ES2871537T3 - Nanopartículas lipídicas que comprenden agentes antiinflamatorios lipófilos y métodos de uso de las mismas - Google Patents

Nanopartículas lipídicas que comprenden agentes antiinflamatorios lipófilos y métodos de uso de las mismas Download PDF

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Abstract

Una nanopartícula lipídica antiinflamatoria que comprende: a) una fase lipídica; y b) al menos un agente antiinflamatorio lipófilo; y c) un segmento de ácido nucleico seleccionado entre ADN, ARNm, ARNpi, complejo Cas9-ARN guía y combinaciones de los mismos.

Description

DESCRIPCIÓN
Nanopartículas lipídicas que comprenden agentes antiinflamatorios lipófilos y métodos de uso de las mismas
Antecedentes
La administración segura y eficaz de los principios activos farmacéuticos a los tejidos y células diana es de suma importancia en el diseño de portadores farmacéuticos. Los portadores farmacéuticos conocidos, como los liposomas y las nanopartículas lipídicas (LNP, por las siglas del inglés lipid nanoparticles), facilitan la administración selectiva y específica de fármacos a los tejidos y las células diana, mejorando así su biodisponibilidad. Sin embargo, uno de los principales obstáculos en el desarrollo de estos portadores es la respuesta inmunogénica asociada a los componentes clave de estas formulaciones.
Los portadores liposómicos adecuados para la administración de polinucleótidos suelen incluir componentes lipídicos catiónicos que permiten la administración a través de la membrana celular en el citoplasma de las células diana. Se sabe que estos liposomas catiónicos activan el sistema inmunitario, lo que se ha utilizado en vacunas (Peer, D., Advanced Drug Delivery Reviews 64:1738-1748 (2012)). Por el contrario, las LNP están diseñadas para tener una carga neta nula a pH fisiológico de 7,4, reduciendo así, aunque no eliminando por completo, la respuesta inmunitaria asociada a que las partículas estén cargadas positivamente. Aunque los liposomas pueden facilitar la administración de fármacos a los tejidos y células diana, también activan el sistema inmunitario, lo que provoca una reacción de hipersensibilidad aguda, que aumenta el riesgo de choque anafiláctico. (Kumar, V. et al., Molecular Therapy-NucleicAcids, 3(e210): 1-7 (2014); Abrams, MT et al., Molecular Therapy, 18(1): 171-180 (2010)).
A pesar de los esfuerzos realizados para minimizar la respuesta inmunogénica asociada a los liposomas y las LNP, como la adición de un escudo de polietilenglicol a las LNP para evitar su reconocimiento por el sistema fagocítico mononuclear y el empleo de ARNpi modificado para minimizar la inmunoestimulación, siguen provocando una respuesta inmunitaria, lo que limita su eficacia como alternativas terapéuticas. (Kumar, V. et al., 2014, anteriormente citado). También se ha investigado la coadministración de un fármaco antiinflamatorio antes de la administración de liposomas o LNP, con resultados limitados. (Tao, W. et al., Molecular Therapy, 19(3): 567-575 (2011); Abrams et al. (2010), anteriormente citado). El tratamiento previo con dexametasona una hora antes de la administración de LNP201, una construcción liposómica, inhibió parcialmente los ARNm inflamatorios, pero no eliminó el efecto inflamatorio. (Abrams et al. (2010), anteriormente citado). Se encontraron resultados similares en ratas pretratadas con varios fármacos antiinflamatorios antes del ARNpi LNP05-SSB o del ARNpi LNP05-Apo5. (Tao, W. et al. (2011), anteriormente citado).
El efecto inmunoestimulador de las LNP sigue bloqueando su uso para la administración segura y eficaz de fármacos. Por consiguiente, existe la necesidad de desarrollar sistemas de administración de LNP eficaces con una mayor ventana terapéutica que no desencadenen una respuesta inflamatoria.
Sumario
La presente memoria descriptiva divulga, en parte, nanopartículas lipídicas antiinflamatorias que comprenden al menos un agente antiinflamatorio lipófilo. En una realización, se divulgan nanopartículas lipídicas antiinflamatorias que comprenden una fase lipídica y al menos un agente antiinflamatorio lipófilo. En otra realización, se divulgan nanopartículas lipídicas antiinflamatorias que comprenden además al menos un segmento de ácido nucleico.
En otra realización, se divulgan composiciones farmacéuticas que comprenden una pluralidad de nanopartículas lipídicas antiinflamatorias que comprenden una fase lipídica, al menos un agente antiinflamatorio lipófilo y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. En otra realización, se divulgan composiciones farmacéuticas que comprenden una pluralidad de nanopartículas lipídicas antiinflamatorias que comprenden una fase lipídica, al menos un agente antiinflamatorio lipófilo, y al menos un segmento de ácido nucleico, y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
También se divulgan métodos para administrar una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de nanopartículas lipídicas antiinflamatorias a un sujeto que las necesita.
En otra realización, se divulga un método de administración de al menos un segmento de ácido nucleico a una célula diana que comprende poner en contacto la célula con una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de nanopartículas lipídicas antiinflamatorias y una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un segmento de ácido nucleico.
En otra realización, se divulga un método de administración de al menos un segmento de ácido nucleico a un sujeto que lo necesita, que comprende la administración al sujeto de una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de nanopartículas lipídicas antiinflamatorias y una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un segmento de ácido nucleico.
También se divulga un método para tratar a un sujeto que padece una enfermedad o trastorno, que comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de nanopartículas lipídicas antiinflamatorias y una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un segmento de ácido nucleico.
En otra realización, se divulgan métodos para inhibir la respuesta inmunitaria asociada a la administración de LNP no antiinflamatorias, que comprenden la administración a un sujeto de una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de nanopartículas lipídicas antiinflamatorias divulgadas en el presente documento. Los métodos de inhibición de la respuesta inmunitaria incluyen la inhibición de la expresión o actividad de al menos un biomarcador o síntoma de una respuesta inmunitaria, por ejemplo: (a) inhibir la expresión o la actividad de los marcadores proinflamatorios; (b) reducir la inflamación (por ejemplo, el edema); y (c) reducir la producción de haptoglobina plasmática asociada a la inflamación o a una respuesta inmunitaria.
En otra realización más, se divulgan métodos para modular la expresión de proteínas o péptidos en las células diana de un sujeto que lo necesita, que comprenden la administración de una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de nanopartículas lipídicas antiinflamatorias divulgadas en el presente documento y una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un segmento de ácido nucleico.
En otra realización, se divulgan procesos para la preparación de las nanopartículas lipídicas antiinflamatorias. En una realización, se divulga un proceso para la preparación de nanopartículas lipídicas antiinflamatorias que comprende:
1. A) proporcionar al menos una solución acuosa que comprenda opcionalmente al menos un segmento de ácido nucleico;
2. B) proporcionar al menos una solución orgánica que comprenda al menos un agente antiinflamatorio lipófilo; 3. C) mezclar la al menos una solución acuosa con la al menos una solución orgánica para producir una solución de nanopartículas lipídicas que contenga una pluralidad de nanopartículas lipídicas.
Descripción detallada
Breve descripción de las figuras
La FIG. 1A ilustra las estructuras químicas de los componentes lipídicos ionizables presentes en las nanopartículas lipídicas antiinflamatorias.
La FIG. 1B ilustra las estructuras químicas de la rofleponida y los profármacos representativos de la rofleponida junto con el log (coeficiente de partición) calculado de octanol-agua utilizando ACD Chemsketch 2014.
La FIG. 1C ilustra las estructuras químicas de la budesónida y los profármacos representativos de la budesónida junto con el log (coeficiente de partición) calculado de octanol-agua utilizando ACD Chemsketch 2014.
Las FIGS. 2A-D ilustran (A): puntuación del edema a las 24 horas después de la administración; (B): concentración de haptoglobina plasmática a las 24 horas después de la administración; (C): concentraciones de citocinas/quimiocinas en plasma a las 8 y 24 horas después de la administración; y (D) concentraciones de la proteína de ARNm 1 frente al tiempo después de la administración subcutánea de p Bs (tampón fosfato, pH 7,4), LNP basadas en DLin-MC3-DMA sin y con palmitato de rofleponida (R-C16).
Las FIGS. 3A-C ilustran (A): la puntuación de edema a las 24 horas después de la administración; (B): la concentración de haptoglobina plasmática a las 24 horas después de la administración; (C): las concentraciones de proteína de ARNm 1 frente al tiempo después de la administración subcutánea de PBS (tampón fosfato, pH 7,4), LNP basadas en DLin-MC3-DMA sin y con palmitato de rofleponida (R-C16)/ARNm 1:1 p/p, 1:10 p/p y 1:30 p/p.
Las FIGS. 4A-C ilustran (A): la puntuación del edema a las 24, 48 y 72 horas después de la administración; (B): la concentración de haptoglobina plasmática frente al tiempo; (C): las concentraciones de proteína de ARNm 1 frente al tiempo después de la administración subcutánea de LNP que contienen palmitato de rofleponida (R-C16) o rofleponida.
La FIG. 5 ilustra la concentración plasmática de rofleponida frente al tiempo después de la administración subcutánea de LNP que contienen palmitato de rofleponida (R-C16, figura A) o rofleponida (figura B).
Las FIGS. 6A-C ilustran (A): la puntuación del edema; (B): la concentración de haptoglobina plasmática a las 24 horas de la administración; (C): las concentraciones de proteína de ARNm 1 en función del tiempo tras la administración subcutánea de LNP que contienen profármacos de rofleponida con diferentes longitudes de cadena de ácido graso: valerato de rofleponida (C5), miristato de rofleponida (C14), palmitato de rofleponida (C16) y estearato de rofleponida (C18).
Las FIGS. 7A-C ilustran (A): la puntuación de edema a las 24 horas después de la administración; (B) la concentración de haptoglobina plasmática a las 24 horas después de la administración; (C) las concentraciones de proteína de ARNm 1 frente al tiempo después de la administración subcutánea de las LNP DLin-MC3-DMA y Merck-32 frente a las LNP DLin-MC3/palmitato de rofleponida (R-C16) y Merck-32/palmitato de rofleponida (R-C16).
Las FIGS. 8A-C ilustran (A): la puntuación del edema a las 24 horas después de la administración comparando diferentes dosis de ARNm 1; (B) concentración de haptoglobina plasmática a las 24 horas después de la administración; (C) concentraciones de proteína de ARNm 1 frente al tiempo después de la administración subcutánea de las LNP DLin-MC3-DMA y Merck-32 (con miristato de rofleponida, R-C14) comparando diferentes dosis de ARNm 1.
Las FIGS. 9A-C ilustran (A): la puntuación del edema a las 24 horas después de la administración comparando diferentes dosis de ARNm 1; (B) la concentración de haptoglobina plasmática a las 24 horas después de la administración; (C) las concentraciones de proteína de ARNm 1 frente al tiempo después de la administración subcutánea de las LNP DLin-MC3-DMA, KL10 (sin/con R-C14) y Acuitas-5 (sin/con R-C14) comparando diferentes dosis de ARNm 1.
LAS FIGS. 10A-G ilustran (A): la puntuación de edema; (B): la concentración de haptoglobina plasmática a las 24 horas después de la administración; (C): las concentraciones de IL-6 en plasma a las 7 y 24 horas después de la administración; (D): las concentraciones de KC en plasma a las 7 y 24 horas después de la administración; (E) las concentraciones de IP-10 en plasma a las 7 y 24 horas después de la administración; (F): las concentraciones plasmáticas de MCP-1 a las 7 y 24 horas después de la administración; (G) las concentraciones de proteína de ARNm 1 frente al tiempo después de la administración subcutánea de LNP que contienen profármacos de budesónida con diferentes longitudes de cadena de ácidos grasos: miristato de budesónida (C14), palmitato de budesónida (C16) u oleato de budesónida (C18:1).
Nanopartículas lipídicas antiinflamatorias
De acuerdo con la presente divulgación, las nanopartículas lipídicas antiinflamatorias tienen un núcleo nanoestructurado denso a los electrones, producido por la mezcla microfluídica de soluciones que contienen lípidos en etanol con soluciones acuosas que contienen uno o más segmentos de ácido nucleico. Debe entenderse que las nanopartículas lipídicas antiinflamatorias divulgadas en el presente documento no tienen regiones acuosas continuas que superen el 50 % en volumen y, por lo tanto, excluyen los liposomas convencionales, tales como las vesículas unilamelares y similares.
En un aspecto, las nanopartículas lipídicas antiinflamatorias comprenden una fase lipídica y al menos un agente antiinflamatorio lipófilo. Las nanopartículas lipídicas pueden comprender además al menos un segmento de ácido nucleico.
Un aspecto de la presente divulgación se refiere a nanopartículas lipídicas antiinflamatorias que tienen un tamaño medio de partícula de aproximadamente 200 nm de diámetro o menos, por ejemplo, menor o igual a aproximadamente 100 nm, o, por ejemplo, menor o igual a aproximadamente 75 nm. En al menos una realización de la presente divulgación, las nanopartículas lipídicas antiinflamatorias tienen un tamaño medio de partícula en el intervalo de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 75 nm, por ejemplo, de aproximadamente 60 nm a aproximadamente 65 nm, tal como aproximadamente 64 nm.
En ciertas realizaciones, las nanopartículas lipídicas antiinflamatorias tienen una eficiencia de encapsulación (% EE) de segmentos de ácido nucleico de aproximadamente el 80 % o mayor, tal como por ejemplo, mayor de aproximadamente el 90 %, tal como por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente el 95 %-100 %, por ejemplo, aproximadamente el 99 %. Como se usa en el presente documento, el término "eficiencia de encapsulación" se refiere a la relación entre el segmento de ácido nucleico encapsulado en las nanopartículas lipídicas antiinflamatorias y el contenido total del segmento de ácido nucleico en la composición farmacéutica, medida mediante la lisis de las nanopartículas lipídicas utilizando un detergente, por ejemplo, Triton X-100. (Véase, por ejemplo Leung et al. (2012), anteriormente citado).
Fase lipídica
La fase lipídica de las nanopartículas lipídicas antiinflamatorias divulgadas en el presente documento puede construirse a partir de cualquier material utilizado en la tecnología convencional de nanopartículas, por ejemplo, lípidos ionizables, lípidos neutros, esteroles y lípidos conjugados con polímeros, siempre que la carga neta de las nanopartículas sea aproximadamente cero.
Los ejemplos no limitantes de lípidos ionizables incluyen, por ejemplo, lípidos que contienen una carga positiva a pH fisiológico, por ejemplo 1,2-dilinoleiloxi-3-dimetilaminopropano (DLin-DMA), dilinoleilmetil-4-dimetilaminobutirato (DLin-MC3-DMA, véase por ejemplo la Patente de EE. UU. n.° 8.158.601), 2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (DLin-KC2-DMA), Merck-32 (véase, por ejemplo, el documento WO 2012/018754), Acuitas-5 (véase, por ejemplo, el documento WO 2015/199952), KL-10 (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de EE.UU. 2012/0295832), C12-200 (véase, por ejemplo, Love, KT et al., p Na S, 107: 1864 (2009)) y similares. Los lípidos ionizables pueden estar presentes en una cantidad en el intervalo de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 90 %, tal como de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 80 %, por ejemplo, de aproximadamente el 25 % a aproximadamente el 75 %, por ejemplo, de aproximadamente el 40 % a aproximadamente el 60 %, tal como aproximadamente el 50 %, en porcentaje molar, en relación con el total de lípidos presentes en las nanopartículas lipídicas antiinflamatorias.
Los lípidos neutros tienen una carga neta cero a pH fisiológico. Los ejemplos no limitantes de lípidos neutros incluyen aquellos lípidos que existen en una forma no cargada o en una forma zwitteriónica neutra a pH fisiológico, tales como diestearoil fosfatidilcolina (DSPC), dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE), dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC), dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC) y similares. Los lípidos neutros pueden estar presentes en una cantidad en el intervalo de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 50 %, tal como de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 20 %, por ejemplo, del 7,5 % a aproximadamente el 12,5 %, por ejemplo, aproximadamente el 10 %, en porcentaje molar, en relación con el total de lípidos presentes en las nanopartículas lipídicas antiinflamatorias.
Los ejemplos no limitantes de esteróles incluyen el colesterol y similares. Los esteróles pueden estar presentes en una cantidad en el intervalo de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 90 %, tal como de aproximadamente el 20 % a aproximadamente el 50 %, por ejemplo, de aproximadamente el 35 %-45 %, tal como aproximadamente el 38,5 %, en porcentaje molar, en relación con el total de lípidos presentes en las nanopartículas lipídicas antiinflamatorias.
Los lípidos conjugados con polímeros comprenden una porción lipídica y una porción polimérica, tales como los lípidos pegilados que comprenden tanto una porción lipídica como una porción de polietilenglicol. Los ejemplos no limitantes incluyen dimiristoil fosfatidil etanolamina-poli(etilenglicol) 2000 (DMPE-PEG2000), DPPE-PEG2000, DMG-PEG2000, DPG-PEG2000, PEG2000-c-DOMG, PEG2000-c-DOPG y similares. El peso molecular del poli(etilenglicol) que puede utilizarse puede oscilar entre aproximadamente 500 y aproximadamente 10.000 Da, o entre aproximadamente 1.000 y aproximadamente 5.000 Da.
Los lípidos conjugados con polímeros pueden estar presentes en una cantidad en el intervalo de aproximadamente el 0 % a aproximadamente el 20 %, por ejemplo, de aproximadamente el 0,5% a aproximadamente el 5 %, tal como, por ejemplo, de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 2 %, por ejemplo, aproximadamente el 1,5 %, en porcentaje molar, en relación con el lípido total presente en las nanopartículas lipídicas antiinflamatorias.
En al menos una realización de la presente divulgación, las nanopartículas lipídicas antiinflamatorias pueden prepararse combinando múltiples componentes lipídicos. Por ejemplo, las nanopartículas lipídicas antiinflamatorias pueden prepararse combinando un lípido ionizable, un esterol, un lípido neutro y un lípido conjugado con polímeros en una relación molar de 50:40-Xlípido PEG:10:xlípido p e g , con respecto al total de lípidos presentes. Por ejemplo, las nanopartículas lipídicas antiinflamatorias pueden prepararse combinando un lípido ionizable, un esterol, un lípido neutro y un lípido conjugado con polímeros en una relación molar de 50:37:10:3 (mol/mol), o por ejemplo, una relación molar de 50:38,5:10:1,5 (mol/mol), o por ejemplo, 50:39,5:10:0,5 (mol/mol), o 50:39,75:10:0,25 (mol/mol).
En otra realización, puede prepararse una nanopartícula lipídica utilizando un lípido ionizable (tal como DLin-DMA, DLin-KC2-DMA, DLin-MC3-DMA, Merck-32, KL10 o Acuitas-5), un esterol (tal como el colesterol), un lípido neutro (tal como DSPC) y un lípido conjugado con polímeros (tal como DMPE-PEG2000) en una relación molar de aproximadamente 50:38,5:10:1,5 (mol/mol), con respecto a los lípidos totales presentes. Otro ejemplo no limitante es una nanopartícula lipídica antiinflamatoria que comprende un lípido ionizable (tal como DLin-DMA, DLin-KC2-DMA, DLin-MC3-DMA, Merck-32, KL10 o Acuitas-5), un esterol (tal como el colesterol), un lípido neutro (tal como DSPC) y un lípido conjugado con polímeros (tal como DMPE-PEG2000) en una relación molar de aproximadamente 47,7:36,8:12,5:3 (mol/mol), con respecto al total de lípidos presentes. Otro ejemplo no limitante es una nanopartícula lipídica antiinflamatoria que comprende un lípido ionizable (tal como DLin-DMA, DLin-KC2-DMA, DLin-MC3-DMA, Merck-32, KL10 o Acuitas-5), un esterol (tal como el colesterol), un lípido neutro (tal como DSPC) y un lípido conjugado con polímeros (tal como DMPE-PEG2000) en una relación molar de aproximadamente 52,4:40,4:6,4:0,8 (mol/mol), con respecto al total de lípidos presentes. En otra realización, un ejemplo no limitante es una nanopartícula lipídica antiinflamatoria que comprende un lípido ionizable (tal como DLin-DMA, DLin-KC2-DMA, DLin-MC3-DMA, Merck-32, KL10 o Acuitas-5), un esterol (tal como el colesterol), un lípido neutro (tal como DSPC) y un lípido conjugado con polímeros (tal como DMPE-PEG2000) en una relación molar de aproximadamente 53,5:41,2:4,6:0,7 (mol/mol), con respecto al total de lípidos presentes. Otro ejemplo no limitante es una nanopartícula lipídica antiinflamatoria que comprende un lípido ionizable (tal como C12-200), un esterol (tal como el colesterol), un lípido neutro (tal como DSPC) y un lípido conjugado con polímeros (tal como DMPE-PEG2000) en una relación molar de aproximadamente 30:50:19:1 (mol/mol), con respecto al total de lípidos presentes.
La selección de los lípidos ionizables, los lípidos neutros, los esteroles y/o los lípidos conjugados con polímeros que componen las nanopartículas lipídicas antiinflamatorias, así como la relación molar relativa de dichos lípidos entre sí, puede determinarse por las características del lípido o lípidos seleccionados, la naturaleza de las células diana previstas y las características del ácido nucleico, tal como, por ejemplo, el ARNm, que se va a administrar. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, el porcentaje molar de lípido ionizable en la nanopartícula lipídica antiinflamatoria puede ser mayor que aproximadamente el 10 %, mayor que aproximadamente el 20 %, mayor que aproximadamente el 30 %, mayor que aproximadamente el 40 %, mayor que aproximadamente el 50 %, mayor que aproximadamente el 60 % o mayor que aproximadamente el 70 %, en relación con los lípidos totales presentes. El porcentaje molar de lípido neutro en la nanopartícula lipídica antiinflamatoria puede ser mayor que aproximadamente el 5 %, mayor que aproximadamente el 10 %, mayor que aproximadamente el 20 %, mayor que aproximadamente el 30 % o mayor que aproximadamente el 40 %, en relación con el total de lípidos presentes. El porcentaje molar de esterol en la nanopartícula lipídica antiinflamatoria puede ser mayor que aproximadamente el 10 %, mayor que aproximadamente el 20 %, mayor que aproximadamente el 30 % o mayor que aproximadamente el 40 %, en relación con los lípidos totales presentes. El porcentaje molar de lípido conjugado con polímeros en la nanopartícula lipídica antiinflamatoria puede ser mayor que aproximadamente el 0,25 %, como por ejemplo mayor que aproximadamente el 1 %, mayor que aproximadamente el 1,5 %, mayor que aproximadamente el 2 %, mayor que aproximadamente el 5 % o mayor que aproximadamente el 10 %, en relación con el total de lípidos presentes.
De acuerdo con la presente divulgación, las nanopartículas lipídicas antiinflamatorias pueden comprender cada uno de los lípidos ionizables, lípidos neutros, esteroles y/o lípidos conjugados con polímeros en cualquier orientación útil deseada. Por ejemplo, el núcleo de la nanopartícula puede comprender un lípido ionizable y un esterol y posteriormente, una o más capas que comprenden lípidos neutros y/o lípidos conjugados con polímeros pueden rodear el núcleo. Por ejemplo, de acuerdo con una realización, el núcleo de la nanopartícula lipídica antiinflamatoria puede comprender un núcleo que comprende un lípido ionizable (por ejemplo, DLin-MC3-DMA), y un esterol (por ejemplo, colesterol) en cualquier proporción particular, rodeado por una monocapa lipídica neutra (por ejemplo, DSPC) de cualquier espesor particular, rodeado además por una monocapa lipídica exterior conjugada con polímeros de cualquier espesor particular. En estos ejemplos, el agente antiinflamatorio lipófilo y el segmento de ácido nucleico pueden incorporarse a cualquiera de las capas centrales o posteriores, dependiendo de la naturaleza de las células diana previstas, y de las características del ácido nucleico, como, por ejemplo, el ARNm, que se va a administrar. El núcleo y las capas externas pueden comprender además otros componentes típicamente incorporados a las nanopartículas lipídicas conocidas en la técnica.
Además, el porcentaje molar de lípidos ionizables, lípidos neutros, esteroles y/o lípidos conjugados con polímeros que comprenden las nanopartículas lipídicas antiinflamatorias puede seleccionarse para proporcionar un parámetro físico particular de la nanopartícula lipídica global, como el área superficial de uno o más de los lípidos. Por ejemplo, el porcentaje molar de lípidos ionizables, lípidos neutros, esteroles y/o lípidos conjugados con polímeros que componen las nanopartículas lipídicas antiinflamatorias puede seleccionarse para obtener una superficie por lípido neutro, por ejemplo, DSPC. A modo de ejemplo no limitante, el porcentaje molar de lípidos ionizables, lípidos neutros, esteroles y/o lípidos conjugados con polímeros puede determinarse para obtener un área superficial por DSPC de aproximadamente 1,0 nm2 a aproximadamente 2,0 nm2, por ejemplo, aproximadamente 1,2 nm2.
Agente antiinflamatorio lipófilo
De acuerdo con la presente divulgación, las nanopartículas lipídicas antiinflamatorias comprenden además una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente antiinflamatorio lipófilo.
Los términos "inflamación" e "inflamatorio" se refieren a una respuesta biológica que implica un aumento del sistema inmunitario, que puede incluir un incremento de la actividad proteica relacionada con la inflamación o una respuesta inmunitaria (por ejemplo, marcadores proinflamatorios como quimiocinas y citocinas, producción de haptoglobina plasmática) y síntomas de inflamación (por ejemplo, dolor, calor, enrojecimiento y/o edema). En algunas realizaciones, la inflamación es aguda. En algunas realizaciones, la inflamación es crónica.
El término "agente antiinflamatorio" incluye agentes que provocan una respuesta biológica o médica en un sujeto que reduce la inflamación (ya sea aguda o crónica) o reduce la respuesta inmunitaria, por ejemplo, reduciendo o inhibiendo la actividad enzimática o proteica relacionada con la inflamación o una respuesta inmunitaria (p. ej., inhibición de los marcadores proinflamatorios o reducción de la producción de haptoglobina plasmática); mejorando uno o más síntomas de inflamación o una respuesta inmunitaria (por ejemplo, dolor, enrojecimiento, calor o edema); o ralentizando o retrasando el proceso inflamatorio o la respuesta inmunitaria.
El término "agente antiinflamatorio lipófilo" se refiere a los agentes antiinflamatorios que presentan un valor logP de aproximadamente 5,0 o mayor. El término "logP" se refiere a la determinación de la función logarítmica de base 10 del coeficiente de partición, P; en donde P es la relación relativa de la concentración de un compuesto en una fase orgánica respecto a la concentración del mismo compuesto en una fase acuosa. La naturaleza lipófila de los agentes antiinflamatorios puede lograrse mediante la conversión de las fracciones hidrófilas de un agente antiinflamatorio en fracciones lipófilas, por ejemplo, mediante la conversión de un grupo carboxilo, un grupo amino, un grupo hidroxilo u otro grupo hidrófilo en un alquilo y ésteres de alquilo, ésteres de ácido, arilo y ésteres de arilo, ésteres de heteroarilo, grupos amida u otro grupo lipófilo. Los agentes antiinflamatorios lipófilos del presente documento presentan un valor logP de aproximadamente 5 o mayor. Los agentes antiinflamatorios lipófilos pueden sintetizarse para aumentar su valor logP modificando el agente antiinflamatorio para que sea más lipófilo, como se ha descrito anteriormente. El agente antiinflamatorio puede prepararse mediante técnicas conocidas, como la esterificación o la alquilación de uno o varios de los grupos hidrófilos presentes en la molécula del fármaco original. (Véase, por ejemplo, Waring, MJ, Expert Opin. Drug Discov., 5(3): 235-248 (2010).
La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz", que precede al menos a un agente antiinflamatorio lipófilo se refiere a la cantidad de agente antiinflamatorio que inhibe y/o mejora alguno o todos los biomarcadores o síntomas de una respuesta inflamatoria asociada a la administración de LNP no antiinflamatorias.
La expresión "LNP no antiinflamatorias" se refiere a las nanopartículas lipídicas que no comprenden un agente antiinflamatorio.
Los agentes antiinflamatorios conocidos incluyen, sin limitación, corticosteroides (por ejemplo, rofleponida, budesónida, etc.), e inhibidores de citocinas (por ejemplo, JAK1, JAK2, JAK3, TRL1-9, NF-Kb, IRAK-1, IRAK-2, IRAK-4, IRF-3, TBK-1, TrAf -3, p38, IKKe, etc.) y similares.
En al menos una realización de la presente divulgación, el agente antiinflamatorio lipófilo es un profármaco de rofleponida. Los ejemplos de profármacos de rofleponida incluyen, pero sin limitación, el valerato de rofleponida (C5), el caproato de rofleponida (C6), el caprilato de rofleponida (C8), el caprato de rofleponida (C10), el laurato de rofleponida (C12), el miristato de rofleponida (C14), el palmitato de rofleponida (C16) o el estearato de rofleponida (C18).
En otra realización, el agente antiinflamatorio lipófilo es un profármaco de budesónida. Los ejemplos no limitantes incluyen el miristato de budesónida (C14), el palmitato de budesónida (C16), el estearato de budesónida (C18), el oleato de budesónida (C18:1) y el linoleato de budesónida (C18:2).
Los agentes antiinflamatorios lipófilos pueden estar presentes en una cantidad en el intervalo de aproximadamente el 0,001 % a aproximadamente el 50 %, en peso, en relación con el peso total de las nanopartículas lipídicas antiinflamatorias. En algunas realizaciones, los agentes antiinflamatorios lipófilos pueden estar presentes en una cantidad en el intervalo de aproximadamente el 0,5 % a aproximadamente el 20 %, tal como, por ejemplo de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 10 %, por ejemplo, aproximadamente el 8 %, en peso, en relación con el peso total de las nanopartículas lipídicas antiinflamatorias.
Segmento del ácido nucleico
De acuerdo con la presente divulgación, las nanopartículas lipídicas antiinflamatorias pueden comprender además una cantidad terapéuticamente eficaz de un segmento de ácido nucleico, que puede estar asociado sobre la superficie de las nanopartículas lipídicas antiinflamatorias y/o encapsulado dentro de las mismas nanopartículas lipídicas antiinflamatorias.
La expresión "segmento de ácido nucleico" se entiende como uno o más segmentos de ácido nucleico seleccionados entre oligonucleótidos antisentido, ADN, ARNm, ARNpi, complejo Cas9-ARN guía o combinaciones de los mismos. Los segmentos de ácido nucleico del presente documento pueden ser de tipo silvestre o modificados. En al menos una realización, las nanopartículas lipídicas antiinflamatorias pueden comprender una pluralidad de segmentos de ácido nucleico diferentes. En otra realización, al menos uno de los segmentos de ácido nucleico, de tipo silvestre o modificado, codifica un polipéptido de interés.
La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz", precediendo a al menos un segmento de ácido nucleico, se refiere a una cantidad de ácido nucleico suficiente para modular la expresión de proteínas en un tejido y/o tipo de célula diana. En algunas realizaciones, una cantidad terapéuticamente eficaz del al menos un segmento de ácido nucleico es una cantidad suficiente para tratar una enfermedad o trastorno asociado con la proteína expresada por el al menos un segmento de ácido nucleico.
En al menos una realización, la relación en peso entre la fase lipídica total y el segmento de ácido nucleico oscila de aproximadamente 40:1 a aproximadamente 1:1, como por ejemplo aproximadamente 10:1. Esto corresponde a una relación molar aproximada de lípido ionizable a monómero de ácido nucleico de aproximadamente 3:1. En otro ejemplo, la relación en peso entre la fase lipídica total y el segmento de ácido nucleico oscila de aproximadamente 30:1 a aproximadamente 1:1, tal como aproximadamente 17:1, lo que corresponde a una relación molar aproximada entre el lípido ionizable y el monómero de ácido nucleico de aproximadamente 6:1. Sin embargo, la relación molar relativa de la fase lipídica y/o de los componentes de la fase lipídica con respecto al monómero de ácido nucleico puede determinarse por la naturaleza de las células diana previstas y las características del segmento de ácido nucleico y, por lo tanto, no se limita en su alcance a las realizaciones identificadas anteriormente.
En otra realización, las nanopartículas lipídicas antiinflamatorias comprenden agentes antiinflamatorios lipófilos y un segmento de ácido nucleico en un intervalo de relación en peso de aproximadamente 10:1 (agentes antiinflamatorios lipófilos a segmento de ácido nucleico) a aproximadamente 1:100. En otra realización, la relación en peso del segmento de ácido nucleico al total de lípidos presentes en las nanopartículas lipídicas oscila de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 1:50, tal como de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:10.
Composiciones
Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación comprenden las nanopartículas lipídicas antiinflamatorias divulgadas en el presente documento, una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente antiinflamatorio y una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un segmento de ácido nucleico, y/o uno o más excipientes, portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables. Como se usa en el presente documento, la expresión "excipiente, portador o diluyente farmacéuticamente aceptable" incluye compuestos, materiales, composiciones y/o formas farmacéuticas que son, dentro del ámbito del buen juicio médico, adecuados para su uso en contacto con los tejidos de los seres humanos y los animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, en consonancia con una relación beneficio/riesgo razonable. En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas pueden comprender además al menos un agente dirigido a los tejidos, por ejemplo, conjugados peptídicos como DSPE-PEG3400-CRPPR o DSPE-CRPPR y similares.
Las composiciones farmacéuticas pueden estar en una forma adecuada para administración parenteral. Dependiendo de la aplicación terapéutica, para la administración in vivo, las composiciones que comprenden nanopartículas lipídicas antiinflamatorias divulgadas en el presente documento pueden administrarse a un sujeto que las necesite por vía intravenosa, intradérmica, intramuscular, subcutánea, sublingual, intratumoral, intracardiaca, por instilación intratraqueal, bronquial y/o por inhalación.
Las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de una suspensión acuosa o inyectable estéril, que puede formularse de acuerdo con procedimientos conocidos. Una preparación inyectable estéril también puede ser una suspensión inyectable estéril en un tampón no tóxico parenteralmente aceptable. En otras realizaciones, la composición farmacéutica puede liofilizarse, obteniéndose en forma de un polvo seco, en donde el polvo seco puede reconstituirse posteriormente para su administración según sea necesario. Las composiciones de polvo seco pueden comprender además agentes de carga, por ejemplo, sacarosa o trehalosa.
Las composiciones farmacéuticas líquidas pueden nebulizarse mediante el uso de gases inertes. Las suspensiones nebulizadas se pueden inhalarse directamente desde el dispositivo nebulizador o el dispositivo nebulizador se puede acoplar a una mascarilla o a un respirador de presión positiva intermitente. Además, las formas farmacéuticas sólidas también pueden administrarse por inhalación mediante inhaladores de polvo seco. Las composiciones farmacéuticas en suspensión o en polvo seco pueden administrarse por vía oral o nasal a partir de dispositivos que suministran la composición farmacéutica de manera adecuada.
La cantidad de segmento de ácido nucleico que se combina con uno o más excipientes para producir una forma farmacéutica unitaria variará necesariamente según el sujeto tratado y la vía de administración particular. Para más información sobre las vías de administración y las pautas posológicas, se remite al lector al capítulo 25.3 del volumen 5 de Comprehensive Medicinal Chemistry (Corwin Hansch; Presidente del Consejo Editorial), Pergamon Press 1990.
Además, en el presente documento se proporciona un kit farmacéutico que comprende una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente antiinflamatorio y una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un segmento de ácido nucleico, como se divulga en el presente documento. Dichos kits pueden comprender además varios componentes de kits farmacéuticos convencionales, como envases que comprenden adyuvantes, diluyentes o portadores farmacéuticamente aceptables, y contenedores adicionales fácilmente evidentes para los expertos en la materia. También pueden incluirse en el kit instrucciones, ya sea en forma de prospectos o etiquetas, que indiquen las cantidades de los componentes que deben administrarse, las pautas de administración y/o las pautas para mezclar los componentes.
Métodos
En una realización, la presente divulgación proporciona un método para administrar composiciones farmacéuticas que comprenden una pluralidad de nanopartículas lipídicas antiinflamatorias a un sujeto que lo necesita.
El término "sujeto" incluye a los mamíferos de sangre caliente, por ejemplo, primates, vacas, cerdos, ovejas, perros, gatos, conejos, ratas y ratones. En algunas realizaciones, el sujeto es un primate, por ejemplo, un ser humano. En algunas realizaciones, el sujeto necesita tratamiento (por ejemplo, el sujeto se beneficiaría biológicamente o médicamente del tratamiento).
Las nanopartículas lipídicas antiinflamatorias divulgadas en el presente documento pueden servir además como plataformas para la administración selectiva de, por ejemplo, segmentos de ácidos nucleicos a las células y tejidos diana, como oligonucleótidos antisentido, ADN, ARNm, ARNpi, complejo Cas9-ARN guía. Por tanto, en una realización, es un método de administración de al menos un segmento de ácido nucleico a una célula que comprende por en contacto la célula, in vitro o in vivo, con una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de nanopartículas lipídicas antiinflamatorias y una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un segmento de ácido nucleico. En algunas realizaciones, el segmento de ácido nucleico modula la expresión, por ejemplo, aumentando o disminuyendo la expresión, o regulando positiva o negativamente la expresión del polipéptido.
Otra realización proporciona un método para suministrar una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un segmento de ácido nucleico a un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de nanopartículas lipídicas antiinflamatorias y una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un segmento de ácido nucleico.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden una pluralidad de nanopartículas lipídicas antiinflamatorias y al menos un segmento de ácido nucleico divulgado en el presente documento pueden utilizarse para tratar una amplia variedad de trastornos y enfermedades caracterizados por la subexpresión de un polipéptido en un sujeto, la sobreexpresión de un polipéptido en un sujeto y/o la ausencia/presencia de un polipéptido en un sujeto. Por consiguiente, se divulgan métodos para tratar a un sujeto que padece una enfermedad o trastorno, que comprenden administrar al sujeto una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de nanopartículas lipídicas antiinflamatorias y una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un segmento de ácido nucleico.
Se divulgan además métodos para inhibir la respuesta inmunitaria asociada a la administración de LNP no antiinflamatorias, que comprenden la administración de una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de nanopartículas lipídicas antiinflamatorias que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente antiinflamatorio lipófilo a un sujeto que lo necesita. Por ejemplo, las nanopartículas lipídicas antiinflamatorias de acuerdo con la presente divulgación pueden inhibir y/o mejorar la expresión o actividad de al menos un biomarcador o síntoma de una respuesta inmunitaria. En al menos una realización, los métodos divulgados en el presente documento reducen y/o inhiben la inflamación en el lugar de la inyección (según lo determinado por la puntuación de edema), reducen y/o inhiben la producción de haptoglobina plasmática y reducen y/o inhiben la cantidad de marcadores proinflamatorios (por ejemplo, citocinas, quimiocinas). Por tanto, la presente divulgación incluye métodos para inhibir la expresión o actividad de marcadores proinflamatorios, reducir la inflamación (por ejemplo, el edema) y para reducir la producción de haptoglobina plasmática, que comprenden la administración de una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de nanopartículas lipídicas antiinflamatorias que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente antiinflamatorio lipófilo y una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un segmento de ácido nucleico.
En al menos una realización, se observa una reducción o inhibición del edema. En otra realización, se observa una reducción o inhibición de los niveles de haptoglobina plasmática. En otra realización, se observa una reducción o inhibición de los marcadores inflamatorios plasmáticos. En cualquiera de los métodos divulgados, no se inhibe la actividad diana del segmento de ácido nucleico encapsulado. Por ejemplo, se divulgan métodos para aumentar la expresión de proteínas en las células, que comprenden la administración de una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de nanopartículas lipídicas antiinflamatorias divulgadas en el presente documento que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente antiinflamatorio y una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un segmento de ácido nucleico.
Los ejemplos no limitantes de marcadores proinflamatorios incluyen citocinas y quimiocinas, por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IP-10, IL-12 (p40), IL-12 (p70), IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, Exotaxina, FGF-básico, G-CSF, GM-CSF, LIF, MIG, MIP-1, MIP-2, MCP-1, INF-y, INFa2, RANTES, TNFa, e IL-1 p. Por ejemplo, los métodos divulgados en el presente documento reducen y/o inhiben el edema, y reducen y/o inhiben la producción de haptoglobina plasmática y/o reducen y/o inhiben la producción de marcadores proinflamatorios asociados a la administración de LNP no antiinflamatorias en un porcentaje mayor que los niveles de control.
Como se usa en el presente documento, la expresión "reduce y/o inhibe" se refiere a un cambio (positivo o negativo) de aproximadamente un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 por ciento o más en comparación con un nivel de control. Como se usa en el presente documento, la expresión "nivel de control" indica una muestra o sujeto no tratado, o una muestra o sujeto tratado con nanopartículas lipídicas sin el agente antiinflamatorio lipófilo divulgado. A modo de ejemplo, un nivel de control es el nivel de expresión o actividad en una muestra de control en ausencia de un agente antiinflamatorio lipófilo.
Por ejemplo, los métodos divulgados en el presente documento reducen y/o inhiben la producción de IL-6, IL-8, KC, IP-10 y MCP-1 en un porcentaje de aproximadamente el 80 % o mayor, que comprenden la administración de una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de nanopartículas lipídicas antiinflamatorias a un sujeto que lo necesita, por ejemplo, aproximadamente un 85 % o mayor.
También se divulgan en el presente documento métodos para inhibir el edema en el sitio de inyección asociado con la administración de LNP no antiinflamatorias, en donde el método comprende la administración de una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de nanopartículas lipídicas antiinflamatorias a un sujeto que lo necesita. Por ejemplo, los métodos divulgados en el presente documento no producen prácticamente ningún edema en el lugar de la inyección. Como se usa en el presente documento, la expresión "prácticamente sin edema" se entiende como la ausencia de hinchazón y/o enrojecimiento visibles a simple vista.
También se divulgan métodos para inhibir la producción de haptoglobina plasmática asociada a la administración de LNP no antiinflamatorias, que comprenden la administración de una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de nanopartículas lipídicas antiinflamatorias a un sujeto que lo necesita. De acuerdo con al menos una realización, los métodos del presente documento inhiben la producción de haptoglobina plasmática en un porcentaje de aproximadamente el 60 % o mayor, que comprenden la administración de una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de nanopartículas lipídicas antiinflamatorias a un sujeto que lo necesita, por ejemplo, de aproximadamente el 80 % o mayor. En otra realización, los métodos del presente documento comprenden la administración de una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de nanopartículas lipídicas antiinflamatorias a un sujeto que lo necesita mientras se mantienen los niveles normales de haptoglobina plasmática. Como se usa en el presente documento, la expresión "niveles normales de haptoglobina plasmática" incluye niveles de haptoglobina plasmática en el intervalo de 3200 ng/ml -65000 ng/ml.
Además, se divulgan métodos para aumentar la expresión de proteínas en las células, que comprenden la administración de una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de nanopartículas lipídicas antiinflamatorias divulgadas en el presente documento, a un sujeto que lo necesita. En al menos una realización, la expresión de la proteína puede aumentarse en un factor de aproximadamente 2 hasta 24 horas. En otra realización, la expresión de la proteína puede aumentarse en un factor de aproximadamente 3 hasta 72 horas.
Ejemplos
Los aspectos de la presente divulgación pueden definirse además por referencia a los siguientes ejemplos no limitantes, que describen en detalle la preparación de nanopartículas lipídicas y composiciones de la presente divulgación y métodos para utilizar nanopartículas lipídicas de la presente divulgación.
Preparación de LNP que contienen ARNm
Se preparó una solución de ARNm 1 en tampón citrato mezclando ARNm 1 disuelto en agua MilliQ, tampón citrato 100 mM (pH 3) y agua MilliQ para obtener una solución de citrato 50 mM. Se preparó una solución de lípidos en etanol (99,5 %) con cuatro componentes lipídicos diferentes: lípidos ionizables (DLin-MC3-DMA, Merck-32, KL10 o Acuitas-5); colesterol (Sigma-Aldrich); DSPC (diestearoil fosfatidil colina, Avanti Polar Lipids Inc); y DMPE-PEG2000 (dimiristoil fosfatidil etanolamina-poli(etilenglicol) 2000, NOF Corporation). Las estructuras químicas de los lípidos ionizables se muestran en la figura 1A. La concentración total de lípidos en todos los experimentos fue de 12,5 mM. Se prepararon nanopartículas lipídicas que contenían profármacos de agentes antiinflamatorios lipófilos añadiendo el profármaco a la solución lipídica de etanol. Las estructuras químicas de la rofleponida y de los diferentes profármacos abreviadas como R-C5, R-C14, R-C16 y R-C18 según las longitudes de las cadenas de ácidos grasos, se muestran en la figura 1B. En la figura 1C se muestran las estructuras químicas de la budesónida y de los diferentes profármacos, abreviados como B-C14, B-C16 y B-C18:1, en función de las longitudes de las cadenas de ácidos grasos.
Las soluciones de ARNm y de lípidos se mezclaron en un sistema de mezcla microfluídica NanoAssemblr (Precision Nanosystems, Vancouver, BC, Canadá) con una relación de mezcla de Ag:EtOH = 3:1 y un flujo constante de 12 ml/min. En el momento de la mezcla, la relación entre los átomos de nitrógeno del lípido ionizable y los átomos de fósforo de la cadena de ARNm era igual a 3,1.
Se desecharon los primeros 0,2-0,35 ml y los últimos 0,05-0,1 ml de la suspensión de LNP preparada, mientras que el resto del volumen se recogió como fracción de muestra. De la fracción de muestra se inyectaron 25 |jl de muestra en 975 j l de tampón fosfato 10 mM a pH 7,4 y se utilizaron para medir el tamaño de partícula de intensidad media en un instrumento Malvern ZetaSizer (ZetaSizer Nano ZS, Malvern Instruments Inc., Westborough, MA, EE. UU.) ("tamaño de partícula antes de la diálisis") y el índice de polidispersidad (PDI). El volumen de muestra restante se transfirió inmediatamente a un casete de diálisis Slide-a-lyzer G2 (10000 MWCO, ThermoFischer Scientific Inc.) y se dializó durante la noche a 4 °C contra PBS (pH 7,4). El volumen del tampón PBS era de 500-1000 veces el volumen de la fracción de la muestra. A continuación, se recogió la fracción de la muestra y de este volumen se inyectaron 25 j l en 975 j l de tampón fosfato 10 mM, pH 7,4, y se midió de nuevo el tamaño de las partículas (tamaño de las partículas después de la diálisis), así como el PDI.
La concentración final de ARNm y el porcentaje de eficacia de encapsulación (% EE) se midieron con el kit de ensayo Quant-it Ribogreen (ThermoFischer Scientific Inc.) utilizando Triton-X100 para disolver las LNP.
Experimentos in vivo con ratones
Se administraron a diferentes grupos de 5 ratones (hembra, edad -12 semanas, Crl:Cd1 (ICR), Charles River) PBS (control negativo) o ARNm 1 formulado en nanopartículas lipídicas. Antes de la administración, se anestesió ligeramente a los ratones con isoflurano al 5 % y se rasuró la zona de inyección. A continuación, las formulaciones se inyectaron por vía subcutánea (5 ml/kg o 0,3 mg de ARNm/kg) en la región intraescapular a diferentes grupos de ratones. Se tomaron muestras de sangre después de la dosis y se preparó el plasma por centrifugación. Se transfirieron alícuotas de plasma a criotubos de polipropileno de 0,5 ml en forma de U (Sarstedt Microtube con tapa Ref n.° 72.730) y se almacenaron congelados hasta la cuantificación de las concentraciones de haptoglobina, citocinas/quimiocinas y proteína de ARNm 1. En algunos estudios, también se llevó a cabo la cuantificación del agente antiinflamatorio lipófilo en muestras de plasma. A las 24 horas de la administración, se evaluaron los signos clínicos de respuesta inflamatoria presionando suavemente el dedo sobre la zona de la inyección para determinar el edema y se juzgó por inspección visual como edema o no edema en los diferentes ratones. Se sumó el número de ratones que mostraban signos visibles de edema por grupo (cada grupo tenía 5 ratones) para obtener una puntuación de edema de 0 a 5.
Cuantificación de la haptoglobina plasmática
Las concentraciones plasmáticas de haptoglobina se midieron con el kit MILLIPLEX® MAP Mouse Acute Phase panel 2 de EMD Millipore (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania). La muestra se diluyó primero 1:20000 con tampón de ensayo y después, junto con los patrones y los QC, se colocó en una placa de 96 pocillos. A continuación, se añadió una solución que contenía perlas. Las perlas eran microesferas magnéticas, cada una de las cuales estaba recubierta con un anticuerpo específico. La mezcla se incubó durante la noche a 4 °C y después se incubó la mezcla de reacción con el conjugado de estreptavidina-PE para completar la reacción en la superficie de cada microesfera. La placa se leyó en el analizador Luminex® 100. Se identificó cada microesfera individual y se cuantificó el resultado de su bioensayo a partir de las señales del indicador fluorescente. La concentración se midió utilizando los datos de la intensidad media de fluorescencia (IMF) mediante un método de ajuste de curvas logísticas de 5 parámetros.
Cuantificación de citocinas/quimiocinas en plasma
Las concentraciones plasmáticas de citocinas/quimiocinas murinas se midieron con el kit de microesferas magnéticas MlLLlPLEX® MAP Mouse Cytokine de EMD Millipore (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania) para la cuantificación simultánea de las citocinas: IL-6, KC, MCP-1 e IP-10. Las muestras se diluyeron primero a 1:2 con tampón de ensayo y posteriormente, junto con los patrones y los QC, se colocaron en una placa de 96 pocillos. Se añadió una solución con perlas. Las perlas son microesferas magnéticas, cada una de las cuales está recubierta con un anticuerpo específico. La mezcla se incubó durante la noche a 4 °C y después se incubó la mezcla de reacción con el conjugado de estreptavidina-PE para completar la reacción en la superficie de cada microesfera. La placa se leyó en el analizador Luminex® 100. Se identificó cada microesfera individual y se cuantificó el resultado de su bioensayo a partir de las señales del indicador fluorescente. La concentración se midió utilizando los datos de la intensidad media de fluorescencia (IMF) mediante un método de ajuste de curvas logísticas de 5 parámetros.
Cuantificación de la proteína de ARNm 1 en el plasma
La proteína de ARNm 1 se midió como un solo analito con las perlas magnéticas Milliplex Human Liver Protein [Merck Millipore, Darmstadt, Alemania]. El ensayo se realizó utilizando el sistema Bioplex Multiplex Suspension Array, Luminex 100TM y el programa informático de ajuste de curvas Bioplex Manager 6.1 [Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA]. Brevemente, el ensayo se realizó según un protocolo modificado basado en las instrucciones del fabricante, con puntos de calibración adicionales para ampliar el rango inferior de la curva patrón. Los datos de las muestras se calcularon a partir de la curva patrón (ajuste de la curva 5PL).
Cuantificación del agente antiinflamatorio lipófilo en el plasma
La concentración del agente antiinflamatorio lipófilo en el plasma se determinó por precipitación de proteínas seguida de cromatografía líquida con detección por espectrometría de masas. Una muestra de plasma de 50 |jl se precipitó con 180 |jl de ácido fórmico al 0,2 % en acetonitrilo que contenía 10 nmol/l de ácido 5,5-dietil-1,3-difenil-2-iminobarbitúrico como marcador de volumen. Tras agitar durante 3 minutos y centrifugar (4000 rpm, 4 °C, 20 min), se tomó el sobrenadante y se analizó. El análisis del sobrenadante se llevó a cabo en una columna de HPLC de fase inversa corta con elución de gradiente rápido y detección EM/EM utilizando un instrumento de triple cuadrupolo con ionización por electropulverización y adquisición de monitorización de reacción múltiple (MRM).
Ejemplo 1: LNP que contienen palmitato de rofleponida/ARN (1:1 p/p)
La composición molar de los lípidos utilizados para preparar la solución lipídica fue DLin-MC3-DMA:DSpC:colesterol:DMPE-PEG2000 = 50:10:38,5:1,5 (mol/mol). Además, la solución también contenía palmitato de rofleponida (R-C16) en una cantidad que daba lugar a una concentración total de R-C16 = 0,25 mM en la solución de LNP antes de la diálisis. La composición molar final de los cuatro lípidos y del R-C16 en las LNP se indica en la tabla 1.
Se mezclaron una alícuota de 1,05 ml de la solución de ARNm 1 y 0,35 ml de la solución de lípido y R-C16 de acuerdo con el proceso descrito anteriormente. Además, se prepararon nanopartículas amorfas de R-C16 que sólo contenían R-C16 y DMPE-PEG2000 ("control de R-C16") en las mismas condiciones de mezcla descritas anteriormente. El tamaño de las partículas se midió inmediatamente después de la preparación utilizando el protocolo descrito para las LNP, tras lo cual también se dializaron estas partículas. Los tamaños de partícula medidos antes y después de la diálisis y el % EE se presentan en la tabla 1a a continuación.
Tabla 1a. C m i i n m l r fin l m ñ r í l m i EE l m r 1 2
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Para determinar la cantidad de palmitato de rofleponida (R-C16) incorporado en las LNP, se ultracentrifugaron 900 j l de las muestras a 500000 g durante 60 minutos y se analizó la fracción inferior de 300 j l y la muestra original (no centrifugada) para determinar el contenido de DLin-MC3-DMA y R-C16 utilizando un sistema de HPLc con señales detectadas mediante un detector PDA-CAD. Para DLin-MC3-DMA se utilizó la señal CAD y para R-C16 se utilizó el máximo de absorción UV a 235 nm y se determinaron las concentraciones con una curva patrón externa. La proporción analizada entre los dos componentes se comparó con la proporción en la muestra original. Además, la concentración de R-C16 en las diferentes fracciones de las muestras de LNP se comparó con la concentración de R-C16 en las muestras que contenían nanopartículas de sólo R-C16 y DMPE-PEG2000 ("control de R-C16"). El análisis de la muestra de "control R-C16" mostró que, tras la ultracentrifugación, el palmitato de rofleponida estaba completamente localizado en la fase inferior, a diferencia de la muestra de LNP que contenían R-C16. Esto indica que el palmitato de rofleponida, que es completamente insoluble en agua, no forma partículas de fármaco separadas en la mezcla, sino que se incorpora a las LNP.
Los resultados de la HPLC para las LNP de R-C16 se muestran en la tabla 1b. La relación entre DLin-MC3-DMA y R-C16 es similar en todas las fracciones y se aproxima a lo observado en la muestra original, lo que indica la incorporación del palmitato de rofleponida (R-C16) en las LNP.
Tabla 1b. La relación en peso analizada entre Dlin-MC3-DMA y R-C16 en la muestra original y en la fase inferior ultracentrifu ada
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Ejemplo 2: LNP no antiinflamatorias frente a LNP de palmitato de rofleponida/ARN (1:1 p/p)
La composición molar de los lípidos utilizados para preparar la solución lipídica fue DLin-MC3-DMA:DsPc:colesterol:DMPE-PEG2000 = 50:10:38,5:1,5. Además, para la muestra S4, la solución también contenía palmitato de rofleponida (R-C16) en una cantidad que daba lugar a una concentración total de R-C16 = 0,25 mM en la solución de LNP antes de la diálisis. La composición molar final de los cuatro lípidos y del R-C16 en las LNP se indica en la tabla 2. Se mezclaron 1,05 ml de solución de ARNm 1 y 0,35 ml de solución de lípido y R-C16 de acuerdo con la descripción general. Los tamaños de partícula medidos antes y después de la diálisis, así como el % EE, se presentan en la tabla 2.
Tabla 2. Com osiciones molares finales tamaños de artícula medidos % EE de las muestras S3 S4.
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El tampón fosfato (PBS) y las muestras S3 y S4 se administraron por vía subcutánea a diferentes grupos de ratones (N = 5) a una dosis de 0,3 mg de ARNm/kg como se ha descrito anteriormente. Los resultados obtenidos para la puntuación del edema, la haptoglobina plasmática, las citocinas/quimiocinas plasmáticas y las concentraciones plasmáticas de proteína de ARNm 1 se muestran en las figuras 2A-D. Los datos de las citocinas/quimiocinas se muestran tanto a las 8 como a las 24 horas. Los resultados demuestran que al utilizar las LNP de acuerdo con la presente divulgación, se reducen significativamente los biomarcadores o síntomas de una respuesta inmunitaria, como la inflamación (medida como puntuación de edema), la haptoglobina y las citocinas/quimiocinas en el plasma. Además, las LNP de acuerdo con la presente divulgación dan lugar a una mayor expresión de proteínas.
Ejemplo 3: LNP no antiinflamatorias frente a LNP de palmitato de rofleponida/ARN (1:1, 1:10 y 1:30 p/p)
La composición molar de los lípidos utilizados para preparar la solución lipídica fue DLin-MC3-DMA:DSPC:colesterol:DMPE-PEG2000 = 50:10:38,5:1,5. Además, para las muestras S5, S6 y S7, la solución también contenía palmitato de rofleponida (R-C16) en una cantidad que daba lugar a una concentración total de R-C16 = 0,25 mM (S5), 0,025 mM (S6) u 8,3 |jM (S7) en la solución de LNP antes de la diálisis. La composición molar final de los cuatro lípidos y del R-C16 en las LNP se indica en la tabla 3. Se mezclaron 1,29 ml de solución de ARNm 1 y 0,43 ml de solución de lípido y R-C16 de acuerdo con la descripción anterior. Los tamaños de partícula medidos antes y después de la diálisis, así como el % EE, se presentan en la tabla 3.
Tabla 3. La m i i n m l r fin l l m ñ r í l m i l EE l m r -S8
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El tampón fosfato (PBS) y las muestras S5-S8 se administraron por vía subcutánea a diferentes grupos de ratones (N = 5) a una dosis de 0,3 mg de ARNm/kg como se ha descrito anteriormente. Los resultados obtenidos para la puntuación de edema, la haptoglobina plasmática y las concentraciones de proteínas plasmáticas se muestran en las figuras 3A-C. Los resultados muestran que al utilizar las LNP de R-C16 (en todas las proporciones), la inflamación medida como puntuación de edema y haptoglobina se reduce significativamente. Además, las LNP de R-C16 (en todas las proporciones) dan lugar a una mayor expresión proteica frente a las LNP de DLin-MC3-DMA no antiinflamatorias.
Ejemplo 4: palmitato de rofleponida frente a LNP de rofleponida
La composición molar de los lípidos utilizados para preparar la solución lipídica fue DLin-MC3-DMA:DSPC:colesterol:DMPE-PEG2000 = 50:10:38,5:1,5. Además, para la muestra S9, la solución también contenía palmitato de rofleponida (R-C16) en una cantidad que daba lugar a una concentración total de R-C16 = 0,25 mM en la solución de LNP antes de la diálisis. Para esta muestra, se mezclaron 1,05 ml de solución de ARNm 1 y 0,35 ml de solución de lípido y R-C16 de acuerdo con la descripción anterior. La muestra S10 se preparó añadiendo 16 |jl de una solución en etanol de rofleponida 21 mM a las LNP de DLin-MC3-DMA:DSPC:Colesterol:DMPE-PEG2000, después de la etapa de diálisis, para obtener la composición deseada y se equilibró a continuación durante 2 días. La composición molar final de los cuatro lípidos y del R-C16 o rofleponida en las LNP se indica en la tabla 4. Los tamaños de partícula medidos antes y después de la diálisis, así como el % EE, se presentan en la tabla 4 a continuación (para la medición del tamaño se utilizó p Bs , pH 7,4).
Tabla 4. Com osiciones molares finales tamaños de artículas medidos %EE de las muestras S9 S10.
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El tampón fosfato (PBS) y las muestras S9 y S10 se administraron por vía subcutánea a dos grupos de ratones (N = 15) a una dosis de 0,3 mg de ARNm/kg como se ha descrito anteriormente. Los resultados obtenidos para la puntuación de edema, la haptoglobina plasmática y las concentraciones de proteínas plasmáticas se muestran en las figuras 4A-C. Los resultados muestran que al utilizar las LNP de R-C16 de acuerdo con la presente divulgación, la inflamación medida como puntuación de edema y haptoglobina se reduce significativamente frente a las LNP que contienen rofleponida a la misma dosis molar. Además, las LNP de R-C16 dan lugar a una expresión proteica mayor y prolongada frente a las LNP que contienen rofleponida.
Ejemplo 5: Conversión del profármaco palmitato de rofleponida en rofleponida
Las muestras S9 y S10 (véase lo anterior) se administraron por vía subcutánea a ratones (N = 16) a una dosis de 0,3 mg de ARNm/kg, como se ha descrito anteriormente. Los resultados obtenidos para la concentración plasmática de rofleponida frente al tiempo se muestran en la figura 5. Los resultados muestran una conversión de palmitato de rofleponida en rofleponida tras la administración s.c. a ratones de las LNP de palmitato de rofleponida. Además, los resultados también ilustran claramente que las LNP de rofleponida dan lugar a concentraciones plasmáticas iniciales significativamente mayores que cuando se utilizan las LNP de palmitato de rofleponida. Esto indica que una porción significativa de rofleponida se localiza en la célula frente al plasma con la administración de las LNP que comprenden palmitato de rofleponida, en comparación con las LNP con compuesto madre de rofleponida, donde una cantidad significativa de rofleponida se escapa al plasma desde el lugar de administración. Por tanto, las LNP de acuerdo con la presente divulgación dan lugar a un aumento total de la ventana terapéutica, lo que permite administrar dosis significativamente menores al sujeto que lo necesita.
Ejemplo 6: LNP con valerato de rofleponida, miristato de rofleponida, palmitato de rofleponida o estearato de rofleponida
La composición molar de los lípidos utilizados para preparar la solución lipídica fue DLin-MC3-DMA:DsPc:colesterol:DMPE-PEG2000 = 50:10:38,5:1,5. Además, la solución también contenía valerato de rofleponida (R-C5, muestra S12), miristato de rofleponida (R-C14, muestra S13), palmitato de rofleponida (R-C16, muestra S14) o estearato de rofleponida (R-C18, muestra S15) en una cantidad que daba lugar a una concentración total de R-CX = 0,25 mM en la solución de LNP antes de la diálisis (donde X = número de carbonos en la cadena). La composición molar final de los cuatro lípidos y de R-CX en las LNP se muestra en la tabla 6. Se mezclaron 2,475 ml de solución de ARNm 1 y 0,825 ml de solución de lípido y R-CX de acuerdo con la descripción general. Los tamaños de partícula medidos antes y después de la diálisis, así como el % EE, se presentan en la tabla 6 a continuación (para la medición del tamaño se utilizó PBS, pH 7,4).
Tabla 6. C m i i n m l r fin l m ñ r í l m i EE l m r 11- 1 .
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El tampón fosfato (PBS) y las muestras S11-S15 se administraron por vía subcutánea a diferentes grupos de ratones (N = 5) a una dosis de 0,3 mg de ARNm/kg como se ha descrito anteriormente. Los resultados obtenidos para la puntuación de edema, la haptoglobina plasmática y las concentraciones de proteínas plasmáticas se muestran en las figuras 6A-C. Los resultados muestran que al utilizar las LNP de R-C14, R-C16 o R-C18 de acuerdo con la presente divulgación, la inflamación medida como puntuación de edema y haptoglobina se reduce significativamente frente a las LNP no antiinflamatorias, aunque la inflamación no se vio influida significativamente al utilizar valerato de rofleponida (R-C5). Además, las LNP de R-C14, R-C16 o R-C18 dan lugar a una expresión proteica mayor y prolongada frente a las LNP no antiinflamatorias, aunque las LNP de R-C5 no produjeron una expresión proteica total significativamente mayor (0­ 24 h).
Ejemplo 7: LNP con Merck-32 con y sin palmitato de rofleponida
Se prepararon dos muestras (S16 y S17). En ambas, la composición molar de los lípidos utilizados para preparar la solución lipídica fue Merck-32:DSPC:Colesterol:DMPE-PEG2000 = 50:10:38,5:1,5. Además, la solución utilizada para S16 también contenía palmitato de rofleponida (R-C16) en una cantidad que resultó en una concentración total de R-C16 = 0,14 mM en la solución de LNP antes de la diálisis. La composición molar final de los cuatro lípidos y del R-C16 en las LNP se indica en la tabla 7. Para S16, se mezclaron 2,925 ml de solución de ARNm 1 y 0,975 ml de solución de lípido y R-C16 y para S17, se mezclaron 0,75 ml de solución de ARNm 1 y 0,25 ml de solución de lípido y R-C16 de acuerdo con la descripción anterior. Tanto para S16 como para S17, la relación molar entre el lípido ionizable (Merck-32) y el nucleótido del ARNm fue de 6,0. Los tamaños de partícula medidos antes y después de la diálisis, así como el % EE, se presentan en la tabla 7 a continuación (para la medición del tamaño se utilizó p Bs , pH 7,4).
Tabla 7. C m i i n m l r fin l m ñ rí l m i EE l m r 1 17.
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El tampón fosfato (PBS), las muestras S11 y S14 que contenían DLin-MC3-DMA (véase la tabla 6) y las muestras S16-S17 que contenían Merck-32 se administraron por vía subcutánea a diferentes grupos de ratones (N = 5) a una dosis de 0,3 mg de ARNm/kg como se ha descrito anteriormente. Los resultados obtenidos para la puntuación de edema, la haptoglobina plasmática y las concentraciones de proteínas plasmáticas se muestran en las figuras 7A-C. Los resultados muestran que al utilizar palmitato de rofleponida en las LNP basadas tanto en DLin-MC3-DMA como en Merck-32, se reduce significativamente la inflamación medida como puntuación de edema y haptoglobina. Además, la presencia de palmitato de rofleponida tanto en las LNP basadas tanto en DLin-MC3-DMA como en Merck-32, da lugar a un aumento de la expresión de la proteína de ARNm 1.
Ejemplo 8: LNP con Merck-32 con miristato de rofleponida (en proporciones de miristato de rofleponida/ARNm 1:1 y 0,3:1 p/p) a una dosis mayor de ARNm
Se prepararon tres muestras (S18-S20); la composición molar de los lípidos utilizados para preparar la solución lipídica se indica en la tabla 8. Para las muestras S19 y S20, la mezcla de lípidos comprendía MC3, DSPC, colesterol y PEG-lípido, y miristato de rofleponida (R-C14) en una cantidad que daba lugar a una concentración total de R-C14 = 0,083 mM (S19) o 0,25 mM (SC20) en la solución de LNP antes de la diálisis. Todas las muestras se mezclaron de acuerdo con la descripción general anterior. Para la muestra S18, el volumen de la solución de ARNm 1 fue de 2,13 ml y el volumen de la solución de lípidos fue de 0,71 ml. Para la muestra S19, el volumen de la solución de ARNm 1 fue de 3,12 ml y el volumen de la solución de lípido y R-C14 fue de 1,04 ml. La muestra S20 estaba compuesta por dos lotes idénticos en los que, para cada lote, el volumen de la solución de ARNm 1 era de 3,21 ml y el volumen de la solución de lípido y R-C14 era de 1,07 ml. Ambas muestras, S19 y S20, se concentraron utilizando filtros de centrifugación Amicon Ultra-15 para alcanzar una concentración deseada para la dosificación in vivo. Antes de la etapa de concentración, se mezclaron los dos lotes que componen la muestra S20. Los tamaños de partícula medidos antes y después de la diálisis, así como el % EE, se presentan en la tabla 8 a continuación (para la medición del tamaño se utilizó PBS, pH 7,4).
Tabla 8. Las composiciones molares finales, los tamaños de partícula medidos y el % EE de las muestras S18-S20. Los dos valores de tamaño antes y después de la diálisis y el PDI de la muestra S20 representan los dos lotes diferentes utiliz r r r r l m r .
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El tampón fosfato (PBS), las muestras S18 que contenían DLin-MC3-DMA y las muestras S20 que contenían Merck-32 y miristato de rofleponida se administraron por vía subcutánea a diferentes grupos de ratones (N = 5) a una dosis de 0,3 mg de ARNm/kg como se ha descrito anteriormente. Además, las muestras S19-S20 también se administraron por vía subcutánea a grupos de ratones (N = 5) a una dosis mayor de ARNm, 1 mg/kg. Los resultados obtenidos para la puntuación de edema, la haptoglobina plasmática y las concentraciones de proteína de ARNm 1 en plasma se muestran en las figuras 8A-C. Los resultados muestran que al utilizar el miristato de rofleponida en las LNP basadas en Merck-32 a una relación de R-C14/ARNm de 1:1, se reduce la inflamación medida como puntuación de edema tanto a 0,3 como a 1 mg/kg. Además, la expresión proteica muestra un aumento aproximadamente proporcional a la dosis (en el intervalo de tiempo de 0 a 24 h) cuando se comparan las dosis de 0,3 y 1 mg/kg.
Ejemplo 9: LNP con KL10 y Acuitas-5 con y sin miristato de rofleponida (en proporciones de miristato de rofleponida/ARN 1:1 p/p)
La composición molar de los lípidos utilizados para preparar la solución lipídica se indica en la tabla 9. Para las muestras S23 y S25, la mezcla de lípidos contenía, además del lípido ionizable, DSPC, colesterol y PEG-lípido, miristato de rofleponida (R-C14) en una cantidad que daba lugar a una concentración total de R-C14 = 0,28 mM (S23) o 0,17 mM (S25) en la solución LNP antes de la diálisis. Todas las muestras se mezclaron de acuerdo con la descripción general con la excepción de que N:P = 3 para las muestras S22 y S23 y N:P = 4,9 para las muestras S24 y S25. Para la muestra S21, el volumen de la solución de ARNm 1 fue de 2,16 ml y el volumen de la solución de lípidos fue de 0,72 ml. Para las muestras S22 y S23, el volumen de la solución de proteína de ARNm 1 fue de 1,41 ml y el volumen de la solución de lípido y R-C14 fue de 0,47 ml, y para las muestras S24 y S25, el volumen de la solución de proteína de ARNm 1 fue de 1,77 ml y el volumen de la solución de lípido y R-C14 fue de 0,59 ml. Los tamaños de partícula medidos antes y después de la diálisis, así como el % EE, se presentan en la tabla 8 a continuación (para la medición del tamaño se utilizó PBS, pH 7,4).
Tabla 9. Las composiciones molares finales, los tamaños de partícula medidos y el % EE de las muestras S21-S25.
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El tampón fosfato (PBS), la muestra S21 que contenía DLin-MC3-DMA, las muestras S22-23 que contenían Acuitas-5 sin y con miristato de rofleponida (R-C14) y las muestras S24-25 que contenían KL10 sin y con miristato de rofleponida (R-C14), se administraron por vía subcutánea a diferentes grupos de ratones (N = 5) a una dosis de 0,3 mg de ARNm/kg como se ha descrito anteriormente. Los resultados obtenidos para la puntuación de edema, la haptoglobina plasmática y las concentraciones de proteína de ARNm 1 en plasma se muestran en las figuras 9A-C. Los resultados muestran que al utilizar miristato de rofleponida en las LNP basadas en Acuitas-5 y KL10, la inflamación medida como puntuación de edema y haptoglobina plasmática se reduce en comparación con las LNP basadas en DLin-MC3-DMA (a 0,3 mg/kg). Además, la expresión de la proteína de ARNm 1 (en el intervalo de tiempo de 0-24 h) aumenta cuando se incorpora a las LNP miristato de rofleponida.
Ejemplo 10: LNP solo con Merck-32 y con miristato de rofleponida, miristato de budesónida, palmitato de budesónida u oleato de budesónida
La composición molar de los lípidos utilizados para preparar la solución lipídica fue L608:DSPC:Colesterol:DMPE-PEG2000 = 50:10:38,5:1,5 (muestra S26). La muestra S27 también contenía miristato de rofleponida (R-C14) y para las muestras S29, S30 y S31, la solución también contenía miristato de budesónida (B-C14), palmitato de budesónida (B-C16) y oleato de budesónida (B-C18:1), respectivamente, en una cantidad que dio como resultado una concentración total de R-C14, B-C14, B-C16 y B-C18:1 = 0,154 mM en la solución de LNP antes de la diálisis. La composición molar final de los cuatro lípidos y de R-C14, B-C14, B-C16 o B-C18:1 en las LNP se indica en la tabla 10. Se mezcló una alícuota de 3,36 ml de solución de proteína de ARNm 1 y 1,12 ml de solución de lípido y R-C14, B-C14, B-C16 o B-C18:1 de acuerdo con la descripción general descrita anteriormente en la sección "Preparación de LNP que contienen ARNm". Todas las muestras se concentraron utilizando filtros de centrifugación Amicon Ultra-4 que después se centrifugaron a 3000 rpm y 8 °C hasta que las formulaciones tuvieron una concentración estimada de ARNm significativamente superior a 0,2 mg/ml. Los volúmenes restantes de la formulación se recogieron y los filtros de centrifugación se lavaron con pequeñas alícuotas de tampón PBS que se añadieron a las fracciones principales de la muestra para obtener una concentración estimada de ARNm de aproximadamente 0,2 mg/ml. Después se volvió a medir el tamaño. Los tamaños de partícula medidos antes de la diálisis y después de la concentración, así como el % EE, se presentan en la tabla 10 a continuación.
Tabla 10. L m i i n m l r fin l l m ñ r í l m i l EE l m r 26-S31.
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Las muestras S26-S31 se administraron por vía subcutánea a diferentes grupos de ratones (N = 5) a una dosis de 0,3 mg de ARNm/kg, como se ha descrito anteriormente. Los resultados obtenidos para la puntuación de edema, la haptoglobina plasmática, las citocinas/quimiocinas plasmáticas y las concentraciones plasmáticas de ARNm 1 se muestran en las figuras 10A-G. Los resultados indican que las LNP de miristato de rofleponida (R-C14), palmitato de budesónida (B-C16) u oleato de budesónida (B-C18:1) reducen significativamente la inflamación medida como puntuación de edema, haptoglobina y citocinas IL-6 y KC frente a las LNP convencionales (muestra S26). Además, la inflamación no se vio influida en la misma medida cuando se utilizó miristato de budesónida (B-C14). Además, las LNP de R-C14, B-C16 o B-C18:1 dieron lugar a una expresión mayor y prolongada del ARNm 1 frente a las LNP convencionales (muestra S26).

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una nanopartícula lipídica antiinflamatoria que comprende:
a) una fase lipídica; y
b) al menos un agente antiinflamatorio lipófilo; y
c) un segmento de ácido nucleico seleccionado entre ADN, ARNm, ARNpi, complejo Cas9-ARN guía y combinaciones de los mismos.
2. La nanopartícula lipídica antiinflamatoria de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la fase lipídica comprende al menos un lípido ionizable, al menos un lípido neutro, al menos un esterol y al menos un lípido conjugado con polímeros.
3. La nanopartícula lipídica antiinflamatoria de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el al menos un lípido ionizable se selecciona entre DLin-DMA, DLin-MC3-DMA, DLin-KC2-DMA, Merck-32, KL10, Acuitas-5, C12-200, y mezclas de los mismos.
4. La nanopartícula lipídica antiinflamatoria de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el al menos un lípido neutro se selecciona entre diestearoil fosfatidilcolina (DSPC), dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE), dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC), dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC) y mezclas de los mismos.
5. La nanopartícula lipídica antiinflamatoria de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el al menos un esterol es colesterol.
6. La nanopartícula lipídica antiinflamatoria de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el al menos un lípido conjugado con polímeros se selecciona entre DMPE-PEG2000, DPPE-PEG2000, DMG-PEG2000, DPG-PEG2000, PEG2000-c-DOMG, PEG2000-c-DOPG, y mezclas de los mismos.
7. La nanopartícula lipídica antiinflamatoria de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el agente antiinflamatorio es un profármaco de rofleponida.
8. La nanopartícula lipídica antiinflamatoria de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el profármaco de rofleponida se selecciona entre valerato de rofleponida (C5), caproato de rofleponida (C6) caprilato de rofleponida (C8), caprato de rofleponida (C10), laurato de rofleponida (C12), miristato de rofleponida (C14), palmitato de rofleponida (C16) o estearato de rofleponida (C18).
9. La nanopartícula lipídica antiinflamatoria de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el agente antiinflamatorio es un profármaco de budesónida, opcionalmente en donde el profármaco del agente antiinflamatorio se selecciona entre miristato de budesónida (C14), palmitato de budesónida (C16), estearato de budesónida (C18), oleato de budesónida (C18:1) y linoleato de budesónida (C18:2).
10. La nanopartícula lipídica antiinflamatoria de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la relación de peso entre la fase lipídica y el segmento de ácido nucleico oscila de aproximadamente 40:1 a 1:1.
11. La nanopartícula lipídica antiinflamatoria de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la relación en peso entre el agente antiinflamatorio lipófilo y el segmento de ácido nucleico oscila de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 1:100.
12. Una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de nanopartículas lipídicas antiinflamatorias de acuerdo con la reivindicación 1.
13. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 12 para su uso en el aumento de la expresión de al menos un péptido o proteína en las células de un sujeto que lo necesita en comparación con un nivel de control, opcionalmente en donde la expresión de al menos un péptido o proteína se aumenta en un factor de aproximadamente 2 hasta 24 horas, en comparación con los niveles de control.
14. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 12 para su uso en la inhibición de la respuesta inmunitaria asociada a la administración de LNP no antiinflamatorias.
15. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 12 para su uso en la inhibición de la respuesta inmunitaria asociada a la administración de LNP no antiinflamatorias, y la inhibición de la expresión o actividad de un marcador proinflamatorio en comparación con un nivel de control, opcionalmente en donde se reduce la producción de IL-6, IL-8, KC, IP-10 y MCP-1 en un porcentaje de aproximadamente el 80 % o más, en comparación con un nivel de control.
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