IT202000028688A1 - Varianti della citidina deaminasi per l’editazione di basi - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
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- C12Y305/04005—Cytidine deaminase (3.5.4.5)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Description
Descrizione della domanda di brevetto per invenzione industriale dal titolo: Varianti della citidina deaminasi per l?editazione di basi
Sfondo dell'invenzione
La presente invenzione si riferisce al campo delle biotecnologie ad in particolare delle biotecnologie mediche in quanto riguarda dei base editors (editori di base) per l?editing (editazione) genomico in grado di indurre delle mutazioni puntiformi specifiche utilizzabili con un elevato livello di sicurezza in quanto in grado di ridurre le mutazioni indesiderate.
Stato dell?arte
I base editors sono molecole chimeriche in cui un dominio, di solito Cas9, in grado di legare il DNA in maniera specifica mediante RNA guida ? fuso con una deaminasi che induce la modifica di una base specifica, impiegate nelle tecniche di editing genomico. Questi strumenti permettono di agire su siti specifici del genoma umano inducendo delezioni ed inserzioni in maniera controllata. Queste molecole permettono la modifica di singole basi in una regione specifica del DNA senza indurre la rottura della doppia catena. Per la mutazione da citosina a timina (editing C>T), La deaminasi pi? comunemente utilizzata ? costituita da APOBEC1 di ratto, un potente mutatore del DNA che agisce fisiologicamente sull?RNA.
E? noto che possono verificarsi casi di mutazione fuori bersaglio (effetti off-target), sebbene la specificit? di Cas9 sia controllata da una sequenza di 20 bp presente su un RNA guida (gRNA) e dalla presenza di una sequenza specifica (PAM). Per esempio possono verificarsi delezioni e ricombinazioni su siti genomici diversi da quelli pianificati a causa di un disallineamento del gRNA in regioni con 3-5 possibili basi diverse da quelle del gRNA (Hsu, P. D. et al., 2013, DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology, 31(9), 827?832.; Fu, Y. et al., 2013, High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nature Biotechnology, 31(9), 822?826). Oppure si possono verificare mutazioni off-target, sia sul DNA sia sull?RNA, dovute all?overespressione della deaminasi, per esempio ? noto che i base editors inducono mutazioni in embrioni di topo (Lee, H. K., Smith, H. E., Liu, C., Willi, M., & Hennighausen, L., 2020, Cytosine base editor 4 but not adenine base editor generates off-target mutations in mouse embryos. Commun Biol, 3(1), 19. doi:10.1038/s42003-019-0745-3), in cellule umane (McGrath, E., Shin, H., Zhang, L., Phue, J.-N., Wu, W. W., Shen, R.-F., . . . Ye, Z., 2019, Targeting specificity of APOBEC-based cytosine base editor in human iPSCs determined by whole genome sequencing. Nat Commun, 10(1), 5353. doi:10.1038/s41467-019-13342-8) e nel riso (Jin, S., Zong, Y., Gao, Q., Zhu, Z., Wang, Y., Qin, P., . . . Gao, C., 2019, Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide offtarget mutations in rice. Science, 364(6437), 292-295. doi:10.1126/science.aaw7166). Ci? accade sia in sequenze codificanti che non codificanti, generando mutazioni missense (senso errato) , nonsense (senza senso), quali siti di splice (siti di taglio e incollaggio) e al 5 '/ 3' UTR (Gr?newald, J., Zhou, R., Garcia, S. P., Iyer, S., Lareau, C. A., Aryee, M. J., & Joung, J. K., 2019, Transcriptome-wide off-target RNA editing induced by CRISPR-guided DNA base editors. Nature, 569(7756), 433? 437; Zhou, C., Sun, Y., Yan, R., Liu, Y., Zuo, E., Gu, C., . . . Yang, H., 2019, Off-target RNA mutation induced by DNA base editing and its elimination by mutagenesis. Nature, 571(7764), 275-278. doi:10.1038/s41586-019-1314-0). Per ridurre questo effetto, ? stata descritta la sostituzione della componente APOBEC1 in BE3 con mutanti di APOBEC1 di ratto, caratterizzati per una ridotta attivit? di editing dell'RNA e basati su mutazioni precedentemente analizzate (Yamanaka, S., Poksay, K. S., Balestra, M. E., Zeng, G. Q., & Innerarity, T. L.,1994, Cloning and mutagenesis of the rabbit apoB mRNA editing protein. A zinc motif is essential for catalytic activity, and noncatalytic auxiliary factor(s) of the editing complex are widely distributed. Journal of Biological Chemistry, 269(34), 21725?21734; Navaratnam, N., Bhattacharya, S., Fujino, T., Patel, D., Jarmuz, A. L., & Scott, J., 1995, Evolutionary origins of apoB mRNA editing: Catalysis by a cytidine deaminase that has acquired a novel RNA-binding motif at its active site. Cell, 81(2), 187?195. MacGinnitie, A. J., Anant, S., & Davidson, N. O., 1995. Mutagenesis of apobec-1, the catalytic subunit of the mammalian apolipoprotein B mRNA editing enzyme, reveals distinct domains that mediate cytosine nucleoside deaminase, RNA binding, and RNA editing activity. Journal of Biological Chemistry, 270(24), 14768?14775; Teng, B. B., Ochsner, S., Zhang, Q., Soman, K. V., Lau, P. P., & Chan, L., 1999, Mutational analysis of apolipoprotein B mRNA editing enzyme (APOBEC1): Structure-function relationships of RNA editing and dimerization. Journal of Lipid Research, 40(4), 623?635; Chen, Z., Eggerman, T. L., Bocharov, A. V., Baranova, I. N., Vishnyakova, T. G., Csako, G., & Patterson, A. P., 2010, Hypermutation induced by APOBEC-1 overexpression can be eliminated. RNA, 16(5), 1040?1052).
Negli anni sono state sviluppate Cas9 con una specificit? di target pi? elevata (Hu et al 2018; Casini et al 2018) e identificati mutanti di APOBEC1 che inducono meno effetti offtarget (Doman, J. L., Raguram, A., Newby, G. A., & Liu, D. R.,2020, Evaluation and minimization of Cas9-independent offtarget DNA editing by cytosine base editors. Nat Biotechnol, 38(5), 620-628. doi:10.1038/s41587-020-0414-6 Zuo; E., Sun, Y., Wei, W., Yuan, T., Ying, W., Sun, H., ? Yang, H., 2019, Cytosine base editor generates substantial off-target single-nucleotide variants in mouse embryos. Science, 364(6437), 289?292; Yu, Y., Leete, T. C., Born, D. A., Young, L., Barrera, L. A., Lee, S.-J., Gaudelli, N. M., 2020, Cytosine base editors with minimized unguided DNA and RNA off-target events and high on-target activity. Nat Commun, 11(1), 2052. doi:10.1038/s41467-020-15887-5).
La domanda di brevetto statunitense, numero di pubblicazione US2018312828 descrive delle proteine di fusione per il gene editing in cui l?attivit? deaminasica ? svolta dall?enzima APOBEC1 e suoi mutanti come quelli con mutanti nella posizione 132 in cui la sostituzione pu? essere fatta con qualunque aminoacido.
La domanda di brevetto internazionale, numero di pubblicazione n. WO2019/241649 descrive delle varianti di citidina deaminasi preparate mediante la tecnica sfrutta la tecnica PACE (Phage Assisted Continuous Evolution ? Evoluzione Continua fago assistita) nonch? vettori che le incorporano con il dominio Cas9. Le varianti di APOBEC1 descritte sono caratterizzate da mutazioni nelle posizioni R33, G45, N57, N65, Y75, T101, F113, F113, A123, S149, A165, H166, T204, F205, e W224.
La domanda di brevetto internazionale, numero di pubblicazione n. WO2019042284 descrive base editors contenenti e una versione cataliticamente inattiva del batterio Lachnospiraceae Cpf1 (LbCpf1) e citidina deaminasi, come per esempio la proteina APOBEC in varie forme come per esempio APOBEC1 con mutazione W90Y o R126E, o APOBEC3A con mutazioni W104A, Y130F, D131Y, D31E e loro combinazioni.
Problema tecnico
L?uso dei base editors ? uno strumento efficiente per l?editing genomico, ma spesso la loro espressione pu? provocare mutazioni indesiderate sia sull?RNA sia sul DNA.
E? pertanto fortemente sentito nel settore di appartenenza della presente invenzione il problema di sviluppare sistemi che riducano o eliminino questo inconveniente.
Alla luce di quanto noto nello stato dell?arte, gli inventori della presente invenzione hanno sviluppato, mediante screening batterici e test in cellule umane, dei mutanti della deaminasi APOBEC1 il cui utilizzo all?interno del base editor induce un numero considerevolmente ridotto di mutazioni sia sull?RNA sia sul DNA e che quindi possono essere utilizzati per indurre editing genomico con un maggiore livello di sicurezza.
Oggetto dell?invenzione
Il problema tecnico viene pertanto risolto fornendo delle sequenze
nucleotidiche varianti della proteina citidina deaminasi APOBEC1
tipo selvatico (wild type) di sequenza
SEQ. ID. NO.1
ATGAGTTCCGAGACAGGCCCTGTAGCTGTTGATCCCACTCTGAGGAGAAGAATTGAGCCCCACGAG TTTGAAGTCTTCTTTGACCCCCGGGAACTTCGGAAAGAGACCTGTCTGCTGTATGAGATCAACTGG GGAGGAAGGCACAGCATCTGGCGACACACGAGCCAAAACACCAACAAACACGTTGAAGTCAATTTC ATAGAAAAATTTACTACAGAAAGATACTTTTGTCCAAACACCAGATGCTCCATTACCTGGTTCCTG TCCTGGAGTCCCTGTGGGGAGTGCTCCAGGGCCATTACAGAATTTTTGAGCCGATACCCCCATGTA ACTCTGTTTATTTATATAGCACGGCTTTATCACCACGCAGATCCTCGAAATCGGCAAGGACTCAGG GACCTTATTAGCAGCGGTGTTACTATCCAGATCATGACGGAGCAAGAGTCTGGCTACTGCTGGAGG AATTTTGTCAACTACTCCCCTTCGAATGAAGCTCATTGGCCAAGGTACCCCCATCTGTGGGTGAGG CTGTACGTACTGGAACTCTACTGCATCATTTTAGGACTTCCACCCTGTTTAAATATTTTAAGAAGA AAACAACCTCAACTCACGTTTTTCACGATTGCTCTTCAAAGCTGCCATTACCAAAGGCTACCACCC CACATCCTGTGGGCCACAGGGTTGAAATGA
Oggetto della presente invenzione ? una sequenza nucleotidica
codificante per una variante della proteina citidina deaminasi
scelta nel gruppo consistente di
sequenza SEQ.ID.NO. 2 [F66L (C196T) /V179I (G535A)]
ATGAGTTCCGAGACAGGCCCTGTAGCTGTTGATCCCACTCTGAGGAGAAGAATTGAGCCCCACGAG TTTGAAGTCTTCTTTGACCCCCGGGAACTTCGGAAAGAGACCTGTCTGCTGTATGAGATCAACTGG GGAGGAAGGCACAGCATCTGGCGACACACGAGCCAAAACACCAACAAACACGTTGAAGTCAATCTC ATAGAAAAATTTACTACAGAAAGATACTTTTGTCCAAACACCAGATGCTCCATTACCTGGTTCCTG TCCTGGAGTCCCTGTGGGGAGTGCTCCAGGGCCATTACAGAATTTTTGAGCCGATACCCCCATGTA ACTCTGTTTATTTATATAGCACGGCTTTATCACCACGCAGATCCTCGAAATCGGCAAGGACTCAGG GACCTTATTAGCAGCGGTGTTACTATCCAGATCATGACGGAGCAAGAGTCTGGCTACTGCTGGAGG AATTTTGTCAACTACTCCCCCTCGAATGAAGCTCATTGGCCAAGGTACCCCCATCTGTGGGTGAGG CTGTACATACTGGAACTCTACTGCATCATTTTAGGACTTCCACCCTGTTTAAATATTTTAAGAAGA AAACAACCTCAACTCACGTTTTTCACGATTGCTCTTCAAAGCTGCCATTACCAAAGGCTACCACCC CACATCCTGTGGGCCACAGGGTTGAAA
SEQ.ID.NO.3 [I195N T584A]
ATGAGTTCCGAGACAGGCCCTGTAGCTGTTGATCCCACTCTGAGGAGAAGAATTGAGCCCCACGAG TTTGAAGTCTTCTTTGACCCCCGGGAACTTCGGAAAGAGACCTGTCTGCTGTATGAGATCAACTGG GGAGGAAGGCACAGCATCTGGCGACACACGAGCCAAAACACCAACAAACACGTTGAAGTCAATTTC ATAGAAAAATTTACTACAGAAAGATACTTTTGTCCAAACACCAGATGCTCCATTACCTGGTTCCTG TCCTGGAGTCCCTGTGGGGAGTGCTCCAGGGCCATTACAGAATTTTTGAGCCGATACCCCCATGTA ACTCTGTTTATTTATATAGCACGGCTTTATCACCACGCAGATCCTCGAAATCGGCAAGGACTCAGG GACCTTATTAGCAGCGGTGTTACTATCCAGATCATGACGGAGCAAGAGTCTGGCTACTGCTGGAGG AATTTTGTCAACTACTCCCCTTCGAATGAAGCTCATTGGCCAAGGTACCCCCATCTGTGGGTGAGG CTGTACGTACTGGAACTCTACTGCATCATTTTAGGACTTCCACCCTGTTTAAATAATTTAAGAAGA AAACAACCTCAACTCACGTTTTTCACGATTGCTCTTCAAAGCTGCCATTACCAAAGGCTACCACCC CACATCCTGTGGGCCACAGGGTTGAAA
SEQ.ID.NO.4 [C82R (T244C)] ATGAGTTCCGAGACAGGCCCTGTAGCTGTTGATCCCACTCTGAGGAGAAGAATTGAGCCCCACGAG TTTGAAGTCTTCTTTGACCCCCGGGAACTTCGGAAAGAGACCTGTCTGCTGTATGAGATCAACTGG GGAGGAAGGCACAGCATCTGGCGACACACGAGCCAAAACACCAACAAACACGTTGAAGTCAATtTC ATAGAAAAATTTACTACAGAAAGATACTTTTGTCCAAACACCAGACGCTCCATTACCTGGTTCCTG TCCTGGAGTCCCTGTGGGGAGTGCTCCAGGGCCATTACAGAATTTTTGAGCCGATACCCCCATGTA ACTCTGTTTATTTATATAGCACGGCTTTATCACCACGCAGATCCTCGAAATCGGCAAGGACTCAGG GACCTTATTAGCAGCGGTGTTACTATCCAGATCATGACGGAGCAAGAGTCTGGCTACTGCTGGAGG AATTTTGTCAACTACTCCCCtTCGAATGAAGCTCATTGGCCAAGGTACCCCCATCTGTGGGTGAGG CTGTACGTACTGGAACTCTACTGCATCATTTTAGGACTTCCACCCTGTTTAAATATTTTAAGAAGA AAACAACCTCAACTCACGTTTTTCACGATTGCTCTTCAAAGCTGCCATTACCAAAGGCTACCACCC CACATCCTGTGGGCCACAGGGTTGAAATGT
Costituiscono ulteriore oggetto della presente invenzione le varianti della proteina citidina deaminasi codificate dalla sequenza nucleotidica scelta nel gruppo consistente di SEQ. ID. NO.2, SEQ. ID. NO.3, SEQ. ID. NO.4.
Costituiscono anche oggetto della presente invenzione gli mRNA trascritti da una qualsiasi delle sequenze nucleotidiche di sequenza SEQ. ID. NO.2, SEQ. ID. NO.3, SEQ. ID. NO.4 e ogni loro variante di splicing.
Ulteriore oggetto della presente invenzione ? qualsiasi vettore e/o cellula ospite comprendente una sequenza nucleotidica scelta nel gruppo consistente di SEQ. ID. NO.2, SEQ. ID. NO.3, SEQ. ID. NO.4 oppure l?mRNA trascritto una sequenza nucleotidica scelta nel gruppo consistente di SEQ. ID. NO.2, SEQ. ID. NO.3, SEQ. ID. NO.4, e ogni sua variante di splicing.
Un altro oggetto della presente invenzione ? una proteina di fusione comprendente:
una variante della proteina citidina deaminasi codificata una sequenza nucleotidica scelta nel gruppo consistente di SEQ. ID. NO.2, SEQ. ID. NO.3, SEQ. ID. NO.4.
e una proteina in grado di veicolare i mutanti di APOBEC1 su acidi nucleici o dominio funzionale della stessa.
Un ulteriore oggetto della presente invenzione ? una sequenza codificante per una proteina di fusione comprendente:
una sequenza nucleotidica scelta nel gruppo consistente di SEQ. ID. NO.2, SEQ. ID. NO.3, SEQ. ID. NO.4, e
una sequenza codificante per una proteina in grado di veicolare i mutanti di APOBEC1 su acidi nucleici o dominio funzionale della stessa.
E? anche oggetto della presente invenzione qualsiasi vettore e/o cellula ospite comprendente sequenza codificante per una proteina di fusione.
Un altro oggetto della presente invenzione ? l?uso della proteina di fusione come editore di basi (base editor).
Un ulteriore oggetto della presente invenzione ? un procedimento di editazione di basi (base editing) che comprende l?uso dell?editore di basi costituito dalla proteina di fusione.
Un ulteriore oggetto della presente invenzione ? un kit che comprende tutti gli elementi necessari per svolgere un procedimento di base editing che comprende l?uso dell?editore di basi costituito dalla proteina di fusione.
Ulteriori caratteristiche della presente invenzione risulteranno evidenti e chiare dalla descrizione dettagliata che segue con riferimento a dati sperimentali presentati nella presente descrizione e alle figure allegate.
Breve descrizione delle figure
La figura 1 mostra le percentuali di editing dei diversi base editor sui bersagli genomici selezionati; ogni grafico rappresenta le percentuali di editing di ciascuna citosina all'interno della finestra di editing di un gene bersaglio; EMX1 ha due C editabili, mentre HEK#3 ha tre C modificabili; all'interno di ogni grafico ? mostrata la base che precede la C editata; un Base Editor senza APOBEC1 (woA1) e con il mutante cataliticamente inattivo E63A sono stati usati come controlli negativi; BE3 (A1) ? stato utilizzato come riferimento per la capacit? di editing dei mutanti carenti di modifica dell'RNA.
La figura 2 mostra la frequenza di editing dell'RNA per i diversi base editor, l'analisi ? stata eseguita in duplicato, BE3 (BE-A1) induce un'alta frequenza di editing su tutto il trascrittoma, i Base Editor con i mutanti inducono una frequenza di editing dell'RNA paragonabile ai controlli negativi BE3woA1 e BE-E63A.
La figura 3 mostra il grafico LOGO dei nucleotidi che circondano il sito modificato all'interno di tutti i campioni sequenziati, nessun arricchimento ? presente ad eccezione del campione con over-espressione del Base Editor con wt APOBEC1 (BE-A1).
La figura 4 mostra il numero di SNV unici presenti su trascritti provenienti da entrambi i filamenti di DNA; solo il Base Editor con il wt APOBEC1 (A1) induce mutazioni off-target.
Descrizione dettagliata dell'invenzione
Definizioni
Nell?ambito della presente invenzione per APOBEC1 si intende il polipeptide catalitico 1 dell?enzima citidina deaminasi che muta citosina in uracile nell?RNA messaggero (mRNA) dell?apolipoproteina B.
Nell?ambito della presente invenzione per proteina chimerica o proteina di fusione si intende una qualsiasi proteina creata sperimentalmente dalla traduzione di almeno due geni uniti fra di loro e originariamente codificanti per proteine separate.
Nell?ambito della presente invenzione per base editor (editore di basi) si intende una proteina di fusione che comprende una variante dell?enzima citidina deaminasi e una proteina in grado di veicolare i mutanti di APOBEC1 su acidi nucleici o dominio funzionale della stessa.
Nell?ambito della presente invenzione una proteina in grado di veicolare i mutanti di APOBEC1 o dominio funzionale della stessa si intende qualsiasi proteina o dominio funzionale in grado di utilizzare un RNA guida per veicolare i mutanti di APOBEC1 sulla regione complementare all?RNA guida. Proteine o domini in grado di svolgere detta funzione sono anche le proteine della famiglia delle proteine associate al CRISPR (Cas), dove per CRISPR si intende CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) brevi ripetizioni palindrome raggruppate e separate a intervalli regolari.
Le proteine grado di veicolare i mutanti di APOBEC1, associate all?editing genomico, possono essere scelte nel gruppo consistente di: Zinc-Finger Nucleases (ZFN), Transcription activator-like effector nucleases (TALENs), Meganucleasi, Cas9 e sue varianti create in laboratorio, Cas12a e sue varianti create in laboratorio, tipo SpCas9, VRER SpCas9, VQR SpCas9, EQR SpCas9, xCas9-3.7, eSpCas9 (1.0), eSpCas9 (1.1), Cas9-HF1, HypaCas9, evoCas9, HiFi Cas9, ScCas9, StCas9, NmCas9, SaCas9, CiCas9, CasX), e Cascade/Cas3 e sue varianti create in laboratorio.
Nell?ambito della presente invenzione per base editing (editare di basi) si intende il processo di produzione di mutazioni puntiformi nel o RNA senza effettuare rotture della molecola.
Nell?ambito della presente invenzione per Cas9 si intende proteina associata al CRISPR 9 (CRISPR associated protein 9) cio? un enzima endonucleasi del DNA con RNA guida associato al sistema immunitario adattivo CRISPR prodotto da Streptococcus pyogenes e da altri batteri.
Nell?ambito della presente invenzione per vettore si intende qualsiasi sistema in grado di trasportare all?interno di una cellula ospite sequenze di DNA esogene e permetterne l?integrazione nel genoma dell?ospite e la sua espressione nella cellula ospite. Il vettore pu? essere di origine plasmidica.
Nell?ambito della presente invenzione per cellula ospite si intende la cellula bersaglio nella quale viene inserito ed espresso il genoma esogeno.
Nell?ambito della presente invenzione per splicing (montaggio) si intende il processo di modifica dell?mRNA trascritto mediante il quale le sequenze introniche vengono rimosse e gli esoni uniti fra di loro, pertanto per varianti di splicing si intendono tutte le sequenze anche intermedie che si producono durante il processo di splicing.
Poich? sono disponibili informazioni solo sul sito catalitico di APOBEC1 ma non ci sono informazioni precise sulle regioni di APOBEC1 coinvolte nel riconoscimento e l?attivit? di APOBEC1 sul DNA e sull?RNA, gli inventori della presente invenzione hanno prima investigato e poi verificato che la porzione C-terminale di APOBEC-1 ha una funzione nell?attivit? di editing dell'RNA ed in particolare che la delezione del dominio C-terminale di 40 aminoacidi inibisce l?attivit? enzimatica di APOBEC1 sull?RNA bersaglio.
E? stato selezionato un insieme di mutanti di APOBEC1 mediante due screen batterici specifici a partire da un insieme specifico di mutanti generati mediante PCR mutagenica. E? stato pertanto selezionato un insieme di mutanti di APOBEC1 caratterizzati da una ridotta capacit? di editing sull?RNA ma capaci di mantenere la capacit? di editare sul DNA mediante l?accoppiamento di due metodi di screening uno per selezionare i mutanti che non sono in grado di editare l?RNA e un altro per selezionare i mutanti che mantengono l?abilit? di editare il DNA.
Alla luce di quanto sopra, oggetto dell?invenzione ? una sequenza nucleotidica codificante per una variante della proteina citidina deaminasi scelta nel gruppo consistente di:
sequenza SEQ.ID.NO. 2, contenente le mutazioni puntiformi F66L e V179I; sequenza SEQ.ID.NO.3 contenete la mutazione I195N; sequenza SEQ.ID.NO.4 contenete la mutazione C82R.
Costituiscono anche oggetto della presente invenzione le varianti della proteina citidina deaminasi codificate da una sequenza nucleotidica scelta nel gruppo consistente di
sequenza nucleotidica SEQ. ID. NO.2, sequenza nucleotidica SEQ. ID. NO.3, sequenza nucleotidica SEQ. ID. NO.4.
Costituisce anche oggetto della presente invenzione l?mRNA trascritto da una sequenza nucleotidica scelta nel gruppo consistente di: SEQ. ID. NO.2, SEQ. ID. NO.3, SEQ. ID. NO.4 e ogni variante di splicing.
Ulteriore oggetto della presente invenzione ? qualsiasi vettore e/o cellula ospite comprendente una sequenza nucleotidica scelta nel gruppo consistente di SEQ. ID. NO.2, SEQ. ID. NO.3, SEQ. ID. NO.4 oppure RNA da esse trascritte oppure corrispondente cDNA.
Un altro oggetto della presente invenzione ? una proteina di fusione comprendente:
una variante della proteina citidina deaminasi codificata dalla sequenza nucleotidica scelta nel gruppo consistente di SEQ. ID. NO.2, SEQ. ID. NO.3, SEQ. ID. NO.4.
e una proteina in grado di veicolare i mutanti di APOBEC1 su acidi nucleici o dominio funzionale della stessa.
Nonch? la sequenza codificante per detta proteina di fusione e qualsiasi vettore e/o cellula ospite comprendente la sequenza codificante per una proteina di fusione.
Preferibilmente la proteina in grado di veicolare i mutanti di APOBEC1, associata all?editing genomico, ? scelta nel gruppo consistente di: Zinc-Finger Nucleases (ZFN), Transcription activator-like effector nucleases (TALENs), Meganucleasi, Cas9 e sue varianti create in laboratorio, Cas12a e sue varianti create in laboratorio, tipo SpCas9, VRER SpCas9, VQR SpCas9, EQR SpCas9, xCas9-3.7, eSpCas9 (1.0), eSpCas9 (1.1), Cas9-HF1, HypaCas9, evoCas9, HiFi Cas9, ScCas9, StCas9, NmCas9, SaCas9, CiCas9, CasX), e Cascade/Cas3 e sue varianti create in laboratorio.
Pi? preferibilmente ? Cas9.
Preferibilmente il vettore ? un vettore plasmidico.
Preferibilmente il plasmide ? scelto nel gruppo consistente di: pAIDExpressPuro, pEGFP-C3, BE3, pFLAG.
Un altro oggetto della presente invenzione ? l?uso della proteina di fusione come editore di basi (base editor).
Un ulteriore oggetto della presente invenzione ? un procedimento di editazione di basi (base editing) che comprende l?uso dell?editore di basi costituito dalla proteina di fusione.
Preferibilmente il procedimento di editazione di basi (base editing) comprende i seguenti stadi:
a) coltura delle cellule
b) trasfezione delle cellule mediante vettore plasmidico comprendente una sequenza codificante per la proteina di fusione una sequenza codificante per l?RNA guida e almeno un gene per la selezione con antibiotico
c) selezione delle cellule che sono state trasfettate con antibiotico fino ad ottenere una coltura cellulare selezionata con la mutazione genomica desiderata.
Un ulteriore oggetto della presente invenzione ? un kit che comprende tutti gli elementi necessari per svolgere un procedimento di base editing che comprende l?uso dell?editore di basi costituito dalla proteina di fusione ed in particolare comprendente almeno un plasmide comprendente una sequenza codificante per la proteina di fusione una sequenza codificante per l?RNA guida e almeno un gene per la selezione con antibiotico.
Esempi
Materiali e Metodi
Coltura cellulare: ? stata impiegata la linea cellulare, disponibile commercialmente, dalla ATCC American Type Culture Collection, HEK293T da rene embrionale umano. Il terreno di coltura tissutale ? stato preparato partendo dal mezzo commerciale Modified Eagle's Medium (DMEM) (Euroclone) di Dulbecco. DMEM ? stato integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di penicillina/streptomicina solfato, 1% di L-glutammina. Le cellule sono state coltivate in incubatrice a 37?C al 5% di CO2. Quando le cellule erano confluenti, venivano divise in nuove piastre contenenti terreno fresco. Il conteggio delle cellule ? stato eseguito in una camera di conteggio dell'emocitometro Neubauer.
Trasfezione: le transfezioni transienti delle cellule HEK293T sono state eseguite utilizzando polietilenimmina (PEI) seguendo le istruzioni del produttore. E? stata effettuata la trasfezione di 1 ?g di DNA plasmidico incubando il DNA con 3 ?l di PEI [1 ?g/?l] in 200 ?l di DMEM. Dopo 15 minuti di incubazione, il volume totale ? stato trasferito goccia a goccia nel volume di 2 ml della coltura cellulare, in questo caso un 6 pozzetti. Lo stesso metodo ? stato ingrandito o ridotto per consentire la trasfezione di quantit? pi? alte o pi? basse di DNA, mantenendo lo stesso rapporto tra DNA e PEI e tra il volume di DMEM e il volume del terreno di coltura cellulare.
Citometria a flusso: Circa 2-5 x 105 cellule sono state trasferite in provette a fondo tondo in polistirene da 5 ml, centrifugate a 300xg a 4?C, lavate una volta in PBS e nuovamente centrifugate. Il pellet cellulare ? stato risospeso in 300 ?l di PBS e analizzato. I citofluorimetri utilizzati erano un FlowCytometer BD Accuri C6 e un Beckaman Coulter CytoFLEX.
Estrazione di DNA e RNA: il DNA dalle cellule eucariotiche ? stato estratto con il kit di purificazione genomica guidata (Promega) secondo le istruzioni del produttore e quantificato con lo spettrofotometro Epoch BioTek.
L'RNA ? stato estratto dalle cellule usando il reagente Trizol (Life Technologies) e quindi purificato dalla potenziale contaminazione del DNA usando il kit ricombinante DNAse I (Roche) secondo le istruzioni del produttore. La retro-trascrizione ? stata eseguita con il kit di trascrizione inversa del cDNA ad alta capacit? (Applied Biosystem).
Costruzione di vettori e plasmidi: i plasmidi sono stati clonati a partire da vettori preesistenti presenti in laboratorio o ottenuti da Addgene. L'inserimento di piccoli frammenti di DNA (<100 bp) ? stato effettuato sintetizzando due oligonucleotidi complementari a singolo filamento, quindi inseriti in specifici siti di restrizione dopo l'annealing (denaturazione) e la fosforilazione, seguendo il ?ZhangLab General Cloning Protocol? (Addgene link). L'inserimento di frammenti di DNA pi? grandi ? stato effettuato mediante amplificazione PCR della sequenza scelta con la polimerasi High-Fidelity e l'uso di primers (iniziatori) estesi al 5'contenenti un sito di restrizione. L'amplificazione per PCR dei frammenti di DNA che dovevano essere clonati o sequenziati ? stata eseguita usando la KOD Hot Start DNA Polymerase (Novagen).
Sono stati selezionati dei mutanti di APOBEC1 attraverso due screen batterici a partire da un pool di mutanti generati mediante PCR mutagenica. Lo screening di mutanti di APOBEC1 con ridotta capacit? di editing sull?RNA ? stato effettuato adattando l?utilizzo dell?operone arabinosio (Ara) per indurre morte cellulare. ? stato posto il gene ccdB, un veleno della topoisomerasi, sotto il controllo del promotore Ara. ? stata inserita la mutazione F15L (T>C) nel gene AraC, il regolatore dell?operone Ara, in modo da rendere l?operone insensibile all?aggiunta di arabinosio. La mutazione disegnata per essere un possibile bersaglio di editing di APOBEC1 sull?RNA. In caso di RNA editing su questo sito, la citosina viene editata in uracile e la sequenza wild-type viene ripristinata. L?aggiunta di arabinosio induce l?espressione del ccdB nei batteri in cui l?RNA editing ha avuto luogo e questo a sua volta induce morte cellulare. In questo modo sopravvivono solo i batteri che esprimono un mutante di APOBEC1 che non effettua editing sull?RNA, permettendo di selezionare i mutanti di APOBEC1 che non sono in grado di editare l?RNA. Per selezionare i mutanti di APOBEC1 che mantengono l?abilit? di editare il DNA ? stato usato un saggio di resistenza all?antibiotico rifampicina, ove i batteri non sono in grado di crescere in presenza di rifampicina a meno che non acquisiscano mutazioni sulla RNA polimerasi che ne permettono il funzionamento anche in presenza dell?antibiotico. La presenza di mutanti di APOBEC1 che inducano un fenotipo mutatore facilita l?introduzione di mutazioni che permettano ai batteri di crescere. L'associazione dei due metodi di screening ha permesso di selezionare mutanti che mantengono la capacit? di editare sul DNA senza la capacit? di editare l'RNA.
Sono stati inizialmente selezionati i seguenti mutanti: F66L+V179I; I195N; C82R; L182H; R132G.
Al termine della sperimentazione sono state ulteriormente selezionate le sequenze F66L+V179I, I195N, C82R
Il sequenziamento del DNA dei bersagli genomici editati ? stato svolto usando il sequenziamento del bersaglio con amplicone usando la tecnologia Illumina MiSeq. I bersagli genomici sono stati amplificati mediante PCR. Gli ampliconi erano stati preparati per il sequenziamento usando il kit TruSeq DNA Nano di Illumina, raggruppati in librerie e sequenziati con MiSeq Reagent Kit v2 micro, 2 x 150 cicli.
I mutanti di APOBEC1 sono stati fusi con Cas9 come nel costrutto BE3 originale descritto in Komor AC, YB, K., MS, P., JA, Z., & DR., L. (2016). Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature, 533(7603), 420? 424. E? stata valutata l?efficienza dei mutanti su cinque bersagli genomici per testare gli base editor come descritto in Komor AC, YB, K., MS, P., JA, Z., & DR., L. (2016). Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature, 533(7603), 420?424.
Le cellule HEK293T sono state trasfettate con i base editor e sgRNA specifici per questi bersagli. Al fine di valutare i livelli di editing, ? stato estratto il DNA genomico dalle cellule trasfettate dopo 72 ore e amplificati frammenti di DNA che racchiudono il sito di editing target. I plasmidi privi di APOBEC1 o contenenti il mutante cataliticamente inattivo E63A sono stati usati come controlli negativi. E? stato eseguito il sequenziamento MiSeq Illumina su tutti i campioni. I risultati della corsa di sequenziamento, della figura 1, mostrano che BE3 (l'editor base originale, indicato come A1) ? il pi? efficiente, in quanto ? in grado di editare tutte le citosine presenti all'interno delle sequenze target (14-26%). Tuttavia, i mutanti sono anche in grado di indurre conversioni da C a T su tutte le citosine (4-16%), anche se con minore efficienza rispetto a BE3, in particolare il mutante RA7 (1-7%). I base editor ottenuti mediante i mutanti della presente invenzione hanno mantenuto la capacit? di modificare le citosine.
Dopo aver dimostrato che i base editor con i mutanti APOBEC1 sono in grado di modificare diversi target genomici, ? stato valutato se i mutanti, diversamente da BE3, non causino editing dell'RNA da C a U. A questo scopo, si ? proceduto al sequenziamento dell'mRNA con tecnologia Illumina NextSeq di campioni di RNA ottenuti da cellule trasfettate con Base Editor indirizzati verso il bersaglio genomico RNF2. E? stato scelto il bersaglio RNF2 in quanto questo sgRNA induce livelli molto bassi di DNA off-target mediato dal mistargeting di sgRNA. Pertanto, le uniche mutazioni off-target previste derivano solo dal mistargeting della deaminasi, sia sull'RNA che sul DNA.
E? stato anche identificato il mutante L182H, simile a quello descritto in Gr?newald, J., Zhou, R., Garcia, S. P., Iyer, S., Lareau, C. A., Aryee, M. J., & Joung, J. K. (2019). Transcriptomewide off-target RNA editing induced by CRISPR-guided DNA base editors. Nature, 569(7756), 433?437, denominato L182A, ma con livelli di off-target minori se confrontato con il controllo negativo.
I risultati della figura 2 mostrano che i base editor selezionati hanno indotto livelli bassi di editing dell'RNA rispetto all'originale BE3 (BE-A1), livelli comparabili a quelli dei controlli privi di attivit? enzimatica deaminante (BE3woA1 e BE-E63A).
Le poche mutazioni riscontrate nei campioni con i mutanti APOBEC1 e i controlli negativi sono probabilmente dovute a mutazioni casuali, infatti l?analisi del contesto della sequenza che circonda i siti di editing, mostrata in figura 3, mostra che mentre APOBEC1 ? noto per deaminare preferibilmente citosine precedute da adenine/timine, non ? possibile osservare tale arricchimento per i mutanti APOBEC1.
Inoltre, poich? le varianti nucleotidiche singole che si verificano sullo stesso sito genomico ma su trascritti originati dai due filamenti di DNA opposti, non possono essere attribuite alla modifica dell'RNA, ? stato possibile valutare la presenza di mutazioni off-target sul DNA usando i dati trascrittomici. Mentre nei campioni in cui BE3 era sovra-espresso erano presenti mutazioni off-target, pochissime mutazioni erano presenti nei campioni che esprimevano i mutanti APOBEC1, come mostrato in figura 4.
Questi risultati indicano che i mutanti di APOBEC1 possono essere utilizzati per effettuare editing genomico con livelli molto bassi di effetti off-target.
Claims (11)
1. sequenza nucleotidica codificante per una variante della
proteina citidina deaminasi scelta nel gruppo consistente di:
SEQ.ID.NO. 2
ATGAGTTCCGAGACAGGCCCTGTAGCTGTTGATCCCACTCTGAGGAGAAGAATTGAGCCCC ACGAGTTTGAAGTCTTCTTTGACCCCCGGGAACTTCGGAAAGAGACCTGTCTGCTGTATGA GATCAACTGGGGAGGAAGGCACAGCATCTGGCGACACACGAGCCAAAACACCAACAAACAC GTTGAAGTCAATCTCATAGAAAAATTTACTACAGAAAGATACTTTTGTCCAAACACCAGAT GCTCCATTACCTGGTTCCTGTCCTGGAGTCCCTGTGGGGAGTGCTCCAGGGCCATTACAGA ATTTTTGAGCCGATACCCCCATGTAACTCTGTTTATTTATATAGCACGGCTTTATCACCAC GCAGATCCTCGAAATCGGCAAGGACTCAGGGACCTTATTAGCAGCGGTGTTACTATCCAGA TCATGACGGAGCAAGAGTCTGGCTACTGCTGGAGGAATTTTGTCAACTACTCCCCCTCGAA TGAAGCTCATTGGCCAAGGTACCCCCATCTGTGGGTGAGGCTGTACATACTGGAACTCTAC TGCATCATTTTAGGACTTCCACCCTGTTTAAATATTTTAAGAAGAAAACAACCTCAACTCA CGTTTTTCACGATTGCTCTTCAAAGCTGCCATTACCAAAGGCTACCACCCCACATCCTGTG GGCCACAGGGTTGAAA
SEQ.ID.NO.3
ATGAGTTCCGAGACAGGCCCTGTAGCTGTTGATCCCACTCTGAGGAGAAGAATTGAGCCCC ACGAGTTTGAAGTCTTCTTTGACCCCCGGGAACTTCGGAAAGAGACCTGTCTGCTGTATGA GATCAACTGGGGAGGAAGGCACAGCATCTGGCGACACACGAGCCAAAACACCAACAAACAC GTTGAAGTCAATTTCATAGAAAAATTTACTACAGAAAGATACTTTTGTCCAAACACCAGAT GCTCCATTACCTGGTTCCTGTCCTGGAGTCCCTGTGGGGAGTGCTCCAGGGCCATTACAGA ATTTTTGAGCCGATACCCCCATGTAACTCTGTTTATTTATATAGCACGGCTTTATCACCAC GCAGATCCTCGAAATCGGCAAGGACTCAGGGACCTTATTAGCAGCGGTGTTACTATCCAGA TCATGACGGAGCAAGAGTCTGGCTACTGCTGGAGGAATTTTGTCAACTACTCCCCTTCGAA TGAAGCTCATTGGCCAAGGTACCCCCATCTGTGGGTGAGGCTGTACGTACTGGAACTCTAC TGCATCATTTTAGGACTTCCACCCTGTTTAAATAATTTAAGAAGAAAACAACCTCAACTCA CGTTTTTCACGATTGCTCTTCAAAGCTGCCATTACCAAAGGCTACCACCCCACATCCTGTG GGCCACAGGGTTGAAA
SEQ.ID.NO.4
ATGAGTTCCGAGACAGGCCCTGTAGCTGTTGATCCCACTCTGAGGAGAAGAATTGAGCCCC ACGAGTTTGAAGTCTTCTTTGACCCCCGGGAACTTCGGAAAGAGACCTGTCTGCTGTATGA GATCAACTGGGGAGGAAGGCACAGCATCTGGCGACACACGAGCCAAAACACCAACAAACAC GTTGAAGTCAATtTCATAGAAAAATTTACTACAGAAAGATACTTTTGTCCAAACACCAGAC GCTCCATTACCTGGTTCCTGTCCTGGAGTCCCTGTGGGGAGTGCTCCAGGGCCATTACAGA ATTTTTGAGCCGATACCCCCATGTAACTCTGTTTATTTATATAGCACGGCTTTATCACCAC GCAGATCCTCGAAATCGGCAAGGACTCAGGGACCTTATTAGCAGCGGTGTTACTATCCAGA TCATGACGGAGCAAGAGTCTGGCTACTGCTGGAGGAATTTTGTCAACTACTCCCCtTCGAA TGAAGCTCATTGGCCAAGGTACCCCCATCTGTGGGTGAGGCTGTACGTACTGGAACTCTAC TGCATCATTTTAGGACTTCCACCCTGTTTAAATATTTTAAGAAGAAAACAACCTCAACTCA CGTTTTTCACGATTGCTCTTCAAAGCTGCCATTACCAAAGGCTACCACCCCACATCCTGTG GGCCACAGGGTTGAAATGT
2. Proteina codificata da una sequenza nucleotidica della rivendicazione 1.
3. mRNA trascritto da una sequenza nucleotidica della rivendicazione 1 e sue varianti di splicing.
4. Proteina di fusione comprendente una variante della proteina citidina deaminasi codificata dalla sequenza nucleotidica secondo la rivendicazione 1 e una proteina in grado di veicolare i mutanti di APOBEC1 su acidi nucleici o dominio funzionale della stessa.
5. Proteina di fusione secondo la rivendicazione 4 in la proteina in grado di veicolare i mutanti di APOBEC1, associata all?editing genomico, ? scelta nel gruppo consistente di: Zinc-Finger Nucleases (ZFN), Transcription activator-like effector nucleases (TALENs), Meganucleasi, Cas9 e sue varianti create in laboratorio, Cas12a e sue varianti create in laboratorio, tipo SpCas9, VRER SpCas9, VQR SpCas9, EQR SpCas9, xCas9-3.7, eSpCas9 (1.0), eSpCas9 (1.1), Cas9-HF1, HypaCas9, evoCas9, HiFi Cas9, ScCas9, StCas9, NmCas9, SaCas9, CiCas9, CasX), e Cascade/Cas3 e sue varianti create in laboratorio.
6. .Sequenza nucleotidica codificante per la proteina di fusione delle rivendicazioni 4 o 5.
7. Vettore comprendente una sequenza nucleotidica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3.
8. Cellula ospite comprendente una sequenza secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3.
9. Uso della proteina di fusione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 4-5 come editore di basi.
10. Procedimento di editazione di basi comprendente i seguenti stadi:
a) coltura delle cellule
b) trasfezione delle cellule mediante vettore plasmidico comprendente una sequenza codificante per la proteina di fusione delle rivendicazioni 4-5, una sequenza codificante per un RNA guida e almeno un gene per la selezione con antibiotico
c) selezione delle cellule che sono state trasfettate con antibiotico fino ad ottenere una coltura cellulare selezionata con la mutazione genomica desiderata.
11. Kit comprendente tutti gli elementi necessari per svolgere un procedimento di base editing mediante l?uso come editore di basi della proteina di fusione delle rivendicazioni 4-5 comprendente almeno un plasmide comprendente una sequenza codificante per detta proteina di fusione, una sequenza codificante per un RNA guida e almeno un gene per la selezione con antibiotico.
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