BR112021013654A2 - Lipídeos para liberação de nanopartículas lipídicas de agentes ativos - Google Patents

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Abstract

lipídeos para liberação de nanopartículas lipídicas de agentes ativos. os compostos são fornecidos com a seguinte estrutura: (i) ou um sal, tautômero ou esteroisômero farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que r1, r2, r3, r4, r5, l1, l2, l3, g1, g2, e g3 são como definidos aqui. uso dos compostos como um componente de formulações de nanopartículas lipídicas para distribuição de um agente terapêutico, composições compreendendo os compostos e métodos para seu uso e preparação também são fornecidos.

Description

“LIPÍDEOS PARA LIBERAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS LIPÍDICAS DE AGENTES ATIVOS”
FUNDAMENTOS Campo técnico
[001] A presente divulgação geralmente se refere a novos lipídeos catiônicos que podem ser usados em combinação com outros componentes lipídicos, tais como lipídeos neutros, colesterol e lipídeos conjugados com polímeros, para formar nanopartículas lipídicas com oligonucleotídeos, para facilitar a liberação intracelular de ácidos nucleicos terapêuticos (por exemplo, oligonucleotídeos, RNA mensageiro) tanto in vitro quanto in vivo.
Descrição da técnica relacionada
[002] Existem muitos desafios associados à liberação de ácidos nucleicos para afetar uma resposta desejada em um sistema biológico. A terapêutica à base de ácido nucleico tem um potencial enorme, mas permanece a necessidade de uma distribuição mais eficaz de ácidos nucleicos em locais apropriados dentro de uma célula ou organismo, a fim de realizar esse potencial. Os ácidos nucleicos terapêuticos incluem, por exemplo, RNA mensageiro (mRNA), oligonucleotídeos antissenso, ribozimas, DNAzimas, plasmídeos, ácidos nucleicos imunoestimulantes, antagomir, antimir, mímico, supermir e aptâmeros. Alguns ácidos nucleicos, como mRNA ou plasmídeos, podem ser usados para efetuar a expressão de produtos celulares específicos, como seriam úteis no tratamento de, por exemplo, doenças relacionadas a uma deficiência de uma proteína ou enzima.
As aplicações terapêuticas da liberação de nucleotídeos traduzíveis são extremamente amplas, pois os construtos podem ser sintetizados para produzir qualquer sequência de proteína escolhida, seja ou não indígena ao sistema. Os produtos de expressão do ácido nucleico podem aumentar os níveis existentes de proteína, substituir versões ausentes ou não funcionais de uma proteína ou introduzir uma nova proteína e funcionalidade associada em uma célula ou organismo.
[003] Alguns ácidos nucleicos, como inibidores de miRNA, podem ser usados para efetuar a expressão de produtos celulares específicos que são regulados por miRNA, pois seriam úteis no tratamento de, por exemplo, doenças relacionadas à deficiência de proteína ou enzima. As aplicações terapêuticas da inibição de miRNA são extremamente amplas, pois os construtos podem ser sintetizados para inibir um ou mais miRNA que, por sua vez, regulariam a expressão de produtos de mRNA. A inibição de miRNA endógeno pode aumentar sua expressão de proteína endógena alvo a jusante e restaurar a função adequada em uma célula ou organismo como um meio para tratar doenças associadas a um miRNA específico ou um grupo de miRNA.
[004] Outros ácidos nucleicos podem regular negativamente os níveis intracelulares de mRNA específico e, como resultado, regular negativamente a síntese das proteínas correspondentes por meio de processos como interferência de RNA (RNAi) ou ligação complementar de RNA antissenso. As aplicações terapêuticas de oligonucleotídeo antissenso e RNAi também são extremamente amplas, uma vez que os construtos de oligonucleotídeos podem ser sintetizados com qualquer sequência de nucleotídeos dirigida contra um mRNA alvo. Os alvos podem incluir mRNAs de células normais, mRNAs associados a estados de doença, como câncer, e mRNAs de agentes infecciosos, como vírus. Até o momento, os construtos de oligonucleotídeos antissenso mostraram a capacidade de regular negativamente as proteínas alvo através da degradação do mRNA cognato em modelos in vitro e in vivo. Além disso, os construtos de oligonucleotídeos antissenso estão atualmente sendo avaliadas em estudos clínicos.
[005] No entanto, dois problemas enfrentam atualmente o uso de oligonucleotídeos em contextos terapêuticos. Primeiro, os RNAs livres são suscetíveis à digestão por nuclease no plasma. Em segundo lugar, os RNAs livres têm capacidade limitada para obter acesso ao compartimento intracelular onde reside a maquinaria de tradução relevante. Nanopartículas lipídicas formadas a partir de lipídeos catiônicos com outros componentes lipídicos, como lipídeos neutros, colesterol, PEG, lipídeos peguilados e oligonucleotídeos têm sido usados para bloquear a degradação dos RNAs no plasma e facilitar a absorção celular dos oligonucleotídeos.
[006] Permanece uma necessidade de lipídeos catiônicos melhorados e nanopartículas de lipídeos para a liberação de oligonucleotídeos. De preferência, essas nanopartículas lipídicas forneceriam proporções de fármaco: lipídeos ideais, protegeriam o ácido nucleico da degradação e eliminação no soro, seriam adequadas para distribuição sistêmica ou local e forneceriam distribuição intracelular do ácido nucleico. Além disso, essas partículas de ácido nucleico-lipídio devem ser bem toleradas e fornecer um índice terapêutico adequado, de modo que o tratamento do paciente com uma dose eficaz do ácido nucleico não esteja associado a toxicidade inaceitável e/ou risco para o paciente. A presente divulgação fornece essas e outras vantagens relacionadas.
BREVE SUMÁRIO
[007] Em resumo, a presente divulgação fornece compostos lipídicos, incluindo estereoisômeros, sais farmaceuticamente aceitáveis ou tautômeros dos mesmos, que podem ser usados sozinhos ou em combinação com outros componentes lipídicos, como lipídeos neutros, lipídeos carregados, esteroides (incluindo, por exemplo, todos os esteróis) e/ou seus análogos e/ou lipídeos conjugados com polímero para formar nanopartículas de lipídeos para a distribuição de agentes terapêuticos. Em alguns casos, as nanopartículas de lipídeos são usadas para liberar ácidos nucleicos, como antissenso e/ou RNA mensageiro.
Métodos para uso de tais nanopartículas lipídicas para o tratamento de várias doenças ou condições, tais como aquelas causadas por entidades infecciosas e/ou insuficiência de uma proteína, também são fornecidos.
[008] Em uma modalidade, os compostos com a seguinte estrutura (I) são fornecidos: (I) ou um sal, tautômero ou esteroisômero farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que R1, R2, R3, R4, R5, L1, L2, L3, G1, G2, e G3 são como definidos aqui.
[009] Composições farmacêuticas compreendendo um ou mais dos compostos anteriores de estrutura (I) e um agente terapêutico também são fornecidas. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas compreendem ainda um ou mais componentes selecionados a partir de lipídeos neutros, lipídeos carregados, esteroides e lipídeos conjugados com polímero.
Essas composições são úteis para a formação de nanopartículas lipídicas para a liberação do agente terapêutico.
[010] Em outras modalidades, a presente divulgação fornece um método para administrar um agente terapêutico a um paciente em necessidade, o método compreendendo a preparação ou fornecimento de uma composição de nanopartículas lipídicas compreendendo o composto de estrutura (I) e um agente terapêutico e liberação ou administração da composição para o paciente.
[011] Estes e outros aspectos da divulgação serão evidentes mediante referência à seguinte descrição detalhada.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[012] Na descrição a seguir, determinados detalhes específicos são apresentados, a fim de fornecer um entendimento completo de várias modalidades exemplares da divulgação. No entanto, um técnico especialista no assunto entenderá que a divulgação pode ser praticada sem esses detalhes.
[013] A presente divulgação é baseada, em parte, na descoberta de novos (amino) lipídeos catiônicos que fornecem vantagens quando usados em nanopartículas de lipídeos para a liberação in vivo de um agente ativo ou terapêutico, como um ácido nucleico em uma célula de um mamífero. Em particular, as modalidades da presente divulgação fornecem composições de nanopartículas de ácido nucleico-lipídeo compreendendo um ou mais dos novos lipídeos catiônicos aqui descritos que fornecem atividade aumentada do ácido nucleico e tolerabilidade melhorada das composições in vivo, resultando em um aumento significativo no índice terapêutico em comparação com composições de nanopartículas de ácido nucleico-lipídeo descritas anteriormente. Em outras modalidades, os lipídeos divulgados e nanopartículas de lipídeos que os compreendem têm maior segurança e/ou tolerabilidade quando usados para a liberação de agentes ativos, tais como ácidos nucleicos.
[014] Em modalidades particulares, a presente divulgação fornece novos lipídeos catiônicos que permitem a formulação de composições melhoradas para a liberação in vitro e in vivo de mRNA e/ou outros oligonucleotídeos. Em algumas modalidades, essas composições de nanopartículas lipídicas melhoradas são úteis para a expressão de proteína codificada por mRNA. Em outras modalidades, essas composições de nanopartículas lipídicas melhoradas são úteis para a regulação positiva da expressão de proteínas endógenas, liberando inibidores de miRNA direcionados a um miRNA específico ou um grupo de miRNA que regula um mRNA alvo ou vários mRNA. Em outras modalidades, essas composições de nanopartículas lipídicas melhoradas são úteis para regular negativamente (por exemplo, silenciamento) os níveis de proteína e/ou os níveis de mRNA de genes alvo. Em algumas outras modalidades, as nanopartículas de lipídeos também são úteis para a liberação de mRNA e plasmídeos para a expressão de transgenes. Em ainda outras modalidades, as composições de nanopartículas de lipídeos são úteis para induzir um efeito farmacológico resultante da expressão de uma proteína, por exemplo, aumento da produção de glóbulos vermelhos através da liberação de um mRNA de eritropoietina adequado, ou proteção contra infecção através da liberação de mRNA que codifica para um antígeno ou anticorpo adequado.
[015] As nanopartículas lipídicas e composições de modalidades da presente divulgação podem ser usadas para uma variedade de fins, incluindo a liberação de agentes terapêuticos encapsulados ou associados (por exemplo, complexados), como ácidos nucleicos para células, tanto in vitro quanto in vivo. Por conseguinte, as modalidades da presente divulgação fornecem métodos de tratamento ou prevenção de doenças ou distúrbios em um sujeito em necessidade dos mesmos, contatando o sujeito com uma nanopartícula de lipídeo que encapsula ou está associada a um agente terapêutico adequado, em que a nanopartícula de lipídeo compreende um ou mais dos novos lipídeos catiônicos aqui descritos.
[016] Conforme descrito neste documento, as modalidades das nanopartículas de lipídeos da presente divulgação são particularmente úteis para a liberação de ácidos nucleicos, incluindo, por exemplo, mRNA, oligonucleotídeo antissenso, DNA de plasmídeo, microRNA (miRNA), inibidores de miRNA (antagomirs/antimirs), RNA mensageiro complementar de interferência de RNA
(micRNA), DNA, RNA multivalente, substrato de RNA dicer, DNA complementar (cDNA), etc. Portanto, as nanopartículas lipídicas e composições de certas modalidades da presente divulgação podem ser usadas para induzir a expressão de uma proteína desejada tanto in vitro quanto in vivo pelo contato das células com uma nanopartícula de lipídeo compreendendo um ou mais novos lipídeos catiônicos aqui descritos, em que a nanopartícula de lipídeo encapsula ou está associada a um ácido nucleico que é expresso para produzir a proteína desejada (por exemplo, um RNA mensageiro ou plasmídeo que codifica a proteína desejada) ou processos de inibição que terminam a expressão de mRNA (por exemplo, inibidores de miRNA). Alternativamente, as nanopartículas lipídicas e composições de modalidades da presente divulgação podem ser usadas para diminuir a expressão de genes e proteínas alvo tanto in vitro quanto in vivo, por meio do contato de células com uma nanopartícula lipídica compreendendo um ou mais novos lipídeos catiônicos aqui descritos, em que a nanopartícula de lipídeo encapsula ou está associada a um ácido nucleico que reduz a expressão do gene alvo (por exemplo, um oligonucleotídeo antissenso ou um pequeno RNA de interferência (siRNA)). As nanopartículas de lipídeos e composições de modalidades da presente divulgação também podem ser usadas para a co-liberação de diferentes ácidos nucleicos (por exemplo, mRNA e DNA de plasmídeo) separadamente ou em combinação, tal como pode ser útil para fornecer um efeito que requer a co-localização de diferentes ácidos nucleicos (por exemplo, mRNA que codifica para uma enzima modificadora de um gene adequado e segmentos de DNA para incorporação no genoma do hospedeiro).
[017] Os ácidos nucleicos para uso com modalidades desta divulgação podem ser preparados de acordo com qualquer técnica disponível. Para o mRNA, a metodologia primária de preparação é, mas não se limita a, síntese enzimática
(também chamada de transcrição in vitro) que atualmente representa o método mais eficiente para produzir mRNA específico de sequência longa. A transcrição in vitro descreve um processo de síntese direcionada a um modelo de moléculas de RNA a partir de um modelo de DNA projetado compreendido por uma sequência promotora de bacteriófago a montante (por exemplo, incluindo, mas não se limitando àquela do colifago T7, T3 e SP6) ligada a uma sequência a jusante que codifica o gene de interesse. O DNA modelo pode ser preparado para transcrição in vitro a partir de uma série de fontes com técnicas apropriadas que são bem conhecidas na técnica, incluindo, mas não se limitando a, DNA de plasmídeo e amplificação da reação em cadeia da polimerase (ver Linpinsel, J.L and Conn, G.L., General protocols for preparation of plasmid DNA template and Bowman, J.C., Azizi, B., Lenz, T.K., Ray, P., and Williams, L.D. in RNA in vitro transcription and RNA purification by denaturing PAGE in Recombinant and in vitro RNA syntheses Methods v. 941 Conn G.L. (ed), New York, N.Y. Humana Press, 2012).
[018] A transcrição do RNA ocorre in vitro usando o molde de DNA linearizado na presença da polimerase de RNA correspondente e adenosina, guanosina, uridina e trifosfatos de ribonucleosídeo de citidina (rNTPs) sob condições que suportam a atividade da polimerase, minimizando a degradação potencial dos transcritos de mRNA resultantes. A transcrição in vitro pode ser realizada usando uma variedade de kits disponíveis comercialmente, incluindo, mas não se limitando a RiboMax Large Scale RNA Production System (Promega), kits de transcrição MegaScript (Life Technologies), bem como com reagentes comercialmente disponíveis, incluindo RNA polimerases e rNTPs. A metodologia para a transcrição in vitro de mRNA é bem conhecida na técnica. (Ver, por exemplo, Losick, R., 1972, In vitro transcription, Ann Rev Biochem v.41 409-46; Kamakaka, R. T. and Kraus, W. L. 2001. In vitro Transcription. Current Protocols in Cell Biology.
2:11.6:11.6.1–11.6.17; Beckert, B. And Masquida, B.,(2010) Synthesis of RNA by In vitro Transcription in RNA in Methods in Molecular Biology v. 703 (Neilson, H. Ed), New York, N.Y. Humana Press, 2010; Brunelle, J.L. and Green, R., 2013, Chapter Five – In vitro transcription from plasmid or PCR-amplified DNA, Methods in Enzymology v. 530, 101-114; todos os quais são incorporados aqui por referência).
[019] O mRNA transcrito in vitro desejado é então purificado a partir dos componentes indesejados da transcrição ou reações associadas (incluindo rNTPs não incorporados, enzima de proteína, sais, oligos de RNA curtos, etc.). As técnicas para o isolamento dos transcritos de mRNA são bem conhecidas na técnica. Procedimentos bem conhecidos incluem extração de fenol/clorofórmio ou precipitação com álcool (etanol, isopropanol) na presença de cátions monovalentes ou cloreto de lítio. Exemplos adicionais, não limitativos de procedimentos de purificação que podem ser usados incluem cromatografia por exclusão de tamanho (Lukavsky, P.J. and Puglisi, J.D., 2004, Large-scale preparation and purification of polyacrylamide-free RNA oligonucleotides, RNA v.10, 889-893), cromatografia de afinidade baseada em sílica e eletroforese em gel de poliacrilamida (Bowman, J.C., Azizi, B., Lenz, T.K., Ray, P., and Williams, L.D. in RNA in vitro transcription and RNA purification by denaturing PAGE in Recombinant and in vitro RNA syntheses Methods v. 941 Conn G.L. (ed), New York, N.Y. Humana Press, 2012). A purificação pode ser realizada usando uma variedade de kits comercialmente disponíveis, incluindo, mas não se limitando a SV Total Isolation System (Promega) e Kit de Limpeza e Concentração de Transcrição In vitro (Norgen Biotek).
[020] Além disso, enquanto a transcrição reversa pode gerar grandes quantidades de mRNA, os produtos podem conter várias impurezas de RNA anormais associadas com a atividade indesejada da polimerase que pode precisar ser removida da preparação de mRNA de comprimento total. Estes incluem RNAs curtos que resultam da iniciação da transcrição abortiva, bem como RNA de fita dupla (dsRNA) gerado pela atividade da polimerase de RNA dependente de RNA, transcrição iniciada por RNA a partir de modelos de RNA e extensão 3’ auto- complementar. Foi demonstrado que esses contaminantes com estruturas de dsRNA podem levar a atividade imunoestimuladora indesejada por meio da interação com vários sensores imunes inatos em células eucarióticas que funcionam para reconhecer estruturas de ácido nucleico específicas e induzir respostas imunes potentes. Isso, por sua vez, pode reduzir drasticamente a tradução do mRNA, uma vez que a síntese de proteínas é reduzida durante a resposta imune celular inata. Portanto, técnicas adicionais para remover esses contaminantes de dsRNA foram desenvolvidas e são conhecidas na técnica, incluindo, mas não se limitando a purificação por HPLC escalonável (ver, por exemplo, Kariko, K., Muramatsu, H., Ludwig, J. And Weissman, D., 2011, Generating the optimal mRNA for therapy: HPLC purification eliminates immune activation and improves translation of nucleoside-modified, protein-encoding mRNA, Nucl Acid Res, v. 39 e142; Weissman, D., Pardi, N., Muramatsu, H., and Kariko, K., HPLC Purification of in vitro transcribed long RNA em Synthetic Messenger RNA and Cell Metabolism Modulation in Methods in Molecular Biology v.969 (Rabinovich, P.H. Ed), 2013). Foi relatado que o mRNA purificado por HPLC é traduzido em níveis muito maiores, particularmente em células primárias e in vivo.
[021] Uma variedade significativa de modificações foi descrita na técnica, as quais são usadas para alterar propriedades específicas de mRNA transcrito in vitro e melhorar sua utilidade. Estes incluem, mas não estão limitados a modificações nos terminais 5’ e 3' do mRNA. O mRNA eucariótico endógeno normalmente contém uma estrutura de capa na extremidade 5’ de uma molécula madura que desempenha um papel importante na mediação da ligação da Proteína de Ligação de capa de mRNA (CBP), que por sua vez é responsável por aumentar a estabilidade e a eficiência do mRNA na célula da tradução do mRNA. Portanto, os níveis mais altos de expressão de proteína são alcançados com transcritos de mRNA capeados. A capa 5’ contém uma ligação 5’-5’-trifosfato entre o nucleotídeo mais 5' e o nucleotídeo de guanina. O nucleotídeo de guanina conjugado é metilado na posição N7. Modificações adicionais incluem metilação do último e penúltimo mais 5’-nucleotídeos no grupo 2’-hidroxila.
[022] Múltiplas estruturas de capa distintas podem ser usadas para gerar a capa 5’ de mRNA sintético transcrito in vitro. O capeamento 5’ de mRNA sintético pode ser realizado co-transcricionalmente com análogos de capa químicos (isto é, capeamento durante a transcrição in vitro). Por exemplo, a capa de análogo de capa antirreverso (ARCA) contém uma ligação 5′-5′-trifosfato guanina-guanina onde uma guanina contém um grupo N7 metil, bem como um grupo 3'-O-metil. No entanto, até 20% dos transcritos permanecem descapados durante este processo de co- transcrição e o análogo de capa sintética não é idêntico à estrutura de capa 5’ de um mRNA celular autêntico, reduzindo potencialmente a capacidade de tradução e a estabilidade celular. Alternativamente, as moléculas de mRNA sintéticas também podem ser encapsuladas enzimaticamente após a transcrição. Estes podem gerar uma estrutura de capa 5’ mais autêntica que imita mais de perto, estrutural ou funcionalmente, a capa 5' endógena que aumentou a ligação de proteínas de ligação de capa, aumentou a meia-vida e reduziu a suscetibilidade a endonucleases 5’ e/ou redução de 5′ de decapagem. Numerosos análogos 5'-capa sintéticos foram desenvolvidos e são conhecidos na técnica por aumentar a estabilidade e a capacidade de tradução do mRNA (ver, por exemplo, Grudzien-Nogalska, E., Kowalska, J., Su, W., Kuhn, A.N., Slepenkov, S.V., Darynkiewicz, E., Sahin, U., Jemielity, J., and Rhoads, R.E., Synthetic mRNAs with superior translation and stability properties in Synthetic Messenger RNA and Cell Metabolism Modulation em Methods in Molecular Biology v.969 (Rabinovich, P.H. Ed), 2013).
[023] Na terminação 3’, uma longa cadeia de nucleotídeos de adenina (cauda poli-A) é normalmente adicionada às moléculas de mRNA durante o processamento de RNA. Imediatamente após a transcrição, a extremidade 3’ do transcrito é clivada para liberar uma hidroxila 3' à qual a polimerase poli-A adiciona uma cadeia de nucleotídeos de adenina ao RNA em um processo denominado poliadenilação. Foi demonstrado que a cauda poli-A aumenta tanto a eficiência translacional quanto a estabilidade do mRNA (ver Bernstein, P. and Ross, J., 1989, Poly (A), poly (A) binding protein and the regulation of mRNA stability, Trends Bio Sci v. 14 373-377; Guhaniyogi, J. And Brewer, G., 2001, Regulation of mRNA stability in mammalian cells, Gene, v. 265, 11-23; Dreyfus, M. And Regnier, P., 2002, The poly (A) tail of mRNAs: Bodyguard in eukaryotes, scavenger in bacteria, Cell, v.111, 611-613).
[024] A cauda poli (A) de mRNA transcrito in vitro pode ser alcançada usando várias abordagens, incluindo, mas não se limitando a, clonagem de um trato poli (T) no molde de DNA ou por adição pós-transcricional usando Polimerase Poli (A). O primeiro caso permite a transcrição in vitro de mRNA com caudas poli (A) de comprimento definido, dependendo do tamanho do trato poli (T), mas requer manipulação adicional do molde. O último caso envolve a adição enzimática de uma cauda poli (A) ao mRNA transcrito in vitro usando poli (A) polimerase que catalisa a incorporação de resíduos de adenina no terminal 3’ do RNA, não exigindo manipulação adicional do molde de DNA, mas resulta em mRNA com caudas poli (A) de comprimento heterogêneo. A cobertura 5’ e a cauda 3'-poli (A) podem ser realizadas usando uma variedade de kits disponíveis comercialmente, incluindo, mas não se limitando a kit Poly (A) Polymerase Tailing (EpiCenter), kit mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra e Poly (A) Tailing Kit (Life Technologies), bem como com reagentes disponíveis comercialmente, várias capas ARCA, polimerase Poly (A), etc.
[025] Além de 5’ capa e 3' de poliadenilação, outras modificações dos transcritos in vitro foram relatados para fornecer benefícios relacionados à eficiência da tradução e estabilidade. É bem conhecido na técnica que DNA e RNA patogênicos podem ser reconhecidos por uma variedade de sensores em eucariotos e desencadear respostas imunes inatas potentes. A capacidade de discriminar entre DNA e RNA patogênicos e próprios demonstrou ser baseada, pelo menos em parte, na estrutura e modificações de nucleosídeos, uma vez que a maioria dos ácidos nucleicos de fontes naturais contém nucleosídeos modificados.
Em contraste, o RNA sintetizado in vitro é desprovido dessas modificações, tornando-o imunoestimulador que, por sua vez, pode inibir a tradução eficaz do mRNA conforme descrito acima. A introdução de nucleosídeos modificados no mRNA transcrito in vitro pode ser usada para prevenir o reconhecimento e ativação de sensores de RNA, mitigando assim esta atividade imunoestimulatória indesejada e aumentando a capacidade de tradução (ver, por exemplo, Kariko, K. And Weissman, D. 2007, Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development, Curr Opin Drug Discov Devel, v.10 523-532; Pardi, N., Muramatsu, H., Weissman, D., Kariko, K., In vitro transcription of long RNA containing modified nucleosides in Synthetic Messenger RNA and Cell Metabolism Modulation in Methods in Molecular Biology v.969 (Rabinovich, P.H. Ed), 2013; Kariko, K., Muramatsu, H., Welsh, F.A., Ludwig, J., Kato, H., Akira, S., Weissman, D., 2008, Incorporation of Pseudouridine Into mRNA Yields Superior Nonimmunogenic Vector With Increased Translational Capacity and Biological Stability, Mol Ther v.16, 1833-1840). Os nucleosídeos e nucleotídeos modificados usados na síntese de RNAs modificados podem ser preparados, monitorados e utilizados usando métodos e procedimentos gerais conhecidos na técnica. Uma grande variedade de modificações de nucleosídeos estão disponíveis que podem ser incorporadas sozinhas ou em combinação com outros nucleosídeos modificados até certo ponto no mRNA transcrito in vitro (ver, por exemplo, US 2012/0251618). Foi relatado que a síntese in vitro de mRNA modificado com nucleosídeos tem capacidade reduzida de ativar sensores imunológicos com concomitante capacidade de tradução aumentada.
[026] Outros componentes do mRNA que podem ser modificados para fornecer benefícios em termos de capacidade de tradução e estabilidade incluem as regiões 5’ e 3' não traduzidas (UTR). A otimização das UTRs (UTRs 5’ e 3' favoráveis podem ser obtidas a partir de RNAs celulares ou virais), tanto ou independentemente, mostraram aumentar a estabilidade do mRNA e a eficiência translacional do mRNA transcrito in vitro (ver, por exemplo, Pardi, N., Muramatsu, H., Weissman, D., Kariko, K., In vitro transcription of long RNA containing modified nucleosides in Synthetic Messenger RNA and Cell Metabolism Modulation in Methods in Molecular Biology v.969 (Rabinovich, P.H. Ed), 2013).
[027] Além do mRNA, outras cargas úteis de ácido nucleico podem ser usadas para esta divulgação. Para oligonucleotídeos, métodos de preparação incluem, mas não estão limitados a síntese química e enzimática, clivagem química de um precursor mais longo, transcrição in vitro como descrito acima, etc. Métodos de síntese de nucleotídeos de DNA e RNA são amplamente utilizados e bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Gait, M. J. (ed.) Oligonucleotide synthesis: a practical approach, Oxford [Oxfordshire], Washington, D.C.: IRL Press, 1984; and Herdewijn, P. (ed.) Oligonucleotide synthesis: methods and applications, Methods in Molecular Biology, v. 288 (Clifton, N.J.) Totowa, N.J.: Humana Press, 2005;
ambos são incorporados aqui por referência).
[028] Para DNA de plasmídeo, a preparação para uso com as modalidades desta divulgação geralmente utiliza, mas não está limitada a expansão e isolamento do DNA de plasmídeo in vitro em uma cultura líquida de bactérias contendo o plasmídeo de interesse. A presença de um gene no plasmídeo de interesse que codifica a resistência a um determinado antibiótico (penicilina, canamicina, etc.) permite que as bactérias contendo o plasmídeo de interesse cresçam seletivamente em culturas contendo antibióticos. Métodos de isolamento de DNA de plasmídeo são amplamente utilizados e bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Heilig, J., Elbing, K. L. and Brent, R., (2001), Large-Scale Preparation of Plasmid DNA, Current Protocols in Molecular Biology, 41:II:1.7:1.7.1–1.7.16; Rozkov, A., Larsson, B., Gillström, S., Björnestedt, R. and Schmidt, S. R., (2008), Large-scale production of endotoxin-free plasmids for transient expression in mammalian cell culture, Biotechnol. Bioeng., 99: 557–566; e US 6.197.553 B1). O isolamento de plasmídeo pode ser realizado usando uma variedade de kits comercialmente disponíveis, incluindo, mas não se limitando a Plasmid Plus (Qiagen), plasmídeo GenJET MaxiPrep (Thermo) e kits PureYield MaxiPrep (Promega), bem como com reagentes disponíveis comercialmente.
[029] Várias modalidades exemplares dos lipídeos catiônicos da presente divulgação, nanopartículas de lipídeos e composições compreendendo os mesmos e seu uso para liberar ativos (por exemplo, agentes terapêuticos), tais como ácidos nucleicos, para modular a expressão de genes e proteínas, são descritos em mais detalhes abaixo.
[030] Conforme usado neste documento, os termos a seguir têm os significados atribuídos a eles, a menos que especificado de outra forma.
[031] A menos que o contexto exija de outra forma, ao longo do presente relatório descritivo e reivindicações, a palavra "compreende" e suas variações, tais como, "compreender" e "compreendendo" devem ser interpretadas em um sentido aberto e inclusivo, isto é, como "incluindo, mas não limitado a".
[032] A referência ao longo desta especificação a "uma modalidade" ou "uma modalidade" significa que um determinado recurso, estrutura ou característica descrita em conexão com a modalidade está incluída em pelo menos uma modalidade da presente divulgação. Assim, as aparições das frases "em uma modalidade" ou "em uma modalidade" em vários lugares ao longo desta especificação não se referem necessariamente à mesma modalidade. Além disso, os recursos, estruturas ou características particulares podem ser combinados de qualquer maneira adequada em uma ou mais modalidades.
[033] Salvo definido em outro lugar, todos os termos técnicos e os científicos aqui utilizados possuem os mesmos significados que os comumente entendidos por um técnico especialista no assunto ao qual a divulgação pertence.
Conforme usado na especificação e nas reivindicações, a forma singular "um", "uma" e "o" inclui referências plurais, a menos que o contexto dite claramente o contrário.
[034] A frase "induzir a expressão de uma proteína desejada" se refere à capacidade de um ácido nucleico para aumentar a expressão da proteína desejada.
Para examinar a extensão da expressão da proteína, um modelo de amostra de teste (por exemplo, uma amostra de células em cultura expressando a proteína desejada) ou um mamífero de teste (por exemplo, um mamífero como um humano ou animal), como um roedor (por exemplo, camundongo) ou um modelo de primata não humano (por exemplo, macaco) é colocado em contato com um ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico em combinação com um lipídeo da presente divulgação). A expressão da proteína desejada na amostra de teste ou animal de teste é comparada à expressão da proteína desejada em uma amostra de controle (por exemplo, uma amostra de células em cultura expressando a proteína desejada) ou um mamífero controle (por exemplo, um mamífero como um modelo humano ou animal), tal como modelo de roedor (por exemplo, camundongo) ou primata não humano (por exemplo, macaco) que não é colocado em contato ou administrado com o ácido nucleico. Quando a proteína desejada está presente em uma amostra de controle ou um mamífero de controle, a expressão de uma proteína desejada em uma amostra de controle ou um mamífero de controle pode ser atribuído a um valor de 1,0. Em modalidades particulares, a indução da expressão de uma proteína desejada é alcançada quando a razão da expressão da proteína desejada na amostra de teste ou no mamífero de teste para o nível de expressão de proteína desejada na amostra de controle ou no mamífero de controle é maior do que 1, por exemplo, cerca de 1,1, 1,5, 2,0. 5,0 ou 10,0. Quando uma proteína desejada não está presente em uma amostra de controle ou em um mamífero de controle, a indução da expressão de uma proteína desejada é alcançada quando qualquer nível mensurável da proteína desejada na amostra de teste ou no mamífero de teste é detectado. Um técnico especialista no assunto compreenderá os ensaios apropriados para determinar o nível de expressão da proteína em uma amostra, por exemplo, dot blots, Northern blots, hibridização in situ, ELISA, imunoprecipitação, função enzimática e ensaios fenotípicos ou ensaios baseados em proteínas repórter que podem produzir fluorescência ou luminescência sob condições apropriadas.
[035] A frase "inibir a expressão de um gene alvo" se refere à capacidade de um ácido nucleico para silenciar, reduzir ou inibir a expressão de um gene alvo.
Para examinar a extensão do silenciamento do gene, uma amostra de teste (por exemplo, uma amostra de células em cultura expressando o gene alvo) ou um mamífero de teste (por exemplo, um mamífero como um humano ou animal) modelo como um roedor (por exemplo, camundongo) ou um modelo de primata não humano
(por exemplo, macaco) é colocado em contato com um ácido nucleico que silencia,
reduz ou inibe a expressão do gene alvo.
A expressão do gene alvo na amostra de teste ou animal de teste é comparada à expressão do gene alvo em uma amostra de controle (por exemplo, uma amostra de células em cultura expressando o gene alvo) ou um mamífero controle (por exemplo, um mamífero como um modelo humano ou animal), tal como modelo de roedor (por exemplo, camundongo) ou primata não humano (por exemplo, macaco) que não é colocado em contato ou administrado com o ácido nucleico.
A expressão do gene alvo em uma amostra de controle ou em um mamífero de controle pode receber um valor de 100%. Em modalidades particulares, silenciamento, inibição ou redução da expressão de um gene alvo é alcançado quando o nível de expressão do gene alvo na amostra de teste ou no mamífero de teste em relação ao nível de expressão do gene alvo na amostra de controle ou o mamífero de controle é cerca de 95%, 90%, 85%, 80%,
75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15 %, 10%, 5% ou 0%. Em outras palavras, os ácidos nucleicos são capazes de silenciar,
reduzir ou inibir a expressão de um gene alvo em pelo menos cerca de 5%, 10%,
15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% em uma amostra de teste ou um mamífero de teste em relação ao nível do alvo expressão gênica em uma amostra de controle ou um mamífero de controle não contatado ou administrado com o ácido nucleico.
Os ensaios adequados para determinar o nível de expressão do gene alvo incluem,
sem limitação, o exame dos níveis de proteína ou mRNA usando técnicas conhecidas pelos técnicos especialistas no assunto, tais como, por exemplo, dot blots, Northern blots, hibridização in situ, ELISA, imunoprecipitação, função enzimática, bem como ensaios fenotípicos conhecidos pelos técnicos especialistas no assunto.
[036] Uma "quantidade eficaz" ou "quantidade terapeuticamente eficaz" de um agente ativo ou agente terapêutico, como um ácido nucleico terapêutico, é uma quantidade suficiente para produzir o efeito desejado, por exemplo, um aumento ou inibição da expressão de uma sequência alvo em comparação com o nível de expressão normal detectado na ausência do ácido nucleico. Um aumento na expressão de uma sequência alvo é alcançado quando qualquer nível mensurável é detectado no caso de um produto de expressão que não está presente na ausência do ácido nucleico. No caso em que o produto de expressão está presente em algum nível antes do contato com o ácido nucleico, um aumento na expressão é alcançado quando o aumento no valor obtido com um ácido nucleico, tal como mRNA em relação ao controle, é cerca de 1,05, 1,1 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,75, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 250, 500, 750, 1000, 5000, 10000 ou superior. A inibição da expressão de um gene ou sequência alvo é alcançada quando o valor obtido com um ácido nucleico, tal como o oligonucleotídeo antissenso em relação ao controle é de cerca de 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% ou 0%. Os ensaios adequados para medir a expressão de um gene ou sequência alvo incluem, por exemplo, o exame dos níveis de proteína ou RNA usando técnicas conhecidas pelos técnicos especialistas no assunto, tais como dot blots, Northern blots, hibridização in situ, ELISA, imunoprecipitação, função enzimática, fluorescência ou luminescência de proteínas repórter adequadas, bem como ensaios fenotípicos conhecidos pelos técnicos especialistas no assunto.
[037] O termo "ácido nucleico", como aqui utilizado, se refere a um polímero contendo pelo menos dois desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos na forma de fita simples ou dupla e inclui DNA, RNA e seus híbridos. O DNA pode estar na forma de moléculas antissenso, DNA de plasmídeo, cDNA, produtos de PCR ou vetores.
O RNA pode estar na forma de RNA em gancho pequeno (shRNA), RNA mensageiro (mRNA), RNA antissenso, miRNA, micRNA, RNA multivalente, RNA substrato dicer ou RNA viral (vRNA) e suas combinações. Os ácidos nucleicos incluem ácidos nucleicos contendo análogos de nucleotídeos conhecidos ou resíduos de estrutura modificados ou ligações, que são sintéticos, de ocorrência natural e de ocorrência não natural, e que têm propriedades de ligação semelhantes às do ácido nucleico de referência. Exemplos de tais análogos incluem, sem limitação, fosforotioatos, fosforamidatos, metilfosfonatos, quiral-metil fosfonatos, 2'- O-metil ribonucleotídeos e peptídeos-ácidos nucleicos (PNAs). A menos que especificamente limitado, o termo abrange ácidos nucleicos contendo análogos conhecidos de nucleotídeos naturais que têm propriedades de ligação semelhantes às do ácido nucleico de referência. A menos que indicado de outra forma, uma sequência de ácido nucleico particular também abrange implicitamente suas variantes modificadas de forma conservativa (por exemplo, substituições de códons degenerados), alelos, ortólogos, polimorfismos de nucleotídeo único e sequências complementares, bem como a sequência explicitamente indicada. Especificamente, as substituições degeneradas de códons podem ser alcançadas gerando sequências nas quais a terceira posição de um ou mais códons selecionados (ou todos) é substituída com base mista e/ou resíduos de desoxinossina (Batzer et al., Nucleic Acid Res., 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem., 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes, 8:91-98 (1994)). "Nucleotídeos" contêm um açúcar desoxirribose (DNA) ou ribose (RNA), uma base e um grupo fosfato. Os nucleotídeos estão ligados entre si através dos grupos fosfato. "Bases" incluem purinas e pirimidinas, que incluem ainda compostos naturais de adenina, timina, guanina, citosina, uracila, inosina e análogos naturais e derivados sintéticos de purinas e pirimidinas, que incluem, mas não estão limitados as modificações que colocam novos grupos reativos, tais como, mas não limitados a aminas, álcoois, tióis, carboxilatos e alquilhalogenetos.
[038] O termo "gene" se refere a uma sequência de ácido nucleico (por exemplo, DNA ou RNA) que compreende sequências codificantes de comprimento parcial ou inteiro necessárias para a produção de um polipeptídeo ou polipeptídeo precursor.
[039] "Produto genético", conforme aqui utilizado, se refere a um produto de um gene, tal como um transcrito de RNA ou um polipeptídeo.
[040] O termo "lipídeo" se refere a um grupo de compostos orgânicos que incluem, mas não estão limitados a ésteres de ácidos graxos e são geralmente caracterizados por serem pouco solúveis em água, mas solúveis em muitos solventes orgânicos. Eles geralmente são divididos em pelo menos três classes: (1) "lipídeos simples", que incluem gorduras e óleos, bem como ceras; (2) "lipídeos compostos", que incluem fosfolipídeos e glicolipídeos; e (3) "lipídeos derivados", tais como esteroides.
[041] Um "esteroide" é um composto que compreende o seguinte esqueleto de carbono: .
[042] Exemplos não limitativos de esteroides incluem colesterol e semelhantes.
[043] Um "lipídeo catiônico" se refere a um lipídeo capaz de ser carregado positivamente. Lipídeos catiônicos exemplares incluem um ou mais grupos aminas que carregam a carga positiva. Os lipídeos catiônicos preferenciais são ionizáveis de modo que podem existir em uma forma carregada positivamente ou neutra dependendo do pH. A ionização do lipídeo catiônico afeta a carga superficial da nanopartícula lipídica em diferentes condições de pH. Este estado de carga pode influenciar a absorção de proteínas plasmáticas, clearance do sangue e distribuição nos tecidos (Semple, S.C., et al., Adv. Drug Deliv Rev 32:3-17 (1998)) bem como a capacidade de formar estruturas endossomolíticas não em bicamada (Hafez, I.M., et al., Gene Ther 8:1188-1196 (2001)) crítica para a distribuição intracelular de ácidos nucleicos.
[044] O termo "lipídeo conjugado com polímero" se refere a uma molécula que compreende uma porção de lipídeo e uma porção de polímero. Um exemplo de um lipídeo conjugado com polímero é um lipídeo peguilado. O termo "lipídeo peguilado" se refere a uma molécula que compreende uma porção de lipídeo e uma porção de polietilenoglicol. Lipídeos peguilados são conhecidos na técnica e incluem 1-(monometoxi polietileno glicol)-2,3-dimiristoilglicerol (PEG DMG) e semelhantes.
[045] O termo "lipídeo neutro" se refere a qualquer uma das várias espécies de lipídeos que existem em uma forma zwitteriônica neutra ou não carregada a um pH selecionado. Em pH fisiológico, tais lipídeos incluem, mas não estão limitados a, fosfotidilcolinas, tais como 1,2-Distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC), 1,2- Dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), 1,2-Dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC), 1-Palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), 1,2-dioleoil-sn- glicero-3-fosfocolina (DOPC), fosfatidiletanolaminas como 1,2-Dioleoil-sn-glicero-3- fosfoetanolamina (DOPE), esfingomielinas (SM), ceramidas, esteroides como esteróis e seus derivados. Os lipídeos neutros podem ser sintéticos ou derivados naturalmente.
[046] O termo "lipídeo carregado" se refere a qualquer uma de uma série de espécies de lipídeos que existem em uma forma carregada positivamente ou negativamente, independente do pH dentro de uma faixa fisiológica útil, por exemplo, pH ~ 3 a pH ~ 9. Os lipídeos carregados podem ser sintéticos ou derivados naturalmente. Exemplos de lipídeos carregados incluem fosfatidilserinas, ácidos fosfatidicos, fosfatidilglicerois, fosfatidilinositois, esterol hemisuccinats, dialquil trimetilamônio-propanos, (por exemplo, DOTAP, DOTMA), dialquil dimetilaminopropanos, etil fosfocolinas, dimetilaminoetano carbamoil esterois (por exemplo, DC-Chol).
[047] O termo "nanopartícula de lipídeo" se refere a partículas tendo pelo menos uma dimensão da ordem dos nanômetros (por exemplo, 1-1.000 nm) que incluem um ou mais dos compostos de estrutura (I) ou outros lipídeos catiônicos especificados. Em algumas modalidades, nanopartículas de lipídeos compreendendo os lipídeos catiônicos divulgados (por exemplo, compostos de estrutura (I)) são incluídos em uma formulação que pode ser usada para liberar um agente ativo ou agente terapêutico, como um ácido nucleico (por exemplo, mRNA) para um local alvo de interesse (por exemplo, célula, tecido, órgão, tumor e semelhantes). Em algumas modalidades, as nanopartículas lipídicas compreendem um composto de estrutura (I) e um ácido nucleico. Tais nanopartículas lipídicas compreendem tipicamente um composto de estrutura (I) e um ou mais excipientes selecionados de lipídeos neutros, lipídeos carregados, esteroides e lipídeos conjugados com polímero. Em algumas modalidades, o agente ativo ou agente terapêutico, como um ácido nucleico, pode ser encapsulado na porção lipídica da nanopartícula lipídica ou um espaço aquoso envolvido por parte ou toda a porção lipídica da nanopartícula lipídica, protegendo-a, assim, de degradação enzimática ou outros efeitos indesejáveis induzidos pelos mecanismos do organismo ou células hospedeiras, por exemplo, uma resposta imune adversa.
[048] Em várias modalidades, as nanopartículas lipídicas têm um diâmetro médio de cerca de 30 nm a cerca de 150 nm, de cerca de 40 nm a cerca de 150 nm, de cerca de 50 nm a cerca de 150 nm, de cerca de 60 nm a cerca de 130 nm, de cerca de 70 nm a cerca de 110 nm, de cerca de 70 nm a cerca de 100 nm, de cerca de 80 nm a cerca de 100 nm, de cerca de 90 nm a cerca de 100 nm, de cerca de 70 a cerca de 90 nm, de cerca de 80 nm a cerca de 90 nm, de cerca de 70 nm a cerca de 80 nm, ou cerca de 30 nm, 35 nm, 40 nm, 45 nm, 50 nm, 55 nm, 60 nm, 65 nm, 70 nm, 75 nm, 80 nm, 85 nm, 90 nm, 95 nm, 100 nm, 105 nm, 110 nm, 115 nm, 120 nm, 125 nm, 130 nm, 135 nm, 140 nm, 145 nm ou 150 nm. Em algumas modalidades, as nanopartículas de lipídeos são substancialmente não tóxicas. Em certas modalidades, os ácidos nucleicos, quando presentes nas nanopartículas lipídicas, são resistentes em solução aquosa à degradação com uma nuclease.
Nanopartículas lipídicas compreendendo ácidos nucleicos e seu método de preparação são divulgados em, por exemplo, Pub. de Patente US Nos. 2004/0142025, 2007/0042031 e Pub. PCT Nos. WO 2013/016058 e WO 2013/086373, as divulgações totais dos quais são aqui incorporadas por referência em suas totalidades para todos os fins.
[049] Tal como aqui utilizado, "lipídeo encapsulado" se refere a uma nanopartícula de lipídeo que fornece um agente ativo ou agente terapêutico, como um ácido nucleico (por exemplo, mRNA), com encapsulação total, encapsulação parcial ou ambos. Em uma modalidade, o ácido nucleico (por exemplo, mRNA) é totalmente encapsulado na nanopartícula de lipídeo.
[050] Conforme usado aqui, o termo "solução aquosa" se refere a uma composição que compreende água.
[051] "Estável no soro" em relação às nanopartículas lipídicas de ácido nucleico significa que o nucleotídeo não é significativamente degradado após a exposição a um ensaio de soro ou nuclease que degradaria significativamente o DNA ou RNA livre. Os ensaios adequados incluem, por exemplo, um ensaio de soro padrão, um ensaio de DNAse ou um ensaio de RNAse.
[052] "Liberação sistêmica", como aqui utilizado, se refere à liberação de um produto terapêutico que pode resultar em uma ampla exposição de um agente ativo dentro de um organismo. Algumas técnicas de administração podem levar à administração sistêmica de certos agentes, mas não de outros. A distribuição sistêmica significa que uma quantidade útil, de preferência terapêutica, de um agente é exposta à maioria das partes do corpo. A distribuição sistêmica de nanopartículas lipídicas pode ser por qualquer meio conhecido na técnica incluindo, por exemplo, administração intravenosa, intra-arterial, subcutânea e intraperitoneal. Em algumas modalidades, a liberação sistêmica de nanopartículas lipídicas é por liberação intravenosa.
[053] "Liberação local", tal como aqui utilizado, se refere à liberação de um agente ativo diretamente a um local alvo dentro de um organismo. Por exemplo, um agente pode ser distribuído localmente por injeção direta em um local de doença, como um tumor, outro local alvo, como um local de inflamação, ou um órgão alvo, como o fígado, coração, pâncreas, rim e semelhantes. A distribuição local também pode incluir aplicações tópicas ou técnicas de injeção localizada, como injeção intramuscular, subcutânea ou intradérmica. A distribuição local não impede um efeito farmacológico sistêmico.
[054] "Alquil" se refere a um radical de cadeia de hidrocarboneto linear ou ramificado que consiste apenas em átomos de carbono e hidrogênio, que é saturado ou insaturado (ou seja, contém uma ou mais ligações duplas (alquenil) e/ou triplas (alquinil)), tendo, por exemplo, de um a vinte e quatro átomos de carbono(C1-C24 alquil), quatro a vinte átomos de carbono (C4-C20 alquil), seis a dezesseis átomos de carbono (C6-C16 alquil), seis a nove átomos de carbono (C6- C9 alquil), um a quinze átomos de carbono (C1-C15 alquil), um a doze átomos de carbono (C1-C12 alquil), um a oito átomos de carbono (C1-C8 alquil) ou um a seis átomos de carbono (C1-C6 alquil) e que está ligado ao resto da molécula por uma ligação simples, por exemplo, metil, etil, n-propil, 1-metiletil (iso propil), n-butil, n- pentil, 1,1-dimetiletil (t-butil), 3-metilhexil, 2-metilhexil, etenil, prop-1-enil, but-1-enil, pent-1-enil, penta-1,4-dienil, ettinil, propinil, butinil, pentinil, hexinil, e semelhantes.
A menos que indicado de outra forma especificamente no relatório descritivo, um grupo alquil é opcionalmente substituído.
[055] "Alquileno" ou "cadeia de alquileno" se refere a uma cadeia de hidrocarboneto divalente linear ou ramificada ligando o resto da molécula a um grupo radical, consistindo unicamente de carbono e hidrogênio, que é saturado ou insaturado (ou seja, contém um ou mais duplos (alquenileno) e ou ligações triplas/(alquinileno)), e tendo, por exemplo, a partir de um a vinte e quatro átomos de carbono (C1-C24 alquileno), um a quinze átomos de carbono (C1-C15 alquileno), uma a doze átomos de carbono (C1-C12 alquileno), um a oito átomos de carbono (C1-C8 alquileno), um a seis átomos de carbono (C1-C6 alquileno), dois a quatro átomos de carbono (C2-C4 alquileno), um a dois átomos de carbono (C1-C2 alquileno), por exemplo, metileno, etileno, propileno, n-butileno, etenileno, propenileno, n-butenileno, propinileno, n-butinileno, e semelhantes. A cadeia de alquileno é ligada ao resto da molécula por meio de uma ligação simples ou dupla e ao grupo radical por meio de uma ligação simples ou dupla. Os pontos de ligação da cadeia de alquileno ao resto da molécula e ao grupo radical podem ser através de um carbono ou quaisquer dois carbonos dentro da cadeia. A menos que indicado de outra forma especificamente no relatório descritivo, uma cadeia de alquileno pode ser opcionalmente substituída.
[056] "Cicloalquil" ou "anel carbocíclico" se refere a um não estável radical de hidrocarboneto monocíclico ou policíclico aromático consistindo apenas em átomos de carbono e hidrogênio, que pode incluir sistemas de anéis fundidos ou em ponte, tendo de três a quinze átomos de carbono, de preferência tendo de três a dez átomos de carbono, e que é saturado ou insaturado e ligado ao resto da molécula por uma única ligação. Os radicais monocíclicos incluem, por exemplo, ciclopropil, ciclobutil, ciclopentil, ciclohexil, cicloheptil e ciclooctil. Os radicais policíclicos incluem, por exemplo, adamantil, norbornil, decalinil, 7,7 dimetil biciclo [2.2.1] heptanil e semelhantes. A menos que indicado de outra forma especificamente no relatório descritivo, um grupo cicloalquil pode ser opcionalmente substituído.
[057] "Cicloalquileno" é um grupo cicloalquil divalente. A menos que indicado de outra forma especificamente no relatório descritivo, um grupo cicloalquileno pode ser opcionalmente substituído.
[058] "Heterociclil" ou "anel heterocíclico" se refere a um radical de anel não aromático estável de 3 a 18 membros (por exemplo, 5, 6 ou 7 membros) tendo um a doze átomos de carbono no anel (por exemplo, dois a doze) e de um a seis heteroátomos no anel selecionados do grupo que consiste em nitrogênio, oxigênio e enxofre. Exemplos de tais radicais heterociclil incluem, mas não estão limitados a azetidinil, pirrolidinil, piperidinil, imidazolidinil, tetra-hidropirimidinil e semelhantes. A menos que indicado de outra forma especificamente no relatório descritivo, um grupo heterociclil pode ser opcionalmente substituído.
[059] "Heteroaril" se refere a um radical de sistema em anel de 5 a 14 membros compreendendo átomos de hidrogênio, um a treze átomos de carbono do anel, um a seis heteroátomos do anel selecionados do grupo que consiste em nitrogênio, oxigênio e enxofre, e pelo menos um anel aromático. Os exemplos incluem, mas não estão limitados a pirrolil, imidazolil, triazolil, tiazolil, piridinil, pirimidinil, pirazinil, piridazinil e semelhantes. A menos que indicado de outra forma especificamente no relatório descritivo, um grupo heteroaril pode ser opcionalmente substituído.
[060] O termo "substituído" aqui utilizado significa qualquer um dos grupos acima (por exemplo, alquil, alquileno, cicloalquil ou cicloalquileno) em que pelo menos um átomo de hidrogênio é substituído por uma ligação a um átomo de não hidrogênio tal como, mas não limitado a: um átomo de halogênio tal como F, Cl, Br ou I; grupos oxo (=O); grupos hidroxil (-OH); grupos C1-C12 alquil; grupos cicloalquil; -(C=O)OR’; -O(C=O)R’; -C(=O)R’; -OR’; -S(O)xR’; -S-SR’; C(=O)SR’; -SC(=O)R’; -NR’R’; -NR’C(=O)R’; -C(=O)NR’R’; -NR’C(=O)NR’R’; -OC(= O)NR’R’; -NR’C(=O)OR’; -NR’S(O)xNR’R’; -NR’S(O)xR’; e -S(O)xNR’R’, em que: R’ é, em cada ocorrência, independentemente H, C1-C15 alquil, ou cicloalquil, and x é 0, 1 ou 2. Em algumas modalidades, o substituinte é um grupo C1-C12 alquil. Em outras modalidades, o substituinte é um grupo cicloalquil. Em outras modalidades, o substituinte é um grupo halo, como flúor. Em outras modalidades, o substituinte é um grupo oxo. Em outras modalidades, o substituinte é um grupo hidroxil. Em outras modalidades, o substituinte é um grupo alcoxi (-OR’). Em outras modalidades, o substituinte é um grupo carboxil. Em outras modalidades, o substituinte é um grupo amina (-NR’R’).
[061] "Opcional" ou "opcionalmente" (por exemplo, opcionalmente substituído) significa que o evento de circunstâncias descrito subsequentemente pode ou não ocorrer, e que a descrição inclui casos em que tal evento ou circunstância ocorre e casos em que não ocorre. Por exemplo, "alquil opcionalmente substituído" significa que o radical alquil pode ou não ser substituído e que a descrição inclui radicais alquil substituídos e radicais alquil sem substituição.
[062] A divulgação aqui divulgada também pretende abranger todos os compostos farmaceuticamente aceitáveis do composto de estrutura (I) sendo isotopicamente marcados por ter um ou mais átomos substituídos por um átomo com uma massa atômica ou número de massa diferente. Exemplos de isótopos que podem ser incorporados nos compostos divulgados incluem isótopos de hidrogênio, carbono, nitrogênio, oxigênio, fósforo, flúor, cloro e iodo, como 2H, 3H, 11C, 13C, 14C, 13 N, 15N, 15 O, 17 O, 18 O, 31 P, 32 P, 35 S, 18 F, 36 Cl, 123 I e 125 I, respectivamente. Estes compostos radiomarcados podem ser úteis para ajudar a determinar ou medir a eficácia dos compostos, caracterizando, por exemplo, o local ou modo de ação, ou afinidade de ligação ao local de ação farmacologicamente importante. Certos compostos marcados isotopicamente de estrutura (I), (IA) ou (IB), por exemplo, aqueles que incorporam um isótopo radioativo, são úteis em estudos de distribuição de fármaco e/ou substrato em tecido. Os isótopos radioativos trítio, ou seja, 3H, e carbono 14, ou seja, 14C, são particularmente úteis para este propósito em vista de sua facilidade de incorporação e facilidade de detecção.
[063] Substituição por isótopos mais pesados, como deutério, ou seja, 2H, pode proporcionar certas vantagens terapêuticas resultantes de uma maior estabilidade metabólica, por exemplo, meia-vida in vivo aumentada ou requisitos de dosagem reduzidos e, portanto, pode ser preferencial em algumas circunstâncias.
[064] Substituição com isótopos de emissão de pósitrons como 11C, 18F, 15O e 13N, podem ser úteis nos estudos de tomografia de emissão de pósitrons (PET) para avaliar a ocupação do receptor de substrato. Os compostos marcados isotopicamente de estrutura (I) podem geralmente ser preparados por técnicas convencionais conhecidas pelos técnicos especialistas no assunto ou por processos análogos aos descritos nas Preparações e Exemplos, conforme estabelecido abaixo, usando um reagente marcado isotopicamente apropriado no lugar do reagente não marcado previamente empregado.
[065] As modalidades aqui divulgadas também se destinam a abranger os produtos metabólicos in vivo dos compostos divulgados. Esses produtos podem resultar, por exemplo, da oxidação, redução, hidrólise, amidação, esterificação e semelhantes do composto administrado, principalmente devido a processos enzimáticos. Por conseguinte, as modalidades da divulgação incluem compostos produzidos por um processo que compreende a administração de um composto desta divulgação a um mamífero por um período de tempo suficiente para produzir um produto metabólico do mesmo. Tais produtos são tipicamente identificados pela administração de um composto radiomarcado da divulgação em uma dose detectável a um animal, tal como rato, camundongo, porquinho da índia, macaco ou humano, permitindo tempo suficiente para que ocorra o metabolismo e isolando seus produtos de conversão de a urina, sangue ou outras amostras biológicas.
[066] "Composto estável" e "estrutura estável" destinam-se a indicar um composto que é suficientemente robusto para sobreviver ao isolamento até um grau útil de pureza de uma mistura de reação e formulação em um agente terapêutico eficaz.
[067] "Mamífero" inclui humanos e animais domésticos, como animais de laboratório e animais domésticos (por exemplo, gatos, cães, suínos, bovinos, ovelhas, cabras, cavalos, coelhos) e animais não domésticos, como animais selvagens e semelhantes.
[068] "Carreador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável" inclui, sem limitação, qualquer adjuvante, carreador, excipiente, deslizante, agente edulcorante, diluente, conservante, corante, intensificador de sabor, surfactante,
agente umectante, agente dispersante, agente de suspensão, estabilizador, agente isotônico, solvente ou emulsificante que foi aprovado pela Food and Drug Administration dos Estados Unidos como sendo aceitável para uso em humanos ou animais domésticos.
[069] "Sal farmaceuticamente aceitável" inclui sais de adição de ácido e base.
[070] "Sal de adição de ácido farmaceuticamente aceitável" se refere aos sais que retêm a eficácia biológica e as propriedades das bases livres, que não são biologicamente ou de outra forma indesejáveis, e que são formados com ácidos inorgânicos, tais como, mas não estão limitados a ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico e semelhantes, e ácidos orgânicos, tais como, mas não se limitando a ácido acético, ácido 2,2-dicloroacético, ácido adípico, ácido algínico, ácido ascórbico, ácido aspártico, ácido benzenossulfônico, ácido benzoico, ácido 4-acetamidobenzoico, ácido canfórico, ácido canfor-10-sulfônico, ácido cáprico, ácido caprílico, ácido caprílico, ácido carbônico, ácido cinâmico, ácido cítrico, ácido ciclâmico, ácido dodecilsulfúrico, ácido etano-1,2-dissulfônico, ácido etanossulfônico, ácido 2-hidroxietanossulfônico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido galactárico, ácido gentísico, ácido glucoheptônico, ácido glucônico, ácido glucurônico, ácido glutâmico, ácido glutâmico, ácido 2-oxo-glutárico, ácido glicerofosfórico, ácido glicólico, ácido hipúrico, ácido isobutírico, ácido láctico, ácido lactobiônico, ácido láurico, ácido maleico, ácido málico, ácido malônico, ácido mandélico, ácido metanossulfônico, ácido mucico, ácido naftaleno-1,5-dissulfônico, ácido naftaleno-2 sulfônico, ácido 1-hidroxi-2-naftoico, ácido nicotínico, ácido oleico, ácido orótico, ácido oxálico, ácido palmítico, ácido pamoico, ácido propiônico, ácido piroglutâmico, ácido pirúvico, ácido salicílico, ácido 4-aminossalicílico, ácido sebácico, ácido esteárico, ácido succínico, ácido tartárico, ácido tiociânico, ácido p-
toluenossulfônico, ácido trifluoroacético, ácido undecilênico e semelhantes.
[071] "Sal de adição de base farmaceuticamente aceitável" se refere aos sais que retêm a eficácia biológica e as propriedades dos ácidos livres, que não são biologicamente ou de outra forma indesejáveis. Estes sais são preparados a partir da adição de uma base inorgânica ou orgânica ao ácido livre. Sais derivados de bases inorgânicas incluem, mas não estão limitados a sais de sódio, potássio, lítio, amônio, cálcio, magnésio, ferro, zinco, cobre, manganês, alumínio e semelhantes.
Os sais inorgânicos preferenciais são os sais de amônio, sódio, potássio, cálcio e magnésio. Sais derivados de bases orgânicas incluem, mas não estão limitados a, sais de aminas primárias, secundárias e terciárias, aminas substituídas incluindo aminas substituídas de ocorrência natural, aminas cíclicas e resinas de troca iônica básicas, tais como amônia, isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina, dietanolamina, etanolamina, deanol, 2-dimetilaminoetanol, 2- dietilaminoetanol, diciclohexilamina, lisina, arginina, histidina, cafeína, procaína, hidrabamina, colina, betaína, benetamina, benzatina, etilenodiamina, glucosamina, metilglucamina, teobromina, trietanolamina, trometamina, purinas, piperazina, piperidina, N-etilpiperidina, resinas de poliamina e semelhantes. Bases orgânicas particularmente preferidas são isopropilamina, dietilamina, etanolamina, trimetilamina, diciclohexilamina, colina e cafeína.
[072] Frequentemente, as cristalizações produzem um solvato de um composto da divulgação (isto é, um composto de estrutura (I)). Tal como aqui utilizado, o termo "solvato" se refere a um agregado que compreende uma ou mais moléculas de um composto da divulgação com uma ou mais moléculas de solvente.
O solvente pode ser água, caso em que o solvato pode ser um hidrato. Alternativamente, o solvente pode ser um solvente orgânico. Assim, os compostos da presente divulgação podem existir como um hidrato, incluindo um mono-hidrato,
di-hidrato, hemi-hidrato, sesqui-hidrato, tri-hidrato, tetra-hidrato e semelhantes, bem como as formas solvatadas correspondentes. Os solvatos do composto da divulgação podem ser solvatos verdadeiros, enquanto em outros casos o composto da divulgação pode meramente reter água adventícia ou ser uma mistura de água mais algum solvente adventício.
[073] Uma "composição farmacêutica" se refere a uma formulação de um composto da divulgação e um meio geralmente aceito na técnica para a liberação do composto biologicamente ativo a mamíferos, por exemplo, humanos. Esse meio inclui todos os transportadores, diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
[074] "Quantidade eficaz" ou "quantidade terapeuticamente eficaz" se refere à quantidade de um composto da divulgação que, quando administrado a um mamífero, de preferência um humano, é suficiente para efetuar o tratamento no mamífero, de preferência um humano. A quantidade de uma nanopartícula de lipídeo da divulgação que constitui uma "quantidade terapeuticamente eficaz " irá variar dependendo do composto, a condição e sua gravidade, o modo de administração e a idade do mamífero a ser tratado, mas pode ser determinado rotineiramente por um técnico especialista no assunto tendo relação com seu próprio conhecimento e a esta divulgação.
[075] "Tratar" ou "tratamento", tal como aqui utilizado, cobre o tratamento da doença ou condição de interesse em um mamífero, de preferência um humano, com a doença ou condição de interesse e inclui: (i) prevenir a doença ou condição de ocorrer em um mamífero, em particular, quando tal mamífero é predisposto à condição mas ainda não foi diagnosticado como tendo a mesma; (ii) inibir a doença ou condição, ou seja, atrasar seu desenvolvimento;
(iii) aliviar a doença ou condição, ou seja, causar a regressão da doença ou condição; ou (iv) aliviar os sintomas resultantes da doença ou condição, ou seja, aliviar a dor sem abordar a doença ou condição subjacente. Tal como aqui utilizado, os termos "doença" e "condição" podem ser usados indistintamente ou podem ser diferentes em que a doença ou condição específica pode não ter um agente causador conhecido (de modo que a etiologia ainda não foi determinada) e é, portanto, ainda não reconhecida como uma doença, mas apenas como uma condição ou síndrome indesejável, em que um conjunto mais ou menos específico de sintomas foi identificado pelos médicos.
[076] Os compostos da divulgação ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis podem conter um ou mais estereocentros e podem, assim, dar origem a enantiômeros, diastereoisômeros e outras formas estereoisoméricas que podem ser definidas, em termos de estereoquímica absoluta, como (R)- ou (S)- ou, como (D)- ou (L)- para aminoácidos. A presente divulgação se destina a incluir todos esses isômeros possíveis, bem como suas formas racêmicas e opticamente puras.
Isômeros (+) e (-), (R)- e (S)-, ou (D)- e (L)- opticamente ativos podem ser preparados usando sintons quirais ou reagentes quirais, ou resolvidos usando técnicas convencionais, por exemplo, cromatografia e cristalização fracionada. As técnicas convencionais para a preparação/isolamento de enantiômeros individuais incluem síntese quiral a partir de um precursor opticamente puro adequado ou resolução do racemato (ou o racemato de um sal ou derivado) usando, por exemplo, cromatografia líquida de alta pressão quiral (HPLC). Quando os compostos descritos neste documento contêm ligações duplas olefínicas ou outros centros de assimetria geométrica, e a menos que especificado de outra forma, pretende-se que os compostos incluam ambos os isômeros geométricos E e Z. Da mesma forma,
todas as formas tautoméricas também devem ser incluídas.
[077] Um "estereoisômero" se refere a um composto feito dos mesmos átomos ligados pelas mesmas ligações, mas com diferentes estruturas tridimensionais, que não são intercambiáveis. A presente divulgação contempla vários estereoisômeros e suas misturas e inclui "enantiômeros", que se refere a dois estereoisômeros cujas moléculas são imagens especulares não sobreponíveis uma da outra.
[078] Um "tautômero" se refere a uma mudança de próton de um átomo de uma molécula para outro átomo da mesma molécula. A presente divulgação inclui tautômeros de qualquer um dos referidos compostos.
Compostos
[079] Em um aspecto, a divulgação fornece novos compostos lipídicos que são capazes de se combinar com outros componentes lipídicos, tais como lipídeos neutros, lipídeos carregados, esteroides e/ou lipídeos conjugados com polímero para formar nanopartículas lipídicas com oligonucleotídeos. Sem desejar estar limitado pela teoria, acredita-se que estas nanopartículas de lipídeos protegem os oligonucleotídeos da degradação no soro e proporcionam uma liberação eficaz de oligonucleotídeos às células in vitro e in vivo .
[080] Em uma modalidade, os compostos têm a seguinte estrutura (I): (I) ou um sal, tautômero ou esteroisômero farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que:
R1 C1-C24 alquil é opcionalmente substituído ou C2-C24 alquenil opcionalmente substituído; R2 e R3 são, cada um, independentemente C1-C36 alquil opcionalmente substituído; R4 e R5 são, cada um, independentemente C1-C6 alquil opcionalmente substituído, ou R4 e R5 juntos, unidos com o N ao qual estão ligados, formam um heterociclil ou heteroaril; L1, L2, e L3 são, cada um, independentemente C1-C18 alquileno opcionalmente substituído; G1 é uma ligação direta, -(CH2)nO(C=O)-, -(CH2)n(C=O)O-, ou –(C=O)-; G2 e G3 são, cada um, independentemente -(C=O)O- ou -O(C=O)-; e n é um número inteiro maior que 0.
[081] Em algumas modalidades, o composto tem a seguinte estrutura (IA): .
(IA)
[082] Em algumas modalidades, o composto tem a seguinte estrutura (IB): .
(IB)
[083] Em algumas modalidades, R1 é C6-C18 alquil opcionalmente substituído ou C14-C18 alquenil. Em certas modalidades, R1 é C8 alquil, C9 alquil, C10 alquil, C12 alquil, C14 alquil, ou C16 alquil. Em algumas modalidades específicas, R1 é C16 alquenil. Em certas modalidades específicas, R1 é não ramificado. Em algumas modalidades, R1 é ramificado. Em certas modalidades, R1 é não substituído.
[084] Em algumas modalidades, G1 é uma ligação direta, -(CH2)nO(C=O)-, ou -(CH2)n(C=O)O-. Em certas modalidades, G1 é uma ligação direta. Em algumas modalidades específicas, G1 é -(CH2)n(C=O)O- e n é maior do que 1. Em algumas modalidades, n é 1-20. Em algumas modalidades, n é 1-10. Em algumas modalidades, n é 5-11. Em algumas modalidades, n é 6-10. Em certas modalidades mais específicas, n é 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em algumas modalidades, n é 5. Em algumas modalidades, n é 6. Em algumas modalidades, n é 7. Em certas modalidades, n é 8. Em algumas modalidades, n é 9. Em algumas modalidades, n é 10.
[085] Em algumas modalidades, L1 é C1-C6 alquileno. Em certas modalidades, L1 é C2 alquileno, C3 alquileno, ou C4 alquileno. Em algumas modalidades específicas, L1 é não ramificado. Em certas modalidades específicas, L1 é não substituído.
[086] Em algumas modalidades, R2 é C8-C24 alquil. Em algumas modalidades, R3 é C8-C24 alquil. Em algumas modalidades específicas, R2 e R3 são ambos C8-C24 alquil. Em algumas modalidades, R2 e R3 são, cada um, independentemente C11 alquil, C12 alquil, C13 alquil, C14 alquil, C15 alquil, C16 alquil, C18 alquil, ou C20 alquil. Em certas modalidades, R2 é ramificado. Em modalidades específicas, R3 é ramificado. Em algumas modalidades específicas, R2 e R3 cada um independentemente tem uma das seguintes estruturas:
ou em que: R6 and R7 são, cada um, independentemente C2-C12 alquil.
[087] Em algumas modalidades, R2 e R3 cada um independentemente tem uma das seguintes estruturas: ; ; ; ; ou .
[088] Em algumas modalidades, L2 e L3 são, cada um, independentemente C4-C10 alquileno. Em certas modalidades, L2 e L3 são ambos C5 alquileno. Em algumas modalidades específicas, L2 e L3 são ambos C6 alquileno. Em certas modalidades, L2 e L3 são ambos C8 alquileno. Em algumas modalidades específicas, L2 e L3 são ambos C9 alquileno. Em algumas modalidades, L2 é não ramificado. Em algumas modalidades, L3 é não ramificado. Em modalidades específicas, L2 é não substituído. Em algumas modalidades, L2 é não substituído.
[089] Em algumas modalidades, R4 e R5 são, cada um, independentemente C1-C6 alquil. Em modalidades específicas, R4 e R5 são ambos metil. Em certas modalidades, R4 e R5 são ambos etil. Em certas modalidades, R4 é metil e R5 é n- butil. Em algumas modalidades, R4 e R5 são ambos n-butil. Em modalidades diferentes, R4 é metil e R5 é n-hexil.
[090] Em algumas modalidades, R4 e R5 juntos, unidos com o N ao qual estão ligados, formam um heterociclil. Em certas modalidades, o heterociclil é um heterociclil de 5 membros. Em algumas modalidades, o heterociclil tem a seguinte estrutura: .
[091] Em várias modalidades diferentes, o composto tem uma das estruturas estabelecidas na Tabela 1 abaixo.
Tabela 1 Compostos incluídos em modalidades de compostos de estrutura (I) No. Estrutura pKa I-1 - I-2 - I-3 - I-4 -
No. Estrutura pKa I-5 -
N N O
O O I-6 -
O
O I-7 6,74 I-8 6,68 I-9 6,83 I-10 -
No.
Estrutura pKa
I-11 -
I-12 -
I-13 -
I-14 -
I-15 -
I-16 6,77
No.
Estrutura pKa
I-17 -
I-18 6,47
I-19 -
I-20 6,84
I-21 -
I-22 -
No.
Estrutura pKa
I-23 -
I-24 -
I-25 6,20
I-26 -
I-27 -
I-28 -
No. Estrutura pKa I-29 6,81 I-30 6,47 I-31 5,05
O O
N I-32 N O 6,41
O
O I-33 6,19 I-34 -
No. Estrutura pKa I-35 - I-36 - I-37 - I-38 - I-39 - I-40 -
[092] Entende-se que qualquer modalidade dos compostos de estrutura (I), conforme estabelecido acima, e qualquer substituinte específico e/ou variável na estrutura do composto (I), conforme estabelecido acima, podem ser combinados independentemente com outras modalidades e/ou substituintes e/ou variáveis de compostos de estrutura (I) para formar modalidades das divulgações não especificamente estabelecidas acima. Além disso, no caso de uma lista de substituintes e/ou variáveis ser listada para qualquer grupo R particular, grupo G, grupo L ou variável n, em uma modalidade particular e/ou reivindicação, entende- se que cada substituinte e/ou a variável pode ser excluída da modalidade e/ou reivindicação particular e que a lista remanescente de substituintes e/ou variáveis será considerada como estando dentro do escopo da divulgação.
[093] Entende-se que na presente descrição, combinações de substituintes e/ou variáveis das fórmulas representadas são permitidas apenas se tais contribuições resultarem em compostos estáveis.
[094] Em algumas modalidades, nanopartículas de lipídeos compreendendo um composto de estrutura (I) são fornecidas. As nanopartículas de lipídeos incluem opcionalmente excipientes selecionados de um lipídeo neutro, um esteroide e um lipídeo conjugado com polímero.
[095] Em algumas modalidades, são fornecidas composições compreendendo qualquer um ou mais dos compostos de estrutura (I) e um agente terapêutico. Por exemplo, em algumas modalidades, as composições compreendem qualquer um dos compostos de estrutura (I) e um agente terapêutico e um ou mais excipientes selecionados de lipídeos neutros, esteroides e lipídeos conjugados com polímero. Outros excipientes e/ou transportadores farmaceuticamente aceitáveis também estão incluídos em várias modalidades das composições.
[096] Em algumas modalidades, o lipídeo neutro é selecionado a partir de DSPC, DPPC, DMPC, DOPC, POPC, DOPE e SM. Em algumas modalidades, o lipídeo neutro é DSPC. Em várias modalidades, a razão molar do composto para o lipídeo neutro varia de cerca de 2: 1 a cerca de 8: 1.
[097] Em várias modalidades, as composições compreendem ainda um esteroide ou análogo de esteroide. Em certas modalidades, o esteroide ou análogo de esteroide é o colesterol. Em algumas dessas modalidades, a razão molar do composto para o colesterol varia de cerca de 5: 1 a 1: 1.
[098] Em várias modalidades, o lipídeo conjugado com polímero é um lipídeo peguilado. Por exemplo, algumas modalidades incluem um diacilglicerol peguilhado (PEG-DAG) como 1-(monometoxi-polietilenoglicol)-2,3-dimiristoilglicerol (PEG-DMG), um fosfatidiletanoloamina peguilado (PEG-PE), um PEG succinato diacilglicerol (PEG- S-DAG) como 4-O-(2’,3’-di(tetradecanoiloxi)propil-1-O-(- metoxi(polietoxi)etil)butanodioato (PEG-S-DMG), uma ceramida peguilada (PEG- cer), ou um dialcoxipropilcarbamato PEG como -metoxi(polietoxi)etil-N-(2,3- di(tetradecanoxi)propil)carbamato ou 2,3-di(tetradecanoxi)propil-N-(- metoxi(polietoxi)etil)carbamato. Em várias modalidades, a razão molar do composto para o lipídeo peguilado varia de cerca de 100: 1 a cerca de 20: 1.
[099] Em algumas modalidades, a composição compreende um lipídeo peguilado tendo a seguinte estrutura (II): (II) ou um sal, tautômero ou esteroisômero farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que: R8 and R9 são, cada um, independentemente uma cadeia alquil linear ou ramificada, saturada ou insaturada contendo de 10 a 30 átomos de carbono, em que a cadeia alquil é opcionalmente interrompida por uma ou mais ligações éster; e w tem um valor médio variando de 30 a 60.
[0100] Em algumas modalidades, R8 e R9 são, cada um, independentemente cadeias alquil lineares, saturadas contendo de 12 to 16 átomos de carbono. Em outras modalidades, o w médio varia de cerca de 42 a 55, por exemplo cerca de 49.
[0101] Em algumas modalidades da composição anterior, o agente terapêutico compreende um ácido nucleico. Por exemplo, em algumas modalidades, o ácido nucleico é selecionado a partir de antissenso e RNA mensageiro. Em algumas das modalidades anteriores, a composição compreende uma nanopartícula de lipídeo.
[0102] Algumas modalidades relacionadas fornecem uma nanopartícula de lipídeo compreendendo o composto de qualquer uma das modalidades anteriores (por exemplo, um composto de estrutura (I)). Em certas modalidades, a nanopartícula de lipídeo compreende ainda um agente terapêutico (por exemplo, um ácido nucleico, como antissenso e RNA mensageiro).
[0103] Em algumas modalidades, a nanopartícula de lipídeo compreende ainda um ou mais excipientes selecionados a partir de lipídeos neutros, esteroides e lipídeos conjugados com polímero. Em algumas modalidades, os lipídeos neutros são selecionados a partir de DSPC, DPPC, DMPC, DOPC, POPC, DOPE e SM. Em modalidades mais específicas, o lipídeo neutro é DSPC.
[0104] Em algumas modalidades mais específicas, a razão molar do composto para o lipídeo neutro varia de cerca de 2: 1 a cerca de 8: 1. Em algumas modalidades, o esteroide é colesterol. Em algumas modalidades, a razão molar do composto para o colesterol varia de 5: 1 a 1: 1.
[0105] Em certas modalidades, o lipídeo conjugado com polímero é um lipídeo peguilado. Em certas modalidades mais específicas, a razão molar do composto para o lipídeo peguilado varia de cerca de 100: 1 a cerca de 20: 1.
[0106] Em algumas modalidades, o lipídeo peguilado é PEG-DAG, PEG- PE, PEG-S-DAG, PEG-cer ou um dialquioxipropilcarbamato PEG. Em outras modalidades, o lipídeo peguilado tem a seguinte estrutura (II): (II) ou um sal, tautômero ou esteroisômero farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que: R8 and R9 são, cada um, independentemente uma cadeia alquil linear ou ramificada, saturada ou insaturada contendo de 10 to 30 átomos de carbono, em que a cadeia alquil é opcionalmente interrompida por uma ou mais ligações éster; e w tem um valor médio variando de 30 a 60.
[0107] Em algumas modalidades específicas da estrutura (II), R8 e R9 são, cada um, independentemente cadeias alquil lineares, saturadas contendo de 12 to 16 átomos de carbono. Em modalidades mais específicas, o w médio é de cerca de
49.
[0108] Em outras modalidades diferentes, a divulgação é direcionada a um método para administrar um agente terapêutico a um paciente em necessidade do mesmo, o método compreendendo a preparação ou fornecimento de qualquer uma das composições anteriores e a administração da composição ao paciente.
[0109] Para fins de administração, modalidades dos compostos da presente divulgação (tipicamente na forma de nanopartículas lipídicas em combinação com um agente terapêutico) podem ser administradas como um produto químico bruto ou podem ser formuladas como composições farmacêuticas. As composições farmacêuticas das modalidades da presente divulgação compreendem um composto de estrutura (I) e um ou mais carreadores, diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Em algumas modalidades, o composto de estrutura (I) está presente na composição em uma quantidade que é eficaz para formar uma nanopartícula lipídica e administrar o agente terapêutico, por exemplo, para tratar uma doença ou condição de interesse particular. As concentrações e dosagens apropriadas podem ser facilmente determinadas por um especialista na técnica.
[0110] A administração das composições de modalidades da divulgação pode ser realizada por meio de qualquer um dos modos aceitos de administração de agentes para servir a utilidades semelhantes. As composições farmacêuticas das modalidades da divulgação podem ser formuladas em preparações sólidas, formas semissólidas, líquidas ou gasosas, tais como comprimidos, cápsulas, pós, grânulos, pomadas, soluções, suspensões, supositórios, injeções, inalantes, géis, microesferas e aerossóis. As vias típicas de administração de tais composições farmacêuticas incluem, sem limitação, oral, tópica, transdérmica, inalação, parenteral, sublingual, bucal, retal, vaginal e intranasal. O termo parenteral, conforme aqui utilizado, inclui injeções subcutâneas, intravenosas, intramusculares, intradérmicas, injeção intraesternal ou técnicas de infusão. As composições farmacêuticas das modalidades da divulgação são formuladas de modo a permitir que os ingredientes ativos nelas contidos estejam biodisponíveis após a administração da composição a um paciente. As composições que serão administradas a um sujeito ou paciente em algumas modalidades assumem a forma de uma ou mais unidades de dosagem, onde, por exemplo, um comprimido pode ser uma unidade de dosagem única e um recipiente de um composto de uma modalidade da divulgação em forma de aerossol pode conter uma pluralidade de unidades de dosagem. Os métodos reais de preparação de tais formas de dosagem são conhecidos, ou serão evidentes, para os especialistas nesta técnica; por exemplo, consulte Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a edição (Philadelphia College of Pharmacy and Science, 2000). Em algumas modalidades, a composição a ser administrada irá, em qualquer caso, conter uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da divulgação, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, para o tratamento de uma doença ou condição de interesse de acordo com os ensinamentos desta divulgação.
[0111] Uma composição farmacêutica das modalidades da divulgação pode estar na forma de um sólido ou líquido. Em um aspecto, os carreadores são particulados, de modo que as composições estão, por exemplo, na forma de comprimido ou pó. Os carreadores podem ser líquidos, sendo as composições, por exemplo, xarope oral, líquido injetável ou um aerossol, que é útil, por exemplo, na administração inalatória.
[0112] Quando destinada à administração oral, a composição farmacêutica de certas modalidades é preferencialmente na forma sólida ou líquida, onde as formas de semissólido, semi-líquido, suspensão e gel estão incluídas nas formas aqui consideradas como sólidas ou líquidas.
[0113] Como uma composição sólida para administração oral, a composição farmacêutica de algumas modalidades pode ser formulada em um pó, grânulo, comprimido, pílula, cápsula, goma de mascar, bolacha ou forma semelhante. Essa composição sólida conterá tipicamente um ou mais diluentes inertes ou carreadores comestíveis. Além disso, um ou mais dos seguintes podem estar presentes: ligantes tais como carboximetilcelulose, etil celulose, celulose microcristalina, goma tragacanto ou gelatina; excipientes, tais como amido, lactose ou dextrinas, agentes desintegrantes, tais como ácido algínico, alginato de sódio, Primogel, amido de milho e semelhantes; lubrificantes, tais como estearato de magnésio ou Sterotex; deslizantes, como dióxido de silício coloidal; agentes edulcorantes, tais como sacarose ou sacarina; um agente aromatizante como hortelã-pimenta, salicilato de metila ou aroma de laranja; e um agente de coloração.
[0114] Quando a composição farmacêutica de algumas modalidades está na forma de uma cápsula, por exemplo, uma cápsula de gelatina, ela pode conter, além de materiais do tipo acima, um veículo líquido, como polietileno glicol ou óleo.
[0115] A composição farmacêutica de algumas modalidades pode estar na forma de um líquido, por exemplo, um elixir, xarope, solução, emulsão ou suspensão. O líquido pode ser para administração oral ou para administração por injeção, como dois exemplos. Quando destinada à administração oral, a composição preferida contém, além de um composto de estrutura (I), um ou mais de um agente adoçante, conservantes, corante/coloração e intensificador de sabor.
Em uma composição destinada a ser administrada por injeção, um ou mais dentre um surfactante, conservante, agente umectante, agente dispersante, agente de suspensão, tampão, estabilizador e agente isotônico podem ser incluídos.
[0116] As composições farmacêuticas líquidas de modalidades da divulgação, sejam elas soluções, suspensões ou outra forma semelhante, podem incluir um ou mais dos seguintes adjuvantes: diluentes estéreis, como água para injeção, solução salina, de preferência soro fisiológico, solução de Ringer, cloreto de sódio isotônico, óleos fixos como mono ou diglicerídeos sintéticos que podem servir como solvente ou meio de suspensão, polietilenoglicóis, glicerina, propilenoglicol ou outros solventes; agentes antibacterianos, tais como álcool benzílico ou metil parabeno; antioxidantes como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes, tais como ácido etilenodiaminotetracético; tampões, tais como acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para o ajuste da tonicidade, tais como cloreto de sódio ou dextrose; agentes para atuar como crioprotetores, como sacarose ou trealose. A preparação parenteral pode ser acondicionada em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de dose múltipla feitos de vidro ou plástico. A solução salina fisiológica é um adjuvante preferencial. Uma composição farmacêutica injetável é preferencialmente estéril.
[0117] Uma composição farmacêutica líquida de modalidades da divulgação destinadas a administração parenteral ou oral deve conter uma quantidade de um composto da divulgação de modo que uma dosagem adequada seja obtida.
[0118] A composição farmacêutica das modalidades da divulgação pode ser destinada à administração tópica, caso em que o carreador pode compreender adequadamente uma solução, emulsão, pomada ou base de gel. A base, por exemplo, pode compreender um ou mais dos seguintes: vaselina, lanolina, polietileno glicóis, cera de abelha, óleo mineral, diluentes como água e álcool, e emulsificantes e estabilizantes. Os agentes espessantes podem estar presentes em uma composição farmacêutica para administração tópica. Se destinada à administração transdérmica, a composição pode incluir um adesivo transdérmico ou dispositivo de iontoforese.
[0119] A composição farmacêutica das modalidades da divulgação pode ser destinada à administração retal, na forma, por exemplo, de um supositório, que irá derreter no reto e liberar a droga. Uma composição para administração retal pode conter uma base oleaginosa como um excipiente não irritante adequado.
Essas bases incluem, sem limitação, lanolina, manteiga de cacau e polietileno glicol.
[0120] A composição farmacêutica das modalidades da divulgação pode incluir vários materiais, que modificam a forma física de uma unidade de dosagem sólida ou líquida. Por exemplo, a composição pode incluir materiais que formam um invólucro de revestimento em torno dos ingredientes ativos. Os materiais que formam o invólucro de revestimento são tipicamente inertes e podem ser selecionados a partir de, por exemplo, açúcar, goma-laca e outros agentes de revestimento entérico. Alternativamente, os ingredientes ativos podem ser encerrados em uma cápsula de gelatina.
[0121] A composição farmacêutica das modalidades da divulgação na forma sólida ou líquida pode incluir um agente que se liga ao composto da divulgação e, assim, auxilia na liberação do composto. Os agentes adequados que podem atuar nesta capacidade incluem um anticorpo monoclonal ou policlonal, ou uma proteína.
[0122] A composição farmacêutica das modalidades da divulgação pode consistir em unidades de dosagem que podem ser administradas como um aerossol. O termo aerossol é usado para denotar uma variedade de sistemas, desde aqueles de natureza coloidal até sistemas que consistem em embalagens pressurizadas. A liberação pode ser por um gás liquefeito ou comprimido ou por um sistema de bomba adequado que dispensa os ingredientes ativos. Aerossóis de compostos de modalidades da divulgação podem ser administrados em fase única, sistemas bifásicos ou trifásicos para fornecer os ingredientes ativos. A liberação do aerossol inclui o recipiente, ativadores, válvulas, sub-recipientes necessários e semelhantes, que juntos podem formar um kit. Um especialista na técnica, sem experimentação indevida, pode determinar os aerossóis preferenciais.
[0123] As composições farmacêuticas das modalidades da divulgação podem ser preparadas por metodologia bem conhecida na técnica farmacêutica.
Por exemplo, uma composição farmacêutica destinada a ser administrada por injeção pode ser preparada combinando as nanopartículas lipídicas da divulgação com água destilada estéril ou outro carreador de modo a formar uma solução. Um surfactante pode ser adicionado para facilitar a formação de uma solução ou suspensão homogênea. Surfactantes são compostos que não interagem covalentemente com o composto da divulgação de modo a facilitar a dissolução ou suspensão homogênea do composto no sistema de distribuição aquoso.
[0124] As composições das modalidades da divulgação, ou sais farmaceuticamente aceitáveis das mesmas, são administradas em uma quantidade terapeuticamente eficaz, que irá variar dependendo de uma variedade de fatores, incluindo a atividade do agente terapêutico específico empregado; a estabilidade metabólica e o tempo de ação do agente terapêutico; a idade, peso corporal, saúde geral, sexo e dieta do paciente; o modo e o tempo de administração; a taxa de excreção; a combinação de drogas; a gravidade do distúrbio ou condição particular; e o sujeito em terapia.
[0125] As composições de modalidades da divulgação também podem ser administradas simultaneamente com, antes ou após a administração de um ou mais outros agentes terapêuticos. Tal terapia de combinação inclui a administração de uma única formulação de dosagem farmacêutica de uma composição de modalidades da divulgação e um ou mais agentes ativos adicionais, bem como a administração da composição de modalidades da divulgação e cada agente ativo em sua própria formulação de dosagem farmacêutica separada. Por exemplo, uma composição de modalidades da divulgação e o outro agente ativo podem ser administrados ao paciente juntos em uma única composição de dosagem oral, como um comprimido ou cápsula, ou cada agente administrado em formulações de dosagem oral separadas. Quando são utilizadas formulações de dosagem separadas, os compostos das modalidades da divulgação e um ou mais agentes ativos adicionais podem ser administrados essencialmente ao mesmo tempo, ou seja, simultaneamente, ou em momentos alternados separadamente, ou seja, sequencialmente; a terapia de combinação é entendida como incluindo todos esses esquemas.
[0126] Os métodos de preparação para os compostos e composições acima são descritos abaixo e/ou conhecidos na técnica.
[0127] Será apreciado por aqueles técnicos especialistas no assunto que no processo aqui descrito os grupos funcionais de compostos intermediários podem precisar ser protegidos por grupos de proteção adequados. Esses grupos funcionais incluem hidroxil, amino, mercapto e ácido carboxílico. Os grupos de proteção adequados para hidroxi incluem trialquilsilil ou diarilalquilsilil (por exemplo, t- butildimetilsilil, t-butildifenilsilil ou trimetilsilil), tetra-hidropiranil, benzil e semelhantes. Os grupos de proteção adequados para amino, amidino e guanidino incluem t-butoxicarbonil, benziloxicarbonil e semelhantes. Os grupos de proteção adequados para mercapto incluem -C(O)-R″ (em que R″ é alquil, aril ou arilalquil), p-metoxibenzil, tritil e semelhantes. Os grupos de proteção adequados para o ácido carboxílico incluem alquil, aril ou ésteres de arilalquil. Os grupos de proteção podem ser adicionados ou removidos de acordo com técnicas padrão, que são conhecidas por um técnico especialista no assunto e conforme descrito neste documento. O uso de grupos de proteção é descrito em detalhes em Green, T.W. and P.G.M.
Wutz, Protective Groups in Organic Synthesis (1999), 3a Ed., Wiley. Como um especialista na técnica apreciaria, o grupo de proteção também pode ser uma resina de polímero, como uma resina Wang, resina Rink ou resina de cloreto de 2- clorotritila.
[0128] Também será apreciado por aqueles técnicos especialistas no assunto, embora tais derivados protegidos de compostos desta divulgação possam não possuir atividade farmacológica como tal, eles podem ser administrados a um mamífero e posteriormente metabolizados no corpo para formar compostos da divulgação que são farmacologicamente ativos. Tais derivados podem, portanto, ser descritos como "pró-fármacos". Todos os pró-fármacos de compostos desta divulgação estão incluídos no escopo da divulgação.
[0129] Além disso, os compostos das modalidades da divulgação que existem na forma de base ou ácido livre podem ser convertidos em seus sais farmaceuticamente aceitáveis por tratamento com a base ou ácido inorgânico ou orgânico apropriado por métodos conhecidos por um técnico especialista no assunto. Sais de compostos de modalidades da divulgação podem ser convertidos em sua forma de base ou ácido livre por técnicas padrão.
[0130] O seguinte Esquema de Reação Geral 1 ilustra métodos exemplares para fazer compostos desta divulgação, ou seja, compostos de estrutura (I): (I) ou um sal, tautômero ou estereoisômero farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que R1, R2, R3, R4, R5, L1, L2, L3, G1, G2, e G3 são como definidos aqui.
Entende-se que um técnico especialista no assunto pode ser capaz de preparar esses compostos por métodos semelhantes ou combinando outros métodos conhecidos por um técnico especialista no assunto. É também entendido que um técnico especialista no assunto seria capaz de fazer, de uma maneira semelhante à descrita abaixo, outros compostos de estrutura (I) não especificamente ilustrados abaixo usando os componentes de partida apropriados e modificando os parâmetros da síntese conforme necessário. Em geral, os componentes de partida podem ser obtidos de fontes como Sigma Aldrich, Lancaster Synthesis, Inc., Maybridge, Matrix Scientific, TCI e Fluorochem USA, etc. ou sintetizados de acordo com fontes conhecidas pelos técnicos especialistas no assunto (ver, para exemplo, Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 5ª edição (Wiley, December 2000)) ou preparado conforme descrito nesta divulgação.
ESQUEMA DE REAÇÃO GERAL 1
[0131] O Esquema de reação geral I fornece um método exemplar para a preparação de compostos de estrutura (I). R1, R2, R3, R4, R5, L1, L2, L3, G1, G2, e G3 no esquema de reação geral 1 são como definidos aqui. X1 e X2 são frações reativas selecionadas para facilitar a reação desejada (por exemplo, halo). Os compostos de estrutura A1 são adquiridos ou preparados de acordo com métodos conhecidos na técnica. A reação de A1 sob condições de redução apropriadas (por exemplo, triacetoxiboro-hidreto de sódio) produz o produto da aminação redutiva entre A1 e
A2, A3. A3 é então reagido com A4 sob condições básicas adequadas (por exemplo, usando trietilamina e DMAP) para gerar o composto A5. A5 é então reagido com amina A6 usando condições apropriadas (por exemplo, calor) para produzir um composto de estrutura (I) como mostrado.
[0132] Deve-se notar que várias estratégias alternativas para a preparação de compostos de estrutura (I) estão disponíveis para aqueles técnicos especialistas no assunto. Por exemplo, outros compostos de estrutura (I) em que podem ser preparados de acordo com métodos análogos usando o material de partida apropriado. A utilização de grupos de proteção conforme necessário e outras modificações ao Esquema de Reação Geral acima serão prontamente evidentes para um técnico especialista no assunto.
[0133] Os seguintes exemplos são fornecidos como ilustração e não como limitação.
EXEMPLO 1 Avaliação in vivo de mRNA de luciferase usando as composições de nanopartículas lipídicas
[0134] Nanopartículas lipídicas foram preparadas e testadas de acordo com os procedimentos gerais descritos nas publicações PCT. Nos. WO 2015/199952 e WO 2017/004143, as divulgações completadas das quais são incorporadas aqui por referência. Resumidamente, lipídeo catiônico, DSPC, colesterol e PEG-lipídeo foram solubilizados em etanol a uma razão molar de cerca de 50: 10: 38,5: 1,5 ou cerca de 47,5: 10: 40,8: 1,7. Nanopartículas de lipídeos (LNP) foram preparadas em uma proporção de peso total de lipídeo para mRNA de aproximadamente 10: 1 a 30: 1. O mRNA é diluído para 0,2 mg/mL em tampão de citrato ou acetato de 10 a 50 mM, pH 4. Bombas de seringa foram usadas para misturar a solução etanólica de lipídeos com a solução aquosa de mRNA em uma proporção de cerca de 1: 5 a
1: 3 (vol/vol) com taxas de fluxo total acima de 15 mL/min. O etanol foi então removido e o tampão externo substituído por PBS por diálise. Finalmente, as nanopartículas lipídicas foram filtradas através de um filtro estéril de poro de 0,2 μm. O tamanho de partícula de nanopartículas lipídicas era de aproximadamente 55-95 nm de diâmetro e, em alguns casos, de aproximadamente 70-90 nm de diâmetro, conforme determinado por dispersão de luz quase elástica usando um Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern, Reino Unido).
[0135] Os estudos foram realizados em camundongos C57BL/6 fêmeas de 6 a 8 semanas de idade (Charles River) ou camundongos CD-1 (Harlan) de 8 a 10 semanas de idade (Charles River) de acordo com as diretrizes estabelecidas por um comitê institucional de cuidado animal (ACC) e o Conselho Canadense de Cuidado Animal (CCAC). Doses variáveis de nanopartículas lipídicas de mRNA foram administradas sistemicamente por injeção na veia da cauda e os animais sacrificados em um ponto de tempo específico (por exemplo, 4 horas) após a administração. Fígado e baço foram coletados em tubos pré-pesados, pesos determinados, imediatamente congelados em nitrogênio líquido e armazenados a - 80 ºC até o processamento para análise.
[0136] Para o fígado, aproximadamente 50 mg foram dissecados para análises em tubos FastPrep de 2 mL (MP Biomedicals, Solon OH). Esfera de cerâmica de ¼’’ (MP Biomedicals) é adicionada a cada tubo e 500 µL de tampão Glo Lysis - GLB (Promega, Madison WI) equilibrado em temperatura ambiente são adicionados ao tecido do fígado. Os tecidos hepáticos foram homogeneizados com o instrumento FastPrep24 (MP Biomedicals) a 2 × 6,0 m/s por 15 segundos. O homogenato foi incubado em temperatura ambiente durante 5 minutos antes de uma diluição 1: 4 em GLB e avaliado usando o sistema de ensaio SteadyGlo Luciferase (Promega). Especificamente, 50 µL de homogenato de tecido diluído foi reagido com 50 µL de substrato SteadyGlo, agitado por 10 segundos seguido por 5 minutos de incubação e então quantificado usando um luminômetro CentroXS³ LB 960 (Berthold Technologies, Alemanha). A quantidade de proteína testada foi determinada usando o kit de ensaio de proteína BCA (Pierce, Rockford IL). As unidades de luminescência relativa (RLU) foram então normalizadas para o total de µg de proteína testada. Para converter RLU em ng de luciferase, uma curva padrão foi gerada com Luciferase recombinante QuantiLum (Promega).
[0137] O mRNA FLuc (L-6107 ou L-7202) da Trilink Biotechnologies irá expressar uma proteína luciferase, originalmente isolada do vaga-lume, photinus pyralis. FLuc é comumente usado em cultura de células de mamíferos para medir a expressão gênica e a viabilidade celular. Ele emite bioluminescência na presença do substrato, a luciferina. Este mRNA coberto e poliadenilado foi totalmente substituído em relação aos nucleosídeos de uridina e/ou citidina.
EXEMPLO 2 Determinação de pKa de lipídeos formulados
[0138] Conforme descrito em outro lugar, o pKa de lipídeos catiônicos formulados está correlacionado com a eficácia de LNPs para liberação de ácidos nucleicos (ver Jayaraman et al, Angewandte Chemie, International Edition (2012), 51(34), 8529-8533; Semple et al, Nature Biotechnology 28, 172–176 (2010)). A faixa preferencial de pKa é ~ 5 a ~ 7. O pKa de cada lipídeo catiônico foi determinado em nanopartículas lipídicas usando um ensaio baseado na fluorescência do ácido 2- (p-toluidino)-6-naftaleno sulfônico (TNS). Nanopartículas de lipídeos compreendendo lipídeo catiônico/DSPC/colesterol/PEG-lipídeo (50/10/38,5/1,5 mol%) em PBS a uma concentração de lipídeo total de 0,4 mM foram preparadas usando o processo em linha, conforme descrito no Exemplo 1. O TNS foi preparado como uma solução estoque de 100 μM em água destilada. As vesículas foram diluídas para 24 μM de lipídeo em 2 mL de soluções tamponadas contendo HEPES 10 mM, MES 10 mM, acetato de amônio 10 mM, NaCl 130 mM, onde o pH variou de 2,5 a 11. Uma alíquota da solução TNS foi adicionada para gerar uma concentração final de 1 µM e após mistura de vórtice a intensidade de fluorescência foi medida em temperatura ambiente em um espectrofotômetro de luminescência SLM Aminco Series 2 usando excitação e emissão de comprimentos de onda de 321 nm e 445 nm. Uma análise de melhor ajuste sigmoidal foi aplicada aos dados de fluorescência e o pKa foi medido como o pH dando origem a metade da intensidade máxima de fluorescência. EXEMPLO 3 Determinação da eficácia de formulações de nanopartículas de lipídeos contendo vários lipídeos catiônicos usando um modelo de roedor de expressão de mRNA de luciferase in vivo
[0139] Os lipídeos catiônicos mostrados na Tabela 2 foram previamente testados com ácidos nucleicos. Para fins comparativos, esses lipídeos também foram usados para formular nanopartículas de lipídeos contendo o mRNA FLuc (L- 6107) usando um método de mistura em linha, conforme descrito no Exemplo 1 e em PCT/US10/22614, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade. Nanopartículas lipídicas foram formuladas usando a seguinte razão molar: 50% de lipídeo catiônico/10% de distearoilfosfatidilcolina (DSPC)/38,5% de colesterol/1,5% de PEG de lipídeo ("PEG-DMG", ou seja, 1-(monometoxi-polietileno glicol)-2,3- dimiristoilglicerol, com um peso molecular médio de PEG de 2.000). Em modalidades alternativas, lipídeo catiônico, DSPC, colesterol e PEG-lipídeo são formulados em uma razão molar de aproximadamente 47,5: 10: 40,8: 1,7. A atividade relativa foi determinada medindo a expressão da luciferase no fígado 4 horas após a administração via injeção na veia da cauda, conforme descrito no
Exemplo 1. A atividade foi comparada a uma dose de 0,3 e 1,0 mg mRNA/kg e expressa como ng de luciferase/g de fígado medido 4 horas após a administração, conforme descrito no Exemplo 1. Tabela 2 Comparador de lipídeos mostrando atividade com mRNA Liver Luc Liver Luc Composto @ 0,3 mg/kg @ 1,0 Estrutura dose mg/kg dose MC2 4+1 N/D DLinDMA 13 + 3 67 + 20 MC4 41 + 10 N/D XTC2 80 + 28 237 + 99 MC3 198 + 126 757 + 528 319 258 + 67 681 + 203 (2% PEG)
O O O
N O 137 281 + 203 588 + 303 O
O A 77 ± 40 203 ± 122
[0140] Os compostos representativos da divulgação mostrados na Tabela 3 foram formulados usando a seguinte razão molar: 50% de lipídeo catiônico/10%
de distearoilfosfatidilcolina (DSPC)/38,5% de colesterol/1,5% de PEG de lipídeo ("PEG-DMA" 2-[2-(-metoxi(polietilenoglicol2000)etoxi]-N,N-ditetradecilacetamida)
ou 47,5% lipídeo catiônico/10% DSPC / 40,7% Colesterol / 1,8% PEG lipídeo.
A atividade relativa foi determinada medindo a expressão da luciferase no fígado 4 horas após a administração via injeção na veia da cauda, conforme descrito no
Exemplo 1. A atividade foi comparada a uma dose de 0,5 mg mRNA/kg e expressa como ng de luciferase/g de fígado medida 4 horas após a administração, conforme descrito no Exemplo 1. Os números dos compostos na Tabela 3 referem-se aos números dos compostos da Tabela 1. Tabela 3 Novos lipídeos catiônicos e atividade associada
Luc hepátic a
Cmp @ 0,5 pKa Estrutura . No. mg/kg
(ng de luc/g de fígado)
6,7 2420 ± I-7 4 1079
6,6 7384 ± I-8 8 1916
Luc hepátic a
Cmp @ 0,5 pKa Estrutura . No. mg/kg (ng de luc/g de fígado)
6,8 2223 ± I-9 3 777
6,7 4678 ± I-16 7 1243
6,4 13301 ± I-18 7 8071
6,8 949 ± I-20 4 628
Luc hepátic a Cmp @ 0,5 pKa Estrutura . No. mg/kg (ng de luc/g de fígado) 6,2 7904 ± I-25 0 1778 6,8 5551 ± I-29 1 1650 6,4 13614 ± I-30 7 3348
O
O 6,4 4091 ± N I-32 N O 1 713 O
O
Luc hepátic a Cmp @ 0,5 pKa Estrutura . No. mg/kg (ng de luc/g de fígado) 6,1 1304 ± I-33 9 278
N N O 6,3 14312 ± O O I-35 9 4174 O
O N O
O 6,5 10377 ± N O
O I-36 O 5 1435
O
O 6,3 15234 ± I-37 0 5248 EXEMPLO 4 Síntese de bis (2-butiloctil) 10-(N-decil-5-(dimetilamino) pentanamido) nonadecanodioato (Composto I-7)
Síntese do composto 4-2
[0141] Uma solução da cetona 4-1 (1,10 g, 1,62 mmol) e 1-decilamina (2,43 mmol, 382 mg, 0,486 mL) em DCE (10 mL) foi agitada em temperatura ambiente durante 15 minutos, seguida pela adição de triacetoxiboro-hidreto de sódio (2,43 mmol, 515 mg) e ácido acético (2,43 mmol, 146 mg; 0,138 mL). Após a mistura ter sido agitada em temperatura ambiente durante 2 dias, a mistura de reação foi concentrada. O resíduo foi diluído com uma mistura de hexanos e lavada com NaOH diluído, NaHCO3 saturado e salmoura. A fase orgânica foi separada, seca sobre sulfato de sódio e concentrada (óleo incolor, 1,41 g). O produto em bruto foi purificado por cromatografia em coluna sobre gel de sílica (hexano/EtOAc/Et3N, 95: 5: 0 a 80: 20: 1). O produto desejado foi obtido como óleo incolor (863 mg de óleo incolor, 1,05 mmol, rendimento de 65%). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 3.98 (d, 5,8 Hz, 4H), 2,54 (t, 7.1 Hz, 2H), 2.43 (quinteto, 5,5 Hz, 1H), 2.30 (t, 7,5 Hz, 4H), 1.68- 1,57 (m, 6H), 1,50-1.41 (m, 2H), 1.41-1.08 (70H), 0.92-0,86 (m, 15H), 0,86-0,77 (br.
1H).
Síntese do composto 4-3
[0142] À uma solução agitada de ácido 5-bromovalérico (1,12 mmol, 204 mg) em CH2Cl2 (1 mL) em temperatura ambiente foi adicionada uma solução de cloreto de tionil (3,36 mmol, 400 mg, 0,25 mL) em CH2Cl2 (5 mL) em um período de 1 minuto, seguido pela adição de DMF (cerca de 16 mg). A mistura foi então aquecida ao refluxo durante 2 horas. A mistura de reação foi então concentrada em vácuo. O cloreto de ácido foi usado diretamente para a próxima etapa.
[0143] Uma solução do cloreto de 5-bromopentanoil acima em benzeno (5 mL) foi adicionada gota a gota a uma solução de 4-2 (230 mg, 0,28 mmol) e trietilamina (5,6 mmol, 565 mg, 0,780 mL) e DMAP (5 mg) em benzeno (5 mL) em temperatura ambiente em 2 minutos. Após a adição, a reação foi agitada em temperatura ambiente durante 1 horas. Foi adicionado metanol (1 mL) e a mistura foi agitada durante 2 horas. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida. O produto em bruto foi purificado por cromatografia em coluna em sílica gel (hexano/EtOAc, 98: 2 a 85:15). O produto desejado foi obtido como óleo incolor (250 mg, 0,25 mmol, 91%, óleo incolor).
Síntese do Composto I-7
[0144] À 4-2 (250 mg, 0,25 mmol) foi adicionada dimetilamina (2 M em THF, 10 mL). A solução foi agitada a 64 ºC durante a noite. A mistura de reação foi concentrada. O resíduo foi retomado em uma mistura de hexano, acetato de etila e Et3N (80: 20: 1) e foi filtrado através de uma almofada de gel de sílica e lavado com a mesma mistura de solventes. A concentração do filtrado gerou um óleo acastanhado (cerca de 233 mg). O produto em bruto (233 mg) foi purificado por cromatografia em coluna de secagem flash em sílica gel (0 a 6% de metanol em clorofórmio). O produto desejado foi obtido como (194 mg, óleo incolor, 0,20 mmol, 82%). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 4.60-4.20 (br, estimated 0.3H, due to slow isomerization about amida bond), 3.97, 3.96 (2 sets of doublets, 5,8 Hz, 4H), 3.60 (quintet-like, 7.0 Hz, 0,7H), 3.06-2.99 (m, 2H), 2.34-2.24 (m, 8H), 2.21 (singlet, 6H), 1,72-1,56 (m, 8H), 1,56-1.37 (m, 8H), 1.37-1.10 (66H), 0.91-0,85 (m, 15H).
EXEMPLO 5 Síntese de bis (2-butiloctil) 10-(N-decil-4-(dimetilamino) butanamido) nonadecanodioato (Composto I-18)
Síntese do Composto I-18, (Método A)
[0145] À uma solução agitada de cloridrato de ácido 4-(dimetilamino) butírico (1,12 mmol, 188 mg) e DMF (10-20 µL) em CH2Cl2 (10 mL) em temperatura ambiente foi adicionado cloreto de oxalil (5,6 mmol, 722 mg, 0,496 mL). A mistura resultante foi agitada em temperatura ambiente durante a noite. A mistura de reação (vermelho escuro) foi concentrada sob pressão reduzida. O cloreto de ácido resultante (sólido cor de tijolo) foi usado diretamente para a próxima etapa.
[0146] Uma solução do cloreto de acila acima em CH2Cl2 (10 mL) foi adicionada gota a gota a uma solução de 4-2 (230 mg, 0,28 mmol) e trietilamina (5,6 mmol, 565 mg, 0,780 µL) e DMAP (5 mg) em CH2Cl2 (5 mL) em temperatura ambiente. A mistura resultante foi agitada em temperatura ambiente durante a noite e concentrada sob pressão reduzida. O produto em bruto foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel (hexano/EtOAc/Et3N, de 80: 20: 0,1 a 75: 25: 1) e ainda foi purificado por cromatografia em coluna seca flash em sílica gel (0 a 5% metanol em clorofórmio). O produto desejado foi obtido como (92 mg, óleo incolor, 0,10 mmol, 35%). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 4,57-4,29 (br. 0,4H), 3,97, 3,96 (2 conjuntos de dubletos, 5,8 Hz, 5,8 Hz, 4H), 3,63 (semelhante a quinteto, 6,8 Hz, 0,6H), 3,06-3,00 (m, 2H), 2,35-2,26 (m, 8H), 2,213, 2,211 (2 conjuntos de singleto, 6H), 1,82 (semelhante a sexteto, 7,6 Hz, 2H), 1,65-1,56 (m, 6H), 1,54-1,48 (m, 2H), 1,47-1,37 (m, 4H), 1,36-1,06 (66H), 0,91-0,86 (m, 15H).
Síntese do Composto I-18, (Método B)
[0147] À uma solução de cloridrato de ácido 4-dimetilaminobutírico (2 equiv, 3,04 mmol, 510 mg) e 4-dimetilaminopiridina (3 equiv, DMAP, 4,56 mmol, 557 mg) em acetonitrila (30 mL) foi adicionado DCC (2,2 equiv, 3,34 mmol), 690 mg) e a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 45 min. Foi adicionada uma solução de 4-2 (1,25 g, 1,52 mmol) em CH2Cl2 (6 mL) e a mistura resultante foi agitada durante a noite. No dia seguinte, mais DCC (450 mg) foi adicionado e a mistura foi agitada por mais um dia. A mistura foi então concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi retomado em uma mistura de hexano, acetato de etila e Et3N (80: 20: 1) e foi filtrado através de uma coluna curta de gel de sílica e lavado com a mesma mistura de solventes. A concentração do filtrado gerou um óleo incolor. O produto foi ainda purificado por cromatografia flash em coluna seca sobre gel de sílica (0 a 5% de metanol em clorofórmio com um traço de Et3N). O produto desejado foi obtido como um óleo incolor (1,14 g, 81%).
EXEMPLO 6 Síntese de bis (2-butiloctil) 10-(N-decil-5-(dietilamino) pentanamido) nonadecanodioato (Composto I-8)
Síntese do Composto I-8
[0148] Uma mistura de 4-3 (179 mg, 0,18 mmol), dietilamina (0,90 mmol, 66 mg, 0,093 mL), N,N-di-isopropiletilamina (0,36 mmol, 46 mg, 0,063 mL) em acetonitrila (6 mL) foi vedado e aquecido a 83 ºC durante 24 horas. A mistura de reação foi concentrada. O resíduo foi retomado em uma mistura de hexano, acetato de etila e Et3N (80: 20: 1) e foi filtrado através de uma almofada de gel de sílica e lavado com a mesma mistura de solventes. A concentração do filtrado gerou um óleo acastanhado (153 mg). O produto em bruto (233 mg) foi purificado por cromatografia em coluna de secagem flash em sílica gel (0 a 6% de MeOH em clorofórmio). O produto desejado foi obtido como (136 mg, óleo incolor, 0,14 mmol, 77%).
EXEMPLO 7 Síntese de bis (2-butiloctil) 10-(N-decil-5-(pirrolidin-1-il) pentanamido)
nonadecanodioato (Composto I-9) Síntese do Composto I-9
[0149] Uma mistura de 4-3 (200 mg, 0,20 mmol), pirrolidina (50 eq. 0,83 mL, 10 mmol) em THF (10 mL) foi vedado e aquecido a 64 ºC durante 24 horas. A mistura de reação foi concentrada. O resíduo foi retomado em uma mistura de hexano, acetato de etila e Et3N (80: 20: 1) e foi filtrado através de uma almofada de gel de sílica e lavado com a mesma mistura de solventes. A concentração do filtrado gerou um óleo acastanhado. O produto em bruto (233 mg) foi purificado por cromatografia em coluna de secagem flash em sílica gel (0 a 6% de MeOH em clorofórmio). O produto desejado foi obtido como (158 mg, óleo incolor, 0,16 mmol, 80%). EXEMPLO 8 Síntese de bis (2-hexildecil) 7-(N-decil-4-(dimetilamino) butanamido) tridecanodioato (Composto I-16)
Síntese do 8-2
[0150] Uma solução de 8-1 (1 eq., 1,15 g, 1,62 mmol) e 1-decilamina (1,5 eq, 2,43 mmol, 382 mg, 0,486 mL) em DCE (10 mL) foi agitada em temperatura ambiente durante cerca de 15 min. À solução foi adicionado triacetoxiboro-hidreto de sódio (1,5 eq., 2,43 mmol, 515 mg) e AcOH (1,5 eq, 2,43 mmol, 146 mg, 0,14 mL). A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 3 dias. A mistura de reação foi então concentrada. O resíduo foi diluído com hexanos/EtOAc (99: 1) e lavado com solução diluída de NaOH, NaHCO3 saturado e salmoura. O extrato orgânico foi seco sobre sulfato de sódio e vertido sobre uma pequena coluna de sílica gel. A coluna foi eluída com uma mistura de hexano, EtOAc e Et3N (95: 5: 0 a
80: 20: 1). As frações contendo o produto puro foram combinadas e concentradas.
O produto desejado foi obtido como um óleo incolor (1,28 g, 1,51 mmol, 93%). 1 HNMR (400 MHz, CDCl3) δ: 3,97 (d, 5,8 Hz, 4H), 2,53 (t, 7,2 Hz, 2H), 2,43 (semelhante a quinteto, 5,5 Hz, 1H), 2,30 (t, 7,5 Hz, 4H), 1,68-1,57 (m, 6H), 1,49- 1,40 (m, 2H), 1,40-1,08 (74H), 0,91-0,85 (m, 15H), 0,83-0,74 (br. 1H).
Síntese do Composto I-16
[0151] À uma solução agitada de cloridrato de ácido 4-(dimetilamino) butírico (2,1 mmol, 352 mg) e DMF (ca 13 mg) em CH2Cl2 (15 mL) em temperatura ambiente foi adicionado cloreto de oxalil (3 eq, 6,3 mmol, 800 mg, 0,55 mL) sob Ar. A mistura resultante foi agitada em temperatura ambiente durante a noite. A mistura de reação (solução laranja claro) foi concentrada em vácuo. O cloreto de ácido resultante (8-3, sólido castanho claro) foi utilizado diretamente para a seguinte reação.
[0152] Uma solução do cloreto de acila acima em CH2Cl2 (10 mL) foi adicionada a uma solução de 8-2 (300 mg, 0,35 mmol) e trietilamina (10,5 mmol, 1,06 g, 1,5 mL) e DMAP (5 mg) em CH2Cl2 (5 mL) em temperatura ambiente. Após a adição, a mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente durante a noite.
Após concentração da mistura, o produto foi isolado por cromatografia em coluna em gel de sílica (hexano, EtOAc e Et3N, de 80: 20: 0,1 a 70: 30: 1) e o produto foi ainda purificado por cromatografia em coluna de secagem flash em gel de sílica (0 a 5% de MeOH em clorofórmio). O produto desejado foi obtido como um óleo ligeiramente amarelo (110 mg, 0,11 mmol, 32%). 1HNMR (400 MHz, CDCl3 a 7,26 ppm) δ: 4,57-4,34 (br. 0,4H), 3,98-3,94 (m, 4H), 3,64 (semelhante a quinteto, 6,8 Hz, 0,6H), 3,06-3,00 (m, 2H), 2,35-2,25 (m, 8H), 2,213, 2,210 (2 conjuntos de singleto, 6H), 1,82 (semelhante a sexteto, 7,4 Hz, 2H), 1,65-1,56 (m, 6H), 1,54-1,48 (m, 2H), 1,48-1,37 (m, 4H), 1,37-1,06 (70H), 0,91-0,86 (m, 15H).
EXEMPLO 9
Síntese de bis (2-butiloctil) 10-(4-(dimetilamino) -N-(2-etilhexil) butanamido)
nonadecanodioato (Composto I-20)
Síntese do 9-2
[0153] Uma solução de 9-1 (1 eq., 0,82 g, 1,21 mmol) e 2-etil-1-hexilamina
(1,5 eq, 1,81 mmol, 234 mg) em DCE (8 mL) foi agitada em temperatura ambiente durante cerca de 15 min. À solução foi adicionado triacetoxiboro-hidreto de sódio (1,5 eq., 1,81 mmol, 384 mg) e AcOH (1,5 eq, 1,81 mmol, 109 mg). A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 2 dias. A mistura de reação foi então concentrada. O resíduo foi diluído com hexanos e EtOAc (CA 99: 5) e lavada com NaOH diluído, NaHCO3 saturado e salmoura. O extrato foi filtrado através de uma curta coluna de sílica gel. A coluna foi lavada com uma mistura de hexano e AcOEt (95: 5) e, em seguida, uma mistura de hexanos, EtOAc e Et3N (80: 20: 0,5). O filtrado da última lavagem foi concentrado até à secura. Isto gerou o produto puro como um óleo incolor (888 mg, 1,12 mmol, 93%). 1HNMR (400 MHz, CDCl3) δ: 3,98 (d, 5,8 Hz, 4H), 2,45 (d, 5,1 Hz, 2H), 2,39 (semelhante a quinteto, 5,5 Hz, 1H), 2,30 (t, 7,5 Hz, 4H), 1,68-1,57 (m, 6H), 1,41-1,08 (65H), 0,92-0,85 (m, 18H), 0,84-0,78 (br. 1H).
Síntese do 9-4
[0154] À uma solução agitada de ácido 5-bromovalérico (2,24 mmol, 405 mg) em CH2Cl2 (2 mL) em temperatura ambiente foi adicionada lentamente uma solução de cloreto de tionila (3 eq. 6,72 mmol, 800 mg, 0,49 mL) em CH2Cl2 (5 mL) em um período de 1 min. DMF (duas gotas minúsculas, cerca de 16 mg) foi adicionado à mistura de reação. A mistura foi então aquecida ao refluxo durante 2 h. A mistura de reação foi concentrada em vácuo. O cloreto de ácido resultante, 9- 3, foi usado diretamente para a próxima etapa.
[0155] Uma solução do cloreto de 5-bromopentanoil acima em benzeno (8 mL) foi adicionada a uma solução de 9-2 (444 mg, 0,56 mmol) e trietilamina (1,56 mL) e DMAP (5 mg) em benzeno (5 mL) em temperatura ambiente em 2 min. Após a adição, a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante a noite. Após evaporação dos solventes em vácuo, o produto foi isolado por cromatografia em coluna em sílica gel (hexano/EtOAc, 99: 1 a 90:10). O produto desejado era puro o suficiente para a próxima etapa (óleo incolor, 527 mg, 0,55 mmol, 98%).
Síntese do Composto I-20
[0156] À um frasco de pressão contendo 9-4 (260 mg, 0,27 mmol) foi adicionada dimetilamina (2 M em THF, 10 mL). A solução foi agitada a 64 ºC (temperatura do banho de óleo) durante a noite. O excesso de amina e solvente foram evaporados. O resíduo foi retomado em uma mistura de acetato de etila e hexano (95: 5) e filtrado através de uma almofada de sílica gel. A almofada foi lavada com uma mistura de hexano e AcOEt (95: 5) e, em seguida, uma mistura de hexanos, EtOAc e Et3N (80: 20: 1). O filtrado da última lavagem foi concentrado até à secura. Isto gerou o produto bruto como um óleo castanho (233 mg). O produto em bruto foi ainda purificado por cromatografia em coluna de secagem flash em sílica gel (0 a 5% de MeOH em clorofórmio). O produto desejado foi obtido como óleo incolor (204 mg, 0,22 mmol, 82%). 1HNMR (400 MHz, CDCl3 a 7,27 ppm) δ: 3,97 (d, 5,8 Hz, 4H), 3,66-3,57 (m, ca 1H), 3,19-2,99 (2 conjuntos de picos, 2H), 2,38-2,24 (m, 8H), 2,22 (singleto, 6H), 1,72-1,37 (m, 15H), 1,37-1,10 (60H), 0,91- 0,85 (m, 18H).
EXEMPLO 10 Síntese de bis (2-butiloctil) 10-(3-(dimetilamino) -N-nonilpropanamido) nonadecanodioato (Composto I-25)
Síntese do 10-1
[0157] À uma solução de ácido 3-bromopropiônico (2,02 mmol, 311 mg) em CH2Cl2 (5 mL) e DMF (0,01 mL) foi adicionado cloreto de oxalil (5,05 mmol, 641 mg, 0,44 mL) em temperatura ambiente. A mistura resultante foi agitada em temperatura ambiente durante a noite. A mistura foi então concentrada em vácuo. O líquido/sólido residual (amarelo) foi dissolvido em 10 mL de CH2Cl2 e adicionado a uma solução de 4-2 (833 mg, 1,02 mmol) e trietilamina (5,05 mmol, 0,7 mL) e DMAP (5 mg) em CH2Cl2 (10 mL) em temperatura ambiente em 4 min. Após a adição, a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 2 h. Após evaporação dos solventes em vácuo, o produto foi isolado por cromatografia em coluna em sílica gel (hexano/EtOAc, 99: 1 a 90:10). O produto desejado foi obtido como um óleo incolor (794 mg, 0,83 mmol, 81%).
Síntese do Composto I-25
[0158] Uma mistura de 10-1 (283 mg, 0,30 mmol) e dimetilamina (2 M em THF, 12 mL) em um frasco de pressão foi agitada a 68 ºC (temperatura do banho de óleo) durante a noite. A mistura de reação foi concentrada. O resíduo foi retomado em uma mistura de hexano, acetato de etila e Et3N (80: 20: 1) e foi filtrado através de uma almofada de gel de sílica e lavado com a mesma mistura de solventes. A concentração do filtrado gerou um óleo acastanhado (302 mg). O produto em bruto (302 mg) foi purificado por cromatografia flash em coluna seca sobre gel de sílica (0 a 5% de MeOH em clorofórmio com um traço de Et3N). O produto desejado foi obtido como um óleo incolor (169 mg, 0,18 mmol, 61%). 1HNMR (400 MHz, CDCl3 a 7,26) δ: 4,50-4,31 (br, estimado 0,3H, devido à isomerização lenta em torno da ligação amida), 3,97 (dubletos em ressaltos, 5,8 Hz, 4H), 3,60 (semelhante a quinteto, 7,0 Hz, 0,7H), 3,07-3,00 (m, 2H), 2,65 (semelhante a q, 7,6 Hz, 2H), 2,48 (semelhante a q, 7,6 Hz, 2H), 2,29 (tripleto em ressaltos, 7,6 Hz, 4H), 2,26, 2,25 (2 conjuntos de singleto, 6H), 1,66-1,56 (m, 6H), 1,56-1,48 (m,2H), 1,48-1,37 (m, 4H), 1,37-1,10 (66H), 0,91-0,85 (m, 15H). EXEMPLO 11 Síntese de bis (2-hexildecil) 7-(N-decil-4-(pirrolidin-1-il) butanamido)
tridecanodioato (Composto I-29) Síntese do 11-1
[0159] À uma solução de ácido 4-bromobutírico (0,97 mmol, 161 mg) em CH2Cl2 (3 mL) e DMF (0,01 mL) foi adicionado cloreto de oxalil (3 eq, 2,91 mmol, 370 mg, 0, 25 mL) em temperatura ambiente. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante a noite. A mistura de reação foi então concentrada em vácuo. O líquido/sólido residual (ligeiramente amarelo) foi dissolvido em 5 mL de CH2Cl2 e foi adicionada uma solução de 8-2 (410 mg, 0,48 mmol), trietilamina (0,4 mL) e DMAP
(2 mg) em CH2Cl2 (20 mL) em temperatura ambiente em 2 min. Após a adição, a mistura resultante foi agitada em temperatura ambiente durante 2,5 h. TLC (hexano/acetato de etila = 9: 1) mostrou duas manchas principais. A mistura de reação foi então concentrada em temperatura ambiente sob pressão reduzida. O resíduo foi usado para a próxima reação sem qualquer purificação.
Síntese do Composto I-29
[0160] O resíduo acima contendo 11-1 foi retomado em uma mistura de pirrolidina (2,10 mL, 25 mmol) e THF (15 mL). A mistura foi transferida para um frasco de pressão e aquecida a 68 ºC durante a noite. A mistura foi resfriada e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi retomado em uma mistura de hexano, acetato de etila e Et3N (80: 20: 1) e filtrada através de uma coluna curta de gel de sílica e lavada com a mesma mistura de solventes. A concentração do filtrado gerou óleo/sólido amarelo. O produto em bruto (300 mg) foi purificado por cromatografia em coluna sobre gel de sílica (0% a 10% de MeOH e 0% a 0,5% de Et3N em CH2Cl2). O produto desejado foi obtido como um óleo amarelo (215 mg). O produto (215 mg) foi ainda purificado por cromatografia em coluna de secagem flash em sílica gel (0 a 5% de MeOH em clorofórmio). O produto desejado foi obtido como um óleo incolor (162 mg, 0,16 mmol, 34%). 1HNMR (400 MHz, CDCl3 a 7,26 ppm) δ: 4,57-4,34 (br. 0,4H), 3,98-3,94 (m, 4H), 3,64 (semelhante a quinteto, 6,8 Hz, 0,6H), 3,06-3,00 (m, 2H), 2,51-2,44 (m, 6H), 2,37-2,21(m, 6H), 1,86 (semelhante a sexteto, 7,6 Hz, 2H), 1,80-1,71 (m, 4H), 1,65-1,48 (m, 8H), 1,48-1,37 (m, 4H), 1,37-1,06 (70H), 0,91-0,86 (m, 15H).
EXEMPLO 12 Síntese de bis (2-butiloctil) 10-(4-(dimetilamino) -N-(2-etilhexil) butanamido) nonadecanodioato (Composto I-30)
Síntese do Composto I-30
[0161] À uma solução de cloridrato de ácido 4-dimetilaminobutírico (0,50 mmol, 85 mg) e 4-dimetilaminopiridina (3 equiv, DMAP, 0,75 mmol, 92 mg) em acetonitrila (5 mL) foi adicionado DCC (1,1 mmol x 2, 226, mg) e a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 45 min. Uma solução de 9-2 (160 mg, 0,20 mmol) em CH2Cl2 (1 mL) foi adicionada à mistura de reação e a mistura resultante foi agitada durante o fim de semana. Mais DCC (135 mg) foi adicionado e agitado por outro dia. Nenhum progresso foi observado com base na análise de TLC. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi retomado em uma mistura de hexanos e EtOAc (ca 99: 5) e foi filtrado através de uma coluna curta de sílica gel. A coluna foi lavada com uma mistura de hexano e AcOEt (95: 5) e, em seguida, uma mistura de hexanos, EtOAc e Et3N (80: 20: 1). O filtrado da última lavagem foi concentrado até à secura (133 mg). O produto em bruto (133 mg) foi ainda purificado por cromatografia em coluna flash seca sobre sílica gel (0 a 5% de MeOH em clorofórmio com um traço de Et3N). O produto desejado foi obtido como (48 mg, óleo incolor, 0,053 mmol, 27%). 1HNMR (400 MHz, CDCl3 a 7,27 ppm) δ: 3,97 (d, 5,8 Hz, 4H), 3,70-3,60 (m, ca 1H), 3,19-2,99 (2 conjuntos de picos, 2H), 2,39-2,25 (m, 8H), 2,22 (singleto, 6H), 1,86-1,76 (m, 2H), 1,72-1,37 (m, ca 11H), 1,37-1,10 (60H), 0,91-0,85 (m, 18H).
EXEMPLO 13 Síntese de bis (2-butiloctil) 10-(N-decil-5-(dibutilamino) pentanamido) nonadecanodioato (Composto I-31) Síntese do Composto I-31
[0162] Uma mistura de 4-3 (284 mg, 0,29 mmol), THF (10 mL), iodeto de sódio (5 mg) e dibutilamina (10 mmol, 1,29 g, 1,68 mL) em um frasco de pressão foi agitada a 78 ºC durante a noite. A mistura de reação foi concentrada. O resíduo foi retomado em uma mistura de hexano, acetato de etila e Et3N (80: 20: 1) e foi filtrado através de uma almofada de gel de sílica e lavado com a mesma mistura de solventes. A concentração do filtrado gerou um óleo acastanhado (o produto e dibutilamina). O óleo foi diluído com hexano e lavado com solução aquosa diluída de HCl (0,5 M), duas vezes, solução saturada de NaHCO3 e com salmoura e seca com sulfato de sódio. O extrato foi concentrado sob pressão reduzida. O produto em bruto (309 mg) foi purificado por cromatografia flash em coluna seca sobre gel de sílica (0 a 5% de MeOH em clorofórmio com um traço de Et3N). O produto desejado foi obtido como um óleo incolor (216 mg, 0,21 mmol, 72%). 1HNMR (400 MHz, CDCl3) δ: 4,50-4,35 (br, estimado 0,3H, devido à isomerização lenta em torno da ligação amida), 3,97, 3,96 (2 conjuntos de dubletos, 5,8 Hz, 4H), 3,61 (semelhante a quinteto, 7,0 Hz, 0,7H), 3,07-2,99 (m, 2H), 2,45-2,36 (m, 6H), 2,34- 2,27 (m, 6H), 1,70-1,56 (m, 8H), 1,56-1,36 (m, 12H), 1,37-1,10 (70 H), 0,97-0,85 (m, 21H).
EXEMPLO 14 Síntese de 10-(4-(dimetilamino) -N-nonilbutanamido) nonadecano-1,19-diil bis (2-butiloctanoato) (Composto I-32)
Síntese do Composto I-32
[0163] À uma solução de cloridrato de ácido 4-dimetilaminobutírico (2 equiv, 1,08 mmol, 181 mg) e 4-dimetilaminopiridina (3 equiv, DMAP, 1,62 mmol, 198 mg) em acetonitrila (10 mL) foi adicionado DCC (2,2 equiv, 1,18 mmol), 245 mg) e a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 45 min. Em seguida, foi adicionada uma solução de 14-1 (442 mg, 0,54 mmol) em CH2Cl2 (2 mL). A mistura resultante foi agitada durante a noite. Foi adicionado mais DCC (140 mg) e a mistura foi agitada durante outro dia. A mistura foi então concentrada sob pressão reduzida.
O resíduo foi retomado em uma mistura de hexano, acetato de etila e Et3N (80: 20: 1) e foi filtrado através de uma coluna curta de gel de sílica e lavado com a mesma mistura de solventes. A concentração do filtrado gerou óleo amarelo (381 mg). O produto em bruto (381 mg) foi purificado por cromatografia flash em coluna seca sobre gel de sílica (0 a 5% de MeOH em clorofórmio com um traço de Et3N). O produto desejado foi obtido como um óleo incolor (345 mg, 0,38 mmol, 70%). 1HNMR (400 MHz, CDCl3 a 7,26 ppm) δ: 5,30-4,34 (br., 0,3H), 4,061, 4,056 (dois conjuntos de tripletos, 6,7 Hz, 4H), 3,64 (semelhante a quinteto, 6,8 Hz, 0,7H), 3,07- 3,01 (m, 2H), 2,35-2,26 (m, 6H), 2,214, 2,211 (dois conjuntos de singleto, 6H), 1,82 (semelhante a sexteto, 7,6 Hz, 2H), 1,65-1,48 (m, 10H), 1,48-1,37 (m, 8H), 1,37- 1,02 (60H), 0,90-0,85 (m, 15H). EXEMPLO 15 Síntese de bis (2-butiloctil) 10-(N-decil-3-(pirrolidin-1-il) propanamido) nonadecanodioato (Composto I-33) Síntese do Composto I-33
[0164] Uma mistura de 10-1 (283 mg, 0,30 mmol), pirrolidina (1,25 mL, 15 mmol) e THF (10 mL) em um tubo de pressão foi aquecida a 64 ºC durante a noite.
A mistura foi resfriada e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi retomado em uma mistura de hexano, acetato de etila e Et3N (80: 20: 1) e filtrada através de uma coluna curta de gel de sílica e lavada com a mesma mistura de solventes.
A concentração do filtrado gerou um óleo amarelo.
O produto em bruto (314 mg) foi ainda purificado por cromatografia em coluna flash seca sobre sílica gel (0 a 5% de
MeOH em clorofórmio com um traço de Et3N). O produto desejado foi obtido como um óleo incolor (113 mg, 0,12 mmol, 40%). 1HNMR (400 MHz, CDCl3 a 7,26) δ: 4,55-4,30 (br, estimado 0,3H, devido à isomerização lenta em torno da ligação amida), 3,97 (dubletos em ressaltos, 5,8 Hz, 4H), 3,61 (semelhante a quinteto, 7,0
Hz, 0,7H), 3,06-3,00 (t-like, 2H), 2,81 (semelhante a q, 7,6 Hz, 2H), 2,58-2,51(m, 6H), 2,292, 2,285 (2 conjuntos de tripletos, 7,5 Hz, 4H), 1,83-1,73 (m, 4H), 1,65-
1,56 (m, 6H), 1,56-1,48 (m,2H), 1,48-1,37 (m, 4H), 1,37-1,10 (66H), 0,91-0,85 (m,
15H). EXEMPLO 16
Síntese de bis (2-butiloctil) 10-(N-decil-5-(hexil (metil) amino) pentanamido)
nonadecanodioato (Composto I-34)
Síntese do 16-1
[0165] Uma mistura de 4-3 (200 mg, 0,20 mmol), hexilamina (20 mmol, 2 g), N,N-di-isopropiletilamina (5 equiv., 1,0 mmol, 0,17 mL) e iodeto de sódio (10 mg) em acetonitrila (6 mL) foi vedada e aquecida a 70 ºC durante 24 h. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida (cerca de 30 mmHg) de 75 a 85 ºC. A TLC mostrou que a maior parte do excesso de hexilamina foi removida. O resíduo foi retomado em uma mistura de hexano, acetato de etila e Et3N (80: 20: 1) e foi filtrado através de uma coluna curta de gel de sílica e lavado com a mesma mistura de solventes. A concentração do filtrado gerou um óleo castanho (192 mg) que foi utilizado na etapa seguinte sem purificação adicional. Síntese do Composto I-34
[0166] À uma solução de 16-1 (192 mg, 0,19 mmol) em THF (5 mL) foi adicionada solução de formaldeído HCHO (500 mg, solução a 37% em peso em água) em temperatura ambiente. A mistura resultante foi agitada durante 30 min antes da introdução de triacetoxiboro-hidreto de sódio (1,2 mmol, 243 mg). A mistura resultante foi agitada em temperatura ambiente durante a noite. A mistura de reação foi concentrada. O resíduo foi colocado em uma mistura de hexano e lavado com solução diluída de NaOH, solução saturada de bicarbonato de sódio e salmoura. Depois de seca sobre sulfato de sódio, a solução foi concentrada até à secura (óleo amarelo). O resíduo foi retomado em uma mistura de hexano, acetato de etila e Et3N (80: 20: 1) e foi filtrado através de uma coluna curta de gel de sílica e lavado com a mesma mistura de solventes. A concentração do filtrado gerou um óleo amarelo (220 mg). O produto em bruto (220 mg) foi ainda purificado por cromatografia em coluna flash seca sobre sílica gel (0 a 5% de MeOH em clorofórmio com um traço de Et3N). O produto desejado foi obtido como óleo incolor (113 mg, 0,13 mmol, 69%). 1HNMR (400 MHz, CDCl3 a 7,26 ppm) δ: 4,50-4,35 (br, estimado 0,3H, devido à isomerização lenta em torno da ligação amida), 3,97, 3,96 (2 conjuntos de dubletos, 5,8 Hz, 4H), 3,60 (semelhante a quinteto, 7,0 Hz, 0,7H), 3,06-2,98 (m, 2H), 2,36-2,26 (m, 10H), 2,191, 2,189 (2 conjuntos de singleto, 3H), 1,70-1,56 (m, 8H), 1,56-1,36 (m, 10H), 1,37-1,10 (72 H), 0,91-0,85 (m, 18H).
EXEMPLO 17 Síntese de bis (2-hexildecil) 7-(N-decil-3-(dimetilamino) propanamido) tridecanodioato (Composto I-35)
Síntese do Composto I-35
[0167] À uma solução de cloridrato de ácido 3-dimetilaminopropiônico (2 equiv, 0,62 mmol, 95 mg) e 4-dimetilaminopiridina (3 equiv, DMAP, 0,93 mmol, 114 mg) em acetonitrila (10 mL) foi adicionado DCC (2,2 equiv, 0,68 mmol), 141 mg) e a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 45 min. Uma solução de 8- 2 (262 mg, 0,31 mmol) em CH2Cl2 (2 mL) foi adicionada e a mistura resultante foi agitada durante o fim de semana. TLC (clorofórmio/MeOH, 9: 1) mostrou uma mancha principal na frente do solvente que poderia ser o produto de eliminação, nenhum material de partida e um pouco do produto desejado. A mistura de reação foi concentrada. O possível produto de eliminação (107 mg de óleo incolor) foi isolado por cromatografia em coluna (hexano-EtOAc, 95: 5) e foi tratado com uma solução de dimetil amina em THF (2M, 9 mL) em temperatura ambiente por 4 dias.
A mistura foi concentrada. O resíduo foi retomado em uma mistura de hexano, acetato de etila e Et3N (80: 20: 1) e foi filtrado através de uma coluna curta de gel de sílica e lavado com a mesma mistura de solventes. A concentração do filtrado gerou um óleo amarelo. O produto em bruto foi adicionalmente purificado por cromatografia flash em coluna seca sobre gel de sílica (0 a 5% de MeOH em clorofórmio com um traço de Et3N). O produto desejado foi obtido como óleo incolor (62 mg). 1HNMR (400 MHz, CDCl3 a 7,26) δ: 4,50-4,36 (br, estimado 0,3H, devido à isomerização lenta em torno da ligação amida), 3,97, 3,96 (dois conjuntos de dubletos, 5,8 Hz, 4H), 3,61 (semelhante a quinteto, 7,0 Hz, 0,7H), 3,07-3,00 (m, 2H), 2,65 (semelhante a q, 7,2 Hz, 2H), 2,53-2,41 (m, 2H), 2,31-2,26 (m, 4H), 2,26, 2,25 (2 conjuntos de singleto, 6H), 1,66-1,56 (m, 6H), 1,56-1,48 (m,2H), 1,48-1,37 (m, 4H), 1,37-1,10 (70H), 0,91-0,85 (m, 15H) EXEMPLO 18 Síntese de bis (2-hexildecil) 7-(3-(dimetilamino)-N-(6-((2-etilhexil) oxi)-6- oxohexil) propanamido) tridecanodioato (Composto I-36)
Síntese do 18-2
[0168] À uma solução de ácido 3-bromopropionílico (0,34 mmol, 52 mg) em CH2Cl2 (3 mL) e DMF (1 gota de uma agulha fina) foi adicionado cloreto de oxalil (0,86 mmol, 109 mg, 74 uL) em temperatura ambiente. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante a noite. A mistura foi então concentrada sob pressão reduzida durante 60 min em temperatura ambiente. O líquido/sólido residual (amarelo) foi dissolvido em 5 mL de CH2Cl2 e adicionado a uma solução de 18-1
(160 mg, 0,17 mmol) e trietilamina (0,86 mmol, 0,12 mL) e DMAP (1 mg) em CH2Cl2 (5 mL) em temperatura ambiente em 1 min. Após a adição, a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 3 h e depois concentrada. O produto foi isolado por cromatografia em coluna sobre gel de sílica (hexano, EtOAc, e Et3N, a partir de 95: 5 a 85:15). O produto desejado foi obtido como um óleo incolor (99 mg, 0,09 mmol, 53%). Síntese do Composto I-36
[0169] À um frasco de pressão contendo 18-2 (99 mg, 0,09 mmol) foi adicionada dimetilamina (2 M em THF, 5 mL). A solução foi agitada a 68 ºC (temperatura do banho de óleo) durante 2 dias. A mistura foi resfriada e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi retomado em uma mistura de hexano, acetato de etila e Et3N (80: 20: 1) e foi filtrado através de uma coluna curta de gel de sílica e lavado com a mesma mistura de solventes. A concentração do filtrado gerou um óleo castanho (94 mg). O produto (94 mg) foi ainda purificado por cromatografia em coluna flash seca sobre sílica gel (0 a 5% de MeOH em clorofórmio com um traço de Et3N). O produto desejado foi obtido como óleo incolor (71 mg, 0,069 mmol, 76%). 1HNMR (400 MHz, CDCl3 a 7,26) δ: 4,53-4,35 (br, estimado 0,3H, devido à isomerização lenta em torno da ligação amida), 4,02-3,93 (m, 6H), 3,62 (semelhante a quinteto, 7,0 Hz, 0,7H), 3,07-3,01 (m, 2H), 2,65 (semelhante a q, 7,6 Hz, 2H), 2,50-2,44 (m, 2H), 2,34-2,26 (m, 6H), 2,26, 2,25 (2 conjuntos de singleto, 6H), 1,69- 1,56-1,48 (m, estimado 11H, sobreposto com pico de água), 1,49-1,37 (m, 4H), 1,37-1,10 (66H), 0,92-0,86 (m, 18H).
EXEMPLO 19 Síntese de di(tridecan-7-il) 10-(N-decil-4-(dimetilamino) butanamido) nonadecanodioato (Composto I-37)
Síntese do 19-2
[0170] Uma solução de 19-1 (1 eq., 0,493 g, 0,70 mmol) e 1-decilamina (1,5 eq, 1,05 mmol, 165 mg, 0,21 mL) em DCE (10 mL) foi agitada em temperatura ambiente por cerca de 15 min. À solução foi adicionado triacetoxiboro-hidreto de sódio (1,5 eq., 1,05 mmol, 222 mg) e AcOH (1,5 eq, 1,05 mmol, 63 mg, 0,059 mL).
A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 2 dias. A mistura de reação foi então concentrada. O resíduo foi diluído com hexano e lavado com NaOH diluído, NaHCO3 saturado e salmoura. Após o extrato orgânico ter sido seco sobre sulfato de sódio, o solvente foi removido sob pressão reduzida. O resíduo foi retomado em uma mistura de hexano, acetato de etila e Et3N (80: 20: 1) e foi filtrado através de uma coluna curta de gel de sílica e lavado com a mesma mistura de solventes. A concentração do filtrado gerou o produto desejado como um óleo incolor (582 mg, 0,69 mmol, 98%). O produto foi usado na próxima etapa sem purificação adicional.
Síntese do Composto I-37
[0171] À uma solução de cloridrato de ácido 4-dimetilaminobutírico (1,71 mmol, 287 mg) e 4-dimetilaminopiridina (3 equiv, DMAP, 2,07 mmol, 253 mg) em acetonitrila (15 mL) foi adicionado DCC (2,2 equiv, 1,52 mmol, 313 mg) e a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 45 min. Uma solução de 19-2 (582 mg, 0,69 mmol) em CH2Cl2 (3 mL) foi adicionada e a mistura resultante foi agitada durante a noite. No dia seguinte, mais DCC (200 mg) foi adicionado e a agitação continuou durante o fim de semana (4 dias). A mistura foi então concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi retomado em uma mistura de hexano, acetato de etila e Et3N (80: 20: 1) e foi filtrado através de uma coluna curta de gel de sílica e lavado com a mesma mistura de solventes. A concentração do filtrado gerou um óleo amarelo. O produto foi ainda purificado por cromatografia flash em coluna seca sobre gel de sílica (0 a 5% de MeOH em clorofórmio com um traço de Et3N). O produto desejado foi obtido como um óleo incolor. EXEMPLO 20 Síntese de bis (2-hexildecil) 10-(N-decil-4-(dimetilamino) butanamido) nonadecanodioato (Composto I-38)
O O O
O O 20-1 H2N
O H N
O 20-2 O O
O N OH O N N O O
O O I-38 Síntese do 20-2
[0172] Uma solução da cetona 20-1 (0,92 g, 1,16 mmol) e 1-decilamina (2,03 mmol, 319 mg, 0,40 mL) em DCE (6 mL) foi agitada em temperatura ambiente durante 15 min, seguida pela adição de triacetoxiboro-hidreto de sódio (2,03 mmol, 429 mg) e AcOH (2,03 mmol, 121 mg, 0,115 mL). Depois de a mistura ter sido agitada em temperatura ambiente durante 2 dias, a mistura de reação foi concentrada. O resíduo foi diluído com hexano e lavado com NaOH diluído,
NaHCO3 saturado e salmoura. A fase orgânica foi separada e seca sobre sulfato de sódio. O extrato foi filtrado através de uma coluna curta de sílica gel e a coluna foi lavada com uma mistura de hexano/EtOAc/Et3N, 95: 5: 0 a 80: 20: 1). O produto desejado foi obtido como um óleo incolor (814 mg de óleo incolor, 0,87 mmol, 75% de rendimento).
Síntese de I-38
[0173] À uma solução de cloridrato de ácido 4-dimetilaminobutírico (2 equiv, 0,76 mmol, 127 mg), 4-dimetilaminopiridina (3 eq, 1,14 mmol, 139 mg) em CH3CN (5 mL) foi adicionado DCC (2,2 equiv, 0,84 mmol, 172 mg) e a mistura foi agitada em temperatura ambiente durante 45 min. Uma solução de 20-2 (350 mg, 0,38 mmol) em DCM (1 mL) foi adicionada e a mistura resultante foi agitada durante a noite. No dia seguinte, mais DCC (50 mg) foi adicionado e agitado por outro dia. A mistura foi então concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi retomado em uma mistura de hexano, acetato de etila e Et3N (80: 20: 1) e foi filtrado através de uma coluna curta de sílica gel e lavado com a mesma mistura de solventes. A concentração do filtrado gerou um óleo incolor. O produto foi ainda purificado por cromatografia em coluna de secagem flash em sílica gel (0 a 5% de MeOH em clorofórmio com um traço de Et3N). O produto desejado foi obtido como um óleo incolor (260 mg).
EXEMPLO 21 Síntese de bis (2-hexildecil) 10-(N-decil-4-(pirrolidin-1-il) butanamido) nonadecanodioato (Composto I-39)
Síntese do 21-1
[0174] À uma solução de ácido 4-bromobutírico (1,00 mmol, 167 mg) em DCM (3 mL) e DMF (uma pequena gota) foi adicionado cloreto de oxalil (3 eq, 3,00 mmol, 381 mg, 0,26 mL) em temperatura ambiente. A mistura foi agitada em temperatura ambiente durante a noite. A mistura de reação foi então concentrada em vácuo. O líquido/sólido residual (ligeiramente amarelo) foi dissolvido em 5 mL de DCM e foi adicionada uma solução de 20-2 (464 mg, 0,50 mmol) e trietilamina (0,42 mL) e DMAP (2 mg) em DCM (5 mL) em temperatura ambiente em 2 min.
Após a adição, a mistura resultante foi agitada em temperatura ambiente durante 2,5 h. TLC (hexano/acetato de etila = 9: 1) mostrou duas manchas principais. A mistura de reação foi então concentrada em temperatura ambiente sob pressão reduzida. O resíduo foi usado para a próxima reação sem qualquer purificação.
Síntese de I-39
[0175] O resíduo anterior foi retomado em uma mistura de pirrolidina (2,20 mL, 26 mmol) e THF (15 mL). A mistura foi transferida para um frasco de pressão e aquecida a 68 ºC durante a noite. A mistura foi resfriada e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi retomado em uma mistura de hexano, acetato de etila e Et3N (80: 20: 1) e foi filtrado através de uma coluna curta de sílica gel e lavado com a mesma mistura de solventes. A concentração do filtrado gerou óleo/sólido amarelo (359 mg). O produto em bruto (359 mg) foi ainda purificado por cromatografia em coluna de secagem flash em sílica gel (0 a 5% de MeOH em clorofórmio). O produto desejado foi obtido como um óleo incolor (165 mg).
[0176] As várias modalidades descritas acima podem ser combinadas para fornecer outras modalidades. Todas as patentes dos U.S, publicações de pedidos de patentes dos U.S, pedidos de patentes dos U.S, patentes estrangeiras, pedidos de patentes estrangeiras e publicações não patenteadas referidas nesta especificação e/ou listadas na Folha de Dados do pedido, incluindo US 62/791,566 e 62/890,469, são incorporados neste documento por referência, em sua totalidade. Aspectos das modalidades podem ser modificados, se necessário para empregar conceitos das várias patentes, pedidos e publicações para fornecer ainda outras modalidades. Estas e outras alterações podem ser feitas nas modalidades à luz da descrição detalhada acima. Em geral, nas reivindicações a seguir, os termos usados não devem ser interpretados para limitar as reivindicações às modalidades específicas divulgadas no relatório descritivo e nas reivindicações, mas devem ser interpretados para incluir todas as modalidades possíveis juntamente com o escopo completo de equivalentes aos quais tais reivindicações têm direito.
Consequentemente, as reivindicações não são limitadas pela divulgação.

Claims (77)

REIVINDICAÇÕES
1. Composto CARACTERIZADO pelo fato de que tem seguinte estrutura (I): (I) ou um sal, tautômero ou esteroisômero farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que: R1 é opcionalmente substituído C1-C24 alquil ou opcionalmente substituído C2-C24 alquenil; R2 e R3 são, cada um, independentemente opcionalmente substituído C1- C36 alquil; R4 e R5 são, cada um, independentemente opcionalmente substituído C1- C6 alquil, ou R4 e R5 juntos, unidos com o N ao qual estão ligados, formam um heterociclil ou heteroaril; L1, L2, e L3 são, cada um, independentemente opcionalmente substituído C1-C18 alquileno; G1 é uma ligação direta, -(CH2)nO(C=O)-, -(CH2)n(C=O)O-, ou –(C=O)-; G2 e G3 são, cada um, independentemente -(C=O)O- ou -O(C=O)-; e n é um número inteiro maior que 0.
2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que possui a seguinte estrutura (IA):
O R2 4 2
R O L O
N R5 L1 N L3 G1 R2 1 R O O .
(IA)
3. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que possui a seguinte estrutura (IB): .
(IB)
4. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, CARACTERIZADO pelo fato de que R1 é opcionalmente substituído C6-C18 alquil ou C14-C18 alquenil.
5. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, CARACTERIZADO pelo fato de que R1 é C8 alquil, C9 alquil, C10 alquil, C12 alquil, C14 alquil, ou C16 alquil.
6. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, CARACTERIZADO pelo fato de que R1 é C16 alquenil.
7. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que R 1 é não ramificado.
8. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que R 1 é ramificado.
9. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que R1 é não substituído.
10. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9, CARACTERIZADO pelo fato de que G1 é uma ligação direta, -(CH2)nO(C=O)-, ou - (CH2)n(C=O)O-.
11. Composto, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que G1 é uma ligação direta.
12. Composto, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que G1 é -(CH2)n(C=O)O- e n é maior do que 1.
13. Composto, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que n é 5, 6, 7, 8, 9 ou 10.
14. Composto, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que n é 7.
15. Composto, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que n é 8.
16. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, CARACTERIZADO pelo fato de que L1 é C1-C6 alquileno.
17. Composto, de acordo com a reivindicação 16, em CARACTERIZADO pelo fato de que L1 é C2 alquileno, C3 alquileno, ou C4 alquileno.
18. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, CARACTERIZADO pelo fato de que L1 é não ramificado.
19. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, em CARACTERIZADO pelo fato de que L1 é não substituído.
20. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, CARACTERIZADO pelo fato de que R2 é C8-C24 alquil.
21. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20,
CARACTERIZADO pelo fato de que R3 é C8-C24 alquil.
22. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, CARACTERIZADO pelo fato de que R2 e R3 são ambos C8-C24 alquil.
23. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, CARACTERIZADO pelo fato de que R2 e R3 são, cada um, independentemente C11 alquil, C12 alquil, C13 alquil, C14 alquil, C15 alquil, C16 alquil, C18 alquil, ou C20 alquil.
24. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, CARACTERIZADO pelo fato de que R2 é ramificado.
25. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, CARACTERIZADO pelo fato de que R3 é ramificado.
26. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, CARACTERIZADO pelo fato de que R2 e R3 cada um independentemente tem uma das seguintes estruturas: ou em que: R6 e R7 são, cada um, independentemente C2-C12 alquil.
27. Composto, de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato de que R2 e R3 cada um independentemente tem uma das seguintes estruturas: ; ; ; ; ou .
28. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, CARACTERIZADO pelo fato de que L2 e L3 são, cada um, independentemente C4- C10 alquileno.
29. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, CARACTERIZADO pelo fato de que L2 e L3 são ambos C5 alquileno.
30. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, CARACTERIZADO pelo fato de que L2 e L3 são ambos C6 alquileno.
31. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, CARACTERIZADO pelo fato de que L2 e L3 são ambos C8 alquileno.
32. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, CARACTERIZADO pelo fato de que L2 e L3 são ambos C9 alquileno.
33. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, CARACTERIZADO pelo fato de que L2 é não ramificado.
34. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, CARACTERIZADO pelo fato de que L3 é não ramificado.
35. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 34, CARACTERIZADO pelo fato de que L2 é não substituído.
36. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 35, CARACTERIZADO pelo fato de que L2 é não substituído.
37. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36, CARACTERIZADO pelo fato de que R4 e R5 são, cada um, independentemente C1- C6 alquil.
38. Composto, de acordo com a reivindicação 37, em CARACTERIZADO pelo fato de que R4 e R5 são ambos metil.
39. Composto, de acordo com a reivindicação 37, CARACTERIZADO pelo fato de que R4 e R5 são ambos etil.
40. Composto, de acordo com a reivindicação 37, CARACTERIZADO pelo fato de que R4 é metil e R5 é n-butil.
41. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36, R4 e R5 juntos, unidos com o N ao qual estão ligados, formam um heterociclil.
42. Composto, de acordo com a reivindicação 41, CARACTERIZADO pelo fato de que o heterociclil é um heterociclil de 5 membros.
43. Composto, de acordo com a reivindicação 42, CARACTERIZADO pelo fato de que o heterociclil tem a seguinte estrutura: .
44. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto é selecionado a partir dos compostos na Tabela 1.
45. Composição, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o composto de qualquer uma das reivindicações 1 a 44 e um agente terapêutico.
46. Composição, de acordo com a reivindicação 45, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende ainda um ou mais excipientes selecionados a partir de lipídeos neutros, esteroides e lipídeos conjugados com polímero.
47. Composição, de acordo com a reivindicação 46, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição compreende um ou mais lipídeos neutros selecionados a partir de DSPC, DPPC, DMPC, DOPC, POPC, DOPE e SM.
48. Composição, de acordo com a reivindicação 47, CARACTERIZADA pelo fato de que o lipídeo neutro é DSPC.
49. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 48, CARACTERIZADA pelo fato de que a razão molar do composto para o lipídeo neutro varia de cerca de 2: 1 a cerca de 8: 1.
50. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a
49, CARACTERIZADA pelo fato de que o esteroide é colesterol.
51. Composição, de acordo com a reivindicação 50, CARACTERIZADA pelo fato de que a razão molar do composto para o colesterol varia de 5: 1 a 1: 1.
52. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 51, CARACTERIZADA pelo fato de que o lipídeo conjugado com polímero conjugado é lipídeo peguilado.
53. Composição, de acordo com a reivindicação 52, CARACTERIZADA pelo fato de que a razão molar do composto para o lipídeo peguilado varia de cerca de 100: 1 a cerca de 20: 1.
54. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 52 ou 53, CARACTERIZADA pelo fato de que o lipídeo peguilado é PEG-DAG, PEG-PE, PEG-S-DAG, PEG-cer ou um dialquioxipropilcarbamato de PEG.
55. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 52 ou 53, CARACTERIZADA pelo fato de que o lipídeo peguilado tem a seguinte estrutura (II): (II) ou um sal, tautômero ou esteroisômero farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que: R8 e R9 são, cada um, independentemente uma cadeia alquil linear ou ramificada, saturada ou insaturada contendo de 10 a 30 átomos de carbono, em que a cadeia alquil é opcionalmente interrompida por uma ou mais ligações éster; e w tem um valor médio variando de 30 a 60.
56. Composição, de acordo com a reivindicação 55, CARACTERIZADO pelo fato de que R8 e R9 são, cada um, independentemente cadeias alquil lineares, saturadas contendo de 12 a 16 átomos de carbono.
57. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 55 ou 56, CARACTERIZADA pelo fato de que que a média de w é cerca de 49.
58. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 57, CARACTERIZADA pelo fato de que o agente terapêutico compreende uma dico nucleico.
59. Composição, de acordo com a reivindicação 58, CARACTERIZADA pelo fato de que o ácido nucleico é selecionado a partir de antissenso e RNA mensageiro.
60. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 59, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição compreende uma nanopartícula de lipídeo.
61. Método para administrar um agente terapêutico a um paciente em necessidade, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende preparar ou fornecer a composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 60, e administrar a composição ao paciente.
62. Nanopartícula de lipídeo compreendendo composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 44.
63. Nanopartícula de lipídeo, de acordo com a reivindicação 62, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende ainda um agente terapêutico.
64. Nanopartícula de lipídeo, de acordo com a reivindicação 63, CARACTERIZADA pelo fato de que o agente terapêutico compreende um ácido nucleico.
65. Nanopartícula de lipídeo, de acordo com a reivindicação 64,
CARACTERIZADA pelo fato de que o ácido nucleico é selecionado a partir de antissenso e RNA mensageiro.
66. Nanopartícula de lipídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 62 a 65, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende ainda um ou mais excipientes selecionados a partir de lipídeos neutros, esteroides e lipídeos conjugados com polímero.
67. Nanopartícula lipídica, de acordo com a reivindicação 66, CARACTERIZADA pelo fato de que os lipídeos neutros são selecionados a partir de DSPC, DPPC, DMPC, DOPC, POPC, DOPE e SM.
68. Nanopartícula de lipídeo, de acordo com a reivindicação 67, CARACTERIZADA pelo fato de que o lipídeo neutro é DSPC.
69. Nanopartícula de lipídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 66-68, CARACTERIZADA pelo fato de que a razão molar do composto para o lipídeo neutro varia de cerca de 2: 1 a cerca de 8: 1.
70. Nanopartícula de lipídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 66 a 69, CARACTERIZADA pelo fato de que o esteroide é colesterol.
71. Nanopartícula de lipídeo, de acordo com a reivindicação 70, CARACTERIZADA pelo fato de que a razão molar do composto para o colesterol varia de 5: 1 a 1: 1.
72. Nanopartícula de lipídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 66 a 71, CARACTERIZADA pelo fato de que o lipídeo conjugado com polímero é lipídeo peguilado.
73. Nanopartícula de lipídeo, de acordo com a reivindicação 72, CARACTERIZADA pelo fato de que a razão molar do composto para lipídeo peguilado varia de cerca de 100: 1 a cerca de 20: 1.
74. Nanopartícula lipídica, de acordo com as reivindicações 72 ou 73,
CARACTERIZADA pelo fato de que o lipídeo peguilado é PEG-DAG, PEG-PE, PEG-S-DAG, PEG-cer ou um dialquioxipropilcarbamato de PEG.
75. Nanopartícula de lipídeo, de acordo com as reivindicações 72 ou 73, CARACTERIZADA pelo fato de que o lipídeo peguilado tem a seguinte estrutura (II): (II) ou um sal, tautômero ou esteroisômero farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que: R8 e R9 são, cada um, independentemente uma cadeia alquil linear ou ramificada, saturada ou insaturada contendo de 10 to 30 átomos de carbono, em que a cadeia alquil é opcionalmente interrompida por uma ou mais ligações éster; and w tem um valor médio variando de 30 a 60.
76. Nanopartícula lipídica, de acordo com a reivindicação 75, CARACTERIZADA pelo fato de que R8 e R9 são, cada um, independentemente cadeias alquil lineares, saturadas contendo de 12 to 16 átomos de carbono.
77. Nanopartícula de lipídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 75 ou 76, CARACTERIZADA pelo fato de que que a média de w é cerca de 49.
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