルアラニン（Ｆ）、メチオニン（Ｍ）、チロシン（Ｙ）、またはトリプトファン（Ｗ）による置換、セリン（Ｓ）８２５のヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、またはトレオニン（Ｔ）による置換、システイン（Ｃ）８４８のアルギニン（Ｒ）による置換、あるいはこれらの置換の組合せにより、好ましくはＴｏＭＶおよびＴＭＶに対する耐性に加えて、ＴｏＢＲＦＶに対する耐性を付与する。

さらなる置換、好ましくは６５５位のフェニルアラニン（Ｆ）のロイシン（Ｌ）による置換により、８４８位、８２２位、および／または８２５位の置換、特に８４８位の置換によって付与される耐性を向上させてもよい。

本発明はまた、市販の植物、系統、および雑種を含む、ＴｏＢＲＦＶに対する耐性を示す植物、特にトマト植物を提供し、ならびにＴｏＢＲＦＶに対する耐性を示す植物、特にトマト植物またはトマト群（生殖質）を生産または識別する方法を提供する。本発明はまた、新たに見出された耐性遺伝子に結合する分子遺伝マーカーを開示する。さらにこのような分子マーカーの方法および使用によって得られる植物を提供する。

本発明はまた、ＴｏＢＲＦＶ耐性植物を識別する方法、ＴｏＢＲＦＶを含む種々のトバモウイルスが蔓延する環境でのトマト生産の収量を向上する方法、ＴｏＢＲＦＶを含むトバモウイルスの蔓延からトマト畑を保護する方法、および少なくともＴｏＢＲＦＶに対する耐性を付与するＴｍ－２－２遺伝子またはＴｍ－２遺伝子の変異体を識別、検出、および／または選択する方法などのいくつかの方法を提供する。

定義
用語「耐性」は、野菜種子産業での有害生物または病原体および非生物的ストレスに対する植物の反応の説明のためにＩＳＦ（国際種子連盟）の野菜および観賞用作物部門が定義する通りである。具体的には耐性とは、同一の環境条件および有害生物または病原体の影響力で、易感染性の植物品種と比較した場合に、特定の有害生物または病原体の成長および増殖および／またはそれらが引き起こす被害を抑制する植物品種の能力を意味する。耐性を有する品種は、重度の有害生物や病原体の影響力で何らかの病気の症状または被害を呈する場合がある。２種の耐性基準が定義されている。

高度の耐性：易感染性の植物に比較して、通常の有害生物の圧力で特定の有害生物の成長および／または増殖および／またはその有害生物が引き起こす被害が高度に抑制される植物を指す。但しこれらの植物は、重度の有害生物の影響力では何らかの症状や損傷を示す場合がある。

中度の耐性：特定の有害生物の成長および／または増殖および／またはその有害生物が引き起こす被害を高度に抑制するが、高度の耐性植物に対比してより広範囲の症状または被害を呈する可能性がある植物を指す。中度の耐性植物は、同一の環境条件および／または有害生物の影響力で栽培した場合に、易感染性植物ほど深刻な症状または被害を呈することはない。

用語「許容性」は通常、成長、外観、および収量に深刻な影響を及ぼすことなく非生物的ストレスに耐える植物の能力を説明するのに用いられる。

但し文献や特許では、この用語を用いて、植物が感染量のウイルスに曝露されても病気の症状の少なくとも一部を発生させない状態で、少なくともいくつかの培養条件では、全身的または局所的な感染、ウイルスの増殖、少なくとも前記植物の細胞内でのウイルスゲノム配列の存在、および／またはそのゲノムの組込みを構築できる植物の表現型を示す。従って許容性のある植物は、症状の発現には耐性があるが、ウイルスの無症状保菌体となる。場合によっては、ウイルス配列は、病気症状を引き起こすことなく植物内に存在しさらに増殖する場合がある。許容性のある植物は一般に、ウイルスに感染しているにも拘らず、ウイルスの成長および増殖を少なくとも適度に抑制できることが分かっている。これを根拠に、本定義による許容性のある植物は、中度の耐性植物を特徴とするのが最も適切である。

ＴｏＢＲＦＶ感染の葉部への症状には、一般的に、モザイク、小葉部の変形、また多くの場合に靴紐様症状が挙げられる。ＴｏＢＲＦＶ感染の果実への症状には、一般的に、典型的な黄色病変（変色）および果実の変形が含まれる。多くの場合に、果実への「赤色斑点病」も見られる。

易感染性：特定の有害生物または病原体の成長および増殖を植物が抑制できないことを指し、易感染性植物は、ウイルス感染に関連する有害な症状、すなわちＴｏＢＲＦＶ感染の場合には葉部の損傷および果実の損傷を示す。

トマトブラウンルゴースフルーツウイルスに対し易感染性のトマト植物には、例えば、Ｓａｌｅｍらからの刊行物（２０１５）に述べる市販品種のカンデラ（Ｃａｎｄｅｌａ）が挙げられる。

本明細書で使用される用語「子孫」または「後代」は、１つ以上の親植物またはその後継からの栄養生殖または有性生殖から後代として生じる任意の植物を指す。例えば子孫植物は、親植物のクローンもしくは自家受粉によって、あるいは２種の親植物の交配によって得られ、自家受粉、ならびにＦ１もしくはＦ２世代、またはさらなる世代を含んでもよい。Ｆ１は、少なくともその一方が初めて形質のドナーとして用いられる親から生産された第１世代の子孫であり、第２世代（Ｆ２）またはその後の世代（Ｆ３、Ｆ４など）の子孫は、第１世代、第２世代などの自家受粉から生産された試料である。従って、Ｆ１は２種の真の育種親（真の育種親は１つの形質に対しホモ接合性である）の間の交配から生じる雑種であってもよく、Ｆ２は前記Ｆ１雑種の自家受粉から生じる子孫であってもよい（通常はその子孫である）。

本明細書で使用される用語「交配する」、「交配」、「他家受粉」または「交雑育種」は、１つの植物の１つの花の花粉が、別の植物の１つの花の胚珠（柱頭）に（人工的にまたは天然に）塗布されるプロセスを指す。

本明細書で使用される用語「遺伝子型」は、個々の細胞、細胞培養物、組織、生物（例えば植物）、または生物群の遺伝子構造を指す。

本明細書で使用される用語「接ぎ木」は、台木に接ぎ穂を移植する操作である。接ぎ木の主な目的は、病気管理のための遺伝手法または化学手法が利用可能でない場合に、土壌由来の有害生物および病原体による被害を回避することである。易感染性の接ぎ穂を耐性のある台木に接ぎ木することにより、品種内に耐性を育種する必要がなく耐性品種を提供できる。さらに接ぎ木により非生物的ストレスに対する耐性を強化でき、収量を向上でき、かつより効率的な水および栄養素の使用を可能にできる。

本明細書で使用される用語「ヘテロ接合体」は、少なくとも１つの遺伝子座に存在する種々の対立遺伝子（所定の遺伝子、遺伝決定基、または遺伝配列の形態）を有する二倍体または倍数体の個々の細胞または植物を指す。

本明細書で使用される用語「ヘテロ接合性」は、特定の遺伝子座に種々の対立遺伝子（所定の遺伝子、遺伝決定基、または遺伝配列の形態）が存在することを指す。

本明細書で使用される用語「ホモ接合体」は、全ての相同染色体の１つ以上の遺伝子座に同一の対立遺伝子を有する個々の細胞または植物を指す。

本明細書で使用される用語「ホモ接合性」は、相同染色体部分の１つ以上の遺伝子座に同一の対立遺伝子が存在することを指す。

本明細書で使用される用語「雑種」は、１つ以上の遺伝子が異なる親の間の交配から生じる任意の個々の細胞、組織、または植物を指す。

本明細書で使用される用語「遺伝子座」は、遺伝的に定義された任意の部位を指し、この部位は単一の位置（ヌクレオチド）または染色体領域であってもよい。遺伝子座は、遺伝子、遺伝決定基、遺伝子の一部、またはＤＮＡ配列であってもよく、種々の配列で占有されていてもよい。遺伝子座は、１つのＳＮＰ（一塩基多型）、複数のＳＮＰ、または隣接する２つのＳＮＰで定義されてもよい。

本明細書で使用される用語「台木」は、接ぎ木プロセスで接ぎ穂を受け入れることができる植物の下方部分を意味する。

本明細書で使用される用語「接ぎ穂」は、接ぎ木プロセスで台木上に接ぎ木することができる植物の上方部分である。

本発明は、種々の倍数性基準の植物、実質的には二倍体植物、さらに三倍体植物、四倍体植物などを包含する。

本発明の詳細な説明
本発明者らは、ＴＭ－２－２タンパク質のＬＲＲドメインの変異体を識別し、ＬＲＲドメインの前記変異体を含むＮＢＳ－ＬＲＲタンパク質により、少なくともＴｏＢＲＦＶ（トマトブラウンルゴースフルーツウイルス）、好ましくはＴＭＶ（タバコモザイクウイルス）および／またはＴｏＭＶ（トマトモザイクウイルス）、また好ましくはＴｏＭＭＶ（トマト斑点モザイクウイルス）を含むいくつかのトバモウイルスの移行タンパク質（ＭＰ）を認識かつ／あるいは結合する。

従って本発明は、ＴＭ－２－２タンパク質のロイシンリッチリピートの変異体すなわち配列番号１１の変異体に関し、ここで前記変異体は、配列番号１１と少なくとも９０％の配列同一性を有し、ＮＢＳ－ＬＲＲタンパク質内に組み込まれる場合に、前記変異体は、少なくともＴｏＢＲＦＶの移行タンパク質（配列番号１５）、また好ましくはＴｏＭＶのＭＰ（配列番号１４）および／またはＴＭＶのＭＰ（配列番号１３）、さらに好ましくはＴｏＭＭＶのＭＰ（配列番号１６）を認識かつ／あるいは結合する能力を付与する。対照的に、ＴＭ－２－２のＬＲＲドメインすなわち配列番号１１は、ＴｏＭＶおよびＴＭＶのＭＰに結合する能力を付与するが、ＴｏＢＲＦＶのＭＰへの顕著な結合または認識を付与しない。本発明のＴＭ－２－２のＬＲＲドメインの変異体は、本発明のＬＲＲ変異体もしくは変異種、またはＬＲＲドメインの変異体もしくは変異種、またはＬＲＲ変異体ドメインと互換的に呼ばれる。

本発明のＬＲＲ変異体によるＴＭ－２－２のＬＲＲドメインすなわち配列番号１１の置換は、このように得られたタンパク質へのＴｏＢＲＦＶのＭＰの認識を付与する、すなわちＴｏＢＲＦＶのＭＰを認識するタンパク質を形成する。

ＮＢＳ-ＬＲＲタンパク質は、直接的または間接的にＴｏＢＲＦＶのＭＰに結合する場合に、ＴｏＢＲＦＶのＭＰを認識すると言われていて、直接的または間接的な結合は、ＬＲＲドメイン基準であってもよく、あるいはタンパク質の全体が関与してもよい。このような認識は、実施例に開示される測定法によって検査できる。

本発明者らはさらに、ＴｏＢＲＦＶのＭＰの認識を付与する変異が、ＴＭ－２－２タンパク質（配列番号８）の８２２位、８２５位、および８４８位のアミノ酸のうちの少なくとも１つの置換に依ることを、より具体的には、以下からなる置換のうちの少なくとも１つの置換に依ることを実証した：
・配列番号１１（ＴＭ－２－２のＬＲＲドメイン；ＴＭ－２－２タンパク質のアミノ酸４７７～８６１に対応する）の３７２位に対応するＴＭ－２－２タンパク質（配列番号８）の８４８位にあるシステイン（Ｃ）のアルギニン（Ｒ）による置換；
・配列番号１１（ＴＭ－２－２のＬＲＲドメイン）の３４６位に対応するＴＭ－２－２タンパク質（配列番号８）の８２２位にあるアスパラギン（Ｎ）のシステイン（Ｃ）、フェニルアラニン（Ｆ）、メチオニン（Ｍ）、チロシン（Ｙ）、またはトリプトファン（Ｗ）による置換；および
・配列番号１１（ＴＭ－２－２のＬＲＲドメイン）の３４９位に対応するＴＭ－２－２タンパク質（配列番号８）の８２５位にあるセリン（Ｓ）のヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、またはトレオニン（Ｔ）による置換。

従って本発明によるＬＲＲ変異体は、ＴＭ－２－２タンパク質中のシステイン８４８に対応する位置でのアルギニンの存在、および／またはＴＭ－２－２タンパク質中のアスパラギン８２２に対応する位置でのシステイン、フェニルアラニン、メチオニン、チロシン、またはトリプトファンの存在、および／またはＴＭ－２－２タンパク質のセリン８２５に対応する位置でのヒスチジン、リジン、またはトレオニンの存在によって特徴付けられる。本発明のＬＲＲ変異体は、説明された置換のうちの１つを、８２２位、８２５位、および８４８位のうちの１つの位置のみ、またはそれらのうちの２つの位置、またはそれら全部の位置に含んでもよい。本発明のＬＲＲ変異体は、Ｃ８４８Ｒ置換とＮ８２２Ｙ置換を同時に含まないことが好ましい。

好ましい実施態様によれば、８２２位、８２５位、および８４８位のうちの１つの位置のみが置換される。

本発明者らはさらに、本発明のＬＲＲ変異体の６５５位での変異または置換、好ましくはロイシン（Ｌ）によるフェニルアラニン（Ｆ）の置換により、ＴｏＢＲＦＶのＭＰの認識が向上できることを明らかにした。理論により束縛はされないが、６５５位での変異により、ＴｏＢＲＦＶのＭＰと相互作用するＬＲＲ変異体のドメインの提示が改善されることが予測される。従って本発明の好ましいＬＲＲ変異体はまた、６５５位に変異、より好ましくはＦ６５５Ｌ変異を含む。ＴＭ２－２タンパク質全体に関して、６５５位は、配列番号１１（ＴＭ－２－２のＬＲＲドメイン）の１７９位に対応する。

本発明の変異体はまた、ＴＭ－２－２タンパク質中のチロシン７６７に対応する位置でのチロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）、またはトリプトファン（Ｗ）の存在、すなわちＴＭ－２－２のＬＲＲ（配列番号１１）の２９１位に対応するＬＲＲ変異体中の位置にあるＹ、Ｆ、またはＷの存在によって特徴付けられる。確かに本発明者らが実験の段落で示すように、ＴＭ－２－２のＬＲＲ／タンパク質中の天然起源の前記チロシンは、機能を失わずにＦまたはＷによって置換できる。さらにこの位置は、Ｋｏｂａｙａｓｈｉらの文献に示されるように、ＴｏＭＶに対して永続的な耐性を提供する。

以下でのアミノ酸の番号付けは、全長ＴＭ－２－２タンパク質（配列番号８）内の前記アミノ酸の位置に相当する。

特定のＬＲＲドメインがＮＢＳ－ＬＲＲタンパク質、特にＴＭ－２－２タンパク質に対して付与する能力、すなわち少なくともトマトブラウンルゴースフルーツウイルス（ＴｏＢＲＦＶ）の移行タンパク質を認識かつ／あるいは結合する能力は、実験の段落で開示される一過性の発現測定法、すなわちＴｏＢＲＦＶのＭＰの存在で試験対象のＬＲＲドメインを含むＮＢＳ－ＬＲＲタンパク質をベンサミアナ・タバコ中で一過的に発現させ、かつ過敏感反応を検査することで容易に試験できる。ＮＢＳ－ＬＲＲタンパク質は、天然起源のＬＲＲドメインが試験対象のＬＲＲ変異体で置換されているＴＭ－２－２タンパク質であることが好ましい。

本発明のＬＲＲドメイン変異体は、本発明のＬＲＲ変異体によるＴＭ－２－２のＬＲＲドメインすなわち配列番号１１の置換により、ＴｏＭＶ、ＴＭＶ、および／またはＴｏＭＭＶ、好ましくは少なくともＴＭＶおよびＴｏＭＶのＭＰを認識する能力を保持するものであることが好ましい。

本発明のＬＲＲドメイン変異体は、ＴＭ－２－２のＬＲＲドメインの配列に対応する配列番号１１に対してアミノ酸の基準で少なくとも９０％の配列同一性を示す。

２つのアミノ酸配列間の配列同一性は、本発明のドメインで通常に定義される通りである。配列同一性を定義するための適切なプログラムは、例えばクラスタル・オメガ（Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ）である。

本発明の好ましい実施態様によれば、ＬＲＲ変異体は、配列番号１１に対して好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、少なくとも９７％、または少なくとも９８％の配列同一性を有する。さらなる実施態様によれば、ＬＲＲ変異体は、配列番号１１に対して９９％以上の配列同一性を有する。

ＴＭ－２－２の野生型ＬＲＲドメインに対する配列同一性の比率に関係なく、本発明による変異体は、ＴＭ－２－２タンパク質の７６７位に対応する位置にＹ、Ｆ、またはＷ、および以下のうちの１種以上を含む：
・ＴＭ－２－２タンパク質のシステイン８４８に対応する位置にあるＲ；
・ＴＭ－２－２タンパク質のアスパラギン８２２に対応する位置にあるＣ、Ｆ、Ｍ、Ｙ、またはＷ；および
・ＴＭ－２－２タンパク質のセリン８２５に対応する位置にあるＨ、Ｋ、またはＴ。

変異体はまた、上述の変異に加えて、ＴＭ－２－２タンパク質の６５５位に対応する位置にロイシン（Ｌ）を含むことが好ましい。

ＴＭ－２－２のＬＲＲドメインの三次元構造内のアミノ酸８２２、８２５、および８４８の近傍でのＬＲＲドメインの変異は、制限されることが好ましく、すなわち８２２位、８２５位、および８４８位の近傍のアミノ酸は、８２３位、８２６位、８２７位、８３０位、８４７位、８４９位、８５０位、８５１位、８５７位、および８５８位である。但し実施例に示されるように、Ｋ８５７Ｑ置換などのこれらの位置でのいくつかの変異は許容される。

従って、本発明のＬＲＲ変異体と配列番号１１との間の変形または変異は、好ましくは、（ＴＭ－２－２タンパク質中のアミノ酸８２２、８２５、および８４８に対応する）アミノ酸３４６、３４９、および３７２の近傍にあるアミノ酸とは異なるアミノ酸に関連する。

変形または変異は、好ましくはＬＲＲドメインの三次元構造を保存する、好ましくは保存的アミノ酸置換である。

すなわち、リジンまたはアルギニンなどの塩基性アミノ酸は、別の塩基性アミノ酸で置換されることが好ましく、アスパラギン酸またはグルタミン酸などの酸性アミノ酸は、別の酸性アミノ酸で置換されることが好ましい。グリシン、アラニン、プロリン、システイン、またはバリンなどの小さな無極性アミノ酸は、別の小さな無極性アミノ酸によって置換されることが好ましい。ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、またはトリプトファンなどの大きな無極性アミノ酸は、別の大きな無極性アミノ酸によって置換されることが好ましい。セリンまたはトレオニンなどの小さな極性アミノ酸は、別の小さな極性アミノ酸によって置換されることが好ましい。アスパラギンまたはグルタミンなどの大きな極性アミノ酸は、別の大きな極性アミノ酸によって置換されることが好ましい。チロシン、フェニルアラニン、またはトリプトファンなどの芳香族アミノ酸は、別の芳香族アミノ酸で置換されることが好ましい。

本発明による可能性のある変形または変異は、実験の段落で示すように、ＴＭ－２－２の６５５位、または８５７位、および／または７６９位に対応するアミノ酸に関連してもよい。

好ましい実施態様によれば、本発明によるＬＲＲドメイン変異体は、ＴＭ－２－２のＬＲＲドメインに対して２０個以下の変異、好ましくは１５個以下の変異、より好ましくは１０個以下の変異を示す。前記変異は、好ましくは保存的変異であり、それら変異は、好ましくは、システイン８４８置換、アスパラギン８２２置換、およびセリン８２５置換の近傍にはないＬＲＲドメインの位置に見られる。

本発明による可能性のあるＬＲＲ変異は、６５５位のロイシン（Ｌ）、８４８位のアルギニン（Ｒ）および７６７位のチロシン（Ｙ）、あるいは６５５位のロイシン（Ｌ）、８４８位のアルギニン（Ｒ）および７６７位のフェニルアラニン（Ｆ）、あるいは６５５位のロイシン（Ｌ）、８４８位のアルギニン（Ｒ）および７６７位のトリプトファン（Ｗ）、あるいは８４８位のアルギニン（Ｒ）および７６７位のチロシン（Ｙ）を含み、ならびに実施例に示される全てのＬＲＲ変異を含む。

本発明はまた、上述の定義のようにＬＲＲドメインの変異をコードするヌクレオチド配列に関する。遺伝コードの縮重を考慮すると、ＴＭ－２－２タンパク質のシステイン８４８に対応する位置にあるアルギニン、および／またはアスパラギン８２２に対応する位置にあるシステイン、フェニルアラニン、メチオニン、チロシン、またはトリプトファン、および／またはセリン８２５に対応する位置にあるヒスチジン、リジン、またはトレオニンによって本質的に特徴付けられる本発明のＬＲＲドメインの変異体をコードする、すなわち配列番号１１の変異体をコードする大きく異なるヌクレオチド配列が想定でき、ここで配列番号１１の前記変異体は、７６７位にチロシン、フェニルアラニン、またはトリプトファンを有し、６５５位にロイシンを有する可能性がある。この配列は、単離されていても単離されていなくてもよい。

適切なヌクレオチド配列は、例えば、配列番号１２に対応する配列すなわちＴｍ－２－２のＬＲＲをコードする野生型配列であり、ここで少なくともＴＭ－２－２の８４８位のシステインに対応するコドンは、アルギニンに対応するコドンによって置換されていて、あるいは少なくともＴＭ－２－２の８２２位のアスパラギンに対応するコドンは、システイン、フェニルアラニン、メチオニン、チロシン、またはトリプトファンに対応するコドンによって置換されていて、あるいは少なくともＴＭ－２－２の８２５位のセリンに対応するコドンは、ヒスチジン、リジン、またはトレオニンに対応するコドンによって置換されている。適切なヌクレオチド配列は、例えば、配列番号４または５のヌクレオチド１４２９～２５８６（または終止コドンを除く２５８３）である。他の適切なヌクレオチド配列は、配列番号１２に由来し、以下のコドンのうちの少なくとも１つが置換されている：
・ＴＭ－２－２の８４８位にシステインをコードするコドンＴＧＣ、すなわち配列番号１２の１１１４～１１１６位のヌクレオチドが、アルギニンをコードするコドンによって、すなわちＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、またはＣＴＧによって置換されている；
・ＴＭ－２－２の８２２位にアスパラギンをコードするコドンＡＡＴ、すなわち配列番号１２の１０３６～１０３８位のヌクレオチドが、システインをコードするコドンによって、すなわちＴＧＴまたはＴＧＣによって置換されていて、フェニルアラニンをコードするコドンによって、すなわちＴＴＴまたはＴＴＣによって置換されていて、メチオニンをコードするコドンによって、すなわちＡＴＧによって置換されていて、チロシンをコードするコドンによって、すなわちＴＡＴまたはＴＡＣによって置換されていて、あるいはトリプトファンをコードするコドンによって、すなわちＴＧＧによって置換されている；および
・ＴＭ－２－２の８２５位にセリンをコードするコドンＴＣＴ、すなわち配列番号１２の１０４５～１０４７位のヌクレオチドが、ヒスチジンをコードするコドンによって、すなわちＣＡＴまたはＣＡＣによって置換されていて、リジンをコードするコドンによって、すなわちＡＡＡまたはＡＡＧによって置換されていて、あるいはトレオニンをコードするコドンによって、すなわちＡＣＣ、ＡＣＴ、ＡＣＧ、またはＡＣＡによって置換されている。

さらに、ＴＭ－２－２の７６７位にチロシンをコードするコドンＴＡＣ、すなわち配列番号１２の８７１～８７３位のヌクレオチドは、フェニルアラニンをコードするコドンによって、すなわちＴＴＴまたはＴＴＣによって、あるいはトリプトファンをコードするコドンによって、すなわちＴＧＧによって置換されていてもよい。

ＴＭ－２－２の６５５位にフェニルアラニンをコードするコドン、すなわち配列番号１２の５３５～５３７位のヌクレオチドは、ロイシンをコードするコドンによって、すなわちＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、ＣＴＧ、ＴＴＡ、またはＴＴＧによって置換されていてもよい。

本発明はまた、配列番号１２に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する配列番号１２に由来する配列に関する。配列番号１２に対する配列同一性の百分率に関係なく、本発明による配列は、上述に定義の本発明のＬＲＲドメイン変異体をコードする。遺伝コードの縮重を考慮すると、本発明のＬＲＲドメイン変異体をコードする配列は、配列番号１２に対して７０％未満の配列同一性を有してもよいが、この配列もまた本発明の範囲内である。

さらなる側面によれば、本発明はまた、本発明の変異型ＬＲＲドメインを含むポリペプチドおよびタンパク質に関し、特に少なくともＴｏＢＲＦＶの移行タンパク質（ＭＰ）、好ましくは少なくともＴｏＭＶまたはＴＭＶ、さらに好ましくはＴｏＭＭＶを含む他のトバモウイルスの移行タンパク質（ＭＰ）を認識または結合するポリペプチドおよびタンパク質に関する。

本発明の好ましい実施態様によれば、目的の変異型または変形型ＬＲＲドメインを含むタンパク質は、ＮＬＲ類のタンパク質（ＮＢＳ－ＬＲＲ）のメンバーであり、より好ましくは二重コイルＮＬＲ（ＣＣ－ＮＢＳ－ＬＲＲ）である。Ｓｌｏｏｔｗｅｇらが示すように、ＮＢＳ－ＬＲＲタンパク質間のＬＲＲの交換は、確かにＮＢＳ－ＬＲＲタンパク質の標的を修飾する可能性がある。従って本発明のＬＲＲドメイン変異体は、任意のＮＢＳ－ＬＲＲの野生型ＬＲＲに置換でき、これによりＴｏＢＲＦＶのＭＰ、好ましくはＴｏＭＶ、ＴＭＶ、および／またはＴｏＭＭＶのＭＰを特異的に標的とするキメラ型ＮＢＳ－ＬＲＲを形成できる。

従って本発明はまた、ＮＢＳ－ＬＲＲタンパク質のＮＢＳ部分および本発明によるＬＲＲドメイン変異体を含むそのようなキメラ型ＮＢＳ－ＬＲＲタンパク質を包含する。上述に示すように、このようなＮＢＳ－ＬＲＲタンパク質は、好ましくはＣＣ－ＮＢＳ－ＬＲＲである。

このような本発明のＮＢＳ－ＬＲＲタンパク質は、好ましくは、本発明のＬＲＲドメイン変異体に融合された配列番号８のアミノ酸１～４７６に対応するＴＭ－２－２タンパク質のＮＢＳ部分を含む。このタンパク質は、有利なことには、配列番号９（ＴＭ２－１４－２５）、配列番号１０（ＴＭ２－４６７）、配列番号１７（ＴＭ２－４）、配列番号１８（ＴＭ２－５）、配列番号１９（ＴＭ２－８２５Ｈ）、配列番号２０（ＴＭ２－８２５Ｋ）、配列番号２１（ＴＭ２－８２５Ｔ）、配列番号２２（ＴＭ１－８２２Ｃ）、配列番号２３（ＴＭ２－８２２Ｆ）、配列番号２４（ＴＭ２－８２２Ｍ）、配列番号２５（ＴＭ２－８２２Ｙ）、または配列番号２６（ＴＭ２－８２２－Ｗ）の配列を有してもよい。従って本発明のこれらのタンパク質は、ＴＭ－２－２タンパク質変異体であり、ＬＲＲドメイン内だけに存在するＴＭ－２－２タンパク質とは異なる。

本発明の別のＮＢＳ－ＬＲＲタンパク質は、本発明のＬＲＲドメイン変異体に融合された配列番号６および７の（ｔｍ２遺伝子およびＴｍ２遺伝子によってコードされたタンパク質に対応する）ＮＢＳ部分を含む。

本発明はまた、ＴＭ－２－２タンパク質の配列（配列番号８）に対して少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有し、ＴｏＢＲＦＶのＭＰと相互作用しかつ／あるいはそれを認識しあるいは標的とするＴＭ－２－２タンパク質変異体に関し、この変異体は、配列番号８のＹ７６７に対応する位置にチロシン、フェニルアラニン、またはトリプトファンを含み、かつ配列番号８のＣ８４８に対応する位置にアルギニン、Ｓ８２５に対応する位置にヒスチジン、リジンまたはトレオニン、およびＮ８２２に対応する位置にシステイン、フェニルアラニン、メチオニン、チロシン、またはトリプトファンのうちの少なくとも１種を含み、すなわちＮ８２２Ｃ、Ｎ８２２Ｆ、Ｎ８２２Ｍ、Ｎ８２２Ｙ、Ｎ８２２Ｗ、Ｓ８２５Ｈ、Ｓ８２５Ｋ、Ｓ８２５Ｔ、およびＣ８４８Ｒの変異のうちの少なくとも１種を含む。このような変異体はまた、配列番号８のＦ６５５に対応する位置にロイシンを含んでもよい。ＴＭ－２－２タンパク質内の変異は、タンパク質のＮＢＳドメインまたはＬＲＲドメイン内に存在してもよい。これらの変異は、主にＮＢＳドメイン内で見られることが好ましい。ＬＲＲドメイン中の変異に関して、変形または変異の要件は、本発明のＬＲＲ変異体に関連して前述した通りである。変形または変異は、好ましくは保存的変異である。変異体は、単離されていても単離されていなくてもよい。

好ましい実施態様によれば、８２２位、８２５位、および８４８位のうちの１つの位置のみが置換されている。別の実施態様によれば、前記位置のうちの２つの位置、またはこれらの位置の全てが置換されている。この変異体は、Ｃ８４８Ｒ置換とＮ８２２Ｙ置換を同時に含まないことが好ましい。

本発明によるＴＭ－２－２タンパク質変異体は、ＴＭ－２－２タンパク質の配列に対して全体的に少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有し、ＬＲＲドメイン基準で少なくとも９５％の配列同一性を有するのが好ましい。さらなる実施態様によれば、本発明のＴＭ－２－２タンパク質変異体の配列同一性の全体的な百分率は、配列番号８に対して少なくとも９５％であり、好ましくはＬＲＲドメイン基準ではより高い配列同一性を有する。ＴＭ－２－２タンパク質と配列番号８との間の配列同一性は、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、さらに少なくとも９９％であることが好ましい。

好ましい実施態様によれば、本発明によるＴＭ－２－２タンパク質変異体は、ＴＭ－２－２タンパク質に対して６０個以下の変異、好ましくは５０個以下の変異、より好ましくは２０個以下の変異を示す。前記変異は、好ましくは保存的変異であり、これら変異は、ＬＲＲドメインではないタンパク質のドメイン内に大部分が見られることが好ましい。

本発明によるＴＭ－２－２タンパク質変異体は、ＴｏＢＲＦＶのＭＰの存在で、好ましくはＴＭＶ、ＴｏＭＶ、およびＴｏＭＭＶのうちの少なくとも１つを含む他のトバモウイルスのＭＰの存在で過敏感反応（ＨＲ）を誘発する。従って本発明によるＴＭ－２－２タンパク質変異体は、トマトでのＴｏＢＲＦＶ感染に対する耐性を付与し、好ましくは、ＴＭＶ、ＴｏＭＶ、およびＴｏＭＭＶなどの他のトバモウイルスに対する耐性を付与する。

なおこの点に関して、ベンサミアナ・タバコのような代用植物での一過性発現測定法による過敏感反応の検出は、トマトでの耐性の検出と同等になる。ＮＢＳ－ＬＲＲタンパク質が（トバモウイルスのＭＰの存在で）ベンサミアナ・タバコの葉で強力なＨＲ反応を引き起こす能力とトマトでのウイルス耐性との間には、確かに完全な相関関係が存在する。この点については、実験の段落に示すように発明者らによって確認されている。

さらに別の実施態様によれば、本発明はまた、上述のポリペプチドまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列、特に本発明のＬＲＲドメイン変異体、本発明の既述のキメラ型ＮＢＳ－ＬＲＲ、またはＴＭ－２－２タンパク質変異体を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を対象とする。本発明によるヌクレオチド配列には、少なくともＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、およびＤＮＡとＲＮＡの混合物が包含される。この配列は単離されていても単離されていなくてもよい。

適切なヌクレオチド配列は、例えば配列番号４または５であり、これらの配列は、野生型配列であるＴｍ－２－２をコードするＴＭ－２－２に由来し、ここで少なくともＴＭ－２－２の８４８位にあるシステインに対応するコドンは、アルギニンに対応するコドンによって置換されている。従って本発明はまた、例えば配列番号４（Ｔｍ２－１４－２５）または配列番号５（Ｔｍ２－４６７）のような変異Ｔｍ－２－２遺伝子を対象とする。本発明はまた、野生型配列であるＴｍ－２－２をコードするＴＭ－２－２に対応する配列番号３に由来する配列を対象とし、この配列では以下のコドンのうちの少なくとも１つが置換されている：
・ＴＭ－２－２の８４８位にシステインをコードするコドンＴＧＣ、すなわち配列番号３の２５４２～２５４４位のヌクレオチドが、アルギニンをコードするコドン、すなわちＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、またはＣＴＧによって置換されている；
・ＴＭ－２－２の８２２位にアスパラギンをコードするコドンＡＡＴ、すなわち配列番号３の２４６４～２４６６位のヌクレオチドが、システインをコードするコドン、すなわちＴＧＴまたはＴＧＣによって、フェニルアラニンをコードするコドン、すなわちＴＴＴまたはＴＴＣによって、メチオニンをコードするコドン、すなわちＡＴＧによって、チロシンをコードするコドン、すなわちＴＡＴまたはＴＡＣによって、あるいはトリプトファンをコードするコドン、すなわちＴＧＧによって置換されている；かつ／あるいは
・ＴＭ－２－２の８２５位にセリンをコードするコドンＴＣＴ、すなわち配列番号３の２４７３～２４７５位のヌクレオチドが、ヒスチジンをコードするコドン、すなわちＣＡＴまたはＣＡＣによって、リジンをコードするコドン、すなわちＡＡＡまたはＡＡＧによって、あるいはトレオニンをコードするコドン、すなわちＡＣＣ、ＡＣＴ、ＡＣＧ、またはＡＣＡによって置換されている。

ＴＭ－２－２の７６７位にチロシンをコードするコドンＴＡＣ、すなわち配列番号３の２２９９～２３０１位のヌクレオチドがさらに、フェニルアラニンをコードするコドン、すなわちＴＴＴまたはＴＴＣによって、あるいはトリプトファンをコードするコドン、すなわちＴＧＧによって置換されていてもよい。

ＴＭ－２－２の６５５位にフェニルアラニンをコードするコドンＴＴＴ、すなわち配列番号３の１９６３～１９６５位のヌクレオチドがさらに、ロイシンをコードするコドン、すなわちＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、ＣＴＧ、ＴＴＡ、またはＴＴＧによって置換されていてもよい。

特定の実施態様によれば、上述のような配列番号３に由来する置換配列は、（ＴＭ２-４をコードする）配列番号２７、（ＴＭ２-５をコードする）配列番号２８、（ＴＭ２－８２５Ｈをコードする）配列番号２９、（ＴＭ２－８２５Ｋをコードする）配列番号３０、（ＴＭ２－８２５Ｔをコードする）配列番号３１、（ＴＭ１－８２２Ｃをコードする）配列番号３２、（ＴＭ２－８２２Ｆをコードする）配列番号３３、（ＴＭ２－８２２Ｍをコードする）配列番号３４、（ＴＭ２－８２２Ｙをコードする）配列番号３５、あるいは（ＴＭ２－８２２－Ｗをコードする）配列番号３６から選択される。

本発明はまた、配列番号３、４、５、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６に由来する配列、あるいは前記配列に対して少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する上記の置換配列に由来する配列に関連する。配列番号３、４、５、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６に対する、あるいは上記の置換配列に対する配列同一性の百分率に関係なく、そのような配列は、本発明によるタンパク質、ポリペプチド、またはＴＭ－２－２変異体をコードする。しかしながら遺伝コードの縮重を考慮すると、本発明のこのポリペプチド、タンパク質、または変異体をコードする配列は、配列番号３、４、５、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６、あるいは上記の置換配列に対して７０％未満の配列同一性を有していてもよいが、この配列もまた本発明の範囲内となる。

潜在的なさらなる変異は、特にＦまたはＷによるＹ７６７の置換である。本発明の前述の側面に既に詳述されたさらなる変異または異形は、この側面に対して変更すべきところは変更して応用される。

別の側面による本発明はまた、植物、特にトマトに、少なくともＴｏＢＲＦＶに対する耐性、好ましくはさらにＴＭＶ、ＴｏＭＶ、およびＴｏＭＭＶのうちの少なくとも１つ以上に対する耐性を付与する、ＴＭ－２－２タンパク質の変異体または対立遺伝子であるＮＢＳ－ＬＲＲタンパク質をコードする耐性遺伝子に関する。そのような耐性遺伝子は、少なくともＴｏＢＲＦＶ、ＴＭＶ、およびＴｏＭＶに対する耐性を付与し、さらに好ましくはＴｏＢＲＦＶ、ＴＭＶ、ＴｏＭＶ、およびＴｏＭＭＶに対する耐性を付与することが好ましい。ＴＭ－２－２タンパク質の変異体または対立遺伝子は、上述に開示のＴＭ－２－２タンパク質の異形体であり、この異形体はＴＭ－２－２タンパク質の８４８位のＣ８４８Ｒ、ＴＭ－２－２タンパク質の８２２位のＮ８２２Ｃ、Ｎ８２２Ｆ、Ｎ８２２Ｍ、Ｎ８２２Ｙ、およびＮ８２２Ｗ、ならびにＴＭ－２－２タンパク質の８２５位のＳ８２５Ｈ、Ｓ８２５Ｋ、およびＳ８２５Ｔの置換のうちの少なくとも１つを含む。

ＴＭ－２－２タンパク質の変異体または対立遺伝子は、８２２位、８２５位、および８４８位からの１つの位置のみに、あるいはそれらの２つの位置または全ての位置に既述の置換のうちの１つを含んでもよい。本発明のＴＭ－２－２タンパク質の変異体または対立遺伝子は、Ｃ８４８Ｒ置換とＮ８２２Ｙ置換を同時に含まないことが好ましい。ＴＭ－２－２タンパク質の変異体または対立遺伝子は、さらにＦ６５５Ｌ置換を含んでもよい。

新たに見出された耐性タンパク質およびこのタンパク質をコードする耐性遺伝子は、ＴＭ－２－２タンパク質のＬＲＲドメイン内でのシステイン８４８、アスパラギン８２２、および／またはセリン８２５の置換によって、すなわちＣ８４８ではアルギニンによって、Ｎ８２２ではシステイン、フェニルアラニン、メチオニン、チロシン、またはトリプトファンによって、かつＳ８２５ではヒスチジン、リジン、またはトレオニンによって置換されて、好ましくはＴｏＭＶおよびＴＭＶに対する耐性に加えて、ＴｏＢＲＦＶに対する耐性を付与する。

さらに別の側面によれば、本発明はまた、本発明によるポリペプチドまたはタンパク質をコードする配列を含む、あるいはＴＭ－２－２変異体をコードするヌクレオチド配列を含む、あるいは本発明による耐性遺伝子を含む核酸構築物を対象とする。

本発明によるポリペプチドまたはタンパク質をコードする、あるいはＴＭ－２－２変異体をコードするヌクレオチド配列を含む、あるいは耐性遺伝子を含むそのような配列は、互換的に、以下のように本発明のヌクレオチド配列または耐性遺伝子、あるいは異形Ｔｍ－２－２遺伝子または変異Ｔｍ－２－２遺伝子とも呼ばれる。

目的のタンパク質、ポリペプチド、または変異体をコードするそのような配列は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターであるプロモーターの制御の下にあることが好ましい。プロモーターは、植物細胞内で活性なプロモーターであることが好ましい。一実施態様によれば、プロモーターは、Ｔｍ－２、Ｔｍ－２－２、またはｔｍ－２遺伝子の野生型プロモーターではない。Ｔｍ－２－２異形遺伝子に対するプロモーターは、Ｔｍ－２、Ｔｍ－２－２またはｔｍ－２の未変性プロモーターであることが好ましい。

従って本発明による核酸構築物は、ベクター、プラスミド、またはＴ－ＤＮＡプラスミドであってもよい。従って細胞内に本発明の構築物が存在すると、本発明によるかつ上述で定義のタンパク質、ポリペプチド、ＴＭ－２－２変異体、または耐性タンパク質の発現を生じることができる。

本発明はさらに、本発明によるポリペプチド、タンパク質、ＴＭ－２－２変異体、または耐性タンパク質の発現、好ましくは植物細胞内での発現に適する発現ベクターまたは構築物を包含する。

さらなる実施態様によれば、本発明はまた、本発明のＴＭ－２－２変異体をコードする定義された配列の使用、または少なくともＴｏＢＲＦＶに対する耐性をトマト植物に付与するために、またはＴｏＢＲＦＶに対する耐性を有する遺伝子組換えトマト植物を得るために、その配列を含む構築物の使用を対象とする。確かに実施例に示されるように、ＴＭ－２－２変異体は、ＴｏＢＲＦＶのＭＰを認識し、それによりＴｏＢＲＦＶ耐性に関連するＨＲ応答を誘発できる。本発明のＴＭ－２－２変異体はまた、少なくともＴＭＶ、ＴｏＭＶ、および／またはＴｏＭＭＶの移行タンパク質を認識し、それによりこれらのトバモウイルスに対する耐性を付与できる。従って本発明はさらに、ＴｏＢＲＦＶに対する耐性およびＴＭＶ、ＴｏＭＶ、およびＴｏＭＭＶのうちの少なくとも１つに対する耐性をトマト植物に付与するための前記配列の使用、かつこれらの耐性を示す遺伝子組換えトマト植物を得るための前記配列の使用を包含する。

さらなる側面によれば、本発明はまた、本発明によるヌクレオチド配列または耐性遺伝子を含む細胞、あるいは上記に開示のＤＮＡ構築物を含む細胞に関連する。

この細胞は、好ましくは植物細胞、好ましくはナス科由来、例えばナス属由来の細胞、さらにより好ましくはトマト植物の細胞、またはトウガラシ属もしくはタバコ属の細胞である。この細胞は、そのゲノム中に、好ましくはその核ゲノム中に、本発明によるヌクレオチド配列または耐性遺伝子またはＤＮＡ構築物を含む。これらの配列の存在により、目的の表現型、すなわち適切な条件でＨＲ応答を誘発する、少なくともＴｏＢＲＦＶのＭＰと相互作用するタンパク質の発現を付与する。これらの配列の存在は、配列に基づいて当業者に周知の任意の技術によって明らかにできる。

特に好ましい種類の細胞は、ナス属、タバコ属、またはトウガラシ属の細胞であり、より好ましくはトマト細胞である。

本発明による細胞は、任意の種類の細胞、特に任意の種類のトマト細胞、とりわけ単離細胞および／または植物全体を再生できる細胞、特に本発明のヌクレオチド配列または耐性遺伝子を有するトマト植物の細胞であってもよい。従って細胞は、再生可能な細胞であってもよく、再生不能の細胞であってもよい。

目的のヌクレオチド配列または耐性遺伝子は、本発明の細胞内にホモ接合またはヘテロ接合で存在してもよい。本発明による細胞は、ヘテロ接合形態で上述に定義の耐性遺伝子またはヌクレオチド配列を含むことが好ましい。

本発明はまた、本発明に従って上述に定義の非再生可能細胞または再生可能細胞の組織培養を対象とし、好ましくは再生可能な細胞は、本発明の胚、原形質体、成長点細胞、カルス、花粉、葉、葯、茎、葉柄、根、根端、果実、種子、花、子葉、および／または胚軸に由来し、細胞は、少なくともＴｏＢＲＦＶに対する耐性を付与するヌクレオチド配列または耐性遺伝子をそのゲノム中に含む。そのような配列または耐性遺伝子はさらに、ＴＭＶおよび／またはＴｏＭＶに対する耐性、好ましくはＴｏＭＭＶに対する耐性を提供することが好ましい。

本発明はまた、任意の植物部分、特にトマトの植物部分、とりわけ種子、外植片、生殖材料、穂木、切穂、種子、果実、根、台木、花粉、胚珠、胚、原形質体、葉、葯、茎、葉柄、または花を対象とし、前記植物部分は、上述のような少なくとも１つの細胞を含む。

本発明はまた、本発明のヌクレオチド配列または耐性遺伝子を含む原形質体を提供する。

別の側面によれば、本発明は、そのゲノム中に本発明のタンパク質またはペプチドをコードする上述に定義のヌクレオチド配列または耐性遺伝子を含む植物、より好ましくはトマト植物を対象とする。従ってそのようなヌクレオチド配列または耐性遺伝子は、（１）８４８位にＣ８４８Ｒ変異、８２２位にＮ８２２Ｃ、Ｎ８２２Ｆ、Ｎ８２２Ｍ、Ｎ８２２Ｙ、またはＮ８２２Ｗ変異、および８２５位にＳ８２５Ｈ、Ｓ８２５Ｋ、またはＳ８２５Ｔ変異のうちの少なくとも１つ、および（２）７６７位にＹ、Ｆ、またはＷを含み、かつ少なくともＴｏＢＲＦＶに対する耐性、好ましくはさらにＴＭＶ、ＴｏＭＶ、およびＴｏＭＭＶのうちの１つ以上に対する耐性、より好ましくは、ＴｏＢＲＦＶに加えて、ＴＭＶ、ＴｏＭＶ、およびＴｏＭＭＶに対する耐性を付与するＴＭ－２－２タンパク質の変異体をコードする。ヌクレオチド配列または耐性遺伝子は、さらに６５５位にロイシンを含むＴＭ－２－２タンパク質の変異体をコードすることが好ましい。

従って本発明はまた、少なくともＴｏＢＲＦＶに対する耐性を有するトマト植物を包含し、このトマト植物は、本発明によるＴＭ－２－２タンパク質（配列番号８）の変異体をコードする、すなわち配列番号８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する変異Ｔｍ－２－２遺伝子を含み、配列番号８の７６７位に対応する位置にチロシン、フェニルアラニン、またはトリプトファンを含み、かつ以下の変異／変形のうちの少なくとも１つを含む：
・野生型ＴＭ－２－２配列内に存在するシステインに代えて、配列番号８の８４８位に対応する位置にあるアルギニン；
・野生型ＴＭ－２－２配列内に存在するアスパラギンに代えて、配列番号８の８２２位に対応する位置にあるシステイン、フェニルアラニン、メチオニン、チロシン、またはトリプトファン；および
・野生型ＴＭ－２－２配列内に存在するセリンに代えて、配列番号８の８２５位に対応する位置にあるヒスチジン、リジン、またはトレオニン。
変異Ｔｍ－２－２遺伝子は、本発明による耐性遺伝子である。

本発明はまた、有益なことには、野生型ＴＭ－２－２配列中に存在するフェニルアラニンに代えて、配列番号８の６５５位に対応する位置にロイシンを含んでもよい。

本発明の耐性遺伝子またはヌクレオチド配列は、植物の細胞の核ゲノム内に安定的に存在することが好ましい。この耐性遺伝子またはヌクレオチド配列は、例えば形質転換後に核ゲノム内に安定して組み込まれるか、または本出願の実験の段落に詳述のようにＴＩＬＬＩＮＧなどの変異誘発プロセスから生じるかのいずれかの可能性がある。少なくともＴｏＢＲＦＶに対する耐性を付与するこれらの配列の存在は、耐性親からの遺伝子移入の結果である可能性もある。少なくともＴｏＢＲＦＶを含む、トバモウイルスに対する耐性を付与するこれらの配列は、必須ではないが、染色体９表面のｔｍ－２またはＴｍ－２遺伝子の遺伝子座に見られることが好ましい。例えば無作為の組込みから生じるゲノム中のその他の位置もまた、適切でありかつ本発明により包含される。

耐性の表現型は、実験の段落、特に実施例１．４に記載のように、自然感染または人工接種によって、最初に葉部基準あるいは果実基準で検定および格付けできる。

少なくともＴｏＢＲＦＶに対する耐性を付与する配列または耐性遺伝子は、本発明による植物、特にトマト植物のゲノム中にホモ接合またはヘテロ接合で存在してもよい。これらの配列はまた、複数のコピーとして存在してもよい。

本発明のこの側面による耐性遺伝子または変異Ｔｍ－２－２遺伝子は、本発明の他の側面に関連して定義される通りであり、従って、配列番号９、配列番号１０、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、または配列番号２６であってもよいＴＭ－２－２タンパク質の変異体をコードする。適切な耐性遺伝子または変異Ｔｍ－２－２遺伝子は、例えば、配列番号４もしくは配列番号５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６を有する遺伝子、あるいは上述の置換配列を有する遺伝子、あるいは配列番号４もしくは配列番号５または上述の置換配列からさらに遺伝コードの縮重までに由来する配列を有する遺伝子である。

本発明はまた、本発明の植物の組織を対象とし、この組織は、未分化組織であっても分化組織であってもよい。この組織は、本発明の耐性遺伝子または変異Ｔｍ－２－２遺伝子を含む１つ以上の細胞を含む。

本発明はまた、本発明による耐性植物、特に上述に定義の耐性遺伝子または変異Ｔｍ－２－２遺伝子を含む耐性トマト植物を生産できる繁殖材料を対象とする。本発明は特に、耐性遺伝子または変異Ｔｍ－２－２遺伝子を含むそのような耐性植物の種子、特にトマトの種子、および本発明によるトマト植物に栽培できる種子を対象とする。

このようなトマトの種子は、植物栄養素、増強微生物、または種子および植物の環境を殺菌するための製品などの個別または組合せの活性種で被覆またはペレット化されていることが好ましい。そのような種や化学物質は、ホルモンなどの植物の成長を促進する製品、防御刺激物質などの環境ストレスに対する耐性を高める製品、基質およびその周囲のｐＨを安定化する製品、または栄養素であってもよい。

これら製品はまた、本明細書ではウイルスおよび病原性微生物を含む、若い植物の成長にとって好ましくない薬剤から保護する製品、例えば、接触、摂取、または気体拡散によって作用する殺真菌剤、殺細菌剤、殺線虫剤、殺虫剤、または除草剤製品であってもよく、その製品は、例えばタイムの抽出物などの任意の適切な精油である。これらの製品は全て、植物の耐性反応を強化し、かつ／あるいは前記植物の環境を消毒または調節する。それらはまた、必要に応じてその生存能力を保証する培地と共に、生存生体物質、例えば非病原性微生物、例えば少なくとも１つの真菌、細菌、またはウイルスであってもよく、例えばシュードモナス属、バチルス属、トリコデルマ属、クロノスタキス属、フザリウム属、リゾクトニア属などのこの微生物は、植物の成長を刺激し、または病原体から植物を保護する。

本発明の植物、細胞、または種子は、ＴｏＢＲＦＶ耐性を付与する本発明の耐性遺伝子または変異Ｔｍ－２－２遺伝子に対してヘテロ接合性またはホモ接合性であってもよい。この遺伝子が付与する耐性は優性形質であると予測され、それにより本発明の耐性遺伝子または変異Ｔｍ－２－２遺伝子をヘテロ接合で有する植物もまたＴｏＢＲＦＶに対して耐性を有する。従って本発明はまた、上述に定義の本発明の耐性遺伝子または変異Ｔｍ－２－２遺伝子をそのゲノム中にヘテロ接合で有する植物、細胞、または種子を包含する。

本発明によるトマト植物は、商業用の植物または系統であることが好ましい。この商業用の植物または系統はまた、好ましくは、以下のさらなる特徴のうちの１つ以上を示す：線虫耐性の形質（Ｍｉ－１またはＭｉ－ｊ）、フザリウム耐性、ベルチシリウム耐性、および／またはＴＹＬＣＶ耐性。本発明によれば、その他の耐性または許容性もまた意図される。

さらに本発明の商業用の植物は、適切な条件で果実を生成し、その果実は、完全成熟で少なくとも１０ ｇ、好ましくは２５ ｇ、好ましくは完全成熟で少なくとも１００ ｇ、さらにより好ましくは完全成熟で少なくとも１５０ ｇ、または少なくとも２００ ｇである。さらに一植物当たりの果実の数は、本発明の耐性遺伝子または変異Ｔｍ－２－２遺伝子の存在によって本質的に影響を受けず、すなわち本発明による植物の生産性は、同一の遺伝子型を有するが前記耐性遺伝子または変異Ｔｍ－２－２遺伝子を含まない植物に対比して２０％を超えて劣ることはない。

さらに別の実施態様によれば、本発明の植物は、有限花序、非有限花序、または半有限花序の植物、あるいはその種子もしくは細胞であり、すなわち、有限花序、非有限花序、または半有限花序の成長習性に対応している。

有限花序とは、まず葉が成長して、次いで受粉が成功した場合に成熟して果実になる花をつける傾向があるトマト植物を意味する。全ての果実は、一本の木にほぼ同時に熟す傾向がある。非有限花序のトマトは、いくつかの葉が成長することから始まり、次いで成長期を通して葉と花を生産し続ける。これらの植物は、いつでも種々の成熟段階のトマト果実を実らせる傾向がある。半有限花序のトマトは、有限花序と非有限花序の中間の表現型を有し、これは有限花序の品種よりも大きく成長することを除けば典型的な有限花序の種である。

本発明による植物、細胞、または種子はさらに、有益にはＴｍ－１遺伝子を含んでもよい。Ｔｍ－１遺伝子は、特にＩｓｈｉｂａｓｈｉら（２００７）の刊行物に定義される通りであり、好ましくは、「Ｔｍ－１遺伝子」とは、この論文に報告されるＴｍ－１活性、すなわちＴｍ－１に感受性の高い野生型ＴｏＭＶ株、例えばこの論文に開示するＴｏＭＶ－Ｌ株のウイルス複製を阻害する能力を有するタンパク質をコードする遺伝子配列を指す。

従って本発明はまた、本発明の耐性遺伝子または変異Ｔｍ－２－２遺伝子に加えて、ホモ接合性またはヘテロ接合性のいずれかでＴｍ－１遺伝子を含むトマト植物、細胞、または種子を包含する。

さらに別の実施態様によれば、本発明の植物は、接ぎ木プロセスでの接ぎ穂または台木として用いられる。接ぎ木はウリ科などの作物に長年用いられてきた方法であるが、トマトに使用されたのはつい最近のことである。接ぎ木を使用して、フィトフトラ属などの地中病原体や特定の線虫に対して一定水準の耐性を提供できる。従って接ぎ木は、栽培される植物または品種と感染した土壌との接触を防止することを意図している。接ぎ木または接ぎ穂として用いられる目的の品種、必要に応じてＦ１雑種が、台木として用いられる耐性植物に移植される。耐性を有する台木は健全な状態を保持し、移植のために普通に供給されて土壌での病気から隔離される。

上に詳述のように、本発明は、ＴｏＢＲＦＶ耐性、好ましくはさらにＴＭＶ、ＴｏＭＶ、および／またはＴｏＭＭＶ耐性を示すトマト植物ならびにそれらの植物を生産する種子を対象とし、そのゲノム中に耐性遺伝子または変異Ｔｍ－２－２遺伝子を含むこれらの植物または種子またはその他の植物部分の細胞を対象とし、かつ前記耐性遺伝子または変異Ｔｍ－２－２遺伝子を含む本発明のこのような植物の子孫を対象とする。

子孫は、本発明による植物との交配からの第１、第２、およびさらなる全ての後代を包含し、交配はそれ自身との交配または別の植物との交配を含む。

なお本発明の種子または植物は、種々のプロセスによって得られてもよく、１つの本質的な生体プロセスによって排他的に得られるわけではない。実際に耐性遺伝子または変異Ｔｍ－２－２遺伝子は、種々の技術によって「細胞内」に導入され、組込まれ、または得られる。従って本発明による植物、細胞、または種子は、遺伝子組換え型であっても非遺伝子組換え型であってもよく、本明細書の他の段落および実施例で詳述するように、これらは本質的に生体プロセスではない技術プロセスによって得られることが好ましい。好ましい実施態様によれば、本発明による植物、細胞、または種子は、本質的に生体プロセスのみにより得られるものではない。

開示のＴＭ－２－２変異体をコードする変異Ｔｍ－２－２遺伝子は、変異誘発、特にＴＩＬＬＩＮＧなどの標的変異誘発などの遺伝子編集技術、塩基編集、またはプライム編集技術、あるいはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムなどの他の遺伝子編集技術、あるいは特注のエンドヌクレアーゼ、あるいはＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、または他のＣａｓタンパク質を用いる塩基編集またはプライム編集によって得られることが好都合である。

これらの技術は当業者には周知である。これらの技術の例は、本出願の実験の段落で説明されている。

本発明の特定の実施態様では、Ｔｍ－２－２遺伝子の変異は、遺伝子操作によって誘発される。使用できる遺伝子操作の手段には、新育種技術（Ｎｅｗ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）と呼ばれるその全ての技術の使用が含まれ、これら技術は、遺伝子変異により植物に新たな特性を形成するのに開発かつ／あるいは使用される種々の新技術であり、その目的は、標的変異誘発、新たな遺伝子の標的導入または遺伝子発現抑制（ＲｄＤＭ）である。このような新育種技術の例は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）技術（ＺＦＮ－１、ＺＦＮ－２、およびＺＦＮ－３、米国特許第９，１４５，５６５号を参照）、オリゴヌクレオチド指向性変異誘発（ＯＤＭ）、シスジェネシスおよびイントラジェネシス、（ＧＭ台木上部への）接ぎ木、逆育種、アグロ浸潤（アグロ浸潤「センス・ストリクト」、アグロ接種、フローラル・ディップ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ、米国特許第８，５８６，３６３号および９，１８１，５３５号を参照）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（米国特許第８，６９７，３５９号、第８，７７１，９４５号、第８，７９５，９６５号、第８，８６５，４０６号、第８，８７１，４４５号、第８，８８９，３５６号、第８，８９５，３０８号、第８９０６，６１６号、第８，９３２，８１４号、第８，９４５，８３９号、第８，９９３，２３３号、および第８，９９９，６４１号を参照）、組換えメガヌクレアーゼ、再組換えホーミングエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡ誘導ゲノム編集（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （２０１６））、および合成ゲノミクスの使用を通して促進される標的配列改変である。新育種技術の別名である標的ゲノム編集の主要部分は、修飾が意図されるゲノム内の選択された位置で、ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘発する応用技術である。ＤＳＢの指示された修復により、標的を絞ったゲノム編集が可能となる。このような応用技術を用いて、変異（例えば、標的化変異または高精度の天然遺伝子編集）ならびに遺伝子の高精度の挿入（例えば、シス遺伝子、イントラ遺伝子、または導入遺伝子）を生成できる。変異をもたらす応用技術は、部位特異的ヌクレアーゼ（ＳＤＮ）技術、例えばＳＤＮ１、ＳＤＮ２、およびＳＤＮ３などとして特定されていることが多い。ＳＤＮ１の場合には、成果は標的を絞った非特異的な遺伝子欠失変異となり、ＤＮＡのＤＳＢの位置は正確に選択されるが、宿主細胞によるＤＮＡ修復は無作為であり、小さなヌクレオチドの欠失、付加、または置換をもたらす。ＳＤＮ２の場合には、ＳＤＮを用いて標的化ＤＳＢを生成し、ＤＮＡ修復鋳型（１つまたは僅かのヌクレオチド以外の標的化ＤＳＢのＤＮＡ配列と同一の短いＤＮＡ配列）を用いてＤＳＢを修復し、これにより、目的の所望の遺伝子内に標的かつ所定の点変異が生成される。ＳＤＮ３に関しては、ＳＤＮは、新たなＤＮＡ配列（遺伝子など）を含むＤＮＡ修復鋳型とともに用いられる。この技術の成果は、そのＤＮＡ配列を植物ゲノム中に組込むことになる。ＳＤＮ３の使用を説明する最も可能性の高い応用技術は、選択されたゲノム位置へのシス遺伝子、イントラ遺伝子、または導入遺伝子の発現カセットの挿入である。これらの各技術の完璧な説明は、２０１１年に欧州委員会の将来技術研究のための共同研究センター（ＪＲＣ）研究機関（Ｊｏｉｎｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）が作成した「新たな植物育種技術－最新技術および商業的発展の見通し」という題目の報告書に記載されている。

定義の耐性遺伝子は、形質転換、特にアグロバクテリウム属の形質転換によって本発明の植物、細胞、または種子に導入してもよく、それにより遺伝子組換え植物、細胞、または種子を生成することができる。この技術はまた、本出願の実施例の段落に説明されている。

本出願は、これらの配列の表示様式に依らず、既に定義の耐性遺伝子または変異Ｔｍ－２－２遺伝子を含む植物、種子、または細胞を対象とし、従って遺伝子組換え植物および非遺伝子組換え植物を対象とする。

さらなる側面では、本発明はまた、ＴｏＢＲＦＶに対する耐性、好ましくはさらにＴｏＭＶ、ＴＭＶ、および／またはＴｏＭＭＶに対する耐性、より好ましくはさらにＴｏＭＶ、ＴＭＶ、およびＴｏＭＭＶに対する耐性を有する植物、特にトマト植物を取得、生育、または生産するための種々の方法を対象とする。

従って本発明は、ＴｏＢＲＦＶに対する耐性、好ましくはさらにＴｏＭＶ、ＴＭＶ、および／またはＴｏＭＭＶに対する耐性を有する植物、特にトマト植物を生産する方法を包含し、この方法は以下の工程を含む：
ａ）変異誘発剤で改変される植物、好ましくはトマト植物のＭ０種子を処理してＭ１種子を得る工程；
ｂ）こうして得られたＭ１種子から植物を生育させて、Ｍ１植物を得る工程；
ｃ）Ｍ１植物の自家受精によりＭ２種子を生産する工程；および
ｄ）必要に応じて、工程ｂ）およびｃ）をｎ回繰り返して、Ｍ１＋ｎ種子を得る工程。

Ｍ１またはＭ２種子を植物に生育させて、ＴｏＢＲＦＶへの感染あるいはＴｍ－２－２遺伝子の変異を識別する検査に供する。

この方法では、工程ａ）のＭ１種子は、ＥＭＳ変異誘発などの化学的変異誘発、または他の化学的変異誘発剤、または例えば選択された電離放射線（Ｘ線、γ線、α粒子など）である照射、重イオンビーム照射、紫外線照射、放射性崩壊、または高速中性子照射などの物理的手段を介して得ることができる。

少なくともＴｏＢＲＦＶに対する耐性、好ましくはさらにＴＭＶ、ＴｏＭＶ、およびＴｏＭＭＶのうちの１つ以上に対する耐性を有するトマト植物を生産するための別の方法は、本発明による変異Ｔｍ－２－２遺伝子を形成するために第９染色体の表面にｔｍ２、Ｔｍ－２、またはＴｍ－２－２遺伝子を予め含む植物に、前記ｔｍ２、Ｔｍ－２、またはＴｍ－２－２遺伝子への変異を導入することを含む、すなわちＴＭ－２－２に対してＣ８４８Ｒ、Ｎ８２２Ｃ、Ｎ８２２Ｆ、Ｎ８２２Ｍ、Ｎ８２２Ｙ、Ｎ８２２Ｗ、Ｓ８２５Ｈ、Ｓ８２５Ｋ、およびＳ８２５Ｔ変異のうちの少なくとも１つを含み、７６７位にＦ、ＹまたはＷを含み、さらに潜在的にＦ６５５Ｌ変異を含むＴＭ－２－２変異体をコードすることを含む。

出発材料がＴｍ－２－２遺伝子を含むトマト植物である場合に、本方法は、有益には、好ましくは変異誘発により、ＴＩＬＬＩＮＧ法により、あるいはゲノム編集、塩基編集、またはプライム編集により、特に物理的手段または化学的手段によって誘発される変異誘発、特にメタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）変異誘発、Ｎ－メチル－Ｎ－ニトロソ尿素（ＭＮＵ）変異誘発、またはアジ化ナトリウム（ＮａＮ_３、ＳＡ）変異誘発、オリゴヌクレオチド指向性変異誘発（ＯＤＭ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）技術、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、またはその他のＣａｓタンパク質、組換えメガヌクレアーゼ、再組換えホーミングエンドヌクレアーゼ、およびＤＮＡ誘導ゲノム編集により、前記Ｔｍ－２－２遺伝子内に少なくとも１つの変異を導入することを含み、ここで前記少なくとも１つの変異は、Ｔｍ－２－２遺伝子によってコードされるタンパク質内にＣ８４８Ｒ、Ｎ８２２Ｃ、Ｎ８２２Ｆ、Ｎ８２２Ｍ、Ｎ８２２Ｙ、Ｎ８２２Ｗ、Ｓ８２５Ｈ、Ｓ８２５Ｋ、またはＳ８２５Ｔ置換を生じる。この方法は、例えばＴｍ－２－２遺伝子がコードされるタンパク質内にＹ７６７ＦまたはＹ７６７Ｗ置換を生じさせるために、Ｔｍ－２－２遺伝子内にさらなる変異を導入することを含んでもよい。

ＴｏＢＲＦＶのＭＰの認識が失われず、好ましくはさらにＴＭＶ、ＴｏＭＶ、およびＴｏＭＭＶのＭＰの認識も失われない条件のもとに、さらなる変異を導入してもよい。

本発明はまた、本発明による遺伝子組換え植物、特に本発明による耐性遺伝子または変異Ｔｍ－２－２遺伝子を導入することによって、少なくともＴｏＢＲＦＶに対する耐性、好ましくはさらにＴｏＭＶ、ＴＭＶ、および／またはＴｏＭＭＶに対する耐性を有する遺伝子組換えトマト植物を得るための種々の方法を包含する。これらの方法には、以下の工程が含まれてもよい：
・本発明の前述の側面に定義するＤＮＡ構築物、すなわち本発明によるＴＭ－２－２変異体をコードする耐性遺伝子または変異Ｔｍ－２－２遺伝子を含むＤＮＡ構築物を取得する工程；
・前記構築物を細胞内に、特にトマト細胞内に導入する工程；
・遺伝子組換え植物を再生する工程；および
・必要に応じて、取得した植物を繁殖させる工程。

別の側面によれば、本発明はさらに、ＴｏＢＲＦＶ耐性の表現型を有するトマト植物、好ましくはＴｏＢＲＦＶ、ＴｏＭＶ、ＴＭＶ、およびＴｏＭＭＶ耐性を有するトマト植物を得るために、繁殖プログラム内での繁殖パートナーとして好ましくは本発明の耐性遺伝子または変異ＴＭ－２－２遺伝子をホモ接合で含む、本発明のトマト種子またはトマト植物の使用を対象とする。そのような繁殖パートナーは、確かに目的の表現型を付与する耐性遺伝子または変異Ｔｍ－２－２遺伝子をそのゲノム中にホモ接合で保有している。従ってこの植物をトマト植物、特にトマト系統と交配して、所望の表現型を付与する本発明の耐性遺伝子または変異Ｔｍ－２－２遺伝子を子孫に導入することが可能となる。従って本発明による植物は、耐性遺伝子または変異Ｔｍ－２－２遺伝子をトマト植物またはトマト生殖質中に遺伝子移入するための繁殖パートナーとして使用できる。目的の耐性遺伝子をヘテロ接合で保有する植物または種子は、上記に詳述の繁殖パートナーとして使用できるが、表現型の分離により繁殖プログラムがより複雑になる可能性がある。

従って本発明はまた、少なくともＴｏＢＲＦＶに対する耐性、好ましくはさらにＴＭＶ、ＴｏＭＶ、および／またはＴｏＭＭＶに対する耐性、最も好ましくはそれらの全てに対する耐性を有するトマト植物を繁殖する方法を対象とし、この方法は以下の工程を含む：
（ａ）本発明による耐性遺伝子または変異Ｔｍ－２－２遺伝子を含むトマト植物を、耐性遺伝子または変異遺伝子を含まない初期のトマト植物と交配する工程；
（ｂ）このように得られた子孫の中から、耐性遺伝子または変異遺伝子を有する植物を選択する工程；および
（ｃ）必要に応じて、工程（ｂ）で得られた植物を１回以上自家受粉させ、このように得られた子孫の中から耐性遺伝子または変異遺伝子を有する植物を選択する工程。

ここでの選択は、当業者に周知の任意の適切な手段によって、特に耐性遺伝子または変異遺伝子に特異的なマーカーを用いて実施できる。

本発明はまた、少なくともＴｏＢＲＦＶに対する耐性、好ましくはさらにＴＭＶ、ＴｏＭＶ、および／またはＴｏＭＭＶに対する耐性、最も好ましくはそれらの全てに対する耐性を有するトマト植物を生産する方法を対象とし、この方法は、本発明による既に定義の耐性遺伝子または変異ＴＭ－２－２遺伝子を含む植物部分を得る工程、および前記植物部分を栄養繁殖させて前記植物部分から植物を生成する工程を含む。

本発明による全ての方法およびプロセスでは、トマト植物は、有限花序、非有限花序、または半有限花序である。

既に開示のように、本発明によるトマト植物はまた、好ましくは、線虫耐性、ＴＹＬＣＶ耐性、フザリウム耐性、および／またはベルチシリウム耐性である。

本発明はまた、上記に開示の方法およびプロセスのいずれかによって得られる、または得ることが可能なトマト植物および種子を対象とする。このような植物は確かに、トバモウイルスに対する耐性、特にＴｏＢＲＦＶに対する耐性、好ましくはさらにＴＭＶ、ＴｏＭＶ、およびＴｏＭＭＶのうちの少なくとも１つに対する耐性を付与する本発明のＴＭ－２－２変異体を発現するトマト植物である。

さらに別の側面によれば、本発明はまた、植物、好ましくはトマト植物またはトマト生殖質を、ＴｏＢＲＦＶ感染に対する耐性に関連する本発明による耐性遺伝子または変異Ｔｍ－２－２遺伝子の存在について遺伝子型を決定する方法を対象とし、前記方法は、Ｔｍ－２－２遺伝子中のＣ８４８Ｒ、Ｎ８２２Ｃ、Ｎ８２２Ｆ、Ｎ８２２Ｍ、Ｎ８２２Ｙ、Ｎ８２２Ｗ、Ｓ８２５Ｈ、Ｓ８２５Ｋ、およびＳ８２５Ｔ変異のうちの１つ以上を含むまたは１つ以上に対応する核酸を、被試験植物のゲノム中で決定または検出することを含む。好ましくは、この方法は、ＴｏＢＲＦＶに対する耐性を付与するこれらの変異のうちの１つに関連する特異的配列を、被試験植物の試料中で識別する工程を含む。同様に本発明はまた、ＴＭＶおよびＴｏＭＶに対する耐性を有する植物内で、ＴｏＢＲＦＶに対する耐性を有するトマト植物を識別、検出、かつ／あるいは選択する方法を対象とし、前記方法は、前記植物のゲノム中でＴｍ－２－２遺伝子の変異対立遺伝子を検出することを含み、前記変異対立遺伝子は、ＴＭ－２－２タンパク質の８４８位にＣ８４８Ｒアミノ酸置換を生じる変異、ＴＭ－２－２タンパク質の８２２位にＮ８２２Ｃ、Ｎ８２２Ｆ、Ｎ８２２Ｍ、Ｎ８２２Ｙ、またはＮ８２２Ｗアミノ酸置換を生じる変異、およびＴＭ－２－２タンパク質の８２５位にＳ８２５Ｈ、Ｓ８２５Ｋ、およびＳ８２５Ｔアミノ酸置換を生じる変異から選択される少なくとも１つの変異を含む。

ＴｏＢＲＦＶ感染を含む、種々のトバモウイルス感染によって引き起こされる被害を阻止する本発明の耐性植物の能力を考慮すると、それら植物は、ＴｏＢＲＦＶさらに潜在的にＴＭＶ、ＴｏＭＶ、および／またはＴｏＭＭＶが蔓延しているか、または蔓延もしくは感染の可能性が高い環境で効率的に栽培され、これらの条件では、本発明の耐性植物は、易感染性植物よりも市場性の高いトマトを生産できる。従って本発明はまた、ＴｏＢＲＦＶさらに潜在的にＴＭＶ、ＴｏＭＶ、および／またはＴｏＭＭＶが蔓延する環境でトマト植物の収量を向上する方法を対象とし、この方法は、それらのゲノム中に本発明の前述の側面により定義された耐性遺伝子または変異Ｔｍ－２－２遺伝子を含むトマト植物を栽培する工程、および前記植物に少なくともＴｏＢＲＦＶに対する耐性を付与する工程を含む。

好ましくは、この方法は、目的の前記耐性遺伝子または変異Ｔｍ－２－２遺伝子を含むトマト植物を選択または選抜する第１の工程を含む。この方法はまた、トマト畑、トンネル、または温室での生産性を向上させる方法として、あるいはトマトの生産での化学薬品や殺菌剤の使用量または使用回数を低減する方法として定義できる。

本発明はさらに、ＴｏＢＲＦＶの蔓延もしくは感染の条件、またはより一般的にはＴｏＭＶ、ＴＭＶ、および／またはＴｏＢＲＦＶの蔓延の条件の下でのトマト生産の損失を低減する方法を対象とし、この方法は、上述に定義のトマト植物を栽培する工程を含む。

これらの方法は、畑、トンネル、または温室のいずれかにあるトマト植物の集団では特に価値が高いものである。

あるいは、収量を向上させるまたはトマト生産の損失を低減する前記方法は、ＴｏＢＲＦＶに対する耐性、好ましくはさらにＴｏＭＶ、ＴＭＶ、およびＴｏＭＭＶに対する耐性を有し、そのゲノム中に、前記植物に少なくともＴｏＢＲＦＶ耐性を付与する耐性遺伝子または変異Ｔｍ－２－２遺伝子を含むトマト植物を識別する第１の工程、次いでウイルスが蔓延している、または蔓延している可能性がある環境で前記耐性植物を栽培する工程を含む。

本発明の耐性植物はまた、ＴｏＢＲＦＶの増殖を阻止することができ、それによってさらに植物の感染およびウイルスの増殖を制限できる。従って本発明はまた、畑、トンネル、もしくは温室、または他の形態の農園をＴｏＢＲＦＶ感染から保護する方法、あるいは前記の畑、トンネル、もしくは温室でのＴｏＢＲＦＶの感染水準を少なくとも制限する方法、あるいは前記の畑、トンネル、もしくは温室、特にトマト畑でのＴｏＢＲＦＶの拡散を制限する方法を対象とする。このような方法は、好ましくは、本発明の耐性植物、すなわち前記植物にＴｏＢＲＦＶ耐性を付与する耐性遺伝子または変異Ｔｍ－２－２遺伝子をそのゲノム中に含む植物を栽培する工程を含む。

本発明はさらに、畑、トンネル、もしくは温室、または他の形態の農園でのＴｏＢＲＦＶの感染または蔓延を制御するためのＴｏＢＲＦＶに対する耐性を有する植物の使用に関し、その植物は、そのゲノム中に上述に定義の耐性遺伝子または変異Ｔｍ－２－２遺伝子を含む本発明の植物である。この使用または方法はさらに、ウイルスの個体数を減少させることによって、畑、トンネル、もしくは温室を消毒する方法でもある。

さらなる側面では、本発明はまた、以下の工程を含むトマトを生産する方法に関する：
ａ）先に定義の耐性遺伝子または変異Ｔｍ－２－２遺伝子を含む、本発明のトマト植物を生育する工程；
ｂ）前記植物に果実を実らせる工程；および
ｃ）前記植物の果実を、好ましくは成熟時および／または成熟前に収穫する工程。

耐性遺伝子または変異Ｔｍ－２－２遺伝子に関する好ましい実施態様は全て、本発明の前述の側面の文脈中に既に開示されている。この方法は、前記トマトをトマト加工食品に加工するさらなる工程を含むのが好都合である。

本発明はまた、遺伝子組換えトマト植物によってトマトを生産する方法に関し、この方法は、本発明によるＴＭ－２－２変異体をコードする核酸分子をトマト植物内に導入することを含む。このプロセスは、遺伝子組換え植物を再生して、その植物に果実を実らせる工程をさらに含んでもよい。このプロセスはまた、前記遺伝子組換え植物の果実を収穫する工程を含んでもよい。

さらに別の実施態様によれば、本発明はまた、少なくともＴｏＢＲＦＶに対する耐性、好ましくはさらにＴＭＶ、ＴｏＭＶ、およびＴｏＭＭＶのうちの少なくとも１つに対する耐性を付与するＴｍ－２－２遺伝子の変異体を識別、検出、かつ／あるいは選択する方法を対象とし、この方法は以下の工程を含む：
・代用植物宿主、好ましくはナス科植物、さらにより好ましくはタバコ種またはトウガラシ種内で、ＴｏＢＲＦＶの移行タンパク質（ＭＰ）の存在により、検定される変異ＴＭ－２－２遺伝子を一過的または構成的に発現させる工程；および
・変異遺伝子から発現されるタンパク質とＴｏＢＲＦＶのＭＰタンパク質との間の相互作用を検出する、好ましくは過敏感反応を検出する工程。

好ましいタバコ種およびトウガラシ種は、ニコチアナ・ベンサミアナ、ニコチアナ・タバカム、およびカプシウム・アンニュームである。上述の方法は、本出願の実験の段落に、ベンサミアナ・タバコ植物およびタバカム・タバコ植物での方法として説明されている。ＴＭＶ、ＴｏＭＶ、およびＴｏＭＭＶの一部または全てに対する耐性の検定が必要とされる場合には、本方法は、ＴｏＢＲＦＶのＭＰをこれらのウイルスのＭＰで置換して同時に実行できる。好ましくは、変異Ｔｍ－２－２遺伝子またはＴｍ－２－２遺伝子の変異体は、本発明の前述の側面、すなわちＣ８４８Ｒ、Ｎ８２２Ｃ、Ｎ８２２Ｆ、Ｎ８２２Ｍ、Ｎ８２２Ｙ、Ｎ８２２Ｗ、Ｓ８２５Ｈ、Ｓ８２５Ｋ、およびＳ８２５Ｔ置換、および７６７位でのＹ、Ｆ、またはＷ置換、および潜在的な６５５位でのＬ置換との関連により定義される通りである。この方法により、Ｔｍ－２－２遺伝子のさらなる変異を容易かつ迅速に検定できる。既に強調したように、この測定法での過敏感反応の検出は、試験対象の変異Ｔｍ－２－２遺伝子を含むトマト中の前記トバモウイルスに対する耐性の検出の代用となる。

同様に、ＴｏＢＲＦＶに対する耐性を付与するＴＭ－２－２タンパク質の変異体を識別、検出、または選択するために、本方法を、試験対象のＴＭ－２－２タンパク質の変異体をコードするヌクレオチド配列を一過的または構成的に発現させて実行する。
配列：
配列番号１：ｔｍ２のヌクレオチ配列。
配列番号２：Ｔｍ－２のヌクレオチ配列。
配列番号３：Ｔｍ－２－２のヌクレオチ配列。
配列番号４：Ｔｍ２－１４－２５のヌクレオチ配列。
配列番号５：Ｔｍ２－４６７のヌクレオチド配列。
配列番号６：ｔｍ２がコードされたタンパク質のアミノ酸配列。
配列番号７：Ｔｍ－２がコードされたＴＭ－２のアミノ酸配列。
配列番号８：Ｔｍ－２－２がコードされたＴＭ－２－２のアミノ酸配列。
配列番号９：Ｔｍ２－１４－２５がコードされたＴＭ２－１４－２５のアミノ酸配列。
配列番号１０：Ｔｍ２－４６７がコードされたＴＭ２－４６７のアミノ酸配列。
配列番号１１：ＴＭ－２－２のＬＲＲドメインのアミノ酸配列。
配列番号１２：ＴＭ－２－２のＬＲＲドメインをコードするヌクレオチド配列。
配列番号１３：ＴＭＶの移行タンパク質のアミノ酸配列。
配列番号１４：ＴｏＭＶの移行タンパク質のアミノ酸配列。
配列番号１５：ＴｏＢＲＦＶの移行タンパク質のアミノ酸配列。
配列番号１６：ＴｏＭＭＶの移行タンパク質のアミノ酸配列。
配列番号１７：ＴＭ２－４のアミノ酸配列。
配列番号１８：ＴＭ２－５のアミノ酸配列。
配列番号１９：ＴＭ２－８２５Ｈのアミノ酸配列。
配列番号２０：ＴＭ２－８２５Ｋのアミノ酸配列。
配列番号２１：ＴＭ２－８２５Ｔのアミノ酸配列。
配列番号２２：ＴＭ２－８２２Ｃのアミノ酸配列。
配列番号２３：ＴＭ２－８２２－Ｆのアミノ酸配列。
配列番号２４：ＴＭ２－８２２－Ｍのアミノ酸配列。
配列番号２５：ＴＭ２－８２２－Ｙのアミノ酸配列。
配列番号２６：ＴＭ２－８２２－Ｗのアミノ酸配列。
配列番号２７：ＴＭ２－４のヌクレオチド配列。
配列番号２８：ＴＭ２－５のヌクレオチド配列。
配列番号２９：ＴＭ２－８２５Ｈのヌクレオチド配列。
配列番号３０：ＴＭ２－８２５Ｋのヌクレオチド配列。
配列番号３１：ＴＭ２－８２５Ｔのヌクレオチド配列。
配列番号３２：ＴＭ２－８２２Ｃのヌクレオチド配列。
配列番号３３：ＴＭ２－８２２－Ｆのヌクレオチド配列。
配列番号３４：ＴＭ２－８２２－Ｍのヌクレオチド配列。
配列番号３５：ＴＭ２－８２２－Ｙのヌクレオチド配列。
配列番号３６：ＴＭ２－８２２－Ｗのヌクレオチド配列。
配列番号３７：プライマーｎｐｔ２Ｆのヌクレオチド配列。
配列番号３８：プライマーｎｐｔ２Ｒのヌクレオチド配列。
配列番号３９：プライマーＴｍ－２－２－Ｆ２のヌクレオチド配列。
配列番号４０：プライマーｔｈｓｐ－Ｒのヌクレオチド配列。
配列番号４１：バイナリープラスミドｐＪＬ４６９のヌクレオチド配列。
配列番号４２：バイナリープラスミドｐＪＬ４７０のヌクレオチド配列。
配列番号４３：バイナリープラスミドｐＪＬ４７１のヌクレオチド配列。
配列番号４４：プライマーＬＭ＿ＴＢＲＦＶ－１－Ｆのヌクレオチド配列。
配列番号４５：プライマーＬＭ＿ＴＢＲＦＶ－１－Ｒのヌクレオチド配列。
配列番号４４：プローブＬＭ＿ＴＢＲＦＶ－１－プローブのヌクレオチド配列。

図１は、ＴＭＶまたはＴｏＢＲＦＶの移行タンパク質の存在あるいは非存在下で、種々のＴＭ－２－２変異体のベンサミアナ・タバコでの一過的な発現を示す。写真は浸潤から約５日後に撮影した。

図２は、ＴＭＶまたはＴｏＢＲＦＶの移行タンパク質の存在あるいは非存在下で、種々のＴＭ－２－２変異体のベンサミアナ・タバコでの一過的な発現を示す。２つの異なる日齢のベンサミアナ・タバコ植物の葉に浸潤させた。約５０日齢の植物（左側）または４３日齢の植物（右側）にアグロバクテリウム培養物を浸潤させて、ＴＭＶまたはＴｏＢＲＦＶの移行タンパク質の存在あるいは非存在下で、種々のＴＭ－２－２タンパク質変異体を一過的に発現させた。写真は浸潤から約５日後に撮影した。

図３は、トマトの形質転換用のプラスミドを示す。 図３ＡはバイナリープラスミドｐＪＬ４６９（配列番号４１）であり、 図３ＢはバイナリープラスミドｐＪＬ４７０（配列番号４２）であり、 図３ＣはバイナリープラスミドｐＪＬ４７１（配列番号４３）である。

図４は、Ｔｍ２－２、Ｔｍ－２－１４－２５、およびＴｍ２－４６７の各遺伝子のタンパク質配列を示す。

図５は、ＴｏＢＲＦＶの移行タンパク質の存在あるいは非存在下で、種々のＴＭ－２－２変異体のベンタミアナ・タバコおよびタバカム・タバコでの一過的な発現を示す。ＡＡ ７６７に種々のアミノ酸を有するＴＭ２２ ８４８Ｒ変異体を、ＴｏＢＲＦＶの移行タンパク質の存在（＋ＭＰ）あるいは非存在下で一過的に発現させた。７６７位にある様々なアミノ酸は、変異体を識別するために標準的な単一アミノ酸コードを用いて図中に標識されている。写真はアグロ浸潤から２日後に撮影した。図５Ａはベンサミアナ・タバコであり、 図５Ｂはタバカム・タバコである。

ＴＭ－２－２タンパク質（Ｔｍ－２－２遺伝子の産物）は、ヌクレオチド結合ロイシンリッチリピートリピートタンパク質（ＮＬＲ）であり、ＴＭＶまたはＴｏＭＶのいずれかのウイルスから産生される移行タンパク質（ＭＰ）に結合して、かつ侵入したウイルスに対する効果的な免疫応答をシグナル伝達して、ＴＭＶおよびＴｏＭＶに対する耐性を付与する。ＴＭ－２－２とトバモウイルスのＭＰとの間の結合の結果は、ベンサミアナ・タバコの一過的発現測定法での過敏感反応（組織の壊死）として観察できる。

ＮＬＲタンパク質であるＴＭ－２およびＴＭ－２－２は、アミノ酸が４つだけ異なる（Ｌａｎｆｅｒｍｅｉｊｅｒ ｅｔ ａｌ． ２００５）。これらの違いは、種々の耐性の範囲に関連している。例えば、ＴＭ－２－２変異体は、ＴＭ－２よりも広い範囲のＴＭＶおよびＴｏＭＶ分離株に対する耐性を付与できる（Ｌａｎｆｅｒｍｅｉｊｅｒ ｅｔ ａｌ． ２００５；Ｌａｎｆｅｒｍｅｉｒｊｅｒ ２００４）。特にＬＲＲドメイン中のアミノ酸７６７の１つのアミノ酸変化は、ＴＭ－２－２タンパク質での耐性のより高耐久性でより広い宿主範囲に関与していることが実証された（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ． ２０１１）。しかしながらＴＭ－２タンパク質およびＴＭ－２－２タンパク質は、ＴｏＢＲＦＶに対する耐性を示すことはない。

従って本発明者らは、ＴＭ－２タンパク質およびＴＭ－２－２タンパク質内の変異が、ＴｏＭＶおよびＴＭＶのＭＰを認識する能力を保持しつつ、ＴｏＢＲＦＶのＭＰも認識する能力を付与できるであろうとの仮説を立てた。

本発明者らは、トバモウイルスのＭＰを認識する能力を試験するためにベンサミアナ・タバコでの一過的発現測定法を用いて、多数の変異体を効率的に試験することができた。本発明者らは思いがけず、ＴｏＢＲＦＶの移行タンパク質（ＭＰ）を効率的に認識して、ＴｏＢＲＦＶのＭＰ（エフェクター）とともに共発現されると過敏感反応を誘発できるＴＭ－２－２タンパク質の変異体を単離した。さらにこれらの変異体は、ＴｏＭＶおよびＴＭＶのＭＰにもまた結合して応答できる。

これらの変異体のＤＮＡ配列が見出され、ならびにＴＭＶおよびＴｏＭＶのＭＰに加えてＴｏＢＲＦＶのＭＰも認識するさらなる変異体の配列も得られた（実施例２、３、４、および５）。

既述のＴＭ－２－２変異体を含む植物を、ＴＩＬＬＩＮＧ法によって得ることができ（実施例６）、ならびにアグロバクテリウムの形質転換によっても得ることができる（実施例７）。
実施例１：材料および方法
１．１．本段落に挙げるｔｍ－２遺伝子の対立遺伝子およびＭＰタンパク質の配列：

１．２．変異誘発：
ＴｏＢＲＦＶのＭＰ（以下、ＭＰルゴースと呼ぶ）の存在でＨＲを誘発するＴＭ－２－２タンパク質変異体を見出すために、２つの異なる手法、すなわちそのそれぞれがＴＭ－２－２のＬＲＲドメイン中に変異を形成するように設計されている無作為変異誘発および部位特異的変異誘発を用いた。

ＴａｋａｒａのＤｉｖｅｒｓｉｆｙ ＰＣＲ無作為変異誘発キットおよび平均で１０００塩基対当たり４個の変化を生み出すＰＣＲ条件を用いて、ＴＭ－２－２遺伝子の最後の約７５０ヌクレオチドをＰＣＲによって増幅した。得られたＰＣＲ産物をＴｍ－２－２遺伝子発現プラスミドにクローンし、Ｔｍ－２－２遺伝子の野生型（ｗｔ）の３’～７５０ ｎｔを置換した。

Ｔｍ－２－２遺伝子内の特定の位置に変異を導入することが望ましい場合には、部位特異的変異誘発を用いてもよい。この変異誘発は、対象となる特定のコドンに配列の変化を有するＴｍ－２－２遺伝子の一部を合成して実現される。例えば、ＰＣＲにプライマーとして使用できる合成オリゴヌクレオチドを、Ｔｍ－２－２遺伝子の一部が増幅するように設計できるが、特定の位置に１つ以上の非野生型ヌクレオチドを有するように設計することもできる。このようなオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲに続いて、ＰＣＲ産物をＴｍ－２－２遺伝子の適切な位置にクローンできる。このようにして、遺伝子内の特定の位置にヌクレオチドの多様性を導入することが可能である。

１．３．ベンサミアナ・タバコでの一過的な発現および壊死の評価：
ベンサミアナ・タバコおよびタバカム・タバコでの一過的な発現は、基本的にＭａらおよびＫｏｂａｙａｓｈｉらが説明するように実施した。

実施例１．２に開示の連結反応の産物を、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（ＧＶ３１０１）に形質転換し、５０ μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび２５ μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを有するＬＢプレートに播種して、形質転換アグロバクテリウムを選択した。

約８６０個の種々のアグロバクテリウムコロニーを形質転換から選択した。各コロニーを液体培養で増殖し、それを用いて植物生物学で通常使用される標準手順（Ｔｏｍｉｔａ ｅｔ ａｌ． ２０１９）によりアグロ浸潤用のアグロバクテリウム懸濁液を調製した。ベンサミアナ・タバコの葉に浸潤する前に、これら培養物を、トバモウイルスのＭＰ発現プラスミド、例えばＴｏＢＲＦＶのＭＰ発現プラスミドであるｐＪＬ ３７９で形質転換されたアグロバクテリウムの懸濁液と共に１：１で混合した。

浸潤した植物を、２２～２５℃のＬＥＤまたは蛍光灯のいずれかの下で保存した（１８時間の点灯、６時間の消灯）。１ ｋｂ当たり約４個の変化の誤識別率として、約２５００ヌクレオチドの変化が採取されると推定した（７５０ ｂｐ／クローン×８６０クローン×４個の誤識別／１０００ ｂｐ ＝ 約２５８０ ｎｔの変化）。配列決定によるこのライブラリーの初期の特徴付けでは、発明者らは、ヌクレオチド変化の約７５％がアミノ酸変化を生じると推定した。選別されたクローン内の全てのヌクレオチド変異の７５％がアミノ酸変化を生成する場合には、ＴＭ－２－２タンパク質に対して約１９００個のＡＡの変化が選別されたことになる（０．７５×２５８０ ＝ １９３５）。

浸潤の約６日後に浸潤した葉を観察し、浸潤領域での壊死の程度（すなわち過敏感反応；ＨＲ）を測定した。典型的には、０～４の尺度を用いて壊死を示す浸潤領域の比率を評価した。尺度の詳細は次の通りである：０ ＝ ０％のＨＲ、１ ＝ ～２５％のＨＲ、２ ＝ ～５０％のＨＲ、３ ＝ ～７５％のＨＲ、４ ＝ １００％のＨＲ。対照として、植物に野生型のＴｍ－２－２発現プラスミド（ｐＪＬ ３６６）およびルゴースＭＰ発現プラスミド（ｐＪＬ ３７９）を保有するアグロバクテリウムの１：１混合物を浸潤させた。

１．４．トバモウイルス耐性を評価する手順：
いくつかのトバモウイルス分離株：ＴｏＢＲＦＶ（特にＪｏｒｄａｎ＿２０１５）、ＴｏＭＶ、ＴＭＶ、または他のトバモウイルス分離株を用いて生物検定を実施した。

ウイルス分離株を、水中に粉砕した１４日齢の感染トマトの葉から得られる、冷凍保存の感染溶液によって保持した（接種材料の比率：４ ｍＬの水に対して１ ｇの葉）。人差し指で子葉を擦って、二葉段階（すなわち播種後１４～１６日目）のトマト苗木に汁液接種して生物検定を実施した。トマト系統／系統種／遺伝子型ごとに少なくとも１８本の苗木（２回または３回のリピートで分離）を、トバモウイルス耐性について試験した。

植物の表現型の評価を、植物に接触せずに植物ごとに点数を付けて実施する。接種された器官での局所病変の存在を、７～１０日のＤＰＩで評価する。遺伝子型ごとに少なくとも１つの植物が接種された器官に局所病変を示す場合には、その遺伝子型は潜在的に興味対象となる型と考えられる。トバモウイルスは、実際には、通常は易感染性の植物に壊死を誘発することはない。

全身の症状の評価を、１４、２１、および２８日のＤＰＩで実行し、最後の評価の実施は任意とする。症状を以下の尺度に従って視覚的に評価する；９：視覚的症状なし／７：表現型に小さな違いはあるが、明瞭に病気症状に起因するものではない／５：軽い症状（モザイクおよび／または軽い葉脈の縞模様）／３：強い症状（強いモザイクおよび／または顕著な葉脈の縞模様および／または小さな葉の変形）／１：非常に強い症状（葉の変形および／またはモザイクおよび／または非常に顕著な葉脈の縞模様）。

試験の１４日および／または２８日後に、症状のない植物をＥＬＩＳＡおよび／または定量ＰＣＲによって試験して、植物内のトバモウイルスの存在を評価する。

１．５．ＴＩＬＬＩＮＧ（ゲノム内に誘発された局所病変を標的とする）：
ＴＩＬＬＩＮＧ法を、通常の手順に従って実施する。

全てのＤＮＡ反応化学薬剤（変異誘発因子）を、ＤＮＡの傷害を誘発するのに使用できるが、ＥＭＳに限定はされない。

以下のような物理的ＤＮＡ反応剤（変異誘発因子）もまた使用できる：
・電離放射線（Ｘ線、γ線、α線・・）、重粒子線照射
・紫外線放射
・放射性崩壊

物理的または化学的変異誘発因子をＭ０種子に加える。次いで変異誘発因子によって導入された全ての変異に対してヘテロ接合性であるＭ１植物を自家受粉して、Ｍ２種子を生成する。これらの種子の一部を保管する。次いで配列決定のために、少なくとも８個のＭ２植物に対し試料採取を行う。理論的な比率として、これら植物の１／２が特定の変異に対してヘテロ接合性であり、１／４がその変異に対してホモ接合性であり、かつ１／４が前記変異の存在がないホモ接合性である。あるいは、適切な変異の選別をＭ１植物に対して実施してもよい。

この場合に、Ｔｍ－２－２遺伝子内の予測される変異が高度に特異的である限り、非常に大きな変異集団を試験することが重要である。

実施例２：ＴｏＢＲＦＶのＭＰを認識するＴｍ２遺伝子の対立遺伝子の特定
背景：
トマトブラウンルゴースフルーツウイルス（ＴｏＢＲＦＶ）は、トマトおよびトウガラシの深刻な病原体である。このウイルスは、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）およびトマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶ）などの他のトバモウイルスに関連している。

ＴＭＶおよびＴｏＭＶに対する遺伝的耐性は、Ｔｍ－２－２遺伝子に位置付けられる。Ｔｍ－２遺伝子の産物であるＴＭ－２－２タンパク質は、ＮＢＳ－ＬＲＲの部類としても知られるヌクレオチド結合ロイシンリッチリピート（ＮＬＲ）の部類の耐性（Ｒ）タンパク質である。商業的なトマト生殖質では、Ｔｍ－２遺伝子の２つの一般的に用いられる対立遺伝子、すなわちＴｍ－２およびＴｍ－２－２が存在する。異なる対立遺伝子により、異なるトバモウイルスに対する耐性が付与される（表１を参照）。特にＴｍ－２－２対立遺伝子は、トマトにとって重大な病気の脅威となる２つのトバモウイルス（ＴＭＶおよびＴｏＭＶ）に対する永続的な遺伝的耐性を付与するので、商業的なトマト生殖質に広く展開されている。しかしＴｏＢＲＦＶは、Ｔｍ－２またはＴｍ－２－２遺伝子を保有する植物に感染する可能性があり、ＴｏＢＲＦＶに対する耐性を付与するＴｍ－２対立遺伝子は特定されていない。

さらに、ＴｏＢＲＦＶ、ＴＭＶ、およびＴｏＭＶに対して同時に効果的な耐性を提供する、既知の耐性遺伝子は存在しない。

ＴＭ－２－２タンパク質は、いずれかのウイルスから産生される移行タンパク質（ＭＰ）に結合し、トマトでの過敏感反応（ＨＲ）を誘発してそれにより細胞死をもたらす侵入ウイルスに対する効果的な免疫応答のシグナルを伝達することによって、ＴＭＶおよびＴｏＭＶに対する耐性を付与する。ＴＭ－２－２とトバモウイルスのＭＰとの間の結合の結果、すなわちＨＲ応答はさらに、Ｋｏｂａｙａｓｈｉら（２０１１）に開示された手順に従って、ベンサミアナ・タバコ植物の葉にＴＭ－２－２タンパク質とＴＭＶまたはＴｏＭＶのＭＰのいずれかを一過的に発現させて観察できる。

（アグロ浸潤技術による）ベンサミアナ・タバコの葉でのＴＭ－２－２とＴＭＶまたはＴｏＭＶのＭＰのいずれかの一過的な発現では、確かに僅か数日で過敏感反応および広範な組織壊死を引き起こす。対照的に、ベンサミアナ・タバコの葉のＴＭ－２－２とＴｏＢＲＦＶのＭＰ（ＭＰルゴース）の一過的な発現では、通常は壊死の発生が無い、あるいは場合によっては非常に軽度の壊死が発生する。

ベンサミアナ・タバコでのＨＲ応答測定法は、トバモウイルスＭＰを認識するのに重要なＮＬＲタンパク質中の特定のアミノ酸を識別するために以前から使用されている（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ， ２０１１）。ＴＭ２のＮＬＲタンパク質がベンサミアナ・タバコの葉で（トバモウイルスのＭＰの存在で）強力なＨＲ応答を誘発する能力と、トマトでのウイルス耐性との間には完全な相関関係が成立する。さらにアグロ浸潤によるタンパク質の一過的な発現は、植物生物学では十分に確立された技術である。

この完全な相関関係を考慮すると、ベンサミアナ・タバコでのこの測定法は、トマトでの耐性の代用として使用できる。

しかしながら、この測定法または方法の過去の使用では、機能の喪失を引き起こす変異を検出することによって、トバモウイルスのＭＰを認識するのに重要なＮＬＲタンパク質内の特定のアミノ酸を識別することを目的としたのに対して、本発明者らは、初めてこの方法を用いて、機能の獲得、すなわちさらなるトバモウイルスのＭＰを認識する能力を提供する可能性のある変異体を試験した。

本発明者らは、まずエラープローンＰＣＲ法を用いて、Ｔｍ－２－２遺伝子の変異体のライブラリーを生成した。次いでこの変異体のライブラリーを、ＴｏＢＲＦＶのＭＰとともにベンサミアナ・タバコ植物の葉で一過的に発現させた（実施例１．２および１．３での材料および方法を参照）。変異体当たり平均２．２５個のアミノ酸修飾に相当する、８６０を超える形質転換アグロバクテリウム培養物を選別した後に、本発明者らは、ＴｏＢＲＦＶのＭＰと共発現した場合に再現性があり（対照に比較して）顕著なＨＲ応答の増加を示す１つのコロニー（ＬＰ １４～２５）を特定した。本発明者らはさらに、ＴｏＢＲＦＶのＭＰの存在で強固なＨＲ応答を誘発するこの変異体が、ＴＭＶまたはＴｏＭＶのＭＰの存在での強固なＨＲ応答を誘発する能力を喪失していないことを確認した（図１および２、および表３を参照）。

詳細な分析により、この変異体は、ＴＭ－２－２タンパク質とは２つのアミノ酸（Ｆ６５５ＬおよびＣ８４８Ｒ）が異なることが明らかになった。この新たな変異体はＴｍ２－１４－２５と呼ばれる（表１を参照）。

部位特異的変異誘発を含む標準的な分子技術を用いるさらなる分析を通して、本発明者らは、ＴｏＢＲＦＶのＭＰを認識する能力を単一のアミノ酸変化（Ｃ８４８Ｒ）に位置付けた。本発明者らは、この新たなＴｍ－２対立遺伝子をＴｍ２－４６７として特定する（表１および表４を参照）。この実験により、ＴＭ－２－２に対するＣ８４８Ｒの変化がＭＰルゴース（ＴｏＢＲＦＶのＭＰ）の検出および応答の両方に関与し、かつそれらのために十分であることが明らかになった。

タンパク質ＴＭ２－２、ＴＭ２－１４－２５、およびＴＭ２－４６７（それぞれＴｍ－２－２、Ｔｍ２－１４－２５、およびＴｍ２－４６７遺伝子のタンパク質産物）の配列を図４に示す。

ＴＭ２－１４－２５およびＴＭ２－４６７タンパク質は両方ともＴｏＢＲＦＶのＭＰを認識しているので、それらが共有するアミノ酸変化が、（ＴＭ－２－２タンパク質に対比して）ＴｏＢＲＦＶのＭＰを強力に認識する能力に関与していることは明らかである。このタンパク質は、（ＴＭ２－１４－２５に固有の変化などの）さらなる変異を有する可能性があり、かつさらにＴｏＢＲＦＶのＭＰを認識することがまた観察されている。ＴＭ２－１４－２５タンパク質およびＴＭ２－４６７タンパク質は両方とも、さらにＴＭＶおよびＴｏＭＶのＭＰを認識する。

ＴＭ２＿１４－２５またはＴＭ２－４６７のタンパク質配列のいずれかは、トマトのＴｏＢＲＦＶに対する耐性の向上を付与することができ、同時にＴＭＶおよびＴｏＭＶに対する耐性を付与することができる。

実施例３：さらなる変異体
上の実施例に詳述のように、本発明者らは、ＴＭ－２－２タンパク質での単一のアミノ酸変化が、ＴｏＢＲＦＶのＭＰの存在で、ＴＭＶおよびＴｏＭＶに対する耐性を失わずに強力なＨＲ応答を誘発するのに十分であることを示している。

この変異および耐性を改善する可能性があるさらなる変異をよりうまく特徴付けるために、部位特異的手法を用いてその他のアミノ酸変異を生成した。ＬＲＲドメイン内の選択されたコドンは、非野生型アミノ酸をコードするように変更された。タンパク質変異体の機能的な選別を、（上述の）ＭＰルゴースの存在でアグロ浸潤およびベンサミアナ・タバコでの一過的な発現によって実施した。場合によっては、選択したアミノ酸変化を、実施例２に述べた８４８Ｒ変化を有するＴＭ－２－２タンパク質の環境で選別した。いくつかの選別の結果を表５～１１に示す。

結論：８４８位のアミノ酸変異のいずれもが、ＭＰルゴースの存在でＣ８４８Ｒに類似の過敏感反応を誘発するＴＭ－２－２変異体は言うまでもなく、Ｃ８４８Ｒよりも強い過敏感反応を誘発するＴＭ－２－２変異体を形成することはできない。

８５７位
８４８位の近くでかつＴＭ－２－２タンパク質の三次元構造内のアミノ酸８４８の近傍にある８５７位でのＡＡの変異の影響をさらに試験した。その結果を表６に示す。

結論：ＡＡ８４８をＲとして８５７位のいくつかのＡＡの変化は、ＭＰルゴースに対するＨＲ応答を低減させる。但し８４８Ｒの近傍の他のＡＡの変化は、ＭＰルゴースへの応答を維持できる。

従って８５７位での変異は許容可能であるが、その範囲は限定される。許容可能な変異は容易に試験できる。

７６７位
７６７位（のみ）でのＡＡの変化の影響をさらに、（８４８位での変異は無しに）試験した。この位置のアミノ酸が、ＴＭ－２耐性とＴＭ－２－２耐性の違いを決定的にすることを、Ｋｏｂａｙａｓｉらが実証している。その結果を表７に示す。

結論：試験した７６７位の７種の異なるＡＡの変異体のうち、Ｃ８４８Ｒ変異の不在では、いずれもＭＰルゴースを検出しかつそれに応答する能力を向上させなかった。

７６９位
７６７位（のみ）でのＡＡの変化の影響をさらに、（８４８位での変異は無しに）試験した。その結果を表８に示す。

結論：７６９位に６種の異なる（非野生型の）ＡＡを有するＴＭ２２変異体の試験では、Ｃ８４８Ｒ変異体よりもＭＰルゴースへの結合および応答に優れるいずれの変異体も見出せなかった。

ＴＭ－２－２の８４８Ｒの環境での７６７位
Ｃ８４８Ｒ変異に加えて、７６７位のＡＡの変異の影響をさらに試験した。その結果を表９に示す。

結論：ＭＰルゴースの検出は、７６７位および８４８位の両方のＡＡに依存する。

ＡＡ８４８をＲとしかつＡＡ７６７をＹとするＴＭ－２－２変異体は、ＭＰルゴースを検出かつそれに応答できる。しかしＡＡ７６７をＳまたはＤに変更すると、ＭＰルゴースに応答するタンパク質の能力が劇的に低下する。このことは、残基７６７および８４８の両方がＭＰルゴースに結合するのが重要であることを示している。

但し本発明者らのさらなる検討では、タンパク質がＭＰルゴースに応答する能力を著しく低下させることなく、７６７位をＷおよびＦで置換でき、さらにこの能力を増強できることが実証された（実施例４を参照）。

８２２位
８２２位のＡＡの変異の影響をさらに、Ｃ８４８Ｒ変異の環境で試験したが、この８２２位は、ＴＭ－２－２タンパク質の三次元構造内のアミノ酸８４８の近傍に位置すると言える。その結果を表１０に示す。

結論：８２２位の様々なアミノ酸は、ＭＰルゴースに結合しかつそれに応答するＴＭ２２の８４８Ｒの能力を低下させる可能性があるが、その他の変異は許容可能となる。８４８がＲである場合に、８２２位にはアミノ酸ＮおよびＳが好ましい。

但し本発明者らのさらなる検討では、８２２位がＣ、Ｆ、Ｍ、Ｙ、およびＷで置換されると、Ｃ８４８Ｒ変異が起こらない場合でもタンパク質がＭＰルゴースに応答する能力を提供できることが実証された（実施例５を参照）。

要約すると、この変異体およびこの機能の獲得を可能にする変異を含むさらなる変異体を特定するプロセスでは、部位特異的変異誘発および無作為変異誘発の組合せを用いて、１０００個を超える種々の変異体を選別できた。なお無作為変異誘発によって得られた変異体ライブラリーのメンバーの一部は、配列決定することなくＨＲ測定法で選別された。

以下の表１１は、ＴｏＢＲＦＶのＭＰに対する応答について選別された種々の変異体を詳述し、分かっている場合には試験済みの変異を記載している。

要約すると、これらの試験に従ってＴＭ－２－２内の７６７Ｙおよび８４８Ｒが、ＭＰルゴースへの結合およびそれに応答する重要な残基であるように見受けられる（但しさらなる修飾は許容されるように思われる；実施例４を参照）。ＬＲＲドメインの他の位置での他のアミノ酸の変化は、多くの場合に、ＭＰルゴースの結合に軽度の低減をもたらし、場合によっては重大な低減を引き起こす可能性があるが、全ての場合にそうとは限らない。適切なアミノ酸の変化は、本発明に記載の測定法によって容易に試験することができる。

ＴＭ－２－２の三次元構造内でのアミノ酸８４８の近傍のアミノ酸は、ＴｏＢＲＦＶへの結合を失うことなく変異することは困難である可能性が高い。

他の実験では、単一コドンでの変異体ライブラリーを選別した。コドン８２７でのそのような実験の一例およびその結果を以下に示す。

ライブラリー１～６で得られた結果は、他の位置で得られた結果と同様に、８４８位の変異が非常に重要であり、かつＴＭ－２－２のＬＲＲ領域内の他のコドンの変異が、ＭＰルゴースに対する認識および応答が向上する変異体を生じないことを実証している。いずれにしても、８４８位での変異はＭＰルゴースの認識に対して必須であるように見受けられる。

実施例４：７６７位でのさらなる修飾および種々のタバコ種での検証
Ｃ８４８Ｒ置換を含むＴＭ－２－２タンパク質変異体の７６７位でのさらなる修飾を、種々のタバコ種で試験した。

具体的には、植物（ベンサミアナ・タバコおよびタバカム・タバコ）に、ＴＭ－２－２タンパク質変異体単独の発現あるいはＴＭ－２－２タンパク質変異体とＭＰルゴースの共発現のためにＴ-ＤＮＡを有するプラスミドを含むアグロバクテリウム培養物を浸潤させた。

結果を図５に示す。葉表面の斑点の傍の文字は、ＴＭ－２－２の８４８Ｒ変異体の環境での７６７位のアミノ酸を示す。ＴＭ－２－２変異体を、単独で発現させ（文字のみで示す）、あるいはルゴースＭＰ（＋ＭＰで示す）と共発現させた。これら植物を浸潤後の約４８時間に撮像した。

結果は、ＴＭ－２－２の７６７Ｙ ８４８Ｒ（ＴＭ２－４６７）、７６７Ｆ ８４８Ｒ（ＴＭ２－４）、および７６７Ｗ ８４８Ｒ（ＴＭ２－５）の全てが、ベンサミアナ・タバコ（図５Ａ）またはタバカム・タバコｃｖ Ｘａｎｔｈｉ（図５Ｂ）のいずれかでのＭＰルゴースの存在でＨＲ応答を誘発することを示している。この測定法では、７６７ＷおよびＹ変異体は、７６７Ｆ変異体よりもＭＰルゴースに対して「応答性が高い」ように見受けられる。対照的に、７６７位にＲ、Ｑ、またはＧの各アミノ酸を有するＴＭ－２－２変異体は、ＭＰルゴースの存在でＨＲを誘発しなかった。

実施例５：ＴｏＢＲＦＶのＭＰを認識するさらなるＴｍ２遺伝子の対立遺伝子の特定
Ｃ８４８Ｒ変異の重要性を考慮して、三次元構造でのＣ８４８の近傍のアミノ酸が変異しているさらなる変異体を試験した。すなわち、Ｃ８４８Ｒ変異の不在の下でＴＭ２－２タンパク質の８２２位および８２５位の２０種の異なるアミノ酸を試験した。

植物（ベンサミアナ・タバコ）に、ＴＭ－２－２タンパク質変異体単独の発現、あるいはＴＭ－２－２タンパク質変異体とＭＰルゴースの共発現のためにＴ-ＤＮＡを有するプラスミドを含むアグロバクテリウム培養物を浸潤させた。

強い過敏感反応を誘発する変異体を、７６７位、８２２位、８２５位、および８４８位の対立遺伝子の詳細とともに表１２に纏める。Ｃ８４８（ｗｔ）およびＹ７６７（ｗｔ）と組合せた８２２位および８２５位の他の変異体の全てが、ＭＰルゴースに対するＨＲを誘発することはない。

結論として、ＴＭ２－２タンパク質のＣ８４８Ｒ変異に加えて、ＴＭ２－２タンパク質のＮ８２２Ｃ、Ｎ８２２Ｆ、Ｎ８２２Ｍ、Ｎ８２２Ｙ、Ｎ８２２Ｗ、Ｓ８２５Ｈ、Ｓ８２５Ｋ、およびＳ８２５Ｔ変異は、ＭＰルゴースに対するＨＲ応答から推測できるように、ＴｏＢＲＦＶに対する耐性を付与するのに十分である。

実施例６：ＴＩＬＬＩＮＧ（ゲノム内での標的誘導局所病変）手法による、ＴｏＢＲＦＶのＭＰを認識するＴｍ２の新型変異体を保有する非遺伝子組換え植物の提供
変異誘発された集団内：
ヌクレオチド置換によりゲノム配列にあらゆる種類の無作為変異を誘発する、当業者には周知の物理的または化学的変異誘発剤を用いて、大規模な変異体トマト集団を形成する。集団に使用される親系統は、好ましくはホモ接合基準でＴｍ２^２遺伝子を保有する系統である。この系統は、ＴｏＭＶ、ＴＭＶには耐性があるが、ＴｏＢＲＦＶには易感染性である。

この集団の大規模な選別を、好ましくは分子測定法または配列決定に基づく周知の選別方法を用いて、Ｔｍ２遺伝子（Ｓｏｌｙｃ０９ｇ０１８２２０）での変異を識別するために、Ｍ１またはＭ２段階（実施例１．５に詳述した手順）で実施する。

Ｔｍ２遺伝子内に変異を保有する植物を、種子の生産のために自家受粉する。次の世代（Ｍ２またはＭ３）を、標的の変異について遺伝子型決定し、ヘテロ接合またはホモ接合された植物（変異の固定）を用いて、表現型を決定しかつＭＡＢＣ（マーカー支援戻し交配）またはその他の古典的な育種法によりエリート系統内に遺伝子移入する。遺伝的な背景にある他の変異を排除するために、数回の戻し交配を実施する。

変異を保有する植物に、実施例１．４に詳述した手順を用いて、ＴｏＢＲＦＶ耐性および他のトバモウイルス耐性について表現型解析を実施する。

実施例７：ＴｏＢＲＦＶのＭＰを認識するＴｍ２の新型変異体を有する遺伝子組換え植物の提供
アナベルトマト系統を、前段落の結果に特定されているようにＴｍ－２－２変異体によるアグロバクテリウムの形質転換に用いる。

種子を、２滴のＴｗｅｅｎ（登録商標） ２０を含む２％の次亜塩素酸ナトリウム溶液中で撹拌しながら２０分間表面滅菌して、次いで滅菌蒸留水で３回洗浄する。

次いで種子を、２０ ｇ／Ｌのショ糖および０．８％の微小寒天を含有するｐＨ ５．９のＭＳ培地（Ｍ０２２２、Ｄｕｃｈｅｆａ社）を有するプラスチックジャー内で培養し、２５℃で光線（３０００～４０００ルクス、１６時間の光周期）の下に配置する。

外植片を１０日目の苗木の子葉から切除する。滅菌鉗子とカミソリ刃を用いて、それぞれの子葉の両端を取り除き、次いで子葉を２つの断片に切断する。外植片を、ＣＣ培地（２ ｍｇ／ＬのＮＡＡ、１ ｍｇ／ＬのＢＡＰ、１６０ ｍｇ／Ｌのグルクロン酸、および４０ ｍｇ／Ｌのアセトシリンゴンを補充した２０ ｇ／Ｌのショ糖および０．８％の微小寒天を含むｐＨ ５．９のＭＳ培地）を含む直径１０ ｃｍのペトリ皿上に配置し、２５℃で光線（３０００～４０００ルクス、１６時間の光周期）の下に１日配置する。

アグロバクテリウム・ツメファシエンス株：Ａ１２２４、Ａ１２２５、およびＡ１２５０を、バイナリープラスミドであるｐＪＬ４７０、ｐＪＬ４７１、およびｐＪＬ４６９（図３Ａ、３Ｂ、および３Ｃを参照）それぞれのアグロバクテリウム・ツメファシエンス株：ＧＶ３１０１への電気穿孔によって得た。

Ｔ－ＤＮＡプラスミドを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンスの単一コロニーを、２８℃の撹拌機（２００ ｒｐｍ）内の１０ μｇ／ｍＬのリファンピシンおよび５０ μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む１５ ｍＬのＬＢ混合液中で２０時間培養した。

細菌を、一晩放置した懸濁液の１０００ ｇでの２０分間の遠心分離によってペレットにして、滅菌したＣＣ液体培地（２ ｍｇ／ＬのＮＡＡ、１ ｍｇ／ＬのＢＡＰ、１６０ ｍｇ／Ｌのグルクロン酸、および４０ ｍｇ／Ｌのアセトシリンゴンを補充した２０ ｇ／Ｌのショ糖を含むｐＨ ５．９のＭＳ培地）中に６００ ｎｍでの光学濃度が０．１になるまで再懸濁する。

滅菌ビーカー中で、子葉の外植片をアグロバクテリウムの懸濁液中で徐々に撹拌（１００ ｒｐｍ）しながら１５分間浸漬する。滅菌鉗子を用いて、外植片を滅菌した濾紙表面で吸い取らせ、次いで固形ＣＣ培地（２ ｍｇ／ＬのＮＡＡ、１ ｍｇ／ＬのＢＡＰ、１６０ ｍｇ／Ｌのグルクロン酸、および４０ ｍｇ／Ｌのアセトシリンゴンを補充した２０ ｇ／Ｌのショ糖および０．８％の微小寒天を含むｐＨ ５．９のＭＳ培地）に移す。プレートを、２５℃で光線（３０００～４０００ルクス、１６時間の光周期）の下に４８時間配置する。

外植片を、２０ ｇ／Ｌのショ糖を含有しかつ１００ ｍｇ／Ｌのアモキシシリン、２０ ｍｇ／Ｌのクラブラン酸を補充した１００ ｍＬの液体ＭＳ培地（ｐＨ ５．９）で２回濯いで滅菌紙に吸い取らせて、次いで固形選択培地（１ ｍｇ／Ｌのゼアチン、１００ ｍｇ／Ｌのアモキシシリン、２０ ｍｇ／Ｌのクラブラン酸、および１００ ｍｇ／Ｌのカナマイシンを補充した２０ ｇ／Ｌのショ糖および０．８％の微小寒天を含むＭＳ培地）に（１ペトリ皿当たり１０個の外植片で）移す。ペトリ皿を、２５℃で光線（３０００～４０００ルクス、１６時間の光周期）の下に配置し、培地を新芽が再生するまで２週間ごとに交換する。

新芽および若木を単離し、発根培地（０．５ ｍｇ／ＬのＩＡＡ、１００ ｍｇ／Ｌのアモキシシリン、２０ ｍｇ／Ｌのクラブラン酸、および１００ ｍｇ／Ｌのカナマイシンを補充した２０ ｇ／Ｌのショ糖および０．８％の微小寒天を含むｐＨ ５．９のＭＳ培地）を含むプラスチックジャー内に入れる。ジャーを２５℃で光線（３０００～４０００ルクス、１６時間の光周期）の下に配置する。

よく根が張った若木を土壌に移す。根を水で濯いで寒天を慎重に取り除いて、土壌を含むトレイにこの植物を入れて温室に移す。

順化から２週間後に、植物から試料採取し若葉の一片を流動細胞計測法によって分析して、二倍体植物を選択する。ゲノムＤＮＡを円盤状の若葉から抽出し、以下のプライマーを用いてｎｐｔＩＩ遺伝子のＰＣＲ増幅を実施して形質転換体を選別する：
順方向プライマー：ｎｐｔ２Ｆ ＣＣＴＧＣＣＧＡＧＡＡＡＧＴＡＴＣＣ（配列番号３７）および
逆方向プライマー：ｎｐｔ２Ｒ ＧＣＣＡＡＣＧＣＴＡＴＧＴＣＣＴＧＡ（配列番号３８）
形質転換体をまた、以下のプライマーを用いるＰＣＲ増幅で特性評価することもできる：
順方向プライマー：ｔｍ２－２－Ｆ２ ＴＴＣＣＴＣＣＡＡＡＴＣＴＣＡＴＣＡＡＧＣ（配列番号３９）および
逆方向プライマー：ｔｈｓｐ－Ｒ ＣＡＡＣＡＡＧＣＣＡＡＧＡｇＡＡＡＡＣＡＣＡ（配列番号４０）。

この手順によって得られた植物を、ＴｏＢＲＦＶに対する耐性、ならびにＴＭＶ、ＴｏＭＶ、およびＴｏＭＭＶに対する耐性を確認するために試験した。

感染した植物内のＴｏＢＲＦＶ配列の分子定量をまた、ＴａｑＭａｎプローブを用いる定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって実施して、さらにウイルス複製の減少を確認した。
ｑＰＣＲによるＴｏＢＲＦＶの分子定量の手順は以下の通りである：

成長した頭部の若いラッパー葉から試料採取する（植物当たり３～４枚の葉）。これらの葉を液体窒素中で粉砕し、１００ ｍｇの分量をＲＮＡ抽出用に保存する。各試料について、ＲＮＡ抽出には１００ ｍｇの粉砕した葉を用いる。

ＲＮＡ抽出を、Ｐｒｏｍｅｇａ社製の「Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）１６ ＬＥＶ Ｐｌａｎｔ ＲＮＡキット」および「Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）抽出ロボット」（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて実施する。抽出したＲＮＡを－２０℃で保存する。

ウイルス定量用ｑＰＣＲを、キット：Ｇｏｔａｑ Ｐｒｏｂｅ ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴｑＰＣＲシステムＡ６１２０（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を備えたＴａｑＭａｎ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて、製造業者の指示書に従って実施する。

増幅された断片は１８７ ｂｐである。

混合物：
キット：ＴａｑＭａｎ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製

混合物の総量は２０ μＬであり、最終容量が２２ μＬになるように２μＬのＲＮＡを加える。
サーモサイクラー：
逆転写：４５℃で１５分間；
逆転写の不活化および活性化：９５℃で２分間；
以下を含む４０回のサイクル：
変性：９５℃で１５秒；
アニーリングプライマー：５４℃で１５秒；および
アニーリングプローブ：４８°Ｃで３０秒。

各試料に対して３回のリピートを実施する。標準希釈曲線を用いて、相対的定量を実施する。

融解曲線をＳｔｅｐＯｎｅ（登録商標）での手順の最後に実行して、検出／定量の特異性を保証する。

各試料のＣｔを標準曲線に適合させて、各試料中のウイルスの相対量を計算する。
結果：

この結果の前の段落に特定されるように、ＴｏＭＶ、ＴＭＶ、ＴｏＢＲＦＶ、およびＴｏＭＭＶに易感染性のアナベルトマト系統を、Ｔｍ２－２変異体によるアグロバクテリウム形質転換に用いる。

ＴｏＢＲＦＶによる感染を、項目１．４の開示のように、形質転換体（Ｔ－ＤＮＡの存在を上の開示のように確認する）および種々の対照（非形質転換のアナベル）に対して実施した。次に植物の表現型について、１４日のＤＰＩおよび２１日のＤＰＩで点数を付ける。ウイルスＤＮＡの存在を２８日のＤＰＩでｑＰＣＲによって定量して、Ｃｔ値が得られる。Ｃｔすなわちサイクル閾値は、反応内で生成された蛍光が、背景の蛍光を大幅に上回る蛍光信号に対応する蛍光閾値を超えるサイクル数である。サイクル閾値（Ｃｔ）では、検出可能な量の増幅産物が、反応の初期の指数関数的段階中に生成される。サイクル閾値は、対象の遺伝子の初期の相対発現水準に反比例し、すなわちＣｔ値が高いほど耐性の水準は高くなる（これは植物内でのウイルス増殖がより少ないことを意味する）。Ｔｍ２－２の非変異配列を提供するＴ－ＤＮＡによって形質転換された易感染性の植物の数値を、対照として使用できる。Ｃｔの差が３．３２であると、試料中のウイルス量に関して１０倍の差があることを意味する。
試験を２回再現する（試験１および試験２）。
結果の詳細を次の表１３に示す。

この表では、「ＲＥＰ」はリピート数、「Ｐｌｔ ｎｂ」は植物数を指す。「Ｔ－ＤＮＡ遺伝子型」の欄に「存在」と示す場合には、これは上の開示のように、Ｔ－ＤＮＡの存在がＰＣＲによって確認されていることを意味する。

この表に報告された結果は、ベンサミアナ・タバコでの一過的な発現を用いる代用測定法で観察された耐性が、耐性遺伝子を含むトマト植物での耐性を実際に代表することを明瞭に示している。

これらの結果はさらに、少なくともＣ８４８Ｒ変異を有する変異体ＴＭ－２－２遺伝子がＴｏＢＲＦＶ感染に対する耐性を提供し、Ｆ６５５Ｌ変異の存在が耐性を向上させる可能性があることを実証している。

視覚症状（０、１４、および２１日のＤＰＩでの疾患進行曲線下のＡＵＤＰＣ面積）によって評価された耐性、およびｑＰＣＲでの（ウイルスの存在に対応する）Ｃｔによって評価された耐性に関する結果を、遺伝子型に応じて以下の表に纏めることができる。視覚症状を易感染性の対照に対して評価し、「＋」は対照よりも症状が少ないことを指し、「－」は向上が無いことを指す。ｑＰＣＲによって評価されたＣｔをまた、易感染性の対照に対し評価する。「＋」は検出されたウイルス配列が少ないことを指し、「－」は向上が無いことを指す。

次いで本発明者らは、他のトバモウイルス、特に二重変異（Ｃ８４８ＲおよびＦ６５５Ｌ）を有するＴｍ２－２変異体を含むＴ－ＤＮＡで形質転換された植物のＴｏＭＶ ｒａｃｅ ０、ＴＭＶ、およびＴｏＭＭＶに対する耐性を調べた。結果を表１４に纏めるが、Ｔ－ＤＮＡを含む植物（すなわち最終列に「存在」の印を入れる）は、表１３に示すようにＴｏＢＲＦＶに加えてこれら全てのトバモウイルスに対する耐性を有することを明確に示す（同じ変異コード）。

これらの結果は、前述の実施例に示した結果、すなわちＴＭ－２－２遺伝子の変異体がトマト植物へＴｏＢＲＦＶ感染に対する耐性を提供し、同時にＴｏＭＶ、ＴＭＶ、およびＴｏＭＭＶに対する耐性も提供できることを完全に裏付けている。

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Ｗｅｂｅｒ， Ｈ．， Ｏｈｎｅｓｏｒｇｅ， Ｓ．， Ｓｉｌｂｅｒ， Ｍ． Ｖ．， ａｎｄ Ｐｆｉｔｚｎｅｒ， Ａ． Ｊ． ２００４． Ｔｈｅ Ｔｏｍａｔｏ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ３０ ｋＤａ ｍｏｖｅｍｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅｓ Ｔｍ－２ ａｎｄ Ｔｍ－２（２）．「トマトモザイクウイルスの３０ ｋＤａの移行タンパク質は、耐性遺伝子Ｔｍ－２およびＴｍ－２（２）と差次的に相互作用する」Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ １４９：１４９９－１５１４．

Claims (29)

1. 配列番号１１に対して少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するＴＭ－２－２タンパク質のＬＲＲドメインの変異体であるロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ドメインであって、
   前記ＬＲＲ変異ドメインによるＴＭ－２－２タンパク質のＬＲＲドメインの置換により、トマトブラウンルゴースフルーツウイルス（ＴｏＢＲＦＶ）の移行タンパク質（ＭＰ）を認識するタンパク質を生じ、かつ前記ＬＲＲ変異ドメインは、
   ＴＭ－２－２タンパク質（配列番号８）のチロシン７６７に対応する位置にチロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）、またはトリプトファン（Ｗ）を含み、ならびに
   ＴＭ－２－２タンパク質（配列番号８）のシステイン８４８に対応する位置でアルギニン（Ｒ）への置換；
   ＴＭ－２－２タンパク質（配列番号８）のアスパラギン８２２に対応する位置でシステイン（Ｃ）、フェニルアラニン（Ｆ）、メチオニン（Ｍ）、チロシン（Ｙ）、またはトリプトファン（Ｗ）への置換；および
   ＴＭ－２－２タンパク質（配列番号８）のセリン８２５に対応する位置でヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、またはトレオニン（Ｔ）への置換
   のうちの１つ以上を含む、ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ドメイン。
2. ＴＭ－２－２タンパク質（配列番号８）のフェニルアラニン６５５に対応する位置にロイシンをさらに含む、請求項１に記載のロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ドメイン。
3. 好ましくは配列番号１２に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項１または２に記載のＬＲＲドメインをコードするヌクレオチド配列。
4. 請求項１または２に記載のＬＲＲドメインを含むポリペプチドまたはタンパク質であって、前記ポリペプチドまたはタンパク質が、ＴｏＢＲＦＶの移行タンパク質（ＭＰ）、場合によってはトマトモザイクウイルス(Tomato Mosaic Virus)（ＴｏＭＶ）、タバコモザイクウイルス(Tobacco Mosaic Virus)（ＴＭＶ）、および／またはトマト斑点モザイクウイルス(Tomato Mottle Mosaic Virus)（ＴｏＭＭＶ）のうちの少なくとも１つの移行タンパク質（ＭＰ）に結合する、ポリペプチドまたはタンパク質。
5. 前記ポリペプチドまたはタンパク質が、ＮＬＲタンパク質である、請求項４に記載のポリペプチドまたはタンパク質。
6. 配列番号８に対して少なくとも９０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するＴＭ－２－２タンパク質変異体であって、
   前記ＴＭ－２－２タンパク質変異体は、トマトでの少なくともＴｏＢＲＦＶ感染に対する耐性を付与し、かつ前記ＴＭ－２－２タンパク質変異体は、
   配列番号８のチロシン７６７に対応する位置にチロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）、またはトリプトファン（Ｗ）を含み、ならびに
   ＴＭ－２－２タンパク質（配列番号８）のシステイン８４８に対応する位置でアルギニン（Ｒ）への置換；
   ＴＭ－２－２タンパク質（配列番号８）のアスパラギン８２２に対応する位置でシステイン（Ｃ）、フェニルアラニン（Ｆ）、メチオニン（Ｍ）、チロシン（Ｙ）、またはトリプトファン（Ｗ）への置換；および
   ＴＭ－２－２タンパク質（配列番号８）のセリン８２５に対応する位置でヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、またはトレオニン（Ｔ）への置換
   のうちの１つ以上を含む、ＴＭ－２－２タンパク質変異体。
7. ＴＭ－２－２タンパク質（配列番号８）のフェニルアラニン６５５に対応する位置にロイシンをさらに含む、請求項６に記載のＴＭ－２－２タンパク質変異体。
8. 請求項４～７のいずれか一項に記載のポリペプチドまたはタンパク質をコードし、トマト植物でのＴｏＢＲＦＶ感染に対する耐性を付与する耐性遺伝子であって、
   好ましくは配列番号３、４、または５に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する、好ましくは配列番号４、配列番号５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、または配列番号３６を有する、耐性遺伝子。
9. 請求項４～７のいずれか一項に記載のポリペプチドまたはタンパク質をコードする配列を含む、または請求項８に記載のヌクレオチド配列を含む核酸構築物であって、
   好ましくはプロモーター、例えばベクター、プラスミド、またはＴ－ＤＮＡプラスミドの制御下にある、核酸構築物。
10. 好ましくはそのゲノムＤＮＡ中にホモ接合またはヘテロ接合で存在する、請求項８に記載の耐性遺伝子または請求項９に記載の核酸構築物を含む、好ましくは植物細胞である、細胞。
11. 請求項１０に記載の細胞あるいは前記細胞の組織培養物であって、
    前記細胞は、胚、原形質体、成長点細胞、カルス、花粉、葉、葯、茎、葉柄、根、根端、種子、花、子葉、および／または胚軸に由来し、かつそれらのゲノム中に前記核酸構築物または前記耐性遺伝子を含む、細胞あるいは前記細胞の組織培養物。
12. ＴｏＢＲＦＶに対する耐性を有する植物、好ましくはトマト植物(S. lycopersicum plant)であって、
    前記植物は、そのゲノム中に、好ましくは染色体９に請求項７に記載の耐性遺伝子をホモ接合またはヘテロ接合で含む、植物。
13. ＴＭ－２－２タンパク質変異体（配列番号８）をコードする変異Ｔｍ－２－２遺伝子を含む、ＴｏＢＲＦＶに対する耐性を有するトマト植物(S. lycopersicum plant)であって、
    前記ＴＭ－２－２タンパク質変異体は、配列番号８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、
    配列番号８の７６７位に対応する位置のチロシン（Ｙ）は変異されていない、あるいはフェニルアラニン（Ｆ）またはトリプトファン（Ｗ）により置換されていて、かつ前記ＴＭ－２－２タンパク質変異体は、
    配列番号８の８４８位に対応する位置で、システイン（Ｃ）は、アルギニン（Ｒ）により置換されている；
    配列番号８の８２２位に対応する位置で、アスパラギン（Ｎ）は、システイン（Ｃ）、フェニルアラニン（Ｆ）、メチオニン（Ｍ）、チロシン（Ｙ）、またはトリプトファン（Ｗ）により置換されている；および
    配列番号８の８２５位に対応する位置で、セリン（Ｓ）は、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、またはトレオニン（Ｔ）により置換されている
    のうちの１つ以上を含む、トマト植物(S. lycopersicum plant)。
14. 前記変異Ｔｍ－２－２遺伝子は、ＴＭ－２－２タンパク質（配列番号８）のフェニルアラニン６５５に対応する位置にロイシンをさらに含むＴＭ－２－２タンパク質変異体をコードする、請求項１３に記載のトマト植物(S. lycopersicum plant)。
15. 前記変異Ｔｍ－２－２遺伝子は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、または配列番号２６を有するＴＭ－２－２タンパク質変異体をコードする、請求項１３または１４に記載のトマト植物(S. lycopersicum plant)。
16. 前記変異Ｔｍ－２－２遺伝子は、遺伝子編集、塩基編集、またはプライム編集の各技術によって、好ましくは変異誘発によって、ＴＩＬＬＩＮＧによって、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによって得られる、請求項１３または１４に記載のトマト植物(S. lycopersicum plant)。
17. 請求項１２～１６のいずれか一項に記載のトマト植物(S. lycopersicum plant)の植物部分、特に種子、外植片、生殖材料、穂木、切穂、種、果実、根、台木、花粉、胚珠、胚、原形質体、葉、葯、茎、葉柄、または花であって、
    前記植物部分は、請求項１０または１１に記載の少なくとも１つの細胞を含む、トマト植物(S. lycopersicum plant)の植物部分。
18. 請求項１２～１６のいずれか一項に記載のトマト植物(S. lycopersicum plant)に生育させることができる、あるいは請求項１０または１１に記載の少なくとも１つの細胞を含む、トマト(S. lycopersicum)の種子。
19. ＴｏＢＲＦＶに対する耐性を有する遺伝子組換えトマト植物(S. lycopersicum plant)を得る方法であって、
    請求項４～７のいずれか一項に記載のポリペプチドまたはタンパク質をコードする配列を含む構築物、あるいは請求項８に記載の耐性遺伝子を含む構築物を得る工程；
    前記構築物をトマトの細胞に導入する工程；
    遺伝子組換え植物を再生する工程；および
    必要に応じて、得られた植物を繁殖させる工程を含む、方法。
20. Ｔｍ－２－２含有トマト植物(S. lycopersicum plant)の染色体９のＴｍ－２－２遺伝子に少なくとも１つの変異を導入することを含む、ＴｏＭＶ、ＴＭＶ、およびＴｏＢＲＦＶに対する耐性を有するトマト植物(S. lycopersicum plant)を生産する方法であって、
    前記少なくとも１つの変異は、変異誘発によって、ＴＩＬＬＩＮＧによって、ゲノム編集、塩基編集、またはプライム編集によって、特にＮ－メチル－Ｎ－ニトロソ尿素（ＭＮＵ）変異誘発、アジ化ナトリウム（ＮａＮ_３；ＳＡ）変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発（ＯＤＭ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）技術、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、Ｃａｓ９、Ｃａｓ２１ａ、組換えメガヌクレアーゼ、再組換えホーミングエンドヌクレアーゼ、およびＤＮＡ誘導ゲノム編集から選択される技術によって導入され、
    前記変異は、Ｔｍ－２－２遺伝子がコードされたタンパク質中に、Ｃ８４８Ｒアミノ酸置換、Ｎ８２２Ｃアミノ酸置換、Ｎ８２２Ｆアミノ酸置換、Ｎ８２２Ｍアミノ酸置換、Ｎ８２２Ｙアミノ酸置換、Ｎ８２２Ｗアミノ酸置換、Ｓ８２５Ｈアミノ酸置換、Ｓ８２５Ｋアミノ酸置換、およびＳ８２５Ｔアミノ酸置換で構成される群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を生じる、方法。
21. ＴｏＢＲＦＶ、かつ必要に応じてＴＭＶ、ＴｏＭＶ、および／またはＴｏＭＭＶのうちの少なくとも１つに対する耐性を有するトマト植物(S. lycopersicum plant)を育種する方法であって、
    ａ）請求項８に記載の耐性遺伝子を含むトマト植物(S. lycopersicum plant)と、耐性遺伝子を含まない初期のトマト植物(S. lycopersicum plant)とを交配する工程；
    ｂ）このように得られた子孫の中から耐性遺伝子を有する植物を選択する工程；および
    ｃ）必要に応じて、工程ｂ）で得られた植物を１回以上自家受粉させて、このように得られた子孫の中から耐性遺伝子を有する植物を選択する工程を含む、方法。
22. ＴｏＢＲＦＶ、および必要に応じてＴＭＶ、ＴｏＭＶ、および／またはＴｏＭＭＶのうちの少なくとも１つに対する耐性を有するトマト植物(S. lycopersicum plant)を生産する方法であって、
    ａ）請求項１２～１６のいずれか一項に記載の植物の部分を得る工程；および
    ｂ）前記植物部分を栄養繁殖させて、前記植物部分から植物を生成する工程を含む、方法。
23. ＴｏＭＶ、ＴＭＶ、ＴｏＭＭＶ、およびＴｏＢＲＦＶに対する耐性をトマト植物(S. lycopersicum plant)に付与する、あるいはＴｏＭＶ、ＴＭＶ、ＴｏＭＭＶ、およびＴｏＢＲＦＶに対する耐性を有する遺伝子組換えトマト植物(S. lycopersicum plant)を得るための、請求項８に記載の配列または請求項９に記載の構築物の使用。
24. ＴｏＭＶ、ＴＭＶ、ＴｏＭＭＶ、およびＴｏＢＲＦＶに対する耐性をトマト植物(S. lycopersicum plant)に付与するための育種プログラムでの育種パートナーとしての、請求項８に記載の耐性遺伝子を有するトマト（S. lycopersicum）の植物または種子、あるいはその一部またはその子孫の使用。
25. 請求項８に記載の耐性遺伝子をそのゲノム中に含むトマト植物を栽培することを含む、ＴｏＢＲＦＶが蔓延している、または蔓延している可能性がある環境でトマト植物の収量を向上する方法、あるいはトマト生産の損失を低減する方法。
26. 請求項８に記載の耐性遺伝子をそのゲノム中に含むトマト植物を栽培することを含む、ＴｏＭＶ、ＴＭＶ、ＴｏＭＭＶ、および／またはＴｏＢＲＦＶ感染の条件の下でのトマト生産の損失を低減する方法。
27. ａ）請求項１２～１６のいずれか一項に記載のトマト植物(S. lycopersicum plant)を栽培する工程；
    ｂ）前記植物に果実を実らせる工程；および
    ｃ）前記植物の果実を、好ましくは成熟前または成熟の段階で収穫する工程を含む、トマトを生産する方法。
28. ＴＭＶおよびＴｏＭＶに対する耐性を有するトマト植物内で、ＴｏＢＲＦＶに対する耐性を有するトマト植物(S. lycopersicum plant)を識別、検出、および／または選択する方法であって、
    前記方法は、前記植物のゲノム中のＴｍ－２－２遺伝子の変異対立遺伝子の検出を含み、
    前記変異対立遺伝子は、Ｔｍ－２－２遺伝子がコードされるタンパク質中に、ＴＭ－２－２タンパク質中のＣ８４８Ｒアミノ酸置換、Ｎ８２２Ｃアミノ酸置換、Ｎ８２２Ｆアミノ酸置換、Ｎ８２２Ｍアミノ酸置換、Ｎ８２２Ｙアミノ酸置換、Ｎ８２２Ｗアミノ酸置換、Ｓ８２５Ｈアミノ酸置換、Ｓ８２５Ｋアミノ酸置換、およびＳ８２５Ｔアミノ酸置換で構成される群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を生じる少なくとも１つの変異を含む、方法。
29. ＴｏＢＲＦＶに対する耐性を付与するＴｍ－２－２遺伝子の変異体を識別、検出、および／または選択する方法であって、
    ナス科植物、好ましくはタバコ種（Nicotiana）またはトウガラシ種（Capsicum）中で、ＴｏＢＲＦＶの移行タンパク質（ＭＰ）の存在で発現されるＴｍ－２－２遺伝子の変異体を一過的または構成的に発現する工程；および
    変異遺伝子から発現したタンパク質とＭＰタンパク質の間の相互作用を検出する工程を含む、方法。

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